Xác định rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật HPLC dùng detector UV - VIS

§¹I HäC QuèC GIA Hµ NéI

Trêng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn

-----------

TrÇn thÞ thanh nga

X¸c ®Þnh rhodamine trong thùc phÈm

b»ng Kü THUËT s¾c ký láng

HiÖu n¨ng cao hplc Sö DôNG DETETOR UV

LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc

Gi¶ng viªn híng dÉn: pgs.ts ph¹m luËn

Hà Nội - 2011

Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành phân tích

Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20

88

Môc lôc

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN .................................................................................... 3

1.1. Một vài nét về rhodamine B .................................................................. 3

1.1.1. Công thức cấu tạo ............................................................................ 3

1.1.2. Tính chất lý học ............................................................................... 3

1.1.3. Tính chất sinh học…………………………………………………..4

1.1.3. Ứng dụng .......................................................................................... 4

1.2. Các phƣơng pháp xác định rhodamine B ............................................ 5

1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký cổ điển - phƣơng pháp sắc ký giấy hay sắc

ký bản mỏng- TLC ....................................................................................... 7

1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................... 8

1.2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp

HPLC…………………...……………………………………………………..…8

1.2.2.2. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng…………10

1.2.2.3. Các kết quả nghiên cứu về rhodamine B bằng phƣơng pháp

HPLC...........................................................................................................11

1.2.3. Phƣơng pháp UV- Vis xác định rhodamine B ............................ 13

Chƣơng 2: ............................................................................................................ 14

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 14

2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ....................................... 14

2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu .................................................. 14

2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu ....................................................................... 14

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................ 15

2.2.1. Detector UV-Vis ............................................................................... 16

2.2.2. Phân tích định lƣợng bằng HPLC .................................................. 17

2.3. Hoá chất và dụng cụ trong nghiên cứu ................................................ 18

2.3.1. Hoá chất ............................................................................................ 18

2.3.2. Máy móc và thiết bị .......................................................................... 19

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 21



89

3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký ................................................................. 21

3.1.1 Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop) ............................................ 21

3.1.2. Chọn bƣớc sóng của detector .......................................................... 22

3.1.2.1. Phƣơng pháp 1........................................................................... 24

3.1.2.2. Phƣơng pháp 2........................................................................... 26

3.2. Chọn pha tĩnh .......................................................................................... 28

3.3. Tối ƣu hóa pha động ............................................................................... 30

3.3.1. Ảnh hƣởng của thành phần pha động tới khả năng tách sắc ký

.................................................................................................................. 30

3.3.1.1. Pha động thứ nhất ..................................................................... 31

3.3.1.2. Pha động thứ hai ....................................................................... 36

3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình tách sắc

ký……………………………………………………………………….………40

3.3.2.1. Pha động gồm 70% MeOH- 30% đệm ................................. 40

3.3.2.2.Pha động gồm 85% ACN- 15% đệm ........................................ 43

3.3.3. Ảnh hƣởng của các chất phụ ........................................................ 45

3.3.3.1. Ảnh hƣởng của trietylamin đối với hệ pha động gồm MeOH và

đệm...........................................................................................................45

3.3.3.2. Ảnh hƣởng của natri 1- heptansunfonat tới dung môi ACN

và đệm fomat có pH=3 ........................................................................... 48

3.3.4. Khảo sát tốc độ pha động .............................................................. 51

3.3.4.1. Hệ pha động MeOH – đệm ....................................................... 51

3.3.4.2. Hệ pha động ACN – đệm .......................................................... 53

3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích .......................................................... 57

3.4.1. Tổng kết các điều kiện đã chọn ....................................................... 57

3.4.2. Khảo sát lập đƣờng chuẩn trong khoảng nồng độ 0,01- 2,00ppm

với pha động ACN- Đệm ........................................................................... 57

3.4.3. Giới hạn phát hiện (limit of detection- LOD) ................................ 61

3.4.3.1. Phƣơng pháp tính toán theo đƣờng chuẩn ............................. 61

3.4.3.2. Phƣơng pháp trực tiếp .............................................................. 63

3.4.4. Giới hạn định lƣợng (limit of quanlity- LOQ) ............................ 64



90

3.4.5. Độ đúng của phép đo ..................................................................... 64

