ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ
Акишев Жигер
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ
- Это перераспределение генетического материала между молекулами или внутри молекулы ДНК, приводящее к появлению новых комбинаций генов или других нуклеотидных последовательностей
• Для всех рекомбинационных процессов общим является этап, на котором молекулы ДНК вступают в контакт в участке, где произойдет обмен полинуклеотидными цепями. Этот этап называется «Синапсис». Однако механизм синапсиса при различных типах рекомбинации принципиально различен
Исходя из этого рекомбинационные процессы можно подразделить на следующие типы:
• Гомологичная или общая рекомбинация (она же кроссинговер) – основан на спаривании
комплементарных цепей ДНК. Она требует общей гомологии между рекомбинирующими ДНК и участие большого набора спец белков. Рекомбинация начинается с возникновения в одном или обоих дуплексах участков из одиночных цепей ДНК, после чего которые с помощью белков находят комплементарные последовательности и образуют гетеродуплекс.
Из гомологичной рекомбинации следует выделить ЭКТОПИЧЕСКУЮ
• Она заключается обменах между отдельными участками гомологичной ДНК, разбросанными по геному, что приводит к различным хромосомным перестройкам (инверсии, делеции, дупликации).
Рассмотрение гомологичной рекомбинации начнем с модели кроссинговера предложенную Холлидеем
Чтобы гомологичные молекулы ДНК поменялись своими частями, сначала должны произойти
разрывы в обоих дуплексах. У Холлидея разрывы происходят в два этапа.
Рекомбинация начинается с разрывов фосфодиэфирных связей ДНК.
• Далее от точек разрывов происходит обмен цепями что приводит к образованию
крестообразной структуры, получившей впоследствии название “полухиазма
Холлидея”.
• Затем, перемещение точки перекреста цепей в полухиазме вдоль рекомбинирующих дуплексов.
• Такое явление описано под названием “миграция ветвления”. От точки перекреста цепей происходит расплетание исходных дуплексов и высвобождающиеся цепи тут же ренатурируют с комплементарными цепями из гомологичных дуплексов, что приводит к образованию и последующему удлинению гетеродуплекса.
• Гетеродуплекс сформирован. Структура должна
разделиться на гомологи. Это называется разрешением
полухиазмы. Для разрешения необходимы еще два
разрыва: вторичные разрывы завершат обмен цепями. Но прежде, полухиазма должна
претерпеть еще одно превращение — изомеризацию.
Изомеризация заключается в изменении структуры
полухиазмы,
• Небольшое отступление по поводу одного важного процесса. От исходных молекул в рекомбинационный гетеродуплекс могут войти разные аллели, и тогда в нем возникнут неспаренные основания, которые локально нарушат
структуру двойной спирали ДНК. Эти нарушения узнаются ферментными системами, эксцизионной репарации.
Они проводят коррекцию неспаренных оснований в гетеродуплексе: удаляют неспаренное основание в одной цепи ДНК и застраивают образующуюся брешь по матрице другого аллеля в комплементарной цепи, тем самым превращая (конвертируя) один аллель в
другой. Это явление было давно известно под названием “конверсия гена”.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ
Генетический материал, передаваемый реципиентам при конъюгации и трансдукции, отличается только
размерами. Далее донорный фрагмент должен заменить гомологичную часть хромосомы
реципиента с помощью парных кроссинговеров, проходящих вблизи концов фрагмента.
Рассмотрим механизм самого кроссинговера
• Самый главный белок RecA — продукт гена recA. Белок имеет небольшой размер (всего около 38 кД) и проявляет разнообразные активности. Этот белок участвует не только в рекомбинации, но и
в репарации ДНК.• Основное назначение белка RecA — приводить
во взаимодействие одноцепочечную ДНК с гомологичным дуплексом. В зависимости от
структуры ДНК-субстратов белок может проводить разные рекомбинационные реакции.
Схемы трех рекомбинационных реакций, осуществляемых белком RecA E.coli in vitro
• Важнейшее свойство белка RecA определяется наличием у него двух сайтов связывания с ДНК.
— Первый для первичного связывания с ДНК. В результате возникает нитевидное образование
— RecA-ДНК-филамент. Если оцДНК была в составе двуцепочечной молекулы, то
формирование филамента распространяется на дуплекс. В филаменте двуцепочечная ДНК
изменяет свою конформацию.
