WykładStres oksydacyjny.

Rola chloroplastów, peroksysomów i mitochondriów w produkcji ROS. Kontrola stężenia ROS w komórkach

roślinnych Autor dr Agnieszka Gniazdowska-Piekarska

W tym wykładzie dowiesz się co to są reaktywne formy tlenu i co znaczy pojęcie „stres

oksydacyjny”. Dowiesz się jaka rolę pełnią reaktywne formy tlenu w komórce roślinnej i z

czego wynika dwoista natura ich działania. Dowiesz się kiedy i gdzie produkowane są

reaktywne formy tlenu w roślinach a także poznasz mechanizmy regulacji ich stężenia w

komórkach.

Dwa oblicza cząsteczki tlenu

O2

Jestem dobry, czy zły ?

Jestem wszechobecny na Ziemi. Beze mnie nie ma życia, Jestem konieczny w procesie oddychania mitochondrialnego.

Odpowiadam za poważne uszkodzenia komórek, czasami prowadzące do śmierci.

Wolne rodniki tlenowe - „bracia i siostry” powstający w wyniku niepełnej redukcji mojej cząsteczki uczestniczą w przekazywaniu informacji, jako cząsteczki sygnałowe.

Tlen jest pierwiastkiem bardzo rozpowszechnionym na Ziemi. W dolnych warstwach

atmosfery zawartość tego gazu wynosi 21 %. Tlen rozpuszczony w wodzie umożliwia życie

wielu organizmom wodnym.

Tlen jest składnikiem niezbędnym do życia ponieważ umożliwia komórkom uzyskanie

dużych ilości energii w procesie oddychania mitochondrialnego (więcej niż zapewniłaby

beztlenowa fermentacja). Komórki płacą jednak wysoką cenę za tę energetyczną korzyść.

Tlen jest koniecznym, ale niebezpiecznym „przyjacielem”.

W stanie podstawowym cząsteczka tlenu ma dwa elektrony na prostopadłych

względem siebie antywiążących orbitalach p. Spiny dwóch elektronów na orbitalach p

cząsteczki tlenu są równoległe. Tlen mający dwa niesparowane elektrony mógłby wejść w

reakcję , ale tylko z cząsteczką mającą również dwa niesparowane elektrony. Jednak

większość cząsteczek na sparowane elektrony. Ponieważ trudno jest znaleźć cząsteczce tlenu

„partnerów” do reakcji dwuelektronowej lub czteroelektronowej, tlen wstępuje na drogę

reakcji jednoelektronowej tworząc anionorodnik ponadtlenkowy. Stąd już blisko do

powstania stresu oksydacyjnego.

Co to są reaktywne formy tlenu (ROS)? Główni sprawcy stresu oksydacyjnego.

Reaktywne formy tlenu (ROS) (rodniki tlenowe i nadtlenek wodoru są produktami kolejnych stopni redukcji cząsteczki tlenu. Niepełna redukcja cząsteczki tlenu prowadzi do powstawania ROS.

O2 + 4 e- + 4H+ 2H2O

4 e

-+

4H

+

O2•-

•HO

H2O2

H2O

O2

2H2O

+

2 e- + 2H+

e- + H+

e- + 2H+

e-

e- + H+

2 e- + 2H+

Całkowita redukcja O2

Nie

peł

na

red

ukc

ja O

2

Tlen cząsteczkowy jest utleniaczem: reagując ze związkami organicznymi, utlenia je,

pobierając od nich elektrony, a sam ulega redukcji. Całkowita redukcja O2 oznacza

przyłączenie 4 protonów i 4 elektronów i powstają wówczas 2 cząsteczki H2O. Jest to reakcja

egzoergiczna, a produkt reakcji tlenek wodoru (H2O) jest niereaktywny wobec innych

składników komórki.

Cząsteczka tlenu, nie zawsze ulega pełnej, czteroelektronowej redukcji. Jeśli tlen ulega

jednoelektrodowej redukcji tworzy się anionorodnik ponadtlenkowy (O2•-), dwuelektronowa

redukcja O2 prowadzi do wytworzenia nadtlenku wodoru (H2O2)

Rodnik to atom lub cząsteczka zdolna do samodzielnego istnienia, mająca jeden lub więcej

niesparowanych elektronów. Obecność niesparowanego elektronu sprawia, że rodniki są

(słabo) przyciągane przez pole magnetyczne

Wolne rodniki są reaktywne, ponieważ dążą do sparowania elektronów (pozbycia się

nadmiaru elektronów, lub przyłączenia dodatkowego elektronu).

Podstawowe Reaktywne Formy Tlenu (ROS)

• Tlen singletowy 1O2

• ozon O3

• Anionorodnik ponadtlenkowy O2•-

• Rodnik hydroksylowy •HO

• Rodnik nadtlenkowy ROO•

• Nadtlenek wodoru H2O2 (nie jest wolnym rodnikiem, ale jest zaliczany do ROS)

Stres oksydacyjny to stan braku równowagi pomiędzy produkcją reaktywnych form tlenu (ROS), a zdolnością do ich szybkiej detoksykacji, detoksykacji powstających toksycznych produktów lub naprawy wyrządzonych szkód.

Nadprodukcja i nagromadzanie ROS powoduje oksydacyjne uszkodzenia składników komórki, a szczególnie białek, lipidów i DNA.

Co to jest stres oksydacyjny?

Mechanizmy detoksykacji ROS i naprawy uszkodzeo ROS

Stres oksydacyjny

Wg. Bartosz 2003

Stres oksydacyjny jest to stan nierównowagi pomiędzy nasileniem reakcji prowadzących do

generacji reaktywnych form tlenu a reakcjami związanymi z ich usuwaniem. Istnieje wiele

danych wskazujących, że powstawanie stresu oksydacyjnego jest wspólną odpowiedzią roślin

na różne czynniki stresowe.