3.4.6. Độ lặp lại của phép đo ................................................................... 68

3.5. Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý và kết quả phân tích .... 69

3.5.1. Khảo sát dung môi chiết lấy Rhodamine B ................................... 69

3.5.1.1. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích ....................................................... 69

3.5.1.2. Chọn dung môi chiết ................................................................. 70

3.5.2. Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết .......................................... 74

3.5.2.1. Mẫu hạt dƣa............................................................................... 74

3.5.2.2. Mẫu bánh xu xê ......................................................................... 77

3.5.2.4. Mẫu siro dâu .............................................................................. 79

3.5.2.5. Mẫu nƣớc ngọt hƣơng dâu ....................................................... 80

KẾT LUẬN ......................................................................................................... 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 85

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

1 HPLC High performance

liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng

cao

2 UV Vùng tử ngoại

3 Vis Vùng khả kiến

4 ADN Acid dedonucleoic

5 LC- MS Sắc ký lỏng khối phổ

6 SPE Cột chiết pha rắn

7 TLC Sắc ký bản mỏng

8 MSD Detectơ khối phổ

9 DAD Diod array Điốt array

10 NP- HPLC Sắc ký hấp phụ pha

thường

11 RP- HPLC Sắc ký hấp phụ pha đảo

12 Ex- HPLC Sắc ký trao đổi ion

13 Gel- HPLC Sắc ký rây phân tử

14 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

15 SD Độ lệch chuẩn

16 LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

17 LOQ Limit of quanlity Giới hạn định lượng



91

Danh môc b¶ng

Bảng 3.1. Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector

đối với hệ dung môi 75% metanol-25% nước. ................................................. 25

Bảng 3.2. Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector

đối với hệ dung môi 85% axetonitril- 15% nước (0,005M natri 1-

heptansunfonat). ............................................................................................... 27

Bảng 3.3. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động ..................... 31

Bảng 3.4. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động ..................... 37

Bảng 3.5. Sự phụ thuộc k’ vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động 40

Bảng 3.6. Sự phụ thuộc k’ vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động 43

Bảng 3.7. Hệ số dung lượng ki’ phụ thuộc vào nồng độ trietylamin ................ 45

Bảng 3.8. Diện tích píc phụ thuộc vào nồng độ natri heptansunfonat ............ 48

Bảng 3.9. Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động .... 51

Bảng 3.10. Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động .. 54

Bảng 3.11. Diện tích píc sắc ký phụ thuộc vào nồng độ Rhodamine B ........... 58

Bảng 3.12. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 0,1ppm ............................... 65



Bảng 3.15. Độ lặp lại của các phép đo tại các nồng độ .................................. 69

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới hàm lượng Rhodamine B ....... 70

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới diện tích píc Rhodamine B ..... 72

Bảng 3.18. Kết quả phân tích mẫu hạt dưa ..................................................... 75

Bảng 3.19. Kết quả phân tích mẫu bánh xu xê ................................................ 77

Bảng 3.20. Kết quả phân tích mẫu siro dâu .................................................... 79

Bảng 3.21. Kết quả phân tích mẫu nước ngọt hương dâu ............................... 81

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao............. 15

Hình 3.1. Phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn rhodamine B .................. 23

Hình 3.2. Diện tích píc sắc ký của rhodamine B phụ thuộc vào bước sóng của

detectơ .................................................................................................................. 26

Hình 3.3. Diện tích píc sắc ký của rhodamine B ................................................. 28

Hình 3.4. Sắc ký đồ của Rhodamine B ở các cột tách khác nhau ....................... 29

Hình 3.5. Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % MeOH trong pha động ............................ 32

Hình 3.6. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau ......... 34

Hình 3.7. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần ACN khác nhau ................. 35

Hình 3.8. Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % ACN trong pha động ............................... 37

Hình 3.9. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau ......... 39

Hình 3.10. Sự phụ thuộc ki’ vào giá trị pH của dung dịch đệm ........................... 41

