«ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ»
ΕΙΔΙΚΑ ΚΕΦΑΛΑΙΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣΕΙΔΙΚΑ ΚΕΦΑΛΑΙΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ
Διάλεξη:
Παρουσίαση: Δρ. Μ.Χ. Αντωνέλου, 07/05/08
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
http://kyttariki.biol.uoa.gr, http://multimedia.biol.uoa.gr
Ιστοσελίδες μαθημάτων
ΕΡΥΘΡΟΕΙΔΗ ΚΥΤΤΑΡΑRBC (XVII)
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΟ
90μm3 -140μm2 (98μm2)
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ
X100.000
Μία από τις καλύτερα μελετημένες
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
(Μαργαρίτης & Παπασιδέρη, 1979; Materia Medica Greca, 1:47)
(Margaritis et al., 1977; J.Cell Biology, 72:47)
X62.000
6-9nm
Ψυκτοεξάχνωση/Μονόπλευρη σκίαση
Ψυκτοεξάχνωση/Κυκλική σκίασηΕπανασυγκροτημένα λιπιδικά κυστίδια
30Α90Α
X230.000
1960-’70D. BrantonH. Moore
• Tυπικοί και «ιδιαίτεροι»• Μεταφορά υλικών και πληροφορίας,
ηλεκτροχημικό δυναμικό, επικοινωνία, ανοσολογική αναγνώριση, μεταγωγή σήματος κλπ
• Ικανότητα ελαστικής παραμόρφωσης RBC (cellular deformability)
γεωμετρία ιξώδες κυτταροπλάσματος μηχανικές ιδιότητες
μεμβράνης• membrane deformability • membrane stability
ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΙ ΡΟΛΟΙ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΙ ΡΟΛΟΙ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
•ελαστική/εκτατή/συμπιέσιμη-ανθεκτική
ΛΙΠΙΔΙΑΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ
95%
Sp4.1
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΛΙΠΙΔΙΑΚΗ ΚΑΤΑΝΟΜΗ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
0
25
50
25
50
Tota
l p
hosp
holip
id (
%)
Total
SM PC
PE
PS
PA PIPn
SM, sphingomyelinPC, phosphatidylcholinePE, phosphatidylethanolaminePS, phosphatidylserinePA, phosphatidic acidPIPn, phosphatidylinositol-(n)-phosphate
(Daleke DL, Curr.Opin.Hematol., 15:191, 2008)
Outer leaflet
Inner leaflet
• Απομόνωση: Υποτονική αιμόλυση (20mOsm)• Dodge et al., 1963; Arch. Biochem. Biophys., 100:119• Steck et al., 1971; Biochemistry 10:2617
Steck T.L., 1974; J. Cell Biol., 62:1
ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
•“White ghosts”
σπεκτρίνες (1, 2) (280kd)
Ζώνη 3 (ΑΕ1) (90-100kd)4.1R
4.2 (παλλιδίνη) (72kd)
αγκυρίνες (2.1, 2.2, 2.3 κλπ)
4.9 (δεματίνη)5 (β-ακτίνη) (45kd)6 (G3PD)
7 (7.2b στοματίνη) (32kd)8 (?) (21kd)
αιμοσφαιρίνη (12-16kd)
(Laemmli U.K., 1970)
αSp βSpank 2.12.2
2.3
34.14.24.9578
(Fairbanks et al., 1971)
ghosts
ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
γλυκοφορίνες
ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
Αντιγόνα ομάδων αίματος
ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ
ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ
Οι πρωτεΐνες της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης έχουν μεγάλο βαθμό συγκρότησης/ολιγομερισμού
(Bruschi et al., 2005; J Proteome Res., 4:1304)
> 500 spots
ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ
(Kakhniashvili et al., 2004; Mol Cell Proteomics, 3:501)
ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
(Kakhniashvili et al., 2004; Mol Cell Proteomics, 3:501)
ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ
GpA, CD59
CD44BCAM
RAP1A, RalA
G3PDaldolase
Glutathionetransferase
2C
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ
(Pasini et al., Blood 2006)(Pasini et al., Blood 2006)
340 proteins in membrane (252 soluble) (30% Membr.prot=B3)
Binding (115), catalytic activity (98), transporters (47), signal transducer (29), structural activity (24) (small GTPases the most numerous intracellular signaling proteins in RBCs)
(20) (SA)
(Goodman et al., Exp.Biol.Med 232:1391, 2007 751 RBC membrane proteins)
4 ΔΕΚΑΕΤΙΕΣ ΜΕΛΕΤΗΣ
αφθονία, προσβασιμότητα
αρχετυπικό σύστημα μελέτης
νέες πρωτεϊνες, συμπλέγματα, δομές
καθαρότητα
κληρονομικέςμεμβρανοπάθειες
κοινές αιματολογικές(και μη-) νόσοι
μη-ερυθροειδή κύτταρα
μη-αιματολογικοίκλινικοί φαινότυποι
ωρίμανση, γήρανση,κυτταρική απόσυρση
ΠΚΘ, απουσία πυρήνα, μιτοχονδρίων
αποτελεσματικότηταμεταγγίσεων
εξωκυττάριακυστιδιοποίηση
DRM’s/rafts
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
(Low)
ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
(Delaunay J., Blood Reviews, 2006)
ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
(gas-channels: ammonium transport function)
