(19)대한민국특허청(KR)

(12) 공개특허공보(A)

(51) 。Int. Cl.

A23K 1/175 (2006.01)

A61K 31/352 (2006.01)

G01F 1/64 (2006.01)

G01N 33/50 (2006.01)

(11) 공개번호

(43) 공개일자

10-2006-0041313

2006년05월11일

(21) 출원번호 10-2006-7003916

(22) 출원일자 2006년02월25일

번역문 제출일자 2006년02월25일

(86) 국제출원번호 PCT/US2004/027644 (87) 국제공개번호 WO 2005/022116

국제출원일자 2004년08월25일 국제공개일자 2005년03월10일

(30) 우선권주장 10/648,047 2003년08월26일 미국(US)

(71) 출원인 마나테크 인코포레이티드

미국 텍사스주 75019 코펠 스위트 200 사우쓰 로열 레인 600

(72) 발명자 맥아날레이 빌 에이치.

미국 텍사스주 그랜드 프레리 캐리어 파크웨이 4921

베넘 아이린 피.

미국 텍사스주 그랜드 프레리 노스 웨스트필드 2229

맥아날레이 쉐인 에이.

미국 텍사스주 그랜드 프레리 캐리어 파크웨이 4921

쾨프케 마이클 씨.

미국 텍사스주 그랜드 프레리 올라 레인 1905

(74) 대리인 김명신

박장규

심사청구 : 있음

(54) 항산화제 감지기, 방법 및 조성물

요약

본 발명은 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 시료와 유동적으로 교류하는 산소 라디칼 민감성 감지기를 사용하는 친유성 및

소유성 항산화제의 항산화제 활성을 직접 검출하기 위한 장치와 방법에 관한 것으로서,

상기 산소 라디칼 민감성 감지기는 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 친유성 및 소유성 항산화제를 동시에 검출하는 것이

특징이다.

대표도

공개특허 10-2006-0041313

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도 1

명세서

기술분야

본 발명은 일반적으로 항산화제 감지기 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 친수성 항산화제(親水性 抗酸化濟;

hydrophilic anti-oxidant)와 소수성 항산화제(疏水性 抗酸化濟; hydrophobic anti-oxidant)를 직접 측정하는 항산화제

감지기와 방법에 관한 것이다.

배경기술

본 명세서는 2004년 8월 26일에 출원된 미국 특허 출원 일련번호 제10/648,047호를 우선권으로 청구하였으며, 본 명세

서는 상기 출원 일부의 계속되는 출원이다. 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 항산화제 감지기 기술 및 검출 방법과 관

련하여 이의 배경을 기재하였다.

생물학적 시스템은 라디칼(radical)과 기타 프로-산화성(pro-oxidative) 종류의 영향에 대항하기 위한 항상화제 시스템으

로 개발되었다. 항산화제는 산화성 기질의 농도와 비교해서 낮은 농도로 존재하여 산화성 기질의 산화를 현저하게 지연시

키거나 또는 방지하는 임의의 물질이다. 여러 미생물에 의해 유전 암호가 지정되는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide

dismutase) 및 카타라제(catalase)와 같은 항산화제는 효소이다. 비타민 C와 식물 페놀과 같은 물질들은 음식물을 통해

생물학적 시스템으로 들어가는 항산화제이다. 상기 물질의 자연 발생 레벨은 몸속에서 충분하게 생성되지 않거나 일반적

인 음식물로도 섭취되지 못한다고 알려져 있다. 과일과 채소 중에 불충분하게 존재하거나/존재하며, 음식물 중 과일과 채

소는 오늘날의 가공 절차 때문에 이들의 항산화제가 감소되어 있기 때문에 일반적인 음식물로는 충분한 항산화제를 섭취

할 수 없다. 보통의 음식물을 개선시킬 수 있지만, 몸에서 필요로하는 항산화제를 운반하기 위해서는 요즘의 생활 습관과

서양 음식의 조악한 성분 때문에 보조 식품(supplementation)을 통하는 것이 가장 실용적인 방법이다. 보통의 음식물을

보충하기 위해서는 보조 식품 중에 포함되어 있는 성분의 항산화제 용량을 측정할 필요가 있다.

유리 라디칼을 퀸칭(quenching)시키기 위한 물질의 능력을 측정하거나 이것의 항산화제 용량을 측정하기 위한 다수의 실

험 방법(이러한 각각의 분석 방법은 이후에 상세하게 설명하였음)이 개발되었다. 간단하게 말하면 상기 분석 방법은

TEAC, 19F-NMR, TRAP, 변형된 TRAP, FRAP, 형광계 방법, 포스포몰리브덴 착체 검출 및 ORAC를 포함하며, 상기 분

석 방법들은 모두 유리 라디칼 종류를 퀸칭시키기 위한 물질 능력의 측면을 측정하기 위해 제안되었다. 하기에 고유의 장

점과 단점을 포함하여 각각의 방법을 간단하게 설명하였다.

TEAC 분석 방법. 트롤록스(상표명) 균등물 항산화제 용량(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, TEAC) 분석 방법

은 2,2'-아지노비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS)을 퍼옥시다아제와 과산화수소의 존재하에 또는 히드록실,

퍼옥실, 알콕실 및 무기 라디칼의 존재하에 배양하는 경우 조금 더 안정한 ABTS˙+ 라디칼 양이온이 발생된다. ABTS, 메

트마이오글로빈, 완충액 및 과산화수소를 함께 첨가하는 시점으로부터 적외선 방사의 흡광도를 시간에 따라 734 nm의 파

장에서 측정한다. ABTS˙+ 라디칼 양이온이 형성되기 시작하면 흡광도가 증가한다. 항산화제를 과산화수소 첨가 이전에

첨가하는 경우 과산화수소에 의해서 형성되는 라디칼을 포착(scavenge)하고 ABTS˙+ 라디칼 양이온의 형성을 지연시켜

흡광도 억제 퍼센트의 증가를 유도한다. 상기 분석 방법에서의 측정 유닛은 시험할 물질의 1 ℓ용액 당 1.0 mmol로 균등물

항산화제 용량을 갖는 트롤록스 농도(mmol/ℓ)가 TEAC이다.

TEAC 분석 방법으로 수용성 약물 또는 용해될 수 있는 약물의 항산화제 용량을 검출한다. 또한 다른 성분들의 기여를 검

출하는 TEAC 분석 방법의 능력으로 시스템의 항산화제 용량을 측정하기 위해서 TEAC 분석 방법을 사용할 수 있다.

TEAC 방법은 약학 및 영양학적 연구에 사용할 수 있다. TEAC 방법의 용도는 시료 중에 존재하는 퍼옥시다아제에 의해서

흡광도의 값이 높고, 시험하는 화학물질도 또한 734 nm에서 흡수되기 때문에 한계가 있다. 따라서 TEAC 방법은 H2O2의

농도가 비교적 낮으므로 항산화제 시료와 시약 사이의 직접적인 상호작용 때문에 유리 라디칼을 직접적으로 퀸칭시키기

위한 시료 항산화제의 특이성을 보장할 수 없다. TEAC 방법은 또한 시료 농도가 낮을때 TEAC 값이 증가되므로 시료를

희석함에 따라 영향을 받는다.

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19F-NMR 분석 방법. 또 다른 방법으로 19F-NMR로 불화된 방향족 아민을 검출하는 19F-NMR(핵자기공명)을 사용한다.

방향족 아민은 히드록실 라디칼과 신속하게 반응하여 수산화 제품 혼합물을 형성한다. 불화 검출제, 즉 N-(4-히드록시페

닐)-트리플루오로아세트아미드가 히드록실 라디칼 공격에 의해 파괴되어 기타 생성물과 함께 CF3CONH2, 트리플루오로

아세트아미드(TFAM)이 수득된다. 히드록실 라디칼 공격으로부터 불화 검출제를 보호하기 위한 물질의 능력을 측정하기

위해 TFAM이 사용된다. 시료가 유리 라디칼 공격으로부터 불화 검출제를 양호하게 보호한다면 TFAM 피크하면적은 불

화 검출제의 보호가 잘 되지 않는 물질인 경우에서보다 더 작아질 것이다. 시약을 함께 혼합하고, NMR을 사용하여 측정한

다. 피크 면적을 측정한 다음에 총 농도의 불소 함유 종류를 배경으로 표준화시킨다. 19F-NMR 방법은 저분자량의 생물분

자의 항산화제 특성을 측정하는 간단한 방법이지만 방법 중에 히드록실 라디칼이 포함되고 방사선 불소를 사용해야 지시

약이 나타나며, NMR 장비를 구입하고 작동시키는 것이 매우 고가이다.

TRAP 분석 방법. 산화성 유기 화합물의 수성 분산물은 총 라디칼-트래핑 항산화제 파라메터(Total Radical-Trapping

Antioxidant Parameter, TRAP) 방법용의 기본으로서 제공되는 수용성 아조 화합물 2,2'-아조-비스-(2-아미디프로프로

판 히드로클로라이드)(ABAP)를 사용하는 과산화화(peroxidation)에 의해서 일정한 속도, Ri로 용이하며 재현가능하게 개

시된다. TRAP 방법으로 과산화성 플라즈마에 의한 산소 섭취가 산소 프로브(oxygen probe)로 억제되는 시간의 길이를

검출하며, 상기 값은 TRAP를 나타낸다. 트롤록스는 천연 항상화제가 소멸된 후의 2차 유도 기간 중에 상기 방법에서 항산

화제 조절제로서 사용된다. 2차 유도 기간은 TRAP 값을 계산하기 위해서 사용하는 Ri 값을 계산하기 위해 사용된다.

TRAP 값은 1 ℓ유체 중에 트래핑된 퍼옥실 라디칼의 몰 수를 나타낸다.

불행하게도 TRAP 방법으로 측정하면 오랜 시간이 소요되므로 작업 분석량이 많은 경우에는 실용성에 한계가 있다. 최대

한의 산소 섭취를 방지하기 위한 소요 시간은 용이하고 정확하게 측정할 수 없으며, 항산화제 1 몰 당 총 라디칼 트래핑 용

량은 이것의 초기 농도에 따라 달라지며; 실제 억제 정도는 측정되지 않는다. TRAP 방법은 단지 하나의 반응 용기를 가지

기 때문에 한번에 하나의 시료만 시험할 수 있어 시간이 많이 소요된다. TRAP 방법은 필요한 유도기(lag phase)를 생성하

기 위해 플라즈마의 희석 수준을 높게 할 필요가 있기 때문에 TRAP 방법이 TEAC 방법보다 보다 특이적이며 동시에 상기

방법을 완성하기 위한 과정은 신속한 사슬 반응을 위해 필요한 지질 사슬 길이가 짧아진다. 리놀레산을 첨가함으로써 사슬

길이가 짧아지는 것을 보상할 수 있지만, 추가 연구에 의해 리놀레산을 첨가하면 다른 에러가 발생된다는 것이 제안되었다

(Ghiselli A; Serafini M; Maiani G; Azzini E; Ferro-Luzzi A., A fluorescence-based method for measuring total

plasma antioxidant capability. Free Radic. Biol. Med. 1995 Jan; 18: 29-36). TRAP 분석 방법 시스템에서, 비타민 C

와 같은 몇몇 항산화제의 총 퍼옥실 라디칼-트래핑 능력은 초기 농도에 따라 달라진다.

변형된 TRAP 분석 방법. 변형된 TRAP 분석 방법은 플라즈마 단백질 또는 시료 희석에 의해 야기되는 문제점을 조정한다

(Ghiselli, et al., supra). 변형된 TRAP 방법은 단백질 β-피코에리트린(β-PE)의 형광 특성 상에서 ABAP에 의해 생성되

는 퍼옥실 라디칼 공격의 영향과 β-PE를 보호하는 플라즈마의 능력을 간접적으로 측정한다. 보호는 황산암모늄으로 플라

즈마에서 단백질을 침전시키고 초원심분리하면 완료된다. 변형된 TRAP 분석 방법은 석영 형광광도계 셀에 시약을 함께

첨가하고 37 ℃에서 5 분 동안 유지시켜 실행한다. ABAP를 첨가한 후 495 nm에서 플로오레신을 측정하고 5 분 마다 관

찰한다. 변형된 TRAP 방법은 원래의 산소 프로브계 방법과 같은 ABAP의 열 분해 때문에 플루오레신이 선형 감소한다.

총 보호 기간은 항산화제 화합물을 첨가함에 따른 유도기에 의해 나타나지만 총 플라즈마 항산화제 용량은 유도기의 길이

와 직접적으로 관련이 있는 것으로 추측된다. TRAP는 항산화제 화합물에 의해 생성되는 유도기와 공지된 농도의 트롤록

스 용액에 의해 생성되는 유도기를 비교하여 정량한다.

변형된 TRAP 방법은 ABAP에 의해 유발되는 지질 과산화화 사슬을 깨는 플라즈마 능력을 측정하지는 않지만 지용성 항

산화제가 TRAP와 관련이 있는지와 어느 정도 관련이 있는지를 완전하게 규정하지 않는다. 상기 변형된 TRAP 방법은 단

지 한 번에 4개 내지 8개의 플라즈마 시료를 다룰 수 있다.

FRAP 분석 방법. 플라즈마의 철 감소 능력(Ferric Reducing Ability of Plasma, FRAP) 분석 방법은 Benzie와 Strain에

의해 개발되었으며, 1996년에 발표되었고, COBAS FARA Ⅱ 분광 분석기에서 실행한다. 모든 용액과 함께 FRAP 시약은

매일 새로 제조한다. FRAP 시약을 37 ℃로 가열한다. 공시료를 판독한 다음에 항산화제 시료와 물을 첨가한다. 반응 0.5

초 후에 개시하고 실험 내내 매 15 초 마다 판독한다. 흡광도의 차이를 측정하기 위해서 공시료 측정 흡광도와 마지막 측정

흡광도의 차이를 계산한 다음 동시에 시험하는 대조군 철(Ⅱ) 용액의 흡광도의 차이와 관련시킨다. FRAP 분석 방법은 농

도에 따라 달라지지 않으며, 초기에서 수득된 결과의 기대되는 선형 트랜드에서 일탈하지 않는다.

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FRAP 분석 방법은 시스템에 도입되는 유리 라디칼이 없다는 것이 알려진 문제점이다. FRAP 분석 방법은 철(Ⅲ)에서 철

(Ⅱ)로 환원시키는 시료의 능력을 측정하기 위해 산화/환원 반응을 사용한다. 항산화제는 산화/환원 반응에 환원제로서 동

일한 방법으로 전자를 전달하므로, FRAP 분석 방법은 항산화제 용량을 평가하기 위한 방법이라고 추측된다. 그러나

FRAP 분석 방법은 포텐셜 항산화제(potential antioxidant)의 항산화제 용량을 직접적으로 측정하지 않는다. 또한 시스템

에 도입되는 유리 라디칼이 없기 때문에 다른 종류의 라디칼에 대한 항산화제 용량을 비교하기 위한 방법이 없다. FRAP

분석 방법은 철(Ⅱ) 및 SH 기 함유 항산화제와 반응할 수 있는 아스코르브산과 같은 특정 항산화제의 항산화제 용량을 정

확하게 측정할 수 없다. FRAP 분석 방법은 많은 억제 정도를 고려할 수 없기 때문에 FRAP에는 총 항산화제 용량의 중요

한 성분이 삭제되어 있다. 항산화제 용량을 정확하게 측정하기 위한 FRAP 및 TEAC 분석 방법의 무능력은 선상 상관

(linear correlation)이 없는 2개의 분석으로부터 수득된 결과를 비교함에 따라 명백해진다.

형광계 방법. 형광계 방법은 퍼옥실과 히드록실 라디칼 공격에 의해 야기되는 손상에 따라 시간에 따른 β-피코에리트린

변화의 플루오레신을 발견하는 것을 기본으로 한다. β-피코에리트린 방법은 플루오레신을 검출하기 위해 퍼킨-엘머 MPF

44B 플루오레신 분광기를 사용한다. 시간에 따라 플루오레신을 측정하며 대조군에 관해서는 "플랫 기간(flat period)"이

얼마나 긴지를 관찰함으로써 항산화제가 제공되는 보호 정도를 측정하는데 플루오레신을 측정한다. 이러한 간접적인 형광

계 방법에서, 흡광도 레벨이 화학물질 B에 있어서의 기간 보다 화학물질 A에 있어서의 기간이 더 긴 "플랫 기간"이 동일하

다면 화학물질 A는 화학물질 B에서 보다 더 라디칼 공격으로부터 보호받는다고 말할 수 있으며, 따라서 더 강한 항산화제

이다.

플루오레신 방법은 소량의 시료에서 신속하게 기타 생물학적인 유체 또는 플라즈마에서 비세럼(non-serum) 항산화제 레

벨을 정량하는 방법을 제공하며, 플라즈마, 단백질, DNA, 신경전달물질과 이와 관련된 물질, 비타민과 이들의 유도체, 및

기타 화학물질의 항상화제 포텐셜을 분석하기 위해서 사용하였다. 그러나 간접 플루오레신 방법은 몇가지의 문제점이 있

다. 예를 들어 상기 분석 방법은 예를 들어 β-PE의 억제 시간을 측정하는 대신에 플루오레신 손실의 초기 선형 비율에서

계산한 억제 퍼센트를 측정한다. 플루오레신 방법은 총 항산화제 용량에 미치는 지용성 항산화제의 기여와 세럼 중의 단백

질의 기여를 측정하는 방법을 제공하지 않는다.

포스포몰리브덴 착체 분석 방법(PCA). 포스포몰리브덴 착제 형성은 FRAP 방법과 유사하다. PCA 방법은 몰리브덴(VI)를

몰르브덴(V)으로 환원시킨 후의 흡광도의 변화를 기본으로 한다. 몰리브덴(VI)를 몰리브덴(V)으로 환원시키기 위해서 예

를 들어 항산화제와 같은 환원화 화학종(reducing species)이 있어야 한다. 적당한 용매 중에 용해시켜 사용하기 직전에

시료를 준비한다. 수용성 화합물에 있어서는 물을 사용한다. 유기 용매 중에 용해된 물질에 있어서는, 에탄올, 메탄올, 디

메틸 설폭사이드 또는 헥산을 문헌에 기초한 흡수율에서 측정한 정확한 농도를 사용한다. 분쇄하고 냉동한 후 시드 시료

(seed sample)를 용해시키고 필요하다면 추출한다. 그 다음에 시료를 몰리브덴-함유 시약 용액과 혼합한다. 배양 및 냉각

한 후 예를 들어 UV-가시광선 분광 광도계를 사용하여 공시료에 대해 흡광도를 측정한다. 공지되어 있지 않는 시료에서

유기 및 수용성 항산화제 용량은 각각 α-토코페롤과 아스코르브산의 균등물로 나타낸다. 항산화제 용량은 포스포몰리브

덴 착체의 몰 흡수율을 비교하는 것을 기본으로 정량한다. 몰 흡수율이 1에 가까우면 더 나은 항산화제이다. 포스포몰리브

덴 방법은 25 ℃ 내지 37 ℃에서 비타민 E와 같은 강한 항산화제의 항산화제 포텐셜을 측정하기 위한 양호하며 간단한 방

법이다. 이러한 방법은 총 항산화제 포텐셜을 측정하기 위한 기타 유용한 방법에 대안적인 저렴한 방법이다.

종래의 ORAC 분석 방법. 산소-라디칼 흡광도 용량(ORAC) 방법은 피코에리트린, 형광 단백질의 화학적 특성을 이용한다.

ORAC 분석 방법은 반응이 정해진 초기에 글레이저 방법(Glazer method)이 플랫 기간(flat period)으로 기록된 것이 무엇

인지를 보는 것이므로 ORAC 방법이 완성되었을 때 유도되는 글레이저 방법과는 상이하다. ORAC 방법은 황산암모늄을

처리한 후 초원심분리를 실행하여 제거되는 단백질이 있는 세럼을 사용할 수 있다. 퍼옥실 라디칼 발생제, 2,2'-아조비스

(2-아미디노프로판)디히드로클로라이드(AAPH)를 상기 분석 방법에 사용한다.

종래의 ORAC 방법의 검출은 예를 들어 플루오레신이 발생되지 않을 때 까지 퍼킨-엘머 LS-5 플루오레신 분광 광도계를

사용하여 실행한다. 시약을 큐벳에 첨가한 후 AAPH를 첨가하고 반응 혼합물을 37 ℃에서 배양하여 반응이 완료되는 동안

내내 매 5 분 마다 플루오레신을 측정한다. 결과는 항산화제의 존재시에 β-PE의 퀸칭 곡선(quenching curve)하의 순 보

호 면적(net protection area)을 나타내는 ORAC 값으로 기록된다. ORAC 값은 공시료 곡선하 면적을 제하여 조정한 두개

의 면적으로 트롤록스 곡선하의 면적으로 시료 곡선하의 면적을 나누어 계산한다. ORAC 1 유닛은 최종 농도에서 1 uM의

트롤록스에 의해 생성되는 순 보호 면적으로 지정한다. 시료에 있어서의 곡선하면적을 트롤록스에 있어서의 곡선하면적과

비교하여 수득된 결과를 트롤록스 균등물(equivalents)로 나타낸다.

자동 ORAC 방법은 예를 들어 COBAS FARA Ⅱ 원심분리 분석기를 사용한다. 개시제를 첨가하고, 초기 판독 후 0.5 초 후

및 그 다음 매 2 분 마다 플루오레신을 측정한다. COBAS FARA Ⅱ는 시료를 돌리고 혼합하기 위한 원심분리기가 부착되

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어 있다. COBAS FARA Ⅱ는 한 번에 30개 이하의 시료를 다룰 수 있으며, 결과는 원래 방법에서와 같은 ORAC 값을 측정

하기 위한 곡선하면적을 사용하여 기록한다. COBAS FARA Ⅱ 방법은 다수의 시료 매트릭스를 평가하기 위해서 효과적으

로 사용되었다.

ORAC는 β-피코에리트린 대신에 플루오레신 염을 사용하여 추가로 변형시킬 수 있다. β-피코에리트린의 순도는 분리 방

법 때문에 약 30 %이며, 롯과 롯 사이에 일관성이 없다. 퍼옥실 라디칼에 다양한 반응성 때문에 β-피코에리트린은 또한 롯

과 롯 사이에 불일치성이 나타나는 것으로 확인되었다. 또한 β-피코에리트린은 특정 시간 동안 여기광(excitation light)에

노출된 후 광퇴색될 수 있다. 비특이적 단백질 결합 때문에 β-피코에리트린는 안정성에 영향을 미치는 폴리페놀과 반응한

다. 또한 β-피코에리트린는 플루오레신보다 비용이 아주 많이 든다. 이러한 이유로 플루오레신을 β-피코에리트린 대신에

사용한다.