Czynniki wywołujące stres oksydacyjny

ROS susza

Intensywne PAR

Uszkodzenia mechaniczne, zranienie

metale ciężkie

niska lub wysoka temperatura

patogeny

nodulacja

starzenie

lignifikacja

postanoksja, posthypoksja

Stres oksydacyjny

Stres oksydacyjny może być wspólną odpowiedzią tkanek roślinnych na różne czynniki

stresowe: deficyt wody, stres osmotyczny, stres solny, niedobór mikro lub makro elementów,

niska lub zbyt wysoka temperatura, atak patogenu, uszkodzenia mechaniczne, zranienie,

promieniowanie UV, nadmiar promieniowania fotosyntetycznie czynnego, post-anoksja lub

post-hypoksja, działanie zanieczyszczeń atmosferycznych (SO2, NO, NO2, O3), jonów metali

ciężkich, niektóre herbicydy.

Stres oksydacyjny pojawia się także podczas naturalnych procesów fizjologicznych

(tworzenie brodawek na korzeniach roślin motylkowatych, lignifikacja czy starzenie się

komórek).

Źródła powstawania ROS w komórkach roślinnych

ROS Miejsce syntezy i reakcja w której powstaje ROS

Tlen singletowy 1O2 Chloroplast, fotoukład PSII

Anionorodnik ponadtlenkowy O2

•-

Mitochondria – łaocuch transportu elektronówChloroplasty – reakcja Mehlera, fotoukład PSIIŚciana komórkowa- peroksydazy ściany komórkowejBłona komórkowa – oksydaza NADPH

Nadtlenek wodoru H2O2 Peroksysomy – fotooddychanieChloroplasty – łaocuch transportu elektronówGlioksysomy - β-oksydacja kwasów tłuszczowychŚciana komórkowa – redukcja anionorodnika ponadtlenkowego

Rodnik hydroksylowy •HO Chloroplast – fotoukład PSII, reakcja Fentona redukcja H2O2

w obecności Fe2+

Reaktywne formy tlenu powstają w różnych przedziałach komórkowych, a intensywność ich

syntezy jest warunkowana przez czynniki środowiskowe, jak też stan fizjologiczny rośliny.

Aby zrozumieć tę cześć wykładu przypomnij sobie jak zbudowane sąt łańcuch transportu

elektronów w chloroplastach i łańcuch transportu elektronów w mitochondriach. Przypomnij

sobie, że w mitochondriach elektrony przekazywane są na tlen przez oksydazę cytochromową

lub alternatywną, a w chloroplastach dochodzi do fotolizy wody i w rezultacie wydzielania

tlenu. Informacje na ten temat znajdziesz w wykładach „Barwniki asymilacujne i fotosynteza”

oraz „Oddychanie”.

Chloroplasty są głównym źródłem ROS w fotosyntetyzujących tkankach

Cyt b6f

PSIPSII PCH2O

O2

O2

O2•-

1O2

O2•-

P680 P700

chl

chl*

Fd

Lumen tylakoidu

stroma

Podstawowym źródłem reaktywnych form tlenu w fotosyntetyzujących komórkach są

chloroplasty.

Głównym miejscem produkcji ROS w chloroplastach jest łańcuch transportu elektronów

zlokalizowany w błonach tylakoidów, w którym może dochodzić do powstawania tlenu

singletowego oraz anionorodnika ponadtlenkowego.

Tlen singletowy powstaje w czasie przechodzenia wzbudzonego stanu tripletowego

cząsteczki chlorofilu (3Ch*) do stanu singletowego (

1Ch*) . Głównym miejscem

powstawania tlenu singletowego jest centrum reakcji PSII oraz kompleksy antenowe LHC

(ang. Light harvesting antena complexes).

Anionorodnik ponadtlenkowy tworzony jest natomiast w fotoukładzie PSII (P680) oraz w

reakcji Mehlera w której elektrony bezpośrednio z PSI są przenoszone na tlen (ta reakcja

została opisana w wykładzie „Barwniki asymilacyjne i fotosynteza”) .

Powstający O2•- ulega w chloroplastach dysmutacji do H2O2 w reakcji katalizowanej przez

dysmutazę ponadtlenkową (SOD). W stromie chloroplastów istotną rolę w „zmiataniu” ROS

odgrywa enzymatyczny cykl reakcji zapobiegający uszkodzeniu aparatu fotosyntetycznego

znany jako cykl askorbinianowo-glutationowy (Haliwella-Asady). Natomiast w lumen

tylakoidów (środowisko lipofilne) funkcje antyutleniaczy pełnią drobnocząsteczkowe

związki: plastochinol, α-tokoferol i α-tokoferylochinon.

Peroksysomy uczestniczą w generacji ROS w fotosyntetyzujących tkankach roślin o fotosyntezie

typu C3 • Generacja H2O2 w peroksysomach

fotosyntetyzujących komórek liści zachodzi podczas fotoddychania w reakcji katalizowanej przez oksydazę glikolanową. Powstający H2O2 jest rozkładany do H2O przez katalazę.

fotooddychanie

glikolan

gliksalan

glicyna

Utlenianie glicyny w mitochondriach

O2

H2O +1/2O2

H2O2

katalaza

oksydaza glikolanowa

Peroksysomy w liściach występują zazwyczaj pomiędzy chloroplastami a mitochondriami,

stykając się z nimi ściśle powierzchnią błon. Główną ich funkcją jest prowadzenie kilku

reakcji cyklu fotoodechowego (opis reakcji znajdziesz w wykładzie dotyczącym barwników

fotosyntetycznych i fotosyntezy). Jedną z reakcji tego cyklu jest utlenianie glikolanu do

glioksalanu w reakcji katalizowanej przez oksydazę glikolanową w której powstaje nadtlenek

wodoru. Peroksysomy roślinne są zatem głównymi organellami odpowiedzialnymi za

wewnątrzkomórkową produkcję H2O2. W starzejących się, żółknących liściach peroksysomy

przekształcają się w glioksysomy. Wykazano, że w organellach tych dochodzi do wzrostu

aktywności enzymów odpowiedzialnych za katabolizm puryn są to m. in. oksydaza

ksantynowa i oksydaza moczanowa. Produktem aktywności oksydazy ksantynowej jest

anionorodnik ponadtlenkowy, natomiast produktem aktywności oksydazy moczanowej jest

nadtlenek wodoru. W starzejących się liściach indukowane są też inne procesy prowadzące do

wzrostu stężenia reaktywnych form tlenu. W błonie peroksysomów występuje krótki łańcuch

transportu elektronów złożony z flawoproteiny – reduktazy NADPH oraz cytochromu. W

wyniku działania tego łańcucha na zewnętrznej, cytoplazmatycznej stronie peroksysomów

wytwarzany jest anionorodnik ponadtlenkowy. Zwiększonemu wytwarzaniu O2-• przez błony

peroksysomów towarzyszy wzrost stężenia H2O2 wewnątrz tych organelli, związany z

obniżeniem aktywności katalazy.