Band 3 macrocomplex
4.2 CD47, RhAG glycozyl.
B3-mut 4.2, CD47, Rh, RhAG
Άμεση αλληλεπίδρ.
και CD47/4.2
ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ
LIPID RAFTS
Σχηματίζουν απομονωμένες πλατφόρμες (μικροδιαμερισματοποίηση) στη μεμβράνη λειτουργικά σημαντικές για τη δημιουργία συμπλόκων σηματοδότησης, διαλογή μεμβρανικών πρωτεϊνών
Lipid rafts (Λιπιδικές μικροδομές ή «σχεδίες» ή «κανώ» DRM)
Εκτεταμένες/πακεταρισμένες αλκυλοαλυσίδες λιπιδίων
Ενσωμάτωση/αποκλεισμός
Πρωτεΐνη-πρωτεΐνηΠρωτεΐνη-λιπίδια
Lipid rafts ΕΜ: πλούσια σε σφιγγολιπίδια, χοληστερόλη και πρωτεΐνες (0.1%-3% of total EM proteins) όπως GPI-anchored proteins (AChE), stomatin (Δ, 7.2b), flotillins (Δ), Β3, peroxiredoxin-2, Hb, synexin, sorcin
T
(Salzer and Prohaska, (Salzer and Prohaska, 2001; 2001; Blood, 97:1141Blood, 97:1141))
Μερική συσχέτιση ορισμένων κατηγοριών RBC-LR με το σκελετό μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων ή δεν περιέχουν καθόλου σκελετικές πρωτεΐνες? Gαs, Sp, actin, 4.1, 4.2 (εν μέρει σχετίζονται)
LIPID RAFTS
5 κύριες και πολλές δευτερεύουσες πρωτεΐνες(Murphy et al, (Murphy et al, 2004; 2004; Blood, 103:1920Blood, 103:1920))
Πολλαπλοί πληθυσμοί Lipid Rafts (stomatin/flotillin/synexin)
ΜΔΕ-2008-Μεμβρανοπάθειες-Αντωνέλου
LIPID RAFTS
ANIONTOΑΝΤΑΛΛΑΚΤΗΣ
Ανταλλαγή ανιόντων
Ανταλλαγή αερίων αναπνοής
ANIONTOΑΝΤΑΛΛΑΚΤΗΣ
Carbonic anhydrase II (metabolon with B3)
Η ζώνη-3 είναι ο κύριος συνδέτης της μεμβράνης με το σκελετό
ANIONTOΑΝΤΑΛΛΑΚΤΗΣ
•Πολυλειτουργική•Γλυκοζυλιωμένη•Φωσφορυλιώνεται•Αντιγόνα Diego•Ρύθμιση μεταβολισμού•Γήρανση RBC•Υποδοχέας παρασίτου ελονοσ.•Νεφροί (pH) και εγκέφαλος (μίτ.)
911αα / 90-100 kDa
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
52 kDa
43 kDa
33αα
ANIONTOΑΝΤΑΛΛΑΚΤΗΣ
•H συσσωμάτωση της ζώνης-3 αυξάνει με την ηλικία/οξείδωση/μόλυνση•Mutations: HS, SAO, HSt, oξέωση νεφρικών σωληναρίων.