• Формирование филамента завершает пресинаптическую
стадию кроссинговера.• Реакции синаптической стадии
кроссинговера, происходят только внутри филаментов. При этом филаменты могут вступать в
рекомбинацию только с “голой”, не находящейся в филаменте ДНК.
Взаимодействие филамента с голой ДНК осуществляется за счет второго
сайта связывания RecA.
• Гомологичное связывание начинается с образования D-
петли. – одноцепочечная ДНК
внедряется в дуплекс и образует двойную спираль с одной, комплементарной ей
цепью дуплекса, одновременно вытесняя вторую цепь. D-петля может быть закрытой, если в
дуплекс внедряется одноцепочечный хвост (а) ,
– или открытой, если она формируется на конце
линейного дуплекса (в).
На следующем этапе — постсинапсисе гетеродуплекс удлиняется путем миграции
ветвления, которую in vitro также может осуществлять белок RecA.
• В условиях in vivo, вместе с RecA задействованы другие белки, где распределение обязанностей может быть несколько иным. Например, в клетке белок RecA не проводит миграцию ветвления. Это более эффективно делают другие специальные белки. Разнообразие белков, работающих вместе с RecA, отражает разнообразие путей рекомбинации.
Основной путь рекомбинации у E. coli — RecBCD.
• Главную роль здесь играет фермент RecBCD-нуклеаза, которой кодируются генами recB, recC и recD. RecBCD имеет экзонуклеазную и хеликазную активность. Наконец, фермент работает как сайт-специфическая эндонуклеаза: расщепляет одноцепочечную ДНК около особой 8-нуклеотидной последовательности 5'-GCTGGTGG-3', называемой Chi-сайтом.
RecBCD-нуклеаза
• Один из самых ранних белков рекомбинации. Она готовит субстрат для белка RecA: линейный дуплекс донорной ДНК с тупыми концами. Именно такая ДНК необходима для рекомбинации с реципиентной хромосомой с участием RecBCD. Фермент атакует конец дуплекса и начинает расплетать его.
• Продолжая расплетать дуплекс, RecBCD- нуклеаза сохраняет петлю в 3'-цепи и продвигает ее вдоль дуплекса.
Поскольку после прохождения фермента комплементарные цепи ренатурируют (“схлопываются”), в
5'-цепи автоматически возникает вторая петля.
Двойная петля продвигается вдоль дуплекса до тех пор, пока фермент не встретит Chi-сайт в 3'-цепи. Фермент должен
подойти к Chi-сайту справа, с 3'-стороны. На расстоянии 4—6 нуклеотидов до него RecBCD разрывает 3'-цепь
• Дальнейшее расплетание дуплекса приводит к вытеснению рекомбиногенного одноцепочечного 3'-конца, который связывается с белком RecA.
После этого происходит уже известная цепь событий. На 3'-конце сначала формируется филамент, затем образуется D-петля (закрытая, так как возникает в кольцевой хромосоме)
и так далее.
• Последующие этапы — миграцию ветвления и разрешение полухиазмы осуществляют RuvA, RuvB и RuvC. RuvA узнает
крестообразную полухиазму и нацеливает на нее RuvB. Последний узнает комплекс RuvA—полухиазма и, используя
энергию АТФ и работая как ДНК-хеликаза, осуществляет миграцию полухиазмы в том же направлении, что и RecA-белок
in vitro, но гораздо эффективнее. Здесь вступает резолваза RuvC: она узнает комплекс RuvB-полухиазма, связывается с ним
и в определенный момент разрешает полухиазму способом, описанным Холлидеем.
Сайт разрываСайт разрыва
Димер RuvC
Рекомбинантная
цепьинтактная цепь
Реакция разрешения полухиазмы,
катализируемая эндонуклеазой RuvC E.coli
• Перечисленные выше белки далеко не исчерпывают список участников кроссинговера у E. coli. Сюда входят также различные белки,
помогающие RecA, белки, участвующие в альтернативных путях рекомбинации, и белки общего метаболизма ДНК: ДНК-гираза, ДНК-
полимераза, ДНК-лигаза и группа белков, осуществляющих коррекцию неспаренных
оснований в рекомбинационном гетеродуплексе.
