Yasemin KAYA - cu.edu.trI ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ SEYHAN BARAJ GÖLÜ’NDEN İZOLE EDİLEN...

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Yasemin KAYA

SEYHAN BARAJ GÖLÜ’NDEN İZOLE EDİLEN ENTEROBACTERIACEAE GRUBU BAKTERİLERDE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİĞİ VE PLAZMİD PROFİLLERİNİN BELİRLENMESİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2009



SEYHAN BARAJ GÖLÜ’NDEN İZOLE EDİLEN

ENTEROBACTERIACEAE GRUBU BAKTERİLERDE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİĞİ VE PLAZMİD PROFİLLERİNİN BELİRLENMESİ

Yasemin KAYA

YÜKSEK LİSANS


Bu tez …./…./2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir.

İmza ……………………. Prof. Dr. Sadık DİNÇER DANIŞMAN

İmza…………………. Doç Dr. Hatice GÜVENMEZ ÜYE

İmza……………… Doç. Dr. Hüseyin ERTEN

ÜYE

Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No:

Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza-Mühür Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2007YL6 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir

I

ÖZ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

SEYHAN BARAJ GÖLÜ’NDEN İZOLE EDİLEN

ENTEROBACTERIACEAE GRUBU BAKTERİLERDE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİĞİ VE PLAZMİD

PROFİLLERİNİN BELİRLENMESİ

Yasemin KAYA




Danışman : Prof. Dr. Sadık DİNÇER

Yrd. Danışman Yrd. Doç. Dr. Fatih MATYAR

Yıl : 2009 Sayfa: 58

Jüri : Prof. Dr. Sadık DİNÇER

Doç. Dr. Hatice GÜVENMEZ

Doç. Dr. Hüseyin ERTEN

Bu çalışmada Seyhan Baraj Gölü’den izole edilen Enterobacteriaceae grubu 88

bakteri suşunun çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) belirlenmiştir. İzolatların plazmidleri

izole edilerek her bakteriye ait plazmid profili belirlenmiştir. İzolatlardan MAR indeksi 1

olan tek bir bakteri belirlenmiş ve bu suş Escherichia coli olarak tanımlanmıştır. İzolatlardan

14 tanesinin MAR indeksinin 0.142 olduğu belirlenmiştir.

Plazmid izolasyonunda 40 izolatın (% 45.5) plazmid içerdiği belirlenmiştir.

Antibiyotik sayılarının plazmid ile ilşkilerine bakıldığında 7 antibiyotiğe karşı dirençli olan

Escherichia coli suşunda hiç plazmid DNA bandı gözlenmemiştir. Tek antibiyotiğe dirençli

olan diğer bir Escherichia coli suşunda ise toplam 7 plazmid DNA bandı olduğu

belirlenmiştir. Beş farklı antibiyotiğe dirençli olan yine bir diğer Escherichia coli suşunda

ise 14 plazmid DNA bandı gözlenmiştir.

Anahtar Kelimeler: Enterobacteriaceae, Seyhan Baraj Gölü, Antibiyotik Dirençliliği, Plazmid izolasyonu, Elektroforez

II

ABSTRACT

M.Sc. THESIS

ANTIBIOTIC RESISTANCES OF ENTEROBACTERIACEAE ISOLATED FROM SEYHAN DAM AND DETERMINATION OF

PLASMID PROFILE

Yasemin KAYA

DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUE OF NATURAL APPLIED

SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA

Supervisor : Prof. Dr. Sadık DİNÇER

Co. Supervisor Assoc. Asist. Prof. Dr. Fatih MATYAR

Year : 2009 Pages: 58

Jury : Prof. Dr. Sadık DİNÇER

Assist. Prof. Dr. Hatice GÜVENMEZ

Assist. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN

In this study, Multiple antibiotic resistance was determined 88 Enterobacteriaceae

strains which were isolated from Seyhan Dam. Plasmids of these strains were isolated and

each of these strains plasmide profile was determined.

MAR index of one strain was determined to be 1 and this strain was identified as

Escherichia coli. MAR index of 14 strains in total 88 isolates were determined to be 0.142.

It was determined that 40 isolates contain plasmid in 88 total isolates. It were seen

that relationship with antibiotic count and plasmid profile, Escherichia coli, which was resist

to 7 antibiotic, has not any plasmid. But another strain of Escherichia coli, which was resist

to 1 antibiotic, has contain total 7 plasmid bands. Moreover, the other Escherichia coli strain

resist to 5 antbiotics. But it has 14 plasmid bands.

Key Words: Enterobacteriaceae, Seyhan Dam, Antibiotic Resistance, Plasmid isolation, Electrophoresis.

III

TEŞEKKÜR

Çalışmalarım esnasında her türlü desteğini ve yardımını esirgemeyen, bilgi

ve deneyimleriyle bana yol gösteren danışman hocam Prof. Dr. Sadık DİNÇER’e

ve ikinci danışmanım olan Yrd. Doç. Dr. Fatih MATYAR’a teşekkürlerimi bir

borç bilirim.

Tezimin deney ve yazım aşamalarında benden yardımlarını esirgemeyen

bütün bölüm hocalarıma teşekkür ederim.

Çalışmam boyunca benden desteklerini esirgemeyen Dr. Osman

GÜLNAZ’a, Arş. Gör. Ayşenur KAYA’ya, Uzman Biyolog Emel

KARADENİZ’e, Uzman Biyolog Esen BİLGİN’e, Uzman Biyolog Sinem

BALCI’ya ve aynı laboratuarı paylaştığım bütün arkadaşlarıma teşekkür ederim.

Bugüne kadar beni destekleyen, çalışmalarım boyunca maddi ve manevi

desteklerini benden esirgemeyen annem Nadire UÇAK, babam Hikmet Öner

UÇAK’a ve değerli eşim Ömer KAYA’ya teşekkürlerimi bir borç bilirim.

IV

İÇİNDEKİLER

ÖZ …………………………………………………………………………………..I

ABSTRACT ............................................................................................................ II

TEŞEKKÜR…………………………………………………………………………III

İÇİNDEKİLER .......................................................................................................IV

ÇİZELGELER DİZİNİ ...........................................................................................VI

ŞEKİLLER DİZİNİ .............................................................................................. VII

1. GİRİŞ .............................................................................................................. 1

1.1. Antibiyotikler .......................................................................................... 2

1.1.1. Penisilinler ........................................................................................ 3

1.1.2. Sefalosporinler .................................................................................. 3

1.1.3. Karbapenemler .................................................................................. 3

1.1.4. Tetrasiklinler ..................................................................................... 4

1.1.5. Aminoglikozitler ............................................................................... 4

1.2. Antibiyotiklere karşı direnç gelişimi ........................................................ 4

1.3. Bakteriyel Ekstra Kromozomal Genetik Elamanlar .................................. 5

1.3.1. F faktörleri......................................................................................... 7

1.3.2. F

1.3.3. Col plazmidleri (Kolisinojenik faktörleri) .......................................... 7

1.3.4. R plazmidleri-RTF faktörleri ............................................................. 8

1.3.5. Staphylococcus plazmidleri ............................................................... 8

1.3.6. Virülans plazmidleri .......................................................................... 9

1.4. Mikroorganizmalar Arası Genetik Madde Aktarımı ................................. 9

1.4.1. Transformasyon ............................................................................... 10

1.4.2. Konjugasyon ................................................................................... 10

1.4.3. Transdüksiyon ................................................................................. 11

1.5. Agaroz Jel Elektroforezi ........................................................................ 11

1.6. Çalışmanın Amaçları ............................................................................. 12

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR .............................................................................. 13

3. MATERYAL ve METOD .............................................................................. 20

SAYFA

V

3.1. Materyal ................................................................................................ 17

3.1.1. Bakteri Suşları……………………………………………………….17

3.1.2. Kullanılan Besiyerleri ...................................................................... 17

3.1.2.1. LB (Luria-Bertoni) Buyyon..................................................... 17

3.1.2.2. PCA Agar ................................................................................ 17

3.1.3. Kullanılan Çözeltiler........................................................................ 18

3.1.3.1. Plazmid izolasyon Kiti ............................................................. 18

3.1.3.2. 10 X TBE (Tris-Borik asit-EDTA) Solüsyonu .......................... 19

3.1.3.3. Agaroz jel (%1) 70 mL ...................................................... 19

3.1.3.4. Örnek Yükleme (Loading Buffer) Tamponu............................. 20

3.1.3.5. Yürütme Tamponu 1x .............................................................. 20

3.1.3.6. Stok Boyama Solüsyonu (Staining) (Ethidium Bromür) ....... …20

3.1.3.7. Boyayı Geri Alma Solüsyonu ................................................... 20

3.2. Metod .................................................................................................... 21

3.2.1. Örnek Toplama İstasyonlarının Özellikleri ...................................... 22

3.2.2. Çoklu Antibiyotik Direnci (MAR) İndeksi ....................................... 22

3.2.3. Bakterilerden Plazmid İzolasyonu .................................................... 22

3.2.4. Agaroz Jelin Hazırlanması ve Örneklerin Jele Uygulanması……….24

3.2.5. DNA'nın Ethidium Bromid ile Boyanması…………………………25

4. BULGULAR ve TARTIŞMA ......................................................................... 26

4.1. Bakterilerin Antibiyotik Dirençlilik Profillerinin Çıkarılması ................ 26

4.2. Çoklu Antibiyotik Dirençliliği (MAR) İndeksi ...................................... 30

4.3. Plazmid Profillerinin Analizi ................................................................. 31

5. SONUÇ ve ÖNERİLER ................................................................................. 50

KAYNAKLAR ....................................................................................................... 52

ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................... 58

VI

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 3.1. Örnek toplama istasyonlarının özellikleri (Balcı, 2007) ....................... 22

Çizelge 4.1. Bakterilerin gösterdikleri dirençlilik dağılımları (Balcı, 2007) ............. 26

Çizelge 4.2. Bakterilerin MAR indeksi-1 ................................................................ 30






SAYFA

VII

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 3.1. Örnek toplama istasyonları...................................................................... 21

Şekil 4.1. Bakterilerin agaroz jel elektroforez sonuçları-1 ....................................... 37


Şekil 4.3. Bakteilerin agaroz jel elektroforez sonuçları-3 ........................................ 40






SAYFA

1. GİRİŞ Yasemin KAYA

1

1.GİRİŞ

Mikroorganizmalar değişen çevre koşullarına hızla uyum sağlayabilme

yeteneklerine sahip yeryüzünün en eski canlılarıdır (Demirtürk ve Demirdal, 2004).

Akuatik çevrelerde bakteriler ekosistemin doğal bir parçasıdır (Robinson ve

Tuovinen, 1984). Yüzey sularına fekal bakteri bulaştıran kirliliğin kaynağının

bilinmemesi, tanımlanmasının güç olduğu ispatlanmıştır (Hagedorn ve ark., 1999).

Kirlilik kaynağının bilinmesi su kalitesinin normal haline gelmesine yardım

edebilir, su havzasına ayrılan nutrientlerin miktarını azaltabilir ve kontamine olmuş

sulara maruz bırakılmasından dolayı ortaya çıkan bulaşıcı hastalıkların tehlikesi

azaltılabilir (Hagedeorn ve ark., 1999). İnsanların günlük yaşam gereği harcadığı ve

kullanım sularının oluşturduğu atık sular, çeşitli şekillerde yerleşim birimlerinden

çevre sularına katılmaktadırlar. Bu nedenle sucul ortamlar, katılan suların içerdiği

kirlilik etkenlerine bağlı olarak organik ve inorganik maddeler tarafından

kirletilmektedir (Karayakar ve ark., 2004).

Akuatik alan üzerinde etkili olan çevresel faktörlere göre bakterilerde

meydana gelen değişiklikler, ekosistem ve insan sağlığı ile ortamın ekonomik

kullanılabilirliğinde olumsuzluklara yol açar (Robinson ve Tuovinen, 1984). Atık

suların herhangi bir arıtma işlemi uygulanmadan çevre sularına katılımı, içerdikleri

organik maddelerin mikroorganizmalarca parçalanması sonucu çevre sularında doğal

yaşam koşullarının bozulmasına neden olurken içerdikleri çeşitli toksik maddeler ve

patojen mikroorganizmalar nedeniyle de insan sağlığı açısından da önemli tehlikeler

oluşturur (Karayakar ve ark., 2004).

Özellikle evsel atıklar, R-plazmidi taşıyan ve çoğunluğu insan barsak

florasından kaynaklanan bakteriler içerir. Bu bakterilerde antibiyotiklere dirençlilik

kazandıran R-plazmidleri yaygın olarak bulunduğundan, atık suların çevre sularına

deşarjı, bu tip dirençli bakterilerin çevreye yayılmasına neden olmaktadır (Karayakar

ve ark., 2004). Antibiyotik çağından önce izole edilip saklanan bakterilerde direnç

faktörlerinin bulunmadığı ve bugün pratikte kullanılan hemen hemen tüm

antibiyotiklere bu bakterilerin duyarlı oldukları kanıtlanmıştır (Doğancı, 2001)


2

Bakteriler çevresel değişikliklere çok çabuk cevap verebildiklerinden, bu

yetenekleri akuatik ekosistemde köklü değişikliklere yol açabilmektedir (Giuliano,

2003). Bu özellikleri geliştirilen her yeni antibiyotiğe direnç geliştirebilmelerine de

yol açmakta ve infeksiyonlarla mücadelede en önemli engel olan antibiyotiklere

direnç sorunu ortaya çıkmaktadır (Vahaboğlu, 2004).

Son yıllarda antibiyotiklere karşı giderek artan direnç sorunu tüm dünyayı

tehdit eder hale gelmiştir (Akçam ve ark., 2004). Bugün için ise klinik önemi

bulunan bakterilerde antibiyotik dirençliliği ile ilgili 100’den fazla gen bulunduğu

bilinmektedir. Bir diğer yönden dirençlilik yayılabilir bir özelliktir ve oluştuktan

sonra, büyük bir hızla sadece aynı tür ve cinsler içinde değil, plazmid ve

transpozonlar gibi aktarılabilir genetik materyallerle diğer bakterilere de

geçebilmektedir (Doğancı, 2001).

1.1. Antibiyotikler

İnfeksiyon etkeni olan mikroorganizmalara karşı etkin bir mücadele

yapılması eski çağlardan beri tıbbın en önemli amaçlarından biri olagelmiştir

(Baştürk, 2005).