Hình 3.11. Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhauđối với pha động MeOH-đệm42

Hình 3.12. Sự phụ thuộc ki’ vào giá trị pH của dung dịch đệm ........................... 43

Hình 3.13. Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhau ............................................. 44

Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hệ số dung lượng vào nồng độ TEA ...................... 46

Hình 3.15. Sắc đồ píc sắc ký của các Rhodamine B với các nồng độ TEA ......... 47

Hình 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ natri heptansunfonat ... 49

Hình 3.17. Sắc đồ píc sắc ký của Rhodamine B với các nồng độ ........................ 50

Hình 3.18. Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động .............. 52

Hình 3.19. Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động ....................... 53

Hình 3.20. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào tốc độ pha động ......................... 54

Hình 3.21. Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động ....................... 56

Hình 3.22. Đường chuẩn theo diện tích pic trong khoảng nồng độ ................... 59

Hình 3.23 Sắc đồ píc sắc ký tại các nồng độ khác nhau của Rhodamine B ....... 61

Hình 3.24. Sắc đồ píc sắc ký mẫu chuẩn Rhodamine B tại các nồng độ............ 63

Hình 3.25. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 0,1ppm .......................... 66



Hình 3.28. Sắc đồ píc sắc ký mẫu hạt dưa với các dung môi chiết ..................... 71

Hình 3.29 Sắc đồ píc sắc ký Rhodamine với các tỷ lệ dung môi chiết ............... 73

Hình 3.30. Đường chuẩn (a) và sắc đồ (b) khi thêm chuẩn đối với mẫu hạt dưa75

Hình 3.31. Đường chuẩn và sắc đồ khi thêm chuẩn đối với mẫu bánh xu xê ..... 78

Hình 3.32. Đường chuẩn(a) và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu siro ....... 80

Hình 3.33. Đường chuẩn (a)và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu nước ngọt82



1

MỞ ĐẦU

Khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khoẻ của con người ngày

càng được chú trọng, trong đó vấn đề an toàn thực phẩm và vệ sinh môi trường

được đặt lên hàng đầu vì nó có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ của con người.

Sự tồn dư của các chất độc hại có trong thực phẩm đang là vấn đề đáng lo ngại

đối với người tiêu dùng. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật,

nhiều kỹ thuật phân tích mới, hiện đại đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vực

khác nhau đặc biệt trong đánh giá, kiểm định các chất độc trong thực phẩm.

Trong quá trinh chế biến thực phẩm, để tạo cho thực phẩm màu sắc đẹp,

bắt mắt, người ta sử dụng phẩm màu công nghiệp. Phẩm màu công nghiệp nói

chung, rhodamine B nói riêng đều độc hại, bị cấm sử dụng trong thực phẩm vì

khó phân huỷ, ảnh hưởng đến gan, thận hoặc tồn dư lâu ngày gây độc hại đến cơ

thể con người, đặc biệt có thể gây ung thư. Phẩm màu thực phẩm và tự nhiên có

độ bền kém hơn, lại đắt hơn phẩm màu công nghiệp. Do vậy nhiều người đã lạm

dụng phẩm màu công nghiệp mặc dù chất này đã bị cấm sử dụng trong thực

phẩm. Vì vậy việc nghiên cứu xác định hàm lượng của các rhodamine B là vấn

đề cần thiết để bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.

Tuy nhiên, ngoài sự có mặt của rhodamine B còn có các thành phần hoá

học khác có trong phẩm nhuộm như Sudan- I, Sudan- IV,…Phương pháp tối ưu

nhất để xác định rhodamine B là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đây là một

phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong những năm gần đây. Nó được áp

dụng để tách nhận dạng và xác định hàng loạt các hợp chất mà một số phương

pháp khác gặp nhiều khó khăn như các hợp chất không bền với nhiệt, các hợp

chất có tính chất hoá học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC cũng có nhiều ưu



