ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

NGUYỄN THỊ HIỀN

XÂY DỰNG MÔ HÌNH TOÁN HỌC

GIÚP NHẬN BIẾT CHẤT ỨC CHẾ

ENZYM HISTON DEACETYLASE 2

CÓ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƢ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HIỀN

XÂY DỰNG MÔ HÌNH TOÁN HỌC

GIÚP NHẬN BIẾT CHẤT ỨC CHẾ

ENZYM HISTON DEACETYLASE 2

CÓ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƢ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa: QH.2012.Y

Người hướng dẫn: 1. TS. LÊ THỊ THU HƢỜNG

2. TS. PHẠM THẾ HẢI

Hà Nội - 2017

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành

tới TS. Lê Thị Thu Hường, công tác tại bộ môn Dược liệu và Dược học cổ

truyền - khoa Y Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội là người thầy tận

tình chỉ bảo, động viên, hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Phạm Thế Hải công tác tại Trường Đại

học Dược Hà Nội đã chỉ bảo tận tình cho tôi từ những bước đi ban đầu khi

nhận đề tài.

Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Khoa Y

Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được làm

khóa luận, được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại Khoa suốt 5 năm học qua.

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và

bạn bè luôn sát cánh, đồng hành, ủng hộ động viên tôi trong quá tình học tập,

nghiên cứu hoàn thành luận văn.

Dù đã rất cố gắng nhưng kiến thức, kỹ năng và thời gian thực hiện còn

hạn hẹp, tôi khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được những ý

kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, Ngày 8 tháng 6 năm 2017

Sinh Viên

Nguyễn Thị Hiền

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên Tiếng Anh Tên Tiếng Việt

CSDL Cơ sở dữ liệu

FDA Food and Drug

Administation

Cơ quan Quản lý Thực

phẩm và Dược phẩm

Hoa Kỳ

HAT Enzym Histon

Acetyltransferase

HDAC Histon deacetylase

HDAC2 Histon deacetylase 2

IC50 The half maximal

inhibitory concentration

Nồng độ ức chế 50%

MLR Multiple Linear

Regression

Phương pháp hồi quy

tuyến tính đa biến

Q2 Hệ số tương quan chéo

Q2

ext Hệ số xác định cho tập

kiểm tra

QSAR Quantitative Structure –

Activity Relationship

Tương quan định lượng

cấu trúc – tác dụng

R2 Hệ số xác định

SAHA Suberoylanilide

hydroxamic acid

Te Test set Tập kiểm tra

Tr Training set Tập huấn luyện

TSPT Tham số phân tử

UHDAC Chất ức chế histon

deacetylase

DANH MỤC HÌNH VẼ

STT Kí hiệu Tên hình Trang

1 Hình 1.1 Cấu trúc nhiễm sắc thể điều hòa hoạt động

phiên mã. (a) Sự methyl hóa và deacetyl

hóa histon dẫn tới hình dạng đóng xoắn

nhiễm sắc thể và ức chế phiên mã. (b) Sự

acetyl hóa và demethyl hóa histon làm tháo

xoắn nhiễm sắc thể và cho phép phiên mã.

7

2 Hình 1.2 Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC

nhóm I, II, IV

8

3 Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của 45 dẫn xuất của acid

hydroxamic thu thập được.

19

4 Hình 3.1 Miền ứng dụng của mô hình QSAR xác

định hợp chất có khả năng ức chế HDAC2

28

5 Hình 3.2 Tóm tắt quy trình sàng lọc in silico chất ức

chế HDAC2 từ CSDL PubChem

30

DANH MỤC BẢNG

STT Ký hiệu Tên bảng Trang

1 Bảng 1.1 Các nhóm thuốc chống ung thư 5

2 Bảng 1.2 Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm

lâm sàng.

12

3 Bảng 2.1 Giá trị IC50 thực nghiệm của 45 hợp

chất trong CSDL.

20

4 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá nội và đánh ngoại mô

hình QSAR.

28

5 Bảng 3.2 Kết quả sàng lọc ảo từ CSDL Pubchem. 33

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH VẼ

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Chƣơng 1- TỔNG QUAN ............................................................................... 3

1.1. Thực trạng ung thư và tử vong do ung thư ............................................. 3

1.1.1. Thực trạng ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới .................. 3

1.1.2. Thực trạng ung thư và tử vong do ung thư ở Việt Nam ................... 4

1.2. Thuốc điều trị ung thư ............................................................................. 4

1.3. Tổng quan histon deacetylase ................................................................. 6

1.3.1. Khái niệm histon deacetylase ........................................................... 6

1.3.2. Phân loại các HDAC ......................................................................... 7

1.3.3. HDAC2 và vai trò trong ung thư ...................................................... 8

1.3.4. Các chất ức chế HDAC ................................................................... 11

1.3.5. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC .............................. 13

1.4. Tổng quan phương pháp QSAR ............................................................ 13

1.4.1. Lịch sử QSAR ................................................................................. 13

1.4.2. Đại cương về QSAR ....................................................................... 14

1.4.3. Quy trình xây dựng mô hình QSAR .............................................. 15

Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 19

2.1. Nguyên liệu .......................................................................................... 19

2.1.1. Cơ sở dữ liệu ................................................................................... 19

2.1.2. Phần mềm sử dụng .......................................................................... 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 20

2.2.1 Tính toán tham số mô tả phân tử ..................................................... 20

2.2.2. Phân chia tập huấn luyện / Tập kiểm tra ........................................ 21

2.2.3. Xây dựng mô hình QSAR ............................................................... 21

2.2.4. Sàng lọc và dự đoán hoạt tính một số dẫn xuất HDAC2 sử dụng mô

hình QSAR đã xây dựng được .................................................................. 21

Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................... 23

3.1. Kết quả .................................................................................................. 23

3.1.1. Mô hình toán học thu được ............................................................. 23

3.1.2. Đánh giá mô hình theo các tiêu chí của OECD .............................. 27

3.1.3. Sàng lọc ảo đánh giá khả năng ức chế HDAC2 sử dụng mô hình

xây dựng được ........................................................................................... 29

3.2. Bàn luận ................................................................................................ 34

3.2.1. Về mô hình QSAR ......................................................................... 34

3.2.2. Về quy trình sàng lọc ảo. ................................................................ 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Theo thống kê của tổ chức Y tế giới (WHO), ung thư đã trở thành căn

bệnh giết người hàng đầu thế giới, với khoảng 14 triệu ca mới phát hiện và

8,2 triệu trường hợp tử vong mỗi năm (số liệu tính đến hết năm 2012). So với

thế giới thì Việt Nam thuộc nhóm nước có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất đối với

nhiều loại ung thư. ớc tính mỗi năm tại Việt Nam có khoảng 150 - 200

nghìn người phát hiện bị ung thư, trong đó 70.000 trường hợp tử vong.

Trước tình hình đó, việc nghiên cứu và phát triển các thuốc mới chống

lại ung thư luôn là mối quan tâm hàng đầu của ngành công nghiệp dược phẩm

thế giới và Việt Nam. Tuy nhiên, quá trình nghiên cứu phát triển thuốc nói

chung và các thuốc điều trị ung thư nói riêng hiện nay vẫn chủ yếu dựa trên

các phương pháp kinh điển hay phương pháp “thử và lỗi” với nhược điểm là

tốn thời gian, tiền bạc và cho hiệu quả thấp [22]. Ngoài ra, các thuốc điều trị

ung thư hiện đang gặp rất nhiều vấn đề liên quan đến độc tính và tỷ lệ kháng

thuốc cao. Do đó yêu cầu cấp bách đặt ra là phải nghiên cứu và phát triển

thuốc chống ung thư mới, có tác dụng chọn lọc trên đích phân tử nhằm phát

huy tối đa hiệu quả, lâu bị kháng và ít độc hơn.

Histon deacetylase (HDAC) là một trong những đích phân tử được ch

hiện nay, enzym này x c tác cho quá trình deacetyl hoá nhóm -N acetyl

lysine amino acid ở phần đuôi của histon. Người ta đã chứng minh được trong

nhiều tế bào ung thư có sự huy động quá mức các enzym HDAC, gây nên

hiện tượng giảm sự acetyl hoá của histon. Các chất ức chế HDAC có thể ngăn

chặn quá trình này thông qua việc làm thay đổi biểu hiện gen gây ung thư hay

các gen ức chế khối u do gây cường acetyl hóa các protein histone [32]. Hiện

nay người ta đã biết đến 18 loại HDAC khác nhau, chia thành 4 nhóm, trong

đó HDAC2 thuộc nhóm I được đánh giá là một đích phân tử quan trọng do có

vai trò trong quá trình deacetyl hoá của các histon H3K56 và H4K16 xảy ra

trong hầu hết các dòng tế bào ung thư người [7,10].

Quá trình nghiên cứu tìm kiếm chất ức chế HDAC nhằm phát triển

thành thuốc chống ung thư đã kéo dài hơn một thập kỷ [43]. Các mô hình liên

quan mối quan hệ cấu trúc – tác dụng dược lý xuất hiện từ năm 1868, được

biết đến là mô hình toán học định lượng mối liên quan tác dụng dược lý và

cấu trúc hóa học của hợp chất hay còn gọi là QSAR. Xây dựng mô hình

QSAR để dự đoán hoạt tính của những phân tử chưa từng được kiểm tra. Từ

đó gi p tìm kiếm các hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, tối ưu hóa cấu

tr c các hợp chất này nhằm tăng hoạt tính sinh học, giảm độc tính, tăng các

tính chất dược động học của thuốc. Phương pháp này nhìn chung nhanh có

tính kinh tế và hỗ trợ rất tốt cho các nghiên cứu thực nghiệm, giúp nâng cao

tỷ lệ thành công của nghiên cứu.

Từ các vấn đề nêu trên, mục tiêu chung của nghiên cứu này là “Xây dựng

mô hình toán học giúp nhận biết chất ức chế enzym histon deacetylase 2 có

tác dụng chống ung thư”. Với mục tiêu cụ thể:

- Xây dựng mô hình QSAR mới sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính

nhằm dự đoán khả năng ức chế HDAC2.

- Đánh giá mô hình xây dựng được theo các tiêu chí của Tổ chức kinh tế

thế giới (OECD).

- Vận dụng mô hình xây dựng được xác định hợp chất dẫn đường tiềm

năng ức chế HDAC2 phát triển thành thuốc chữa ung thư.

Chƣơng 1- TỔNG QUAN

1.1. Thực trạng ung thƣ và tử vong do ung thƣ

1.1.1. Thực trạng ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới

Ung thư là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên

toàn thế giới. Trong năm 2012, có khoảng 14 triệu trường hợp ung thư được

phát hiện mới và có đến 8,2 triệu ca tử vong liên quan đến ung thư [40].

Trong đó, số lượng các ca tử vong do các ung thư chủ yếu là: ung thư phổi

(1,59 triệu ca), ung thư gan (745000 ca), ung thư dạ dày (723000 ca), ung thư

đại trực tràng (694000 ca), ung thư v (521000 ca), ung thư thực quản

(400000 ca) [40].

Số lượng các ca ung thư mới được dự đoán sẽ tăng khoảng 70% trong

vòng hai thập kỉ tới. Dự đoán số trường hợp ung thư hàng năm sẽ tăng từ 14

triệu trong 2012 lên 22 triệu trong vòng hai thập kỉ tới [2]. Hơn 60% số các ca

ung thư mới hàng năm trên thế giới xảy ra ở Châu Phi, Châu Á, Trung và

Nam Mỹ, chiếm 70% số các ca tử vong ung thư thế giới [40].

Đối với nam giới, 5 ung thư phổ biến nhất được chẩn đoán trong năm

2012 là ung thư phổi, tuyến tiền liệt, đại trực tràng, dạ dày và gan. Đối với nữ

giới, 5 ung thư phổ biến nhất được chẩn đoán là ung thư v , đại trực tràng,

phổi, cổ tử cung, dạ dày.

Khoảng 30% các trường hợp tử vong liên quan đến ung thư là do 5 yếu

tố nguy cơ hàng đầu về hành vi và chế độ ăn uống: chỉ số khối cơ thể cao (béo

phì), ăn ít rau quả tươi, ít tập thể dục, nghiện thuốc lá hoặc rượu. Thuốc lá là

yếu tố nguy cơ quan trọng nhất đối với ung thư, gây ra hơn 20% các ca tử

vong ung thư và khoảng 70% các ca tử vong do ung thư phổi trên toàn cầu.

