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实验三微核试验Dept. of Toxicology

School of Public Health

Xinjiang Medical University

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实验目的

学习小鼠骨髓微核试验原理

掌握微核试验的制片方法

学习掌握微核的观察计数

掌握微核试验的结果分析评价4

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实验原理

微核 (Micronucleus) 的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。


实验原理

细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。


微核试验 (Micronucleus test ， MNT) 是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出 DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。


实验原理


器材与试剂

•器材手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃蜡笔、玻璃染色缸、 2ml注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。


器材与试剂

•试剂•甲醇 ( 分析纯 ) 、甘油 ( 分析纯 ) 、小牛血清、生理盐水、 Giemsa储备液 ( 取Giemsa染料 1g，甘油 66m1，甲醇60m1)、 pH 6.8的磷酸盐缓冲液。


器材与试剂

• 阳性对照物 •环磷酰胺或丝裂霉素 C


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试验动物及处理

观察计数

骨髓液的制备和涂片

操作步骤


操作步骤

1 、试验动物及处理 (1) 动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重18~20g ， 7~12 周龄。每组小鼠数量 10 只，雌雄各半。


操作步骤 (2) 染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与人体接触化学毒物相同的途径。

食道气管

By LASCO

面向自己,沿着门牙左边滑入

食道气管

By LASCO

面向自己,沿着门牙左边滑入


操作步骤 (3) 染毒次数及取样时间：研究证实化学毒物需在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作用。不同化学毒物诱发微核出现的高蜂时间也不尽相同。波动范围可以达到 24~72h 。这就要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒的方法。其中以 4 次染毒比较方便合理。即每天染毒一次，连续 4 天，第 5 天取样。这样，取样一次就能覆盖 24~72h 高峰，如果高峰延迟到 96h 也不会漏掉。


操作步骤(4) 剂量选择：受试化学毒物的最大剂量除受溶解度大小所限外，应达到最大耐受量。一般情况下，应设 3~5 个或更多剂量组，剂量覆盖的范围要达到 3 个数量级以上。同时还应设立阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺 (50~100mg/kg) 或丝裂霉素 C(10mg/kg)腹腔注射 1 次或 2 次。阴性对照组使用等体积的溶剂。


2 、骨髓液的制备和涂片试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺。用小型弯止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片。


• 也可在动物处死后，迅速用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理盐水洗去血污和碎肉，剪去两端的骨骺，用带针头的 2m1注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均匀，以 1000 r/min离心 10min，弃去多余的上清液，留下约 0.5ml与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在清洁的载玻片上，推片。


操作步骤


操作步骤3 、固定将推好晾干的骨髓片放入染色缸中、用甲醇溶液固定 15min 取出晾干。不能及时染色的涂片也应固定后保存。


操作步骤4 、染色将固定晾干后的涂片、用新鲜配制的 Giemsa 应用液 (Giemsa 储备液 1份加PH6.8 的磷酸盐缓冲液 9 份 ) 染色 10~15min ，然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。


操作步骤5 、观察计数 • 先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀．染色较好的区域，再在油镜下观察计数， PCE 细胞呈灰蓝色，正染红细胞(NCE)呈橘黄色。细胞中含有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或多个微核。计数 1000 个 PCE 中含微核的 PCE 数，并且计数 200 个细胞中 PCE 与NCE 的比值。


MN

NCE

Illustration of a binuclear human lymphocyte containing a micronucleus (arrow). Nuclear material appears in yellow, cytoplasm in red. Acridin-Orange staining, fluorescence microscopy, enlargement 1000 fold


结果与分析本试验中只计数 PCE 中的微核，微核率以千分率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄动物分别计算微核 PCE 的均值。雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分别进行计算；正常的 PCE/NCE 比值约为 l (正常范围为 0.6~1.2) 。如比值＜ 0.1 ，则表示PCE形成受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据相一致。


结果与分析• 微核试验所获数据资料的频数分布尚无定论，多种统计学方法 ( 如泊松分布、二项分布、 χ2检验等 ) 均有人用于试验结果的统计分析。该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片及优质的染色。

卫生毒理学教研室

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