W ostatnich latach wykazano również, że w peroksysomach powstają O2-. i tlenek azotu

(NO.), będący jedną z reaktywnych form azotu (RNS).

Znaczne ilości ROS są wytwarzane w peroksysomach (typ glioksysomy) w procesie β-

oksydacji kwasów tłuszczowych, w enzymatycznej reakcji z udziałem oksydaz flawinowych

oraz w procesie dysproporcjonowania rodników O2-. .

Ciekawostka dla zainteresowanych.

Peroksysomy są również jednym z podstawowych źródeł tlenku azotu (NO) w komórce

roślinnej. Jest to reaktywna forma azotu (RNS ang. reactive nitrogen species) pełniąca bardzo

istotne funkcje regulacyjne w komórkach roślinnych i działająca jako cząsteczka sygnałowa.

Biosynteza tej molekuły w peroksysomach zachodzi prawdopodobnie na drodze

enzymatycznej zależnej od aktywności podobnej do ssaczych syntaz tlenku azotu, co oznacza,

ze NO powstaje z aminokwasu L-argininy. Istnieją również inne drogi biosyntezy NO u

roślin, należy do nich np. reakcja katalizowana przez reduktazę azotanową lub reduktazę NO2-

: NO, NI-NOR (ang. nitrite: NO-reductase), zlokalizowaną w błonie komórkowej korzeni. W

komórkach roślinnych istnieje również nieenzymatyczna droga syntezy NO. Produkcja NO

bez udziału enzymów zachodzi w kwaśnym pH, w obecności reduktantów np. askorbinianu.

Jedną z wielu poznanych funkcji NO jest udział tego gazu w reakcjach roślin na różnego

rodzaju stresy biotyczne i abiotyczne. Cząsteczki NO, podobnie jak ROS mogą

(bezpośrednio) stanowić czynnik toksyczny w obronie przed patogenami lub mogą

(pośrednio) brać udział w reakcjach obronnych jako cząsteczki sygnałowe (wtórne

przekaźniki sygnałów). Najwięcej wiadomo na temat oddziaływania NO w regulacji

odpowiedzi odpornościowej roślin na atak patogenów. Współdziałanie RNS i ROS wykazano

podczas odpowiedzi na czynniki stresowe (zasolenie, promieniowanie UV-B), w indukcji

reakcji nadwrażliwości HR (ang. hypersensitive response).. Znany jest udział NO w regulacji

procesów wzrostu i rozwoju roślin. NO powoduje zahamowanie starzenia organów

wegetatywnych roślin takich, jak liście i generatywnych (owoce) oraz przyspiesza ich wzrost.

NO hamuje starzenie się liści poddanych działaniu stresu mechanicznego, w tym przypadku

zwiększając stężenie askorbinianu w tkankach. Wykazano udział NO w regulacji wzrostu

korzeni bocznych oraz przybyszowych. Podanie NO roślinom pozbawionym światła sprzyja

procesom de etiolacji (zazieleniania) siewek oraz hamuje wydłużanie się międzywęźli. NO

uczestniczy również w regulacji gospodarki wodnej roślin, poprzez regulację ruchów

aparatów szparkowych. W przypadku niedoboru wody w środowisku dochodzi do szybkiego

zamykania aparatów szparkowych pod wpływem ABA, w reakcji zależnej od NO i H2O2.

Tlenek azotu jest także zaangażowany w regulację procesu ustępowania spoczynku i

kiełkowania nasion. Transdukcja sygnału NO odbywa się za pośrednictwem cGMP

(cykliczny guanozynomonofosforan) i aktywację cyklazy guanylanowej.

W procesie oddychania mitochondrialnego, w standardowych warunkach, obserwuje

się zjawisko tzw. przecieku mitochondrialnego, które polega na niepełnej redukcji (około 1 -

2 %) tlenu zużywanego przez rośliny. Prowadzi to do wytwarzania ROS, głównie O2-., który

ulega dysmutacji do H2O2. Jednak głównym źródłem ROS w mitochondriach jest łańcuch

transportu elektronów. Można więc przyjąć, że wzrost produkcji ROS w mitochondriach jest

związany z intensywnością oddychania. Tworzeniu ROS w mitochondriach sprzyja obniżenie

aktywności oksydazy cytochromu c, oraz wyczerpanie akceptora fosforanu ADP w

warunkach dużej dostępności substratu oddechowego.

Powstający O2•- ulega w mitochondriach dysmutacji do H2O2 w reakcji katalizowanej

przez dysmutazę ponadtlenkową (SOD).

Powstawanie ROS w mitochondriach

IVIII

II

I

Syn

taza

ATP

UQ

ND

ND AOX

c

O2•-

O2•-

O2•-

H+

H+H+H+

Matriks mitochondrialna

O2 O2

H2O H2O

bursztynian

fumaran

NADH

NAD+

Wg. Blokhina , Fagerstedt 2009. Physiol Plant 138: 447-462 (zmodyfikowane).