Ngoài ra, các bệnh nhiễm virus HBV, HCV và một số type Human Papilloma

Virus (HPV) là nguyên nhân của trên 20% số các ca tử vong ung thư ở các

nước thu nhập thấp và thu nhập trung bình [12].

1.1.2. Thực trạng ung thư và tử vong do ung thư ở Việt Nam

Ở Việt Nam, trong năm 2012, số lượng các ung thư gặp phổ biến ở nam

giới là gan 16.815 ca, phổi 16.082 ca, dạ dày 9.406 ca, đại trực tràng 4.561 ca

và mũi họng 3.301 ca; còn các ung thư gặp phổ biến ở nữ giới là: vú 11.067

ca, phổi 5.783 ca, gan 5.182 ca, cổ tử cung 5.146 ca và dạ dày 4.797 ca [39].

Ở Việt Nam, tổng số ca tử vong do ung thư năm 2012 là 91.600 ca,

trong đó: số nam giới tử vong do ung thư là 58.200 ca: ung thư gan chiếm

26,9%, phổi 24,4%, dạ dày 14,5%, miệng - thực quản 5,8%, đại trực tràng

5,2% và do ung thư khác là 23,2%; số nữ giới tử vong do ung thư là 33.400

ca: ung thư phổi chiếm 14,5%, gan 13,7%, v 12,5%, dạ dày 12,1%, đại trực

tràng 8% và do ung thư khác là 39,3% [39].

1.2. Thuốc điều trị ung thƣ

Ngày nay có nhiều phương pháp điều trị ung thư, gồm có phẫu thuật,

vật lí trị liệu (xạ trị liệu), hóa trị liệu (dùng thuốc điều trị ung thư), nội tiết,

miễn dịch [1]. Tuy nhiên áp dụng phương pháp nào để điều trị có hiệu quả

còn tuỳ thuộc vào giai đoạn, vào sức chịu đựng của cơ thể, vào khả năng của

cơ sở điều trị và một phần vào kinh nghiệm của thầy thuốc chuyên khoa.

Từ khi bắt đầu tiến triển, ung thư đã có thể cho di căn, do đó các

phương pháp điều trị tại chỗ và tại vùng như phẫu thuật và xạ trị thường

không mang lại hiệu quả. Sử dụng các thuốc điều trị ung thư đặc biệt là các

hóa chất chống ung thư có thể ngăn chặn được tiến triển của ung thư. Hóa

chất chống ung thư đều là những chất gây độc tế bào. Ch ng can thiệp vào

phân bào theo các cách khác nhau, ví dụ như sự sao chép DNA hay quá trình

phân chia các nhiễm sắc thể mới được tạo thành [1]. Điều trị hóa chất dựa trên

sự đáp ứng khác biệt nhau giữa tế bào ung thư và tế bào lành. Đặc trưng tăng

trưởng của ung thư có ảnh hưởng rất lớn đến đáp ứng với hóa trị. Các hiểu

biết về động học tế bào, sự tăng trưởng của khối u, sinh học ung thư là căn

bản cho các nguyên tắc hóa trị lâm sàng.

Có khoảng hơn 200 loại thuốc chống ung thư trên lâm sàng [1]. Theo

cơ chế hoạt động, các thuốc chống ung thư được phân loại như bảng 1.1 [1].

Bảng 1.1. Các nhóm thuốc chống ung thư

Nhóm tác nhân Mục tiêu Cấu trúc hóa học

Các tác nhân ngăn

chặn tổng hợp DNA

bằng alkyl hóa có

nguồn gốc tổng hợp

(các tác nhân alkyl

hóa)

Liên kết chéo DNA Nitrogen mustard

Ethyle limin

Sulfonic acid ester

Epoxide

Nitrosourea

Halogenated hexitol

Hợp chất platinum

Kháng sinh kháng u Xen giữa DNA làm đứt gãy

DNA

Anthracyclin,

Actinomycin D,

Mitomycin C,

Bleomycin

Các kháng chuyển

hóa

Sinh tổng hợp acid nhân Các kháng acid Folic,

kháng Purin, kháng

Pirimidin, các ức chế

tổng hợp protein và acid

amin

Các ức chế giai

đoạn gián phân hình

thoi

Ngăn cản hình thức thoi

trong kì gián phân

Alkaloid nhóm vinca

Podophylin

Colchicin

Hỗn hợp Không xác định Alkylamin (HMM,

PMM)*

Dacarbazin

Procarbazin

Các Taxane Làm đông cứng các vi quản

nội tế bào

Taxol, Taxotere

Các camptothecin Ức chế men topoisomerasa I Camptothecin, CPT - 11

Các hormone Androgen

Estrogen

Steroid

Progestin

Các thuốc tác dụng lên tuyến

yên

Antiandrogen

Estrogen Antiestrogen

Antisteroid

* HMM: Hexamethylmelamine

PMM: Pentamethylmelamine

1.3. Tổng quan histon deacetylase

1.3.1. Khái niệm histon deacetylase

Nhiễm sắc thể là phức hợp gồm 3 thành phần: ADN, protein histon và

protein không phải histon [21]. Đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể là

nucleosom. Mỗi nucleosom gồm 146 cặp base ADN được gói trong một

protein histon octame [16] tạo bởi 4 thành phần: H2A, H2B, H3, H4 [13].

Các đầu amino của protein histon thường bị biến đổi bởi các quá trình

methyl hóa, phosphoryl hóa hoặc acetyl hóa sau dịch mã. Quá trình acetyl hoá

là một trong những cơ chế điều hoà chính của biểu thị gen. Kiểm soát quá

trình biểu thị gen này phụ thuộc vào sự cân bằng giữa hoạt động của enzym

histon acetylase và enzym histon deacetylase, nhờ vào sự điều hoà quá trình

acetyl hoá lysin ở phần đuôi histon [6].

Histon acetyltrasferase (HAT) là enzym acetyl hóa nhóm -NH2 trong

gốc lysin (đầu N tận) của histon, làm trung hòa điện tích dương trên lysin, do

đó giảm khả năng tương tác của histon với ADN (tích điện âm) tạo cấu trúc

mở chromatin. Vì vậy, sự acetyl hóa histon tạo điều kiện cho quá trình phiên

mã, dịch mã xảy ra (hình 1.1b) [6,21].

Histon deacetylase (HDAC) là enzym có tác dụng đối lập với HAT.

HDAC loại bỏ nhóm acetyl từ acetyl lysin (Ac-Lys) ở đầu N tận của histon,

làm đóng xoắn chromatin, do đó ức chế quá trình phiên mã (Hình 1.1) [6,21].

Hình 1.1. Cấu trúc nhiễm sắc thể điều hòa hoạt động phiên mã. (a) Sự

methyl hóa và deacetyl hóa histon dẫn tới hình dạng đóng xoắn nhiễm sắc thể

và ức chế phiên mã. (b) Sự acetyl hóa và demethyl hóa histon làm tháo xoắn

nhiễm sắc thể và cho phép phiên mã.

1.3.2. Phân loại các HDAC

Hiện nay người ta đã biết đến 18 loại HDAC khác nhau, được chia

thành 4 nhóm: I, II, III, IV. HDAC nhóm I, II và IV được gọi là các HDAC

“kinh điển” và thường được sử dụng để sàng lọc và thiết kế các chất ức chế

HDAC mới [43].

Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8. Các enzym này có ở

phần nhân của nhiều loại tế bào.

Nhóm II: gồm nhóm IIa và nhóm IIb. Trong đó nhóm IIa có HDAC4,

HDAC5, HDAC7, HDAC9, nhóm IIb có HDAC6, HDAC10. Các enzym này

biểu thị mô đặc trưng, có khả năng di chuyển giữa bào tương và nhân.

Nhóm III: Các protein điều hoà chuỗi thông tin 2 (SIRT): SIRT 1 – 7,

chúng có ở bào tương, ty thể và nhân.

Nhóm IV: HDAC11, có ở phần nhân của nhiều loại tế bào.

Các enzym nhóm I, II và IV phụ thuộc vào Zn2+

. Nhóm III là các

enzym có cấu trúc phụ thuộc NAD+

[11,43].

Trung tâm hoạt động HDAC gồm 2 phần chính (Hình 1.2): ion Zn2+

là

coenzyme của HDAC và kênh enzym dạng túi hình ống. Cấu trúc rất linh

động, có thể biến đổi phù hợp với chiều dài cơ chất khác nhau. Trên miệng túi

có một vành nhỏ được tạo nên từ một vài vòng xoắn protein, phần vành này

sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt HDAC [18].

Hình 1.2. Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV.

1.3.3. HDAC2 và vai trò trong ung thư

Histon deacetylasa 2 (HDAC2) thuộc HDAC nhóm I. HDAC2 hoạt

động như một chất ức chế phiên mã thông qua loại bỏ nhóm lysine ở đầu N

của protein histon (H2A, H2B, H3 và H4). Tuy nhiên HDAC2 không liên kết

với ADN nên chúng sẽ được chọn lọc bởi các yếu tố phiên mã như YY1,

SP1/SP3, gen ức chế khối u p53 và BRCA1. HDAC2 cũng có thể được gắn

vào ADN như là một phần của phức hợp CoREST, mSin3 và NuRD. Những

phức hợp là mục tiêu với các trình tự gen đặc hiệu bằng các tương tác với các

yếu tố phiên mã trình tự đặc hiệu. Ví dụ, các HDAC2/HDAC1 chứa phức hợp

Sin3-SAP chọn lọc họ E2F của các yếu tố phiên mã để ức chế phiên mã [17].

Phức hợp chứa HDAC2 cũng liên quan đến gen điều chỉnh phiên mã

qua thụ thể trung gian. Những phức hợp chứa gen biến đổi biểu sinh khác,

chẳng hạn như MeCp2 – là một protein có nhóm liên kết methyl. Các enzyme

vận chuyển nhóm methyl DNA DNMT1, DNMT3A và DNMT3B, sự methyl

transferases histone SUVAR39H1 và G9a và histon bị bỏ đi nhóm methyl

(LSD1), cho thấy một cách khác mà HDAC2 quy định biểu hiện gen và sửa

chữa nhiễm sắc.

HDAC2 cũng quy định biểu hiện gen thông qua sự deacetyl của yếu tố

phiên mã cụ thể bao gồm STAT3 và SMAD7. HDAC2 là một chìa khóa quan

trọng của gen điều hòa chu kỳ tế bào, quá trình tế bào tự tiêu diệt, kết dính tế

bào và di cư. Cùng với HDAC1, HDAC2 quy định việc phiên mã của các gen

liên quan đến quá trình tạo máu, biệt hóa tế bào biểu mô, phát triển tim và tế

bào thần kinh [34].

Các đột biến có thể có ở HDAC2 xuất hiện ở tế bào soma. HDAC2 bị

đột biến trong các khối u lẻ tẻ và trong các khối u phát sinh ở người có ung

thư biểu mô đại trực tràng không polyp di truyền. Đột biến này do sự cắt bỏ 9

adenin ở exon1 tạo thành protein không hoạt động. Sự biểu hiện các dạng đột

biến của HDAC2 gây ra sự kháng với tác dụng của các chất ức chế HDAC.

Việc thiếu các biểu hiện và chức năng HDAC2 tạo nên sự tăng điều chỉnh gen

th c đẩy tăng trưởng khối u [5,25].

HDAC2 liên quan đến nhiều bệnh ung thư khác nhau:

Việc điều hòa về biểu hiện hoạt động HDAC2 có liên quan đến sự phát

triển ung thư. HDAC2 biểu hiện quá mức trong các loại ung thư khác nhau

bao gồm cả đại tràng, dạ dày, cổ tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi

không tế bào nhỏ và ung thư biểu mô tế bào gan. HDAC2 biểu hiên quá mức

liên quan đến ung thư một phần thông qua việc chọn lọc sai lầm của nó và sự

im lặng của các gen ức chế khối u. Sự ức chế của gen p21WAF1 ức chế khối

u ở vùng khởi động và có thể được đảo ngược bởi việc điều trị bằng thuốc ức

chế HDAC [31]. Biểu hiện HDAC2 tương quan với tiên lượng xấu khi bệnh ở

giai đoạn tiên triển trong ung thư đại trực tràng, tuyến tiền liệt, dạ dày và biểu

mô tế bào gan.