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
TEΤΡΑΜΕΡΗ
ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ
ΚΥΡΙΕΣ ΔΕΥΤΕΡΕΥΟΥΣΕΣ
ΕΡΥΘΡΟΕΙΔΙΚΕΣ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ
GpA
•Ρυθμιστική πρωτεΐνη του συμπληρώματος•Αντιγόνα ομάδων αίματος MN, Wright (Β=Ss)•Φωσφορυλιώνεται•Υποδοχείς παρασίτου ελονοσίας και Sendai•Cell recognition/erythrophagocytosis•Λειτουργεί αντισταθμιστικά με band 3•(-)GpA, (-) GpB Φυσιολ. Μηχανική RBC•Με πρόσδεση IgGs Sk, Deform., B3•Band 3, 4.1, 4.2 (?)•CDA I, II, ΡΝΗ
RBC-specific
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ
Διμερισμός GpA στην ερυθροκυτταρική μεμβράνη
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ
H GpA είναι πρωτεΐνη-συνοδός της B3 κατά τη βιοσύνθεση/trafficking
(Williamson & Toye, BCMD, 2008, in press)
106 copies/RBC
Anti-GpA decrease in the rotational mobility of B3Most dRTA mutations of B3 do not cause RBC phenotype due to GpA
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ
Γλυκοφορίνη C
•Δευτερεύουσες γλυκοφορίνες•Μη-ερυθροειδικές (πνεύμ., ήπαρ, νεφροί)•Gerbich (Ge), Lsa, Webb, Dha•3 domains
I
II
III
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΓΛΥΚΟΦΟΡΙΝΕΣ
(ΜcMulin, 1999)
p55
Γλυκοφορίνη C
Ρύθμιση κυτταρικού σχήματοςΡύθμιση μηχανικών ιδιοτήτων
GpC-----4.1R*-----p55
Hereditary elliptocysosis + variationsΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΤΟΜΑΤΙΝΗ
(Wang &Morrow, 2000)
7.2b
•31kDa, 7.2b
•Εφράζεται σε διαφορετικούς Ιστούς
•Υδρόφοβο domain (NH2, COOH* cyt)
•Membrane-associated (integral)
•Oligomeric (9-12 monomers)
•Κύριο συστατικό των RBC LR
•Σύνδεση με Sk
•$ in folds and protrusions
•Ρύθμιση διαπερατότητας ιοντ. Καναλ
•Ανοσοκατακρημνίζεται με μεταφ. Γλυκόζης
•Hereditary stomatocytosis (mutations?)ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
• Channel-forming integral protein (CHIP28)Channel-forming integral protein (CHIP28)• Κύριος πρωτεϊνικός δίαυλος νερού• Αρχετυπικό μέλος υδατοπορινών• Οσμωτικός-υδατοεπιλεκτικός πόρος• Ομοτετραμερές (4 πόροι) (γλυκοζυλιωμένος)• NH2, COOH in cytoplasm• Άφθονη σε νεφρούς, επιθήλια• (-/-) όχι κλινική συμπτωματολογία
ΥΔΑΤΟΠΟΡΙΝΗ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
• GLUT1GLUT1• Μη-ερυθροειδική• 55 kDa, 700.000 • 12TM, NH2, COOH• Part of 4.5b• Ετερογενώς γλυκοζυλιωμένη σακχ.καταλοίπων ενεργότητα μεταφ.• Επιταχύνει παθητική διάχυση γλυκόζης• Dimers/tetramers
ΜΕΤΑΦΟΡΕΑΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
• 140 kDa• Εξαρτώμενη από ATP αποβολή
Ca++• Ανταλλαγή Ca++/H+• Ενεργοποιείται από το
σύμπλεγμα calmodulin/Ca++
ATP-άση ιόντων Ca++
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΙΑΡ, Integrin-associated protein
Surface glycoprotein, 50kd, storage lesion
Σε nl RBC, η CD47 προσδένεται και ενεργοποιεί τη ρυθμιστική πρωτείνη α (SIRPa) των μακροφάγων, οδηγώντας σε παρεμπόδιση της ενεργοποίησής τους & της ερυθροφαγοκυττάρωσης (CD47-SIRPa signalling)
