โครงการ RPUS

รหัสโครงการ R51D03005

อาจารย์�ที่�ปร�กษา อ อาจารย์�ที่�ปร�กษา อ..ดรดร.. นพพล เล�กสวั�สด�� นพพล เล�กสวั�สด��

1. 1. นางสาวัฐิ�ติ�พร ก�านบั�วันางสาวัฐิ�ติ�พร ก�านบั�วั รหั�สน�กศึ�กษา รหั�สน�กศึ�กษา 48130974813097

2. 2. นางสาวัติติ�ย์า คำ"าที่�พย์�นางสาวัติติ�ย์า คำ"าที่�พย์� รหั�สน�กศึ�กษา รหั�สน�กศึ�กษา 48131014813101

3. 3. นางสาวัพน�ติน�นที่� ส�ที่ธิ�มู%ล นางสาวัพน�ติน�นที่� ส�ที่ธิ�มู%ล รหั�สน�กศึ�กษา รหั�สน�กศึ�กษา 48131084813108

ที�มงานวิ�จัย

กระบวินการ R-phenylacetylcarbinol ไบโอทีรานส�ฟอร�เมชั่�นแบบสองเฟสที��ใชั่�ตัวิเร งปฏิ�ก�ร�ยาชั่�วิภาพชั่น�ดเซลล�รวิมในสภาวิะเขย า

Biphasic Biphasic RR-phenylacetylcarbinol -phenylacetylcarbinol Biotransformation Biotransformation

Utilizing Whole Cells Biocatalyst Utilizing Whole Cells Biocatalyst in Shaking Conditionin Shaking Condition

ควิามเป)นมาและคำวัามูส"าคำ�ญของโคำรงการ

วั�ติถุ*ประสงคำ� ส�งที่�คำาดวั,าจะได�ร�บั วิสด*อ*ปกรณ์�และวิ�ธี�การทีดลอง ตัารางเวิลาและแผนการด.าเน�นงาน ผลการทีดลอง

เค�าโครงการน.าเสนอ

• ล"าไย์อบัแหั�งที่�ย์�งคำ�างอย์%,ก�ไมู,สามูารถุจ"าหัน,าย์ออกไปได�เน/องจากอาจเก�ดป0ญหัาการปลอมูปนขาย์ในติลาด

• แก�ป0ญหัาด�งกล,าวัด�วัย์การแปรสภาพล"าไย์อบัแหั�ง ที่�3งหัมูดเป4นป*5ย์อ�นที่ร�ย์�และเอที่านอล โคำรงงานวั�จ�ย์น�3

เป4นหัน�งในคำวัามูพย์าย์ามู ที่�จะช่,วัย์แก�ไขป0ญหัาด�งกล,าวัโดย์ที่"าการติ,อย์อดผลงานวั�จ�ย์ที่�มูงานน�กศึ�กษา

ที่*น IRPUS50 ของสกวั. และ YSTP 50 ของสวัที่ช่.

ควิามเป)นมาและควิามส.าคญของโครงการ

จ�งได�น"าล"าไย์อบัแหั�งที่�3งเปล/อกของที่�เส�ย์แล�วัมูาใช่�ในการที่ดลองผล�ติเอที่านอลในสภาวัะที่�ไมู,มู�การเติ�มูแหัล,งอาหัารไนโติรเจน

อ/นเพ�มูและผล�ติ PAC ในสภาวัะ– เพ��มเวิลาในการที.าปฏิ�ก�ร�ยา– เพ��มควิามเข�มข�นของเบนซาลด�ไฮด�ในชั่1นสารอ�นทีร�ย�– เพ��มควิามเข�มข�นของฟอสเฟตับฟเฟอร�– เพ��มควิามเข�มข�นของเซลล�รวิม

โดยม�จั*ดม* งหัมายในการปรบปร*งแก�ไขกระบวินการผล�ตัใหั�ม�ประส�ทีธี�ภาพย��งข21น

1. เพ3�อศึ2กษาการเจัร�ญของเชั่31อจั*ล�นทีร�ย� 15 สายพนธี*� ในระดบ 100 ml ที��ใชั่�อาหัารเล�1ยงเชั่31อเป)นสารสกดจัากล.าไยอบแหั�งหัมดอาย*ที��ม�การเตั�มน.1าตัาลและโมลาซ ที1งน�1ไม ม�การเตั�มแหัล งอาหัารไนโตัรเจันอ3�น2. เพ3�อศึ2กษาจัลนพลศึาสตัร�การเจัร�ญของจั*ล�นทีร�ย�สายพนธี*�ด�ที��ส*ดส.าหัรบการเพาะเล�1ยงในระดบ 1,000 ml ที��ม�สารสกดจัากล.าไยอบแหั�งหัมดอาย*ที��ม�การเตั�มน.1าตัาล และโมลาซ เป)นแหัล งอาหัาร