Ung thư đại tràng: Có một số nghiên cứu cho thấy HDAC2 biểu hiện

quá mức trong ung thư đại tràng. Sự gia tăng các biểu hiện HDAC2 đã được

tìm thấy ở mức độ protein và mRNA chỉ ra rằng HDAC2 quá mức là do hoạt

hóa phiên mã. Các nghiên cứu cho thấy trong loại khối u này sự phiên mã

HDAC2 được điều chỉnh bởi tín hiệu beta-catenin-TCF-myc đã bị xóa bỏ

trong bệnh ung thư đại tràng. HDAC2 biểu hiện quá mức tương quan với tiên

lượng xấu và bệnh ở giai đoạn tiến triển trong ung thư đại trực tràng. Tuy

nhiên, Ropero và các cộng sự tìm thấy một sự đột biến bất hoạt của HDAC2

trong ung thư đại tràng với bất ổn microsatellite [29].

Ung thư v : Các nghiên cứu khác nhau cho thấy vai trò quan trọng của

HDAC2 trong ung thư v . HDAC2 gây lão hóa trong tế bào ung thư v . Hơn

nữa sự mất hoạt tính của HDAC2 kéo theo quá trình chết tế bào (apoptosis)

của tamoxifen trong estrogen/ progesterone tế bào ung thư v dương tính

[27].

Bệnh ung thư tuyến tiền liệt: Theo nghiên cứu của Weichert và các

cộng sự thấy rằng HDAC2 được biểu hiện mạnh mẽ trong hơn 70% các

trường hợp phân tích ung thư tuyến tiền liệt. Sự gia tăng trong biểu hiện

HDAC2 có liên quan với tăng cường tăng sinh tế bào khối u [5].

Ung thư biểu mô tế bào gan: HDAC2 quy định chu kỳ tế bào và sự

phân chia của HDAC2 gây ra ngừng chuyển pha G1/S trong chu kỳ tế bào.

Trong quá trình chuyển đổi G1/S, sự phân chia đích của HDAC2 có tính

chọn lọc gây ra các biểu hiện của p16 (INK4a) và p21 (WAF1/Cip1), và đồng

thời ức chế sự biểu hiện của cyclin D1, CDK4 và CDK2. Do đó, sự ức chế

HDAC2 dẫn đến sự giảm điều chỉnh của gen đích E2F/DP1 thông qua việc

giảm sự phosphoryl hóa protein PRB [5].

Ung thư phổi: HDAC2 được điều chỉnh lên cao trong ung thư phổi.

HDAC2 bất hoạt dẫn đến thoái hoá tăng trưởng tế bào khối u và kích hoạt các

quá trình chết tế bào (apoptosis) qua p53, kích hoạt Bax và ức chế BCL2.

Trong điều chỉnh chu kỳ tế bào, HDAC2 bất hoạt gây ra cảm ứng biểu hiện

p21WAF1/Cip1, đồng thời ức chế sự biểu hiện của cyclin E2, cyclin D1, và

CDK2, tương ứng. Do đó, điều này dẫn đến việc giảm quá trình phosphoryl

hóa của protein PRB trong chuyển pha G1/S và do đó bất hoạt phiên mã gen

đích E2F/DP1 của các tế bào A549. HDAC2 trực tiếp điều chỉnh biểu hiên

p21WAF/Cip1 không phụ thuộc p53 [5].

Bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD): giảm hoạt động và biểu hiện

HDAC2 được tìm thấy trong bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD). Việc

giảm hoạt động của HDAC2 làm tăng điều hòa các gen liên quan đến phản

ứng viêm và kháng corticosteroid trong COPD [5].

1.3.4. Các chất ức chế HDAC

Yoshida và cộng sự (1990), đã phát hiện ra dẫn chất hydroxamat tự

nhiên đầu tiên có tác dụng ức chế trực tiếp HDAC là Trichostatin A (TSA),

vốn là chất có tác dụng chống nấm [41]. Sau đó, dựa trên hiểu biết về mối liên

quan giữa HDAC và ung thư đồng thời xác định được cấu trúc 3D của các

HDAC, một số chất ức chế HDAC đã được nghiên cứu và thử nghiệm trên

lâm sàng để ứng dụng trong điều trị ung thư. Cho đến nay, nhiều chất ức chế

HDAC (UHDAC) đã được công bố. Chúng có thể có nguồn gốc tự nhiên hay

tổng hợp. Trong các nhóm chất ức chế HDAC, các acid hydroxamic là nhóm

chất được quan tâm chú ý và tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Do các acid

hydroxamic có cấu tr c đơn giản, dễ tổng hợp và có nhóm -NHOH tạo được

phức bền với Zn+ ở trung tâm hoạt động của HDAC mang lại có hoạt tính ức

chế enzym mạnh. Hiện nay, FDA đã phê duyệt một acid hydroxamic UHDAC

điển hình là vorinostat (suberoylanilide hydroxamic acid, Zolinza) vào năm

2006 sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào [cutaneous T-cell lymphoma

(CTCL)]. Một hợp chất UHDAC khác là depsipeptide (romidepsin, Istodax)

cũng được FDA cấp phép lưu hành vào năm 2009 để điều trị CTCL và điều

trị ung thư hạch tế bào T ngoại vi [peripheral T-cell lymphoma (PTCL)]. Đây

chính là nguồn động lực để các nhà nghiên cứu tiếp tục tìm kiếm các chất ức

chế HDAC mới. Nhiều chất ức chế enzym HDAC khác cũng đang được thử

nghiệm lâm sàng nhằm phát triển liệu pháp điều trị ung thư dựa trên đích này,

bao gồm nhóm hydroxamat, benzamid, peptid vòng, acid carboxylic (Bảng

1.2) [4,30].

Bảng 1.2. Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm lâm sàng.

Nhóm Hợp chất Pha Loại ung thƣ

Acid carboxylic Butyrat

AN-9 (tiền thuốc)

Acid valproic

Phenyl butyrate

I, II

I, II

I, II

I

Ung thư đại tràng

Thể rắn, NSCLC

Thể rắn, ung thư máu, AML,

MDS, CTCL, u trung biểu

mô

Thể rắn, AML/MDS

Acid hydroxamic SAHA

PXD101

NVP-LAQ824

LBH-589

ITF-2357

SB-939

CRA 024781

JNJ-16241199

Đã c/m

I, II

II

I

II, III

II

I

I

I

CTCL

Thể rắn, ung thư máu

Ung thư máu

Thể rắn, ung thư máu

Thể rắn, AML, ALL,

MDS

U lympho Hodgkin

Thể rắn, ung thư máu

Các benzamid SNDX-275

(MS-275)

CI-994

MGCD-0103

I, II

I, II

II

Thể rắn, u lympho, AML, u

hắc sắc tố ác tính di căn tiến

triển

Thể rắn, NSCLC, tế bào

thận, tuỵ

Thể rắn, ung thư bạch cầu,

MDS

Peptid vòng Depsipeptid

(FK228)

I, II Thể rắn, CLL, AML, CTCL,

u đa tuỷ xương, NHL tế bào

T ngoại vi, RAI kháng

thyroid, ung thư đại tràng

tiến triển

Trong đó:

NSCLC (Non-Small Cell Lung Cancer) : Ung thư phổi không tế bào nhỏ

AML (Acute Myeloid Leukemia): Bệnh bạch cầu myeloid cấp tính

MDS (Myelodysplastic Syndrome ): Hội chứng rối loạn sinh tủy

CTCL (Cutaneous T Cell Lymphoma): U lympho tế bào T da

NHL (non-Hodgkin's lymphoma): Ung thư hạch không Hodgkin

RAI (Radioactive iodine): Iod phóng xạ

Tuy nhiên, mỗi nhóm nêu trên đều có những hạn chế nhất định như:

các acid hydroxamic bị chuyển hoá nhanh, ức chế không chọn lọc lên các loại

enzym HDAC; các benzamid và acid béo có hiệu lực kém; các peptid vòng

khó tạo thành về mặt hoá học và FK-228 có phần gắn kết với ion Zn2+

chứa

thiol [26].

1.3.5. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thư do tác động lên

nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong

tế bào ác tính. Trong đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung

thư của ch ng là th c đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và th c đẩy

sự chết tế bào. Ngoài ra, hoạt hóa đáp ứng miễn dịch và ức chế sự tạo

mạch cũng là vai trò rất quan trọng của các UHDA, gián tiếp ức chế sự

phát triển của các khối u. Ngoài ra các chất ức chế HDAC ngăn cản các đuôi

histon có nhóm acetyl tiến đến vị trí xúc tác [7,9].

Vai trò sinh học của HDAC và các nghiên cứu về các chất UHDA cho

thấy nó là một mục tiêu quan trọng cần hướng tới trong điều trị ung thư. Do

đó, việc tìm kiếm các hợp chất mới có tiềm năng ức chế HDAC là một hướng

đi nhằm tìm kiếm các hợp chất mới với khả năng ức chế cao hơn, ít độc tính

hơn đang là một hướng đi được nhiều nhà khoa học quan tâm [21].

1.4. Tổng quan phƣơng pháp QSAR

1.4.1. Lịch sử QSAR

Lịch sử phát triển của phương pháp QSAR có thể nói khởi nguồn từ

những nghiên cứu của Crum-Brown và Frasher (1868) khi nhận xét rằng tác

dụng sinh học là hàm số của cấu trúc hóa học. Đến năm 1893, Richet đã cho

rằng sự khác nhau về tác dụng sinh học là do sự thay đổi về tính chất lí hóa.

Đến năm 1935, một phương trình quan trọng của Hammett được coi là mô

hình đầu tiên biểu diễn mối quan hệt hoạt tính và cấu trúc:

Log

Với K, Ko là hằng số acid, là hằng số Hammett, thông số hóa l đặc

trưng cho khả năng h t hoặc đấy điện tử của nhóm thế.

QSAR thực sự được nghiên cứu bởi C.L. Corwin Hansch từ

những năm 60 của thế kỉ 20. Mô hình QSAR Hansch thường sử dụng phương

pháp hồi quy tuyến tính đa biến để biểu thị mối tương quan giữa các tham số

hóa lí và hoạt tính sinh học, ví dụ một phương trình của ông như sau:

Log (1/C) = k1+ k22+ k3

Trong đó: C là nộng độ mol mà tại đó hoạt chất thể hiện hoạt tính sinh

học, : hằng số kỵ nước, : hằng số thế Hammett, k1,k2,k3 là các hệ số hồi

quy.

Kể từ đây, đã có nhiều phương trình QSAR cùng với những phương

pháp xây dựng đa dạng đã ra đời và chiếm một vai trò quan trọng trong

nghiên cứu và phát triển dược phẩm.

1.4.2. Đại cương về QSAR

Về mặt toán học, mô hình QSAR (Quantitative Structure-Activity

Relationships) biểu diễn mối tương quan định lượng giữa cấu trúc phân tử và

hoạt tính thông qua phương trình:

Y = f(x1) + f(x2) + ... + f(xn) (1.4.2)

Trong đó, Y là biến phụ thuộc, phản ánh hoạt tính sinh học của các hợp

chất. Giá trị của Y được xác định thông qua các nghiên cứu thực nghiệm, ví

dụ như nồng độ ức chế 50% hoạt tính của enzym (IC50), MIC (Minimum

Inhibitory Concentration): nồng độ ức chế tối thiểu, hay nồng độ kìm khuẩn

tối thiểu (dùng trong vi sinh); MBC (Minimum Bactericidal Concentration):

nồng độ diệt khuẩn tối thiểu; EC 50 (Effective Concentration): nồng độ 50%

tác dụng tối đa... Y cũng có thể nhận giá trị rời rạc, ví dụ như có hay không có

hoạt tính, hoạt tính mạnh hay yếu. Các biến x trong mô hình QSAR được gọi

là các tham số phân tử (TSPT), mô tả một đặc điểm cấu tr c nào đó của phân

tử hóa học. Hàm f là một hàm mô tả mối tương quan giữa Y và các biến x. Để

xây dựng được hàm f, cần áp dụng các thuật toán thống kê (statistical) hoặc

học máy (machine learning). Một số kỹ thuật thống kê thường được sử dụng

trong xây dựng mô hình QSAR có thể kể đến như bình phương tối thiểu từng

phần (Partial Least Squares), hồi quy đa biến tuyến tính (Multiple Linear

Regression), phân tích thành phần chính (Principal Component Analysis).