CD47
(Delaunay J., Blood Reviews, 2006)
Σύμπλοκο Rhesus
ΣΚΕΛΕΤΟΣ
βιμεντίνηδεσμίνη
Εκχύλιση κυττάρου με Triton X-100
3D structure
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΚΕΛΕΤΟΣ
2D-structure
Sp’s
4.1
actin
ίχνη Hb
σκελετοί
Κοντά πρωτονημάτια ακτίνης (33-37 nm)
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΚΕΛΕΤΟΣIδιαίτερα ανεπτυγμένος (65%) εξασφαλίζει μηχανικές ιδιότητες
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΚΕΛΕΤΟΣ
Αυτό το μοντέλο βρίσκει εφαρμογή και σε άλλους ιστούς/κύτταρα/ οργανίδια με διαφορετική όμως οργάνωση και λειτουργία
ΣΗΜΕΙΑ ΣΥΝΔΕΣΗΣ:
1) Sp-ank (band 3) (***)
2) Sp-4.1R-actin-p55-GpC
3) Rh, RhAG-ank
4) Sp, 4.1R PS
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
(Liu et al., 1987; J.Cell Biol., 104:527-536)
ΣΚΕΛΕΤΟΣ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
Πυκνό και νηματώδες δίκτυο, αλλά με έκταση και αρνητική χρώση…
(Palek & Sahr,1992)
ΣΚΕΛΕΤΟΣ
ΣΚΕΛΕΤΟΣ
ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΖΕΥΞΗΣ:ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΖΕΥΞΗΣ:
Τα κομβικά σημεία διασταύρωσης
των SpT μεταξύ τους και με τα
πρωτονημάτια ακτίνης
Οριζόντιες διαπρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις σε επίπεδο SK
240-360 ΣΖ/μm2
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ
•Eκτεταμένο, γραμμικό, εύκαμπτο, αρθρωτό, πολυλειτουργικό μόριο
•α, β υπομονάδες, ΑΥΤΟΣΥΓΚΡΟΤΟΥΜΕΝΕΣ σε διμερή, τετραμερή
•Πλευρική και αντιπαράλληλη σύνδεση (αβ)
•Head-to-head of 2 (αβ) tetramer α2β2
•3-6 nm, 200-260 nm
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ
• Αρχαίες πρωτεΐνες, αλλά στην εξελιγμένη τους μορφή υπάρχουν μόνο στα μετάζωα
• 2 γονίδια α (chr1), 4 β-, 1 γονίδιο β-Η (chr14) (human)
• Συνδυασμοί ετεροτετραμερή λειτουργίες• Σκελετικός μυς, Golgi homo-Τ-β• Eπιθήλια, νευρικό σύστημα• αρχετυπικό μέλος υπεροικογένειας Sp και δικτύων
Sp σε άλλα κύτταρα, υποκυτταρικά οργανίδια και ιστούς
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
• Μοριακό ελατήριο
• Διμερή: 29-37 nm in situ, 100 nm σε έκταση
• Τετραμερή: 200-260 nm
ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ
22 domains
**
Επαναλήψεις δομής τριπλής έλικας
19 domains
•Οι τριπλές έλικες σταθεροποιούνται από αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε υδρόφοβα κατάλοιπα που βρίσκονται σε συγκεκριμένες αποστάσεις μεταξύ τους ακολουθώντας ένα επαναλαμβανόμενο πρότυπο
•Ελατήρια προασαρμοζόμενου μήκους
•Δομική ομολογία, αλλά εν μέρει διαφορετικά λειτουργικά μόρια (αποικ)ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ
Υπο-domains κάθε υπομονάδας ανθεκτικά στη θρυψίνη (HE)
1D-SDS-PAGE
2D-electrophoresis
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ
Oι σπεκτρίνες είναι μόρια αυτοσυγκροτούμενααυτοσυγκροτούμενα, υψηλή συγγένεια αλληλεπ.