ORAC 방법은 50 % 아세톤-물 혼합물 중에 무작위로 메틸화 베타-시클로덱스트린(RMCD)를 도입시킴으로써 지용성 항

산화제 시료를 분석할 수 있도록 개작하였다. 상기 아세톤:물 혼합물은 인산염 완충액 중에 용해된 지용성 항산화제를 만

든다. ORAC 방법은 항산화제와 세럼 또는 기타 생물학적 유체의 퍼옥실 라디칼 흡수 용량을 측정하는 간단하고, 민감하며

확실한 방법이다. 세럼의 히드록실 라디칼 흡수 용량은 ORAC 방법을 사용하여 성공적으로 실행하였다. ORAC(fl) 방법은

많은 시료를 가지고 동시에 운동 분석을 실행하고 요구되는 상당한 양의 세럼을 환원시키기 위해서 96 웰 판을 사용하는

형광분석기(fluorometry microplate reader)를 사용할 수 있다. ORAC 방법은 곡석하면적을 측정함으로써 단일한 양에

억제 정도와 억제 시간을 고려하는 분석 방법으로서 독특하다(9). ORAC 방법은 희석에 의해 영향을 받지 않는다(5).

FRAP와 TEAC 분석과 β-피코에리트린를 사용하는 COBAS FARA Ⅱ 자동 분석으로 비교하면, 상기에는 추가로 시료의

항산화제 용량을 정확하게 측정하기 위한 TEAC 분석의 무능력이 나타나는 ORAC와 TEAC 사이의 선상 상관이 없다. 그

러나 포텐셜 항산화제의 항산화제 용량을 측정하기 위한 FRAP 분석의 정밀함이 낮게 나타나는 ORAC와 FRAP 사이에는

다소 약한 선상 상관이 보인다.

물질의 항산화제 포텐셜을 측정하기 위한 몇가지 방법을 확인하였다. 이러한 모든 방법들은 잇점이 있지만 또한 한계점도

있다. 항산화제 산업을 구성하는 과반수의 작은 회사에서 사용하기에는 상기 방법들이 매우 고가[장비(몇가지는 더이상

제조되지 않음), 시약, 인권비 등을 포함]이므로 부적합하다.

Fang이 발표한 미국 특허 제5,518,590호에 포함된 기타 방법들은 모터 오일과 기타 윤활제용의 전기화학적 감지기를 개

시하고 있다. 간단하게, 민감하고 신속한 전기화학적 감지기는 오일 형성 중에 잔존하는 마모방지제와 항산화제를 측정함

으로써 모터 오일 열화, 특히 항산화제 특성을 기록한다. 전기화학적 감지기는 전극 표면 상에 전도성 전해질 액상 또는 겔

-유사 분열 간기를 갖는 2개 또는 3개의 전극 전기화학적 셀이다. 모터 오일의 열화 정도는 오일의 마모방지제 또는 항산

화를 측정하여 확인한다. 전기화학적 감지기는 전기활성 첨가제를 함유하는 탄화수소와 기타 윤활제를 확인하기 위해 사

용한다. 전기화학적 감지기는 오일의 임의의 화학적 또는 물리적인 전처리 없이 인시츄에서 실행하여 측정한다.

항산화제 감지기의 또 다른 예로는 Hodges의 미국 특허 제6,638,415호에 나타나 있으며, 상기에서는 유동 시료 중에 산

화제 또는 항산화제 기질의 레벨을 측정하기 위한 장치와 방법을 기재하고 있다. 이러한 장치는 기질과 산화환원 반응을

실행할 수 있는 시약을 함유하는 일회용 전기화학적 셀, 예컨대 박층 전기화학적 셀을 포함한다. 상기 장치와 방법이 느린

반응 기질과 사용된다면 전기화학적 셀 내에 함유되어 있는 발열성 물질에 의해서 또는 장치 중에 저항성 가열 요소에 의

해서 시료에 열을 제공할 수 있다. 열을 적용하는 것은 시약과 기질 사이의 산화환원 반응의 속도를 촉진시키고 느린 반응

기질의 전기화학적 측정을 촉진시키기 위한 것으로 기재되어 있다.

마지막으로 미국 특허 공보 제20020182736호에서는 친유성 항산화제 활성을 간접적으로 측정하기 위한 방법을 개시하

고 있다. 친지성 라디칼 발생제와 산화성 친지성 지시제를 사용하여 시료의 지질 부분내에 지질 항산화제 활성을 측정하기

위한 선택적인 방법을 개시하고 있다. 상기 발명은 지질과 수성 부분 둘 다에서 시료의 총 항산화제 활성을 정확하고 효율

적으로 측정하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 방법은 대상자들 중에 존재하는 초과의 유리 라디칼로 야기되는 질환을

예방하고 진단하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 시약은 키트 분석으로 제공될 수 있다. 그러나 산소

라디칼 흡광도 용량(ORAC) 값은 대조군 플루오로신 프로브를 사용하여 간접적으로 측정한다.

발명의 상세한 설명

발명의 요약

본 발명은 총 시료 산화 상태에 항산화제의 영향과 총 시료 산화 레벨을 직접 측정하기 위한 방법과 항산화제 감지기를 포

함한다. 본 발명의 또한 최적의 건강을 위해 개인에게 효율적인 항산화제 양을 제공하기에 유용한 방법과 조성물을 포함한

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다. 여기서 개시하고 있는 장치와 방법은 실시간으로 동시에 직접적으로 시료의 총 항산화제 용량을 검출한다. 본 발명자

들은 인용 문헌에서 항산화제의 2개의 상호 배타적인 범주(친유성과 소유성)를 인공적으로 만들고 분리하여 측정한 것을

알았다. 또한 인용 문헌은 검출가능한 기록 분자를 사용하여 간접적으로 라디칼의 존재를 측정한 것이 일반적이다.

본 발명은 신속하고 저렴하며 직접적으로 검출하는 시스템을 사용함으로써 종래 문헌의 검출기와 방법의 한계점을 극복하

였다. 이러한 한계점을 검토하기 위해서 본 발명자들은 여기서 기재하고 있는 산소 라디칼 흡광도 용량-산소(ORAC(o))

장치와 방법을 개발하였다. ORAC(o) 장치를 사용하여 본 발명자들은 동시에 실시간으로 용존 산소 레벨에 미치는 친유성

과 소유성 항산화제 둘 다의 효과를 일차로 측정할 수 있었다. ORAC(o) 분석 방법을 사용하여 발명자들은 또한 1개 이상

의 항산화제 강화제와 결합하거나 또는 단독으로 사용될 수 있는 상승 작용의 항산화제 조성물을 개발할 수 있었다.

보다 구체적으로 본 발명은 용매/물/계면활성제 혼합물 중 시료와 산소 라디칼 민감성 분자와 유동적으로 교류하는 용존

산소 감지기를 포함하는 친유성 및 소유성 항산화제 둘 다의 항산화 활성을 직접 검출하기 위한 장치를 포함하며; 산소 라

디칼 민감성 감지기는 동시에 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 친유성 및 소유성 항산화제를 검출한다. 산소 라디칼 민감

성 분자는 산소, 예를 들어 콘쥬게이트된 이중 결합을 갖는 분자(질소 또는 황 함유 화합물)와 반응하는 분자일 수 있다. 산

소 라디칼 민감성 분자의 예로는 예를 들어 플루오레신, β-피코에리트린(β-PE), 글루타치온-S-트랜스퍼라아제, 리놀레

산 또는 이들의 배합물이 있다. 산소 라디칼 레벨은 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 용존 산소 측정기 또는 감지기를 사용

하여 직접 측정한다. 용존 산소 레벨은 산소 감지기, 예를 들어 전기화학 감지기, 화학발광 감지기, 표면 플라즈몬 공명 감

지기, 적외선 감지기, 용량 결합 감지기, 염료 결합 광섬유 감지기 또는 초다중분광 감지기를 사용하여 측정할 수 있다. 용

존 산소 측정기 또는 감지기는 작업량이 많은 분석을 위해 직렬로 위치하며, 단일 시료 검출기일 수 있으며, 및/또는 사무

실 또는 심지어 집에서도 사용하기에 적당할 수 있다. 용매는 유기 용매, 예를 들어 아세톤일 수 있다. 계면활성제는 세제,

예를 들어 트윈-20과 같은 비이온성 세제일 수 있다. 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 용매는 용매/물/계면활성제 혼합물

부피 중 약 10 % 내지 90 %, 예를 들어 33 %가 일반적이다. 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 물은 용매/물/계면활성제 혼

합물의 부피 중 10 % 내지 90 %, 예를 들어 33 % 내지 67 %가 일반적이다. 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 계면활성제

(또는 세제)는 용매/물/계면활성제 혼합물 부피 중 약 0.1 % 내지 10 %이며, 물 중에 용해되어 저장될 수 있다. 하나의 특

이 실시예에서 용매/물/계면활성제의 비율은 약 1:1:1이다.

장치는 1개 이상의 프로세서, 예를 들어 검출기, 데이타 수집, 데이타 저장, 데이타를 기본으로 하는 계산 실행 및/또는 정

도 데이타베이스, 및/또는 표, 그래프, 차트 등의 형식으로 데이타의 디스플레이 또는 데이타 요약을 제어할 수 있는 컴퓨

터를 추가로 포함할 수 있다. 프로세서/컴퓨터는 또한 산소 감지기와 용매/물/세제 혼합물과 유동적으로 교류하는 유동성

시스템과 열결할 수 있으며, 심지어 제어할 수 있다. 본 발명은 공지된 대조군의 활성의 결과로서 관찰되는 산소의 상대적

인 소멸에 대한 항산화제 용량 시험을 시행한 시료의 활성 결과로부터 나온 산소의 상대적인 소멸과 관련된 곡선하면적을

측정한다. 본 발명과 여기서 기재하고 있는 방법을 사용하여 용존 산소 레벨을 동시에 친유성과 소유성 항산화제를 포함하

는 용액 중에서 직접 측정한다. AUC를 계산하기 위한 수학식의 예는 하기와 같다:

[상기 수학식 1에 있어서,

AUCSMP는 시료의 곡선하면적 값이고;

AUCBLNK는 공시료(blank)의 곡선하면적 값이며;

AUCTRIX는 트롤록스의 곡선하면적 값이고;

SMP는 시료임]

본 발명은 또한 하기의 공정을 포함하는 항산화제 활성을 직접 측정하는 방법을 포함한다: 1개 이상의 항산화제와 산소 라

디칼 표적의 존재하에 용매/물/계면활성제 혼합물 중에 용해된 시험 용액 중의 용존 산소 레벨을 측정하는 공정(수용성 및

지용성 항산화제 활성은 산소 검출기로 측정함). 용존 산소 라디칼 레벨은 산소 검출기, 예를 들어 전기화학 감지기, 화학

발광 감지기, 표면 플라즈몬 공명 감지기, 용량 결합 감지기, 염료 결합 광섬유 감지기 또는 초다중분광 감지기를 사용하여

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측정한다. 항산화제 활성은 약 37 ℃에서 측정할 수 있다. 라디칼 개시제의 예로는 예를 들어 2,2'-아조비스[2-(5-메틸-

2-이미다졸린-2-일)프로판]디히드로클로라이드, 2,2' 아조비스(2-아미디노프로판)디히드로클로라이드(AAPH), 2,2'-

아조비스(2-아미디노프로판)[2-(N-스테아릴)아미디노프로판]디히드로클로라이드(SA-1), 2,2'-아조(2-(2-이미다졸린

-2-일)-프로판)-[2-[2-(4-n-옥틸)이미다졸린-2-일]-프로판]디히드로클로라이드(C-8), 2,2'-아조비스(4-메톡시-

2,4-디메틸발레로니트린)(MeO-AMVN), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴)(AMVN), 아조-비스-이소부틸니트

릴, 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트)(DAMP), 2,2'-아조비스-(2-아미디노프로판), 이들의 염, 이들의 혼합물 및 이

들의 균등물을 포함한다. 상기 검출기는 일회용일 수 있다.

본 발명은 또한 임의의 분리 및 정제된 소유성 항산화제와 임의의 분리 및 정제된 친유성 항산화제를 포함하는 건강 보조

식품을 포함할 수 있으며, 상기의 결합된 소유성 및 친유성 항산화제는 1 g 당 6,000 uMol 트롤록스 균등물(TE) 이상의

용존 산소 값을 갖는다. 당업에 통상의 지식을 가진 자에게 상기 값은 또한 액상 균등물, 예를 들어 1 ml 당 6,000 uMol 트

롤록스 균등물(TE)로서 나타낼 수도 있다는 것을 알 수 있다. 소유성 및 친유성 항산화제는 지효성(time-released)이며,

알파 토코페롤, 베타 토코페놀, 델타 토코페롤, 엡실론 토코페롤, 감마 토코페롤, 제타 토코페롤, 에타 토코페롤, 크시1 토

코페롤, 크시2 토코페롤, 시그마 토코페롤, 알파 토코트리에놀, 베타 토코트리에놀, 델타 토코트리에놀, 감마 토코트리에

놀, 이들의 유사체(analog), 이들의 약학적 허용 염 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 비타민

E를 포함할 수 있다. 친유성 항산화제의 예로는 퀘르세틴(quercetin), 캠프페롤(kaempferol), 미리세틴(myricetin), 에피

제닌(apigenin), 이들의 유도체, 이들의 유사체, 이들의 약학적 허용 염 및 이들의 배합물을 포함한다.

임의의 분리 및 정제된 소유성 항산화제와 임의의 분리 및 정제된 친유성 항산화제를 포함하는 건강 보조 식품은 또한 2개

이상의 필수 사카라이드, 예를 들어 갈락토스, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 만노스, 아세틸화-만노스, N-아세틸뉴

라민산, 푸코스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민 및/또는 크실로스를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서 보

조 식품은 또한 비타민 C의 공급원, 예를 들어 오스트레일리아 부시 플럼(Australian bush plum; Terminalia

ferdinandiana)과 같은 천연이며 생물학적으로 이용가능한 비타민 C를 다량 포함하는 식물 공급원을 포함한다. 또 다른

특이 실시양태에서, 비타민 C는 야생-오스트레일리아 부시 플럼(wild-Australian bush plum; Terminalia

ferdinandiana)과 같은 비타민 C의 식물 공급원으로부터의 항산화제 활성의 강화제이며, 상기 야생-오스트레일리아 부시

플럼은 농장에서 재배되는 부시 플럼 보다 더 많은 양의 비타민 C를 포함한다. 보조 식품은 또한 1개 이상의 생균제(pro-

biotics), 예를 들어 락토바실러스 종(Latobacillus sp.) 및 비피도박테리움 종(Bifidobacterium sp.)을 포함할 수 있다. 보

조 식품은 롤러 압착 입자(roller-compressed particle), 캡슐, 정제, 미니 정제(mini-tab), 캐플릿(caplet), 발포성 정제

(effervescent tablet) 및 이들의 조합으로 통상적인 산소 불투과 면(oxygen impermeable surface)을 제공하기 위해 압

착될 수 있다.

상기에서 기재하고 있는 ORAC(o) 장치 및 방법을 비교하면 분리 및 정제된 친유성 및 소유성 항산화제는 1 g 당 7000

uMol 트롤록스 균등물(TE) 이상의 항산화제 ORAC(fl-lipo)를 가질 것이다. 본 발명은 본 발명의 항산화제를 포함하는 항

산화제/당영양소 혼련물을 음식물을 통해 섭취한 각각의 사람들의 항산화제 레벨 의 변화를 측정하기 위해 개방형 임상 실

험(open label study)을 하였다. 환자에게 제공하면 소유성 및 친유성 항산화제는 누적 환자 모집단의 평균 기본 항산화제

레벨에서 ORAC(β-PE)를 측정하여 13 % 이상의 평균 증가를 보인다.

본 발명은 또한 많은 조성물을 포함한다. 여기서 밝히는 조성물은 각각의 성분으로부터 기대되는 것 이상으로 측정가능한

활성을 갖는 친유성 및 소유성 항산화제를 결합시킬 수 없는 유용한 건강 보조 식품을 기본으로 한다. 본 발명의 장치와 방

법을 사용하여 본 발명자들은 친유성 및 소유성 항산화제 뿐만아니라 항산화제 활성 강화제를 첨가할 수도 있는 상승 작용

의 배합물을 개발할 수 있었다.

퀘르세틴과 같은 플라보노이드는 최근에 유전자의 항산화제 반응성 요소를 통해서 글루타치온 합성 중에 율속 효소(rate-

limiting enzyme), 감마-글루타밀시스테인 합성 효소의 중 하위단위의 전사를 증가시키는 것으로 나타났다. 증가된 전사

는 이후에 조직 배양 세포 중의 환원 (활성) 글루타치온의 증가된 세포내 레벨를 번역한다. 퀘르세틴은 레드 와인, 포도 껍

질 및 양파의 주요 성분이다. 레드 와인, 포도 껍질 및 양파로부터의 퀘르세틴를 연구하여 건강에 매우 유익한 효과를 준다

를 것을 알았다. 퀘르세틴은 사람에게 흡수가 잘 되는 것으로 알려져 있다. 소화되는 모든 퀘르세틴은 식사를 한 후 2 시간

안에 대사된다는 것이 한 연구에 의해서 밝혀졌다(European Research on Functional Effects of Dietary Antioxidants,

September 25-28, 2002, Cambridge, UK). 적당한 양의 레드 와인을 마신 사람에게서 LDL 산화가 실질적으로 감소된

것을 발견함으로써 연구원들은 퀘르세틴의 활성과 이의 대사에 보호 효과(protective effect)가 있을 것으로 추정할 수 있

다고 주장했다. 퀘르세틴은 또한 적혈구의 안정성을 강화시키는 것으로 밝혀졌다.

산화성 스트레스(oxidative stress)에 영향을 미치는 요소가 매우 많고 다양하기 때문에 개인마다 다른 요구사항과 화학적

성질에 맞춘 항산화제 보조 식품이 필요하다는 것을 본 발명으로 확인하였다. 또한 각 개인마다 다른 요구 사항을 맞추기

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위해 토코페롤 배합물도 필요하다는 것을 확인하였다. 토코페롤 배합물은 몇몇의 항산화제가 몸에서 "선택적(selected)"

이기 때문에 필요하다. 예를 들어 북쪽 미국인 음식물에 우세한 비타민 E 제형은 대두와 옥수수로부터 유도된 생성물 뿐만

아니라 식물성 오일 중에 일반적으로 발견되는 감마-토코페롤이다. 그러나 몸은 알파-토코페롤을 우세하게 보유한다. 알

파-토코페롤 전달 단백질(alpha-tocopherol transfer protein)에 편향된 특이적인 방법은 몸에서 알파-토코페롤의 농도

를 조절하기 위한 것으로 확인되었다. 종래 문헌의 항산화제 조성물과 같지 않게 본 발명은 혼합 토코페롤을 사용하여 각

제형의 최적 양을 선택, 보유 및 사용할 수 있는 여러 제형의 비타민 E를 몸에 제공한다. 또한 퀘르세틴과 혼합 토코페롤의

상승 작용 배합으로 각 개인의 요구 사항을 기본으로 상이한 항산화제 영양분을 최적으로 선택할 수 있는 다양한 세트를

몸에 제공한다.

본 발명자들은 상기 항산화제의 활성을 강화하는데 도움을 주는 화합물을 첨가함으로써 상승 작용의 퀘르세틴과 혼합 토

코페롤의 활성을 추가로 최대화시키는 것을 찾았다. 이러한 강화제 중의 하나는 비타민 C이다. 비타민 C는 다수의 비항산

화제 영양 작용성 뿐만 아니라 영양 작용성에 기여하는 현저한 항산화제 활성을 갖는다. 특히 전이 금속(transition metal)

의 존재하에 비타민 C의 산화 촉진(pro-oxidant) 특성에 많은 영향을 미친다. 비타민 C의 산화 촉진 특성은 전적으로 파

괴적인 것은 아니다. 그러나 다른 연구자들은 비타민 C가 비결합 금속(unbound metal)의 존재하에서도 항산화제 특성을

갖는 것을 발견하였다고 주장한다.

항산화제 활성의 기타 강화제는 천연 추출물, 예를 들어 포도씨 추출물과 그린티 추출물을 포함한다. 하나의 연구를 보면

그린티는 생체외에서 잠재적인 항균성 활성을 나타내며 쥐의 결장에서 발암 물질 유도 종양전 병변의 발생을 억제한다. 그

린티는 또한 장에서의 폴립 형성을 현저하게 억제한다. 따라서 본 발명자들은 천연 공급원, 예컨대 퀘르세틴과 혼합 토코

페롤로부터 정제 및 분리된 항산화제의 상승 작용 배합물을 결합시킬 뿐만 아니라 추가로 상기 제제의 검출가능한 항산화

제 활성을 증가시키는 강화제를 첨가하였다.

보다 구체적으로 조성물은 영양적으로 유효한 양의 2개 이상의 필수 사카라이드; 분리 및 정제된 소유성 산소-라디칼 퀸

처(quencher); 및 분리 및 정제된 친유성 산소-라디칼 퀸처를 포함하는 식이 보조 식품을 포함하며, 상기 결합된 친유성

및 소유성 산소-라디칼 퀸처는 1 g 당 6,000 uMol 트롤록스 균등물(TE) 이상의 산소-라디칼 퀸처 값을 갖는다. 하나의

분석에서 환자에게 제공되는 경우의 소유성 및 친유성 산소-라디칼 퀸처는 환자 집단의 기본 항산화제 레벨에서 ORAC

(fl-lipo)로 측정하여 13 % 이상으로 평균적으로 증가한다. 소유성 및 친유성 산소-라디칼 퀸처는 서방형(extended-

release)으로 포장하며, 알파 토코페롤, 베타 토코페롤, 델타 토코페롤, 엡실론 토코페롤, 감마 토코페롤, 제타 토코페롤,

에타 토코페롤, 크시1 토코페롤, 크시2 토코페롤, 시그마 토코페롤, 알파 토코트리에놀, 베타 토코트리에놀, 델타 토코트리

에놀, 감마 토코트리에놀, 이들의 유사체, 이들의 약학적 허용 염 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개

이상의 비타민 E를 포함한다. 친유성 산소-라디칼 퀸처는 플라보놀, 퀘르세틴, 캠프페롤, 미리세틴, 에피제닌, 이들의 유

도체, 이들의 유사체, 이들의 약학적 허용 염 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 1개 이상 포함할 수

있다. 보조 식품은 추가로 갈락토스, 글루코스, 만노스, N-아세틸뉴라민산, 푸코스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루

코사민, 크실로스, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 이들의 약학적 허용 염 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되

는 2개 이상의 사카라이드를 추가로 포함할 수 있다.

