YT

Media Type

• Composition– Buffer (phosphate based)– Nitrogen source (ammonium

chloride or ammonium sulfate)– Carbon Source (glucose or

glycerol)– Trace Metals (Ca, Co, Cu, Fe,

Mn, Mo, Se and Zn)– Vitamins (Biotin, thiamine,

folic acid, riboflavin, niacinamide, PABA, pantothenic acid and pyridoxine)

• Composition– Tryptone

– Yeast extract

– Sodium Chloride

• Examples– Luria Broth (LB)

– 2xYT

– TB (phosphate buffered)

Rich Media Chemically Defined

M9 medium is a minimal growth medium used for bacterial cultures.

It has the advantage of being cheap

M9 minimal medium

Isotopically labeled proteins can be prepared straightforwardly in E. coli by growing cells in minimal media M9 supplemented with appropriate nutrients (15NH4Cl, 13C-glucose)

For large proteins deuterium labeling provides simplified spectra for the remaining 1H nuclei and has useful effects on relaxationproperties of attached or adjacent atoms (1H, 15N,13C).

1x M9 salts 2mM MgSO4 0.1mM CaCl2

0.4% carbon source (e.g. glycerol, glucose, etc.)1g nitrogen source (15N)

In sterile H2O

5X M9 salts contains: 64 g Na2HPO4.7H2O

15 g KH2PO4 2.5 g NaCl 5 g NH4Cl

dissolved in deionized water to a final volume of 1 L

Rich vs. Minimal Media

pET expression of At3g17210

pQE expression of At3g17210

Parametri delle colture

Temperatura

Da 16°C a 37°C

Surf1 pTH24 C41 25° Surf1 pTH24 C41 18°M IB Prot FT1 FT2 W1 W2 W3 W4 W5 E1 E2 E3M IB IB Prot FT1 FT2 W1 W2 W3 W4 W5 E1 E2 E3

IPTG

Differenti concentrazioni

1mM - 0.1mM

Induzioni a tempi diversi

FASE DI LATENZA: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano all’ambiente (non si moltiplicano)

FASE ESPONENZIALE: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costantePLATEAU: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che muoiono

FASE DELLA MORTE: cessa la moltiplicazione dei microrganismi che invecchiano e muoiono

t

Uni

tà f

orm

anti

colo

nie

latenza

espo

nenz

iale

plateau

morte

Trasformazione del DNA per espressione proteica

Trasformazione in BL21 A 100.0 l di cellule competenti di E. coli (BL21) si aggiungono X l (corrispondenti a 100 ng) di uno dei campioni di DNA plasmidico che hanno dato risultato positivo allo screening. Controllo: in parallelo compiere la stessa reazione aggiungendo X l di acqua sterile invece del plasmide. 30’, ghiaccio 90’’, 42°C 2’, ghiaccio aggiungere 900.0 l 2xYT, 1h shaker a 37°C, 150 rpm. Strisciare su piastre contenenti 2xYT + amp (200 g/ml), 200.0 l di ognuna delle trasformazioni. O/N, 37°C

Coltura massiva

Inoculo Si prelevano singole colonie che vengono trasferite in alcuni ml di terreno liquido. Si lascia incubare in shaker alla temp. opportuna per il ceppo batterico, per circa 12-16 ore (fase stazionaria)

Coltura massivaL’inoculo viene trasferito in alcuni litri di terreno liquido, 1% in volume .Si lascia incubare in shaker alla temp. opportuna.All’inizio della fase esponenziale l’espressione della proteina viene indotta per aggiuntadi un induttore che determina l’avvio della trascrizione proteica

tempo di incubazione

0 4 8 12 16

fase esponenziale

Abs600

+IPTG

raccolta celluleO

S

HH

OH

H

OH

H OH

H

OH

CH3

CH3

IPTG

Procedura per l’espressione di rame proteina

Preparazione inoculo da piastra 

Inoculare 2 tubi contenenti ciascuno 6 ml di 2xYT + amp (200 g/ml) con 2-3 colonieprelevata da piastra. Mettere ad incubare in shaker O/N a 37°C. Preparazione coltura massiva 