1.4.3. Quy trình xây dựng mô hình QSAR

Các bước để xây dựng mô hình QSAR [19] gồm:

1) Xây dựng cơ sở dữ liệu (CSDL); 2) Tính toán tham số mô tả phân tử đặc

trưng cho cấu trúc; 3) Xây dựng mô hình QSAR: Sử dụng các phương pháp

xác suất thống kê và các kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ

giữa các tham số phân tử (TSPT) và các giá trị đại lượng biểu diễn hoạt tính;

4) Đánh giá mô hình; 5) Giải thích các kết quả và sử dụng mô hình trong quá

trình sàng lọc ảo (nếu có thể).

Xây dựng cơ sở dữ liệu: CSDL thường là cấu trúc của các hợp chất

hoá học đã được chứng minh hoạt tính sinh học in vitro. Để hạn chế các yếu

tố gây sai số cho mô hình, CSDL thường sẽ được làm sạch dựa trên sự tương

đồng về cấu trúc, về protocol,...

Tính toán tham số mô tả phân tử đặc trưng cho cấu trúc:

Tham số mô tả phân tử là một số thu được từ một quá trình toán học và

lôgic chuyển đổi thông tin được mã hóa trong cấu trúc hóa học [37]. Trong

nghiên cứu này, các tham số được tính toán sử dụng phần mềm Dragon [37].

Xây dựng mô hình QSAR: sử dụng các phương pháp xác suất thống kê

và các kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ giữa các TSPT và

giá trị đại lượng biểu diễn hoạt tính.

Đánh giá mô hình: Đánh giá mô hình là giai đoạn quan trọng liên quan

đến khả năng ứng dụng của mô hình. Đánh giá mô hình thường sử dụng 5

nguyên tắc của OECD [28].

- Nguyên tắc 1: Có đích xác định (defined end-points).

Đích là những giá trị thực nghiệm về hoạt tính sinh học thu được từ

CSDL. Nếu toàn bộ CSDL đều sử dụng một protocol để xác định giá trị của

đích, thì mô hình xây dựng được có độ tin cậy cao, có thể dùng để dự đoán

hoạt tính các hợp chất mới (nếu thực nghiệm dùng theo quy trình này). Còn

nếu CSDL sử dụng nhiều protocol khác nhau thì mô hình sẽ không có độ tin

cậy cao.

- Nguyên tắc 2: Các thuật toán sử dụng được mô tả rõ ràng.

Các thuật toán sử dụng để xây dựng mô hình cần được mô tả rõ ràng,

có khả năng ứng dụng để xây dựng các mô hình khác.

- Nguyên tắc 3: Có miền cấu trúc ứng dụng xác định.

Miền cấu trúc ứng dụng là khoảng không gian cấu tr c được xác định

bởi các hợp chất trong tập huấn luyện để xây dựng mô hình. Những hợp chất

thuộc tập huấn luyện nếu có cấu trúc nằm ngoài miền cấu trúc ứng dụng sẽ

ảnh hưởng đến độ chính xác của mô hình. Những hợp chất thuộc tập dự đoán,

nếu có cấu trúc nằm ngoài miền này sẽ cho kết quả dự đoán không chính xác.

Các phương pháp xác định miền ứng dụng thường gặp như: phương pháp đòn

bẩy, phương pháp ba lân cận gần nhất,...

- Nguyên tắc 4: Có độ khớp, độ ổn định, và khả năng dự đoán tốt.

Độ khớp hay độ tuyến tính được đánh giá thông qua giá hệ số xác định

R2, R

2 càng cao thì mức độ khớp (tuyến tính) của mô hình với các giá trị thực

nghiệm càng tốt. R2> 0,6 thì mô hình mới có nghĩa. Công thức tính hệ số

xác định như sau:

R2 = 1-

∑ ^

ii yy

∑ )( yyi

Trong đó n là số các quan sát của tập huấn luyện; yi, iy^

, lần lượt là giá

trị thực tế, giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i; y là giá trị thực

tế trung bình của biến phụ thuộc.

Độ ổn định được đánh giá thông qua hệ số tương quan chéo Q2, Q

2

được đánh giá dựa trên phương pháp tham số chéo (cross validation leave one

out) bằng cách lần lượt loại 1 quan sát ra khỏi tập huấn luyện, giữ nguyên các

biến đã lựa chọn và tính toán lại các thông số của mô hình. Q2 càng gần 1,

tính tổng quát hóa của mô hình càng cao, mô hình càng ổn định. Thông

thường, yêu cầu Q2

> 0,5 thì mô hình mới bền vững. Công thức hệ số tương

quan chéo tính như sau:

Q2 = 1 -

∑ ^

/ iii yy

∑ )( yyi

Trong đó n là số các quan sát tập huấn luyện; yi, là giá trị thực tế của

quan sát thứ i; ^

/ iiy giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i sử dụng

mô hình đã loại biến i; y là giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc.

Khả năng dự đoán ngoại

Khả năng dự đoán ngoại được đánh giá thông qua giá trị Q2

ext, Q2

ext

càng lớn mô hình càng cho thấy độ tuyến tính của tập kiểm tra và do vậy

chứng tỏ khả năng dự đoán của mô hình cao.

2

extQ = 1 - ∑

^

ii yy

∑ )( yyi

Trong đó n là số các quan sát tập kiểm tra; yi,

^

y , lần lượt là giá trị thực

tế, giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i; y là giá trị thực tế

trung bình của biến phụ thuộc.

- Nguyên tắc 5: Giải thích được cơ chế (nếu có thể).

Mô hình cần được giải thích về vai trò của các biến trong mô hình, qua

đó gi p định hướng thiết kế các hợp chất mới. Tuy nhiên việc giải thích các

biến này nhiều khi gặp phải khó khăn vì cơ chế của chúng phức tạp đòi hỏi

những hiểu biết chuyên sâu về hóa lượng tử. Bên cạnh đó có nhiều biến chưa

có các tài liệu tham khảo, do đó chưa đủ cơ sở để giải thích.

Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Cơ sở dữ liệu

Cơ sở dữ liệu (CSDL): gồm 45 hợp chất ức chế HDAC2 lựa chọn từ dữ

liệu xây dựng bởi 6 bài báo khoa học đã công bố trước đó cùng với giá trị IC50

được xác định bằng phương pháp giống nhau (sử dụng Kit định lượng

Bioscence®) [8,14,15,24,36,38]. Công thức hóa học mô tả như hình 2.1 và

giá trị IC50 tương ứng được nêu trong bảng 2.1.

N

OO

O

NHOH

O

X

1. X=H2. X=Cl3. X=F4. X=Br5. X=H3C6. X=H3CO

N

OO

O

NHOH

O

Cl

(7)(1-6)

O

HN

NO

N OH

OH

X8. X=H9. X=F10. X=Cl11. X=Br12. X=H3C13. X=H3CO

O

HN OH

NO

N OH

Cl

(8-13) (14)

O

HN

NO

N O

CH3

OH

X

15. X=H16. X=F17. X=Cl18. X=Br19. X=H3C20. X=H3CO

O

HN OH

NO

N O

CH3

Cl

(15-20) (21)

HOHN

N

O

O2S

X

HOHN

N

O

O2S

OCH3

OCH322. X=H3CO24. X=F25. X=NO2

(22,24,25) (23)

HOHN

N

O

(26)

NO

HN

OH

O O

NO

HN

OH

O O

F

NO

HN

OH

O O

N

HN

O

HN

OH

O O

(27)

(29)(30)

(28)

N

OO

O

NHOH

O

X

31. X=H32. X=F33. X=Cl34. X=Br35. X=NO236. X=H3C37. X=H3CO

N

OO

O

NHOH

OCl

(31-37) (38)

N

SS

O

NHOH

O

N

SS

O

NHOH

O

H3C

N

HN

NHOH

O

O

O

HN

NHOH

O

O

HN

HN

NHOH

O

OHN

NHOH

O

O

HN

NHOH

O

O

(39) (40)

(41) (42)

(43) (44)

(45)

Hình 2.1. Cấu trúc hóa học của 45 dẫn xuất của acid hydroxamic thu thập

được.

Bảng 2.1. Giá trị IC50 thực nghiệm của 45 hợp chất trong CSDL.

STT IC50

(µM)

STT IC50

(µM)

STT IC50

(µM)

STT IC50

(µM)

STT IC50

(µM)

1 0,308 10 0.116 19 0.175 28 0.310 37 0.120

2 0,284 11 0.152 20 0.254 29 0.190 38 0.150

3 0,891 12 0.086 21 1,399 30 0.192 39 0.320

4 0,460 13 0.120 22 0.3618 31 0.160 40 0.260

5 0,358 14 0.179 23 0.002 32 0.060 41 2,457

6 0,870 15 0.117 24 0.199 33 0.030 42 1,987

7 1,779 16 0.447 25 0.189 34 0.030 43 2,015

8 0.116 17 0.472 26 0.381 35 0.080 44 0.105

9 0.152 18 0.267 27 0.270 36 0.160 45 5.784

2.1.2. Phần mềm sử dụng

Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm:

1. ChemDraw phiên bản 10.0 2. Dragon 6.0

3. Mobydigs 1.0 4. Microsoft Excell 2007

5. STATISTICA 10.0

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Tính toán tham số mô tả phân tử

Tham số mô tả phân tử là kết quả của một quá trình toán học và logic

chuyển đổi thông tin được mã hóa trong cấu trúc hóa học thành một số có khả

năng đặc trưng cho phân tử đấy [37]. Để thực hiện tính toán, tất cả các cấu

trúc của CSDL được chuyển đổi thành hệ thống đơn giản hóa với đầu vào

được biểu diễn dưới dạng dòng SMILES (Simplified Molecular Input Line

Entry System) bằng việc sử dụng phần mềm ChemDraw phiên bản 10.0 [33].

Căn cứ vào các mã code, hơn 2000 mô tả phân tử thuộc họ 0D, 1D và 2D

được tính toán bằng phần mềm Dragon phiên bản 6.0 [3].

2.2.2. Phân chia tập huấn luyện / Tập kiểm tra

Sau khi tính toán mô tả phân tử, CSDL được chia ngẫu nhiên thành tập

huấn luyện (Tr - training set) và tập kiểm tra (Te – test set). Tập huấn luyện

(chiếm 75% CSDL) được sử dụng cho việc xây dựng (huấn luyện) mô hình.

Tập huấn luyện cho phép phát hiện mối quan hệ có khả năng dự đoán. Còn

tập kiểm tra bao gồm các phân tử mà mô hình chưa bao giờ gặp được sử dụng

để đánh giá độ mạnh và khả năng ngoại suy của các mô hình xây dựng được.

2.2.3. Xây dựng mô hình QSAR

Tập huấn luyện gồm 75% số hợp chất trong CSDL được lựa chọn ngẫu

nhiên để xây dựng mô hình QSAR. Các hợp chất còn lại được xếp vào tập

kiểm nghiệm để đánh giá mô hình. Các mô hình được xây dựng bằng các

phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính (MLR) sử dụng phần mềm

STATISTICA 10.0, lựa chọn TSPT bằng phương pháp thuật giải di truyền

(Genetic algorithm) sử dụng phần mềm Mobydigs 1.0, sau đó đánh giá để lựa

chọn mô hình tốt nhất.