Tedavi amaçlı olarak doğal yollardan elde edilen bitkiler ve özütleri

kullanılmakta iken bu durum 1908’ de Paul Ehrlich’in bazı bakteriler üzerine kesin

olarak zararlı, konak hücreye ise daha az zararlı bazı kimyasal maddeleri bilimsel

metodlarla araştırıp ortaya koymasına kadar sürmüştür (Baştürk, 2005). İlk defa

İskoç bakteriyolog Alexander Fleming’in 1929’da gözlediği ve 1940 yılında Chain

ve Flarey’in Penicillium notatum’un salgılarından elde ettiği ve penisilin adını

verdikleri ilacın birçok mikroba öldürücü etkide bulunmasının keşfedilmesi bir

devrim olmuştur. İnfeksiyon hastalıklarının tedavisinde antibiyotikler son 50 yılda

son derece faydalı olmuşlar ve eskiden öldürücü olduğu bilinen pek çok hastalığın

tedavisi için vazgeçilmez unsurlar haline gelmişlerdir (Berzeg, 2005).

Antibiyotikler, bazı bakteri ve mantar türü mikroorganizmalar tarafından

üreme ortamlarında oluşturulan ve başka mikroorganizmalar için mikrobiyostatik ya

da mikrobisid etki gösteren ve sağaltımda kullanılan maddelerdir (Bilgehan, 1994).


3

İkinci Dünya Savaşı sırasında savaşla ilişkili yaraların sekonder bakteriyel

infeksiyonların ve pnömoni, sepsis gibi sistemik infeksiyonların tedavisinde

başarıyla kullanılarak, enfeksiyonlara bağlı ölümler azaltılmıştır (Tanır ve Göl,

1999).

1.1.1. Penisilinler

Yapılarındaki etkinlikleri için esas oluşturan beta-laktam halkası nedeniyle

beta-laktam antibiyotikler olarak adlandırılırlar. Bakterilerde hücre duvarı sentezini

seçici olarak inhibe ederler. Penisilinler en yüksek etkiyi aktif olarak çoğalan

bakteriler üzerinde gösterirler; bölünmeyen bakterilerde etkileri ya çok azdır ya da

hiç yoktur. Bakterisid etkilidirler (Strohl ve ark., 2006).

1.1.2. Sefalosporinler

Cephalosporicum acremonium isimli bir mantardan elde edilen sürekli

geliştirilerek antibakteriyel tedavide yaygın kullanılan antibiyotik türlerinden biridir

(Öncül, 2002). Gerek yapısal gerekse işlevsel olarak penisilinlere çok yakın beta-

laktam antibiyotikler olup bakterisid etkilidirler (Strohl ve ark., 2006). Bakterisid

etkilerini penisilinlerde olduğu gibi hücre duvar sentezinde rolü olan PBP (penisilin

bağlayıcı protein)’leri inhibe ederek ve otolitik enzimleri aktive ederek gösterirler

(Öncül, 2002). Bunlar, bazı bakteriler tarafından üretilen beta-laktamaz enzimlerinin

inaktive edici etkilerine karşı daha dayanıklıdırlar. Sefalosporinler birinci, ikinci,

üçüncü ve dördüncü kuşak olarak sınıflandırılırlar (Strohl ve ark., 2006).

1.1.3. Karbapenemler

Beta laktam grubu antibiyotiklerden olan karbapenemler, bugüne kadar

geliştirilen en geniş spektrumlu antibiyotiklerdir. Hem gram-pozitif hem de gram-

negatif aerob ve anaerob bakterilere etkilidir. Klinik kullanımda bulunan iki üyesi


4

imipenem ve meropenemdir. Streptomyces cattleya’dan (bir toprak mantarı) üretilen

tienamisin bu grubun ilk etken maddesidir (Öncül, 2002).

1.1.4. Tetrasiklinler

Tetrasiklinler, aminoglikozitler ve makrolitler gibi bazı antibiyotikler, yapısal

olarak memeli ribozomlarından farklı alt birimlerden oluşan bakteri ribozomlarını

hedef alan etki mekanizmalarına sahiptirler. Tetrasiklinler, bakterilerde ribozomların

30S alt birimine bağlanarak bakterilerde protein sentezini inhibe ederler. Bunlar

geniş spektrumlu antibiyotikler olup bakteriyostatik etki gösterirler (Strohl ve ark.,

2006).

1.1.5. Aminoglikozitler

Aminoglikozitler, bakterilerde protein sentezini engellerler. Duyarlı

bakterilerde oksijene bağımlı bir sistemle hücre içine alınırlar. Tüm aminoglikozitler

bakterisid etkilidir. Sadece aerob bakterilere etkilidirler (Strohl ve ark., 2006).

1.2. Antibiyotiklere Karşı Direnç Gelişimi

Antibiyotik direnci; bir mikroorganizma türünün bazı suşlarının

antibiyotikten etkilenmemesi ya da antibiyotiğe duyarlı bir suşun çeşitli direnç

mekanizmalarından biri ile dirençli hale dönmesi olarak tanımlanır (Demirtürk ve

Demirdal, 2004).

Antimikrobik kemoterapötik maddeler günümüzde etki mekanizmalarına göre

5 gruba ayrılır;

1. Hücre duvarı sentezini inhibe edenler

2. Sitoplazmik membranın yapı ve fonksiyonunu inhibe edenler

3. Protein sentezini inhibe edenler

4. Kimyasal yapılarındaki benzerlik dolayısı ile bakteri metabolizmasını

bozanlar


5

5. Nükleik asit sentezini inhibe edenler (Baştürk, 2005).

Kazanılmış antibiyotik direnci, ya mikroorganizma kromozomunda oluşan

mutasyonlarla ya da dirençli bir mikroorganizmanın direnç genini duyarlı

mikroorganizmalara aktarması ile ortaya çıkar. Enterobacteriaceae üyelerinde

görülen direncin en önemli kaynağı (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Enterobacter spp.) beta-laktamaz enzimlerdir. Beta-laktamazlar en çok gram-negatif

bakteriler tarafından sentezlenen, dizi analizleri benzediği için penisilin bağlayıcı

proteinlerden türediğine inanılan ve beta-laktam halkası taşıyan antibiyotiklere karşı

dirence neden olan enzimlerdir. Bazı mikroorganizmalar beta-laktamazları doğal

kromozomal bir enzim olarak salgılarken bazıları bakteriler arasında aktarılabilen

plazmidler aracılığı ile salgılanmaktadır (Demirtürk ve Demirdal, 2004).

Direnç sorununu aşacak antibiyotiklerin geliştirilmesinin direnç gelişimine

göre daha yavaş olması ve önemli miktarda ekonomik kaynak gerektirmesi konunun

önemini ortaya koymaktadır. Ayrıca, bugün için Enterococcus, Staphylococcus gibi

bazı bakterilerin neden olduğu infeksiyonların varolan antibiyotiklerin hiçbiri ile

tedavi edilememesi potansiyel bir tehlikedir (Tanır ve Göl, 1999).

Beta-laktam antibiyotiklerini hidrolize eden ve inaktif hale getiren beta-

laktamaz üretimi, başta Enterobacteriaceae üyeleri olmak üzere birçok bakteri

türünün en önemli direnç mekanizmalarından birisidir. Sayıları 350’ye ulaşan beta-

laktamazlardan yaklaşık 150 tanesi geniş spektrumlu beta-laktamazlar olup

plazmidik özellikleri nedeniyle bakteriler arasında aktarılabilirler (Akçam ve ark.,

2004). Tatlı su sistemleri, zayıf karakterli ve antibiyotik dirençliliğe katkısı az olarak

bilinen bakteri populasyonlarını içerir. Bunun yanında birçok tatlı su sisteminde fekal

bakteriler önemli bir sayısal varlığa sahip değildir. Çevresel dirençlilik havuzu hangi

mükemmeliyet derecesi ile ölçülürse ölçülsün fekal orjinli bakteriler dışında kalanlar

da hesaba katılmalıdır (Jones, 1986).

1.3. Bakteriyel Ekstra Kromozomal Genetik Elemanlar

Yapılan yoğun çalışmalar, 1940’lı yılların ortalarından itibaren bakterilerin de

yüksek organizmalar gibi genetik materyale sahip olduğunu ve bakterilerin gen


6

transfer mekanizmalarını ortaya koymuştur. Bakteriler aseksüel olarak ürer ve

ortadan ikiye bölünme sırasında belirli karakterler nesilden nesile geçer. Bu

özellikler kromozom üzerindeki genler aracılığıyla aktarılır (Akan, 1992).

Kromozom dışında, bakterilerin içinde bulunan, DNA yapısında içinde

bulunduğu hücreye bazı önemli özellikler kazandıran ve bu özellikleri genetik

kontrol altında tutan elementlere plazmid denilmektedir. Plazmidler çift iplikli DNA

molekülünden yapılmış, sitoplazma içinde dairesel yapıda bir uçları ile bakteri

sitoplazmasının bir noktasına bağlanmış şekilde, bakteri kromozomundan ayrı olarak

replike olabilen bakteri kromozomundan daha küçük genetik elementlerdir

(Bilgehan, 2002).

Plazmidler antimikrobiklere ve ağır metallere direnç genleri yanında değişik

virulans faktörlerini de taşıyabilirler. R-plazmidi denen direnç plazmidleri bir veya

daha çok sayıda antibiyotiğe karşı direnç genlerini taşımaktadır. Direnç plazmidleri

diğer duyarlı bakterilere transdüksiyon, transformasyon ve konjugasyon olaylarıyla

geçerek direnç gen paketini aktarır ve böylece direncin yayılmasına neden olur (Gür,

1994).

Plazmid büyüklüklerinin 1-2 milyon dalton arasında değişebildiği

belirtilmektedir (Olgun ve Topal, 1999). Plazmidlerin hepsi kendini replike edebilme

yeteneğinde olup, üzerinde 1-2 veya daha fazla gen taşıyabilirler. Plazmidlerin

bazıları bakteriden bakteriye kendinin transferini sağlayacak transfer genleri taşırlar.

Bu tip plazmidlere konjugatif plazmidler denilmektedir. Bu tür genleri

bulundurmayan plazmidlere ise konjugatif olmayan plazmidler denilmektedir.

Plazmidler kromozom dışında sitoplazmada serbest halde bulunabileceği gibi bakteri

kromozomuyla bütünleşmiş halde epizomik olarak da bulunabilir. F plazmidleri

özelikle konjugasyon olaylarında bulundukları hücreye erkeklik ve dişilik özelliği

kazandırır. F plazmidi bulunan bakterilere verici (erkek), F plazmidi bulunmayan

bakterilere alıcı (dişi) bakteriler denilmektedir. Plazmidler taşıdıkları dirençlilik

genlerini bir bakteriden başka bir bakteriye plazmidlerin aktarılması yolu ile

taşımaktadırlar (Akman, 1983; Bilgehan, 2002).

Plazmidlerin bir genom olmaları bulundukları bakterilerde bazı genetik

olayların kontrolünü yapma özelliği vermektedir. Bazı plazmidlerin hücredeki


7

fonksiyonları bilinmeyebilir bu tür plazmidlere gizli plazmidler (Cryptic plazmid)

denilmektedir. Plazmidler bir bakteride kendiliğinden oluşabildiği gibi bir başka

bakteriden aktarılma yolu ile meydana gelebilirler. Bir plazmid hücrede

kendiliğinden kaybolabileceği gibi kimyasal ve fiziksel yollarla da yok olabilirler

(Bilgehan, 2002).

Bilinen başlıca plazmidler şunlardır:

1. F faktörleri (Fertilite=Cinsel=Seks faktörleri)

2. F’ faktörleri

3. Col plazmidleri (Kolisinojenik faktörleri)

4. R plazmidleri-RTF faktörleri

5. Stafilokok plazmidleri

6. Virülans plazmidleri

1.3.1. F Faktörleri

Kromozom dışında bağımsız olarak bulunabildiği gibi kromozomla

bütünleşmiş olarak da (epizomik durum) bulunabilmesi, bakteride cinsel olarak

verici (erkek) hücre olma özelliğini kontrol altında tutması ve bakteriden bakteriye

aktarılması gibi özellikleri vardır.

1.3.2. F’ Faktörleri

Kendi genleri ile bakteriye ait genleri taşıyan F faktörleridir. Bu durum hfr

bakterilerde F faktörü epizomik durumdan bağımsız duruma geçerken beraberinde

bakteri DNA’sından bazı genleri de kendine yapışmış olarak alabildiği durumlarda

gözlenir. F faktörünü taşıyan bakteriye F-prime ya da F’ hücresi denir.

1.3.3. Col Plazmidleri (Kolisinojenik Faktörleri)

Koli basillerinin bazı kökenlerinde yine başka koli basillerini eriten maddeleri

(kolisin) oluşturma özellikleri hücrelerin içinde bulunabilen DNA yapısında ve tipik


8

plazmid niteliği gösteren elementler tarafından sağlanır. Bu elementlere col

plazmidleri adı verilir.

1.3.4. R Plazmidleri-RTF Faktörleri

Bakterilerde antibiyotiklere ve kemoterapötik ilaçlara karşı ekstra

kromozomal dirençliliğin bakteriden bakteriye aktarılmasını yöneten kromozom dışı

elementlerin bulunduğu belirlenmiştir. Bu faktörlere kısaca RTF (rezistans transfer

faktörü) adı verilir. Bakteri hücresi içinde çembersel ya da düz olarak bulunurlar

(Bilgehan, 1994). Bakteri kromozomu ile de integre olabilirler (Arda, 1995). RTF

faktörü bulunduran bakterilerden bu faktörü olmayanlara kemoterapötiklere karşı

direnç genlerinin aktarılması, bu faktörlerin kontrolü altında yapılır (Bilgehan, 1994).

R faktörleri iki bölümden oluşurlar. Biri konjugasyonu ve aktarılmayı

yöneten transfer faktörü (TF) ve diğeri de çeşitli ilaçlara karşı dirençliliği tayin eden

rezistanslık faktörü (RF) veya R determinanttır. Bu faktörler birbirinden bağımsız

olarak aktarılabilirler. Eğer RF transfer edilirse alıcı hücre ilaçlara karşı dirençli hale

gelir. Ancak, RF’nin, TF olmadan tek başına aktarılması olanaksızdır. Bu nedenle

RF’nin aktarılması diğer mekanizmalar tarafından yönetilir.

R faktörünün bir kısmı, zamanla, spontan olarak veya antibiyotik baskısının

kalkması sonu, konakçı bakteriden ayrılabilir. Spontan kaybolmalarda R faktörünün,

kromozomla aynı anda bölünerek kardeş hücrelere aktarılması da rol oynar.

Mutasyonlar sonu da, antibiyotiklere karşı dirençlilik oluşabilmektedir.