Ген Белок Активности
Инициаторы (пресинапсис)
recBRecBCD
АТФаза, ДНК-хеликаза, ДН ДНК экзонуклеаза, ОН ДНК экзонуклеаза,Chi-специфическая эндонуклеаза.Формирует рекомбиногенный 3’-хвост иучаствует в формированииRecA-ДНК-филамента
recC
recD
recE ExoVIII 5’-3’ ДН ДНК экзонуклеаза (изозим экзонуклезы l)
recJ RecJ 5’-3’ ОН ДНК экзонуклеаза
recQ RecQ ДНК-хеликаза
xseA ExoVII 5’- ОН ДНК экзонуклеаза
ssb SSB Белок, связывающийся с ОН ДНК истабилизирующий ее
Гены и белки гомологичной рекомбинации
Ген Белок Активности
Гомологичное спаривание и strand exchange (синапсис)
recA RecA Формирует RecA-ДНК-филамент, которыйкатализирует гомоголичное спаривание иstrand exchange и является копротеазойбелков LexA, репрессора l, UmuD и др.
recF RecF Белок, связывающийся с ОН ДНК; можетфункционировать в комплексе с RecO и RecRи участвовать в формировании RecA-ДНК-филамента
recO
recR
RecO
RecR
Совместно cтимулируют связывание белка RecA с ОН ДНК (участвуют в формировании RecA-ДНК-филамента)
ssb SSB
Ген Белок Активности
Миграция и разрешение полухиазмы (постсинапсис)
ruvA RuvA Специфическое связывание с точкой перекреста вструктуре Холлидея, нацеливает RuvB на ДНК
ruvB RuvB АТФаза, ДНК-хеликаза,осуществляет миграциюполухиазмы (вместе с RuvA)
ruvC RuvC Специфическая эндонуклеаза, разрешающая структуры Холлидея
recG RecG АТФаза, ДНК-хеликаза, специфически связывающаяся с точкой перекреста в структуре Холлидея, осуществляет миграцию полухиазмы
rusA RusA Специфическая эндонуклеаза, разрешающая структуры Холлидея
Принципиально иными являются три других типа рекомбинации, которые основаны не на взаимодействии комплементарных цепей ДНК, а на совершенно иных механизмах и участии иных белков: сайт-специфическая рекомбинация, транспозиции и незаконная рекомбинация.
САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ• Сайт-специфическая
рекомбинация происходит между специфическими последовательностями ДНК в пределах очень коротких участков гомологии, обычно 15—30 п.н. Она обеспечивает интеграцию (включение) ДНК умеренных фагов в хромосомы бактерий, инверсию, а также другие процессы, играющие важную роль в циклах развития фагов и бактерий.
• Наиболее изучена она у умеренного бактериофага лямбда. – После инфекции в клетку E. coli
линейная вирионная двуцепочечная ДНК фага замыкается в кольцо за счет имеющихся на ее концах комплементарных одноцепочечных последовательностей. Последующее развитие фага может идти по пути интеграции в хромосому бактерии между генами gal и bio. Интеграция происходит путем рекомбинации между особыми att (attachment)- сайтами: attP в хромосоме фага и attB в хромосоме бактерии. Интегрированный фаг называется профагом. Он фланкирован рекомбинантными сайтами attL (левый) и attR (правый). Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы происходит в обратной последовательности событий.
P, P' и B, B' - последовательности сайтов attP и attB соответственно, окружающие
центральную часть (О). A, J, N и R - гены фага.
• Из нее видно, что в интегративной рекомбинации участвуют сайты attP и attB, продукт фагового гена int (интеграза) и белок IHF (Integration Host Factor) E. coli. Для эксцизии необходимы сайты attL и attR, те же белки и еще продукт фагового гена xis.
Cначала интеграза производит обмен между двумя цепями
одинаковой полярности (разрыв и воссоединение цепей происходят
между строго определенными нуклеотидами в центральной части att-сайтов (а)). Возникает структура
соответствующая полухиазме Холлидея (б). Затем на расстоянии 7
п.н. происходит вторая пара обменов между двумя другими цепями. Вторая пара обменов
приводит к интеграции фага (в); интегрированный профаг
фланкирован рекомбинантными сайтами attL и attR.
• Сайт-специфическая рекомбинация- катализируется инвертазами бактерий и фагов.
• Пример инвертаза фага Mu. • В центральной части своей хромосомы фаг содержит
особый сегмент G размером около 3 т.п.н. Сегмент имеет повторы на которых присутствует специфический рекомбинационный сайт, где инвертаза проводит
рекомбинацию. 4 субъединицы фермента, по одной субъединице на каждую цепь ДНК одновременно расщепляют все цепи, образуя 5'-P и 3'-ОН-концы. Разрывы цепей в каждом дуплексе происходят на
расстоянии 2 п.н., так что 3'-конец выступает. Фермент ковалентно связывается с 5'-Р-концами. Затем одна часть
первого дуплекса меняется местами с такой же частью второго дуплекса, после чего восстанавливаются фосфодиэфирные связи во всех четырех цепях.