도면의 간단한 설명

본 발명의 특성과 잇점을 보다 확실하게 이해하기 위해서 하기의 설명과 같은 첨부된 도면과 함께 참고하여 본 발명의 상

세한 설명을 설명하였다:

도 1은 ORAC(o) 직접 항산화제 장치를 묘사한 것이며;

도 2는 본 발명의 ORAC(o) 방법의 흐름도이고;

도 3은 각각 산소 라디칼 표적으로서 리놀레산 또는 플루오레신, 및 대조군으로서 트롤록스, 개시제로서 AAPH를 사용한

ORAC(fl)(플루오레신) 측정과 ORAC(o)(산소 퍼센트) 중의 공시료 용액을 비교한 2개의 그래프이며;

도 4는 각각 산소 라디칼 표적으로서 리놀레산 또는 플루오레신, 및 대조군으로서 트롤록스, 개시제로서 AAPH를 사용하

는 ORAC(fl)(플루오레신) 측정과 ORAC(o)(산소 퍼센트) 중의 항산화제 대조군 트롤록스를 비교한 2개의 그래프이고;

도 5는 각각 산소 라디칼 표적으로서 리놀레산 또는 플루오레신, 및 대조군으로서 트롤록스, 개시제로서 AAPH를 사용하

는 ORAC(fl)(플루오레신) 측정과 ORAC(o)(산소 퍼센트) 중의 공시료 용액, 대조군 및 시료를 비교한 2개의 그래프이며;

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도 6은 본 발명의 ORAC(o) 방법에 의해 측정한 10 ug/mL의 농도에서 각각의 성분을 분리하여 비교함으로써 5 ug/mL의

혼합 토코페롤(MT)와 5 ug/mL의 퀘르세틴(Q) 배합물의 항산화제 효과를 보여주는 그래프이고;

도 7은 본 발명의 ORAC(o) 방법에 의해 대조군으로서 측정한 트롤록스와 5 ug/mL의 혼합 토코페롤(MT)과 5 ug/mL의

퀘르세틴(Q) 배합물의 항산화제 효과를 보여주는 그래프이며;

도 8은 항산화제 용량을 측정하기 위해 ORAC(o)를 사용하여 퀘르세틴과 혼합 토코페롤의 적정 비율로부터 수득된 곡선

하면적(AUC)의 그래프이고;

도 9는 퀘르세틴과 혼합 토코페롤을 적정함으로써 기대되는 결과와 비교하여 선 위에 검출된 상승 작용 정도와 기대되는

결과(선)를 설명하는 항산화제 용량을 측정하기 위해 ORAC(o) 방법을 사용하여 퀘르세틴과 혼합 토코페롤의 적정 비율로

부터 수득된 AUC의 또 다른 그래프이며;

도 10은 49.18 % 퀘르세틴, 32.79 % 혼합 토코페롤 및 1.64 % 부시 플럼의 존재하에 포도 껍질 추출물과 그린티 추출물

을 다양한 비율(포도 껍질 추출물 대 그린티 추출물의 최적의 비율은 60/40 내지 80/20임)로 ORAC(o) 분석하여 수득된

결과를 보여주는 그래프이고;

도 11은 10 ug/mL의 농도에서 각 성분을 분리 비교함으로써 5 ug/mL의 혼합토코페롤(MT)과 5 ug/mL의 퀘르세틴(Q)의

배합물의 ORAC(fl) 결과를 나타내는 그래프이며;

도 12는 아세톤:물 중에 용해된 퀘르세틴 대 α-토코페롤를 적정하여 측정한 ORAC(fl) 분석의 결과 그래프이고;

도 13은 용매:물:세제 혼합물 중에 용해된 퀘르세틴:α-토코페롤 비율의 고정 비율에 있어서 측정된 항산화제 활성을 측정

한 ORAC(fl) 분석 결과 그래프이며;

도 14는 용매:물 대 세제 혼합물의 2개의 상이한 비율 중에 용해된 퀘르세틴:α-토코페롤 비율의 고정 비율에 있어서 측정

된 항산화제 활성을 측정한 ORAC(fl) 분석 결과 그래프이고;

도 15는 퀘르세틴 및 혼합 토코페롤의 비율을 다르게 하여 수득된 ORAC(o) 값을 보여주는 그래프이며;

도 16은 포도씨 추출물과 그린티 추출물의 비율을 다르게 하여 수득된 ORAC(o) 값을 보여주는 그래프이고;

도 17은 최대의 퀘르세틴:혼합 토코페롤 및 포도씨 추출물과 그린티 추출물 배합물의 ORAC(o) 값을 보여주는 그래피이

다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 다양한 실시양태를 제조하고 사용하는 것을 하기에 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 광범위하고 다양한 특이

내용을 포함할 수 있는 응용가능한 많은 창의적인 개념을 제공한다는 것을 인식해야 한다. 여기서 설명하는 특이 실시양태

는 주로 본 발명을 구성하고 사용하는 특이 방법을 설명하며 본 발명의 범주를 이에 제한하지는 않는다.

본 발명의 이해를 돕기 위해서 여러 가지 용어를 하기에 설명하였다. 여기서 규정하는 용어는 본 발명과 관련된 분야에 통

상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것을 의미한다. "a", "an" 및 "the"라는 용어는 단지 하나를 나타내는 것을

의미하지는 않지만 설명을 위해 특이 예를 사용할 수 있는 일반적인 부류를 포함한다. 여기서의 용어는 본 발명의 특이 실

시양태를 설명하기 위해서 사용하였지만 이들의 용도는 청구항에서 명시하는 것을 제외하고 본 발명을 제한하지는 않는

다.

본 발명은 어느 정도 2개의 서로 배타적인 범주의 항산화제를 인공적으로 제조하며 이것을 분리하여 측정하는 것을 기본

으로 한다. 또한 본 발명은 기록 분자를 사용하여 간접적으로 라디칼의 존재를 측정하는 것이 일반적이다. 본 발명은 동시

에 시료의 총 항산화제 용량을 직접적으로 검출하는 장치와 방법을 제공한다.

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여기서 사용하는 "항산화제(antioxidant)"라는 용어는 산화성 표적 분자의 산화를 지연하거나 또는 방지하는 임의의 분자

를 나타낸다. 항산화제는 중요한 반응성 유리 라디칼 또는 기타 반응성 산소 종류(예를 들어 O2, H2O2, HOCl, 페릴, 퍼옥

실, 퍼옥시니트릴 및 알콕실)를 생물학적으로 스캐빈징(scavenging)하고; 산소 라디칼 형성을 방지하며; 또는 유리 라디칼

또는 기타 반응성 산소 종류를 반응성이 적은 종류로 촉매적으로 전환시키는 작용을 한다. 항산화제를 2개의 부류로 나누

는 것이 일반적이다: (1) 지질(친유성 또는 소수성) 항산화제; 및 (2) 수성(소유성 또는 친수성) 항산화제. 지질 항산화제의

예로는 이에 제한하지는 않지만 중심 지질 부분에 위치하는 카로티노이드(예를 들어 루테인, 제아잔틴, β-크립토잔틴, 라

이코펜, α-카로틴 및 β-카로틴), 및 지질 부분의 중간면에 위치하는 토코페롤(예를 들어 비타민 E, α-토코페롤, γ-토코페

롤 및 δ-토코페롤) 및 레티노이드(예를 들어 비타민 A, 레티놀 및 레티닐 팔미테이트) 및 지용성 폴리페놀, 예를 들어 퀘르

세틴을 포함한다. 수성 항산화제의 예로는 이에 제한하지는 않지만 아스코르브산 및 이의 산화 형태, "디하이드로아스코르

브산(dehydroascorbic acid)", 요산 및 이의 산화 형태 "알란토인(allantoin)", 빌리루빈, 알부민 및 비타민 C 및 수용성 폴

리페놀, 예컨대 카데킨(인지질 막과 친화력인 높음), 이소플라본 및 프로시아니딘을 포함한다.

산소 라디칼과 항산화제 용량의 상대 레벨을 검출하기 위해 일반적으로 사용하는 방법은 산소 라디칼 흡광도 용량(ORAC)

분석 방법이다. 공지된 ORAC-형태 분석 방법에서 항산화제 값은 특정 산소 라디칼에 의해 산화하기에 양호한 표적이 아

닐 수 있는 산소 라디칼, 예를 들어 플루오레신 또는 기타 검출가능한 분자의 효과를 측정하기 위해 간접적으로 측정한다.

일반적으로 항산화제를 시험 시료에 첨가하는 경우, 초산화물과 같은 유리 라디칼 또는 과산화수소와 같은 비라디칼 반응

성 산소 종류의 양의 검출가능한 감소가 항산화제로 처리되지 않은 시료(예를 들어 대조 시료)와 비교하여 시료중에 나타

날 수 있다. 그러나 상기와 같은 간접적인 방법은 매개제 상의 라디칼 효과가 산화제와 항산화제의 상대 레벨의 진정한 반

영이라는 것을 가정하여 측정된 매개제(예를 들어 플루오레신, β-피토에리트린(β-PE) 등)를 경유하여 항산화제 상태의

변화를 기록한다. 상기 분석 방법의 대조군은 산소 라디칼 발생제의 알려진 농도이며, 시료를 위한 대조군으로서 사용되며

측정되는 항산화제로 공지되어 있다.

여기서 사용되는 "유리 라디칼(free radical)"이라는 용어는 1개 이상의 짝이 없는 전자를 함유하는 분자를 나타낸다. 대부

분의 분자들은 짝수의 전자를 함유하며, 이들의 공유 결합은 공유하는 전자쌍을 포함하는 것이 일반적이다. 상기 결합의

분해(cleavage)로 2개의 분리된 유리 라디칼이 생성되며, 각각은 (짝이 있는 전자에 더하여) 짝이 없는 전자를 갖는다. 전

기적으로 충전되거나 또는 중성화되는 유리 라디칼은 반응성이 높고 생이 짧은 것이 일반적이다. 유리 라디칼은 짝이 없는

전자 또는 다른 유리 라디칼과 결합한다. 완전한 분자와의 반응에서 유리 라디칼은 자체의 전자 구조를 완성하려고 시도하

여 사슬 반응을 만드는 기타 분자와 함께 반응하는 새로운 라디칼을 발생시킨다. 유리 라디칼 사슬 반응은 특히 고온에서

물질의 분해와 중합 반응에 중요하다. 몸속에서 산화 유리 라디칼은 조직 손상의 원인을 제공한다. 열, 자외선 및 이온화

방사선 모두는 유리 라디칼을 발생한다. 유리 라디칼은 산화성 기작의 2차 효과로서 발생된다. 초과 유리 라디칼은 천연

보호 효소, 예컨대 슈퍼옥사이드 디스무타제, 카탈라아제 및 퍼옥시다아제를 전멸시킬 수 있다. 유리 라디칼, 예컨대 과산

화수소(H2O2), 히드록실 라디칼(HO˙), 일중항 산소(1O2), 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(O˙2-), 질소 옥사이드 라디칼

(NO˙), 퍼옥실 라디칼(ROO˙), 과산화질소(ONOO-)는 지질 또는 수성 부분 중에 있을 수 있다. 항산화제 영양소(예를 들어

비타민 C, 비타민 E, 셀레늄, 폴리페놀)은 이러한 효과를 감소시킬 수 있다.

여기서 사용하는 "지질 부분(lipid compartment)"라는 문구는 환형 또는 비환형 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체,

예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데하이드를 갖는 화합물을 나타낸다. 예를 들어 일반적인 지질은 지방산, 지

방, 인지질, 스테로이드, 에이코사노이드, 왁스 및 지용성 비타민을 포함한다. 몇몇 지질은 단순 지질과 복합 지질과 같이 2

개의 군으로 분류하는 것이 일반적이며, 예를 들어 트리글리세라이드 또는 지방 및 오일, 글리세롤의 지방산 에스테르, 왁

스, 장쇄 알콜 및 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤과 에르고스테롤의 지방산 에스테르이다. 복합 지질은 예를 들어 포스파

티드 또는 포스포리피드(인 함유 지질), 당지질(카르보하이드레이트 함유 지질) 및 스핀고지질(스핀고신 함유 지질)을 포

함한다.

여기서 사용하는 "지질(lipid)"이라는 용어는 지방 또는 지방 유사 물질을 포함한다. 화학 이름, 예컨대 단백질 또는 카르보

하이드레이트 보다 오히려 상기 용어를 사용한다. 지질은 진짜 지방(즉 지방산과 글리세롤의 에스테르), 리포이드(즉, 포스

포리피드, 세레브로사이드, 왁스) 및 스테롤(즉, 콜레스테롤, 에르고스트롤)을 포함한다. 지질은 항산화와 같은 기작을 통

한 산화 표적일 수 있다. 여기서 사용하는 "지방산(fatty acid)"이라는 용어는 예를 들어 음전기로 충전되어 있고 일반적으

로 선형인 탄화수소 사슬의 군을 나타낸다. 지방산의 탄화수소 사슬은 길이와 산화 상태가 다양하다. 일반적으로 지방산은

음전기로 충전된 부분(예를 들어 카르복실 말단에서)을 갖고, 지방산의 수용해도와 양쪽 친매성 특성을 결정하는 "꼬리

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(tail)" 부분을 갖는다. 예를 들어 지방산은 세포 내부에 에너지를 저장하기 위해 사용되거나 또는 혈액흐름 중에 지방을 운

반하기 위한 지방으로서 생물학적인 막을 포함하는 인지질 성분이다. 여기서 사용하는 "인지질(phospholipid)"라는 용어

는 지방산, 알콜 및 질소 염기와 같은 사이드 그룹 중 1개 이상을 포함하는 인산의 에스테르 부류이다.

여기서 사용하는 "지방(fat)" 또는 "지방들(fats)"이라는 용어는 지방산의 글리세릴 에스테르, 예를 들어 지방산의 모노아실

글리세롤, 디아실글리세롤 및 트리아실글리세롤 형태를 나타낸다. 트리글리세라이드는 중성으로 충전되고 전체적으로 소

수성, 즉 환원된 분자인 분자를 나타낸다. 모노아실글리세라이드와 디아실글리세라이드는 인지질 합성에서 대사 매개물이

며, 트리글리세라이드는 물이 없으며, 콤팩트한 상태로 화학 에너지를 저장하기 위해 사용되는 지방 분자를 형성한다. 여

기서 사용하는 "지용성 비타민(fat-soluble vitamins)"이라는 용어는 비타민 (A)(레티놀), 비타민 D[예를 들어 비타민 D3

(콜레칼시페롤)], 비타민 E, 비타민 K 등을 포함하는 통상적인 지용성 비타민을 나타낸다.

여기서 사용되는 "지질 항산화제 활성(lipid antioxidant activity)" 또는 "지질 항산화제 용량(lipid antioxidant capacity)"

이라는 표현은 서로 교환하여 사용할 수 있으며, 시료의 지질 부분으로부터 야기되는 항산화제 능력을 측정한 것을 나타낸

다. 여기서 사용하는 "수성 항산화제 활성(aqueous antioxidant activity)" 또는 "수성 항산화제 용량(aqueous

antioxidant capacity)"이라는 표현은 서로 교환하여 사용할 수 있으며, 시료의 수성 부분에서 야기되는 항산화제 능력을

측정한 것을 나타낸다. 여기서 사용하는 "총 항산화제 활성(total antioxidant activity)" 또는 "총 항산화제 용량(total

antioxidant capacity)"이라는 표현은 서로 교환하여 사용할 수 있으며, 시료의 지질과 수성 부분 둘 다에서 야기되는 항산

화제 능력을 측정한 것을 나타낸다.

여기서 사용하는 "수성 부분(aqueous compartment)"이라는 표현은 지질 부분과 상호작용하지 않는 유동 시료 부분을 나

타낸다. 수성 부분은 생물액 시료, 예를 들어 혈액, 플라즈마, 세럼, 배설물, 뇌척수액, 양수, 간질액, 림프액 및 활액을 포함

한다. 예를 들어 세럼과 같은 액상 시료의 수성 부분은 혈액을 응고시고, 혈액 세포를 제거하기 위해 원심분리 한 후 남아

있는 액상 부분 뿐만 아니라 기타 화합물, 예컨대 단백질, 예를 들어 알부민과 글로부린; 항체; 효소; 소량의 영양 유질, 예

컨대 아미노산과 글루코스; 무기 물질, 예컨대 나트륨, 클로라이드, 설페이트, 포스페이트, 칼슘, 칼륨, 비카르보네이트, 마

그네슘, 요오드, 아연 및 철; 소량의 폐기생성물, 예컨대 요소, 요산, 크산틴, 크레아티닌, 크레아틴, 담즙 색소 및 암모니아;

및 극소량의 기체, 예컨대 산소와 이산화탄소도 포함할 수 있다. 액상 시료는 또한 비생물학적 시료, 예를 들어 화학 제제,

합성 조성물 또는 식품 및 화장품일 수 있다.

여기서 사용하는 "시료(sample)"라는 용어는 액상 또는 유동 생물학적 시료, 또는 고형 생물학적 시료를 나타내며, 상기

시료들 중에 유리 라디칼 발생제(예를 들어 친유성 유리 라디칼 발생제 또는 소유성 유리 라디칼 발생제)를 사용하면 유리

라디칼이 발생될 수 있으며, 본 발명의 방법과 (ORAC(o)) 검출기를 사용하여 검출할 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들어

혈액, 플라즈마, 세럼, 뇌척수액, 소변, 양수, 간질액 및 활액을 포함한다. 고형 생물학적 시료는 예를 들어 조직, 세포, 조직

배양물, 고정 세포, 세포 현탁액 또는 조직 또는 세포 물질 부분(또는 추출물)을 포함한다. 상기 용어의 시료는 또한 비생물

학적 시료, 예컨대 화학 용액, 합성 조성물 및 식품을 포함한다. 여기서 사용하는 "상대적(relative) ORAC(o)" 및 "ORAC

(o)"라는 용어는 동일한 값을 나타내며, 1 g 당 또는 1 ml 당의 트롤록스의 마이크로몰과의 균등물로 측정한다. 마이너스

값의 ORAC(o)는 조성물이 항산화제로서 활성을 갖는 것 보다는 산화를 촉진시키는 전산화제(pro-oxidant)를 나타내는

공시료로 수득된 활성 보다 라디칼 퀸칭 활성이 적다는 것을 반영한다.

여기서 사용하는 "라디칼 발생제(radical generator)" 또는 "라디칼 개시제(radical initiator)"라는 용어는 서로 교환하여

사용할 수 있으며, 유리 라디칼을 생성하는 제제, 화합물 또는 분자를 나타낸다. 라디칼 발생제는 예를 들어 항산화제 또는

산화성 지시제가 측정가능하거나 또는 검출가능한 산출물을 생성하기 위해 유리 라디칼과 상호작용할 수 있는 레벨과 같

은 측정 레벨에서 유리 라디칼을 생성할 수 있다. 라디칼 발생제의 예로는 예를 들어 공지된 일정한 속도로 유리 라디칼의

유입물을 생성하는 화합물인 아조 라디칼 발생제를 포함한다. 아조 라디칼 발생제의 예로는 예를 들어 2,2'-아조비스(4-

메톡시-2,4-디메틸발레로니트릴)(MeO-AMVN), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴(AMVN), 아조-비스-이소부

틸니트릴, 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트)(DAMP) 및 2,2'-아조비스-(2-아미디노프로판), 2,2'-아조비스[2-(5-

메틸-2-이미다졸린-2일)프로판]디히드로클로라이드, 철, 아스코르브산 및 금속 이온을 포함한다.

여기서 사용하는 "대상자(subject)"라는 용어는 임의의 살아있는 유기체를 나타낸다. 상기 대상자라는 용어는 예를 들어

어류, 포유류, 파충류, 조류, 곤충 등을 포함한다. 특이적이 시료로서는 인간, 비인간 영장류, 예컨대 침팬지, 원숭이, 몽키

종류; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가축, 예컨대 개와 고양이; 마우스, 쥐 및 기니 피그와 같은 설치류를 포

함하는 실험 동물 등을 포함한다. 상기 용어는 특별한 나이 또는 성별을 나타내지는 않는다. 따라서 성인이나 새로 태어난

대상자 뿐만 아니라 태아는 성별에 상관 없이 모두를 나타낸다.

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여기서 사용하는 "유리 라디칼 관련 질환(free radical associated disorder)"이라는 표현은 유리 라디칼 생성 또는 유리

라디칼에 노출되는 병리학적 상태를 나타낸다. 여기서 사용하는 "유리 라디칼 관련 질환"이라는 용어는 질병 상태의 병리

학에 원인이 되는 유리 라디칼로 손상을 입은 병리학적 상태를 포함하며, 유리 라디칼 개시제(예를 들어 데스페리옥사민),

스캐빈저(예를 들어 토코페롤, 글루타치온) 또는 촉매(예를 들어 SOD, 카탈라아제)의 관리로 증상의 감소, 생존 증가 또는

병리적 상태를 예방하거나 또는 보호하는데 기타 검출가능한 임상적 잇점을 제공하는 검출가능한 잇점이 있음을 보여준

다. 유리 라디칼 질환의 예로는 이에 제한하지는 않지만 허혈성 재관류 손상, 염증성 질환, 전신성 홍반성 루프스, 심근경

색증, 뇌졸증, 외상성 출혈, 척수외상, 크론시병, 자가 면역 질환(예를 들어 관절염, 당뇨병), 백내장 발생, 연령관련 황반변

성, 알쯔하이머 질환, 포도막염, 폐기종, 위궤양, 산소 중독, 종양, 바람직하지 않은 세포 자살 및 방사능병을 포함한다.

여기서 사용하는 "산화성 스트레스(oxidative stress)"라는 용어는 대상자에게서 산소 유리 라디칼에 의해 야기되는 손상

의 레벨을 나타낸다. 손상 레벨은 반응성 산소 종류가 얼마나 신속하게 생성되며, 그 후에 손상이 나아지는 속도와 위치 뿐

만 아니라 항산화제에 의해 불활성화되는 것에 따라서 달라진다. 여기서 사용하며 산화성 상태와 산화성 스트레스를 서로

교환하여 사용할 수 있는 것과 같이 "벗어남(deviation)" 또는 "벗어나다(deviat)"라는 용어도 서로 교환하여 사용할 수 있

으며, 시료의 항산화제 활성의 변화를 나타낸다. 산화성 상태 중의 변화는 공지된 정상의 값에서 항산화제 활성이 증가, 감

소, 고도 또는 저하될 수 있다. 예를 들어 시료의 지질 부분, 시료의 수성 부분 또는 시료의 지질 및 수성 부분 둘 다에 항산

화제 활성의 증가 또는 감소가 있다.

여기서 사용하는 "필수 사카라이드(essential saccharides)"라는 용어는 세포 당단백질의 올리고사카라이드 사슬 중에서

모노사카라이드가 일반적으로 발견되며, 사람의 몸에 식품 또는 생화학적 제조물을 통해서 용이하게 이용할 수 없는 것을

규정하기 위해서 사용한다[예를 들어 Harper's Biochemistry(Murray et al., 1996)(참고문헌 8번)과 Principles of

Biochemistry, Vol II(Zubay, et al., 1995)(참고분헌 11번)참조]. 자연계에서는 200개 이상의 모노사카라이드가 발견되

지만 하기 11개는 포유동물 중에서 건강을 유지하기에 중요하다고 알려져 있다: 갈락토스, 글루코스, 만노스, N-아세틸뉴

라민산, 푸코스, N-아세틸칼락토사민, N-아세틸글루코사민, 크실로스, 이듀론산, 아라비노스 및 글루쿠론산. 이러한 카르

보하이드레이트의 구조는 잘 공지되어 있다[예를 들어 Stryer's Biochemistry(Stryer, 1995)와 the Merck Index, 12th

Edition, 1996 참조].

여기서 사용하는 "영양학적 유효량(nutritionally effective amount)"이라는 용어는 포유동물에서의 유리한 영양 효과 또

는 반응을 제공하는 양을 규정하기 위해서 사용한다. 예를 들어 비타민 및 미네랄 함유 건강 보조 식품에의 영양적 반응은

포유동물과 포유동물 사이에서 다양하기 때문에 각각 비타민과 미네랄의 영양 유효량을 이해해야 한다. 또한 필수 아미노

산, 비타민 C, 철, 요오드, 비타민, 미네랄, 카르보하이드레이트, 지질 등이 부족하면 생리학적 및 세포학적 작용에 영향을

줄 수 있는 것으로 알려져 있다. 여기서 밝히고 있는 항산화제와 사카라이드의 영양 유효량은 상기 영양 보조 식품에 있어

서의 이들의 식품을 늘리거나 또는 유지하는 인간의 식품 중에 이러한 중요한 영양소의 레벨을 보존하거나 및/또는 증대시

킬 수 있다. 따라서 하나의 포유동물은 규정된 양으로 존재하는 비타민과 미네랄의 특정 프로파일을 필요로할 수 있으며,

또 다른 포유동물은 상이하게 규정된 양으로 존재하는 비타민과 미네랄의 동일한 특정 프로파일을 요구할 수 있다.