Η αυτοσυγκρότηση in vitro είναι ανάλογη ΤoC και [Sp]
In vivo (37oC) ευνοούνται τα ΤSp λόγω πολύ υψηλής [Sp]
Tα TSp είναι η φυσιολογική μορφή συγκρότησης της Sp στο Sk (HE)
ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ
Πυρήνωση ετεροδιμερούς
β1-β4
α19-α22
Αρχικά αναπτύσσονται ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσειςηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε α και β-υπομονάδες στη θέση πυρήνωσης οι οποίες εξασφαλίζουν το ζευγάρωμα στη σωστή φάση των τριπλετών κατά μήκος του διμερούς. Μετά την αρχική διασύνδεση, το διμερές σταθεροποιείται από υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις έλικες (ασθενείς, αλλά πολλές), και περιελίσσεται η μία υπομονάδα γύρω από την άλλη σα σχοινί.
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΠΕΚΤΡΙΝΗ
Αυτοσυγκρότηση ετεροτετραμερούς
α1α2
β17
υβριδική τριπλέτα
Mη-ομοιοπολική διασύνδεση, ενδογενής ιδιότητα (Hb)
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΠΕΚΤΡΙΝΗΑυτοσυγκρότηση ετεροτετραμερούς
•pH•Ιοντική ισχύ•Θερμοκρασία•Συγκέντρωση Sp
Υψηλής-συγγένειας Υψηλής-συγγένειας Sp-AnkSp-Ank τοπικές [Sp] υπομεμβρανικά που ευνοούν τον ολιγομερισμό
Αντίθετα, η διασύνδεση διασύνδεση Sp-actin Sp-actin είναι χαμηλής συγγένειαςείναι χαμηλής συγγένειας (μη-αυτοσυγκροτούμενη) και χρειάζεται την 4.1R
Συνδέσεις Sp: διαμεμβρανικές πρωτεΐνες απευθείας
διαμέσου ank
με φωσφολιπίδια
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΑΚΤΙΝΗ
•Μόνο β-ισομορφήβ-ισομορφή (βγ)•Κοντά πρωτονημάτια 33-37 Κοντά πρωτονημάτια 33-37 nmnm (δευτεροταγής δομή, αλληλεπιδράσεις)•Μονομερής ακτίνη (G) ΔΕΝ συμμετέχει στο Sk•Aπαντάται στα σύμπλοκα ζεύξης μαζί με 4.14.1RR και SpSp•Mετά την πρόσδεση ενός μορίου 4.1R προκαλούνται δομικές αλλαγές στο πρωτονημάτιο που ευνοούν την πρόσδεση extra 4.1R, Sp
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
4.1R
Βοηθητική Sp-actin, GpC-p55
Σύμπλοκα ζεύξης
200.000 αντίγραφα/RBC
Aρχετυπικό μέλος 4.1 family
Eγκέφαλος, ήπαρ, έντερο, πάγκρεας, μετασυναπτικές μεμβράνες, πυρήνας, κυτταρικοί σύνδεσμοι
Σχηματίζει πολυμοριακά σύμπλοκα με διαμεμβρανικές & άλλες πρωτεΐνες με ρόλο στη δομική σταθερότητα και μεταγωγή σήματος(Han et al., Nat.Struct.Biol., 7:871, 2000)
ΑΝΚ*
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
4.1R
•Οι αλληλεπιδράσεις της 4.1R ρυθμίζονται με φωσφορυλίωση και από το σύστημα calmodulin/Ca++ (αναστολή σύνδεσης σε μεμβράνη & Sp/actin).•H πρόσδεση Ca++ στην calmodulin αυξάνει (20x) την πρόσδεση της calmodulin στην εξαρτώμενη από ασβέστιο θέση πρόσδεσης calmodulin της 4.1. Αυτό προκαλεί αλλαγή στη διαμόρφωση της 4.1 που επιφέρει εξασθένιση των αλληλεπιδράσεών της με τις p55, GpC, B3
4.1R
Aρθρωτή πρωτεΐνη-3 domains: Ι. Πρόσδεσης σε μεμβράνη (PS, B3, p55, calmodulin) ΙΙ. Πρόσδεσης σε Sp/actin (σπονδυλόζωα, ΗΕ) III. COOH domain (απόλυτα συντηρημένο στα μετάζωα)
General
Brain
Neuron
ΘηλαστικάΘηλαστικά(εκτεταμέναγεγονόταεναλλακτικούματίσματοςκαι θέσεωνέναρξηςΜΦΡ mRNA)
RBC
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
4.1R
Ghosts (Laemmli-linear 5-15%)
•Ο καλύτερος δείκτης της ηλικίας του Ο καλύτερος δείκτης της ηλικίας του RBCRBC
•SDS-PAGE: 4.1α/β, 80 & 78 kDa
•Μετα-ΜΦΡ τροποποίηση της Asn502 που συμβαίνεισταδιακά και αργά και προκαλεί β α.