2

điểm mà các phương pháp khác không có như: xác định đồng thời được nhiều

chất, tốn ít mẫu, thao tác đơn giản,…

Trong phân tích bằng phương pháp HPLC có hai loại cột tách thường sử

dụng là cột trao đổi ion và cột tách pha đảo. Trong luận văn này, chúng tôi sẽ

tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tách và xác định hàm

lượng của rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detetor UV- Vis. Phương pháp này có độ

chọn lọc cao, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm ở nước ta,

có tính khả thi và tính ứng dụng thực tế cao. Phân tích một số mẫu thực phẩm

như hạt dưa, bánh xu xê, mứt, …và các mẫu thực phẩm khác nhằm đánh giá hàm

lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm này. Dựa trên các kết quả nghiên

cứu về phân tích hàm lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm mà có thể

đánh giá vấn đề an toàn thực phẩm của các cơ sở sản xuất.



3

Chƣơng 1: TỔNG QUAN

1.1. Một vài nét về rhodamine B

1.1.1. Công thức cấu tạo

Rhodamine B là một hợp chất hóa học, là một thành phần của phẩm màu

công nghiệp.

Công thức phân tử là C28H31ClN2O3

Phân tử khối là 479,02g/mol.

Công thức cấu tạo của rhodamine B

[9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]-diethylammonium chloride

1.1.2. Tính chất vật lý

Rhodamin B là những tinh thể màu tối có ánh xanh hay ở dạng bột màu nâu đỏ.

Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 2100 C đến 211

0C

Rhodamine B là một thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt trong

methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l). Dung dịch nước và rượu etylic có màu

đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ trong các dung

dịch loãng. Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có = 526 và 517 nm.



4

1.1.3. Tính chất sinh học

Rhodamine B gây độc cấp và mãn tính. Qua tiếp xúc, nó gây dị ứng hoặc

làm mẩn ngứa da, mắt,... Qua đường hô hấp, nó gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau

ngực. Qua đường tiêu hóa, nó gây nôn mửa, có hại cho gan và thận. Nếu tích tụ

dần trong cơ thể nó gây nhiều tác hại đối với gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh

cũng như có thể gây ung thư [17,21]. Thực nghiệm trên chuột cho thấy

rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống hoặc tiêm

vào tĩnh mạch [21], khi rhodamine B đi vào cơ thể có thể chuyển hóa thành amin

thơm tương ứng có phần độc hại hơn loại rhodamine B thường, gây ung thư và

phát triển khối u dạ dầy. Tại đây rhodamine B và dẫn xuất của nó sẽ tác động

mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào gây ung thư gan, vì gan là cơ

quan tạng đầu tiên lọc chất rhodamine B [29]. Một số thực nghiệm khác cho thấy

rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể khi đưa vào nuôi

cấy tế bào [24,19].

1.1.4. Ứng dụng

Rhodamine B thường được sử dụng trong nước để xác định tốc độ và

hướng của dòng chảy vận chuyển [22].

Được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng công nghệ sinh học như kính

hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang [22].

Rhodamine B đang được thử nghiệm để sử dụng trong vắcxin bệnh dại

cho động vật hoang dã [22].

Nó cũng được trộn vào thuốc diệt cỏ. Ngoài ra Rhodamine B còn được sử

dụng để tạo mầu và nhuộm mầu trong công nghiệp sợi, nhuộm màu trong phòng

thí nghiệm, để xét nghiệm tế bào do tính bền mầu [23].

Rhodamine B được sử dụng trong sinh học như là một thuốc nhuộm

huỳnh quang. Tận dụng đặc tính phát quang của rhodamine B, người ta dùng



5

chúng để giúp kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt, cây lấy

dầu [23].

Tại Indonesia, phẩm mầu được đưa vào thực phẩm làm cho món hàng hấp

dẫn hơn, đánh lừa cảm quan của người dân Indonesia. Việc tổng hợp màu ngày

càng tăng trong một số loại thực phẩm do chi phí rất rẻ [21].