Ancak, bu tarz rezistanslık, ekstrakromozomal değil, kromozomaldir. Bazı

durumlarda, yabancı DNA segmentleri hücrelere girer ve kromozomla da birleşebilir

ve mutasyonlara yol açabilir (Arda, 1995).

1.3.5. Staphylococcus Plazmidleri

İçerdikleri plazmidler yönünden Staphylococcus bazı değişik durumlar

göstermektedirler. Genellikle bu plazmidler tek genli plazmidler olup, sık sık bakteri

kromozomu ile bütünleşebilme ve yine ayrılma özelliği gösterebilirler. Bu plazmidler


9

bakteriyofajlar aracılığı ile transdüksiyon yoluyla bir bakteriden diğerine aktarılırlar.

Bilinen Staphylococcus plazmidlerinin başlıcaları penisilinaz plazmidleri, tetrasiklin

plazmidleri, kloramfenikol plazmidleri, neomisin, kanamisin plazmidleridir

(Bilgehan, 1994).

1.3.6. Virülans Plazmidleri

Bakterilerin sahip oldukları virülans faktörlerin bir kısmı kromozomlarında

kodlanmasına karşın bazıları da plazmid orjinlidir (Arda,1995). Virülans plazmidleri

bakterilerin virülansını etkilerler (Bilgehan, 1994).

1.4. Mikroorganizmalar Arası Genetik Madde Aktarımı

Mikroorganizmalar arasında gerek in vitro ve gerekse in vivo koşullarda gen

veya genetik madde aktarımı meydana gelmektedir. Mikroorganizmalar arasında

genetik madde aktarımı beş farklı tipte meydana gelmektedir. Bunlar;

1- Transformasyon

2- Konjugasyon

3- Transdüksiyon

4- Elektroporasyon

5- Protoplast füzyon

Bu gen transfer mekanizmalarının bazı ortak özellikleri bulunmaktadır (Akan,

1992).

1. Genellikle verici hücre diye adlandırılan ana hücrenin kromozom

parçalarının alıcı hücre diye adlandırılan yavru hücreye transfer edilmesi,

2. Alıcı hücrenin kromozomunun homolog bölgelerinin verici

kromozomunun parçaları ile çiftleşmesini üstlenmesi,

3. Çiftleşme sonunda vericinin genetik materyalinin genellikle haploid

rekombinantlar oluşturmak için alıcı kromozomunda alleik materyalin yerine

geçmesi (buna replacement integration denir),


10

4. Bazı özel durumlarda plazmid veya bakteriyofaj gibi genetik elementlerin

genetik materyalin tümüne sahip karma bir molekül oluşturmak için bakteri

kromozomu ile rekombine olabilmesi (bu tip rekombinasyon ise additive

recombination diye adlandırılır) dir (Akan, 1992).

1.4.1. Transformasyon

Verici bir hücre tarafından ortama salınan erimiş haldeki çıplak DNA’nın

alıcı bir hücre tarafından alınması sonucu meydana gelen gen transferine

transformasyon adı verilir. Streptococcus pneumonia,Bacillus subtilis, Neisseria spp

ve Haemophilus influenza gibi bazı bakteriler diğer bakterilerin erimesi ile çevreye

yayılan solubl DNA’yı kolaylıkla alırlar. E. coli ve Pseudomonas aeruginosa gibi

bazı bakteriler ise yüksek konsantrasyondaki kalsiyum ve magnezyum gibi divalent

katyonlarda tutulduklarında yabancı DNA’yı alabilirler (Akan, 1992).

1.4.2. Konjugasyon

Bir bakteriye ait genetik maddenin (DNA), aynı cins içinde bulunan veya

aynı türden diğer mikroorganizmaya direk temas veya seks pilusları aracılığı ile

transfer edilmesine konjugasyon denir. Konjugasyon olayı bazı transfer genler

tarafından gerçekleştirilmektir. Bu konuda bilinen en iyi örnek E. coli’deki F-

faktörünü (fertilite faktörü) kodlayan seks pilusu gen transferinde bir köprü

görevindedir (Ippen-Ihler ve Minkley, 1986).

Konjugasyon plazmidle ilişkili olarak 10-8’de 1’e kadar olan bir sıklıkla

değişebilmektedir. Ayrıca herhangi bir plazmidin transfer sıklığı çevresel faktörlerle

de ilişkilidir (Singleton ve Anson, 1985).

Konjugasyon ile genlerin aktarımının doğal ortamlarda, karasal ortamlarda ve

sucul ortamlarda gerçekleştiği bilinmektedir (Dinçer, 1994).


11

1.4.3. Transdüksiyon

Bir bakteriyofaj aracılığı ile bir bakteriden diğerine genetik materyal

aktarılması olayına transdüksiyon denir (Bilgehan, 1994).

Gram-negatif ( Salmonella sp., E. coli, Shigella sp., Proteus sp. vs) ve gram-

pozitif mikroorganizmalarda (Staphylococcus sp., basiller, vs) bu tarz gen transferine

rastlanmaktadır. Bakterilerde transdüksiyon doğal ortamlarda, karasal ortamlarda ve

sucul ortamlarda gerçekleşebilmektedir (Arda, 1995).

1.5. Agaroz Jel Elektroforezi

DNA molekülünün analizlerinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla beraber

bunların arasında en yaygın ve sık kullanılanı, agaroz jel elektroforezidir. DNA’nın

elektroforetik analizinin temeli, DNA molekülünün elektriksel alanda jel içerisinde

hareketine dayanmaktadır. Jel elektroforezinde ayırıcı ortam agar veya agaroz

olabilir. Bazı durumlarda agaroz-poliakrilamid karışık jel sistemleri kullanılsa da en

yaygın kullanılan agaroz jel sistemidir.

Agaroz kırmızı bir alg türü olan Agar agar’dan elde edilen lineer bir

polisakkarittir. Sıcak suda çözünerek jel haline geçer. Polimerleşmede polisakkaritler

arasında hidrojen bağlarının kurulmasıyla jel yapısı meydana gelir. Ticari olarak

üretilen agarozların saflık dereceleri farklı olmaktadır. Kullanılan agarozun saflık

derecesine göre DNA molekülünün jeldeki göç hızı etkilenmektedir. Kimyasal yapısı

değiştirilerek düşük sıcaklıklarda eriyebilen agaroz tipleri de elde edilmiştir. Bu tip

agarozların ayırım özellikleri oldukça fazladır ve DNA jelden geri kazanılacaksa bu

tip agaroz kullanımı uygundur. Agaroz konsantrasyonu %0.5-1.5 değiştirilerek jelin

por çapı ayarlanabilir. Bu sayede küçük DNA fargmentleri için yüksek, büyük DNA

fragmentleri için düşük agaroz konsantrasyonu kullanılarak DNA molekülünün daha

rahat yürümesi sağlanabilir. Bir DNA molekülünün agaroz jelde görünür hale

gelmesi için ethidium bromürün DNA bağları arasına bağlanarak 300 veya 360

nm’deki UV ışığını absorblaması sonucu floresan etki göstermesi ile olur. Bu etki


12

DNA konsantrasyonuna bağlı olarak az veya kuvvetli olabilir (Olgun ve Topal,

1999).

1.6. Çalışmanın Amaçları

Günümüzde çevre kirliliği giderek artmakta ve çözülmesi gerekli olan bir

problem halini almaktadır. Çevre kirliliğinde önemli bir boyutu daha çok endüstriyel

faaliyetler alsa da ilaçların çevreye verdiği zararlar ve bunun sonucunda oraya çıkan

çevre kirliliği de önemli bir sorunu ortaya çıkarmaktadır. İlaç kullanımında en

önemli grubu antibiyotikler oluşturmaktadır. Bakteriyel infeksiyonların tedavisinde

kullanılan antibiyotiklerin bilinçli ve bilinçsiz olarak çevreye verilmesi ve

bakterilerde bu antibiyotiklere karşı çeşitli direnç mekanizmalarının gelişmesine

neden olmaktadır.

Bu çalışmada;

Seyhan baraj gölünden izole edilen, Enterobacteriaceae grubu bakterilerin

antibiyotiklere karşı dirençlilik profillerinin belirlenmesi ve bu bakterilerde

antibiyotik dirençliliklerinin kromozomal veya plazmid kökenli olup olmadıklarının

belirlenmesi amaçlanmıştır.

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yasemin KAYA

13

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

Grabow ve arkadaşları (1975), R-faktörlerinin epidemiyolojisi, antibiyotik

dirençliliğinin tipleri ve R-faktörlerinin orijinleri ile su kalitesi arasındaki ilişkiyi

detaylı olarak araştırıp, yüzey ve kanalizasyon sularının enterik rezervuarı şeklinde

davrandıklarını ve suların kanalizasyon suları ile kontamine olması neticesinde R-

faktörlerinin geniş çaplı alanlara yayıldıklarını bildirmişlerdir.

Cooke (1976), kanalizasyon suları ile kontamine olmuş deniz suyundan izole

ettikleri koliform bakterilerde yüksek frekansta çoklu antibiyotik dirençliliğinin

geliştiğini tespit etmişleridir.

Stewart ve Koditsihek (1980), deniz suyundan izole ettikleri bakterilerle

Escherichia coli’nin laboratuar suşları arasında, antibiyotik direçliliğinin transfer

edilebildiğini ortaya koymuşlardır.

Bell ve arkadaşları (1980), Red Nehri’nden izole ettikleri fekal koliformların

12 antibiyotiğe karşı, Salmonella izolatlarının ise %18’nin bir veya daha fazla

antibiyotiğe karşı dirençli olduklarını saptamışlardır.

Casawell ve Philips (1981), Klebsiella pneumoniae suşlarının transfer

edilebilir antibiyotik dirençliliğinin önemli bir kaynağını oluşturduklarını, 1970’li

yıllarda çok antibiyotiğe dirençli Klebsiella pneumoniae suşlarının salgın halinde

çeşitli hastane infeksiyonlarına sebep olduklarını gentamisin ve sefalotin

dirençliliğinin plazmidler aracılığı ile edilebildiğini bildirmişlerdir.

Knothe ve ark., (1983), sefalosporin dirençliliğinin plazmid kökenli olduğunu

ve Klebsiella pneumoniae suşlarından izole edilen plazmidin, sefotaksim, sefuroksim

diğer sefalosporinler, penisilinler ve gentamisin dirençliliğini hassas suşlara

aktarabildiğini bildirmişlerdir. sefotaksim ve diğer son kuşak beta-laktam antibiyotik

dirençliliklerinin Escherichia coli bakterisine çok kolay aktarabildiğini

belirtmişlerdir.

Kryalikovya ve arkadaşları (1984), Yugoslavya’da atık suların deşarj edildiği

bir nehirden izole ettikleri Enterobactericeae üyelerinin gentamisine dirençli suşlar

olduğunu tespit etmişlerdir.


14

Finch ve Smith (1987), bazı antibiyotiklere karşı simultan dirençlilik

gelişiminin, plazmidler tarafından meydana getirildiğini bildirmişlerdir.

Büscher ve arkadaşları (1987), kliniksel Enterobacter cloacae izolatlarının

çeşitli beta-laktam grubu antibiyotiklere karşı direnç geliştirdiklerini ve beta-

laktamaz ürettiklerini tespit etmişlerdir.

Rinker ve arkadaşları (1988), ABD’de Monacacy nehrinden aldıkları

numunelerden izole ettikleri 24 adet örneğin 22’sinde beş veya daha fazla

antibiyotiğe dirençli gram-negatif bakteri tespit etmişlerdir.

Çetin ve arkadaşları (1999), hastane infeksiyonu etkeni olarak izole edilen

Enterobacteriaceae ailesinden 117 gram-negatif bakteri suşunun 38’inde (%32.5)

GSBL saptanmıştır. 51 Klebsiella pneumoniae suşunun 24’ünde (%47), Escherichia

coli suşunun altısında (%15.8), 9 Enterobacter aerogenes suşunun dördünde, 7

Enterobacter cloacea suşunun birinde, bir Citrobacter freundii ve bir Enterobacter

sakazakii suşunda GSBL oluşumunu gözlemişlerdir. Çalışma sonucunda denenen

suşlara en etkili antibiyotikleri karbapenem grubunun oluşturduğunu ve bunları

kinolon ve aminoglikozidlerin izlediğini saptamışlardır.

Mathew ve arkadaşları (1999), domuzlardan izole edilen Escherichia coli’nin

farklı yaşlarda ki domuzlar arasında antibiyotik kullanım derecesine bağlı olarak

Echerichia coli’nin gösterdiği antibiyotik dirençliliğini farklı düzeylerde

belirlemişlerdir.

Go-Ni-Urriza ve arkadaşları (2000), İspanya’da evsel ve endüstriyel atık

suların deşarj edildiği Arga nehrinden izole ettikleri Enterobacteriaceae sp.

suşlarının %72’sinin, Aeromonas sp. suşlarının ise %20’sinin nalidiksik asite karşı

dirençli olduğunu tespit etmişleridir. Enterobacteriaceae sp izolatlarının tetracycline

%24.3, beta-laktamlara %20.5 dirençli oldukların, Aeromonas sp izolatlarının ise

tetrasikline %27.5, co-trimoksazole %26.6 dirençli bulmuşlardır.

Cesur ve arkadaşları (2001), yaptıkları çalışmada yatan hastalara ait idrar

örneklerinden izole edilen Escherichia coli, Klebsiella türleri ve Pseudomonas

aeruginosa suşlarının antibiyotiklere duyarlılıklarını izlemişler ve suşlarda ampisilin

ve trimetoprim/ sulfametoksazole direnç oranını yüksek bulmuşlardır.


15

Karbapenemler, kinolonlar ile 3. ve 4. kuşak sefalosporinlerin suşlara en etkili

antibiyotikler olduklarını bulmuşlardır.

Otkun ve arkadaşları (2001), Salmonella typhimurium’un klinik

infeksiyonlardan izole edilen 75 suşun dirençlilik mekanizmasını araştırmışlar,

üretilen 22 suşun 20 tanesinin aminoglikozitlere, 12 suşun ise

trimethoprimsulfamethoksazol’e karşı dirençlilik gösterdiğini belirlemişlerdir.

Thimm ve arkadaşları (2001), atık sular ile sulanmış arazilerde bazı

antibiyotiklere karşı dirençli olan Escherichia coli’lere yüksek miktarda

rastlamışlardır.

Çiftçi ve arkadaşları (2003), yanık ünitesinde yatan hastaların yara ve kan

kültürlerinde üreyen mikroorganizmalar ve bunların çeşitli antibiyotiklere

duyarlılıklarını belirlemişlerdir. Hastaların toplam 108 kültüründen en sık izole

edilen mikroorganizmalar, sıklık sırasıyla, Pseudomonas aeruginosa (50/%46.2),

Acinetobacter spp. (24/%22.2) ve metisiline dirençli Stapylococcus aureus (9/%8)

olarak tespit etmişlerdir. İzole edilen bakterilerde yüksek oranda ve çoklu antibiyotik

direncini saptamışlardır.