여기서 사용하는 "약학적 허용 염(pharmaceutically acceptable salt)"이라는 용어는 지나친 독성, 자극, 알레르기 반응

등이 없이 인간과 하등 동물의 조직에, 조직 상에 또는 조직으로 적당한 의학 판정의 범주내의 염이며, 반응성 잇점/위험

비율(reasonable benefit/risk ratio)의 단위로 계산하는 염이다. 약학적 허용 염은 당업에 잘 공지되어 있다(예를 들어 S.

M. Berge, et al., J. Pharmaceutical Sciences, 1977, relevant portions incorporated herein by reference 참조). 적당

한 염은 본 발명의 화합물을 최종으로 분리 정제하는 도중에 제조될 수 있거나 또는 분리하여 적당한 유기산으로 유리 염

기 작용이 반응함으로써 제조될 수 있다. 대표되는 산 첨가 염은 이에 제한하지는 않지만 아세테이트, 아디페이트, 알지네

이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠 설포네이트, 비설페이트, 부티레이트, 캠포레이트, 캠포 설포네이트,

디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 하이드로클로라이드, 하

이드로브로마이드, 하이드로아이오딘, 2-히드록실에탄설포네이트(이소티오네이트), 락테이트, 말레이트, 메탄 설포네이

트, 니코티네이트, 2-나프탈렌 설포네이트, 옥살레이트, 팔미노에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트,

피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 비카르보

네이트, p-톨루엔 설포네이트 및 운데카노에이트를 포함한다. 4원화제(quaternizing agent)로서 사용되는 염기성 질소 함

유 군의 예로는 저급 알킬 할라이드(메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이트 및 요오드화물); 디알킬 설페이트

(디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 설페이트); 장쇄 할라이드(데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드

및 요오드화물); 아릴알킬 할라이드(벤질 및 페네틸 브로마이드) 등을 포함한다. 약학적 허용 산 첨가 염을 형성하기 위해

서 이용할 수 있는 산의 예로는 무기 산, 예를 들어 염화수소산, 브롬화수소산, 황산 및 인산, 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시

트르산과 같은 유기산을 포함한다. 염기성 첨가 염은 또한 암모니아 또는 유기 1차, 2차 또는 3차 아민과 함께 또는 약학적

허용 금속 양이온의 히드로옥사이드, 카르보네이트 또는 비카르보네이트와 같은 적당한 염기와 함께 여기서 기재하고 있

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는 항산화제 화합물의 최종 분리 및 정제 도중에 인시츄로 제조할 수 있다. 약학적 허용 염은 이에 제한하지는 않지만 알칼

리 금속 또는 알칼리토금속, 예컨대 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등을 기본으로 하는 양이온, 및 비

독성 4차 암모니아 및 아민 양이온(암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸암모늄, 디메틸암모늄, 트리메틸암

모늄, 트리에틸암모늄, 디에틸암모늄 및 에테르 중의 에틸암모늄을 포함함)을 포함한다. 염기 첨가 염의 형성에 유용한 기

타 대표적인 유기 아민은 에틸렌디아민, 에텐올아민, 디에탄올아민, 피퍼리딘, 피퍼라진 등을 포함한다.

여기서 사용하는 "강화제(potentiate)"라는 용어는 본 발명의 소유성 및/또는 친유성 항산화제의 활성을 직접 또는 간접적

으로 증가시키거나 또는 강화시키는 1개 이상의 제제를 나타낸다. 상기 강화제 중 하나는 비타민 C이며, 상기 비타민 C는

항산화제를 재활성 또는 재순환시킬 수 있으며, 그 자체로 현저한 항산화제 활성을 가질 수 있다. 비타민 C의 전산화제 특

성은 전이 금속의 존재하에 관찰된다. 항산화제 활성의 기타 강화제는 천연 추출물, 예컨대 포도씨 추출물과 그린티 추출

물을 포함한다. 하나의 연구에서 그린티는 생체외에서 잠재적인 항균제 활성을 나타내며, 동물 모델에서 발암 물질 유도

발암 병변의 발생을 억제한다. 상기와 같이 강화제는 천연 공급원, 예컨대 퀘르세틴 및 혼합 토코페롤로부터 정제 및 분리

된 항산화제를 강화시키거나 또는 상기 항산화제와 함께 상승 작용을 가질 수 있다.

여기서 사용하는 "당영양의(glyconutritional)" 또는 "당영양소(glyconutrient)"라는 용어는 세포와 세포 사이의 교류(즉,

사이토카인, 성장요소 등)를 활성화시키거나 또는 세포 막(즉, 수용체 부위, 이온 운반 채널, 항원 규명 등)의 특이적 분자

활성이 높은 병소를 포함하는 분자 구조를 구성하는 세포간 세포 유동체 중에 없을 수 있는 신호 분자와 교류의 다양한 부

류를 생화학적으로 합성하기에 필수적이며 천연에서 합성되는 착체 카르보하이드레이트 또는 사카라이드 또는 간단한 당

을 나타낸다.

여기서 사용하는 "피토뉴투리셔널(phytonutritional)" 또는 "피토뉴트리언트(phytonutrient)"라는 용어는 식물의 세포를

보호하기 위해 생성되는 식물 중에서만 발견되는 천연 합성 분자에 관한 것이다. 피토뉴트리언트는 일차로 항산화제, 유리

라디칼 스케빈저 및 생체 미량영양소 활성을 갖는다. 건강 식품 보조제를 통해 공급되는 상기 분자들은 천연 식물 조직에

서 발견되며, 종피(seed coat)와 씨 주위에 둘러쌓여 있는 열매 조직(fruiting tissue) 중에 대부분이 농축되어 있다. 포유

동물 조직에서 음식물로 공급되는 경우 상기 분자들은 세포 미세환경 중에 생화학, 면역학 및 생리학적으로 최적의 활성을

갖는다.

여기서 사용하는 "식물 추출물(plant extract)" 및 "약초 추출물(herbal extract)"이라는 용어는 식물 조직 중에서 생성되

고, 물, 극성을 갖는 용매 또는 석유 용매에 의해 추출될 수 있으며, 건강에 유리하거나 또는 치료 활성이 있는 양으로 피토

케미컬을 나타내는 것으로 서로 교환하여 사용할 수 있다. 대부분의 약초 추출물은 특히 농축하는 경우에 독성이 있을 수

있으며, "건강을 증진시키고 질병을 치료하기 위한 민간 약초"로서 습포 및 차로 이들의 보다 전통적인 방법으로 이용하는

경우에 보다 안정한 것이 일반적이다. 여기서 사용하는 "약초 바디 조율제(herbal body-toning agent)"라는 용어는 주름,

처짐, 과색소침착 및 손상된 외모의 기타 바람직하지 않은 요소의 반전를 효과적으로 감소 또는 제거시키는 팽창의 회복

및 탄력성에 의해 입증되는 것과 같이 노화 또는 태양 손상에 의해 야기되는 탄성 조직 및 콜라겐 섬유 손상을 감소시키고

회복시키기 위해 발명자들이 발견한 물질을 나타낸다.

본 발명의 건강 보조 식품에 포함되는 카르보하이드레이트는 광범위하게 다양한 관목, 나무, 식물, 효모, 균, 곰팡이, 검, 레

진, 스타치 및 셀룰로스 유도체 및 천연 뮤신 공급원와 같은 천연 및 합성 공급원으로부터 이용가능하다. 특히 몇가지의 천

연 공급원은 하기를 포함한다: (a) 아카시아, 카라야(karaya), 트라가칸스(tragacanth) 또는 가티(ghatti)를 함유하는 관목

또는 나무 삼출물(shrub or tree exudates); (b) 한천, 알긴 또는 카라기난을 포함하는 마린 검(marine gum); (c) 구아, 로

커스 빈 또는 실리움(psyllium)을 포함하는 시드 검; (d) 펙틴 또는 아세틸화 폴리만노스를 함유하는 식물 추출물; (e) 스타

치 및 셀룰로스 유도체, 예컨대 헤타스타치, 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸

셀룰로스, 산화 셀룰로스; 및 덱스트란, 잔탄을 함유하는 미생물 검. 그러나 본 발명의 조성물은 각각의 카르보하이드레이

트가 수득되는 공급원으로 제한하지 않는다는 것을 알아야 한다.

본 발명의 사카라이드는 모노사카라이드, 올리고사카라이드 및/또는 폴리사카라이드로서 자연계에서 발견할 수 있다. 따

라서 본 발명의 조성물은 이들의 모노머, 올리고머 및/또는 폴리머 형태 중에 사카라이드를 함유할 수 있다. 여기서 참고문

헌으로서 병합하고 있는 미국 특허 제 US2003072770를 참조하면 사카라이드와 이의 용도에 있어서의 공지된 천연 공급

원의 목록이 기재되어 있다.

여기서 사용하는 "카르보하이드레이트(carbohydrate)"라는 용어는 카르보하이드레이트 화학 분야에 통상의 지식을 가진

자에게 잘 공지되어 있는 "사카라이드", "폴리사카라이드", "올리고사카라이드" 및 "당"이라는 용어와 서로 교환하여 사용

할 수 있다. 본 발명의 조성물이 2개 이상의 필수 사카라이드를 포함하는 경향이 있지만, 사카라이드는 모노사카라이드,

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올리고사카라이드 및/또는 폴리사카라이드 형태일 수 있으며, 예를 들어 검 트라가칸트와 구아 검을 함유하는 조성물은 갈

락투론산, 시알산, 만노스 및 갈락토스를 함유하는 것으로 간주할 것이다. 따라서 주어지는 건강 식품 보조제에 특정 검의

양을 조절함으로써 건강 보조 식품 중에 각각의 사카라이드의 양을 조절할 수 있다.

여기서 사용하는 "2개 이상의 제형의 비타민 E 혼합물(a mixture of at least two forms of vitamin E)"이라는 용어는 알

파 토코페롤, 베타 토코페롤, 델타 토코페롤, 엡실론 토코페롤, 감마 토코페롤, 제타 토코페롤, 에타 토코페롤, 크시1 토코

페롤, 크시2 토코페롤, 시그마 토코페롤, 알파 토코트리에놀, 베타 토코트리에놀, 델타 토코트리에놀, 감마 토코트리에놀,

이들의 배합물 또는 이들의 유도체의 2개 이상의 제형의 혼합물을 설명하기 위해 사용한다. 하나의 실시양태에서 "2개 이

상의 제형의 비타민 E 혼합물(a mixture of at least two forms of vitamin E)"은 알파 토코페롤, 베타 토코페롤, 델타 토

코페롤 및 감마 토코페롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 제형의 토코페롤의 혼합물이다. 또 다른 실시양태

에서 "2개 이상의 제형의 비타민 E 혼합물(a mixture of at least two forms of vitamin E)"은 Henkel Corporation 또는

Cognis Corporation(Kankakee, IL)의 Spain, SA, VITAECAPS에서 수득할 수 있다. COVITOL(상표명) F-350M은

Cognis에서 시판하고 있으며, 식용가능한 식물 오일로부터 수득되는 혼합 토코페롤과 천연 공급원 알파-토코페롤를 함유

한다. 본 발명의 항산화제 조성물에 포함되는 토코페롤의 특정 혼합물은 ORAC(o) 항산화제를 측정함으로써 결정한다.

토코페롤의 유도체 또는 염은 약학적 허용 염, 예컨대 아세테이트, 설페이트, 숙시네이트, 니코티네이트, 알로파네이트, 포

스페이트, 퀴논 또는 할로겐화 유도체; 에스테르; 입체이성질체 등을 포함한다. 본 발명은 유도체가 비타민 E의 항산화제

활성을 유지하는 것을 조건으로 치환, 첨가 및 기타 대안이 6-크로마놀 고리 및/또는 측쇄로 만들어지는 비타민 E 유도체

를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어 토코페롤과 이들의 유도체는 알킬기, 이중 결합 및 기타 치환물의 수와 위치, 및 고

리와 측쇄의 다양성에 의해서 다양할 수 있다. "알킬(alkyl)"은 단지 탄소와 수소, 예컨대 메틸, 부틸 및 옥틸을 함유하는 환

형, 분지쇄형 또는 직쇄형 사슬 화학기이다. 알킬기는 1개 이상의 치환물, 예를 들어 할로겐, 알콕시, 아실록시, 아미노, 히

드록실, 머캅토, 카르복시 또는 벤질로 치환되거나 또는 치환되지 않을 수 있다. 알킬기는 1개 이상의 위치가 포화되거나

또는 불포화될 수 있다. 통상적인 알킬기는 1개 내지 8개의 탄소, 1개 내지 6개의 탄소, 또는 1개 내지 4개의 탄소 원자를

포함할 것이다. 추가의 토코페롤은 고리 구조 또는 다양한 다른 부분, 예컨대 산소, 질소, 황 및/또는 인을 함유하는 측쇄에

콘쥬게이트됨으로써 구성될 수 있다. 토코페롤 유도체는 또한 알파 토코페롤, 베타 토코페롤, 델타 토코페롤 및 감마 토코

페롤과 같은 전형 토코페롤에서 발견되는 측쇄의 길이를 변형시킴으로써 만들어질 수 있다. 토코페롤은 또한 고리 구조와

측쇄 중의 결합의 포화와 입체화학이 다양할 수 있다.

프로드러그를 포함하는 추가의 토코페롤 유도체는 측쇄 또는 고리 구조에 당 또는 다른 부분의 콘쥬게이트화에 의해서 제

조될 수 있다. 혼합 토코페롤은 단일 토코페롤(예를 들어 알파-토코페롤의 +와 - 입체이성체; (+/-)는 라세미 혼합물을

나타냄) 또는 구조적으로 별개의 토코페롤(예를 들어 알파 토코페롤 + 감마 토코페롤)의 혼합물의 입체이성체의 혼합물에

제한이 없다.

본 발명은 상기에서 언급한 11개의 필수 사카라이드를 포함하지만, 기타 사카라이드, 영양 화합물 또는 생물학적 활성 또

는 불활성 화합물도 본 발명의 건강 보조 식품에 포함될 수 있다는 것을 알아야 한다. 상기 기타 영양 화합물은 1개 이상의

피토뉴트리언트, 디오스콜레아 착체, 식물 추출물, 약초 추출물, 식물 부분, 약초 성분, 비타민 또는 미네랄을 1개 이상 포

함한다. 이러한 영양소 화합물은 본 발명의 건강 보조 식품에 첨가할 수 있거나, 또는 건강 보조 식품으로 관리하는 포유동

물에게 별계로 제공할 수도 있다. 예를 들어 본 발명의 당영양소 함유 알약을 섭취한 사람은 또한 동일한 알약 또는 개별

알약으로 피토뉴트리언트도 섭취할 수 있다. 불활성 화합물은 향, 충전제, 윤활제, 완충액, 겔, 결합제, 부형제, 담체 및/또

는 기타 화합물(본 발명의 건강 보조 식품의 제제화 또는 투여를 촉진시킴)을 포함할 수 있다. 본 발명의 당영양소 함유 건

강 보조 식품 조성물 모두, 심지어 추가 화합물, 제제 또는 기타 물질을 함유하는 것은 Mannatech, Inc.(Coppell, Tex.)에

서 직접 구입할 수 있다.

본 발명은 소수성 및/또는 친수성 항산화제를 포함하는 조성물의 산소 라디칼 흡수 용량(ORAC)를 직접 동시에 측정하는

장치와 방법을 포함한다. "ORAC(o)"라는 용어는 분석 방법이 시료 중에 산소 함량을 직접 측정하는 산소 라디칼 흡수 용

량 분석(ORAC(o))에서 산소가 소멸되는 것을 직접적으로 트래킹함으로써 라디칼을 퀸칭하기 위한 항산화제 능력을 측정

하기 위해 사용한다. 현 산업 표준 분석 방법, 예컨대 ORAC(fl)와 ORAC(β-PE)는 플루오레신 화합물(플루오레신 또는 β-

피코에리트린)의 플루오레신 방출의 감손을 간접적으로 측정하여 항산화제 용량을 측정한다. 상기 분석 방법은 친수성 항

산화제는 분석이 잘 되지만 소수성 및 친수성 항산화제의 혼합물 또는 소수성 항산화제를 측정하는 것은 효율성에 한계가

있다. 또한 공지된 ORAC(fl)와 ORAC(β-PE) 시스템과 같지 않게, 여기서 밝히고 있는 ORAC(o)는 일회용 감지기로서 간

단하게 제조된 것으로 적당하다. 이러한 시스템은 생물학적 시료로부터 사용자가 산화성 용량을 즉각적으로 평가하기 위

해 사무실이나 집에서도 충분히 가능하다.

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ORAC(o) 장치. 도 1은 ORAC(o) 직접 항산화제 장치(10)를 묘사한 것이다. 장치 (10)는 묘사한 것과 같이 3개의 기본적인

부분을 가진다: 검출기 시스템(12), 유체 시스템(14) 및 데이타 프로세서 시스템(16)(상기는 데이타 캡처, 유체 및 시료 조

절 및 데이타 프로세싱을 제공하기 위해서 서로 연결되어 있을 수 있음). 검출기 시스템(12)은 1개 이상의 도관(20)을 경유

하여 유체 시스템(14)과 유동적으로 교류하고 있는 산소 감지기(18)를 갖는다. 1개 이상의 도관(20)을 통한 유체 흐름은

데이타 프로세서 시스템(16)의 조절 하에 및/또는 상호 조절될 수 있는 1개 이상의 밸브(22)로 조절된다. 작동하면 시료

(24)는 유체 시스템으로 들어가고, 검출기(18)로 향하며, 데이타 캡처 후에 폐기 저장고(26)으로 운반된다. 유체 시스템

(14)은 또한 펌프, 진공 또는 압력, 예를 들어 압력화 불활성 기체에 의해서 유체 시스템(14)를 통해 직접 전이되는 1개 이

상의 용액(28)을 포함할 수 있다. 유체 시스템(14)의 용액(28)은 미리혼합되거나 또는 평형화되는 것이 일반적이며, 본 발

명을 사용하는 경우에는 일반적으로 물, 용매, 세제 또는 물:세제 혼합, 산소 라디칼 발생제, 산화 표적 등을 포함할 수 있으

며, 산소 검출 챔버(34)에 운반되기 이전에 혼합 챔버(30)에서 혼합될 수 있다. 유체 시스템의 선택은 당업에 통상의 지식

을 가진 자에게 공지되어 있는 것과 같이 목적하는 자동화 또는 선택한 자동화의 정도에 따라서 달라질 것이다. 시료(24)

는 산소 감지기(18)를 조정하기 위해서 사용하는 동일한 용액과 미리 혼합할 수 있거나 또는 혼합 챔버(30)에서 미리 혼합

할 수 있다.

본 발명을 사용하기 위한 산소 검출기(18)의 예로는 용매, 물 및 세제의 존재하에 용존 산소를 검출할 수 있는 용존 산소 감

지기를 포함할 것이다. 용존 산소 감지기의 예로는 예를 들어 전기화학 감지기, 화학발광 감지기, 표면 플라즈몬 공명 감지

기, 적외선 감지기, 용량 결합 감지기, 염료 결합 광섬유 감지기 또는 초다중분광 감지기를 포함한다. 하나의 특이 실시예

에서, 용존 산소 감지기는 YSI 5300A 생물학적 산소 감지기(YSI, USA), SPREETA 감지기(Texas Instruments),

PASCO PS2108(Pasco, USA) 등이다. 하나의 실시예에서, 용존 산소 감지기는 하기의 세목을 가진다: 0-20 mg/L 범위;

정확성: 실무 크기의 ±10%; 분할: 0.01 mg/L; 최대 시료 속도: 20 sps; 디폴트 시료 속도: 2 sps; 반응: 60 초에 98 %; 온

도 범위: 0 ℃ 내지 50 ℃; 온도 배상: 10 ℃ 내지 40 ℃; 캐소드: 백금; 애노드: Ag/AgCl; 막: 1 ml 실리콘; 및 산소 감지기

는 제조사, 예를 들어 Dissolved Oxygen EZ(Pasco, USA)에서 제조한 소프트웨어로 콘쥬게이트하여 사용할 수 있다. 상

기 시스템은 또한 유체 시스템과 유동적으로 교류하여 pH, ORP, 전도도 또는 혼탁도 감지기를 포함한다.

작동 중인 여기서 밝히고 있는 ORAC(o)는 하기와 같이 사용할 수 있다: 사용자는 시료를 수집하고 ORAC(o) 용매 키트(건

조 또는 액상)로 또는 키트에 용해시킨다. ORAC(o) 감지기, 예를 들어 소형 표면 플라즈몬 공명 산소 감지기(예를 들어

Texas Instruments SPREETA 감지기 참조)에 1개 이상의 측정 대조군을 노출시킨 다음에 사용 시료를 노출시킨다. 산소

감지기는 감지기 상의 검출기 표면의 산물를 평가하고 판독한 정도를 사용자에게 제공하는 프로세서와 연결되어 있다. 판

독한 정보는 스크린에 나타나고, 프린트하고 및/또는 프로세서에 전송되고, 기억된다. 사용 시료는 소변, 타액, 눈물, 점액

분비물, 땀, 혈액(또는 혈액 생성물), 조직, 배설물 또는 산소 라디칼을 갖는 것으로 의심되는 기타 생물학적 시료일 수 있

다. 하나의 실시예에서 시료는 인공호흡장치, 예를 들어 폐쇄된 인공호흡장치로 수집한 1회 이상의 호흡물(1회 이상의 흡

입 및/또는 호기)이다. 감지기로 검출된 값은 사용자의 산화 상태를 평가하기 위해서 과거 또는 미래의 값을 비교하거나 또

는 미래에 참고하기 위해서 기억장치에 저장된다(비지구, 반 영구적 또는 영구적으로).

본 발명의 항산화제 활성을 측정하기 위한 ORAC(o)의 기본 성분은 현존하는 ORAC-유사 방법의 잇점을 취하므로 많은

훈련을 하지 않고도 실험실에서 사용하기에 용이하다. 간단하게 ORAC(o)는 시료 용액과 대조군으로서의 산화성 퀸처(항

산화제) 중의 1개 이상의 산소 라디칼 발생 분자의 상대 활성을 직접적으로 측정함으로써 전산화제 활성을 측정하기 위한

산소 감지기, 예를 들어 혈액 플라즈마 산소 감지기 또는 용해가능한 산소 감지기이다. 특정 제제, 예를 들어 환원제 또는

휘발제는 용액 중의 산소의 양에 영향을 줄 수 있는 라디칼 공급원, 예를 들어 AAPH의 부재하에 용액 중의 산소의 흡수 또

는 생성을 유도할 수 있다는 것을 알아야 한다. 본 발명을 사용하여 당업에 통상적인 지식을 가진 자들은 예를 들어 유리

라디칼 개시제의 첨가 이전에 용액 중에 시료의 특성을 평가함으로써 시료의 라디칼 퀸칭과 비라디칼 퀸칭 활성을 비교할

수 있다. 본 발명을 사용하여 측정할 수 있는 것과 같이 시험할 시료의 라디칼 퀸칭과 비라디칼 퀸칭 활성은 산화 상태와

관련이 있다는 것을 알아야 한다. 산소 라디칼 발생제와 산소 라디칼 퀸처의 상대 활성을 간접 방법 ORAC(fl), ORAC(fl-

lipo), ORAC(β-PE) 등으로 시간에 따라서 적정 및/또는 측정할 수 있다.