2.2.4. Sàng lọc và dự đoán hoạt tính một số dẫn xuất HDAC2 sử dụng mô

hình QSAR đã xây dựng được

Dựa trên công thức hóa học của một chất đã có tác dụng ức chế

HDAC2 mạnh là SAHA (Suberoylanilide hydroxamic acid hay còn gọi là

Vorinostat), chúng tôi tìm kiếm và dự đoán hoạt tính cho các hợp chất có tính

tương đồng về cấu trúc với SAHA mà chưa được nghiên cứu tác dụng ức chế

HDAC2. Để làm được điều này, chúng tôi tiến hành sàng lọc dựa trên 2 bước:

- Bước 1. Lấy SAHA làm khuôn, tìm kiếm trên CSDL PubChem các hợp

chất có tính tương đồng cao về cấu trúc với SAHA, sử dụng công cụ “tìm

kiếm đồng dạng” (Similarity searching) tích hợp trên CSDL PubChem:

Dán công thức SMILES của SAHA vào thanh công cụ tìm kiếm. Sau đó

chọn tiêu chí tương đồng, sử dụng tùy biến hệ số Tanimoto ≥ 0,85. Kết

quả thu được dãy các dẫn xuất của hydroxamic, lựa chọn các hợp chất

chưa từng được nghiên cứu tác dụng ức chế HDAC2.

- Bước 2. Tính toán TSPT cho các hợp chất được lựa chọn và sử dụng mô

hình QSAR đã xây dựng được để dự đoán hoạt tính cho chúng.

Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả

3.1.1. Mô hình toán học thu được

Mô hình QSAR là mô hình biểu thị mối liên hệ định lượng giữa cấu

trúc và hoạt tính của các hợp chất. Mô hình QSAR được biểu diễn dưới dạng

một phương trình toán học (1.4.2). QSAR sử dụng các TSPT, các kỹ thuật xác

suất thống kê và trí tuệ nhân tạo để xây dựng các mô hình. QSAR được xây

dựng dựa trên giả thuyết là cấu trúc của một phân tử phải chứa những đặc

điểm cấu trúc liên quan tới tính chất hóa học, vật lý, sinh học và dựa trên khả

năng các mô tả phân tử. Bởi các mô hình QSAR, hoạt tính sinh học của một

phân tử mới hoặc chưa được kiểm nghiệm có thể được suy ra từ cấu trúc của

các hợp chất tương tự trong đó tính chất của ch ng đã được kiểm nghiệm

[37].

Phương pháp QSAR xây dựng các mô hình toán học nhằm dự đoán

hoạt tính của các hợp chất dựa trên cấu trúc hóa học của chúng, là các kỹ

thuật nhằm dự đoán các kết quả trước khi các thử nghiệm được tiến hành

trong phòng thí nghiệm. QSAR cung cấp thông tin dự đoán về kết quả có thể

có của một thử nghiệm nào đó và khả năng mới này cung cấp các yếu tố liên

quan để thiết lập thứ tự ưu tiên cho một chất mới cho các thử nghiệm [35].

Như vậy, để có thể xây dựng được các mô hình này thì cả cấu trúc và

hoạt tính đều phải được định lượng hóa. Trong nghiên cứu này, các cấu trúc

được định lượng thông qua các TSPT (biến x), biến Y là giá trị logIC50 với

IC50 là nồng độ ức chế 50% hoạt tính của enzym HDAC2, được đánh giá bằng

các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm sử dụng Kit định lượng

Bioscence®). Giá trị logIC50 thu được bằng cách xử lí dữ liệu IC50 bằng phần

mềm Microsoft Excell 2007. IC50 càng nhỏ hoạt tính ức chế enzym HDAC2

của chất đó càng mạnh.

- Tính toán TSPT: Tham số mô tả phân tử là một số thu được từ một

quá trình toán học và lôgic chuyển đổi thông tin được mã hóa trong cấu trúc

hóa học [37]. Trong nghiên cứu này, các tham số được tính toán sử dụng phần

mềm Dragon [37]. Dragon là một phần mềm được phát triển bởi công ty

Talete của Italia vào năm 1993, được sử dụng rất rộng rãi hiện nay trong các

nghiên cứu hóa tin và thiết kế thuốc. Dragon tính toán được hơn 5000 TSPT

khác nhau . Các mô tả phân tử thường được phân loại dựa vào chiều thông

tin mô tả cấu trúc. (i) Tham số 0D mô tả thành phần cấu tạo nên cấu trúc, còn

được gọi là các tham số đếm nguyên tử, như số lượng C, N... (ii) Tham số 1D

mô tả cấu tr c dưới dạng chuỗi, như vân tay cấu trúc (fingerprint), hay số

lượng các mảnh cấu tr c, như số lượng nhân thơm, nhóm carboxylic... (iii)

Tham số 2D mô tả cấu tr c dưới dạng hình học topo, cho phép xác định chính

xác thứ tự, vị trí của nguyên tố hay mảnh cấu trúc trong phân tử. Các tham số

2D thường được tính toán dựa trên lý thuyết về graph. (iii) Tham số 3D mô tả

đặc điểm cấu trúc của phân tử trong không gian. Các tham số 3D có thể được

tính toán dựa trên các phương pháp l thuyết như MoRSE, GETAWAY, tính

toán lượng tử, mô tả bề mặt hoặc thể tích phân tử...

Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn tham số phân tử 2D để mô tả

cấu trúc các hợp chất. Bởi so với các mô tả phân tử 3D thì mô tả phân tử 2D

không cần tới các thông tin về cấu trúc 3D của phân tử, có tính ổn định cao

hơn do các hợp chất được mô tả dưới dạng 3D thường có độ linh động về cấu

dạng.

Kết quả: Sử dụng phần mềm Dragon 6.0 tính toán được 3764 TSPT cho

mỗi phân tử trong CSDL. Sau khi xử lí loại bỏ TSPT gây nhiễu, 1632 TSPT

còn lại được kiểm tra quan hệ phi tuyến với biến đáp ứng LogIC50. Cuối cùng

các hợp chất được tính toán với 534 TSPT 2D và lưu dưới dạng file.txt.

- Phân chia tập huấn luyện / tập kiểm tra

Sử dụng phương pháp phân chia ngẫu nhiên chia 45 hợp chất trong

CSDL thành 34 hợp chất được phân vào tập huấn luyện, 11 hợp chất được

phân vào tập kiểm tra.

- Xây dựng mô hình: Lựa chọn tham số phân tử bằng phương pháp

thuật giải di truyền sử dụng phần mềm Mobydigs 1.0. Sau đó xây dựng mô

hình QSAR trên tập huấn luyện bằng phương pháp MLR sử dụng phần mềm

STATISTICA 10.0 để xác định tương quan hoạt tính ức chế với tham số mô

tả phân tử Dragon.

Lựa chọn TSPT thích hợp: tất cả các biến không phải được đưa

hết vào mô hình. Mặc dù việc thêm biến độc lập vào làm tăng hệ số tương

quan R2, nhưng nó chỉ tốt khi chúng có liên hệ mạnh với biến phụ thuộc. Mô

hình được chọn ứng với mô hình có Q2 cao nhất. Thực hiện thuật giải di

truyền để chọn mô hình có các biến tối ưu bằng phần mềm Mobydigs 1.0.

Thuật giải di truyền dựa trên cơ chế của chọn lọc tiến hóa trong tự

nhiên: “Trong mọi thế hệ, một tập mới các sinh vật được tạo ra bằng cách lai

ghép những nhân tố thích hợp nhất với môi trường của những sinh vật trong

thế hệ cũ cùng với sự xuất hiện đột biến ngẫu nhiên của các cá thể trong thế

hệ mới”. Vận dụng cơ chế này, đầu tiên thuật toán sẽ mã hoá tất cả các tham

số của cấu tr c ban đầu trong một nhiễm sắc thế - biểu diễn bằng một vec tơ.

Từ nhiễm sắc thể ban đầu này, tạo ngẫu nhiên một quần thể. Quần thể này

được đánh giá và từ đó các nhiễm sắc thể thích nghi nhất (tức là có hàm mục

tiêu Q2

cao nhất) được chọn làm khung để tạo ra quần thể tiếp theo. Quy trình

này làm tăng Q2 của toàn bộ nhiễm sắc thể bằng cách truyền các đặc tính cấu

trúc thuận lợi từ một quần thể này sang một quần thể khác. Sau một số chu kỳ

tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng ta sẽ tìm được một nhiễm sắc thể (mô hình)

phù hợp với giá trị Q2 cao nhất.

Các bước thực hiện thuật giải di truyền:

(1). Khởi tạo một quần thể ban đầu (file đầu vào được lưu dưới dạng

file.mdd chứa các dữ liệu về tên, các mô tả phân tử được tính toán bằng phần

mềm Dragon 6.0, giá trị log IC50 của các hợp chất trong tập huấn luyện).

(2). Xác định hàm mục tiêu (fitness) cho mỗi cá thể trong quần thể.

Hàm mục tiêu trong nghiên cứu này là giá trị Q2.

(3). Tạo ra quần thể mới bằng cách lai ghép chéo (crossver) từ các cá

thể hiện tại có chọn lọc (selection), đồng thời tạo ra các đột biến (mutation)

trong quần thể mới theo một xác suất nhất định. Quá trình này thực hiện

thông qua cài đặt giải thuật di truyền (Genetic Algorithm set up).

(4). Các cá thể trong quần thể mới được sinh ra thay thế cho các cá thể

trong quần thể cũ.

(5). Nếu điều kiện dừng, giải thuật dừng lại và trả về cá thể tốt nhất

cùng với giá trị hàm mục tiêu của nó.

Kết quả đã lựa chọn được 6 tham số mô tả phân tử có thể xây dựng mô

hình tốt nhất. Đó là ATS8m, JGI10, SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm),

SM09_AEA(dm), B06[N-O].

Lập mô hình với số biến đã chọn bằng phương pháp hồi qui đa

biến tuyến tính (MLR) bằng phần mềm STATISTICA 10.0. MLR là một

trường hợp rất phổ biến trong thực tế, là tổ hợp tuyến tính giữa các biến phụ

thuộc (Y) với nhiều biến độc lập (x). Trong nghiên cứu này x chính là các

TSPT đặc trưng cho cấu trúc các hợp chất trong CSDL, Y là giá trị logIC50

với IC50 là nồng độ ức chế 50% hoạt tính của enzyme HDAC2. Phân tích hồi

qui bao hàm cả nghĩa “ước tính” (Estimating) hay “dự đoán” (Predictive) vì

sau khi sự tương quan tuyến tính giữa x và Y được thiết lập bởi một biểu thức

toán học cụ thể người ta có thể ước tính hay dự đoán giá trị của Y từ một giá

trị của x. Đường biểu diễn biểu thức toán học ấy được gọi là đường hồi qui

của Y theo x.

Kết quả mô hình MLR xây dựng được gồm 6 biến TSPT như sau:

LogIC50 = 2.808 + 0.064×ATS8m – 230.167×JGI10 –

1.072×SM15_AEA(bo) – 2.821×SM08_AEA(dm) +

3.519×SM09_AEA(dm) – 0.700×B06[N-O]

(3.1)

Trong đó ATS8m, JGI10, SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm),

SM09_AEA(dm), B06[N-O] là các biến tham số phân tử 2D. Hệ số của biến

mang dấu (+), giá trị biến TSPTcàng lớn thì logIC50 càng lớn, IC50 càng lớn

chứng tỏ hoạt tính ức chế enzyme HDAC2 của chất đó càng nhỏ. Và ngược

lại, hệ số biến mang dấu (-), giá trị biến TSPTcàng lớn thì logIC50 càng nhỏ,

IC50 càng nhỏ, hoạt tính ức chế enzyme HDAC2 càng lớn.

3.1.2. Đánh giá mô hình theo các tiêu chí của OECD

Đánh giá mô hình QSAR là công việc quan trọng nhất quyết định việc

mô hình xây dựng được có thể sử dụng để dự đoán sàng lọc hay không. Để sử

dụng và được thông qua mô hình QSAR bởi các cơ quan quản lý, mô hình

phải thỏa mãn các nguyên tắc, tiêu chí của OECD (Tổ chức kinh tế thế giới):

Tiêu chí 1: Toàn bộ CSDL đều sử dụng đích xác định là nồng độ ức

chế 50% (IC50) enzym HDAC2 được tiến hành theo cùng một điều kiện thí

nghiệm là sử dụng Kit định lượng Bioscence®.

Tiêu chí 2: Thuật toán áp dụng rõ ràng: Các phương pháp xây dựng mô

hình trong nghiên cứu chúng tôi đã nêu rõ trong mục 2.2. Do tính rõ ràng và

đ ng đắn của phương pháp mà mô hình có thể được sử dụng lặp lại để phát

hiện các hợp chất mới ức chế HDAC2.