Aslım ve arkadaşları (2004), Türkiye’deki farklı köy ve kasabalardan

toplanan yoğurt örneklerinden 34 suş Streptococcus thermophilus olarak teşhis

etmişlerdir. 34 S. thermophilus suşunun antibiyotik dirençlilikleri ve plazmid

içeriklerini incelemişlerdir. Bir çok suş gentamisin (%79) ve penisilin G’ye (%64)

dirençlilik gösterdiğini belirlemişler, suşların %88 oranında tetrasikline, %94

oranında da kloramfenikole duyarlılık gösterdiğini tespit etmişlerdir. Plazmid DNA

analizlerinde ise 7 suşun plazmid DNA içermediğini, plazmid DNA’sı içeren

suşlarda ise sayısının 1 ve 5 arasında, moleküler ağırlıklarının ise 1,88-19,89 kb

arasında olduğunu tespit etmişlerdir. Bir veya hiç plazmide sahip olmayan suşların

birçok antibiyotiğe duyarlı olduğunu belirlemişlerdir. Beş plazmid DNA’ya sahip 3

suşun da bir çok antibiyotiğe dirençli olduğunu belirlemişlerdir.

Karayakar ve arkadaşları (2004), Mersin kıyı şeridinden aldıkları su

örneklerinden izole edilen Escherichia coli bakterilerinin, III. Kuşak

antibiyotiklerden Sefazol (CF), Seftriakson (CRO) ve Sefizoks (ZOX)'a karşı doğal

dirençlilik frekansları saptamışlardır. Doğal ve plazmide bağlı dirençlilik, en fazla


16

Sefazol (CF) antibiyotiğine karşı gelişirken bunu sırasıyla Sefizoks (ZOX) ve

Seftriakson (CRO)'a karşı dirençliliğin izlediğini ortaya koymuşlardır.

Yılmaz ve arkadaşları (2005), idrar yolu infeksiyonu etkenlerini ve bunların

antibiyotiklere duyarlılıklarını saptamışlardır. İdrar örneklerinden sık izole edilen

etkenler sırasıyla, Escherichia coli (%51.5), Klebsiella pneumoniae (%11) ve

Enterococcus faecalis (%6.2) olarak bulmuşlardır. Poliklinik hastalarından izole

edilen E. coli’nin antibiyotik duyarlılığı seftriaksona %92.6, gentamisine %90.2,

siprofloksasine %82.5, kotrimoksazole %47.4 olarak bulmuşlardır. Yatan hastalarda

en etkili antibiyotikler E. coli için meropenem %98.9, imipenem %96.4, sefepim

%95.7, amikasin %94.6, seftriakson %87, Klebsiella pneumoniae için meropenem

%97.8, imipenem %96, amikasin %80.7, Acinetobacter baumannii için meropenem

%85.8 ve imipenem %81 olarak bulmuşlardır.

Erkan ve Vural (2006), Dicle Nehri’nin hijyenik kalitesi üzerine yapmış

oldukları çalışmada su numunelerini toplam mezofilik aerob bakteri,

Enterobactericeae, koliform, Escherichia coli, Staphylococcus-Micrococcus,

Staphylococcus aureus, küf-maya, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae,

Yersinia enterocolitica ve anaerob bakteri sayısı yönünden incelemişler ve

örneklerdeki koliform ve E.coli kontaminasyonunu sırasıyla, %100 ve %90 olarak

bulmuşlardır.

3. MATERYAL ve METOD Yasemin KAYA

17

3. MATERYAL ve METOD

3.1. Materyal

3.1.1. Bakteri Suşları

Balcı (2007) tarafından Seyhan Baraj Gölü’nden 02.11.2005,

29.12.2005,22.03.2006 ve 20.06.2006 tarihlerinde, arazi üzerinde belirlenen 7 farklı

istasyondan alınan su örnekleri laboratuara getirilip, bakteri izolasyon yöntemleri

uygulanarak saf kültür halinde elde edilen, identifikasyonları ve antibiyogramları

yapılan bakteri suşları çalışmamızda kullanılmıştır.

3.1.2. Kullanılan Besiyerleri

3.1.2.1. LB (Luria-Bertoni) Buyyon (pH:7.5)

LB buyyon izole edilen bakterilerin zenginleştirilmesi için kullanılmıştır

(Manniatis ve ark., 1982).

Bileşimi g/L

Tripton 10

Maya 5

NaCl 10

3.1.2.2. Plate Count Agar (PCA)

PCA agar elde edilen bakteri suşlarının stok kültürünü yapmak için

kullanılmıştır (Halkman, 1995).


18

Bileşimi g/L

Pepton 5 g

Yeast extract 2,5 g

D(+) Glukoz 1 g

Agar 12 g

3.1.3. Kullanılan Çözeltiler

3.1.3.1. Plazmid izolasyon Kiti

Çalışmamızda kullandığımız bakteri suşlarının plazmidlerinin izolasyonunda

hazır plazmid izolasyon kiti kullanılmıştır (Roche applied science high pure plazmid

isolation kit. Cat no: 11 754 777 001).

Çalışmalarda kullanılan plazmid izolasyon test kiti içeriği aşağıdaki gibidir.

Süspansiyon Çözeltisi (25 mL): 50 mM Tris-HCl ve 10 mM EDTA, pH 8.0

(25°C)

RNase A (2,5 mg): Süspansiyon çözeltisi içerisinde çözdürülmüştür.

Lizis Çözeltisi (25 mL): 0.2 M NaOH ve %1 SDS

Binding Buffer (25 mL): 4 M guanidin hidroklorit ve 0.5 M potasyum

asetat, pH 4.2

Yıkama Çözeltisi I: 5 M guanidin hidroklorit, 20 mM Tris-HCl, pH 6.6

(25°C). 33 mL. Yıkama çözeltisi I’i kullanmadan önce içerisine 20 mL susuz etil

alkol eklenmiştir.


19

Yıkama Çözeltisi II: 20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5 (25°C). 10 mL.

Yıkama çözeltisi II’i kullanmadan önce çözelti içerisine 40 mL susuz etil alkol

eklenerek hazırlanmıştır.

Elusyon Çözeltisi (40 mL): 10 mM Tris-HCl, pH 8.5 (25°C)

Filtrasyon Tüpü: 700 µL hacimli 50 tüp

Toplama Tüpü: 2 mL’lik 50 polipropilen tüp

3.1.3.2. 10 X TBE (Tris-Borik asit-EDTA) Solüsyonu

Tris 21.6 g

Borik Asit 11 g

EDTA 1.86 g

Tartılarak son hacim 200 mL olacak şekilde saf suda çözülür ve pH 8,3’e

ayarlanır (Manniatis ve ark., 1982).

3.1.3.3. Agaroz jel (%1) 70 mL

Agaroz 0,7 g

10x TBE Solüsyonu 7 mL

Distile su 63 mL

Agaroz, homojen bir karışım oluşuncaya kadar ısıtılarak eritilir (Manniatis ve

ark., 1982).


20

3.1.3.4. Örnek Yükleme Tamponu

Brom fenol mavisi % 0.25

Gliserol % 10

100 mL saf suda çözülerek elde edilir (Manniatis ve ark., 1982).

3.1.3.5. Yürütme Tamponu 1x

10x TBE tamponunun 10 kat sulandırılmasıyla elde edilir (Manniatis ve ark.,

1982).

3.1.3.6. Stok Boyama Solüsyonu

Ethidium bromür 1 g

Distile su 100 mL

Boya tamamen çözündükten sonra koyu renkli şişede +4 C’de saklanır

(Manniatis ve ark., 1982).

3.1.3.7. Boyayı Geri Alma Solüsyonu

MgSO4 0.04 g

Distile su 200 mL

200 ml distile su içerisinde MgSO4 çözülmüştür. Elde edilen çözelti 1 mM

MgSO4 çözeltisidir.


21

3.1. Metod

3.2.1. Örnek Toplama İstasyonlarının Özellikleri

Şekil 3.1. Örnek toplama istasyonları (Balcı, 2007)


22

Çizelge 3.1. Örnek Toplama İstasyonlarının Özellikleri (Balcı, 2007) İstasyonlar Özellikleri

Birinci istasyon Seyhan nehrinin ilk giriş noktasıdır.

İkinci istasyon Seyhan nehrinin baraj suyuyla karıştığı nokta olup yeni yapılmış henüz kullanımda olmayan yerleşim yerlerinin bulunduğu istasyondur.

Üçüncü istasyon Çakıt nehrinin baraja döküldüğü ilk noktadır.

Dördüncü istasyon Çakıt nehrinin yerleşim yerlerine olan başlangıç noktasıdır.

Beşinci istasyon Çakıt ile Seyhan nehrinin baraj suyuyla birleştiği yerdir.

Altıncı istasyon İki su kaynağının gölün suyuyla karıştığı bölge, Adnan Menderes yarımadasının orta bölgesidir

Yedinci istasyon Suyun drenaj noktasına gittiği bölge, Kayıkhanenin karşısıdır.

3.2.2. Çoklu Antibiyotik Direnci (MAR) İndeksi

Çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) indeksi test organizmalarının dirençli

olduğu antibiyotik sayısının toplam denenen antibiyotik sayısına oranı ile

hesaplanmaktadır. Çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) indeksi verilen

populasyonlarda bakteri direnç yayılımını göstermektedir. Hesaplanan MAR indeksi

sonucu eğer 0.2’den daha büyükse birkaç antibiyotiğin kullanıldığı ortam kökenli

bakteri suşlarının varlığını gösterir (Ehinmidu, 2003).

3.2.3. Bakterilerden Plazmid İzolasyonu

1. Plazmid izole edilecek mikroorganizmanın LB buyyon besiyerinde bir

gecelik taze kültürü hazırlanarak bu kültürden 0.1 mL alınıp 10 mL’lik LB buyyon

besiyerine inokulasyonu yapılmıştır. 4-6 saat 37°C’de üretildikten sonra, örneğin

tamamı 100 mL’lik LB buyyon besiyerine aktarılmış ve 2 saatlik inkübasyondan

sonra ortama son konsantrasyon 170 µg/mL olacak şekilde chloramphenicol ilave

edilerek bir gece üremeye bırakılmıştır.

2. Prosedüre başlamadan önce binding buffer buz üzerinde bekletilmiştir.


23

3. Başlama materyalleri hazırlanır:

Bakteri kültürünün 0.5-4 mL’si steril mikrosantrifüj tüplerine aktarılmış

6000xg’de santrifüj edilmiştir.

Bakteri hücreleri çökelti haline geldikten sonra üst faz atılmıştır.

Çökeltinin üzerine 250 µL RNase A eklenmiş olan süspansiyon çözeltisi

eklenmiştir.

Bakteriyal pelet resüspanse edilmiştir.

4. Resüspanse edilmiş bakteri çökeltisine aşağıdaki maddeler sırasıyla

uygulanmıştır.

Tüplere 250 µL lizis çözeltisi eklenip, 3-6 defa yavaşça alt üst ederek

karıştırılmıştır.

5 dakika +15- +25 °C’de inkübe edilmiştir. 5 dakikadan fazla inkübe edilmez.

5. Lize edilmiş solüsyona sırasıyla şu işlemler uygulanmıştır.

Tüplere 350 µL soğutulmuş binding buffer eklendikten sonra tüpler yavaşça

alt üst edilmiştir ve buz üzerinde 5 dakika bekletilmiştir.

Buz üzerinde bekletildikten sonra yaklaşık olarak 10 dakika 13000xg’de

santrifüj edilir.

6. Santrifüj edildikten sonra;

Bir filtrasyon tüpü bir toplama tüpü içerisine yerleştirilerek elde edilen bütün

süpernatant filtrasyon tüpü içerisine aktarılmıştır.

Bütün toplama tüplerinin içerisine yerleştirilmiş olan filtrasyon tüpleri

mikrosantrifüj içerisine yerleştirilip, 1 dakika 13000xg’de santrifüj edilmiştir.

7. Santrifüjden sonra;

Toplama tüpünden filtrasyon tüpü taşınıp, toplama tüpü içerisindeki akışkan

sıvı atılmıştır ve yeniden filtrasyon tüpü aynı toplama tüpü içerisine yerleştirilmiştir.

Eğer bakteri kültürü yüksek miktarda nükleaz içeriyorsa isteğe bağlı yıkama

adımı uygulanır, yoksa bir sonraki adıma geçilir.

İsteğe bağlı yıkama adımı:

Yüksek nükleaz aktivitesini preparasyondan elimine edilmiştir ve 500 µL

yıkama çözeltisi-I filtrasyon tüpüne eklenmiştir.

1 dakika 13000xg’de santrifüj edilir.


24

8. Hücreleri yıkama:

700 µL yıkama çözeltisi-II filtrasyon tüpüne eklenmiştir.

30-60 saniye 13000xg’de santrifüj edilmiş ve toplama tüpü içerisine toplanan

akışkan sıvı atılmıştır.

9. Akışkan sıvı atıldıktan sonra;

Bütün filtrasyon tüpleri içerisine hiçbir madde eklenmeden ek olarak 1 dakika

daha santrifüj edilmiştir.

Ekstra santrifüj zamanı yıkama solüsyonunun kalıntısının taşınmasını

sağlamak için yapılmıştır.

10. DNA’yı elüt etmek için;

Filtrasyon tüpleri 1,5 mL’lik steril mikrosantrifüj tüplerinin içerisine

yerleştirilerek, 100 µL elüsyon çözeltisi veya ddw (pH=8,0-8,5) filtrasyon tüplerinin

içerisine aktarılmıştır ve 1 dakika 13000xg’de santrifüj edilmiştir.

11. Mikrosantrifüj tüpü elde edilmiş plazmid DNA’sını içermektedir. +2-

+8°C’de veya daha sonra yapılacak analizler için (-15)- (-25) °C’de saklanmıştır.

3.2.4. Agaroz Jelin Hazırlanması ve Örneklerin Jele Uygulanması

1. % 1’lik jel hazırlamak için 0.7 g agaroz 7 mL 10x TBE tamponu ve 63 mL

saf suda çözüldükten sonra ısıtılarak eritilmiştir.

2. Çözelti yaklaşık 40°C’ye kadar soğutulup, 15x20x5 cm boyutlarındaki jel

kutusuna dökülmüştür ve üzerine jel tarağı yerleştirilmiştir.