Anionorodnik ponadtlenkowy (O2•- ) może być generowany w wyniku jednoelektronowej

redukcji O2 zachodzącej z udziałem flawin lub ubichinonu. Miejscem jego tworzenia jest

kompleks I (oksydoreduktaza NADH:ubichinon), kompleks II (oksydoreduktaza

bursztynian:ubichinon) i kompleks III (oksydoreduktaza ubichinol:cytochrom c).

ROS powstają również jako odpowiedź rośliny na atak organizmów patogenicznych

Kompleks oksydazy NADPH

O2 O2•-

H2O2

Reakcja nadwrażliwości reakcja systemiczna modyfikacja budowy ściany komórkowej

Ściana komórkowa

plazmolema

cytoplazma NADPH NADP + H+

W warunkach stresu biotycznego związanego z obecnością patogenów podstawowym

miejscem syntezy ROS jest błona komórkowa. Reakcja ta jest katalizowana przez kompleks

błonowej oksydazy NADPH. Powstające ROS biorą udział w indukcji specyficznych reakcji

rośliny na obecność patogenów (reakcja nadwrażliwości, odpowiedzi systemicznej,

modyfikacji struktury ściany komórkowej).

Wiesz już w których kompartymentach komórkowych i na jakiej drodze dochodzi do

tworzenia ROS. Postaraj się, spoglądając na poniższy rysunek przeanalizować udział

poszczególnych organelli komórkowych w generowaniu ROS. Pamiętaj o tym, że procesy te

zachodzą w komórce jednocześnie.

Podsumowanie Główne źródła ROS w fotosyntetyzującej komórce

mezofilowej roślin o fotosyntezie C3

Uproszczony schemat powstawania ROS w komórce mezofilowej rośliny o fotosyntezie C3 zmodyfikowane w.g. Ślesak i inni 2007 Acta Biochim. Pol. 54: 39-50.

mitochondrium

peroksysom

chloroplast

PSII PSI

O2•-

H2O2

SOD Wiązanie CO2

fotooddychanie

glikolan

gliksalan glicyna

H2O2

glicyna

seryna

NADH

NADH

Cykl TCA

O2•-

H2O2

Oksydaza NADPH

O2•-

H2O2

Peroksydazy ściany komórkowej

światło

Ściana komórkowa

Niektóre skutki działania ROS na komórki i ich składniki

• Uszkodzenia kwasów nukleinowych

• Peroksydacja lipidów błonowych

• Zahamowanie fosforylacji oksydacyjnej

• Utlenianie związków niskocząsteczkowych: glutation, askorbinian, NADH

• Inaktywacja enzymów

• Inaktywacja białek transportowych

• Zaburzenia wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca2+

• Zaburzenia struktury cytoszkieletu (polimeryzacja aktyny, rozerwanie

mikrofilamentów)

• Powstawanie mutacji

Toksyczność ROS w komórkach wynika z ich ogromnej reaktywności z różnymi składnikami

komórki takimi jak: lipidy, białka (w tym enzymy), kwasy nukleinowe i cukry. Prowadzi to

do wielu uszkodzeń na terenie komórki (oksydacja lipidów, inaktywacja enzymów, białek

transportujących, receptorów i kanałów jonowych, uszkodzenie struktury kwasów

nukleinowych, depolimeryzacja polisacharydów). Najgroźniejszą formą ROS dla

komórkowego DNA jest rodnik hydroksylowy (·OH), który może niszczyć strukturę

deoksyrybozy oraz zasad purynowych i pirymidynowych. Rodnik ten natychmiast wchodzi w

reakcję ze wszystkimi składnikami komórki. Reaguje też z wolnymi cukrami. Stężenie ROS

dodatkowo wzrasta w reakcji Fentona, w obecności takich katalizatorów jak jony żelaza

(Fe3+

) czy miedzi (Cu2+

), co powoduje gwałtowną produkcję ·OH, przy współudziale H2O2 i

O2-.. Wzmożona peroksydacja lipidów występuje wówczas, gdy ROS reagują z

nienasyconymi kwasami tłuszczowymi wchodzących w skład lipidów błon komórkowych.

Prowadzi to do zniszczenia struktury błony, utraty turgoru, a następnie śmierci komórek.

Oddziaływania ROS z białkami dotyczą modyfikacji aminokwasów oraz fragmentacji

łańcuchów polipeptydowych. Zmiany takie mogą powodować z jednej strony agregację białek

poprzez tworzenie dodatkowych wiązań lub z drugiej strony naznaczać białka do proteolizy.

Wiesz już, że ROS indukują tzw. stres oksydacyjny. Wiesz też, jakie są negatywne skutki

działania ROS na składniki komórki. Teraz dowiesz się jak roślina broni się przed

konsekwencjami nadmiernej produkcji i akumulacji ROS.

Jednocześnie z produkcją ROS aktywacji ulega system antyoksydacyjny w komórkach

roślinnych. Komórkowy system antyoksydacyjny to wieloskładnikowy system enzymatyczny

i drobnocząsteczkowy odpowiadający za „zmiatanie” ROS. Komórkowy system

antyoksydacyjny składa się z szeregu enzymów odpowiadających za rozkładanie ROS i

niskocząsteczkowych związków łatwo reagujących z wolnymi rodnikami.

Do systemu antyoksydacyjnego enzymatycznego zaliczamy takie enzymy jak: dysmutaza

ponadtlenkowa (SOD), katalaza (CAT), enzymy zaangażowane w cykl glutationowo-

askorbinianowy (zwany też cyklem Halliwell-Asada): peroksydaza askorbinianowa (APX),

reduktaza monodehydroaskorbinianowa (MDHAR), reduktaza dehydroaskorbinianu (DHAR)

oraz reduktaza glutationowa (GR). Innymi enzymami zaangażowanym w metabolizm ROS są

peroksydazy całkowite (POx) oraz peroksydaza glutationowa (GPX). W przypadku

mitochondrium, enzymem zaangażowanym w regulację stężenia ROS jest alternatywna

oksydaza (AOX), która katalizuje redukcję O2 z pominięciem kompleksu III i IV, zatem może

ograniczać ilość powstałego ROS.