4.1β/α: περιφερική αιμόλυση, αυξημένα ΔΕΚ
•Πρόκειται για κοινό μηχανισμό σε πολλά είδη θηλαστικών αλλά η τιμή του λόγου διαφέρει απόείδος σε είδος.
4.1(-) ΗΕ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΑΔΟΥΣΙΝΗ
•Βοηθητική πρωτεΐνη του συμπλόκου Sp-actin (τριαδικό σύμπλοκο)
•Υπάρχει μόνο στα μετάζωα
•Άνθρωπο: 3 υπομονάδες/γονίδια (α, β, γ)
•RBC: ετεροδιμερή αβ, 15.000 μόρια/RBC (διμερή και τετραμερή)
Αλληλεπιδρά με άλλες υπομονάδες αδουσίνης Προάγει σχηματισμό ολιγομερών
Sp/actinPhosphor.calmodulin
ΑΔΟΥΣΙΝΗ
Πρωτεΐνη κάλυψης των νηματίων ακτίνης (παρεμποδίζει μεταβολή μήκους τους και προάγει πρόσδεση Sp).
Συνδέεται απευθείας σε ακτίνη αλλά με μεγαλύτερη συγγένεια σε Sp/actin
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
p55•Μέλος οικογένειας MAGUKs (Membrane-associated Guanylate kinase homologues)
•Οργάνωση Sk στοιχείων, κυτταρική σήμανση, cell proliferation, καταστολή όγκων
•RBC: SDS-PAGE band 4.9
•4.1-GpC (δένει και στις δύο, αλλά δεν επιδρά στη συγγένεια αλληλεπίδρασης)
•(-)4.1R, (-)GpC ολοκληρωτική απώλεια p55
ΔΕΜΑΤΙΝΗ
• Zώνη 4.9
• Τριμερή (48, 52 kDa), 43.000/RBC
• Σφαιρική δομή
• Πακετάρισμα ακτίνης σε δέσμες
• Σύμπλοκο ζεύξης
• Με φωσφορυλίωση αναστέλλεται η λειτουργικότητά της
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΤΡΟΠΟΜΥΟΣΙΝΗ (ΤΜ)
•Actin-binding protein
•2 μονομερή που αυτοσυγκροτούνται κεφαλή με ουρά κατά μήκος των αυλάκων της διπλής έλικας ακτίνης
•Καθορίζουν μήκος 33-37nm
Έμμεσα ρυθμίζουν SpT
•4 γονίδια (α, β, γ και δ)
•RBC: 29/27 kDa, 70-80.000 copies/RBC
•Σύμπλοκα ζεύξης: ΤΜ5 (γ) και TM5b (α) σε ομο- ή ετεροδιμερή
•1) Αλληλεπιδρούν με 6 μόρια ακτίνης, 2) συγγένεια για ΤD/actinΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΤΡΟΠΟΜΟΝΤΟΥΛΙΝΗ (TD)
•Πρωτεΐνη κάλυψης ΤΜ
•Σφαιρική
•40.6 kda (πρώτα σε RBC)
•Iσομοριακή με ΤΜ.