3. Jel tamamen donduktan sonra tarak dikkatlice ayrılmıştır.

4. 20-25 µL’lik miktarlarda DNA örnekleri alınarak 5 µL yükleme

tamponuyla karıştırıldıktan sonra mikropipet ile örnek çukurlarına doldurulmuştur.

5. Separe edilen nükleik asitlerin moleküler ağırlıklarını belirlemek amacı ile

jeldeki çukurlardan birine 3 µL marker DNA (Sıgma Lambda DNA Hınd III Digest

Aqueous Solution) yüklenmiştir.

6. Jel agaroz aparatına yerleştirilmiştir.

7. Aparata jelin üzerini kaplayacak kadar yürütme tamponu konulmuştur. 10

V/ cm2 voltaj uygulanarak 4 saat yürütme işlemi gerçekleştirilmiştir. Separasyon


25

zamanını sonlandırmak için, yükleme tamponunda bulunan brom fenol mavisinin

jelde katettiği mesafe bize yol gösterir.

3.2.5. DNA’nın Ethidium Bromid ile Boyanması

1. Elektroforez işlemi tamamlanınca jel elektroforez aparatından alınıp

boyama kabına konulmuştur ve jel üzerine 0.5 µg/mL konsantrasyonda ethidium

bromid boyama solüsyonu konarak 45 dk. boyanmıştır.

2. Boyanın fazlası jeli 1 mM MgSO4 solüsyonu ile 15 dk. muamele etmek

suretiyle geri alınmıştır.

3. Jel daha sonra U.V. transillüminatör üzerine konarak fotoğrafları

çekilmiştir (Manniatis ve ark., 1982).

4. BULGULAR ve TARTIŞMA Yasemin KAYA

26

4. BULGULAR ve TARTIŞMA

4.1. Bakterilerin Antibiyotik Dirençlilik Profillerinin Çıkarılması

Çizelge 4.1. Bakterilerin gösterdikleri dirençlilik dağılımları (Balcı, 2007)

BAKTERİ NO

BAKTERİ ADI

ANTİBİYOTİKLER

CRO 30

µg/mL

GEN 30

µg/mL

CZ 30

µg/mL

CEF 30

µg/mL

AMP 25

µg/mL

STR 10

µg/mL

IPM 10

µg/mL 1 E.coli H H H H R H H 2 E.coli R H H H H H H 3 T.E H R H H H H H 4 T.E H H H H H R H 5 E.coli H H H R H H H 6 En.clo H H H H H H R 7 Citro. H H R H H H H 8 Kleb. R H H H H R H 9 En.clo H H H H H R R

10 E.coli H H H H R R H 11 E.coli R H H H H H R 12 E.coli H R R H H H H 13 E.coli H H H R H R H 14 En.aer H H R H H R H 15 En.clo H H R H R H H 16 T.E H H R H H H R 17 Citro. H H R R H H H 18 Citro. H H R R H H H 19 E.coli R H H H H R R 20 E.coli R H R H H H R 21 En.clo R H R R H H H 22 E.coli R H R R H H H 23 T.E H R R R H H H 24 T.E H H R R H R H 25 T.E H H R R H H R 26 T.E H H R H R H R


27

Çizelge 4.1.’in devamı

BAKTERİ NO

BAKTERİ ADI

ANTİBİYOTİKLER

CRO 30

µg/mL

GEN 30

µg/mL

CZ 30

µg/mL

CEF 30

µg/mL

AMP 25

µg/mL

STR 10

µg/mL

IPM 10

µg/mL 27 En.clo R H R H H R H 28 En.clo H H R H R R H 29 Kleb. H H R R H R H 30 Kleb. H H R R R H H 31 En.clo R H R H H R H 32 Citro. H H R R H H R 33 En.clo H H R R R H H 34 En.clo H H R H R H R 35 Citro. R H R H R R H 36 En.clo R H R H R R H 37 En.clo R H R R R H H 38 En.clo R H R R R H H 39 En.clo R H R R R H H 40 En.clo R H R R R H H 41 En.clo R H R R R H H 42 En.clo R H R R R H H 43 En.clo R H R R R H H 44 En.clo R H R R R H H 45 En.clo R H R R R H H 46 En.clo R H R R R H H 47 E.coli R R R R H H H 48 E.coli R R R R H H H 49 E.coli H R R R H R H 50 T.E R H R R H R H 51 E.coli R H R R H R H 52 T.E R H R R H R H 53 T.E R H R R H R H 54 T.E R H R R H R H 55 T.E R H R R H R H 56 T.E R H R R H R H


28

Çizelge 4.1.’in devamı

BAKTERİ NO

BAKTERİ ADI

ANTİBİYOTİKLER CRO

30 µg/mL

GEN 30

µg/mL

CZ 30

µg/mL

CEF 30

µg/mL

AMP 25

µg/mL

STR 10

µg/mL

IPM 10

µg/mL 57 En.clo R R R H R H H 58 E.coli R R R H R H H 59 En.clo R R R H R H H 60 En.clo R R R H R H H 61 Citro. H H R R R H R 62 En.clo R H R R R R H 63 E.coli R R R R R H H 64 E.coli R R R R R H H 65 En.clo R R R R R H H 66 En.clo R R R R R H H 67 T.E R H R R R R H 68 E.coli R H R H R R R 69 E.coli R H R R R R H 70 E.coli R H R R R R H 71 E.coli R H R R R R H 72 E.coli R H R R R R H 73 En.clo H H R H H H H 74 E.coli R R R R R R R 75 E.coli H H H R H H H 76 E.coli H R H H H H H 77 Citro. H H H H H R H 78 E.coli H H H H H H R 79 En.clo R R R R R H R 80 En.clo R R R R R H R 81 En.clo H H H H R H H 82 E.coli R H H H H H H 83 E.coli R H R R R R H 84 E.coli R H R R R R H 85 E.coli R H R R R R H 86 E.coli R H R R R R H 87 E.coli R H R R R R H 88 E.coli R H R R R R H

CRO: Ceftriaxon, GEN: Gentamisin, CZ: Cefazolin, CEF: Cefuroksim, AMP: Ampicilin, STR: Streptomisin, IPM: Imipenem. E.coli: Escherichia coli, En.clo: Enterobacter cloacae, En.aer: Enterobacter aerogeneses, Kleb.: Klebsiella, pneumoniae, Citro.:Citrobacter freundii, T.E: Tespit Edilemedi, R: Dirençli, H: Hassas


29

Çalışılan bakteri suşlarında 33 bakteri suşunun Escherichia coli (% 37.5), 30

bakteri suşunun Enterobacter cloacae (% 34.1), 3 bakteri suşunun Klebsiella (%

3.4), 7 bakteri suşunun Citrobacter freundii (% 7.95), 1 bakteri suşunun

Enterobacter aerogenesis (% 1.14) olduğu görülmüştür ve 14 bakteri suşunun (%

15.91) tanımlaması yapılamamıştır.

Bu bakterilerin dirençlilik analizi yapıldığında bakterilerin antibiyotiklere

karşı gösterdikleri dirençlilik düzeyleri şu şekilde gerçekleşmiştir.

CRO antibiyotiğine karşı toplam 55 bakteri suşunda (% 62.5), GEN

antibiyotiğine karşı toplam 18 bakteri suşunda (% 20.45), CZ antibiyotiğine karşı

toplam 70 bakteri suşunda (% 79.5), CEF antibiyotiğine karşı toplam 54 bakteri

suşunda (% 61.36), AMP antibiyotiğine karşı toplam 46 bakteri suşunda (% 52.27),

STR antibiyotiğine karşı toplam 37 bakteri suşunda (42.05), IPM antibiyotiğine karşı

toplam 16 bakteri suşunda (% 18.2) direnç gözlenmiştir.

Seyhan baraj gölünden izole edilen 88 bakterinin kullanılan 7 antibiyotiğe

karşı gösterdikleri direçlilikte bir bakterinin kullanılan tüm antibiyotiklere karşı

dirençli olduğu görülmüştür. Benzer şekilde yapılan çalışmalarda kanalizasyon suları

ile kontamine olmuş yüzey suyundan izole edilen fekal kökenli koliform bakterilerde

yüksek frekansta çoklu antibiyotik dirençliliğinin olduğu belirtilmektedir (Cooke,

1976). Bell ve arkadaşları (1980), Red nehrinden izole ettikleri fekal koliformların 12

antibiyotiğe karşı dirençli olduklarını belirtmektedirler.

Armstrong ve arkadaşları (1982), çeşitli içme suyu sistemlerindeki

bakterilerde çoklu antibiyotik dirençliliğinin önemli derecede arttığını

göstermişlerdir. Yaptığımız bu çalışmada farklı bölgelerden farklı zamanlarda izole

edilen benzer özelliklere sahip olan Enterobacteriaceae grubu bakterilerin

gösterdikleri antibiyotik dirençlilik düzeylerinin farklı olduğu görülmektedir.

Çalışmamızda 14 bakterinin tek bir antibiyotiğe karşı direnç gösterdiği bunun

yanında tek bir izolatın ise kullanılan tüm antibiyotiklere karşı dirençli olduğu

görülmektedir. Bu durum Armstrong ve arkadaşlarının (1982) belirttiği gibi zamanla

organizmaların multiple antibiyotik dirençliliğinin geliştiğini göstermektedir.

Karayakar ve arkadaşları (2004), Mersin kıyı şeridinden aldıkları su örneklerinden

izole edilen Escherichia coli bakterilerinin, III. Kuşak antibiyotiklerden Sefazol


30

(CF), Seftriakson (CRO) ve Sefizoks (ZOX)'a karşı doğal dirençlilik frekanslarını

saptamışlardır. Doğal ve plazmide bağlı dirençlilik, en fazla Sefazol (CF)

antibiyotiğine karşı gelişirken bunu sırasıyla Sefizoks (ZOX) ve Seftriakson (CRO)'a

karşı dirençliliğin izlediği ortaya koymuşlardır.

4.2. Çoklu Antibiyotik Dirençliliği (MAR) İndeksi

Çizelge 4.2. Bakterilerin MAR indeksi-1

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

1- E.co

li

2- E

.coli

3- T.E

.

4- T.E

.

5- E

.coli

6-En.cl

o

7- C

itro

8- K

leb.

9- En.c

lo

10- E.co

li

11- E.co

li

12- E

.coli

13- E

.coli

14- En.ae

r

15- En.c

lo

MA

R İN

DE

KS

İ

Yapılan hesaplamalara göre bu çizelgede, 7 bakteri suşunun MAR indeksi

0.142 olarak tespit edilmiş olup, bu bakteri suşları Escherichia coli, Enterobacter

cloacae, Citrobacter freundii olarak belirlenmiş ve 2 bakteri suşunun ise tespiti

yapılamamıştır. Diğer 8 bakteri suşunun MAR indeksi ise 0.285 olup bu bakteri

suşlarını ise Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Escherichia coli,

Enterobacter aerogeneses oluştumaktadır.

Buradaki bakteri suşlarından 1 numaralı Escherichia coli 7. istasyonun dip

bölgesinden, 2 numaralı Escherichia coli 5. istasyonun dip bölgesinden, 3 numaralı

T.E. 3. istasyonun dip bölgesinden, 4 numaralı T.E. 1. istasyonun dip bölgesinden, 5


31

numaralı Escherichia coli 1. istasyonun yüzey bölgesinden, 6 numaralı Enterobacter

cloacae 7. istasyonun dip bölgesinden, 7 numaralı Citrobacter freundii 1. istasyonun

yüzey bölgesinden, 8 numaralı Klebsiella pneumoniae 5. istasyonun dip bölgesinden,

9 numaralı Enterobacter cloacae 5. istasyonun yüzey bölgesinden, 10 numaralı

Escherichia coli 7. istasyonun dip bölgesinden, 11 numaralı Escherichia coli 5.

istasyonun dip bölgesinden, 12 numaralı Escherichia coli 7. istasyonun dip

bölgesinden, 13 numaralı Escherichia coli 6. istasyonun dip bölgesinden, 14

numaralı Enterobacter aerogeneses 4. istasyonun dip bölgesinden, 15 numaralı

Enterobacter cloacae 2. istasyonun yüzey bölgesinden izole edilmiştir.

Çizelge 4.3. İzole edilen bakterilerin MAR indeksi-2

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

16- T.E

.

17- C

itro

18- C

itro

19- E.co

li

20- E.co

li

21- E

n.clo

22-E

.coli

23- T

.E.

24- T

.E.

25- T.E

.

26- T

.E.

27- En.cl

o

28- En.c

lo

29- K

leb.

30- K

leb .

MA

R İN

DE

KS

İ

Bu çizelgede 3 bakteri suşunun MAR indeksi 0.285 olup, bu bakteri

suşlarının 2 tanesi Citrobacter freundii olup diğeri tespit edilememiştir. Diğer 12

suşun MAR indeksi 0.428 olup bu bakteri suşlarını Escherichia coli, Enterobacter

cloacae ve Klebsiella pneumoniae oluşturmaktadır. MAR indeksi 0.428 olarak

belirlenen suşlardan 4 tanesi ise tanımlanamamıştır.


32

Buradaki bakteri suşlarından 16 numaralı T.E. 2. istasyonun yüzey

bölgesinden, 17 numaralı Citrobacter freundii 1. istasyonun dip bölgesinden,18

numaralı Citrobacter freundii 1. istasyonun yüzey bölgesinden, 19 numaralı

Escherichia coli 5. istasyonun dip bölgesinden,20 numaralı Escherichia coli 4.

istasyonun yüzey bölgesinden, 21 numaralı Enterobacter cloacae 4. istasyonun dip

bölgesinden, 22 numaralı Escherichia coli 7. istasyonun yüzey bölgesinden, 23

numaralı T.E. 3. istasyonun yüzey bölgesinden, 24 numaralı T.E. 3. istasyonun yüzey

bölgesinden, 25 numaralı T.E. 4. istasyonun yüzey bölgesinden, 26 numaralı T.E. 2.

istasyonun yüzey bölgesinden, 27 numaralı Enterobacter cloacae 4. istasyonun dip

bölgesinden, 28 numaralı Enterobacter cloacae 4. istasyonun yüzey bölgesinden, 29

numaralı Klebsiella pneumoniae 3. istasyonun dip bölgesinden,30 numaralı

Klebsiella pneumoniae 3. istasyonun dip bölgesinden izole edilmiştir.