วิตัถุ*ประสงค�

3. เพ3�อน.าเซลล�รวิมที��ผล�ตัได�ในระดบ 1,000 ml ไปใชั่�ในกระบวินการไบโอทีรานส�ฟอร�เมชั่�นแบบของเหัลวิสองชั่1นในการผล�ตั R-phenylacetylcarbinol จัากไพร7เวิตัและเบนซาลด�ไฮด�

1 . ได�ข�อม7ลการเจัร�ญของเชั่31อจั*ล�นทีร�ย� 15 สายพนธี*� ในระดบ 100 ml ส.าหัรบประกอบการพ�จัารณ์าเพ3�อออกแบบกระบวินการผล�ตัเอทีา

นอลจัากล.าไยอบแหั�งที��หัมดอาย*ในทีางปฏิ�บตั�ได� 2. ได�ข�อม7ลจัลนพลศึาสตัร�การเจัร�ญของจั*ล�นทีร�ย�

สายพนธี*�ด�ที��ส*ดส.าหัรบการเพาะเล�1ยงในระดบ 1,000 ml

ส��งที��คาดวิ าจัะได�รบ

3. ได�ข�อม7ลการผล�ตั R-PAC ด�วิยกระบวินการไบโอทีรานส�ฟอร�เมชั่�นแบบของเหัลวิสองชั่1นจัากไพร7เวิตัและเบนซาลด�ไฮด� ที��สภาวิะเขย า 200 rpm ที�� 6OC เป)น

เวิลา 72 h

4. การที.างานวิ�จัยเป)นที�มได�รบประสบการณ์�และทีกษะในการวิางแผนการทีดลอง

เทีคน�คในการเตัร�ยมอาหัารเล�1ยงเชั่31อ การสกดน.1าตัาลจัากล.าไยอบแหั�งและโมลาซ

วิสด*อ*ปกรณ์�และวิ�ธี�การทีดลอง

การทีดลองที�� 1: การศึ2กษาการเจัร�ญของเชั่31อจั*ล�นทีร�ย� 15 สายพนธี*� ในระดบ 100 ml ที��ใชั่�อาหัารเล�1ยงเชั่31อเป)นสารสกดจัากล.าไยอบแหั�งหัมดอาย*ที��ม�การเตั�มน.1าตัาลและโมลาซและไม ม�การเตั�มมแหัล งอาหัารไนโตัรเจันอ3�น

การทีดลองที�� 2: การศึ2กษาจัลนพลศึาสตัร�การเจัร�ญของจั*ล�นทีร�ย�สายพนธี*�ด�ที��ส*ดส.าหัรบการเพาะเล�1ยงในระดบ 1,000 ml ที��ม�สารสกดจัากล.าไยอบแหั�งหัมดอาย*ที��ม�การเตั�มน.1าตัาลและโมลาซในนอตัราส วิน 1:1 เป)นแหัล งอาหัาร

การทีดลองที�� 3: การน.าเซลล�รวิมที��ผล�ตัได�ในระดบ 1,000 ml ไปใชั่�ในกระ

บวินการไบโอทีรานส�ฟอร�เมชั่�นแบบของเหัลวิสองชั่1นในการผล�ตั R-

phenylacetylcarbinol จัากไพร7เวิตัและเบนซาลด�ไฮด� ที��สภาวิะการเขย า 200 rpm ที�� 6OC เป)นเวิลา 72 h ส.าหัรบมวิลชั่�วิภาพเข�มข�น 3.06 และ 6.12 g เที�ยบ

เที ามวิลชั่�วิภาพแหั�งตั อล�ตัร ตัามล.าดบ

เชั่31อจั*ล�นทีร�ย� และอาหัารเล�1ยงเชั่31อและวิ�ธี�การเตัร�ยม

- อาหัารเล�1ยงเชั่31อระดบ 100 ml ที��ม�แหัล งอาหัารเป)นสารสกดจัากล.าไยอบแหั�งหัมดอาย*ที��ม�การเตั�มน.1าตัาลและโมลาซอตัราส วิน 11:

การปรบสภาวิะเร��มตั�นในการทีดลอง

การเก8บตัวิอย าง

การเติร�ย์มูติ�วัอย์,างเพ/อการวั�เคำราะหั�

วั�ธิ�การวั�เคำราะหั�

การศึ2กษาการเจัร�ญของเชั่31อจั*ล�นทีร�ย� 15 สายพนธี*� ในระดบ 100

ml

ผสมใหั�เข�ากนด�

ที.าการผสมสารละลายโมลาซเข�มข�นและสารสกดล.าไยเข�มข�นจัากล.าไยอบแหั�งหัมดอาย*ที��ม�การเตั�มน.1าตัาล

น.าไปฆ่ าเชั่31อ

ใชั่� dispenser ด7ดสารผสมปร�มาตัร 100 ml ลงในขวิดแก�วิเล�1ยงเชั่31อ จั.านวิน 30 ขวิด

น.าไปแชั่ แข8งที�� -20OC

กล*,มูติ�วัอย์,าง “A” และ “B”

น"ามูาละลาย์ที่�อ*ณหัภ%มู�หั�องแล�วัเก�บัไวั� ณ 4OC เพ/อรอการหัมู*นเหัวั�ย์ง

หัมู*นเหัวั�ย์ง 15 นาที่� 5,000 rpm (2,822 g)

ติะกอนเซลล� ของเหัลวั

ล�างติะกอนเซลล� น"าไปวั�เคำราะหั�

1. ค า pH2. ควิามเข�มข�นของแข8งที��ละลายน.1าได�ที1งหัมด

(TSS)3. ควิามเข�มข�นน.1าตัาลกล7โคส ฟร*กโตัส ซ7โครส4. ควิามเข�มข�นแอลกอฮอล� กรดและสารอ�นทีร�ย�

ที่"าปร�มูาติรส*ดที่�าย์ 10 ml ด�วัย์น"3ากล�นไปวั�เคำราะหั� 5.OD600

ล�างติะกอนเซลล�

หัมู*นเหัวั�ย์ง 15 นาที่� 5,000 rpm (2,822 g)

กล*,มูติ�วัอย์,าง “A” กล*,มูติ�วัอย์,าง “B”

น"าไปวั�เคำราะหั�

หัมู*นเหัวั�ย์ง 15 นาที่� 5,000 rpm (2,822 g)

6. มวิลชั่�วิภาพแหั�ง

น"าไปวั�เคำราะหั�

7. ค าก�จักรรมการที.างานเอนไซม�ไพร7เวิตัด�คาร�บอกซ�เลส

8. ควิามเข�มข�นโปรตั�นที��ละลายน.1าได�

ที1งหัมด

• คำ,า pH • มูวัลช่�วัภาพแหั�ง • คำวัามูเข�มูข�นของแข�งที่�ละลาย์น"3าได�ที่�3งหัมูด • การที่"าใหั�ผน�งเซลล�จ*ล�นที่ร�ย์�เก�ดร%ร� วั• คำวัามูเข�มูข�นของโปรติ�นที่�ละลาย์น"3าได�ในสารละลาย์• คำ,าก�จกรรมูการที่"างานของเอนไซมู�ไพร%เวัติด�คำาร�

บัอกซ�เลสด�วัย์วั�ธิ�คำาร�โบัไลเกส

• คำวัามูเข�มูข�นของน"3าติาล สารอ�นที่ร�ย์� และแอลกอฮ อล� ด�วัย์

HPLC

วิ�ธี�การวิ�เคราะหั�

Coomassie ที่�เจ/อจาง1,000 µl ที่"าปฏิ�ก�ร�ย์า

ก�บัติ�วัอย์,าง 20 µl ใน cuvette ขนาด 1.5 ml

เป4นเวัลา 5 นาที่�

สารสก�ดใส (crude extract)

อ,านคำ,าการด%ดกล/นแสงที่� 595 nm ด�วัย์เคำร/องวั�ดคำ,าการด%ดกล/นแสงแบับั double-beam

คำ"านวัณคำวัามูเข�มูข�นของโปรติ�นในติ�วัอย์,าง

ลกษณ์ะภายนอกเคร3�องวิดค าการด7ดกล3นแสง(spectrophotometer) แบบ double-beam

มวิลชั่�วิภาพแหั�ง = น.1าหันกหัลอดหัม*นเหัวิ��ยงพร�อมตัะกอนเซลล� -

น.1าหันกหัลอดหัม*นเหัวิ��ยงเร��มตั�น

หัลอดหัมู*นเหัวั�ย์งก,อนเก�บัติ�วัอย์,างที่"าการอบัในติ%�คำวับัคำ*มูอ*ณหัภ%มู� ณ 105C เป4นเวัลา 48 h และน"าไปช่�งน"3าหัน�กโดย์ไมู,มู�ฝา