도 2는 본 발명의 방법의 기본적인 공정을 요약한 흐름도(50)이다. 공정(52)에서 가용성의 산소 프로브는 용매:물:세제 혼

합물의 존재하에 평형화 및/또는 교정하고, 기본값을 측정한다. 하나의 실시예에서 용매:물:세제는 1:1:1 비율의 아세톤:

물:트윈-20 혼합물이다. 공정(54)에서 항산화제 활성의 기본값 측정은 예를 들어 항산화제로서 트롤록스를 사용하여 항산

화제 활성의 비교를 위한 양성 대조군과 기본값으로서 제공된다. 트롤록스와 관련된 분자의 잇점 하나는 상기 비티민 E 유

도체가 롯으로부터 롯에서 가장 안정하며, 롯의 변화가 적고, 합성되어 항산화제 활성의 확실한 농도를 제공한다. 공정

(54)의 혼합물은 공정(58)에서 산소 라디칼 발생제를 첨가하기 이전에 산소 라디칼 표적, 예를 들어 리놀레산과 공정(56)

에서 혼합된다. 분석은 공정(60)에서 진행되며, 곡선하면적(AUC)은 저장된 시료의 값과 초과시간에 소멸된 용존 산소를

측정하여 계산한다. 일렬로 또는 평행으로 시료는 용매:물:세제 혼합물에 용해시키고(공정 66) 공정(68)에서 산소 라디칼

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표적을 첨가한다. 일반적으로 공정(56)과 (68)에서는 동일한 형태의 산소 라디칼 표적을 사용하고, 공정(58)과 (70)에서는

동일한 형태의 산소 라디칼 발생제를 사용하는 것이 일반적이다. 공정(72)에서 시료의 AUC를 검출하고, 저장된 시료의 값

을 검출한다. 대조군과 시료 AUC를 측정하고 공시료의 AUC를 공제하여 값을 기준에 맞춘다. 기준에 맞춘 대조군과 시료

AUC 값을 그 다음에 시료 중의 항산화제 활성 레벨를 비교하고 계산한다.

본 발명의 설명에 도움을 주기 위해서 하기의 설명을 하였으며, 이의 범주에 제한하지는 않는다. 세제 트윈 20을 리놀레산

을 분산시키기 위해서 첨가할 수 있다. 리놀레산은 산소를 흡수할 수 있도록 하기 위해서 이중 결합을 제공한다. 트롤록스

는 내부 대조군으로서 사용하는 합성 항산화제이다. 모든 시료에서 수득된 값은 트롤록스의 값과 관련된다. 산소 라디칼

발생 분자: 2,2' 아조비스 (2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드(AAPH)는 산소와 반응하여 탄소 중심 라디칼을 제조

한다. AAPH로 발생되는 라디칼은 리놀레산의 산화를 야기한다. 리놀레산의 산화 결과로서 리놀레산의 이중 결합은 탄소

중심 라디칼 중에 산소 분자와 결합하는 케톤이 된다. 산소 프로브는 리놀레산의 산화 때문에 반응 챔버로부터 제거되는

산소의 속도를 측정하는데 사용한다. 아조 라디칼은 리놀레산과 직접 반응하여 리놀레산 라디칼을 형성시킬 수 있다. 그

다음에 리놀레산 라디칼은 케톤을 형성하기 위해서 반응 챔버 중에 존재하는 산소와 반응한다. 제안된 기작을 통해서 리놀

레산의 산화때문에 산소가 소비된다. 항산화제는 리놀레산의 산화를 방해함으로써 반응 챔버 중에 산소의 소비를 늦춘다.

시간 플롯 대 용존 산소에 대한 곡선하면적을 계산하여 리놀레산의 산화를 늦추는 능력에 의해 나타나는 시료의 항산화제

용량을 측정한다.

산소 라디칼 발생제. 아조-라디칼 발생제는 항산화제 활성 측정용 라디칼을 발생시키기 위해서 공지된 농도에서 본 발명

의 ORAC(o) 분석 방법 중에 존재한다. 아조 개시제는 예를 들어 2,2'-아조비스[2-(5-메틸-2-이미다졸린-2-일)프로판]

디히드로클로라이드, 2,2' 아조비스(2-아미디노프로판)디히드로클로라이드(AAPH), 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)

[2-(N-스테아릴)아미디노프로판]디히드로클로라이드(SA-1), 2,2'-아조(2-(2-이미다졸린-2-일)-프로판)-[2-[2-(4-

n-옥틸)이미다졸린-2-일]-프로판]디히드로클로라이드(C-8), 2,2'-아조비스(4-메톡시-2,4-디메틸발레로니트린)

(MeO-AMVN), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴)(AMVN), 아조-비스-이소부틸니트릴, 2,2'-아조비스(2-메틸프

로피오네이트)(DAMP) 및 2,2'-아조비스-(2-아미디노프로판)을 포함한다.

예를 들어 라디칼 발생제 2,2' 아조비스 (2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH)는 분자 질소 및 2개의 탄소 라

디칼로 분해된다. 탄소 라디칼은 안정한 생성물을 제조하기 위해서 결합되거나 또는 퍼옥실 라디칼을 제조하기 위해서 분

자 산소와 반응한다. AAPH의 반감기는 약 175 시간이다(중성 pH와 37 ℃에서). 따라서 유리 라디칼 발생의 속도는 용액

중의 최초 몇 시간 동안에 일정해야 하는 것이 필수이다. 사용되는 AAPH는 종종 지방산의 수성 분산물 중에 지질 과산화

화를 위해 사용되며, 예컨대 친유성 및/또는 소유성 라디칼 발생제와 결합하거나 또는 단독으로 사용될 수 있다. 여기서 밝

히고 있는 용매 시스템은 시료 중의 총 산소를 장치가 측정하는 것과 같이 친유성 및/또는 소유성 라디칼 발생제 둘 다 또

는 둘 중의 하나를 사용한다.

용매 시스템. ORAC(o)용의 용매 시스템은 용매, 수상 및 세제를 포함하는 3 부분 시스템이다. 예를 들어 용매는 알콜, 아

민, 에스테르, 글리콜 에테르, 글리콜, 테르펜 및/또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 용매일 수 있

다. 유기 용매 시스템은 용매 성분의 약 50 % 이하, 약 30 % 이하, 약 33 % 이하, 20 % 이하로 제제화될 수 있으며, 어떤

경우에는 용매 성분 중 10 % 이하인 경우도 있다.

하나의 실시양태에서 용매는 ORAC(o) 용매 시스템 중 약 10 부피/부피% 내지 90 부피/부피%의 아세톤, ORAC(o) 용매

시스템 중 약 10 부피/부피% 내지 90 부피/부피%의 수성 부분 및 용매 시스템 중 0.001 % 내지 90 %의 세제일 수 있다.

예를 들어 ORAC(o) 용매 시스템은 3분의 1의 물, 3분의 1의 세제("3분의 1(one-third)" 용매) 및 시료 농도는 예를 들어

1 mg/mL일 수 있다. 그 다음에 동일한 용매를 사용하여 희석한다. 세제는 비이온성 세제, 예컨대 TWEEN(상표명)(즉,

TWEEN 20), BRIJ(상표명) 또는 TRITON(상표명); 쌍극성 세제, 예컨대 CHAPS(상표명); 양이온성 세제; 또는 음이온성

세제, 예컨대 콜레이트, 데옥시콜레이트, 나트륨 도데실설페이트, 또는 TWEEN-80; 또는 계면활성제일 수 있다. 세제에

대한 아세톤에 대한 물의 비율은 약 5 %~90 % 내지 90 %~5 %일 수 있다. 반은 아세톤과 반은 물을 사용하는 2개 성분

시스템인 ORAC(fl)와 같지 않게 ORAC(o) 용매 시스템의 세제는 총 시료의 산소를 직접 측정하도록 한다. 하나 다른 것은

무작위 메틸화 β-시클로덱스트린을 사용하는 ORAC(fl-lipo)이다.

ORAC(o) 분석 방법의 사용: ORAC(o) 분석 방법은 본 발명의 영양 보조 식품용의 성분의 평가를 위해서 및 심지어 본 발

명의 최종 건강 보조 식품 및/또는 경쟁 제품을 평가하고 시험하기 위해서 생물학적 시료의 총 항산화제 활성을 측정하기

위해서 사용할 수 있다. 생물학적 시료의 평가에 사용하기 위해서, 예를 들어 세럼, 지용성 세럼 분류, 수용성 세럼 분류, 소

변, 지용성 소변 분류, 수용성 소변 분류, LDL 분류, 조직 균질화, 항산화제 보조 식품의 품질 관리, 식품의 품질 관리, 방부

제의 품질 관리, 새로운 항산화 보조 식품의 개발, 새로운 식품의 개발, 새로운 방부제의 개발, 새로운 항산화제 치료의 개

발, 식품 제조 및 가공의 품질 관리, 식물의 항산화제 활성의 평가 또는 화장품의 항산화 활성의 기록에 사용할 수 있다.

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실시예

실시예 1: ORAC(fl)와 ORAC(o) 분석 방법을 사용하는 항산화제 활성의 비교

항산화제 조성물용 성분으로 플루오레신을 측정하는 종래의 산소 라디칼 흡수 용량(ORAC(fl))을 사용하고, 용존 산조를

측정하는 본 발명의 방법(ORAC(o))를 사용하여 항산화제 활성을 분석하였다. 제품의 항산화제 활성은 퍼옥실 라디칼에

의해 야기되는 손상으로부터 시스템을 보호하기 위한 항산화제의 능력이다.

비교를 위한 항산화제 활성을 측정하는 종래 방법. ORAC(fl) 분석 방법에 있어서, Ou 등의 방법(Ou, B., Hampsch-

Woodill, M. and Prior, R.L., J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 4619-4626)은 하기와 같다. 발표된 Ou의 절차에서의 차

이점은 진탕기의 속도(Ou, 400 rpm; 본 발명은 280 rpm), 원심분리기의 속도(Ou, 14,000 rpm, 15 분; 본 발명 3200

rpm, 15 분) 및 분석 시간(Ou, 30 분; 본 발명 100 분)을 포함한다. 플루오레신, 나트륨 염은 Aldrich(Milwaukee, WI)에서

수득하였다. Ou 방법에 있어서, 플루오레신의 표준양을 시험할 항산화제 제품에 첨가하고 플루오레신의 초기 레벨을 측정

하였다. 유리 라디칼 개시제를 첨가하고 플루오레신이 소멸되는 시간과 소멸되는 정도를 측정하였다. 트롤록스(상표명)

6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸클로만-2-카르복실산은 잠재적인 항산화제 특성을 갖는 비타민 E의 세포 침투성인 수

용성 유도체이다. 트롤록스(상표명)는 퍼옥시니트릴-중재 산화성 스트래스와 쥐의 흉선세포의 자살을 예방하며, 롯투롯

(lot-to-lot)이 일정한 합성 항산화제이고, 각 시료를 비교하기 위한 대조군으로서 사용하며 진행시킨다. 각 시료에 대한

ORAC(0) 값을 조정하기 위해서 사용하는 공시료(콘트롤)를 각각의 진행에 포함할 수 있다. 플루오레신 대 시간으로 도면

을 작성하였다. 모든 곡선에서 공시료(콘트롤)를 공제하였다. 항산화제의 곡선하 순면적을 트롤록스(상표명)의 곡석하 순

면적과 비교하였다. 곡선하 순면적이 커지면 시료 중의 분자의 항산화제 용량이 커진다. 모든 ORAC(fl) 분석 방법을

COBAS FARA II 원심분리 분석기(Roche Diagnostic System Inc., Branchburg, NJ; 여기 파장 = 493 nm와 방출 필터 =

515 nm)로 실행하였다. 결과는 시료 1 g 당 트롤록스(상표명) 균등물의 마이크로몰로 나타내었다.

항산화제 활성의 측정 방법. 작동 중에 본 발명의 ORAC(o) 분석 방법은 공기로 평형화시킨 산소의 존재하에 표적 분자(리

놀레산)에 대항하는 용액과 항산화제 조성물, 배합물을 평가하기 위해서 사용하였다. 유리 라디칼 개시제를 첨가하고 산소

가 소멸하는데 걸리는 시간을 측정하여 소멸율을 수득하였다. 트롤록스(상표명)을 대조군으로 사용하여 공시료는 콘트롤

로서 진행시켰다. 용존 산소의 양 대 시간을 곡선하순면적을 직접 비교하는 도면을 작성하였다. 상세한 방법은 하기와 같

다: 완충액[K2HPO4(F.W. 174.2), NaH2PO4(FW 120.0)]은 Sigma(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 리놀레산 99 %, 트

롤록스(상표명)(6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸클로만-2-카르복실산) 97 %, 트윈(상표명) 20 및 2,2'-아조비스(2-메

틸프로피온아미딘) 디하이드로클로라이드 97 %(AAPH)를 Aldrich(Milwaukee, WI)에서 구입하였다. HPLC 등급 아세톤

은 Fisher(Hampton, NH)에서 구입하였다. YSI 5300A 생물학적 산소 측정기는 YSI(Yellow Springs, Ohio)에서 구입하

고, 제조자의 설명에 따라 사용하였다.

ORAC(o) 방법. 하기의 저장 용액을 사용하였다. 인산 완충액(75 mM, pH 7.4); 750 mM K2HPO4(F.W. 174.2); 500 mL

메스 플라스크에 65.33 g 중량; 표시까지 dH2O를 첨가하여 제조하였다. 농도는 750 mM이다. 눈금 온도계가 장착된 냉장

고(2 ℃ 내지 8 ℃)에 750 mM K2HPO4 저장 용액에 넣어 저장하였다. 목표 온도는 4 ℃이다. 750 mM NaH2PO4(FW

120.0); 500 mL 메스 플라스크에 45.00 g 중량; 표시까지 dH2O를 첨가하였다. 농도는 750 mM이다. 눈금 온도계가 장착

된 냉장고(2 ℃ 내지 8 ℃)에 750 mM K2HPO4 저장 용액에 넣어 저장하였다. 목표 온도는 4 ℃이다. 750 mM K2HPO4

저장 용액 40 ml과 750 mM NaH2PO4 저장 용액 10 ml을 혼합하였다(4 대 1 비율). ORAC 저장 용액 완충액 50 mL가 수

득될 것이다. 눈금 온도계가 장착된 냉장고(2 ℃ 내지 8 ℃)에 저장 용액에 넣어 저장하였다. 목표 온도는 4 ℃이다. dH2O

로 혼합물을 희석하여(1:9) ORAC 완충액 사용 용액으로 만들고 pH를 측정하였다. pH는 7.4이여야 한다. 상온에서 사용

할 준비가 될 때까지 뚜껑을 덥고 유지시킨다.

트윈 제조. 트윈 20 10 g을 칭량하고, 탈이온수 90 g을 첨가하였다. 뚜껑을 덮고 혼합물을 밤새 교반하였다. 트윈 저장 용

액을 1 주일 동안 유지시킨다. 실험대 위에 둔다.

용매 제조. 아세톤 25 mL, 탈이온수 25 mL 및 트윈 20 25 mL을 혼합하였다. 상기 용매를 시료 제조에 사용하였다. 실험을

실행하기 전에 프로브는 막에 특별히 세심한 주의를 기울여 손상 유무를 관찰하고 필요하다면 대체시킨다. 프로브는 탈이

온수의 팁에 저장하여야 한다. 단지 하나의 브로브와 하나의 반응 챔버가 분석 방법에 사용될 수 있다. 공시료와 트롤록스

(상표명)(10 ug/ml 또는 0.03995 umol/ml에서)를 8 시간 마다 진행시킨다.

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시료는 10 ug/ml의 농도로 진행시켜야 한다. 시료 농도와 트롤록스(상표명) 농도는 동일해야 한다.

시료 1 mg를 칭량하고, 용매 1 ml를 첨가하여 시료를 희석하고 초기 추출을 시작한다. 1 시간 동안 흔들고, 초기 추출 용

액 0.5 ml을 유리 신틸레이션 병에 넣은 다음에 4.5 ml 용매를 첨가하여 일차 희석액을 제조한다. 약 30 초 동안 일차 희석

액을 흔든다. 이의 농도는 0.1 mg/ml 또는 100 ppm이다. 일차 희석물 0.5 ml를 취하여 또 다른 유리 신틸레이션 병에 넣

은 다음에 4.5 ml 용매를 첨가하고 약 30 초 동안 흔들어 농도가 0.01 mg/ml 또는 10 ppm이 되도록 한다. 병 시료 액 0.5

ml를 취하여 또 다른 유리 신틸레이션 병에 넣은 다음에 4.5 ml 용매를 첨가하고 약 30 초 동안 흔들어 농도가 0.01 mg/

ml 또는 10 ppm이 되도록 한다. 상기 병을 4 ℃ 냉장고에 넣는다. 37 ℃ 수조에서 리놀레산을 해동시키고, 70.8 mg 리놀

레산에 0.18 mL 트윈 저장 용액, 0.18 mL 완충액 및 0.44 mL 탈이온수를 첨가하여 리놀레산 용액(저량임)을 제조하였다.

용액 튜브를 호일로 싸서 둔다. 리놀레산 용액은 8 시간 마다 새로 만든다. 산소 라디칼 발생제를 제조하기 위해서 AAPH

67.8 mg을 칭량하여 0.9 mL 완충액에 용해시킨다. AAPH는 냉장으로 보관하고 8 시간 이내에 사용하여야 한다. 1 시간

동안 흔든다. 트롤록스(상표명) 용액은 매 번 냉장 보관하여야 한다. 항산화제 활성을 측정하기 위해서, 각각의 반응 컨테

이너, 2.36 mL 물의 완충액 1.86 mL을 37 ℃ 신틸레이션 병에 첨가하고, 반응 매트릭스가 온도에 도달할 때 까지 3 분 동

안 교반한다. 시료 0.284 mL를 첨가하고 반응 용액을 만지지 않고 용기에 프로브 팁을 두고, 1 분 동안 교반하였다. 광선

을 차단한 환경에서 취해 측정하는 것이 좋다.

데이타 수집 후에 챔버에서 프로브를 제거하고 각 리놀레산 용액 0.357 mL를 첨가하고 챔버에서 프로브 끝을 즉각 대체한

다. AAPH 용액 0.357 mL를 첨가하고 조심스럽지만 신속하게 용액 튜브에 프로브를 넣어 반응 면적에 버블이 생기지 않

도록하고 프로브 케이스 상의 과범람 마루 중에 용액이 없도록 한다. 다음에 용액에 프로브를 넣고 판독한다. 데이타를 수

집하고 항산화제 활성을 계산한다.

시료는 "3분의 1 용매(one-third solvent)"(또한 ORAC(o) 용매 시스템으로도 나타냄) 중에 1 mg/mL 농도로 제조하였다.

"3분의 1(one-third)" 용매는 동량의 물, 아세톤 및 물로 1:9로 희석된 트윈 20 용액이다. 시료는 280 rpm의 진탕기 상에

서 상온에서 1 시간동안 흔든다. 시료 용액은 "3분의 1(one-third)" 용매로 추가 희석(일반적으로 10 ug/mL)하면 분석 준

비가 완료된다. "3분의 1(one-third)" 용매를 또한 공시료로서 사용하였다.

ORAC(o) 분석 방법은 YSI 5300A 생물학적 산소 측정기를 사용하여 실행하였다. 리놀레산은 70.8 mg의 리놀레산에

0.18 mL의 75 mM 인산 완충액(pH 7.4), 0.18 mL의 10 중량%의 트윈 20 저장 용액 및 0.44 mL 탈이온수를 첨가하여 제

조하였다. AAPH는 67.8 mg의 AAPH에 0.9 mL 완충액을 첨가하여 제조하였다. 최종 반응 부피(5.218 mL)를 리놀레산

(21.59 mM)을 유리 라디칼 공격 표적으로서 사용하고 AAPH(19.00 mM)을 퍼옥실 라디칼 발생제로서 사용하였다. 트롤

록스(상표명, 10 ug/mL)를 대조군으로서 사용하였다. 판독이 0이 관찰될 때 까지 초 당 판독하였다.

ORAC(o) 값(산소 라디칼 흡광도 용량 산소 특이 전자)을 계산하는 수학식은 하기와 같다:

(수학식 1)

대안적으로, ORAC(o)는 액상 식을 평가하는 경우에 밀리리터로 계산하였다. 상기 계산은 시료 1 g 당 트롤록스(상표명)

균등물의 마이크로몰로 공지된 품질이 수득된다. 마이너스 값의 ORAC(o)는 항산화제로서 활성을 갖는 것 보다는 산화를

촉진시키는 제제인 전산화제인 조성물을 나타내는 공시료로 수득된 것 보다 라디칼 퀸칭 활성이 적다는 것을 반영한다. 그

러나 시료에 의해서 산소가 흡수되거나 또는 방출되지 않는다는 ORAC(o) 분석을 가정하여 시료의 산소 레벨의 효과를 평

가할 수 있으며 계산된 항산화제 값을 보상하기 위해서 사용된다.

ORAC(o)와 ORAC(fl) 분석 파라미터의 비교. ORAC(fl)와 비교하여 ORAC(o)의 잇점은 항산화제 포텐셜의 직접 대 간접

측정으로 측정한다. ORAC(fl)는 플루오레신(표적 분자)이 단지 측정하는 플루오레신 성분이라는 것을 가정하여 적용되기

때문에 간접 산소 라디칼 검출이다. 그러나 많은 항산화제 화합물은 자연스럽게 형광을 발하며(예를 들어, 블루베리); 라디

칼-라디칼 반응에서의 상기 화합물의 배합도 또한 형광을 발한다. 따라서 시료에서의 플루오레신은 플루오레신을 기본으

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로하는 분석의 결과에서 벗어날 수 있다. 한편 ORAC(o) 방법은 유리 라디칼에서 산소의 소멸을 직접 측정하는 산소 섭취

의 직접 측정이다. 항산화제 용량의 상기 측정 방법은 산소가 수용성 또는 지용성 성분에 부착되었는지의 유무에 상관이

없다. ORAC(fl)와 ORAC(o) 방법의 분석 파라메터의 비교를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

ORAC(fl)와 ORAC(o)의 분석 파라메터의 비교

분석 중의 분석 파라메터 ORAC(fl) ORAC(o)

온도 37 ℃ 37 ℃

AAPH 농도 인산 완충액 중의 1.28 ×10-2M 인산 완충액 중의 19.00 mM

표적 분자 농도 인산 완충액 중의 플루오레신, 43.8 nM

10 % 트윈 20, 완충액 및 물(0.18 mL,

0.18 mL, 0.44 mL)의 혼합물 중의 리놀레

산 21.59 mM

시료 농도 초기에는 완충액으로 10 ug/mL가 되도록

희석된 20 mL 현탁액 중에 500 mg 초기에 1 mg/mL, 10 ug/mL로 희석

시료 용매 완충액 중에 아세톤/물, 50/50 v/v 희석 "3분의 1" 용매 중의 물/아세톤/트윈 20

10 중량%, v/v/v("3분의 1"용매)

분석용 완충액, 농도 75 mM 인산염, pH 7.4 75 mM 인산염, pH 7.4

최종 분석 부피 400 ul 5.218 mL

공시료(콘트롤) 완충액 "3분의 1" 용매

대조군 완충액 중의 62.5 uM 트롤록스 "3분의 1" 용매 중의 10 ug/mL의 트롤록

스(38.755 uM)

시료의 항산화제 용량 측정 방법

라디칼에 의해 산화됨으로써 플루오레신

은 형광성이 감소되며, 항산화제는 이러

한 감소를 방어하고 지연시킴.