Tiêu chí 3: Xác định miền ứng dụng của mô hình.

Để đạt được khả năng dự đoán tốt trong sàng lọc ảo, việc xác định được

miền ứng dụng của mô hình QSAR là vô cùng cần thiết. Miền ứng dụng là

khoảng không gian cấu trúc bao gổm trong mô hình. Chỉ những dự đoán đối

với các hợp chất có cấu trúc nằm trong miền cấu trúc này mới đáng tin cậy.

Miền ứng dụng được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa phần dư

chuẩn (Standardized Residual) và giá trị “đòn bẩy” (Leverage) (ký hiệu là h)

tính được cho từng hợp chất. Biểu đồ dưới đây (Hình 3.1) cho thấy mối quan

hệ giữa phần dư chuẩn và giá trị h. Chỉ số h cho biết một chất có ảnh hưởng

tới không gian cấu trúc của biến như thế nào. Giá trị giới hạn của h gọi là h*,

h* là một ngưỡng quan trọng để tham chiếu các dự đoán bởi mô hình QSAR

cho hợp chất trong Tr và Te được tính toán theo công thức: h* = 3p/N, trong

đó p là số biến độc lập trong mô hình (3.1), N là số lượng quan sát trong tập

huấn luyện. Miền ứng dụng được xác định là phần giới hạn bởi khung vuông

± 3 phần dư chuẩn đối và h* bằng 0.6.

Hình 3.1. Miền ứng dụng của mô hình QSAR xác định hợp chất có khả năng

ức chế HDAC2.

Sau khi tính toán tập huấn luyện, ta thấy 34/34 hợp chất đều nằm trong

miền ứng dụng. Với tập kiểm tra, toàn bộ 11 hợp chất đều nằm trong miền

ứng dụng, do đó có thể thấy các dự đoán của mô hình đối với tập kiểm tra là

hoàn toàn đáng tin cậy.

Tiêu chí 4: Kết quả các đánh giá nội và ngoại được trình bày trong

bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá nội và đánh ngoại mô hình QSAR.

Thông số R2

Q2

Q2

ext

Giá trị thực tế 0,89 0,81 0,85

Ta có R2 ~ 1,0 chứng tỏ độ chính xác của mô hình cao, Q

2 = 0,81 cho

thấy mô hình có độ ổn định tốt. Khả năng dự đoán nội 88,85% và khả năng

dự đoán ngoại 84,64% cho thấy mô hình có khả năng dự đoán hoạt tính tốt.

Như vậy mô hình thoả mãn các tiêu chí đánh giá nội và ngoại về độ

chính xác, độ ổn định và khả năng dự đoán tốt.

Tiêu chí 5: Giải thích cơ chế của mô hình.

Mô hình QSAR có sự tham gia của 6 biến, là các tham số phân tử 2D.

Tham số phân tử 2D biểu diễn các cấu tr c theo kích thước, độ phân nhánh,

và hình dạng tổng thể.

Các tham số phân tử 2D trong mô hình bao gồm ATS8m, JGI10,

SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm), SM09_AEA(dm), B06[N-O]. Trong đó:

ATS8m: mô tả tự tương quan Moreau-Broto (ATS) đại diện cho các

tương tác giữa các nguyên tử ở khoảng cách topo 8, (lag 8) theo khối lượng

nguyên tử. Giá trị này dương, hệ số của tham số mang dấu (+) chứng tỏ sự có

mặt của các nguyên tử khối lượng càng lớn càng làm tăng tương tác và càng

giảm hoạt tính ức chế.

JGI 10: Chỉ số topo trung bình cụm 10. Hệ số của tham số này mang

dấu (+), vì vậy giá trị này càng cao càng làm giảm hoạt tính.

Các tham số SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm), SM09_AEA(dm)

thuộc nhóm mô tả Edge adjacency indices. Việc giải thích các biến này gặp

phải khó khăn vì cơ chế của chúng phức tạp đòi hỏi những hiểu biết chuyên

sâu về hóa lượng tử. Bên cạnh đó chưa có nhiều tài liệu tham khảo, do đó

chưa đủ cơ sở để giải thích.

B06[N-O] = 1 hoặc 0 nếu có mặt hoặc không có mặt khoảng cách

giữa 2 nguyên tử Nitơ và Oxi là 6 liên kết (C-C). Hệ số B06[N-O] mang dấu

(-) do đó nếu giá trị này bằng 1 sẽ làm tăng hoạt tính ức chế.

Như vậy mô hình thỏa mãn các tiêu chí đánh giá của OECD, do đó có

thể ứng dụng mô hình này để ứng dụng vào dự đoán hoạt tính sinh học của

các hợp chất thiết kế.

3.1.3. Sàng lọc ảo đánh giá khả năng ức chế HDAC2 sử dụng mô hình xây

dựng đƣợc

Nghiên cứu sử dụng phương pháp sàng lọc các hợp chất ức chế

HDAC2 sử dụng mô hình sàng lọc ảo. Hệ thống sàng lọc được định hướng

phát triển theo các bước như hình 3.2 dưới đây.

Hình 3.2. Tóm tắt quy trình sàng lọc in silico chất ức chế HDAC2 từ

CSDL PubChem.

- Sàng lọc sử dụng tìm kiếm đồng dạng trên CSDL PubChem:

PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) một CSDL miễn phí về

các cấu trúc hóa học, đặc tính và vai trò sinh học của các hợp chất hóa học và

các chất nói chung. Các hợp chất có nguồn gốc từ khoảng hơn 80 nhà cung

cấp, với khoảng 31 nghìn hợp chất. PubChem giúp tìm kiếm nhanh chóng

các hợp chất hóa học dựa vào các phương pháp tìm kiếm theo sự tương

đồng về cấu trúc. PubChem chứa thông tin về tên, tên gọi khác, các tính chất:

cấu trúc hóa học, tên đoạn, cấu trúc hóa học, khối lượng phân tử, logP, và các

liên kết cho và nhận hydrogen.

Để tìm kiếm trên PubChem, "structural query input" có thể là

PubChem Identifier (CID – tên định danh trong PubChem), SMILES, Inchi.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi dùng SAHA là cấu trúc truy vấn. Bởi trong

các nhóm chất ức chế histon deacetylase (HDAC), các acid hydroxamic là

nhóm chất được quan tâm chú ý và tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Do các

acid hydroxamic có cấu tr c đơn giản, dễ tổng hợp và có nhóm -NHOH tạo

được phức bền với Zn+ ở trung tâm hoạt động của HDAC mang lại có hoạt

Tìm kiếm đồng dạng

Hợp chất ức chế HDAC2

QSAR

CSDL PubChem

tính ức chế enzym mạnh. Trên thực tế, FDA đã phê duyệt một acid

hydroxamic UHDAC điển hình là vorinostat (suberoylanilide hydroxamic

acid, Zolinza) vào năm 2006 sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào

[refractory cutaneous T-cell lymphoma (CTCL)]. Chính vì vậy SAHA được

lựa chọn là cấu trúc truy vấn (chất mẫu), được sử dụng để sàng lọc các hợp

chất có cấu tr c tương tự. Các chất này có cấu tr c tương tự SAHA hy vọng

có tính chất hoặc hoạt tính sinh học giống SAHA.

Kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng là kỹ thuật tìm kiếm các hợp chất có cấu

trúc tương tự với hợp chất mẫu (SAHA) trên CSDL (Pubchem) về cấu trúc

của các hợp chất. Kỹ thuật được tiến hành dựa trên nguyên tắc tương tự, theo

đó những phân tử có cấu trúc tương tự nhau thường có đặc tính và hoạt động

sinh học tương tự nhau. Các hợpchất được xếp hạng dựa trên sự tương đồng

với chất mẫu. Độ tương đồng của một chất với chất mẫu có thể phản ánh khả

năng có hoạt tính của chất đó.

Hệ số Tanimoto (Còn được gọi là hệ số Jaccard) là hệ số tương đồng

được sử dụng để biểu diễn sự giống nhau giữa các chất của CSDL được sàng

lọc và chất mẫu rộng rãi nhất trong hóa tin. Hệ số này được tính toán dựa trên

công thức:

Hệ số Tanimoto =

Trong đó: là Số lượng các đặc tính xuất hiện trong cấu trúc A

là Số lượng các đặc tính xuất hiện trong cấu trúc B

NC là Số lượng các đặc tính xuất hiện trong cả 2 cấu trúc A và B

Sau khi tiến hành sàng lọc trên PubChem với dữ liệu đầu vào là công

thức SMILES của SAHA thu được một dãy các dẫn chất hydroxamics có hệ

số tương đồng Tanimoto ≥ 0.85. Lựa chọn ra 120 hợp chất chưa được nghiên

cứu về tác dụng ức chế HDAC2. Đặc điểm các chất được nêu trong Phụ lục.

- Sau đó tính toán tham số phân tử cho các hợp chất được lựa chọn với

các TSPT 2D là ATS8m, JGI10, SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm),

SM09_AEA(dm), B06[N-O] bằng phần mềm Dragon 6.0. Tiếp theo sử dụng

mô hình QSAR đã xây dựng được (3.1) để dự đoán hoạt tính cho chúng. Số

liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excell 2007. Kết quả tính toán

TSPT và dự đoán hoạt tính được nêu trong Phụ lục.

- Từ kết quả sàng lọc này, chọn 10% các hợp chất có IC50 thấp nhất,

được nêu trong bảng 3.2 dưới đây.

Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc ảo từ cơ sở dữ liệu PubChem.

STT Mã CID

(PubChem)

Cấu trúc IC50

dự đoán

(μM)

1 58624316

0.032781

2 20721667

0.0213922

3 85697302

0.012845

4 44359800

0.0231520

5 42637850

0.0326886

6 54753628

0.042486

7 14496775

0.0387043

8 0.0395340

0.0395340

9 88254626

0.003744

10 21302179

0.0380004

11 54077290

0.0240224

12 90889464

0.0044032

13 70232351

0.003756

14 4953736

0.0331159

SAHA

0.265

Như vậy so với SAHA, là một chất ức chế HDAC2 mạnh, đã được ứng

dụng trong lâm sàng, các hợp chất sàng lọc được trên CSDL PubChem có

hoạt tính ức chế HDAC2 cao hơn rất nhiều. Các hợp chất này là các

hydroxamics có cấu tr c tương đồng với SAHA > 85%. Do đó các hơp chất

này hoàn toàn có thể tổng hợp được và có nhiều tiềm năng phát triển thành

thuốc chống ung thư.

Trong nghiên cứu này, mô hình QSAR xây dựng được giúp phát hiện

các hợp chất mới có tiềm năng ức chế HDAC2 chỉ dựa trên thông tin cấu trúc

phân tử. Mô hình in silico này có vai trò rất quan trọng trong việc sàng lọc

nhanh và hiệu quả các hợp chất mới ngay cả khi ch ng chưa được tổng hợp

hay phân lập giúp tiết kiệm thời gian, tiền bạc trong quá trình nghiên cứu,

phát triển thuốc chống ung thư.

3.2. Bàn luận

3.2.1. Về mô hình QSAR

QSAR hiện nay đang là một kỹ thuật được ứng dụng trong rất nhiều

các lĩnh vực như dược phẩm, y học, hóa học… Kỹ thuật này sử dụng các

TSPT, các kỹ thuật xác suất thống kê và trí tuệ nhân tạo để xây dựng các mô

hình. Mô hình xây dựng bằng phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính, lựa

chọn tham số phân tử bằng giải thuật di truyền. Phương pháp này gi p tối ưu

hóa mô hình nhằm tìm ra mô hình biểu thị tốt nhất mối quan hệ giữa biến đáp

ứng là các tham số phân tử.

Mô hình QSAR xây dựng được gồm 6 TSPT 2D. Tham số 2D mô tả

cấu tr c dưới dạng hình học topo, cho phép xác định chính xác thứ tự, vị trí

của nguyên tố hay mảnh cấu trúc trong phân tử. Mô tả phân tử 2D không cần

tới các thông tin về cấu trúc 3D của phân tử, có tính ổn định cao hơn do các

hợp chất được mô tả dưới dạng 3D thường có độ linh động về cấu dạng. Tuy

nhiên, do không kết hợp phương pháp protein docking trong xây dựng mô

hình QSAR nên không thu được thông tin cấu dạng, không xác định được cơ

chế tương tác giữa các chất và enzyme HDAC2.