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

31- E

n.clo

32- C

itro

33- E

n.clo

34- En.c

lo

35- C

itro

36- E

n.clo

37- En.c

lo

38- En.c

lo

39- E

n.clo

40- E

n.c lo

41- E

n.clo

42- E

n.clo

43- E

n.clo

44- E

n.clo

45- En.c

lo

MA

R İN

DE

KSİ

Bu çizelgede 4 bakteri suşunun MAR indeksi 0.428 olarak hesaplanmıştır. Bu

bakteri suşlarını Enterobacter cloacae ve Citrobacter freundii oluşturmaktadır. Diğer

11 bakteri suşunun MAR indeksi ise 0.571 olarak belirlenmiştir. Bu bakteri suşlarını

ise Enterobacter cloacae türü oluşturmaktadır.


33

Buradaki bakteri suşlarından 31 numaralı Enterobacter cloacae 4. istasyonun

dip bölgesinden, 32 numaralı Citrobacter freundii 7. istasyonun yüzey bölgesinden,

33 numaralı Enterobacter cloacae 2. istasyonun dip bölgesinden, 34 numaralı

Enterobacter cloacae 2. istasyonun yüzey bölgesinden, 35 numaralı Citrobacter

freundii 7. istasyonun dip bölgesinden, 36 numaralı Enterobacter cloacae 6.

istasyonun dip bölgesinden, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ve 44 numaralı Enterobacter

cloacae 6. istasyonun dip bölgesinden, 45 numaralı Enterobacter cloacae 4.

istasyonun dip bölgesinden izole edilmiştir.


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

46- E

n.clo

47- E

.coli

48- E

.coli

49- E.co

li

50- T

.E.

51- E

.coli

52- T.E

.

53- T

.E.

54- T

.E.

55- T

.E.

56- T.E

.

57- E

n.clo

58- E

.coli

59- E

n.clo

60- En.c

lo

MA

R İN

DE

KSİ

Bu çizelgede bütün bakteri suşlarının MAR indeksleri 0.571 olarak tespit

edilmiştir. Bu bakteri suşlarını Enterobacter cloacae, Escherichia coli ve tespit

edilemeyen bakteri türleri oluşturmaktadır.

Buradaki bakteri suşlarından 46 numaralı Enterobacter cloacae 4. istasyonun

dip bölgesinden, 47 ve 48 numaralı Escherichia coli 7. istasyonun dip bölgesinden,

49 numaralı Escherichia coli 6. istasyonun dip bölgesinden, 50 numaralı T.E.

4.istasyonun dip bölgesinden, 51 numaralı Escherichia coli 4. istasyonun dip


34

bölgesinden, 52, 53, 54, 54, 55 ve 56 numaralı T.E. 4. istasyonun dip bölgesinden, 57

numaralı Enterobacter cloacae , 58 numaralı Escherichia coli, 59 ve 60 numaralı

Enterobacter cloacae 6. istasyonun dip bölgesinden izole edilmiştir.


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

61- C

itro

62- E

n.clo

63- E

.coli

64- E.co

li

65- E

n.clo

66- En.c

lo

67- T

.E.

68- E.co

li

69- E

.coli

70- E

.coli

71- E

.coli

72- E

.coli

73- E

n.clo

74- E

.coli

75- E.co

li

MA

R İN

DE

KSİ

Bu çizelgede bir bakteri suşunun Mar indeksi 0.485 olup, bu bakteri suşu

Citrobacter freundii’dir. Geriye kalan bakteri suşlarından 11 tanesinin MAR indeksi

0.714’tür. bu bakteri suşları arasında Enterobacter cloacae, Escherichia coli ve tespit

edilemeyen bakteri suşu bulunmaktadır. İki bakteri suşunun MAR indeksi 0.142 olup

bu bakteriler Enterobacter cloacae ve Escherichia coli’dir. Bir bakteri suşu ise bütün

antibiyotiklere dirençli olup MAR indeksi 1.000’dır.

Buradaki bakteri suşlarından 61 numaralı Citrobacter freundii 2. istasyonun

dip bölgesinden, 62 numaralı Enterobacter cloacae, 63 ve 64 numaralı Escherichia

coli, 65 ve 66 numaralı Enterobacter cloacae 6. istasyonun dip bölgesinden, 67

numaralı T.E. 4. istasyonun dip bölgesinden, 68 numaralı Escherichia coli 4.

istasyonun yüzey bölgesinden, 69, 70, 71 ve 72 numaralı Escherichia coli 2.

istasyonun dip bölgesinden, 73 numaralı Enterobacter cloacae 5. istasyonun dip


35

bölgesinden, 74 numaralı Escherichia coli 5. istasyonun yüzey bölgesinden, 75

numaralı Escherichia coli 6. istasyonun dip bölgesinden izole edilmiştir.


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

76- E

.coli

77- C

itro

78- E.co

li

79- E

n.c lo

80- E

n.clo

81- En.c

lo

82- E

.coli

83- E

.coli

84- E

.coli

85- E

.coli

86- E.co

li

87- E.co

li

88- E

.coli

MA

R İN

DE

KSİ

Bu çizelgede 5 bakteri suşunun MAR indeksi 0.142 olarak belirlenmiştir. Bu

bakteri suşları Escherichia coli, Citrobacter freundii ve Enterobacter cloacae

türleridir. Geriye kalan bakteri suşlarından 6 tanesinin MAR indeksi 0.714 olarak

belirlenmiş olup, bu bakteri suşlarını ise Escherichia coli türü oluşturmaktadır. Diğer

2 bakterinin ise MAR indeksi 0.857 olup, bu bakteri suşlarını ise Enterobacter

cloacae oluşturmaktadır.

Buradaki bakteri suşlarından 76 numaralı Escherichia coli 7. istasyonun

yüzey bölgesinden, 77 numaralı Citrobacter freundii 3. istasyonun yüzey

bölgesinden, 78 numaralı Escherichia coli 5. istasyonun dip bölgesinden, 79 ve 80

numaralı Enterobacter cloacae 6. istasyonun dip bölgesinden, 81 numaralı

Enterobacter cloacae 4. istasyonun yüzey bölgesinden, 82 numaralı Escherichia coli

7. istasyonun dip bölgesinden, 83, 84, 85, 86, 87 ve 88 numaralı Escherichia coli 2.

istasyonun dip bölgesinden izole edilmiştir.


36

Çalışmada izole edilen bakterilerin toplamı hesaba katıldığında 14 bakteri

suşunun (% 15.90) MAR indeksi 0.142, 11 bakteri suşunun (% 12.5) MAR indeksi

0.285, 16 bakteri suşunun (% 18.2) MAR indeksi 0.428, 27 bakteri suşunun (%

30.68) 0.571, 17 bakteri suşunun (% 19.32) 0.714, 2 bakteri suşunun (% 2.27) 0.857

ve bir bakteri suşunun (% 1.14) 1,000’dir.

Yüzey sularından izole edilen bakterilerin antibiyotik kullanımına bağlı

olarak gösterdikleri çoklu antibiyotik dirençliliği artmaktadır. Benzer konularda

yapılan çalışmalarda elde edilen bulgular sonuçları desteklemektedir. Go-Ni-Urriza

ve arkadaşları (2000), nehrinden izole edilen Enterobacteriaceae spp. suşlarının

%72’sinin, Aeromonas sp. suşlarının ise %20’sinin nalidiksik aside karşı dirençli

olduğunu tespit etmişlerdir. Enterobacteriaceae sp izolatlarının tetrasikline %24.3,

beta-laktamlara %20.5 dirençli olduklarını, Aeromonas sp izolatlarının ise

tetrasikline %27.5, co-trimoksazole %26.6 dirençli olduklarını bulmuşlardır.

Bakterilerde çoklu antibiyotik dirençliliğinin gelişmesinde çeşitli faktörler rol

oynamaktadır. Colamiris ve ark., (1984), zararsız olarak tanımlanan bazı bakterilerde

R-faktörlerine bağlı MAR dirençliliği olduğunu tespit etmişlerdir. Antibiyotiklere

karşı geliştirilen direnç kromozomal olabileceği gibi ekstrakromozomal kökenli de

olabilmektedir. Bou ve arkadaşları (2000), hastalardan izole ettikleri Acinetobacter

baummannii suşlarından birinin hem imipeneme hemde meropeneme karşı dirençli

olduğunu ve bu suşun karbapenemi hidrolize uğratıcı bir enzim taşıdığını tespit

etmişlerdir. Bu dirençliliğin sadece kromozomal DNA’da kodlanan bir D sınıfı beta-

laktamazdan kaynakladığını da bildirmişlerdir. Grace ve ark., (1987), Klavulanik

asit, Sulbaktam ve sefamisin bileşiklerinin krozomal ve plazmid kodlu beta-

laktamazlar üzerine olan inhibitör etkisini incelemişler ve inhibisyon oranlarını lineer

olmayan regrasyon analizleri ile göstermişlerdir. klavulanik acit ve sulbaktamın

SHV-1, TEM-1 ve PSE-4 gibi plazmid kodlu, saflaştırılmış beta-laktamazlara karşı

yüksek afiniteye sahip oldukları ve bu ajanların asıl potansiyel inhibisyon

özelliklerinin düşük Ki değerlerinden kaynakladığını tespit etmişlerdir. klavulanik

acit ve sulbaktamın ise krozomal beta-laktamazlara karşı etkisiz olduğunu

belirtmişlerdir.


37

4.3. Plazmid Profillerinin Analizi

Çalışmada izole edilen 88 Enterobacteriaceae grubu bakterilerin tamamı

kullanılarak plazmid izolasyonları gerçekleştirilmiştir.

Seçilen bakteri suşlarından izole edilen plazmidlerin büyüklükleri agaroz

jelde yürütülen marker DNA’sına göre belirlenmiştir.

Şekil 4.1. Bakterilerin agaroz jel elektroforez sonuçları-1

1. ve 14. sütunlar marker plazmid DNA’sı olup 7 tane DNA bandı jelde

görülmektedir. Agaroz jel görüntüleme sistemine marker DNA’nın bç’si kontrol

olarak kullanılmış ve sistemde örneklerin DNA büyüklükleri hesaplanmıştır.

Marker DNA’nın band büyüklükleri sırasıyla 23130 bç, 9416 bç, 6557 bç,

4361 bç, 2322 bç, 2032 bç ve 564 bç’dir.

1 numaralı Escherichia coli bakterisinde bir DNA bandı görünmekte olup

büyüklüğü 25632 bç’dir.

2 numaralı Escherichia coli bakterisinde 7 DNA bandı görünmekte olup

büyüklükleri sırasıyla 39155 bç, 26299 bç, 8434 bç, 3958 bç, 3157 bç, 2896 bç ve

2092 bç’dir.

6 numaralı Enterobacter cloacae bakterisinde 1 DNA bandı görülmekte olup


23130 9416 6557

2322 2027

564

4361


38

8 numaralı Klebsiella pneumoniae bakterisinde 7 DNA bandı görülmekte

olup büyüklükleri sırasıyla 40756 bç, 27331 bç, 8598 bç, 4044 bç, 3174 bç, 2991 bç

ve 2081 bç’dir.




büyüklükleri sırasıyla 41751 bç, 26985 bç, 9246 bç, 4110 bç, 3225 bç, 3007 bç ve

2102 bç’dir.

Bir antibiyotiğe karşı dirençli olan Escherichia coli, iki antibiyotiğe dirençli

olan Escherichia coli ve 2 antibiyotiğe diençli olan Klebsiella pneumoniae bakteri

suşlarında yedi plazmid DNA bandı görülmüştür ve bu DNA bandlarının

büyüklüklerine bakıldığında birbirine çok yakın değerler olduğu görülmüştür. Diğer

tek ve iki antibiyotiğe dirençli olan bakteri suşlarında ise ya bir plazmid DNA bandı

görülmüştür ya da hiç DNA bandı görülmemiştir. Plazmid DNA’sı görülen bakteriler

beşinci ve yedinci istasyondan izole edilmişlerdir. Antibiyotiklere karşı direnç

gösterdikleri halde plazmid DNA’sı olmayan bakteri suşları ise birinci, üçüncü,

beşinci ve yedinci istasyondan izole edilmişlerdir.


23130

9416

6557 4361

2322 2027


39





4361 bç, 2322 bç ve 2032 bç’dir.




büyüklükleri 4170 bç, 3320 bç ve 2017 bç’dir.



24 numaralı T.E. bakteride bir DNA bandı görünmekte olup büyüklüğü 3780

bç’dir.

İki antibiyotiğe dirençli olan bir Escherichia coli bakterisinde bir plazmid

DNA bandı görülmüştür. Üç antibiyotiğe dirençli olan iki Escherichia coli

bakterisinin birinde 3 plazmid DNA bandı görülürken diğerinde tek band

gözlenmiştir. Yine üç antibiyotiğe karşı dirençli olan T.E. bakteride tek DNA bandı

görülmüştür. Plazmid DNA’sı görülen bakteriler üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı

istasyondan izole edilmişlerdir. Antibiyotiklere karşı dirençli oldukları halde direnç

göstermeyen bakteri suşları birinci, ikinci, üçüncü, dördüncü ve yedinci istasyondan

izole edilmişlerdir.


40






4361 bç, 2322 bç ve 2032 bç’dir.

28 numaralı Enterobacter cloacae bakterisinde 2 DNA bandı görünmekte

olup büyüklükleri 4065 bç ve 2315 bç’dir.

29 ve 30 numaralı Klebsiella pneumoniae bakterisinde tek DNA bandı

görülmekte olup büyüklüğü 2315 bç’dir.

35 numaralı Citrobacter freundii bakterisinde 3 DNA bandı görülmekte olup

büyüklükleri sırasıyla 6411 bç, 5562 bç ve 3404 bç’dir.

Üç antibiyotiğe dirençli olan Enterobacter cloacae bakterisinde 2 plazmid

DNA bandı görülmüştür. Yine 3 antibiyotiğe dirençli olan iki Klebsiella pneumoniae

bakterisinde tek band görülmüş olup görülen bandların büyüklüğü aynıdır. Dört

antibiyotiğe dirençli olan Citrobacter freundii bakterisinde ise 3 plazmid DNA bandı

görülmüştür. Plazmid DNA bandı görülen bakteri suşları üçüncü, dördüncü ve

yedinci istasyondan izole edilmişlerdir. Antibiyotiklere karşı direnç gösterdikleri

23130

9416

6557

4361

2322 2027


41

halde plazmid DNA’sı görülmeyen bakteri suşları ise ikinci, dördüncü, altıncı ve

yedinci istasyondan izole edilmişlerdir.




olarak kullanılmıştır.


4361 bç, 2322 bç ve 2032 bç’dir.

Hepsi 4 antibiyotiğe dirençli olan 10 Enterobacter cloacae ve 2 Escherichia

coli suşunun hiçbirinde plazmid DNA bandı görülmemiştir. Bu bakteri suşları

dördüncü, altıncı ve yedinci istasyondan izole edilmişlerdir.