Zapamiętaj!

Enzymy komórkowego systemu antyoksydacyjnego to:

• Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD),

• Katalaza (CAT),

• Peroksydaza glutationowa, (GPX)

• Peroksydaza askorbinianowa (APX),

• Reduktaza glutationowa (GR)

• Reduktaza monodehydroksyaskorbinianu (MDHAR)

• Reduktaza dehydroksyaskorbinianu(DHAR)

Systemy antyoksydacyjne współdziałające w usuwaniu ROS w chloroplastach funkcjonują w

cyklu Halliwella-Asady (glutationowo-askorbinianowym).

Postaraj się zapamiętać na czym polega antyoksydacyjna rola poszczególnych enzymów i

jakie reakcje są przez nie katalizowane. Pamiętaj, że w wyniku działania enzymów

antyoksydacyjnych dochodzi do usunięcia ROS i wytworzenia cząsteczki wody.

Enzymy antyoksydacyjne i ich aktywnośd katalityczna

katalaza Odpowiada za zmiatanie H2O2, nie potrzebuje antyoksydantów cząsteczkowych

Peroksydaza glutationowa Odpowiada za zmiatanie H2O2, wymaga obecności GSH

Odpowiada za zmiatanie O2•-, nie potrzebuje

antyoksydantów cząsteczkowychDysmutaza ponadtlenkowa

Reduktaza glutationowaZapewnia odtwarzanie GSH z GSSG, zużywa NADPH

Reakcje katalizowane przez podstawowe enzymy systemu antyoksydacyjnego

Dysmutaza ponadtlenkowa: O2

•- +O2•- + 2H+ → H2O2 + O2

Katalaza: 2H2O2 → 2H2O+ O2

Peroksydaza glutationowa: 2GSH+ H2O2 →GSSG+2H2O

Reduktaza glutationowa GSSG+NADPH + H+ →2GSH+H+

GSSG – utleniona forma glutationu (związek niebezpieczny dla komórki bo utlenia grupy tiolowe białek, prowadząc do powstawania mostków disulfidowychGSH- zredukowana forma glutationu (antyoksydant)

Peroksydaza askorbinianowa: askorbinian + H2O2 → dehydroaskorbinian + 2 H2O

Enzymami, które zalicza się do głównych i działających jako pierwsze antyoksydanty są:

dysmutazy ponadtlenkowe (SOD). Różne izoformy SOD mogą występować w różnych

częściach komórki: (i) w matriks mitochondrium, peroksysomach i glioksysomach – MnSOD

(tetrametr, zawierający mangan w centrum aktywnym, złożony z czterech podjednostek o

masie cząsteczkowej około 20 kDa) (ii) w stromie chloroplastów - Cu,ZnSOD (homodimer

zawierający miedź i cynk w centrum aktywnym, złożony z dwóch podjednostek o masie

cząsteczkowej około 16 kDa), oraz izoforma zawierająca żelazo - FeSOD, (iii) a w cytozolu –

Cu,ZnSOD. Wszystkie z wymienionych izoform SOD charakteryzuje różna wrażliwość na

H2O2 i HCN. Enzymy te katalizują reakcję dysproporcjonowania O2-.

do H2O2 i O2 . Wydaje

się, że MnSOD i FeSOD są ewolucyjnie starsze w stosunku do Cu,ZnSOD. Nie wszystkie

izoformy SOD wykazują taką samą aktywność, wykazano, że najbardziej aktywną jest

Cu,ZnSOD. U wszystkich gatunków roślin, w których analizowano aktywność różnych

izoform SOD, stwierdzono, że obecność tego enzymu zależy zarówno od wieku jak i od

stadium rozwojowego tkanek. Do konstytutywnych enzymów zalicza się Cu,ZnSOD obecną

w cytozolu, a aktywność MnSOD podlega regulacji przez takie czynniki jak tlen, czy silne

utleniacze np. żelazicyjanek. MnSOD i FeSOD są izoformami występującymi w

specyficznych organellach komórkowych, takich jak mitochondria czy chloroplasty,

natomiast cytoplazmowa izoforma Cu,ZnSOD wydaje się być konstytutywna.

Katalazy (CAT) są kolejnymi enzymami szlaku antyoksydacyjnego, zaangażowanymi w

metabolizm ROS, tetramerami, które katalizują reakcję dysmutacji H2O2 do H2O i O2.

Aktywność CAT nie wymaga obecności siły redukcyjnej, enzym ten jest bardzo aktywny,

choć ma niższe powinowactwo do substratu w porównaniu do peroksydaz. CAT należą do

metalo-enzymów, w centrum aktywnym zawierają żelazo czyli należą do hemoprotein. Inną

grupą CAT, są enzymy, które zamiast żelaza posiadają w centrum aktywnym mangan. CAT te

charakteryzuje niewrażliwość na cyjanki i azydki. U rzodkiewnika CAT jest kodowana przez

rodzinę genów (CAT1, CAT2, CAT3). Każdy z tych genów koduje pojedyncze podjednostki,

które razem mogą tworzyć co najmniej sześć różnych izoform katalazy. U słonecznika

zidentyfikowano osiem lizoform tego enzymu (CAT1 – CAT8). Głównym miejscem

występowania CAT są peroksysomy, ale w przypadku kukurydzy, izoforma CAT 3

zlokalizowana jest w mitochondrium.

Reduktaza glutationowa (GR) to heterotetramer, składający się z podjednostek o masie

cząsteczkowej około 60 kDa i 32 kDa. GR katalizuje redukcję glutationu (GSSG do GSH) w

obecności NADPH, który ulega utlenieniu do NADP+. Wzrost aktywności GR jest

zintegrowany ze zwiększoną produkcją NADPH (donor elektronów dla GR) w szlaku

pentozofosforanowym (PPP). Aktywność GR oznaczono głównie w tkankach aktywnych

fotosyntetycznie, przede wszystkim w chloroplastach, ale enzym ten może znajdować się

również w innych częściach roślin, takich jak korzenie.