•Αναστέλλει:
1)Συνεργατικότητα ΤΜ
2) Επιμήκυνση / αποπολυμερισμό ακτίνης
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΜΟΝΤΕΛΟ ΜΟΝΤΕΛΟ SUNG et al., 2000SUNG et al., 2000
Στην πτυχωτή επιφάνεια της ΤΜ5 δημιουργείται μία θέση πρόσδεσης ΤD
Η ΤΜ5 έχει 6 θέσεις πρόσδεσης ακτίνης
Το σύμπλοκο ΤΜ5/TD καθορίζει ως χάρακας το μήκος ακτίνης 33-37 nm
Tα πρωτονημάτια ακτίνης ευνοούν τηνπρόσδεση 6 SpT
Γεωμετρία εξαγωνικών πλεγμάτων Sk
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΑΓΚΥΡΙΝΗΠρωτεΐνη-συνδέτης (215 kDa), φωσφορυλίωση
Αρθρωτή (4 domains)
Sp (T)10x
Domain πρόσδεσης σε μεμβράνη(24 αντίγραφα αλληλουχίας 33ααΕπαναλήψεις ΑΝΚ)
Nεκρικό domain
COOH-domain ρύθμισης (εναλλακτ.μάτισμα)2.2* ank (186 kDa), ανθρώπινη αγκυρίνη
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΑΓΚΥΡΙΝΗ
(-) ank band 3 dimers
• Mία σειρά αντιπαράλληλων αναδιπλωμένων α-ελίκων συνδεόμενων με θηλιές σε διάταξη κάθετη ως προς τις έλικες
• Μεταγραφικοί παράγοντες, σκελετικές πρωτεΐνες, τοξίνες• Μηχανισμοί αναγνώρισης και πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΑΓΚΥΡΙΝΗ
(Restricted, Broadly, Giant)•Μεταγωγή σήματος,•Ενδοκυττάρωση,•Πολωμένη κατανομή πρωτεϊνών στη μεμβρ.
Μακροφάγα
(2.400αα)
Πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΠΑΛΛΙΔΙΝΗ (4.2)
72 kDa, 200.000 copies/RBC
Περιφερική με υδρόφοβες ιδιότητεςμε υδρόφοβες ιδιότητες
Φωσφορυλιωμένη
Ν-myristylated (myristic acid)
Παλμιτιλιωμένη (palmitic acid) (b3,p55)Το πρόσθετο υδρόφοβο τμήμαυδρόφοβο τμήμα αλληλεπιδράσεις με μεμβράνη
(-) ΙΙΙ exon επιθηλιακά κύτταραΕγκέφαλος, Νεφροί, Λεμφοκύτταρα, PLT
Tετραμερή-Hereditary spherocytosis-like (hemolytic anemia, εύθρ.RBC)
Band 3 (* ενίσχυση σύνδεσης Β3-Sk, εκχύλιση), ank, 4.1R(?), ΑΤΡΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΚΕΛΕΤΟΣ
Oργάνωση αντιστρεπτά μεταβλητή –Πυκνός-Ελαστικός-Εκτατός
ΣΖ 2.8x
8x
Σύμφωνα με ένα μοντέλο, η διαφορετικού βαθμού συμπίεση συγκεκριμένων μορίων Sp προκαλεί αλλαγές στο γεωμετρικό σχήμα του γεωμετρικό σχήμα του SkSk και αντιστρ.παραμόρφωση της μεμβράνης αλλά όχι αλλαγή στη συνολική συνολική επιφανειακή έκταση επιφανειακή έκταση (ΣΖ, θραύση)
ΣΚΕΛΕΤΟΣ
Αλληλεπιδράσεων deformability (HE)
Αλληλεπιδράσεων σε ΣΖ membrane stability (HS)
AYTOAYTOΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΑΙ ΣΚΕΛΕΤΟΥΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΑΙ ΣΚΕΛΕΤΟΥ:1. Βοηθητικές πρωτεΐνες2. Ca++/calmodulin/calpain3. Phosphorylation4. Μετα-ΜΦΡ τροποποιήσεις: ΔΟΜΙΚΕΣ Ή ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΕΣ
Μη-αντιστρεπτές
μυριστιλίωση 4.2
οξείδωση
μη-ενζυματική γλυκοζυλίωση
πρωτεόλυση
Αντιστρεπτές
φωσφορυλίωση
ακυλίωση λιπαρών οξέων