라디칼 개시제와 리놀레산 탄소 라디칼

이 산소를 포획하며; 항산화제는 산소 유

입을 방어하고 감소시킴.

본 발명의 하나의 명확한 잇점은 사용자들이 실험 환경에 본 장치와 방법을 혼입시키는 장비를 구입하거나 새로운 기술을

습득할 필요가 없다는 것이다. 예를 들어 시료 포화를 측정하는 경우 예를 들어 Ou 등에 의해 개발된 잘 공지된 간접 측정

에서와 같이 본 발명은 대부분 동일한 완충액, 조건, 추출 및/또는 분리 공정을 사용한다. Ou 등은 20 mL에 500 mg의 농

도에서 아세톤/물(50:50 v/v)로 시료를 제조하고, 1 시간 동안 400 rpm의 회전 진탕기에서 회전시키며, 15 분 동안

14,000 rpm에서 원심분리하고, pH 7.4에서 인산칼륨 완충액 75 mM로 희석한다(Ou, et al., Development and

Validation of Oxygen Radical Absorbance Capacity Assay for Lipophilic Antioxidants Using Randomly

Methylated-β-Cyclodextrin as the Solubility Enhancer, J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 1815-1821). 본 발명자들

은 많은 시험 시료를 Ou 조건(ORAC(fl) 조건)하의 용액에 넣지 않고 보다 가용성 성분으로 덜 가용성 성분을 대체하는 방

법을 발견하였다. 결과적으로 ORAC(fl) 조건하에서 용해되는 시료의 부분만을 ORAC(fl) 시료와 측정에 포함하였다. 따라

서 분석을 위한 ORAC(fl) 방법에 따라 제조된 현탁 용액은 실제 시료의 총 항산화제 활성을 나타내지 않을 것이다. ORAC

(fl) 완충액 중의 시료 용액이 항상 시료의 함량을 반영하지 않기 때문에 ORAC(fl)를 사용하면 결과가 빗나갈 수 있다.

시료 용해시에 문제점이 나타나고, 항산화제 측정에서 혼합 토코페롤의 기여 부족은 ORAC(fl)를 사용하는 경우 관찰되는

퀘르세틴과 혼합 토코페롤 혼합물에서 발생한다. 도 7에서 보여주는 것과 같이 ORAC(o) 시스템을 사용하면 10 ug/mL로

각각 분리된 성분과 비교하여 퀘르세틴 5 ug/mL과 혼합 토코페롤 5 ug/mL를 배합한 경우에 항산화제 효과를 발견하였

다. 대조적으로 간접 ORAC(fl) 시스템은 퀘르세틴 단독으로 사용한 경우의 값 보다 동일한 배합물에서 추가의 효과가 없

었다(도 11 참조). 혼합 토코페롤과 배합된 것의 활성 부족과 포화 문제점은 시료의 농도가 보다 희석되고, 시료용 용매가

아세톤, 물 및 시료의 모든 성분을 용해시키기 위한 세제를 함유하기 때문에 ORAC(o) 방법에서는 없다. 시료를 위한 용매

중의 트윈 20의 존재는 혼합 토코페롤로부터의 활성 검출의 원인이 된다. 트롤록스 활성용 콘트롤로서 도 7에서는 10 ug/

mL로 분리한 각 성분과 비교하는 퀘르세틴 5 ug/mL와 혼합 토코페롤 5 ug/mL를 보여주며, 트롤록스 콘크롤를 포함하고,

과시간에 시료 중에 잔존하는 산소 라디칼의 레벨을 검출하기 위해 ORAC(o)의 능력을 설명하였다.

ORAC(o)는 아주 값비싼 ORAC(fl)(자동 약 $250,000; 비자동 약 $50,000)와 비교하여 가격이 많이 절약된다. 대조적으로

여기서 밝히고 있는 ORAC(o) 장치는 형광계 검출 시스템의 비용이 비싼 부류에서 집에서 사용하거나 의사 사무실에서 판

매하기 위해 개발할 수 있는 자동화 및/또는 소형화가 용이한 기성품 산소 감지기 시스템의 잇점을 가진다. 단독 실험실 허

가를 위한 분석 화학회(AOAC)에 의해 실행되어 제공되는 허가는 표 2, 3 및 4에 나타내었다.

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[표 2]

매일의 값은 10 ug/mL의 농도에서 퀘르세틴 시료를 3회 진행시킨 평균 값이다. HORRAT 값은 당업에 통상의 지식을 가

진 자에게 공지된 Horwitz 반응식으로 예견한 관찰된 RSDR 값과 RSDR 값 사이의 비율이며, 정확하게 하기 위한 방법의

허용가능한 표시로 간주한다. 단일 실험실 실행 연구에서 일련의 HORRAT는 방법의 허용가능한 정확성을 표시하는 0.5

와 2.0 사이의 비율이다. 5 일 동안의 시험에서의 HORRAT 값은 1.98이다. 선형 범위로서 분석 범위의 결정은 표 3에 나

타내었다.

[표 3]

선형의 완결은 시료의 농도가 거의 1000 ug/mL로 하락하는 것을 나타낸다. 선형 범위로서 분석 범위의 결정으로 500 ug/

mL 이하의 다양한 농도의 곡선하면적 값을 결정한다. 표 4는 정확한 하루의 결과를 나타낸다.

[표 4]

하루의 정확한 시험은 10 ug/mL 농도의 퀘르세틴 시료를 5회 분리 진행한 것을 포함한다. ORAC(o) 방법에 있어서의 표

4의 HORRAT 값은 0.65448이다.

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ORAC(o) 분석 방법은 실시예 2에서 설명한 것과 같은 항산화제 조성물 중의 성분의 비율을 최적화시키는데 사용하였다.

조성물의 하나의 실시양태는 1 g 당 17,254 마이크로몰 트롤록스 균등물의 ORAC(o)를 사용한 항산화제 값을 제공하기

위한 퀘르세틴 49.18 중량%; 혼합 토코페롤 32.79 중량%; 포도 껍질 추출물 9.84 중량%; 그린티 추출물 6.56 중량%; 및

부시 플럼 1.64 중량%를 갖는다. 동일한 조성물은 1 g 당 5,281 마아크로몰 트롤록스 균등물의 ORAC(fl)를 사용하는 항

산화제 값을 제공한다. 상기 데이타로 항산화제 활성을 측정하는 ORAC(o)와 ORAC(fl) 방법은 간접 ORAC(fl) 방법이 제

한되기 때문에 수득되는 결과가 상이하다는 것을 알 수 있다.

실시예 2: 상승 작용의 항산화제 조성물

본 발명의 건강 보조 식품에 따라 5개의 성분을 전 세계의 장수한 사람들의 식품에 우세한 항산화제 조성물과 배합한다.

본 발명자들은 장수로 알려진 지역에서의 식품을 포괄적으로 연구한 것을 기본으로 하는 성분을 선택하였다. 본 발명자들

은 상기 지역의 식품들이 플라보놀과 토코페롤이 풍부한 것을 확인하였다. 본 발명자들은 특정의 천연 화합물이 이들의 항

산화제 활성을 불활성화시키는, 예를 들어 비타민 C와 유리하게 상호작용한다는 것을 추가로 확인하였다. 실제로 예를 들

어 α-토코페롤의 발생 중에 비타민 C의 역활이 많은 연구들로 확인되었다(Pizzorno and Murray, Textbook of Natural

Medicine, 1999, 2nd Ed. New York, Churchill Livingston).

상기 연구를 기본으로 본 발명자들은 장수한 사람들이 많은 여러 지역에서 생이용가능한 화합물을 많은 양으로 포함하는

천연 및 기타 공급원으로부터 분리 및 정제한 추출물을 사용하여 하나의 제제로 배합하였다. 본 발명의 하나의 실시예에서

하기의 기본 성분들을 선택하였다: 플라보놀, 혼합 토코페롤, 포도 껍질 추출물, 그린티 추출물 또는 부시 플럼[하기 지역

에 사는 사람들의 식품에 우세하게 많이 존재함; Andean village of Vilcabamba in Ecuador, the land of Huza in the

Karakoram Range in Kashmir, or in Abkhazia in the Georgian State of the former USSR; 예를 들어 하기 문헌 참조;

Leaf A., Launois J. "A Scientist Visits Some of the World's Oldest People," National Geographic. 1973 January; of

the Italian island of Sardinia(Koenig R. "Sardinia's Mysterious Male Methuselahs," Science. 2001, March 16), and

of Australia].

본 발명의 조성물은 상승 작용의 항산화제 활성을 보여준다. 이론적으로 연결되어 있는 것을 원하지는 않지만 항산화제 조

성물의 다양한 성분은 몸을 보호하는 세포간 사이토졸, 세포간 막 및 세포외 유체를 보호하는 활성을 갖는다. 부시 플럼 성

분은 예를 들어 세포에 있는 친수성의 천연 비타민 C 함량 중에 높으며, 사이토졸을 보호하기에 유용하며; 친수성인 포도

껍질 추출물과 그린티 추출물은 세포로 들어갈 수 없으며, 세포의 유체를 보호하는데 유용하고; 혼합 토코페롤은 친수성이

며 친지성이 플라보놀(예를 들어 퀘르세틴)과 함께 막을 보호한다. 또한 식품 또는 건강 보조 식품 자체에도 포함되는 섬유

는 배설용의 적당한 운반체를 제공할 수 있다.

상승 작용의 항산화제 조성물의 성분. 본 발명의 ORAC(o) 장치와 방법의 유용성으로 본 발명자들은 항산화제 활성의 강

화에 도움을 주는 제제, 예를 들어 비타민 C 등과 친유성 및 소유성 항산화제의 배합물의 총 항산화제 활성을 측정할 수 있

다. ORAC(o) 시스템을 사용하여 상승 작용의 활성을 갖는 항산화제 조성물을 플로보노이드, 예를 들어 퀘르세틴, 비타민

E, 선택적으로 포도 껍질 추출물, 그린티 추출물 및 오스트레일리아 부시 플럼의 2개 이상의 제형의 혼합물을 포함하여 개

발하였다. 상기 상승 작용은 퀘르세틴 대 비타민 E의 혼합물의 중량 비율이 40/60 내지 90/10 %에서 관찰되었다. 조성물

의 하나의 실시양태에서는 하기의 중량 비율을 포함한다: 퀘르세틴 49.18 %; 혼합 토코페롤 32.79 %; 포도 껍질 추출물

9.84 %; 그린티 추출물 6.56 %; 및 부시 플럼 1.64 %.

도 6은 퀘르세틴, 혼합 토코페롤, 및 토코페롤과 퀘르세틴의 혼합물 및 상승 작용의 항산화제 대조군:트롤록스(Hoffman-

La Roche)를 포함하는 ORAC(o) 분석 방법의 결과를 보여주는 그래프이다.

퀘르세틴과 같은 플라보노이드. 조성물의 플라보노이드는 플라본, 플라보놀, 이소플라본, 이소플라보놀, 이들의 유사체,

이들의 약학적 허용 염 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 플라보놀의 예로는 퀘르세틴, 캠프페롤 및 미리세틴을 포함한다. 조

성물 중에 포함되는 특정 플라보노이드 또는 플라보노이드 유사체 또는 염은 ORAC(o) 항산화제 측정을 진행하여 결정한

다. 퀘르세틴의 활성 중 80 % 내의 활성은 유사물을 제공하려는 의도이다. 플라보노이드에 참조하여 특히 퀘르세틴은 당

이 예를 들어 아라비노스, 람노스, 칼라토스 또는 글루코스인 어글리콘 또는 글리코사이드를 나타낸다. 퀘르세틴의 람노스

글리코사이드는 루틴 또는 퀘르세틴으로 공지되어 있으며, 미리세틴의 람노스 글리코사이드는 미리시트린으로 공지되어

있다. 퀘르세틴의 유사체는 3, 5, 7, 3' 및 4' 위치 중 1개 이상에 -OH 기가 아닌 치환기를 포함하는 화합물을 포함한다. 기

타 치환기는 하기를 포함한다: 탄소 원자가 5개 이하인 알킬, 아세틸, 설필 또는 말로닐. 퀘르세틴의 유사체에 있어서 단지

1개 또는 2개의 위치에 -OH 기가 아닌 다른 것으로 치환된다.

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퀘르세틴과 같은 플라보노이드는 생체외에서의 합성이 용이하다. 그러나 (퀘르세틴을 포함하여) 플라보노이드는 현존하

며, 예를 들어 천연 발생 식품들, 특히 과일과 채소, 예컨대 사과, 배, 포도, 양파, 레드와인, 종고추, 레드커런트, 블랙커런

트, 레몬, 체리, 크랜베리, 구스베리, 토마토, 올리브, 무, 콜라비, 서양고추냉이, 감자 및 아스파라거스로부터 분리 및 정제

될 수 있다. 퀘르세틴은 Pharmline(Florida, NY)에서 수득할 수 있다.

부시 플럼: 오스트레일리아 부시 플럼(Terminalia ferdinandiana)은 HPLC 크로마토그램으로 나타내는 다양한 성분과 약

5 %의 비타민 C를 함유한다(데이타는 없음). 상기 성분들은 플라본과 플라보노이드를 포함한다고 알려져 있다. HPLC 크

로마토그램은 메탄올과 물 추출 부시 플럼 분말 시료를 사용하여 1 mL/분의 유속으로 0.1 % 트리플루오로아세트산과

100 % 메탄올의 단계 글래디언트를 사용하여 역상 C18 컬럼으로 실행한다. 플라보노이드를 분리하고 비타민 C를 분리하

기 위한 조건을 개발하였다. 흡광도는 245 nm에서 측정한다.

부시 플럼의 펄프와 껍질을 과일 씨에서 제거하고 수 중에 슬러리로 만든다. 슬러리를 냉동 건조시키고 분쇄한다. 여기서

항산화제 조성물에 있어서 냉동 건조된 물질을 바람직한 양으로 칭량한다. 부시 플럼은 본 발명의 조성물에는 0 중량% 내

지 87.9 중량%의 양으로 존재하며, 또 다른 실시양태에서는 약 2 중량%로 존재한다.

포도 껍질 추출물. 포도 껍질 추출물은 포도 껍질로 제조하며, 폴리페놀이 30 % 내지 85 % 함유되어 있고, Polyphenolics,

Madera, CA: Hunan Kinglong, Bio-Resource Co., Ltd., Changsha Economic Development Zone, China; 또는

Pharmline, Florida, NY에서 구입할 수 있다.

그린티 추출물. 그린티 추출물은 Camellia sinensis의 잎에서 추출하며, 폴리페놀을 35 % 내지 95 % 함유하고, Amax

NutraSource Inc., Eugene, OR; Blue California, Rancho Santa Margarita, CA; 또는 PL Thomas & Co., Morristown,

N.J.에서 구입할 수 있다.

기타 성분. 본 발명의 항산화제 조성물은 1개 이상의 비독성 약학적 허용 담체, 예컨대 락토스, 스타치, 슈크로스, 글루코

스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 디칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 만니톨, 솔비톨, 시클로덱스트린, 시클로

덱스트린 유도체 등을 포함할 수 있다. 상기 1개 이상의 담체 캡슐 또는 정제를 사용하면 용이하게 제제화할 수 있으며, 삼

키거나 또는 씹는데 용이하게 만들 수 있다. 정제는 적당한 담체, 결합제, 윤활제, 희석제, 붕해제, 착색제, 향료, 흐름유도

제(flow-inducing agent) 또는 용융제를 함유할 수 있다. 정제는 선택적으로 1개 이상의 추가 성분과 함께 압착

(compression) 또는 몰딩(molding)에 의해서 제조될 수 있다. 압착된 정제는 선택적으로 결합제(예를 들어 젤라틴, 하이

드록시프로필메틸셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕해제(예를 들어 나트륨 전분 글리코레이트, 가교화 카르복

시메틸 셀룰로스) 표면 활성제 또는 분산제와 함께 자유 흐름 형태(예를 들어 분말, 과립)에 활성 성분을 압착함으로써 제

조할 수 있다. 적당한 결합제로는 전분, 젤라틴, 천연 당 예컨대 글루코스 또는 베타-락토스, 옥수수 감미료, 천연 및 합성

검, 예컨대 아카시아, 트라가칸스, 또는 나트륨 알지네이트, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한

다. 상기 알약에 사용하는 윤활제는 나트륨 올레이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트,

나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 예를 들어 전분, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토나이트, 잔탄

검 등을 포함한다. 몰딩된 정제는 불활성 액상 희석제로 분말 활성 성분을 수분화시킨 혼합물을 적당한 기계에서 몰딩함으

로써 제조할 수 있다.

캡슐 또는 정제는 선택적으로 코팅하거나 또는 표를 낼 수 있으며, 항산화제 조성물을 천천히 또는 조절해서 방출하도록

제제화할 수 있다. 제제의 방출을 조절하기 위한 지효성 조성물(timed-relase composition)은 일반적으로 선택된 시간 동

안 장의 분해 또는 붕해에 대해 저항하는 물질로 코팅하거나 또는 혼합한 입자 제제를 함유한다. 제제의 방출은 빨기

(leeching), 침식(erosion), 파열(rupture), 확산(diffusion) 또는 유사한 활동에 의해서 발생할 수 있다.

담체는 지효성을 부여할 뿐만 아니라 항산화제 활성을 촉진시킬 수 있다. AMBROTOSE(상표명) 피토 포뮬라라고도 하는

식물 카르보하이드레이트의 혼합물을 항산화제 조성물과 결합시킬 수 있다. 이러한 배합물은 항산화제 조성물의 보존 기

간을 연장시키며, 지효성 제형용으로 제공된다. AMBROTOSE(상표명) 피토 포뮬라는 검 아라빅(아카시아), 잔탄 검, 검

트라가칸트, 검 가티(TicGum에서 구입할 수 있음) 및 알로에 배라 겔 추출물(aloe vera gel extract, 예를 들어 내부 입

겔, Carrington Labs, Irving, TX, MANAPOL(상표명) 분말 또는 유사 제품)을 약 30/30/20/19/1 중량/중량 비율로 함유

한다. AMBROTOSE(상표명) 피토 포뮬라는 2:1 내지 1:2의 중량 비율로 본 발명의 항산화제 조성물과 혼합한다. 또 다른

실시양태에서 AMBROTOSE(상표명) 피토 포뮬라는 2:1의 중량 비율로 항산화제 조성물과 혼합된다.

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캡슐 또는 정제는 추가로 특이 제제에 따라서 약 0.1 % 내지 90 %의 중량%로 식물 성분을 함유할 수 있다. 담체의 경우에

담체 자체는 조성물에 영양적으로 현저한 효과가 없으나 상기 담체는 본 발명의 영양적으로 효과적인 양의 방출의 프로파

일을 방출하고, 위치시키고, 시간을 지키는데 효과적이다. 예를 들어 본 발명의 1개 이상의 항산화제는 1개 이상의 큰 알약

으로 방출시켜 예를 들어 일련의 방출로 혈액 또는 소변으로 검출되는 항산화제 레벨을 첨가할 수 있다. 또 다른 실시양태

에서 항산화제는 어느 정도 균등하게 방출될 수 있으며, 혈액 또는 소변 레벨을 첨가시키는 그래디언트로서 제공될 수도

있다. 사실 본 발명은 다른 시간 또는 소화 중의 위치에서 소유성 및 친유성 항산화제를 방출하는 것을 포함할 수 있다. 예

를 들어 1개의 항산화제는 상이한 항산화제가 예를 들어 위산 또는 장 경로로 방출되면서 방출을 중재하기 위해서 거품이

이는 담체로 제공될 수 있다.

제제화 과정. 롤러 압착 항산화제 조성물의 제제화 과정은 여기서 설명한 항산화제 조성물과 AMBROTOSE(상표명) 피토

포뮬라를 혼련하는 공정을 포함한다. 혼련 결과물을 롤러 압착기에 옮기고, 롤러 사이를 압착하여 콤팩트를 제조한다. 혼

련에 부여되는 압력은 성분 사이의 물리적인 부착성을 강화시킨다. 상기 압력에 의한 콤팩트를 이후에 분쇄하여 과립을 형

성한다. 그 다음에 상기 과립으로 목적하는 알약, 예컨대 캡슐 또는 정제를 제조한다. 하나의 실시예에서 Fitzpatrick

Chilsonator Model 4LX10D 롤러 압축기를 고정된 힘(fixed force) 10 톤과 피츠밀 스크린(Fitzmill screen) 약 0.093을

가지고, 정면을 가로질러 새겨지고 회전에 수직인 롤를 사용할 수 있다. 롤러 압축 장치는 다양한 회전 속도, 전력 적용

(force application) 및 틈 폭 용량(gap width capacity), 예를 들어 Gerteis Polygran 건조 롤러 압축기 시스템(Gerteis,

Germany)을 가질 수 있다. 롤러 압축기는 2개의 카운터 회전 롤러 사이에 혼련물을 통과시킴으로써 혼련물 상에 균일하

게 압력을 적용하여 작동된다. 롤러에 의해 혼련물 상에 부여되는 압력은 혼련물을 콤택트, 예를 들어 시트 또는 리본(통상

적으로 분쇄하여 과립을 제조함)으로 압축시킨다. 대안적으로 과립은 요구될 수 있는 슬러깅(slugging), 밀링 또는 체질

(sieving)에 의해 획득될 수 있다. #20-80 매시의 과립을 선택한다.

AMBROTOSE(상표명) 피토 포뮬라와 항산화제 조성물을 롤러로 압축한 배합물의 보존 기간이 길어지는 것은 산소에 노

출되는 항산화제 조성물의 표면 면적의 양이 감소하기 때문이라고 믿어진다. 롤러 압축 배합물은 또한 캡슐 또는 정제 제

조 과정에서 부형 충진제(excipient filler)의 필요성을 없앤다. 여기서 설명하는 항산화제 조성물과 AMBROTOSE(상표

명) 피토 포뮬라의 배합물의 추가의 잇점은 하기와 같다: 소화기관내에서 짝이 없는 전자를 쇠퇴시키는 불용성 섬유의 조

건과 세포 글리코형태의 옳은 구조용의 모노사카라이드의 조건이 유리 라디칼에 의해 손상된 세포를 회복시키는데 세포

중재 교류의 원인이 된다.