Peroksydazy (POx) to grupa enzymów korzystających z różnych donorów elektronów, w

zależności od katalizowanej reakcji. POx (zaliczane do peroksydaz guaiacolowych) biorą

udział m.in. w biosyntezie lignin, degradacji IAA, biosyntezie etylenu. W centrum aktywnym

tego typu peroksydaz, zaliczanych do glikoprotein, znajduje się Fe. Osobną grupę peroksydaz

(nie będących glikoproteinami), typowych zmiataczy ROS, stanowią: APX (wykorzystująca

askorbinian jako donor elektronów), występująca głównie u roślin i GPX (wykorzystująca

glutation jako donor elektronów), charakterystyczna dla ssaków.

Peroksydazy glutationowe należą do rodziny izozymów katalizujacych redukcję H2O2,

organicznych nadtlenowodorów i lipidowych nadtlenowodorów, z udziałem GSH jako donora

elektronów. GPX należą do tetramerów o masie cząsteczkowej około 80 kDa. Do niedawna

uważano, że GPX występują głównie w organizmach zwierzęcych, dopiero pod koniec XX w.

oznaczono ich aktywność w tkankach roślinnych. Trudności w identyfikacji GPX u roślin

związane są z brakiem stałej obecności tego enzymu w komórkach. Synteza GPX zachodzi w

odpowiedzi na czynnik stresowy. Brak jonów żelaza w centrum aktywnym cząsteczki GPX

odróżnia ją od innych POx. Aktywność GPX jest niższa niż aktywność całkowitych POx, w

przypadku wysokich stężeń H2O2 występujących w komórkach roślinnych. U rzodkiewnika

GPX są kodowane przez rodzinę 8 genów (GPX1 - GPX8). Wykazano, u rzodkiewnika, że

GPX występują w chloroplastach (wyodrębnione geny GPX1 i GPX7), cytozolu (GPX2,

GPX4, GPX6), mitochondriach (GPX3) oraz retikulum endoplazmatycznym (GPX5).

Prawdopodobnie GPX8 występuje w cytozolu.

Najważniejszymi, enzymatycznymi zmiataczami ROS w komórkach roślin są CAT i APX,

natomiast GPX uczestniczą w usuwaniu nadtlenków lipidów i nadtlenków alkilowych. U

roślin oznaczana jest głównie aktywność GPX – podobna.

Enzymy komórkowego systemu antyoksydacyjnego

Systemy antyoksydacyjne współdziałające w usuwaniu ROS w chloroplastach tzw. cykl Halliwella-Asady (askorbinianowo-glitationowy)

SOD APX MDHARGRDHAR

askorbinian

H2O2 H2OCAT

Zwróć uwagę, że współdziałanie poszczególnych enzymów cyklu Haliwella –Asady jest

uzależnione od jednoczesnej obecności glutationu i askorbinianu.

W skład nieenzymatycznego systemu antyoksydacyjnego można zaliczyć głównie

cząsteczkowe, komórkowe „zmiatacze” ROS, rozpuszczalne w wodzie, jak: askorbinian i

glutation oraz rozpuszczalne w tłuszczach, głównie tokoferole . Antyoksydacyjne

działanie tokoferoli związane jest przede wszystkim z usuwaniem wtórnych rodników

organicznych i przerywaniem łańcuchowych reakcji wolnorodnikowych lipidów. Innymi

cząsteczkowymi składnikami systemu detoksykacji ROS są: polifenole, flawonoidy,

antocyjany i peroksyredoksyny – homologi tioredoksyn. Peroksyredoksyny są

antyoksydantami zależnymi od grup tiolowych i mogą redukować OH. i H2O2 oraz

ochraniać białka przed stresem oksydacyjnym poprzez redukcję mostków disulfidowych.

Zapamiętaj!

Podstawowe antyoksydanty cząsteczkowe (nieenzymatyczne) pełniące rolę „zmiataczy”

lub „wychwytywaczy” ROS to:

• ASKORBINIAN (ASA- witamina C)

• GLUTATION (GSH- forma zredukowana)

• TOKOFEROL (α-tokoferol-witamina E)

• FLAWONOIDY

• KAROTENOIDY

Stosunek zawartości zredukowanej formy antyoksydanta do utlenionej formy

antyoksydanta jest sygnałem modulującym mechanizmy zmiatania ROS.

Ascorbinian (witamina C) bierze udział w cyklu reakcji Haliwella-Asady, jest również

konieczny do prawidłowego funkcjonowania cyklu ksantofilowego (fotokonwersja

wiolaksantyna/zeaksantyna o którym była mowa na wykładzie dotyczącym fotosyntezy

C3 , C4 i CAM). Ponad 40 % całkowitej zawartości askorbinianu występującego w

komórkach odnajdowane jest w chloroplastach.

Glutation (γ-Glu-Cys-Gly) to ważny rezerwuar nie-białkowych reszt tiolowych w

komórkach roślinnych. Występuje w postaci zredukowanej (GSH) i utlenionej (GSSG).

W standardowych warunkach dominującą formą glutationu jest forma zredukowana i

stanowi ona ponad 90 % ogólnej jego zawartości. U roślin, glutation występuje w stężeniu

od 0,1 – 0,5 µM g-1

świeżej masy, ale największą ilość tego tripeptydu zanotowano dla

wyizolowanych chloroplastów grochu od 2 – 4,5 mM. Forma zredukowana glutationu

pełni funkcję ochronną w stosunku do białek narażonych na działanie stresu

oksydacyjnego. Grupa tiolowa GSH oddziaływuje z grupami tiolowymi białek.