Inoculare 2 beute da 2l contenenti ciascuna 0.5 l 2xYT + amp (200 g/ml) con 5 ml di inoculo già preparato. Mettere ad incubare in shaker a 37°C. Misurare ad intervalli regolari la densità ottica a 600 nm. Quando la densità ottica raggiunge il valore di 0.6, aggiungere a ciascuna beuta 1.0 ml di soluzione di IPTG 0.5 M (concentrazione finale 1 mM) e 125 l di soluzione di CuSO4 1 M Continuare l’incubazione in shaker alla temperatura di 25°C per 16 h.Aggiungere 375 l di soluzione di CuSO4 1 M 45’ prima di raccogliere le cellule

Isolamento della proteina

Rottura delle celluleSeparazione dell’estratto dalle cellule

Ottimizzazione per lo scale-up

Minifors fermenters• Interactive control of culture

parameters: Temp, pH, pO2

• Parameters can be automatically changed during the culture from a computer

• Possibility of feed/continuous cultures

GESTIONE DEI PARAMETRI DI PROCESSO

Temperatura riscaldamento/raffreddamento

Agitazione impostazione/variazione di un “set point”

Flusso aria impostazione/variazione di un “set point”

pH aggiunte di acido/base e/o feed

pO2 agitazione/ flusso aria/ arricchimento in O2 e/o feed

Schiuma aggiunte di antischiuma

Alimentazione impostazione/variazione di un ciclo di attività della pompa del feed

Nei processi di estrazione e purificazione delle proteine, a differenza di quanto avviene per il DNA/cellule, non occorre prestare attenzione alla sterilità ma bisogna evitare la denaturazione dei campioni (elevate temperature, detergenti, valori estremi di pH possono denaturare facilmente le proteine)

Inoltre è importate procedere all’estrazione delle proteine il più velocemente possibile, per evitare processi degradativi.

Per conservare i campioni da cui estrarre le proteine vanno congelati rapidamente in azoto liquido (-140°C) e poi conservati in frigo a -80°C

ESTRAZIONE______________________________________________

LISI DELLE CELLULE

Localizzazione della proteina

Tipo di cellule

Quantità di cellule

BUFFER DI LISI

Localizzazione della proteina

Parametri chimico-fisici della

proteina (pI, idrofobicità, …)

Presenza di Cys ridotte/ossidate

Metalli

Regioni transmembrana

Attività proteolitica

Rimozione di acidi nucleici

CHIARIFICAZIONE

Centrifugazione

Ultrafiltrazione

Proteine extracellulari secrete nel terreno di cultura o nel siero possono essere rimosse dal materiale insolubile per semplice centrifugazione

Proteine intracellulari possono essere recuperate dopo rottura delle cellule

La procedura adottate per ottenere un estratto grezzo (estratto contenente tutte le proteine cellulari solubili nel tampone di estrazione utilizzato) dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse.

I metodi utilizzati per la rottura delle cellule dipendono in gran parte dalla fragilità delle cellule

Cellule animali

-Cellule fragili(eritrociti)

-Cellule che contengono materiale fibroso(c. muscolari)

Cellule vegetali

Più difficili da rompere perché contengono cellulosa

Microorganismi

-Batteri che si lisano facilmente

-Batteri con pareti più resistenti

• Utilizzo di detergenti per dissolvere la membrana cellulare

Proteine di secrezione Le proteine contengono segnali che ne determinano la destinazione.Una proteina può restare nel citosol, può essere portata sulle membrane plasmatica o interna,nello spazio intermembrana o nel mezzo intracellulare.

Sequenze segnale aminoterminali (16-26 AA) dirigono le proteine batteriche attraverso le membrane plasmatiche od esterne del batterio. Vengono riconosciute e tagliate da opportune peptidasi

Proteine secrete nel periplasma possono essere recuperate per rottura della sola membrana esterna (shock osmotico)

Shock osmotico

Per 1 litro di coltura Centrifugare la cultura a 8000 rpm per 10’, 4°C. Disperdere il pellet in 50 ml Tris-HCl 10 mM a pH 7.5. Aggiungere 50 ml di soluzione di saccarosio al 40% in 10 mM Tris-HCl pH 7.5 + 2 ml di soluzione EDTA 0.5 mM pH 8. Le soluzioni devono essere ice-cold. Tenere in agitazione in ghiaccio in camera fredda per 20’.

Centrifugare 10000 rpm per 15’ a 4°C. Rimuovere accuratamente il surnatante.

Disperdere il pellet in 30 ml H2O fredda tenere in bagno di ghiaccio per 20’.

Centrifugare per 15000 rpm per 15‘ a 4°C. Raccogliere accuratamente il surnatante che contiene la proteina.