23130

9416 6557

4361

2322 2027


42






4361 bç, 2322 bç ve 2032 bç’dir.

49 numaralı Escherichia coli bakterisinde 2 plazmid DNA bandı görülmekte

olup büyüklükleri 3836 bç ve 2622 bç’dir.

57 numaralı Enterobacter cloacae bakterisinde 4 plazmid DNA bandı

görülmekte olup büyüklükleri 10046 bç, 4182 bç, 3881 bç ve 2858 bç’dir.


olup büyüklükleri 9965 bç, 4172 bç, 3881 bç ve 2838 bç’dir.





Dört antibiyotiğe dirençli olan Escherichia coli bakterisinde 2 plazmid DNA

bandı görülmüştür. Yine 4 antibiyotiğe dirençli olan Escherichia coli ve 2

23130

9416

6557

4361

2322 2027


43

Enterobacter cloacae suşlarında 4 plazmid DNA bandı görülmüştür ve bu bandların

büyüklüklerinin hemen hemen aynı olduğu görülmüştür. Plazmid DNA’sı görülen

bakteri suşları altıncı istasyondan izole edilmişlerdir. Antibiyotiklere karşı dirençli

olan fakat plazmid DNA’sı görülmeyen suşlar ise dördüncü istasyondan izole

edilmişlerdir.






4361 bç, 2322 bç ve 2032 bç’dir.

62 numaralı Enterobacter cloacae bakterisinde tek plazmid DNA bandı

görülmüş olup büyüklüğü 4411 bç’dir.

63 numaralı Escherichia coli bakterisinde 6 plazmid DNA bandı görülmüş

olup büyüklükleri 58694 bç, 23636 bç, 6605 bç, 5302 bç, 3514 bç ve 3352 bç’dir.


olup büyüklükleri 23130 bç, 6701 bç, 5302 bç, 3560 bç ve 3308 bç’dir.

23130

9416 6557

4361

2322 2027


44


görülmüş olup büyüklükleri 6701 bç, 5425 bç, ve 3323 bç’dir.


görülmüş olup büyüklükleri 59333 bç, 24417 bç, 6848 bç, 5394 bç, 3560 bç ve 3337

bç’dir.


olup büyüklükleri 11319 bç, 7049 bç, 4305 bç ve 2445 bç’dir.


olup büyüklükleri 58694 bç, 48826 bç, 24154 bç, 9727 bç, 6948 bç, 6653 bç, 5425

bç, 4781 bç, 4305 bç, 4052 bç, 3514 bç, 3351 bç, 2724 bç ve 2488 bç’dir.


olup büyüklükleri 50438 bç, 23382 bç, 9940 bç, 6557 bç, 4808 bç, 4386 bç, 4035 bç

ve 3576 bç’dir.



bç, 4000 bç, 3560 bç, 3351 bç, 2701 bç, 2488 bç’dir.



bç, 4437 bç, 4000 bç, 3545 bç, 3351 bç, 2712 bç ve 2488 bç’dir.

Beş antibiyotiğe dirençli olan Enterobacter cloacae suşlarında 1, 3 ve 6

plazmid DNA bandı görülmüştür. Beş antibiyotiğe dirençli olan Escherichia coli

suşlarında 4, 5, 6, 8, 12, 13 ve 14 plazmid DNA bandı görülmüştür. Plazmid DNA’sı

bulunan suşlar ikinci, dördüncü ve altıncı istasyondan izole edilmişlerdir.

Antibiyotiklere karşı direnç gösterdikleri halde plazmid DNA’sı görülmeyen bakteri

suşları ise ikinci ve dördüncü istasyondan izole edilmişlerdir.


45






4361 bç, 2322 bç ve 2032 bç’dir.




olup büyüklükleri 16586 bç, 15021 bç, 9964 bç, 3520 bç, 3007 bç ve 2175 bç’dir.


görülmüş olup büyüklükleri 9550bç ve 2886 bç’dir.


görülmüş olup büyüklükleri 9483 bç ve 2877 bç’dir.



Bir antibiyotiğe dirençli olan 2 Enterobacter cloacae bakteri suşunda birer

plazmid DNA bandı görülmüştür. Yine bir antibiyotiğe dirençli olan Escherichia coli

23130

9416 6557

4361

2322 2027


46

bakterisinde 6 plazmid DNA bandı gözlenirken, 7 antibiyotiğe dirençli olan

Escherichia coli bakterisinde plazmid DNA bandı gözlenmemiştir. Altı antibiyotiğe

direçli olan 2 Enterobacter cloacae suşunda ikişer plazmid DNA bandı görülmüştür.

Plazmid bandları görülen bakteri suşları dördüncü, beşinci ve altıncı istasyondan

izole edilirken antibiyotiklere karşı dirençli oldukları halde plazmid bandları

gözlenmeyen bakteri suşları ise üçüncü, beşinci, altıncı ve yedinci istasyonlardan

izole edilmişlerdir.


1. sütun marker plazmid DNA’sı olup 6 tane DNA bandı jelde görülmektedir.

Agaroz jel görüntüleme sistemine marker DNA’nın bç’si kontrol olarak kullanılmış

ve sistemde örneklerin DNA büyüklükleri hesaplanmıştır.

23130

9416

6557

4361

2322 2027


47


4361 bç, 2322 bç ve 2032 bç’dir.


olup büyüklükleri sırasıyla 25678 bç, 8070 bç, 3764 bç, 3182 bç, 2551 bç, 2351 bç

ve 2192 bç’dir


olup büyüklükleri sırasıyla 7975 bç, 3748 bç, 3143 bç, 2530 bç, 2370 bç ve 2192

bç’dir.


olup büyüklükleri sırasıyla 39413 bç, 8215 bç, 6525 bç, 6008 bç, 3764 bç, 3156 bç,

2530 bç ve 2370 bç’dir.


olup büyüklükleri sırasıyla 41527 bç, 26220 bç, 8022 bç, 3810 bç, 3156 bç, 2541 bç,

ve 2370 bç’dir.


olup büyüklükleri sırasıyla 41527 bç, 26496 bç, 3841 bç, 3221 bç, 2380 bç, ve 2238

bç’dir.


olup büyüklükleri sırasıyla 42404 bç, 27055 bç, 3810 bç, 3156 bç, 2469 bç, ve 2219

bç’dir.

Beş antibiyotik dirençliliği gözlenen 6 Escherichia coli suşunda 6, 7 ve 8

plazmid DNA bandı gözlenmiştir ve bu bakteriler ikinci istayondan izole

edilmişlerdir.

Çalışmada izole edilen 88 bakteriden gerçekleştirilen plazmid izolasyonunda

40 bakteride (% 45.5) plazmid saptanmıştır.

Plazmid izole edilen bakterilerde, 5 farklı antibiyotiğe dirençli olan 1

bakterinin (% 1.14) izole edilen 14 plazmid bandı olduğu, 1 bakterinin (% 1.14) 13

plazmid bandı olduğu ve bir bakterinin de (% 1.14) 12 plazmid bandı olduğu

belirlenmiştir. 6 farklı antibiyotiğe direnç gösteren 2 bakteride (% 2.27) ise 2

plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. 2 farklı antibiyotiğe dirençli olan 2 bakteride

(% 2.27) ise 7 plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. Tek antibiyotiğe dirençli olan 1


48

bakteride (% 1.14) ise 7 plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. 5 farklı antibiyotiğe

dirençli olan 1 bakteride (%1.14) ise tek plazmid bandı olduğu belirlenmiştir.

7 farklı antibiyotiğe direnç olan 1 bakteride (% 1.14) ise plazmid bandı

gözlenmemiştir. Yine 4 farklı antibiyotiğe dirençli olan 21 bakteride de (% 23.86)

plazmid bandı gözlenmemiştir.

İzole edilen bakterilerin gösterdikleri antibiyotik dirençlilik özelliklerinin

kromozomal veya plazmidik oldukları gözlenmektedir. Kromozom dışında,

bakterilerde bulunan hücreye bazı önemli özellikler kazandıran ve bu özellikleri

genetik kontrol altında tutan plazmidler bulunmaktadırlar. Plazmidler

mikroorganizmalara antibiyotik ve ağır metal dirençliliği gibi özellikler

kazandırmaktadırlar ve üzerinde 1-2 veya daha fazla gen taşıyabilirler (Bilgehan,

2002). Plazmid büyüklükleri 1-2 milyon dalton arasında değişebildiği

belirtilmektedir (Akman, 1983; Olgun ve Topal, 1999). Plazmidler bir bakteride

kendiliğinden oluşabildiği gibi bir başka bakteriden aktarılma yolu ile meydana

gelebilirler. Bir plazmid hücrede kendiliğinden kaybolabileceği gibi kimyasal ve

fiziksel yollarla da yok olabilirler (Bilgehan, 2002).

Shah ve Stille (1983), yaptıkları çalışmalar sonucunda Almanya’da beta-

laktam antibiyotiklere karşı Klebsiella pneumoniae ve Escherichia. coli suşlarının

dirençlilik kazandıklarını tespit etmişlerdir. Saunders (1984), farklı konaklardan izole

edilen suşlar arasında antibiyotik dirençliliğinin plazmidlerle aktarıldığını

bildirmiştir.

Sanders ve Sanders (1985), bir hastanede yaptıkları çalışmada

Enterobacteriaceae üyelerinin cephalosporinlere karşı transfer edilebilir bir

dirençlilik geliştirdiklerini ortaya koymuşlardır. Knothe ve ark., (1983),

cephalosporin dirençliliğinin plazmid kökenli olduğunu ve Klebsiella pnemoniae

suşlarından izole edilen plazmidin, Cefotaxime, Cefuroxime diğer Cephalosporinler,

Penicilinler ve Gentamicin dirençliliğini hassas suşlara aktarabildiğini

bildirmişlerdir. Cefotaxime ve diğer son kuşak beta-laktam antibiyotik

dirençliliklerinin E. coli bakterisine çok kolay aktarabildiğini belirtmişlerdir.


49

Beta-laktam antibiyotiklerini hidrolize eden ve inaktif hale getiren beta-

laktamaz üretimi, başta Enterobacteriaceae üyeleri olmak üzere birçok bakteri

türünün en önemli direnç mekanizmalarından birisidir (Akçam ve ark., 2004).

Plazmidler kromozomdan bağımsız olarak çoğalan, kromozom dışı genetik

elementlerdir. Plazmidler antimikrobiklere ve ağır metallere direnç genleri yanında

değişik virulans faktörlerini de taşıyabilirler. Klinikte görülen direncin ana

sorumlusu plazmide bağlı dirençtir. R-plazmidi denen direnç plazmidleri bir veya

daha çok sayıda antibiyotiğe karşı direnç genlerini taşımaktadır. Direnç plazmidleri

diğer duyarlı bakterilere transdüksiyon, transformasyon ve konjugasyon olaylarıyla

geçerek direnç gen paketini aktarır ve böylece direncin yayılmasına neden olur.

5. SONUÇ ve ÖNERİLER Yasemin KAYA

50

5. SONUÇ ve ÖNERİLER

Bu çalışmada, Seyhan Baraj Gölünden izole edilen ve antibiyotik dirençlilik

düzeyleri tespit edilmiş Enterobacteriaceae grubu bakterilerdeki ve bu dirençliliğin

plasmid kökenli olup olmadıkları, izole edilen plasmidlerin büyüklükleri elektroforez

yapılarak ortaya konmuştur.

Örneklemeler Seyhan Baraj Gölü üzerindeki belirlenen bölgelerden alınmış

olup toplam yedi istasyon bölgesi belirlenmiştir. Birinci istasyon olarak Seyhan

Nehri’nin ilk giriş noktası, İkinci istasyon Seyhan Nehri’nin baraj suyuyla karıştığı

nokta, üçüncü istasyon olarak Çakıt Nehri’nin baraja döküldüğü nokta, dördüncü

istasyon olarak Çakıt Nehri’nin yerleşim yerlerine olan başlangıç noktası, beşinci

istasyon noktası olarak Çakıt ile Seyhan Nehri’nin baraj suyuyla birleştiği yer, altıncı

istasyon olarak iki su kaynağının gölün suyuyla karıştığı bölge, yedinci istasyon

olarak suyun drenaj noktasına gittiği bölge seçilmiştir.

Özellikle 2. 4. ve 6. istasyonlar insan aktivitelerinin en fazla olabileceği

bölgeler olup bu bölgelerden izole edilen Enterobacteriaceae grubu bakterlerde

antibiyotik dirençlilik düzeyinin yüksek olduğu belirlenmiştir.

İzolatların 14’ü bir antibiyotiğe dirençli iken 5. istasyondan izole edilen ve

Escherichia coli olarak tanımlanan 88 izolatın 1 tanesinin çalışmada kullanılan 7

antibiyotiğe karşı dirençli olduğu tespit edilmiştir. Diğer izolatların ise en az 2

antibiyotiğe dirençli olduğu belirlenmiştir. Mikrobiyal genetik maddelerin

aktarılmasında doğada çeşitli yöntemler bulunmaktadır. Bunlar arasında en önemli

olanlardan bir tanesi konjugasyonla plasmidlerin bakteriler arasında alış veriş

yapılarak aktarılmasıdır. Çalışmamızda izole ettiğimiz 88 bakteriden 40 tanesi

plazmid taşımaktadır. Bu durum bakterilerin doğada bu plasmidleri aktararak

bakteriler arasında antibiyotik dirençliliğinin artmasında önemli bir rol oynayabilir.

Yoğun antibiyotik kullanımı genellikle plazmide bağlı dirençliliğinin ortaya

çıkmasında önemli rol oynamaktadır. Seyhan Nehri’nin mikrobiyal kontaminasyona

maruz kalması, izole edilen bakteriler arasında 7 antibiyotiğe dirençli organizma

izole edilmiş olması bu durumların halk sağlığı açısından ciddi problemler teşkil

edebileceğini düşündürebilir. Baraj gölünün çevresinde yaşayan halkın ve göl

5. SONUÇ ve ÖNERİLER Yasemin KAYA

51

çevresinde otlatılan hayvanların dışkılarının suya karışması bu kirliliğin önemli

sebeplerinden olabilir. Sulak alanların mikrobiyal kirlilikten kurtarılması ve daha

fazla kirlenmesini engellemek için göle giren fekal kökenli kirlilik kaynaklarının ve

atık su deşarjlarının önlenmesi büyük öneme sahip olacaktır. Bu sulak alanlara yakın

bölgelerde imara açılacak olan sitelerin özellikle atık suların sulak alanlara

verilmemesi ve kaçaklardan kaynaklanacak kirlenmenin önüne geçilmesi öneriler

arasında sunulabilir.