Stabilizując grupy –SH aminokwasów budujących białkach, glutation odpowiada za

utrzymanie ich prawidłowej struktury. Stanowi on ponadto prekursor fitochelatyn,

uczestniczących w odpowiedzi roślin na stres obecności metali ciężkich. Poza udziałem w

metabolizmie ROS utrzymanie odpowiedniego stosunku GSH/GSSG odpowiada za

komórkową homeostazę potencjału redoks i pełni rolę wtórnego przekaźnika informacji w

szlakach transdukcji sygnałów. Reguluje nie tylko metabolizm komórkowy ale

uczestniczy w aktywacji ekspresji niektórych genów. Zmiany stosunku GSH/GSSG

stanowią składowy element w szlaku sygnalnym indukowanym przez H2O2 . Istnieją

również przesłanki świadczące o tym, że glutation uczestniczy w regulacji podziałów

komórkowych, od jego stężenia zależy przejście komórki do fazy S (fazy poprzedzającej

mitozę), również jest niezbędny do przejścia komórki do fazy G1. Glutation należy zatem

do czynników stymulujących i determinujących dalsze losy komórki. Stanowi

bezpośredni donor elektronów w reakcjach katalizowanych przez GPX.

Karotenoidy takie jak ksantofile: zeaksantyna, anteraksanyna, wiolaksantyna czy luteina

uczestniczą przede wszystkim w wygaszaniu tlenu singletowego w antenach

fotosyntetycznych.

Tokoferole – przede wszystkim usuwają rodnikowe produkty utleniania lipidów,

wygaszają 1O2, neutralizują powstające podczas utleniania wielonienasyconych kwasów

tłuszczowych rodniki nadtlenkowe lipidów.

Oprócz aktywnej walki z ROS roślina może unikać niekontrolowanego wzrostu stężenia

ROS.

Mechanizmy unikania niekontrolowanego wzrostu stężenia ROS to:

• Adaptacje anatomiczne – struktura liści, epidermy, ruchy liści, prowadzące do

„ukrycia” szparek lub przemieszczania się chloroplastów w komórkach mezofilowych

liści

• Modyfikacje metabolizmu – fotosyntetyczne wiązanie CO2 u roślin CAM lub C4

• Rearanżacje aparatu fotosyntetycznego – rozbudowa anten fotosyntetycznych

• Aktywacja alternatywnych oksydaz (AOX) w łańcuchu transportu elektronów (o tym

zagadnieniu znajdziesz szczegółowe informacje w wykładzie o oddychaniu

mitochondrialnym)

Wiesz już, że ROS są toksyczne dla komórki, a stężenie ROS jest precyzyjnie regulowane -

modulowane przez sprawnie funkcjonujący system antyoksydacyjny.

Teraz dowiesz się, że bez ROS komórka nie mogłaby prawidłowo funkcjonować.

ROS pełnią funkcję cząsteczek sygnałowych

Czynnik transkrypcyjny

bodziec

ROS

Fosfatazy + Kinazy MAP

Odpowiedź fizjologiczna

Przekazywanie informacji (transdukcja sygnału) wymaga przemieszczania się i szybkich

zmian stężenia cząsteczek zwanych cząsteczkami sygnałowymi (przekaźniki informacji).

Działanie ROS w komórkach roślinnych oprócz tego, że wywołują stres oksydacyjny

przejawia się też ich funkcją sygnałową. Rolę tę pełni przede wszystkim H2O2, który nie ma

charakteru wolnorodnikowego. Jest stosunkowo stabilną formą ROS i posiada zdolność do

swobodnego przemieszczania się przez błony biologiczne, kanałami wodnymi –

akwaporynami lub specyficznymi kanałami zwanymi peroksykanałami. Może zatem

oddziaływać z różnymi składnikami komórki np. modyfikować strukturę białek (reagowanie z

grupami sulfhydrylowymi –SH reszt aminokwasów) poza miejscem, w którym powstaje . Z

tego względu H2O2 uznawany jest za przekaźnik drugiego rzędu w przenoszeniu sygnału w

komórkach roślinnych.

Wszystkie formy ROS, stanowią bardzo ważny element w wielu szlakach transdukcji sygnału

pełniąc funkcje wtórnych przekaźników informacji np. w szlaku sygnalnym etylenu czy

ABA. Wyniki badań prowadzonych nad tolerancją tkanek rzodkiewnika na wysokie stężenia

H2O2 wykazały, że rośliny są w stanie przetrzymać stężenia rzędu 102

- 2 x

105 µM H2O2.

Ponadto, rośliny traktowane H2O2, były bardziej odporne na stres świetlny i chłodu. ROS

mogą modyfikować DNA, głównie na poziomie nukleotydów. Wykazano, że podwyższone

stężenie H2O2 w kulturze zawiesinowej komórek rzodkiewnika wywołuje zmianę poziomu

ekspresji ponad 100 genów (część z nich stanowiły geny kodujące enzymy należące do

systemu antyoksydacyjnego). ROS stymulują ponad 2-krotnie ekspresję genów kodujących

takie białka jak: białka związane ze starzeniem organizmu i naprawą uszkodzonego DNA,

m.in. aktywując czynniki transkrypcyjne. ROS mogą oddziaływać z białkami w regulacji

różnych procesów metabolicznych, kontrolują również funkcjonowanie kaskady kinaz

białkowych aktywowanych mitogenami (MAP). ROS hamują aktywność fosfataz, aktywują

kanały wapniowe i białka wiążące wapń. Regulują potencjał redoks w komórce m.in. w

wyniku oddziaływania na zmianę stosunku GSH/GSSG (glutationu w formie zredukowanej

do formy utlenionej). Wykazano, że aktywność niektórych białek zaangażowanych w procesy

energetyczne podlega modyfikacjom przez H2O2. Ponadto, H2O2 może współdziałać z NO w

modyfikacji innych białek, oddziaływując na grupy sulfhydrylowe (-SH) i umożliwiając ich

nitrozylację. Wspólnie z NO, ROS (głównie H2O2) stymulują alternatywną drogę oddechową,

poprzez aktywację genów alternatywnej oksydazy AOX . Z drugiej strony, AOX może

zmniejszać stężenia ROS w mitochondriach, kiedy następuje zaburzenie transportu

elektronów, zwłaszcza pod wpływem różnych czynników stresowych i w ten sposób działać

jako antyoksydant.