Bên cạnh đó xây dựng mô hình QSAR còn môt số hạn chế như CSDL

thu thập được từ 6 bài báo khác nhau, do đó có thể gặp sai số trong xây dựng

mô hình QSAR; việc giải thích các biến TSPT đôi khi gặp phải khó khăn vì

cơ chế của chúng phức tạp đòi hỏi những hiểu biết chuyên sâu về hóa lượng

tử; bên cạnh đó chưa có nhiều tài liệu tham khảo, do đó chưa đủ cơ sở để giải

thích.

3.2.2. Về quy trình sàng lọc ảo.

Trong nghiên cứu này, tiến hành sàng lọc các hợp chất ức chế HDAC2

từ CSDL PubChem. Quá trình sàng lọc qua 2 bước cơ bản. CSDL PubChem

sau khi sàng lọc bằng phương pháp “Tìm kiếm đồng dạng” với hệ số đồng

dạng Tanimoto ≥ 0.85, dữ liệu đầu vào là cấu trúc dạng SMILE của SAHA.

Kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng là kỹ thuật tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc

tương tự với hợp chất mẫu (SAHA) trên CSDL (PubChem) về cấu trúc của

các hợp chất. Kỹ thuật được tiến hành dựa trên nguyên tắc tương tự, theo đó

những phân tử có cấu tr c tương tự nhau thường có đặc tính và hoạt động sinh

học tương tự nhau. Các hợpchất được xếp hạng dựa trên sự tương đồng với

chất mẫu. Độ tương đồng của một chất với chất mẫu có thể phản ánh khả

năng có hoạt tính của chất đó. Kết quả qua phương pháp “tìm kiếm đồng

dạng” là một dãy dẫn chất Hydroxamics có cấu tr c tương đồng với SAHA ≥

0.85. Lựa chọn 120 chất chưa được nghiên cứu về tác dụng ức chế enzym

HDAC2 tiếp tục sàng lọc qua mô hình QSAR xây dựng được nhằm dự đoán

nồng độ ức chế 50% HDAC2 (IC50). Từ đó tìm được các hợp chất có hoạt tính

ức chế HDAC2 dự đoán mạnh nhất có tiềm năng phát triển thành thuốc chống

ung thư.

Như vậy từ một CSDL lớn (hơn 31 nghìn chất) qua hệ thống sàng lọc

này đã sàng lọc được một tập hợp nhỏ các hợp chất có tiềm năng ức chế

enzym HDAC2. Phương pháp này giúp ích nhiều cho việc phát hiện các hợp

chất mới có hoạt tính sinh học ngay cả trước khi ch ng được tổng hợp hay

phân lập. Từ đó gi p tiết kiệm rất nhiều thời gian và công sức và tiền bạc cho

các khâu của quá trình nghiên cứu và phát triển một thuốc mới.

Bên cạnh những ưu điểm trên,mô hình sàng lọc ảo cũng còn gặp một

số khó khăn như không tiến hành sàng lọc qua Docking nên không xác định

khả năng tương tác của hợp chất sàng lọc với enzyme HDAC2, không tìm

hiểu được cơ chế ức chế HDAC2.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu đã trình bày trên đây ch ng tôi r t ra các

kết luận sau:

1. Nghiên cứu đã xây dựng thành công mô hình toán học biểu diễn mối quan

hệ định lượng giữa cấu trúc và tác dụng ức chế enzyme HDAC2 có phương

trình:

LogIC50 = 2.808 + 0.064×ATS8m – 230.167×JGI10 –

1.072×SM15_AEA(bo)– 2.821×SM08_AEA(dm) +

3.519×SM09_AEA(dm) – 0.700×B06[N-O]

2. Nghiên cứu đã đánh giá mô hình xây dựng được theo các nguyên tắc của

OECD với R2=0.89, Q

2= 0.81, khả năng dự đoán nội 88,85% và khả năng dự

đoán ngoại 84,64%. Như vậy mô hình thoả mãn các tiêu chí đánh giá nội và

ngoại về độ chính xác, độ ổn định và khả năng dự đoán tốt. Mô hình xây dựng

được có thể được ứng dụng để sàng lọc các CSDL lớn nhằm tìm kiếm các hợp

chất ức chế HDAC2.

3. Nghiên cứu đã sàng lọc được 120 hợp chất từ CSDL Pubchem, 14 trong

số đó có hoạt tính mạnh tương đương hoặc hơn SAHA, một thuốc ức chế

HDAC đang lưu hành trên thị trường. Đặc biệt, có 3 hợp chất mạnh hơn

SAHA 60 -70 lần và chưa từng được nghiên cứu tác dụng chống ung thư. Các

hợp chất này có tiềm năng phát triển thành thuốc chống ung thư mới.

KIẾN NGHỊ

Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu của khóa luận trong tìm

kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học ức chế HDAC2 cao, chúng tôi xin

đưa ra các đề xuất sau:

1. Nghiên cứu bằng phương pháp Docking phân tử để tìm hiểu cơ chế ức chế

HDAC2 của 14 hợp chất sàng lọc được.

2. Đánh giá hoạt tính sinh học ức chế HDAC2 của các hợp chất đó trên in

vitro.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Nguyễn Bá Đức (2001), "Bài giảng UNG TH HỌC", NXB Y Học.

Tài liệu Tiếng Anh

2. Anand P., Kunnumakkara A. B., Sundaram C., Harikumar K. B,

Tharakan S. T., Lai O. S. and Sung B. B. (2008), "Cancer is a

preventable disease that requires major lifestyle changes", Pharm Res

25(9), 2097 - 2116.

3. Andrea M., Viviana C., Manuela P. and Todeschini R. (2006),

"DRAGON SOFTWARE: an easy approach to molecular descriptor

and calculator", MATCH Commun. Math. Comput. Chem. 56, 237-248.

4. Andrianov V., Gailite V., Lola D., Loza E. and Semenikhina V.

(2009), "Novel amide derivatives as inhibitors of histone deacetylase:

design, synthesis and SAR", Eur J Med Chem. 44.

5. Bae H. and Nam S. W. (2014), "HDAC2 (histone deacetylase 2)", Atlas

Genet Cytogenet Oncol Haematol 18, 594-597.

6. Bernstein B. E. and Tong J. K. (2000), "Genomewide studies of histone

deacetylase function in yeast", Proc Natl Acad Sci U S A. 97(25),

13708-13.

7. Bertrand P. (2010), "Inside HDAC with HDAC inhibitors", Eur J Med

Chem. 45(6), 2095-116.

8. Chun P. (2011), "Synthesis and Importance of Bulky Aromatic Cap of

Novel SAHA Analogs for HDAC Inhibition and Anticancer Activity",

Bulletin of the Korean Chemical Society. 32(6), 1891-1896.

9. Chueh A. C. (2015), "Mechanisms of Histone Deacetylase Inhibitor-

Regulated Gene Expression in Cancer Cells", Antioxid Redox Signal.

23(1), 66-84.

10. Claude B. (2005), "Histone deacetylase inhibitors", Eur J Med Chem.

40, 1-13.

11. Dallavalle S., Cincinelli R., Vesci L. and Barbarino M. (2009),

"Design, synthesis, and evaluation of biphenyl-4-yl-acrylohydroxamic

acid derivatives as histone deacetylase (HDAC) inhibitors", Eur J Med

Chem, 1-13.

12. de Martel C., Ferlay J., Franceschi S., Vignat J., Bray F. and Forman D.

M. (2012), "Global burden of cancers attributable to infections in 2008:

a review and synthetic analysis.", The Lancet Oncology. 13(6), 607 -

615.

13. de Ruijter A. J., van Gennip A. H., Caron H. N. and Kemp S. (2003),

"Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical

HDAC family", Biochem J. 370(Pt 3), 737-49.

14. Do T. M. Dung (2015), "Novel 3-substituted-2-oxoindoline-based N-

hydroxypropenamides as Histone Deacetylase Inhibitors and Antitumor

Agents", Medicinal Chemistry. 11(8), 725-735.

15. Do Thi Mai Dung, Phan Thi Phuong Dung, Dao Thi Kim Oanh, Tran

Khac Vu, Hyunggu Hahn, Byung Woo Han, Minji Pyo, Young Guk

Kim, Sang-Bae Han and Nam, N.H. (2015), "Exploration of novel

5'(7')-substituted-2'-oxospiro[1,3]dioxolane-2,3'-indoline-based N-

hydroxypropenamides as histone deacetylase inhibitors and antitumor

agents", Arabian Journal of Chemistry.

16. Dokmanovic M. (2005), "Prospects: histone deacetylase inhibitors", J

Cell Biochem. 96(2), 293-304.

17. Edwardand C. (2000), "Histone deacetylase transcriptional control and

cancer", Journal of cenlular Physyology. 184(1), 1-16.

18. Eric V. (2006), "Histone Deacetylases Transcriptional Regulation and

Other Cellular Functions".

19. Han van de W. (1995), "Chemometric methods in molecular design",

New York: Wiley-VCH.

20. John J. I. and Shoichet B. K. (2005), "ZINC – A Free Database of

Commercially Available Cosmpounds for Virtual Screening", J Chem

Inf Model. 45(1).

21. Johnstone R. W.(2002), "Histone-deacetylase inhibitors: novel drugs

for the treatment of cancer", Nat Rev Drug Discov. 1(4), 287-299.

22. Kamb A., Wee S. and Lengauer C. (2007), "Why is cancer drug

discovery so difficult?", Nat Rev Drug Discov. 6(2), 115-120.

23. Kim S., Thiessen P. A., Bolton E. E., Chen J., Fu G., Gindulyte A., Han

L., He J., He S., Shoemaker B. A., Wang J., Yu B., and Zhang J.

(2016), "PubChem Substance and Compound databases", Nucleic Acids

Res. 44.

24. Lai M.J. (2012), "Synthesis and Biological Evaluation of 1-

Arylsulfonyl-5-(N-hydroxyacrylamide)indoles as Potent Histone

Deacetylase Inhibitors with Antitumor Activity in Vivo", Medicinal

Chemistry. 55(8), 3777–3791.

25. Lee Y. H., Seo D., Choi K. J., Andersen J. B., Won M. A., Kitade M.,

Gomez-Quiroz L. E., Judge A. D., Marquardt J. U., Raggi C,. Conner

E. A., MacLachlan I. and Factor V. M. (2014), "Antitumor effects in

hepatocarcinoma of isoform-selective inhibition of HDAC2", Cancer

Res. 74(17), 4752-61.

26. Marson C. M., Mahadevan T., Dines J., Sengmany S., Morrell J. M.,

Alao J. P., Joel S. P. and Vigushin D. M. (2007), "Structure-activity

relationships of aryloxyalkanoic acid hydroxyamides as potent

inhibitors of histone deacetylase", Bioorg Med Chem Lett. 17(1), 136-

41.

27. Müller B. M., Jana L., Kasajima A., Lehmann A., Prinzler J., Budczies

J., Winzer K. J., Dietel M. and Weichert W. (2013), "Differential

expression of histone deacetylases HDAC1, 2 and 3 in human breast

cancer - overexpression of HDAC2 and HDAC3 is associated with

clinicopathological indicators of disease progression", BMC Cancer.

13, 215-220.

28. Organisation for Economic Co-operation and Developme (2007),

"Guidance Document on the Validation of (Q)SAR Models ",

Environment directorate joint meeting of the chemicals committee and

the working party on chemicals, pesticides and biotechnology.

29. Pawan K. and Sasazuki T. (2008), "HDAC2 deficiency sensitizes colon

cancer cells to TNFα-induced apoptosis through inhibition of NF-κB

activity", Experimental Cell Research. 314(7), 1507–1518.

30. Pingyuan W., Zhiqing L. and Chen H. (2009), "Sulfamides as novel

histone deacetylase inhibitors", Bioorganic and Medicinal Chemistry

Letters. 17, 1123-1128.

31. Roperoand Santiago (2007), "The role of histone deacetylases

(HDACs) in human cancer", Molecular Oncology. 1, 19-25.

32. Roth S. Y. (2001), "Histone acetyltransferase", Annu.Rev.Biochem.

(120, 81-120e).