Disperdere nuovamente il pellet in 20 ml H2O fredda e tenere ancora per 20’ in

bagno di ghiaccio sotto agitazione.

Centrifugare a 15000 rpm per 15’ a 4°C e raccogliere il surnatante.Riunire i due surnatanti.

LISI DELLE CELLULE

Tecniche di rottura delle cellule

Uso del lisozima nella rottura della parete cellulare

Il lisozima lisa alcuni tipi di batteri rompendo la componente polisaccaridica della parete, formata da 2 tipi di zuccheri, N-acetilglucosamina (NAM) e da acido N-acetilmuranico (NAG).La parete perde rigidita’ e il batterio scoppia a causa dell’elevata pressione osmotica intracellulare

Il lisozima idrolizza il legame glicosidico tra il C-1 del NAM e il C-4 del NAG

Alcuni sistemi per rompere le cellule

Vari modelli di omogeneizzatore.

I buffer più utilizzati sono: Fosfato – Tris – HEPES (pH: 5.8-9)

Concentrazioni del buffer: 20-50 mM

Tris: il pH dipende dalla temperatura pKa: 8.06 a 25°C 8.85 a 0°C

SCELTA DEL BUFFER DI LISI

Buffer pH range

Citric acid - NaOH 2.2 - 6.5

Sodium citrate - citric acid 3.0 - 6.2

Sodium acetate - acetic acid 3.6 - 5.6

Cacodylic acid sodium salt - HCl 5.0 - 7.4

MES - NaOH 5.6 - 6.8

Sodium dihydrogen phosphate - disodium hydrogen phosphate 5.8 - 8.0

Imidazole - HCl 6.2 - 7.8

MOPS - KOH 6.6 - 7.8

Triethanolamine hydrochloride - NaOH 6.8 - 8.8

Tris - HCl 7.0 - 9.0

HEPES - NaOH 7.2 - 8.2

Tricine - NaOH 7.6 - 8.6

Sodium tetraborate - boric acid 7.6 - 9.2

Bicine - NaOH 7.7 - 8.9

Glycine - NaOH 8.6 - 10.6

SCELTA DEL BUFFER DI LISI

TAMPONICOMMERCIALI

SCELTA DEL BUFFER DI LISI

Class of additive example concentration purpose

Salts NaCl, KCl, (NH4)2SO4

50-150 mM maintain ionic strength of medium

Detergents Deoxycholate,Triton X-100

0.1-1% solubilization of poorly soluble proteins

Glycerol   5-10% stabilization

Glucose or sucrose   25 mM Stabilize lysosymal membranes, reduce protease release

Metal chelators EDTA, EGTA 1 mM reduce oxidation damage, chelate metal ions

Reducing agents DTT, DTE2-Mercaptoethanol

1-10 mM0.05%

reduce oxidation damage

Ligands, metal ions Mg2+, ATP, GTP 1-10 mM stabilization

Protease Inhibitors PMSF, Aprotinin,… Reduced protease activity

DNase DNAse I 10-100 U/ml Reduced solution viscosity

ADDITIVI: Aumentano la stabilità della proteina Aumentano la solubilità della proteina

- 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate

- Molecular Weight: 614.88g

- Micelle Molecular Weight: 6149g

- Critical Micelle Concentration (CMC): 8 to 10mM

- Dialyzable: Yes

Un’analisi di sequenza della proteina target può evidenziare siti di taglio per specifiche proteasi

E’ importante lavorare a basse temperature

Ottimizzazione dell’estratto Il tampone di estrazione deve avere composizione salina e pH piu’ simile possibile alle condizioni cellulari, per mantenere in soluzione le proteine Forza ionica 0.15-0.2 MpH 7-7.5Generalmente 2-3 volumi di tampone rispetto al volume del pellet. Maggiore il volume minore

sarà la % di proteine perse nel pellet

Tipici tamponi utilizzati sono 20-30 mM fosfato o Tris-HCl o HEPES

Talvolta vengono aggiunti specifici stabilizzanti come, detergenti, EDTA, inibitori delle proteasi e reagenti contenenti gruppi sulfidrilici come -mercaptoetanolo e ditiotreitolo (5-20mM)