Jedną z najważniejszych potranslacyjnych modyfikacji białek przez ROS jest ich

utlenianie, będące najprawdopodobniej procesem nieodwracalnym. Utlenianie w białkach

reszt aminokwasowych takich jak: Arg (arginina), His (histydyna), Lys (lizyna), Pro (prolina),

Thr (treonina) i Trp (tryptofan) powoduje powstawanie wolnych grup karbonylowych.

ROS pełnią funkcję cząsteczek sygnałowych

H2O2 uczestniczy w regulacji szeregu procesów fizjologicznych np. takich jak:

• Ruchy aparatów szparkowych indukowane obecnością kwasu abscysynowego (ABA)

• Reakcja grawitropiczna korzeni w odpowiedzi na auksynę

• Kiełkowanie nasion

• Starzenie owoców, nasion i liści

• Dojrzewanie owoców

• Reakcja roślin na patogeny

Oddziaływanie ROS na żywą tkankę, polega nie tylko na ich toksyczności (właściwości

antyseptyczne H2O2 w stosunku do patogenów), ale również na regulacji wielu procesów

fizjologicznych. Kontroli za pośrednictwem ROS podlegają oprócz procesów wymienionych

powyżej wzrost i rozwój korzenia, liści i kwiatów. ROS uczestniczą w somatycznej

embriogenezie, a także indukują programowaną śmierć komórki – PCD (ang. programmed

cell death). W czasie elongacyjnego wzrostu komórek, auksyny zwiększają apoplastyczną

produkcję ROS. Peroksydazy związane ze ścianami komórkowymi katalizują wytwarzanie

·OH wykorzystując nagromadzone ROS. Rodnik

·OH uczestniczy w rozluźnianiu struktury

ściany komórkowej i w ten sposób umożliwia wydłużanie się komórek.

Dojrzewanie i starzenie się owoców jest procesem kontrolowanego utleniania. W tkankach

owoców podczas dojrzewania zmniejsza się zawartość grup tiolowych, a wzrasta zawartość

nadtlenku wodoru i nadtlenków lipidów. Dojrzewanie owoców można przyspieszyć przez

traktowanie ich zewnętrznymi źródłami ROS lub doprowadzając do zwiększenia

wewnątrzkomórkowego stężenia ROS. Wydaje się, że istnieje współdziałanie pomiędzy ROS

i etylenem (hormon roślinny, zaliczany do grupy inhibitorów wzrostu) w regulacji starzenia

tkanek i dojrzewania owoców

PodsumowanieToksyczna i regulacyjna funkcja ROS

ROS

Błony komórkowe

Endoplazmatycznereticulum

chloroplasty

mitochondria

peroksysomy

Funkcja sygnałowa Działanie toksyczne

Kaskadowa reakcja z udziałem kinaz białkowych MAP

Aktywacja czynników transkrypcyjnych

Indukcja stresu oksydacyjnego

Uszkodzenia białek, kwasów nukleinowych lipidów błonowych

Modyfikacja ekspresjii genów

Utrata funkcji organelli komórkowych

Uszkodzenie lub śmierd komórki

Odpowiedź fizjologiczna komórki

Podsumowanie wykładu

Konsekwencją wysokiej zawartości O2 w atmosferze jest powstawanie reaktywnych form

tlenu (ROS), które są stale produkowane w komórkach roślinnych jako uboczny produkt

metabolizmu głównie fotosyntetycznego i oddechowego. Do podstawowych reaktywnych

form tlenu należą: nadtlenek wodoru (H2O2), anionorodnik ponadtlenkowy (O2.-), rodnik

hydroksylowy. Wzmożoną produkcje ROS obserwuje się komórkach roślin poddanych

działaniu różnych stresów, zarówno biotycznych jak i abiotycznych. Sytuacja nadmiernej

produkcji ROS, przekraczającej możliwości usuwania ROS z komórek nosi nazwę stresu

oksydacyjnego. Ochrona przed niekorzystnym działaniem ROS polega na uruchomieniu

komórkowego systemu antyoksydacyjnego: drobnocząsteczkowego (askorbinian, glutation,

karotenoidy, tokoferol) i enzymatycznego (dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, enzymy

cyklu Haliwella-Asady). Oprócz funkcji cytotoksycznej ROS pełnią także funkcję cząsteczek

sygnałowych, odpowiedzialnych za przenoszenie informacji w regulacji odpowiedzi na różne

stresy biotyczne i abiotyczne oraz procesów wzrostu i rozwoju roślin.

Literatura podstawowa

Fizjologia roślin, red. J. Kopcewicz, S. Lewak, rozdz. Stres oksydacyjny. Wydawnictwo

Naukowe PWN Warszawa 2002

Małecka A., Tomaszewska B. 2005.Reaktywne formy tlenu w komórkach roślinnych i

enzymatyczne systemy obronne. Postępy Biologii Komórki 32: 311-325.

Szymańska R., Strzałka K. 2010. Reaktywne formy tlenu w roślinach – powstawanie,

dezaktywacja i rola w przekazywaniu sygnału. Postępy Biochemii 56: 182-190.

Druga twarz tlenu, Bartosz G. Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 2003.

Literatura dodatkowa i ciekawostki

Lane N. 2005. Tlen. Cząsteczka, która stworzyła świat. Prószyński i S-ka, Warszawa.

Gniazdowska A. (2004) Rola tlenku azotu w metabolizmie komórki roślinnej. Kosmos 53:

343-355.

Gniazdowska A. Bogatek R. 2007. Regulacyjna rola NO w kiełkowaniu nasion. Postępy

Biologii Komórki 34:431-443.

Pytania problemowe

1. Zastanów się, czy określenie stres oksydacyjny ma jednoznacznie negatywne

znaczenie?

2. Dlaczego mówi się niekiedy o dwóch obliczach cząsteczki tlenu?

3. Czy obecność sprawnego systemu antyoksydacyjnego gwarantuje usunięcie

wszystkich ROS obecnych w komórce i czy byłoby to dla niej korzystne?