Ülkemiz üç tarafı sularla çevrili olup, sulak alanları bakımından dünyanın

önemli bir bölgesidir. Kullanılabilir su ve su kaynaklarının korunması, bu su

kaynaklarının mikrobiyal ve diğer kimyasal kirlenmenin önlenmesi gelecekte

doğabilecek olan su sıkıntısının önüne geçilmesinde stratejik bir öneme sahiptir. Bu

nedenle bilinçli yapılanma ve bilinçli olarak su kaynaklarının kullanılması, arıtma

tesislerinin kurulması gelecek nesiller için büyük önem arz etmektedir.

52

KAYNAKLAR

AKAN, E., 1992. Genel Mikrobiyoloji ve İmmünoloji. Çukurova Üniversitesi Tıp

Fakültesi Yayınları No:16. 404:81-200

AKÇAM, F. Z., GÖNEN, İ., KAYA, O., ve YAYLI, G., 2004. Hastane İnfeksiyonu

Etkeni Enterobakterilerde Beta-laktam Antibiyotiklere Duyarlılık ve ESBL

Sıklığının Araştırılması. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fak. Dergisi,

11(1):6-9

AKMAN, M., 1983. Bakteri Genetiği, Cumhuriyet Ünv. Tıp Fak. Yayını, No:8

Sivas, sf: 560.

ARDA, M., 1995. Biyoteknoloji. Kükem Derneği Bilimsel Yayınlar No: 3, 3. Baskı,

Ankara. s.432.

ARMSTRONG, J. L., SHIGENO, D. S., COLAMIRIS, J. J., and SEIDLER, R. J. ,

1981. Antibiotic- resistant Bacteria in Drinking-water . Appl. Env. Microbiol.

, 42: 277–283.

ASLIM, B., ve BEYATLI, Y., 2004. Antibiotic Resistance and Plasmid DNA

Contents of Streptococcus thermophilus Strains Isolated from Turkish

Yogurts. Turk J Vet Anim Sci Tübitak 28:257-263

BAŞTÜRK, S., 2005. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas

aeruginosa ve Acinetobacter baumannii Suşlarında Çeşitli Kinolon Grubu

Antibiyotiklerin Duyarlılıklarının Araştırılması. Haseki Eğitim ve Araştırma

Hastanesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği Uzmanlık

Tezi, 61:7

BALCI, R. S., 2007. Seyhan Baraj Gölünün Bakteriyolojik Kirlilik Düzeyinin

Belirlenmesi ve Enterobacteriaceae Üyelerinde Antibiyotik Dirençliliği.

Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi.

BELL, J. B., MACRAE, W. R., ELLIOT, G. E., 1980. Incidence of R Factors in

Coliform, Fecal Coliform, and Solmonella Populations of The Red River in

Canada. Appl. Env. Microbio., 40: 486-491.

BERZEG, D., 2005. Çeşitli Klinik Materyallerden İzole Edilen Enterokok Suşlarında

Antibiyotik Direnci, Yüksek Düzey Aminoglikozid Direnci ve E Test ile

53

Vankomisin MİK Değerlerinin Değerlendirilmesi. Haseki Eğitim ve

Araştırma Hastanesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği

Uzmanlık Tezi, 95:5-6

BİLGEHAN, H., 1994. Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi. Fakülteler Kitap

Evi Barış Yayınları, 589:145-178.

BİLGEHAN, H., 2002. Klinik Mikrobiyolojik Tanı, Fakülteler Kitap Evi Barış

Yayınları, 777s.

BOU, G., CERVERO, G., DOMINGUEZ, M. A., QEREDA, C., MARTINEZ-

BELTRAN, J., 2000. Characterization of a Nosocomial Outbreak Caused by

a Multiresistant Acinatobacter baumannii Strain with a Carbapenem-

Hydrolyzing Enzyme: High- Level Carbepenem Resistance in a A. baumannii

is not due Solely to the Presence of Beta-Lactamases. J. Clin. Mic., 38: 3299-

3305.

BÜSCHER, K. H., CULLMANN, W., DICK, W., STIEGLITZ, M., 1987. Selection

Frequancy of Resistant Variants by Various Beta-Lactam Antibiotics in

Clinical Enterobacter Cloacae Isolates. Chemother., 33:40-51.

CASAWELL, M. W., PHILIPS, I., 1981. Aspect of the Plasmid-Mediated Antibiotic

Resistance and Epidemiology of Klebsiella Species, Ann. J. Med. 70:459–

460

CESUR, S., ALBAYRAK, F., ÖZDEMİR, D., KOLCU, Z., ve TEKELİ, E., (2001)

Türk Mikrobiyal Cem Derg 32:174-176

COLAMIRIS, J. J., ARMSTRONG, J. L., SEIDLER, R. J., 1984. Association of

Metal Tolerance with Multiple-Antibiotic Resistance of Bacteria Isolated

from Drinking Water, Apply. Environ. Microbiol. 47:1238–1242.

COOKE, M. D., 1976. Antibiotic Resistance Among Coliform and Fecal Coliform

Bacteria Isolated from Sewage, Seawater and Marina Shell Fish, Antimicrob.

Agent and Chemorther. 9:879–944.

ÇETİN, B., GÜNDÜZ, A., ŞENSOY, A., KORKMAZ, F., ve SEBER, E., 1999.

Hastane İnfeksiyonu Etkeni Gram Negatif Bakterilerin Genişlemiş

Spektrumlu Beta-Laktamaz ve Antibiyotik Duyarlılık Özelliklerinin

54

Araştırılması. Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi İnfeksiyon

Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği İstanbul

ÇİFTÇİ, A., AKSARAY, S., ve CESUR, S., (2003). Yanık Ünitesinde Yatan

Hastaların Yara ve Kan Kültürlerinden İzole Edilen Mikroorganizmalar ve

Antibiyotik Duyarlılıkları. İnfeksiyon Dergisi. 17(3):293-296

DEMİRTÜRK, N., ve DEMİRDAL, T., 2004. Antibiyotiklerde Direnç Sorunu.

Kocatepe Tıp Dergisi 5 sf:17-21

DİNÇER, S., 1994. Hastane Laboratuarı Ve Kanalizasyondan İzole Edilen

Enterobacteriaceae Cinslerinde Plasmid-Kodlu III. Kuşak Cephalosporin

Dirençliliğinin Dağılımı, R-Plazmidlerinin Konjugasyon ve Transformasyon

ile Aktarabilirliğinin Saptanması. Ç.Ü. Fen. Bil. Enst. Biyoloji ABD. Doktora

Tezi.

DOĞANCI, L., 2001. Antibiyotik Direncinin Sıklığı Üzerine Antibiyotik

Kullanımının Etkisi. Klinik Dergisi Cilt 14(2) sf:57-61

EHINMIDU, J. O., 2003. Antibiotics Susceptibility Patterns of Urine Bacterial

Isolates in Zaria, Nigeria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research,

2(2):223-228

ERKAN, M. E., VURAL, A., 2006. Dicle Nehrinin Hijyenik Kalitesi Üzerine Bir

Araştırma. Dicle Tıp Dergisi. 33(4): 205–209.

FINCH, G. R., SMITH, D. W., 1987. The Response of Fecal Coliform and

Antibiotic-Resistance Escherichia coli. to İncremental Doses of Ozone

6During Disinfection of Activated Sludge Effluent. Env. Technol. Lett., 8:1-

18.

GIULIANO, L. 2003. Bacterial diversity in the Mediterranian and the Black seas: a

comparative approach. International Conference on the Sustainable

Development of the Mediterranian and Black Sea Environment 1-3, Greece

GO-NI-URIZZA, M., CAPTEPUY, M., APRIN, C., RAYMOND, N., CAUMETTE,

P.,QENTIN, C., 2000. Impact of an Urban Effluent on Antibiotic Resistance

of Riverine Enterobacteriaceae and Aeromonas spp. Appl. Env. Mic., 66:

125-132.

55

GRABOW, O. K., PROZESKY, O. W., BURGER, J. S., 1975. Behavior in a River

and Dam of Coliform Bacteria with Transferable or Non-Tranferable Drug

Resistance, Water Research, 13:145-148

GRACE, M. E., FU, K. P., GREGORY, F. J., HUNG, P. P., 1987. Interraction of

Clavulanic Acid, Sulbactam and Cephamycin Antibiotics with Beta-

Lactamases. Drugs Explt. Clin. Res. 13:145–148.

GÜR, D., 1994. Antibiyotiklere Direnç Gelişmesi. Klinik Uygulamalarda

Antibiyotikler ve Diğer Antimikrobiyal İlaçlar. Güneş Kitabevi Limitet

Şirketi. Ankara, s.19–37

HALKMAN, K., A., 2005. Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları (Editör, Halkman).

Merc Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamarı. s. 261-281.

HAGEDORN, C., ROBINSON, S. L., FILTZ, J.R., GRUBBS, S.M., ANGİER, T.A.,

and RENEAU, R.B., 1999. Determining Sources of Fecal Pollutıon in a

Virginia Watershed with Antibiotic Resistance Patterns in Fecal Streptococci.

Applied and Environmental Microbiology, Vol. 65 p. 5522-5531

JONES, J. G., 1986. Antibiotic Resistance in Aquatic Bacteria. Journal of

Antimicrobial Chemotherapy, 18. Suppl. C. 149-154

KARAYAKAR, F., AY, Ö., CİCİK, B., 2004. Mersin Kıyı Şeridinden Alınan Su

Örneklerinden İzole Edilen Escherichia coli Suşlarının Bazı Antibiyotiklere

Karşı Plasmid Kökenli Dirençliliğin Saptanması. Eko. Çev. Kor. 13,52: 28–

32.

KNOTHE, P., SHAH, P., KREMERY, V., ANTAL, M., MITSIUHASHI, S., 1983.

Tranferable Resistance to Cefotaxime, Cefoxitine, Cefamandole and

Ceforoxime in Clinical Isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia

marcessens Infections, 11: 315-317.

KRYALIKOVYA, K., KRYCMYERY, V., KRYCMYERY, V. Jr., 1984.

Transferable Resistanece To Gentamicin And Other Antibiotics in

Enterobacteriaceae Isolates from Municipal Wastewater. Jour. Hyg.

Epidemiol. Immunol., 28: 161-166.

MANNIATIS, T., FRITSCH,E.F., SAMBROOK, J., 1982. Molecular Cloning a

Labarotory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory. NY. sf : 545.

56

MATHEW, A. G., SAXTON, A. M., UPCHURCH, W. G., AND CHATTIN, S.

E.,1999. Multiple Antibiotic Resistance Patterns of Escherichia coli Isolates

from Swine Farms, APPLIED AND ENVIRONMENTAL

MICROBIOLOGY, p. 2770–2772

OLGUN, A., TOPAL, A., 1999. DNA’nın analizi. (Ed: G.Temizkan, N. Arda)

Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler. Nobel Kitap Evi, sf: 236.

OTKUN, M., ERDEM, B., AKATA, F., TATMAN-OTKUN, M., GERÇEKER, D.,

YAĞCI, S., ve ÖZKAN, E., 2001. Antibiotic Resistance Patterns and Plasmid

Profiles of Salmonella typhimurium Isolates in Turkey, Eur J Clin Microbiol

Infect Dis 20 :206–209

ÖNCÜL, O., 2002. Antibiyotikler I. İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp

Eğitimi Etkinlikleri, Akılcı Antibiyotik Kullanımı ve Erişkinde Toplumdan

Edinilmiş İnfeksiyonlar Sempozyum Dizisi, 31: 23-28.

ROBINSON, J. B., TUOVINEN, O. H., 1984. Mechanism of microbial resistance

and detoxification of mercury and organomercury compounds: Physiological,

Biochemical, and Genetic Analyses. Microbiological Reviews 48(2), 95-124.

RINKER, A. G., Jr., BOYD, A. L., GARY, N. D., KUNDIG, W., 1988. Isolation of

Multiple Antibiotic Resistant Enterobacteriaceae from River Water.

Microbios., 56: 169-175.

SANDERS, C. C., SANDERS, W. E., 1985. Microbial Resistance to Newer

Generation Beta-Lactam Antibiotics : Clinical and Laboratory Implications J.

Infect. Dis., 151: 399-406.

SHAH, P. M ., STILLE, W., 1983. Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae

Strains More Suspectible to Cefoxitin than to III-Generation Cephalsporins .

J. Antimicrob cChemother., 11: 597-598.

STEWART, K. R., KODITCHEK, L., 1980. Drug Resistance Transfer in

Escherichia coli. in New York Bignt Sediment, Mar. Pollut. Bull. 11:130–

133.

STROHL, W. A., ROUSE, H., ve FISHER, B. D., 2006. Lippincott’s Illustrated

Reviews: Microbiology (R. A. HARVEY ve P. A. CHAMPE editör). Nobel

Tıp Kitapevleri. 516:44-47

57

TANIR, G., ve GÖL, N., 1999. Antibiyotik Direnci. Klinik Dergisi Cilt:12(2) sf:47-

54

THIMM, T., HOFFMAN, A., FRITZ, I., TEBBE, C. C., 2001. Contribution of the

Earthworm Lumbricus rubellus (Annelida, Oligachaeta) to the Establishment

of Plasmids in Soil Bacterial Communities. Microbial Ecology.

VAHABOĞLU, H., 2004. Antibiyotiklerde Direnç Sorunu. Türkiye Klinikleri

Farmakoloji Özel, 2: 92-96.

YILMAZ, E., ÖZAKIN, C., SINIRTAŞ, M., ve GEDİKOĞLU, S., (2005). Uludağ

Üniversitesi Tıp Fakültesi Bakteriyoloji Laboratuvarı’nda 1999-2002 Yılları

Arasında İdrar Örneklerinden İzole Edilen Mikroorganizmalar ve Antibiyotik

Duyarlılıkları. İnfeksiyon Dergisi. 19(1):91-96

58

ÖZGEÇMİŞ

1982 yılında Adana’da doğdum. İlk ve orta öğrenimimi Adana’da

tamamladım. 2000 yılında Çukurova Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji

Bölümü’ne kaydoldum. 2004 yılında aynı bölümden mezun oldum. 2006 yılında

Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda Yüksek

Lisans öğrenimime başladım.

Yasemin KAYA - cu.edu.trI ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ SEYHAN BARAJ GÖLÜ’NDEN İZOLE EDİLEN...

Documents

Transcript of Yasemin KAYA - cu.edu.trI ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ SEYHAN BARAJ GÖLÜ’NDEN İZOLE EDİLEN...