Questi hanno lo scopo di proteggere i residui cisteinici dall’ossigenoI gruppi SH delle cisteine esposti all’ossigeno possono1) formare legami disolfuro –S-S-2) ossidarsi a gruppi solfinici –S-OH3) ossidarsi a gruppi solfoniciLa reazione 1) puo’ essere accelerata da ioni metallici.EDTA rimuove gli ioni metalliciReagenti con gruppi SH si ossidano all’ossigeno al posto delle cisteine

S

OH

OR

SH

OH

HOH

H

SH

+ 1/2 O2SOH

HOH

H

S

Chiarificazione dell’estratto

L’estratto proteico, dopo la rottura delle cellule può essere viscoso per la presenza di acidi nucleiciQuesti possono essere rimossi: per aggiunta di RNAasi e DNAsi per precipitazione con solfato di protamina (composto policationico estratto da pesci)La protamina interagisce elettrostaticamente con gli acidi nucleici.Si forma un complesso che precipita a f. ionica non troppo elevata (< 0.1 M) e ne provoca la precipitazione

L’estratto viene chiarificato da organelli, frammenti di membrana e precipitati per centrifugazione.

CHIARIFICAZIONE: CENTRIFUGAZIONE

La velocità e la durata della centrifugazione dipendono dal coefficiente di

sedimentazione (S) delle particelle da separare:

Il coefficiente di sedimentazione è un numero adimensionale che misura il rapporto tra la velocità di

sedimentazione di un corpo ideale (sfera) e quella del corpo in esame, a parità di condizioni di

riferimento. In alcuni casi è espresso come unità di misura non SI denominata Svedberg

ω = velocità angolare [rad sec-1] = 0.10472 x RPM (rotazioni per min)

r = distanza tra la particella ed il centro del rotore [mm]

dr/dt = velocità di sedimentazione della particella [cm sec-1]

dr/dt = [2/9 r2 p (p-m) 2 r]/

S = 1/ω2r x dr/dt

Differenza tra la sua densità e quella del

mezzo

Coefficiente di viscosità del mezzo

1 Svedberg = 10–13 sec

  S

enzimi, ormoni peptidici, proteine solubili

2-25  s

Acidi nucleici 3-100 s

Ribosomi e polisomi 20-200 s

virus 40-1.000 s

lisosomi 4.000 s

membrane 100-100x103 s

mitocondri 20x103S-70x103 s

nuclei 4.000x103 S-40.000x103 s

Dimensione della particella

CHIARIFICAZIONE:

ULTRAFILTRAZIONE

Separazione tramite filtrazione con

membrane a diverso CUT-OFF

ESTRAZIONE DI PROTEINE ESPRESSE IN CORPI DI INCLUSIONE

REFOLDING:

L’agente denaturante viene rimosso per permettere la rinaturazione della proteina

Tecniche di refolding:Tecniche di refolding:

REFOLDING DIRETTO

DIALISI

REFOLDING IN COLONNA (proteine di fusione)

Metodo sperimentale proprietà chimico-fisiche della proteina

Preparazione materiale e soluzioni

 

     Sterilizzare materiale (punte, eppendorf, tubi da PCR)     Sterilizzare 4 beute da 2 l, con 0.5 l ciascuna di 2YT     Sterilizzare H2O

     Preparare 2 0.5 l 2YT sterile     Preparare 2 10 ml amp sterile 1000 (2g/10 ml)     Preparare 2 5 ml IPTG sterile (0.5 M)     Preparare 2 10 piastre 2YT agar + amp (200 g/ ml) Soluzione sterile di ampicillina (2 g/10 ml)Sciogliere 2 g di ampicillina in 10 ml di H2O

Sterilizzare per filtrazione in Falcon sterile Soluzione sterile di IPTGSciogliere la quantità opportuna di IPTG, per avere soluzione 0.5 M, in 5 ml di H2O. Sterilizzare per filtrazione in Falcon sterile 

Preparazione materiale e soluzioni 

2YT 0.5 l triptone 8.0 gestratto di lievito 5.0 gNaCl 2.5 g Portare a volume con H2O – Sterilizzare in autoclave, 120 °C, 1 bar, 30’.

 

2YT agar 0.5 l triptone 8.0 gestratto di lievito 5.0 gNaCl 2.5 gAgar-agar 10.0 g Portare a volume con H2O – Sterilizzare in autoclave, 120 °C, 1 bar, 30’.

 Aggiungere soluzione ampicillina sterile (concentrazione finale 200 g/ ml, 0.5 ml su 0.5 l) quando la soluzione e’ quasi fredda, prima che solidifichi