투약량. 본 발명의 조성물의 투여를 위한 유용한 투약량 제제는 항산화제 조성물의 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg,

500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg 또는 1000 mg의 캡슐 또는 정제를 포함한다. 하나의 실시양태에서는 충진

제, 담체 또는 안정제를 조성물에 첨가하지 않는다. 또 다른 실시양태에서 AMBROTOSE(상표명) 피토 포뮬라와 본 발명

의 항산화제 조성물을 2:1, 1:1 또는 1:2의 중량 비율로 혼련한다. 또 다른 실시양태에서 AMBROTOSE(상표명) 피토 포

뮬라는 항산화제 조성물과 2:1의 중량비율로 혼련한다. 또 다른 실시양태에서 캡슐 또는 정제는 AMBROTOSE(상표명)

피토 포뮬라와 혼련된 항산화제 조성물 500 mg을 제공한다. 상기 실시양태에서 2개의 캡슐 또는 정제를 하루에 섭취할 수

있다. 기호성을 증가시키거나 또는 흡수를 지연시키기 위해서 적당하게 코팅할 수 있다.

도 8과 도 9에서는 항산화제 용량을 측정하기 위해서 ORAC(o) 방법을 사용하여 퀘르세틴과 혼합 토코페롤을 다양한 비율

로 하였을 경우의 곡선하순면적(AUC)의 결과를 보여준다. 시료(Q+MT)의 총 농도는 각각의 퍼센트로 분석하여 10 ug/

mL이다. 예를 들어 0 % 퀘르세틴에서 혼합 토코페롤의 농도는 10 ug/mL이며, 시료 중에는 퀘르세틴이 없다. 10 % 퀘르

세틴에서 시료는 1 ug/mL의 퀘르세틴과 9 ug/mL의 혼합 토코페롤을 갖는다. 20 % 퀘르세틴에서 시료는 2 ug/mL의 퀘르

세틴과 8 ug/mL의 혼합 토코페롤을 갖는다. 상승 효과는 40 % 내지 100 % 퀘르세틴에서 쉽사리 관찰되며, 가장 용이하게

관찰되는 범위는 40 % 내지 90 % 퀘르세틴 범위이다. 직선은 추가 효과, 즉 0 % 퀘르세틴에서 나타나며, 선은 혼합 토코

페롤 단독의 활성 중 90 %와 퀘르세틴 단독의 활성 중 10 %의 합을 나타낸다. 상승 작용 효과는 상기 선에서 발견되었다.

본 발명의 조성물의 일차 항산화제 성분(퀘르세틴으로 나타내는 플라보노이드 및 2개 이상의 비타민 E 제형의 혼합물)은

12.1 % 내지 100 %, 30 % 내지 85 %를 포함하거나 또는 또 다른 실시양태에서는 5개의 성분의 중량의 약 82 %를 포함함

다. 하나의 실시양태에서 퀘르세틴의 양은 49.18 %이며, 비타민 E 제형의 양은 5개 성분의 총 중량의 32.79 %이다.

본 발명의 조성물의 이차 성분(또는 강화제)(포도 껍질 추출물, 그린티 추출물 및 부시 플럼)은 5개의 성분의 0 중량% 내

지 87.9 중량%, 15 중량% 내지 70 중량%, 또는 약 18 중량%를 포함한다. 도 10에서 보여주는 것과 같이 최적의 포도 껍

질 추출물과 그린티 추출물의 비율은 49.18 % 퀘르세틴, 32.79 % 혼합 토코페롤 및 1.64 부시 플럼의 존재하에 결정된다.

포도 껍질 추출물 대 그린티 추출물의 최적의 비율은 60/40 내지 80/20이다. 하나의 실시양태에서 항산화제 조성물의 총

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중량을 기준으로 포도 껍질 추출물은 9.84 중량%이며, 그린티 추출물은 6.56 중량%이다. 부시 플럼(Terminalia

ferdinandiana)은 약 0 % 내지 87.9 %의 양으로 조성물의 성분으로서 제공되며, 또 다른 실시양태에서는 약 2 %이다. 도

10의 실시양태에서 부시 플럼은 조성물의 1.64 %이다.

ORAC(o) 분석으로 항산화제 혼련물은 하기와 같은 중량 비율을 갖는다는 것을 알 수 있다: 퀘르세틴 49.18 %; 혼합 토코

페롤 32.79 %; 포도 껍질 추출물 9.84 %; 그린티 추출물 6.56 %; 및 부시 플럼 1.64 %; 항산화제 활성은 1 g 당 트롤록스

균등물 17,254 마이크로몰이다.

AMBROTOSE AOTM의 안정성. AMBROTOSE AOTM, AMBROTOSE(상표명)(Mannatech, USA)와 본 발명의 항산화제

제제의 혼련물(2:1의 중량 비율)은 약 6 개월의 보존 기간에 일치되는 촉진된 안정 조건(75 % 상대 습도에서 40 ℃)하에서

이의 활성을 유지시키는 것을 보여주었다.

ORAC(fl) 분석과 비교한 ORAC(o) 분석의 증명. 도 11은 α-토코페롤를 퀘르세틴과 상이한 비율로 혼합하는 경우의 AO

활성에 기여하지 않는다는 것을 보여주는 ORAC(fl) 결과 그래프이다. 상기 그래프로 직접적으로 대조군 아세톤:물: 용액

의 ORAC(fl) 분석으로 퀘르세틴 농도가 증가하는 것과 비례하는 AUC의 선형 증가를 보여준다. AO 활성에의 기여 부족은

아세톤:물에 α-토코페롤이 용해되지 않기 때문일 수 있다.

도 12A와 12B는 친유성 및 소유성 항산화제 용량을 둘 다 검출하고 시료를 용해시키기 위해서 용매/물/세제 용액을 사용

한 상대 AUC의 결과와 혼합 토코페롤를 사용한 ORAC(fl-lipo) 결과 그래프이다. 도 11(상기)에서 친유성 AO의 AO 기여

를 검출하기 위한 대조군 ORAC(fl) 방법을 사용하여 α-토코페롤를 검출 할 수 있는 활성이 통계적으로 크지 않다는 것을

보여주었다. 도 12A에서 보여주는 것과 같이 α-토코페롤에 있어서의 ORAC(fl-lipo) AUC는 발표된 ORAC(fl-lipo) 방법

(아세톤:물)과 아세톤:물:트윈-20 사이를 비교하였고, ORAC(fl-lipo) 분석의 AUC에서 크게 증가한 것을 검출하였다. 도

12B는 가로좌표를 통한 직선의 결과로서 퀘르세틴과 혼합 토코페롤을 배합하는 경우의 공지된 ORAC(fl-lipo) 방법을 사

용하여 검출되는 상승 작용이 없다는 것을 설명하고 있다(이러한 분석을 사용하면 상승 작용이 없음을 알 수 있음).

공지된 분석 방법을 사용하여 수득된 결과는 여기서 추천하는 방법과 참고문헌을 기본으로 봐도 놀랄만한 것은 아니다. "

고-ORAC 식품(High-ORAC Foods):(www.ars.usda.gov 참조)을 평가히기 위한 현재의 표준으로 소유성 항산화제로부

터 분리되고 떨어진 친유성의 항산화제 포텐셜을 측정하기 위한 것임을 지시한다. 본 발명은 세럼 ORAC 값의 효과와 시험

튜브 ORAC 값이 관련이 있는 경우 서로 교류하지 않는 연구원들의 결과가 관찰된다는 이분법을 생각할 필요가 없다.

ORAC(fl) 평가와 비교하여 세럼에서 항산화제 효과를 측정하는 경우에 USDA의 농민 연구 서비스는 예를 들어 시금치가

시험 튜브 ORAC 분석에서 딸기에 비해 더 낮은 점수를 받았지만, 시금치는 세럼 ORAC 값에 딸기 보다 더 큰 효과를 가진

다는 것을 발견하였다. 본 발명과 여기서 설명하는 조성물을 사용하여, 본 발명자들은 인간의 몸에서 항산화제 활성에 더

나은 영향을 주는 다양한 용해도의 항산화제 사이에 상호작용을 하도록하는 시스템을 개발함으로써 불일치를 중재하였다.

간접 ORAC(fl) 및/또는 ORAC(fl-lipo) 방법으로는 총 항산화제 활성을 측정할 수 없고 특정 식품의 상승 작용 효과를 검

출할 수 없었다.

도 13은 AUC 측정에 효과를 보여주기 위해 사용되는 세제의 양을 다양하게 하여 α-토코페롤를 사용한 ORAC(fl) AUC 결

과의 그래프이다. 상기 분석에서 3분의 1 용매는 이의 완전한 3분의 1로 사용하고, 소량의 트윈 20을 혼합물에 사용하였

다. 도 14는 용매:물 대 세제 혼합물의 2개의 상이한 비율로 용해된 퀘르세틴:α-토코페롤 비율의 고정 비율을 측정하는 항

산화제 활성을 측정하는 ORAC(fl) 분석 그래프이다. 도 13과 도 14의 결과로 세제(트윈-20)는 AUC를 증가시키는 원인이

아니라는 것을 보여주며, 따라서 ORAC(fl) 활성의 검출은 대조군 아세톤:물 혼합물과 비교하여 증가하는 것을 보여준다.

실시예 3. 항산화제 상승 작용과 강화 작용의 ORAC(o) 검출

ORAC(o) 분석으로 친유성 및 소유성 항산화제 활성을 동시에 검출할 수 있다는 것을 보여주기 위해서, 친유성 및 소유성

항산화제의 공지된 농도의 특이 배합물의 효과와 포도씨 추출물과 그린티 추출물 단독의 결과를 비교하여 포도씨 추출물

과 그린티 추출물의 첨가로 동일한 강화 능력을 보여주는 일련의 연구를 실행하였다. 도 15는 퀘르세틴과 혼합 토코페롤의

상이한 비율로 수득되는 ORAC(o) 값을 보여주는 그래프이다. 도 16은 포도씨 추출물(GES)과 그린티 추출물(GTE)의 상

이한 비율에 있어서의 ORAC(o) 값을 보여주는 그래프이다. GSE와 GTE에 있어서의 항산화제 활성의 최대 비율을 결정한

후에, 퀘르세틴과 혼합 토코페롤을 최적의 비율로 결합하였다. 도 17은 최대의 퀘르세틴:혼합 토코페롤 및 포도씨 추출물

과 그린티 추출물 비율의 배합물의 ORAC(o) 값을 보여주는 그래프이다. 결합된 퀘르세틴과 혼합 토코페롤, GSE, GTE로

보조 식품의 항산화제 포텐셜을 최대화시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

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실시예 4: 조절된 플라시보 효과가 없이 개방형 임상 실험에서 소수의 건강한 개인의 AMBROTOSE AOTM의 항산화제 효

과

항산화제는 생물학적 물질의 산화를 지연시키거나 또는 방지할 수 있는 임의의 물질이다. 항산화제를 함유하는 과일과 채

소에 풍부한 식품은 산화성 스트래스로부터 야기되는 병적 조건의 발병을 감소시키는 것과 관련이 있다. 그러나 분리된 항

산화제 화합물과 함께 건강 보조 식품은 종종 어떤 경우에는 건강을 개선시키는데 효과가 없다는 것이 입증되었고, 다른

한편으로는 위험하다는 것이 입증되었다.1,3,4 과일과 채소를 많이 섭취하는 것의 항산화제 잇점은 단일 항산화제로부터의

배타적인 결과가 아닐 수 있으며, 상기 식품 중에 존재하는 상이한 항산화제의 배합에 의한 활성일 수 있다는 것이 제안되

었다.5,6 상기에 의해 단일한 항산화제가 영양 보조 식품을 사용하여 항산화제가 풍부한 식품을 섭취하는 경우의 보호 효과

가 증폭되지 않는 이유에 대해 과학자들이 의문을 제기하였다.7

최근의 연구들은 세포간 교류와 면역 작용을 지지하는 당을 제공하는 글리코뉴트리셔널(GN) 보조 식품, 뉴트리셔널 보조

식품은 생체외 및 생체내에서 항산화제 활성을 갖는다는 것을 제안하였다. GN 보조 식품을 함유하는 배양 배지에서 자란

쥐 간 세포는 대조군에 배해서 환원된 글루타치온의 레벨이 높게 나타나 항산화제 방어가 증가된 것을 보여주었다.8

파일럿 임상 연구에서는 사람들이 GN 보조 식품을 소비한 경우 산화성 스트래스의 생물표지가 감소하였고, 산화성 방어

의 생물표지가 증가한 것을 나타내었다. 보통의 식사에서 2 gr의 GN 보조 식품을 매일 첨가한 후 72 일 후에 총 철 결합 용

량과 엽산이 현저하게 많이 관찰되었으며, 구리/세룰로플라즈민 비율(copper/ceruloplasmin)에서 현저한 증가가 관찰되

었다. 또한 세럼 알케날, 호모시스테인, 8-히드록시데옥시구아노신(8-OHdG) 및 총 콜레스테롤의 증가와 산소 라디칼 흡

광도 용량(ORACβ-PE)의 증가도 관찰되었다.9

최근에 연구에서 과일과 채소의 항산화제 활성에 기여하는 광범위한 범위의 영양소(몇 가지는 공지되었으며 몇 가지는 아

직 규정되지 않았음)를 설명하였다.10.11,12,13,14 몇몇의 공지된 유익한 항산화제는 폴리페놀과 비타민 C와 E를 포함한다.6

포도(및 레드와인), 그린티 및 오스트레일리아 부시 플럼(Terminalia ferdinandiana)을 포함하는 특정 식품과 음료는 이

러한 항산화제를 비교적 많은 양으로 함유한다.6,15,16

그린티, 포도, 혼합 토코페롤, 퀘르세틴 및 오스트레일리아 부시 플럼으로부터 유도된 혼련물과 GN 보조 식품을 배합한 새

로운 영양 보조 식품에 의해 제공되는 항산화제 방어를 상기 연구에서 측정하였다.

방법: 혈액 시료를 Cover-Tek(Cover-Tek, Inc., Dallas, TX)에 수집하였다. 모든 혈액과 소변 시료를 Genox

Corporation(Baltmore, MD)에 의해 분석하고, 모든 통계 분석은 Decision Analyst(Arlington, TX)로 실행하였다.

시료의 항산화제 포텐셜을 시험하기 위한 다수의 방법이 출판되어 있다.17 상기 연구에서 사용하는 시험은 총 세럼

ORACβ-PE의 측정이다. 상기 방법은 공지된 대조군, 트롤록스(상표명)와 비교하는 경우, 퍼옥실 라디칼에 특이적으로 대

항하는 세럼 시료의 항산화제 스캐빈징 용량을 결정하기 위해서 β-피코에리트린, 플루오레신 프로브를 사용한다. 상기 결

과는 1 g 당 트롤록스 균등물(TE)의 마이크로몰로 표현한다.18 연구에 사용하는 기타 표준화된 분석 기술은 간접적으로

DNA 손상과 관련된 소변 8-OHdG와 지질에 대한 유리 라디칼 손상 정도의 양과 간접적으로 관련된 소변 지질 과산화수

소 및 알케날을 측정하는 것이다.19.20,21

상기 연구에서 사용하는 항산화제 영양 보조 식품, Ambrotose AOTM은 생체외 평가된 성분(퀘르세틴, 혼합 토코페롤, 포

도 추출물, 그린티 추출물, 오스트레일리아 플럼)을 사용하여 개발하였다. 각 성분의 생체외 항산화제 값은 대조군 ORACfl

방법(상이한 플루오레신 프로브, 플루오레신을 사용함)을 사용하여 측정하였다. 성분 혼합물의 항산화제 값은 용존 산소를

직접적으로 측정하는 새롭게 개발된 방법, ORACo를 사용하여 측정하였다. 지용성 및 수용성 항산화제는 생체내에서 협력

하여 작용하기 때문에 지용성 및 수용성 화합물의 상호작용과 기여를 동시에 측정하는 ORACo는 형광계 방법(ORACfl-lipo

와 ORACβ-PE)의 개선된 형태의 방법이다. 상기 방법들은 지용성 또는 수용성 화합물의 활성을 단독으로 측정하는 가장

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좋은 방법이다. 따라서 ORACo는 수용성 및 지용성 성분 둘 다의 혼련물의 총 생체외 항산화제 활성을 측정하는 보다 정확

한 방법을 제공한다. 수용성 및 지용성 성분을 결합하고, ORACo로 평가하여 혼련물의 최대의 상승 작용과 최대의 생체외

ORACo 값을 수립한다.*

이후의 혼련물은 Ambrotose AOTM를 제조하기 위해서 1:2의 비율로 Ambrotose(상표명)과 롤러 압착하였다.

Ambrotose(상표명) 중의 많은 천연 검은 지속적인 운반을 하는 화합물을 방출하는 것을 제어하기 위해서 사용하였다. 특

이 제품 개발은 분리 출원 및 미국 특허 출원의 대상이다.

상기 연구는 소변 지질 과산화수소, 알케날 및 8-OHdG 분석에 의해 간접적으로 및 세럼 ORACβ-PE에 의해 직접적으로

측정한 Ambrotose AO(상표명)의 상이한 양의 표준화된 시험을 사용하여 생체내의 항산화제 활성을 측정하기 위해 도안

하였다. 종래 문헌 및 Cao는 최근에 몇몇의 병리학적 조건, 예컨대 기능상실증이 산화성 스트래스와 관련이 없는 1개의 시

험으로 대체될 수 있기 때문에 1개의 단일 시험에서 보다는 일련의 시험이 필요하다고 제안하였다.22

모든 참가자들로부터 정보에 근거한 동의를 얻었다. 영양 보조 식품을 섭취시키지 않고, 본 연구를 방해하는 임의의 약제

를 섭취시키지 않은 12명의 건강한 남자와 여자 성인 희망자를 명부에 올렸다. 본 연구의 대상자들인 4명의 남자와 8명의

여자의 나이는 22-61이며, 다량의 항산화제 보조 식품을 섭취하도록 하였다. 과시간에 ORACβ-PE 가변성을 평가하기 위

해서 및 실험실 결과의 재현성을 시험하기 위해서, 혈액과 소변 시료를 보조 식품을 섭취하지 않은 추가의 대상에서 수집

하였다. 연구 중에 참가자들에게 그들의 보통의 연구 전 매일의 음식을 기계적으로 섭취시켰다. 표 5는 연구 대상자들의

정도를 나타낸다.

[표 5]

12명의 연구 대상자들은 아침에 신속하게 세럼 ORACβ-PE를 하고, 소변 분석은 보조 식품을 섭취하지 않고 초기 장세척을

2 주간 한 후 실행하고, 각각 증가된 양의 항산화제 보조 식품을 섭취한 후 2 주 마지막에 실행한다. 사용한 양은 보조 식품

사용 처음 14 일 동안 매일 500 mg(1 캡슐)(기간 1), 이후 이차 14 일 동안 매일 1.0 g(2 캡슐)(기간 2) 및 이후 3차 14 일

동안 매일 1.5 g(3 캡슐)(기간 3)이다. 추가로 보조 식품을 소비한 개인의 혈액과 소변 시료는 분석을 정확하게 하기 위해

서 3번 분석하였다. 혈액과 소변 시료는 독립적으로 정맥 채혈사에 의해 모으고, 모은 직후에 드라이 아이스로 포장하여

제조를 위해서 현지 병원 실험실로 옮겼다. 그 다음에 제조된 세럼과 소변 시료를 Genox 프로토롤에 의해 독립적 분석을

위해 Genox에 밤새 드라이아이스로 수송하였다.23 그 다음에 모든 시료를 드라이아이스의 Genox에 저장하고, ORACβ-

PE와 소변 측정을 연구의 마지작에 동시에 모두 측정하여 분석 시약의 가변성을 최소화하였다.

결과: ORAC 값과 기초 결과로부터의 변화 퍼센트 섭취한 12명의 참가자에 대한 ORACβ-PE 값과 Ambrotose AOTM를 기

초 값으로부터의 변화 퍼센트를 표 6에 나타내었다. 기초 값은 2 주 동안 장세척 후의 값이고, 기간 1은 500 mg의 2 주 후

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이고, 기간 2는 1.0 g의 2 주 후이며, 기간 3은 1.5 g의 2 주 후이다. 몇몇 기간 2 시료의 세럼 병 라벨은 Genox로 수송하

는 동안에 떨어진다. ORACβ-PE 값은 단지 상기 기간 동안의 연구 참자가들 중 3 명에서 특이적으로 배속할 수 있으며 나

머지 연구 참가자나 또는 추가의 연구대상이 아닌 개인들에게는 배속하지 않았다.

원래의 ORAC 결과의 통계 분석. 기초, 기간 1, 기간 2 및 기간 3 원래의 ORAC 결과 사이에 차이점이 있는지의 유무를 확

인하기 위해서 반복 측정 ANOVA를 실행하였다. 전체 시간의 기간에서 현저한 차이점이 있었다(F(3,24)=4.02, p=0.020)

. 사후 분석으로 기간 2는 기초 값과 현저한 차이가 있다는 것을 확인하였다(t(24)=-3.47, p=0.002). 기간 1은 기간 2와

현저하게 상이하였다(t(24)=-2.77, p=0.011). 기간 2는 기간 3과 현저하게 상이하였다(t(24)= 2.87, p=0.009). 각 시간

의 기간에 대한 평균을 표 6에 나타내었다.

[표 6]

기초 ORAC 결과로부터의 변화 퍼센트의 통계 분석. 상기에서 기록된 분석에 사용한 원래 결과와 대조적으로(표 6), 이번

분석은 기초 값으로부터의 변화 퍼센트로 표현하는 시간의 기간 사이의 차이점을 시험하였다. 기간 1, 기간 2 및 기간 3

ORAC 결과의 기초 값으로부터의 변화 퍼센트 사이의 차이점에 접근하기 위해서 반복 측정 ANOVA를 실행하였다. 총괄

적인 시험으로 전체적으로 현저성이 없다는 것을 확인하였다(F(2,13)=0.71, p=0.510). 또한 사후 분석으로 기간 사이의

현저한 차이점이 없다는 것을 확인하였다. 각 시간의 기간 평균을 도 B에서 보여주는 대응하는 박스플롯과 함께 표 7에 나

타내었다.

[표 7]

평균 지질 과산화수소, 총 알케날 및 8-OHdG 값은 표 8에 요약하였다. 동일한 시료로 동일한 시간에 측정하여 소변 크레

아티닌으로 나눈 소변 농도 가변성을 교정하였다.

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[표 8]

대기질(Air Quality). 대기질은 산화성 스트래스의 레벨에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 보통의 오염물, 예컨대 오

존과 이산화질소의 농도가 증가하면 대기질이 감소한다. 상기로 ROS가 발생할 잠재성이 더 커진다.24,25 편균 미국 환경

보호 에이전시(EPA) 대기질의 요약은 표 6에 나타내고 있는 대상자들이 살고 있는 달라스/포트 워트(DFW) 지역에서 각

2 주 동안을 가리킨다. EPA는 면적 대기질 지도를 위해 컬러 코드를 사용한다: 그린:"양호함(Good)"(오존 10 억당 0-79

파트[ppb]), 옐로: "적당함(Moderate)"(80-90 ppb), 오렌지:"민감한 군에게 건강에 해로움(Unhealthy for Sensitive

Groups)"(100-124 ppb), 레드: "해로움(Unhealthy)"(150 ppb 이상). 연구 면적의 각각의 매일의 EPA 지도에 대한 수치

값은 컬러에 할당되는 수로 계산하였다: 그린: 1, 옐로: 2, 오렌지: 3, 레드: 4 및 퍼플: 5 및 발간된 EPA 지도 상의 각 컬러

의 면적을 기준으로 매일 수의 평균을 평가하였다. 그 다음에 매일의 수치 값을 각 2 주의 연구 기간 동안 평균화하였다(표

9).