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΣΚΕΛΕΤΟΣΟ Σκελετός ως μηχανισμός διαλογής πρωτεϊνών στο ερυθροκύτταρο
Η εξωκυστιδιοποίησηεξωκυστιδιοποίηση ρυθμίζεται από αλληλεπιδράσεις του Sk με τη μεμβράνη
Σκελετοί Sp-ANK εκτός της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης
1. Δομική υποστήριξη κυτταρικής μεμβράνης
2. Ρύθμιση κατανομής/λειτουργίας διαμεμβρανικών πρωτεϊνών και μεμβρ. ενζύμων σε πολωμένα κύτταρα
3. Διαλογή πρωτεϊνών
4. Αρχιτεκτονική πυρήνα κατά τη μίτωση
5. Ρύθμιση μονοπατιών μεταγωγής σήματος
ΣΚΕΛΕΤΟΙ Sp-Ank
RBC
•Πυκνοί
•Εκτεταμένοι
•Ομοιογενείς
•Κοντά πρωτονημάτια ακτίνης
ΕΚΤΟΣ RBC
•Σποραδικοί
•Μακρύτερα νημάτια ακτίνης
•Μικροσωληνίσκοι
•(δυνείνη, δυνακτίνη)
•υποδοχείς/ microdomains/πρωτεΐνες μη-RBC
Επιθήλια, Νευρικό, Golgi
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
GOLGI
Διατήρηση δομής, δυναμικής φύσης,διαμερισματοποίησης
Διαλογέας πρωτεϊνών ανάλογος τηςκλαθρίνης στα καλυμμένα βοθρία
1. Προσδένει ποικιλία πρωτεϊνών2. Επιλεκτική συγγένεια3. 2D-ολιγομερείς δομές4. Κατάσταση δυναμικής συγκρότησης
Ρυθμίζει συγκράτηση πρωτεϊνών στις μεμβράνες Golgi εμποδίζοντας την είσοδό τους σε εκκριτικά κυστίδια μεταφοράς
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ
• Στα τελικά στάδια της ωρίμανσης ερυθροβλαστών σε ΔΕΚ, RBC σημειώνονται ριζικές αλλαγές (nucl., TfR, microtub, membr, Sk, S/V)
• Διαφοροποίηση δομικών συστατικών ερυθροβλάστεςRBC• Οι Sk πρωτεΐνες συντίθενται/συγκροτούνται σε Sk σε
διαφορετικές φάσεις κατά την ερυθροποίηση και σε ποικίλοντα ποσά
• Με την ωρίμανση αλλάζουν οι μηχανικές ιδιότητες κυττάρων (στα ΔΕΚ η διασύνδεση Sk μεμβράνης είναι ακόμα ασθενής) (?)
• Ο Sk αυτοσυγκροτείται (Μετα-ΜΦΡ) αλλά ή αυτοσυγκρότηση πρέπει να γίνεται υπομεμβρανικάυπομεμβρανικά.
1. επιλεκτική/ταχεία αποικοδόμηση β-σπεκτρίνης2. μεμβρανικοί υποδοχείς (akn)
3. «βοηθητικές πρωτεΐνες» (4.1R, TM5-TD)
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
• Η βιογένεση είναι μία σπάταλη διαδικασία (2-3x αSp/β)• Η σύναψη συμπλόκων σταθεροποιεί τα μόρια και τα προστατεύει
από τον καταβολισμό. • Sp, ank ασταθές/παροδικό προ-συγκροτούμενο κυτταροσκελετικό
δίκτυο (ανακύκλωση, 10% παροδική συγκρότηση)• Band 3, 4.1 ευσταθές membrane-associated system σύνθεση Sp, actin, ank, ανακύκλωση, συγκρότηση σε Sk σύνθεση Band 3, 4.1 (isoforms)
ΒΙΟΓΕΝΕΣΗ ΥΠΟΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΣΚΕΛΕΤΟΥ
Ανθρώπινοι προερυθροβλάστες in situ σύγχρονη σύνθεση b3/Sp/ank.
(-/-)ΑΕ1 mouse φυσιολογική συγκρότηση Sk κατά τη διαφοροποίηση
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
ΤΕΛΟΣ Α’ ΜΕΡΟΥΣ
ΕΚΚΒ_2008_Ερυθροκυτταρική Μεμβράνη_Αντωνέλου
Top Related