อบัในติ%�คำวับัคำ*มูอ*ณหัภ%มู�

ณ 105C เป4นเวัลา 48 h

แย์กติะกอนเซลล�ด�วัย์เคำร/องหัมู*นเหัวั�ย์ง

หัลอดหัมู*นเหัวั�ย์งพร�อมูติะกอนเซลล�

ช่� งน"3าหัน�กโดย์ไมู,มู�ฝา

หัาคำวัามูเข�มูข�นของมูวัลช่�วัภาพแหั�งในหัน,วัย์ g/l

การชั่�งหัลอดหัม*นเหัวิ��ยงเปล าเพ3�อน.าไปหัาผลตั างมวิลชั่�วิภาพแหั�งภายหัลง

ละลาย์ในสารละลาย์ซ�เติรติบั�ฟเฟอร�คำวัามูเข�มูข�น 200 mM ใหั�ปร�มูาติร1 ml

แช่,ไนโติรเจนเหัลวัแล�วัละลาย์ในอ,างน"3าคำวับัคำ*มูอ*ณหัภ%มู� ณ 30OC

vortex mixer

ที่"าซ"3า 3 รอบั

ใส, glass bead ปร�มูาติร 1 ml ในหัลอดหัมู*นเหัวั�ย์ง vortex 1 นาที่� แช่,น"3าแข�งเกล�ด 1

นาที่�

ที่"าซ"3า 3 รอบั

หัมู*นเหัวั�ย์งแล�วัแย์กเก�บัส,วันสารสก�ดใส

ติะกอนเซลล�

สารสก�ดใส (crude extract) สารละลาย์คำาร�โบัไลเกสบั�ฟเฟอร�

และสารสก�ดใสอย์,างละ 50 µl ที่"าปฏิ�ก�ร�ย์าในอ,างคำวับัคำ*มู

อ*ณหัภ%มู� ณ 25OC เป4นเวัลา 20 นาที่�

ที่"าการเติ�มูกรดไติรคำลอโรอะซ�ติ�กคำวัามูเข�มูข�น 100% (w/v) ปร�มูาณ 10 µl

หัมู*นเหัวั�ย์งที่� 14,000 g เป4นเวัลา 2 นาที่�

ของเหัลวัใสไปวั�เคำราะหั�ปร�มูาณ PAC ที่�ผล�ติได�ด�วัย์เคำร/อง HPLC

คำ"านวัณคำ,าก�จกรรมูการที่"างานของเอนไซมู�ไพร%เวัติด�คำาร�บัอกซ�เลส

การหัม*นเหัวิ��ยงที�� 5,000 rpm (2,822 g)

เป)นเวิลา 15 นาที�

การผสมของเหัลวิหัลงจัากการหัม*นเหัวิ��ยง

เก8บ supernatant แล�วิน.าไปแชั่ ที�� -20◦C

การล�างตัะกอนเซลล�

เคร3�อง vortex

การใชั่� vortex mixer ที.าใหั�เซลล�แขวินลอยอ�กคร1ง

ตัะกอนมวิลชั่�วิภาพแหั�ง

เคร3�องวิด pH (Eutech pH 510)

สารละลายมาตัรฐานที��ใชั่�ในการสอบเที�ยบ

การวิดค า pH ของ supernatant หัลงการหัม*นเหัวิ��ยง

การวิดควิามเข�มข�นของแข8งที��ละลายน.1าได�ที1งหัมด

HPLC (High Pressure Liquid Chromatography )

การจัดระบบกรอง mobile phase ( 0.005 M H2SO4 )

แผนการด.าเน�นงาน

เด3อนม�.ย -.ตั.ค.

2551

พ.ย -.ธี.ค.

2551

ม.ค -.ก.พ.2552

ม�.ค.2552

1 เพาะเล�3ย์งเช่/3อจ*ล�นที่ร�ย์�15 สาย์พ�นธิ*� ในระด�บั 100 ml

     

2 การที่ดลองจลนพลศึาสติร�ในระด�บั 1,000 ml

     

3 การที่ดลอง biotransformation ในสภาวัะเขย์,า ใช่�คำวัามูเข�มูข�นเซลล� จ*ล�นที่ร�ย์�สองระด�บั ณ 72 h

     

4 . จ�ดที่"าราย์งาน