33. Stefan B., "Short Manual to the Chemical Drawing Program

ChemDraw®", IfC Department of Chemistry.

34. Sento E. and Glozak M. A. (2007), "Histone deacetylases and cancer",

Oncogene. 26, 5420-5432.

35. The Chemicals Committee and Working Party on Chemicals.(2004),

"OECD Principles for the Validation, for Regulatory Purposes, of

(Quantitative) Structure-Activity Relationship Models".

36. Thaler F. (2013), "Synthesis and biological characterization of

spiro[2H-(1,3)-benzoxazine-2,40-piperidine] based histone deacetylase

inhibitors", European journal of medicinal chemistry. 64, 273-84.

37. Todeschini R. and Consonni V. (2000), "Handbook of Molecular

Descriptors 1st", Federal Republic of Germany. 11.

38. Tran T.L. Huong. (2015), "Novel 2-oxoindoline-based hydroxamic

acids: Synthesis, cytotoxicity and inhibition of histone deacetylation",

Tetrahedron Letters Tetrahedron Letters. 56(16), 6425–6429.

39. WHO, "Cancer Country Profiles, Vietnam, 2014".

40. WHO (2014), "World Cancer Report".

41. Yoshida M., Kijima M., Akita M. and T, B. (1990), "Potent and

specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and

in vitro by trichostatin A", J Biol Chem. 265(28), 17174-9.

42. Zhang L., Fang H. and W X. (2010), "Strategies in developing

promising histone deacetylase inhibitors", Medicinal Research

Reviews. 30(4), 585-602.

43. Zhang L., Han Y. and Q J. (2015), "Trend of Histone Deacetylase

Inhibitors in Cancer Therapy: Isoform Selectivity or Multitargeted

Strategy", Medicinal research reviews. 35, 63-84.

PHỤ LỤC

Bảng . Sàng lọc CSDL Pubchem các hợp chất giống SAHA (Tanimoto similarity index ≥ 0.85), tính toán tham số

phân tử và dự đoán hoạt tính bằng mô hình (3.1)

ST

T

Cấu trúc

(https://pubchem.ncbi.nlm

.nih.gov/compound/)

Mã CID ATS

8m

JGI10 SM15_

AEA

(bo)

SM08_

AEA

(dm)

SM09_

AEA

(dm)

B06

[N-O]

IC50dự đoán

(μM)

1

10039224 2.865 0.003 1 -1 -1.282 0 0.4347064

2

58833044 2.94 0.006 1 -1 -1 0 0.6070787

3 s 87072389 2.784 0.006 1 -1.179 -1.385 0 0.1895215

4

71661014 2.616 0.005 0.532 -1.529 -1.796 0 0.2748285

5

46205431 2.882 0.007 1 -1.167 -1.333 0 0.1758513

6

53302622 2.992 0.008 1 -1 -1.3 0 0.0824400

7

9838671 2.887 0.007 1.049 -1.171 -1.373 0 0.1394253

8

59507279 2.887 0.005 1.049 -1.172 -1.414 0 0.2265910

9

88576450 2.865 0.007 1 -1 -1.178 0 0.1833417

10

66894183 2.711 0.008 0.726 -1.549 -1.806 0 0.0847290

11

24861500 4.074 0.004 1.532 0.347 0.111 0 1.0217461

12

58624316 2.683 0.008 1 -1.193 -1.62 0

0.032781

13

10516731 2.865 0.005 1 -1 -1.173 0 0.3659117

14

85697273 2.98 0.006 1.066 -1.169 -1.368 0 0.2061343

15

85697290 2.98 0.006 1.061 -1.164 -1.229 0 0.3832203

16

85697309 2.98 0.006 1.049 -1 -1.172 0 0.2664222

17

23075284

2.98 0.008 1.063 -1.166 -1.321 0

0.1298851

18

20721667 2.924 0.006 1.049 -1 -1.171 1 0.0213922

19

44456995 2.877 0.006 1 -1.172 -1.414 0 0.1726303

20

85697255 2.871 0.005 1.049 -1.172 -1.414 0 0.2240354

21

85697257 3.065 0.006 1.043 -1 -1 0 0.6242240

22

20721673 2.98 0.008 1.056 -1.149 -1.201 0 0.2119347

23

85697302 2.463 0.008 0.325 -1.766 -1.946 1

0.012845

24

23399147 3.065 0.009 1.064 -1.141 -1.185 0

0.1661152

25

14496776 2.378 0.007 0.608 -1.774 -1.94 0 0.1443687

26

57426850 2.199 0.007 0.181 -1.939 -2 0 0.3368304

27

70379132 2.348 0.007 0.349 -1.779 -1.948 0 0.2003737

28

44359674 2.865 0.003 1 -1 -1.282 0 0.4347064

29

44359673 2.94 0.006 1 -1 -1 0 0.6070787

30

44431491 2.932 0.008 1 -1 -1.3 0 0.0790071

31

59835569 2.952 0.006 1 -1 -1.349 0 0.1250892

32

56951447 4.01 0.01 1.584 -1 -1 0 0.1492143

33

23557326 2.865 0.006 1 -1.163 -1.358 0 0.2132279

34

52936399 2.935 0.004 1 -1 -1 0 1.1801555

35

44359800 2.875 0.01 1 -1 -1.414 0 0.0231520

36

85905437 2.995 0.004 1 -1 -1 0 1.2314345

37

85697276 3.065 0.007 1.075 -1 -1.171 0 0.1961748

38

42637850 2.679 0.008 1 -1.193 -1.62 0 0.0326886

39

24284701

2.88 0.006 1 -1 -1.353 0

0.1167208

40

14496777 2.593 0.004 0.731 -1.567 -1.799 0 0.3261645

41

14496778 2.69 0.003 0.879 -1.38 -1.63 0 0.4118330

42

564390 2.222 0.007 0.181 -1.939 -2 0 0.3423673

43

68394755 2.563 0.003 0.794 -1.597 -1.816 0 0.4245148

44

54753628 2.763 0.008 1 -1 -1.41 0

0.042486

45

71459490 2.982 0.006 1 -1 -1.325 0 0.1425234

46

46205757 3.121 0.007 1.049 -1 -1 0 0.4610862

47

56668788 3.001 0.005 1 -1 -1 0 0.8854045

48

44431497 3.06 0.006 1.03 -1 -1 0 0.6335470

49

52950298 3.763 0.006 1.733 0.958 0.606 0 0.2773072

50

71712264 3.267 0.005 1.414 -0.283 -0.586 0 0.2389080

51

89108892 2.964 0.006 1 -1 -1.349 0 0.1261578

52

88272607 2.964 0.006 1 -1 -1.349 0 0.1261578

53

11232029 3.01 0.006 1.049 -1 -1 0 0.5952860

54

71376590 2.94 0.006 1 -1 -1.171 0 0.2788060

55

88272608 2.955 0.006 1 -1 -1.349 0 0.1253555

56

44359788 2.795 0.007 0.81 -1.38 -1.598 0 0.1486498

57

85697281 3.065 0.006 1.074 -1 -1.17 0 0.2756449

58

85697284 3.065 0.006 1.088 -0.824 -1.17 0 0.1359989

59

9543542 3.111 0.005 1.354 -1 -1 0 0.5804522

60

54789249 2.845 0.006 1 -1 -1.39 0 0.0962167

61

54789247 2.935 0.007 1 -1 -1 0 0.4331006

62

68232694 2.796 0.009 1 -1.185 -1.34 0 0.0881255

63

14496779 2.779 0.004 1 -1.277 -1.414 0 0.4732568

64

19422086 2.351 0.007 0.349 -1.779 -1.948 0 0.2008003

65

17607862 2.387 0.009 0.242 -1.776 -1.944 0 0.1236229

66

24710930 2.496 0.004 0.525 -1.791 -1.949 0 0.4932942

67

71354457 2.935 0.005 1 -1 -1.133 0 0.4612942

68

23428 2.469 0.004 0.525 -1.791 -1.949 0 0.4839423

69

5196616 2.578 0.003 0.794 -1.597 -1.816 0 0.4290529

70

207164 2.754 0.004 1 -1 -1.414 0 0.1577748

71

14496775 2.082 0.012 0.438 -1.927 -2 0 0.0387043

72

42637654 2.189 0.007 0.181 -1.939 -2 0 0.3344511

73

57426849 2.017 0.012 -0.126 -2 0 0 977.4688919

74

46205758 3.164 0.007 1.049 -1 -1 1 0.0395340

75

54753629 3.016 0.005 1 -1 -1 0 0.8948695

76

16739374 3.149 0.007 1.21 -1 -1 0 0.3746286

77

44431493 3.003 0.007 1 -1 -1.102 0 0.2857221

78

44431496 3.069 0.006 1.03 -1 -1 0 0.6376020

79

56658395 3.239 0.004 1.242 -0.84 -1 0 0.5570702

80

59567106 2.904 0.008 0.821 -1.324 -1.389 0 0.2355086

81

102191201

2.882 0.007 1 -1.329 -1.414 0

0.2288591

82

88254626 2.964 0.007 1 -1 -1.502 1

0.003744

83

44415994 2.883 0.003 1 -1 -1.282 0 0.4402888

84

4119737

2.514 0.007 0.884 -1.656 -1.801 0 0.127857

85

54508233 3.075 0.004 1.262 -1 -1 0 0.9000322

86

91172933 2.772 0.006 1 -1.172 -1.414 0 0.1602474

87

81275 3.209 0.005 1.414 -0.235 -0.503 0 0.2773776

88

252600 3.153 0.002 1.404 -0.331 -0.82 0 0.2532248

89

4351049 3.221 0.006 1.028 -0.75 -0.77 0 0.7647220

90

15560754 3.093 0.006 1.388 -0.596 -1 0 0.0808510

91

21302179 2.789 0.007 1 -1 -1.512 0 0.0380004

92

54077290 3.022 0.006 1 -1 -1.176 1 0.0240224

93

58660950 3.004 0.006 1.155 -1 -1 0 0.5103040

94

90889464 2.816 0.009 1 -1.403 -1.642 1 0.0044032

95

3597078 2.914 0.006 1 -1 -1 0 0.5959920

96

3382807 3.052 0.004 1.01 -1 -1 0 1.2642211

97

17202535 3.064 0.006 1.024 -1 -1 0 0.6407555

98

17204914 2.985 0.005 1 -1 -1 0 0.8754187

99

36656244 2.803 0.011 0.731 -1.414 -1.55 0 0.0623897

100

70232351

2.862 0.008 1 -1 -1.412 1 0.003756

101

101030013 3.638 0.005 1.597 0.244 0.103 0 0.7060332

102

43125168 2.6 0.006 0.54 -1.536 -1.804 0 0.1906166

103

59838335 2.677 0.008 1 -1.193 -1.62 0 0.0326423

104

4518322 3.296 0.003 1.414 -0.147 -0.481 0 0.4512904

105

3833468 3.19 0.004 1.307 -0.537 -0.75 0 0.4694463

106

71344197 3.346 0.003 1.45 0.02 -0.298 0 0.5326504

107

71376591 2.586 0.003 0.794 -1.597 -1.816 0 0.4314930

108

65450231 2.697 0.005 0.804 -1.338 -1.61 0 0.2192940

109

71402929 3.282 0.003 1.414 -0.147 -0.481 0 0.4468337

110

89974472 2.689 0.008 0.726 -1.549 -1.806 0 0.0834179

111

89556224 2.444 0.004 0.525 -1.791 -1.949 0 0.4754412

112

203897 2.677 0.003 1 -1.313 -1.652 0 0.2395842

113

94794 2.849 0.004 1 -1 -1.139 0 0.5898757

114

3624549 2.767 0.004 1 -1 -1.414 0 0.1592355

115

4195216 2.925 0.003 1 -1 -1 0 1.6367313

116

20721653 1.982 0 -0.131 -2 0 0 52941.67496

10

117

4953736 2.655 0.009 0.706 -1.251 -1.681 0 0.0331159

118

1718311 2.746 0.006 0.709 -1.249 -1.406 0 0.3323904

119

13311491 2.692 0.003 1 -1.478 -1.69 0 0.3877590

120

102095300 2.93 0.005 1 -1 -1.133 0 0.4596620