ТРАНСПОЗИЦИИ• В основе лежат перемещение подвижных генетических
элементов. Транспозиции осуществляются белками, ген которых в основном локализован в самих подвижных элементах. Главный белок транспозиции — транспозаза. Подвижные элементы с короткими обращенными повторами (а) характерны для бактерий, растений и дрозофилы. Элементы с длинными обращенными повторами (б) описаны у бактерий.
• Сначала транспозаза сводит вместе концы и делает разрывы (а). Затем она сводит в контакт концы элемента и дуп лекс ДНК-мишени. При этом она делает в обеих це пях ДНК-мишени ступенчатые разрывы (б).
• Следующий этап — обмен цепями, приводящий к рекомбинации между ДНК элемента и мишени. 3'-ОН-концы элемента соединя ются с 5'-Р-концами мишени, оставляя за счет ступенчатости разрывов бреши между 5'-Р-концами элемента и 3'-ОН-концами мишени (в). На следующем этапе бреши заполняются путем репаративной репликации ДНК по матрице ДНК-мишени (г). Заполнение брешей является причиной возникновения прямых повторов ДНК-мишени на концах элемента (д).
Общий принцип реакций транспозиции:
репликативная транспозиция
нерепликативная транспозиция
перемещение ретротранспозонов
Можно выделить три основных механизма рекомбинации при
транспозициях:
• Репликативная транспозиция — относительно редкий механизм. Он обнаружен у фага Mu и бактериальных транспозонов семейства Tn3 с короткими обращенными повторами.
• Репликативная транспозиция (а) отличается тем, что подвижный элемент, перемещаясь в другую молекулу, оставляет свою копию в исходной ДНК. Произойдет это за счет удвоения элемента. При этом кольцевые ДНК донора и мишени сливаются, образуя коинтеграт, в котором последовательности обеих молекул разделены двумя копиями элемента, расположенными в одной ориентации. Далее происходит разрешение коинтеграта на исходные молекулы. Последняя реакция осуществляется по механизму сайт-специфической рекомбинации ферментом резолвазой.
• Неконсервативная транспозиция заключается в вырезании элемента
и его перемещении в новое место. У ретротранспозонов с длинными
концевыми повторами транспозиция происходит по схеме, включающей РНК-интермедиат. В этом процессе участвуют специальные ферменты,
кодируемые самими ретротранспозонами В их
центральной части расположен ген pol, кодирующий несколько
необходимых для транспозиции ферментов: интегразу, обратную
транскриптазу и РНКазу H, которые первоначально образуются в виде общего белка, а потом нарезаются на отдельные белки под действием
специальной протеазы, также кодируемой геном pol.
• С геномной ДНК элемента транскрибируется РНК-копия, но уже с короткими концевыми прямыми повторами, с нее путем обратной транскрипции синтезируется ДНК-копия с длинными повторами, которая встраивается в новое место с помощью интегразы.
НЕЗАКОННАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ
• Эта рекомбинация происходит без гомологии между молекулами ДНК, и при этом без участия механизмов сайт-специфической рекомбинации или транспозиций. В качестве примеров можно привести захват ретровирусом некоторых клеточных генов при его эксцизии из хромосомы хозяйской клетки.
• Впервые механизм был описан японским исследователем Х. Икедой в 1982 году. В опыте in vitro провели рекомбинацию между полностью негомологичными ДНК плазмиды pBR322 и фага лямбда, катализируемую высокоочищенной топоизомеразой II (ДНК- гиразой) E. coli.
• Согласно модели две молекулы гиразы временно разрывают в обеих молекулах обе цепи ДНК, удерживая их концы. Затем они обмениваются парами субъединиц вместе с удерживаемыми концами разных ДНК-партнеров и сшивают концы дуплексов. Позднее Икеда показал такую рекомбинацию и in vivo в клетках E. coli.
Литература
• В. М. ГЛАЗЕР // ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ БЕЗ ГОМОЛОГИИ: ПРОЦЕССЫ, ВЕДУЩИЕ К ПЕРЕСТРОЙКАМ В ГЕНОМЕ //
• В. М. ГЛАЗЕР // ГОМОЛОГИЧНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ // 1998 год// Соровский журнал.
Top Related