[표 9]

상기에서 개략적으로 설명한 것과 같이 기간 2 중에 연구 참가자들에게 할당된 값에서 불확실성을 고려하여, 12명의 연구

참가자들에 대한 최하의 가능성 평균 ORACβ-PE을 계산하였다. 참가자에게 속하는 것으로 규명될 수 없는 라벨의 세럼 시

료로부터의 최하의 9개 값을 가정하고 3개의 공지된 값과 결합하여 최하의 가능 평균 값을 얻고, 따라서 기초 값으로부터

의 변화 중 대부분의 보수적 추정 값이 수득된다. 9개의 최하의 ORACβ-PE 값은 4727.9, 5233.9, 5104.3, 4599.9,

5699.9, 5364.8, 3987.3, 4179.7 및 4584.9이다. 표 5의 3개의 공지된 기간 2의 값과 결합시키면 기간 2 중 12명의 연구

참가자들에 대한 평균 ORACβ-PE 값이 5467.70이 된다. 이것은 4279.49의 기초 평균 이상의 27.8 %이다.

토론. 과일과 채소에 풍부한 식품을 섭취하면 산화성 스트래스에 대해 방어적이 된다는 것을 연구에서 나타내고 있

다.7,26,27 식이 가이드라인은 매일 과일은 2-4 단위량을 섭취하고 채소는 3-5 단위량을 섭취해야 한다고 주장한다.28 이

러한 지식과 추천에도 불구하고 미국에서는 매우 소수의 사람들만이 1일 권장 양을 섭취한다.

미국 농림부(USDA) 지원의 임상 연구에서, 연구원들은 과일과 채소의 소비의 증가, 즉 매일 보통 5 단위량에서 실험적인

10 단위량으로 증가하고, 특히 2 주 후에 대략 13 % 이하의 세럼 ORACβ-PE 값이 증가하였다는 것을 발견하였다.7 현 연

구에서 각 보조 식품의 양을 사용하여 평균 세럼 ORACβ-PE 값의 증가는 500 mg으로 19.1 %, 1.0 g으로 37.4 % 및 1.5 g

으로 14.3 %이다. 상기 결과로 건강한 사람에게서 기초 값 이상의 세럼 ORACβ-PE 값이 크게 증가하는 결과의 최적의 양

은 1.0 g이라는 것을 알 수 있다. 1.0 g의 보수적 추정인 Ambrotose AOTM으로 27.8 % 증가는 5의 추가 과일과 채소를

매일 소비한 사람의 13 % 보다 2배 이상이다.

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소변 지질 과산화수소/크레아티닌 값은 보조 식품의 사용이 증가하면 감소한다. 각 양의 감소는 500 mg에서는 12.1 %,

1.0 g에서는 15.0 % 및 1.5 g에서는 17.0 %이며, 이것은 연구 범위 이상으로 증가된 양의 보조 식품으로 지질 손상이 증

가된 것을 보호한다는 것을 지시한다.

지질 과산화수소 결과가 ORACβ-PE 값과 실제로 관련되어 있지 않는 이유는 명백하지 않다. 세럼 ORACβ-PE는 측정 시간

에서 유리 라디칼을 퀸칭하기 위한 이의 능력과 관련하여 혈액의 항산화제 보호의 측정이다. 소변 지질 과산화수소는 과거

에 어떤 시점에 지질 산화성 손실이 있다는 표시이다. 실제 지질 손산과 소변 중의 지질 과산화수소의 소멸 사이의 일시적

인 관련은 명확하게 규정되어 있지 않다. 상기 일시적인 차이점은 부분적으로 변동에 원인이 된다.

소변 지질 과산화수소에 더하여, 소변 8-OHdG 및 알케날도 또한 각 시간의 기간에 측정하였다. 현저한 차이점도 경향도

관찰되지 않았다. 상기는 또한 실제 지질과 DNA 손상 사이의 일시적인 관계와 요소 중의 생물표지의 소멸과 관련이 있을

수 있다.

연구의 참가자들은 DFQ 지역에 거주한다. DFW에 발표된 EPA 1일 대기질을 매 2 주 기간의 값을 평균으로 하였다. 대기

질은 연구 중에 나빠졌다. 이것은 ROS가 증가하여 산화성 손상, 예컨대 지질 과산화수소의 생물표지가 증가함으로써 산화

성 스트래스가 증가한 것으로 예상하는 것이 일반적이다. 대조적으로 증가된 방어는 세럼 ORAC 값이 증가함으로써 측정

한 것의 증거이다. 또한 소변 지질 과산화수소 값이 하향하는 경향과 소변 8-OHdG와 알케날의 안정성이 산화성 손상이

감소한 것의 증거가 된다. 상기의 결과를 함께 생각해 보면 보조 식품에 의해 영향을 받은 항산화제 효과는 실제 측정된 효

과 이상이라는 것을 알 수 있다.

결론. 발표된 가이드라인에 따라 개인들은 과일과 채소를 소비해야 한다고 권장하고 있지만 현실적으로 대다수가 그렇게

하지 않는다. 이러한 예비 결과로 최종 제품에 항산화제 활성을 보존하는 최적의 항산화제 성분을 함유하는 영양 보조 식

품은 세럼 ORACβ-PE로 측정한 건강한 개인에게서 항산화제 보호가 증가하고 소변 지질 과산화수소로 측정된 지질 산화

성 손상이 감소한다는 것을 알 수 있다. 2 주 후에 기초 값 이상으로 세럼 ORACβ-PE 값이 증가함으로써 설명하는 것과 같

이 건강한 사람의 보호는 2 주 동안 식품에 5 단위량의 과일과 채소를 추가하여 발표된 결과에서 설명하는 것보다

Ambrotose AOTM의 500 mg, 1.0 g 및 1.5 g을 사용하여 더 증가하였다(19.1 %, 37.4 % 및 14.3 % 대 13 %).

우리의 지식에 건강한 사람의 산화성 스트래스를 4회 측정하기 위해서 항산화제 보조 식품으로 일차 연구를 하였고, 세럼

ORACβ-PE의 증가를 보여주었다. ORACβ-PE 값으로 알 수 있는 건강한 대상들 사이의 최적의 범위는 하루에 1 g인 경우에

연구에서 낮은 세럼 ORAC 값을 갖는 개인은 많은 양의 항산화제 보조 식품으로 도움을 받을 수 있다는 것을 보여주었

다.30 따라서 항산화제 스트래스가 증가하여 고통받는 사람들이나 스트래스를 받는 개인들은 다량으로 도움을 받는다.

ORACo를 항산화제 혼련 제제에 사용하는 경우에 독립 실험실에서는 설정된 방법인 ORACβ-PE를 사용하여 인간 임상 시

험 플라즈마 시료를 분석한다. Ambrotose AOTM 제품의 항산화제 효율성의 생체내 평가는 ORACo 방법의 사용에 의존하

지 않았다.

이러한 결과로 본 발명의 항산화제 보조 식품은 세럼 ORAC(β-PE)으로 측정하여 소비자에게 항산화제 보호가 증가되고,

소변 지질 과산화수소로 측정하여 지질 산화성 손상을 감소시킨다는 것을 확인하였다.

여기서 기재하고 있는 특정 실시양태는 실례로서 나타내며, 본 발명를 제한하지는 않는다는 것을 알 수 있을 것이다. 본 발

명의 주요한 특성은 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 실시양태에 적용할 수 있다는 것이다. 당업에 통상의 지

식을 가진 자들은 여기서 기재하고 있는 특이 과정에 일상적인 실험, 다수의 균등물 이상의 것이 아닌 것을 사용하여 규명

할 수 있거나 인식할 것이다. 상기 균등물은 본 발명의 범주내로 간주하며 청구 범위에서 다룬다.

여기서 언급한 모든 출판물과 특허 출원은 본 발명에 속하는 당업에 통상의 지식을 가진 자의 레벨을 지시한다. 모든 출판

물과 특허 출원은 각각의 출판 또는 특허 출원이 참고문헌으로서 혼합된 것을 특이적으로 개별적으로 지시한다면 동일한

정도로 참고문헌으로 여기에 혼합하였다.

여기서 청구하고 기재하고 있는 모든 조성물 및/또는 방법은 본 발명의 상세한 설명을 고려하여 불필요한 실험 없이 제조

하고 실행할 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법은 바람직한 실시양태로 기재하였지만, 당업에 통상의 지식을 가진 자에게

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- 29 -

는 본 발명의 개념, 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서 여기에 기재된 방법의 일련의 공정 또는 단계로 조성물 및/또는 방

법을 다양하게 적용할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 보다 특히 동일하거나 유사한 결과를 획득할 경우에 관련된 화학적

및 물리적 특정 제제가 여기서 기재된 제제를 대체할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당업에 통상의 지식을 가진 자에게 명

백한 상기와 같은 모든 대체와 변형은 첨부된 청구 범위에서 규정한 것과 같이 본 발명의 정신, 범주 및 개념 내에 있는 것

으로 간주한다.

<참고 문헌>

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(57) 청구의 범위

청구항 1.

친유성 항산화제(親油性 抗酸化濟; lipophilic anti-oxidant)와 소유성 항산화제(疏油性 抗酸化濟, lipophobic anti-

oxidant)의 항산화제 활성을 직접 검출하는 장치로서,

상기 장치는 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 산소 라디칼 민감성 분자(oxygen radical sensitive molecule) 및 시료

(sample)와 유동적으로 교류하는 산소 감지기(oxygen sensor)를 포함하고,

상기 산소 라디칼 민감성 감지기는 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 친유성 항산화제와 소유성 항산화제를 동시에 검출하

는 것을 특징으로 하는 장치.

청구항 2.

제 1 항에 있어서,

산소 라디칼 민감성 분자는 산소와 반응하는 분자, 콘쥬게이트된(conjugated) 이중 결합을 갖는 분자(질소 또는 황 함유

화합물), 플루오레신, β-PE, 글루타치온-S-전이효소, 리놀레산 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을

특징으로 하는 장치.

청구항 3.

제 1 항에 있어서,

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- 32 -

용존 산소 레벨(dissolved oxygen level)은 용존 산소 측정기(dissolved oxygen meter)를 사용하여 측정하는 것을 특징

으로 하는 장치.

청구항 4.

제 1 항에 있어서,

용존 산소 레벨은 전기화학 감지기, 화학발광 감지기, 표면 플라즈몬 공명 감지기, 적외선 감지기, 용량 결합 감지기, 염료

결합 광섬유 감지기 또는 초다중분광 감지기를 포함하는 산소 감지기를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 장치.

청구항 5.

제 1 항에 있어서,

용매를 유기 용매로 추가 규정하는 것을 특징으로 하는 장치.

청구항 6.

제 1 항에 있어서,

계면활성제를 세제(洗劑; detergent)로 추가 규정하는 것을 특징으로 하는 장치.

청구항 7.

제 1 항에 있어서,

계면활성제를 비(非)이온성 세제(non-ionic detergent)로 추가 규정하는 것을 특징으로 하는 장치.

청구항 8.

제 1 항에 있어서,

용매/물/계면활성제 혼합물 중의 용매는 용매/물/계면활성제 혼합물 부피 중 10 % 이상인 것을 특징으로 하는 장치.

청구항 9.

제 1 항에 있어서,

용매/물/계면활성제 혼합물 중의 물은 용매/물/계면활성제 혼합물 부피 중 10 % 이상인 것을 특징으로 하는 장치.

청구항 10.

제 1 항에 있어서,

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용매/물/계면활성제 혼합물 중의 계면활성제는 용매/물/계면활성제 혼합물 부피 중 10 % 이상인 것을 특징으로 하는 장

치.

청구항 11.

제 1 항에 있어서,

용매/물/계면활성제의 비율은 약 1:1:1인 것을 특징으로 하는 장치.

청구항 12.

제 1 항에 있어서,

용매는 아세톤을 포함하는 특징으로 하는 장치.

청구항 13.

제 1 항에 있어서,

계면활성제는 트윈(Tween)을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.

청구항 14.

제 1 항에 있어서,

산소 라디칼 레벨은 하기 수학식 1을 사용하여 결정하는 것을 특징으로 하는 장치:

(수학식 1)

[상기 수학식 1에 있어서,

AUCsmp는 시료의 곡선하면적 값이고;

AUCblnk는 공시료(blank)의 곡선하면적 값이며;

AUCtrlx는 트롤록스(Trolox)의 곡선하면적 값이고;

SMP는 시료임]

청구항 15.

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항산화제 활성을 측정하는 방법으로서,

1개 이상의 항산화제와 산소 라디칼 표적(oxygen radical target)의 존재하에 용매/물/계면활성제 혼합물 중에 용해된 시

험 용액 중 용존 산소 수준을 측정하는 공정을 포함하며, 수용성 항산화제 활성과 지용성 항산화제 활성을 산소 검출기로

측정하는 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 16.

제 15 항에 있어서,

용존 산소 레벨은 전기화학 감지기, 화학발광 감지기, 표면 플라즈몬 공명 감지기, 용량 결합 감지기, 염료 결합 광섬유 감

지기 또는 초다중분광 감지기를 포함하는 산소 검출기를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 17.

제 15 항에 있어서,

용존 산소 레벨은 용존 산소 감지기를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 18.

제 15 항에 있어서,

산소 라디칼 레벨은 하기 수학식 1을 사용하여 결정하는 것을 특징으로 하는 방법:

(수학식 1)

(상기 수학식 1에 있어서,

AUCsmp는 시료의 곡선하면적 값이고;

AUCblnk는 공시료의 곡선하면적 값이며;

AUCtrlx는 트롤록스의 곡선하면적 값이고; 및

SMP는 시료임)

청구항 19.

제 15 항에 있어서,

용매를 유기 용매로 추가 규정하는 것을 특징으로 하는 방법.

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- 35 -

청구항 20.

제 15 항에 있어서,

계면활성제를 세제로 추가 규정하는 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 21.

제 15 항에 있어서,

계면활성제를 비이온성 세제로 추가 규정하는 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 22.

제 15 항에 있어서,

용매/물/계면활성제 혼합물 중의 용매는 용매/물/계면활성제 혼합물 부피 중 10 % 이상인 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 23.

제 15 항에 있어서,

용매/물/계면활성제 혼합물 중의 물은 용매/물/계면활성제 혼합물 부피 중 10 % 이상인 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 24.

제 15 항에 있어서,

용매/물/계면활성제 혼합물 중의 계면활성제는 용매/물/계면활성제 혼합물 부피 중 10 % 이상인 것을 특징으로 하는 방

법.

청구항 25.

제 15 항에 있어서,

용매/물/계면활성제 비율은 약 1:1:1인 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 26.

제 15 항에 있어서,

용매는 아세톤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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- 36 -

청구항 27.

제 15 항에 있어서,

계면활성제는 양이온성 세제, 이온성 세제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것을 특징으로

하는 방법.

청구항 28.

제 15 항에 있어서,

계면활성제는 트윈을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 29.

제 15 항에 있어서,

항산화제 활성은 약 37 ℃에서 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 30.

제 15 항에 있어서,

2,2'-아조비스[2-(5-메틸-2-이미다졸린-2-일)프로판]디히드로클로라이드, 2,2' 아조비스(2-아미디노프로판)디히드로

클로라이드(AAPH), 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)[2-(N-스테아릴)아미디노프로판]디히드로클로라이드(SA-1),

2,2'-아조(2-(2-이미다졸린-2-일)-프로판)-[2-[2-(4-n-옥틸)이미다졸린-2-일]-프로판]디히드로클로라이드(C-8),

2,2'-아조비스(4-메톡시-2,4-디메틸발레로니트린)(MeO-AMVN), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴)(AMVN),

아조-비스-이소부틸니트릴, 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트)(DAMP), 2,2'-아조비스-(2-아미디노프로판), 이들

의 염, 이들의 혼합물 및 이들의 균등물로 이루어진 군으로부터 선택되는 라디칼 개시제를 제공하는 공정을 추가로 포함하

는 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 31.

제 15 항에 있어서,

검출기는 일회용품인 것을 특징으로 하는 방법.

청구항 32.

항산화 건강 보조 식품(antioxidant dietary supplement)으로서,

분리 및 정제된 소유성 항산화제; 및 분리 및 정제된 친유성 항산화제를 포함하며,

결합된 소유성 및 친유성 항산화제의 용존 산소 값은 1 g 당 6,000 uMol Trolox Equivalents(TE) 이상인 것을 특징으로

하는 항산화 건강 보조 식품.

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청구항 33.

제 32 항에 있어서,

소유성 및 친유성 항산화제는 지효성(time-released)인 것을 특징으로 하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 34.

제 32 항에 있어서,

소유성 항산화제는 알파 토코페롤, 베타 토코페놀, 델타 토코페롤, 엡실론 토코페롤, 감마 토코페롤, 제타 토코페롤, 에타

토코페롤, 크시1 토코페롤, 크시2 토코페롤, 시그마 토코페롤, 알파 토코트리에놀, 베타 토코트리에놀, 델타 토코트리에놀,

감마 토코트리에놀, 이들의 유사체(analog), 이들의 약학적 허용 염 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1

개 이상의 비타민 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 35.

제 32 항에 있어서,

친유성 항산화제는 퀘르세틴(quercetin), 캠프페롤(kaempferol), 미리세틴(myricetin), 에피제닌(apigenin), 이들의 유도

체, 이들의 유사체, 이들의 약학적 허용 염 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항산화

건강 보조 식품.

청구항 36.

제 32 항에 있어서,

2개 이상의 필수 사카라이드(essential saccharide)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 37.

제 32 항에 있어서,

갈락토스, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 만노스, 아세틸화-만노스, N-아세틸뉴라민산, 푸코스, N-아세틸갈락토사

민, N-아세틸글루코사민 및 크실로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 사카라이드를 추가로 포함하는 것을

특징으로 하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 38.

제 32 항에 있어서,

비타민 C의 식물 공급원(plant source)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 39.

제 38 항에 있어서,

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비타민 C의 식물 공급원은 오스트레일리아 부시 플럼(Australian bush plum; Terminalia ferdinandiana)을 포함하는 것

을 특징으로 하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 40.

제 38 항에 있어서,

비타민 C의 식물 공급원은 야생-오스트레일리아 부시 플럼(wild-Australian bush plum; Terminalia ferdinandiana)을

포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 41.

제 38 항에 있어서,

1개 이상의 생균제(pro-biotics)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 42.

제 38 항에 있어서,

락토바실러스 종(Lactobacillus sp.) 및 비피도박테리움 종(Bifidobacterium sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개

이상의 생균제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 43.

제 32 항에 있어서,

항산화 건강 보조 식품을 압착하여 통상적인 산소 불투과 면(oxygen impermeable surface)을 제공하는 것을 특징으로

하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 44.

제 32 항에 있어서,

항산화 건강 보조 식품의 제형은 롤러 압착 입자(roller-compressed particle), 캡슐, 정제, 미니 정제(mini-tab), 캐플릿

(caplet), 발포성 정제(effervescent tablet) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항산

화 건강 보조 식품.

청구항 45.

제 32 항에 있어서,

분리 및 정제된 소유성 항산화제; 및 분리 및 정제된 친유성 항산화제를 포함하며,

소유성 및 친유성 항산화제의 항산화제 ORAC(fl-lipo) 값은 1 g 당 7000 uMol Trolox Equivalents(TE)인 것을 특징으

로 하는 항산화 건강 보조 식품.

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청구항 46.

제 32 항에 있어서,

분리 및 정제된 소유성 항산화제; 및 분리 및 정제된 친유성 항산화제를 포함하며,

환자에게 제공되는 경우 소유성 및 친유성 항산화제는 환자의 기본 항산화제 레벨에서 ORAC(β-PE)로 측정하여 13 % 이

상 증가하는 것을 특징으로 하는 항산화 건강 보조 식품.

청구항 47.

건강 보조 식품으로서,

영양적으로 유효한 양의 2개 이상의 필수 사카라이드; 분리 및 정제된 소유성 산소-라디칼 퀸처(quencher); 및 분리 및 정

제된 친유성 산소-라디칼 퀸처를 포함하며,

결합된 소유성 및 친유성 산소-라디칼 퀸처의 산소-라디칼 퀸처 값은 1 g 당 6,000 uMol Trolox Equivalents(TE) 이상

인 것을 특징으로 하는 건강 보조 식품.

청구항 48.

제 47 항에 있어서,

환자에게 제공되는 경우 소유성 및 친유성 산소-라디칼 퀸처의 항산화제 레벨은 환자의 기본 항산화제 레벨에서 ORAC

(β-PE)로 측정하여 13 % 이상 증가하는 것을 특징으로 하는 건강 보조 식품.

청구항 49.

제 47 항에 있어서,

소유성 및 친유성 산소-라디칼 퀸처는 서방형(extended-release)으로 포장하는 것을 특징으로 하는 건강 보조 식품.

청구항 50.

제 47 항에 있어서,

소유성 산소-라디칼 퀸처는 알파 토코페롤, 베타 토코페롤, 델타 토코페롤, 엡실론 토코페롤, 감마 토코페롤, 제타 토코페

롤, 에타 토코페롤, 크시1 토코페롤, 크시2 토코페롤, 시그마 토코페롤, 알파 토코트리에놀, 베타 토코트리에놀, 델타 토코

트리에놀, 감마 토코트리에놀, 이들의 유사체, 이들의 약학적 허용 염 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는

1개 이상의 비타민 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강 보조 식품.

청구항 51.

제 47 항에 있어서,

공개특허 10-2006-0041313

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친유성 산소-라디칼 퀸처는 플라보노, 퀘르세틴, 캠프페롤, 미리세틴, 에피제닌, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 이들의 약

학적 허용 염 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강 보조 식품.

청구항 52.

제 47 항에 있어서,

갈락토스, 글루코스, 만노스, N-아세틸뉴라민산, 푸코스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 크실로스, 이들의

유도체, 이들의 유사체, 이들의 약학적 허용 염 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 사카라이드

를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 건강 보조 식품.

청구항 53.

제 47 항에 있어서,

갈락토스, 글루코스, 만노스, N-아세틸뉴라민산, 푸코스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 크실로스, 이들의

유도체, 이들의 유사체, 이들의 약학적 허용 염 및 이들의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 6개 이상의 사카라이드

를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 건강 보조 식품.

청구항 54.

조성물의 항산화 포텐셜(antioxidant potential)을 측정하는 시스템으로서,

하기 (a), (b) 및 (c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템:

(a) 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 시료 및 산소 라디칼 민감성 분자와 유동적으로 교류하는 산소 감지기(상기 산소 라디

칼 민감성 감지기는 용매/물/계면활성제 혼합물 중의 친유성 항산화제와 소유성 항산화제를 동시에 검출함);

(b) 1개 이상의 용기(vessel), 밸류(value) 및 도관(conduct)을 포함하는 산소 감지기와 유동적으로 교류하는 유동성 시스

템;

(c) 산소 감지기와 유동성 시스템에 연결된 프로세서(processor).

청구항 55.

제 54 항에 있어서,

유동성 시스템과 유동적으로 교류하는 pH 감지기, ORP 감지기, 전도성 감지기 또는 혼탁성 감지기를 추가로 포함하는 것

을 특징으로 하는 시스템.

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