Kết quả phân tích Hóa Lý cho thấy việc sử dụng phẩm màu tổng hợp trong

đồ ăn nhẹ và thức uống chứng minh rhodamine B là phẩm màu được sử dụng

rộng rãi tại Jakarta. Thông tin này dựa trên những nghiên cứu chứng minh rằng

trong 20 đồ ăn nhẹ, 10 loại thức uống và 8 thương hiệu của chất màu đều có

chứa rhodamine B [21]. Một số loại phẩm mầu sử dụng tại Indonesia được cho

vào các loại thực phẩm như: thức ăn snack, tôm, kẹo bông, siro,…Nghiên cứu

cũng chỉ ra trong đồ uống được bán tại các trường tiểu học tiểu bang Bangdung

có chứa phẩm mầu công nghiệp với hàm lượng từ 7,841- 3226,55 ppm [21].

Theo Ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu, nhiều thuốc nhuộm màu thuộc

nhóm azo có khả năng gây ung thư. Năm 2005, Ủy ban châu Âu đã quy định rất

rõ các chất nhuộm màu nhóm azo không được dùng trong thực phẩm và mỹ

phẩm [11,17] nên không có giới hạn chấp nhận đối với nhóm chất nhuộm này.

Do tính độc hại của rhodamine B nên ở các nước thuộc khối EU và hầu hết các

nước trên thế giới đều cấm sử dụng rhodamine B cho sản xuất và chế biến thực

phẩm [24, 19].

1.2. Các phƣơng pháp xác định rhodamine B

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích rhodamine B đã

được triển khai và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm bao gồm các phương pháp vi

sinh và hóa học. Phương pháp vi sinh phân tích rhodamine B cho độ nhạy và độ

chọn lọc kém [12]. Vì vậy, các phương pháp hóa học được áp dụng rất rộng rãi

trên thế giới như: phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp sắc ký lỏng khối

phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang.



6

Nhưng phương pháp sắc ký bản mỏng có độ nhạy, độ chọn lọc kém, thời

gian xử lý mẫu lâu, sử dụng nhiều hóa chất gây độc hại và tốn kém [21, 15, 10].

Vì vậy phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng

sử dụng detectơ huỳnh quang là các phương pháp được sử dụng hiện nay [19]…

Tuy các phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao với giới hạn phát hiện

10ppb, giới hạn định lượng 35 ppb [27] nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại,

thường phải chiết bởi các dung môi độc hại, làm sạch qua cột chiết pha rắn

(SPE) [12] trước khi bơm vào cột sắc ký.

Năm 2006, Brian Stuart và M Walker [11] đã đưa ra một phương pháp xử

lý mẫu nhanh, đơn giản, ít phải sử dụng đến các dung môi độc. Rhodamine B có

khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến rất nhạy nên thiết bị sắc ký lỏng

với detectơ UV- Vis là rất phù hợp cho việc phân tích rhodamine B. Vì vậy

chúng tôi chọn phương pháp của Brian Stuat và M.Walker để áp dụng cho

nghiên cứu này. Hiện nay các phương pháp phân tích rhodamine B trong gia vị

vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ cho các

nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học.

Tại Việt Nam, do ý thức chủ quan của con người, môi trường và thực

phẩm ngày càng bị ô nhiễm, nhiều chất độc hại làm ảnh hưởng đến sức khỏe và

gia tăng số người mắc bệnh ung thư. Đặc biệt là việc lạm dụng các chất phụ gia

trong chế biến thực phẩm như sử dụng rhodamine B để làm tăng màu đỏ của gia

vị: bột điều xay, ớt đỏ, bột sa tế, các loại gia vị nấu bò kho, nấu thịt hầm ragu và

hạt dưa đỏ làm cho món hàng hấp dẫn hơn. Ngày 02 tháng 02 năm 2010, sở y tế

Thành phố Hồ Chí Minh đã lấy mẫu ớt bột và mẫu gia vị có mầu đỏ tại cơ sở

Kim Nga- quận Bình Tân để kiểm tra kết quả đã phát hiện mẫu ớt bột sản xuất

ngày 20 tháng 01 năm 2010 có chứa 51 mg/kg rhodamine B và các mẫu bột gia

vị nhuộm màu đỏ lấy cùng ngày có chứa 33,4 mg/kg. Cơ sở này buộc phải tiêu

hủy 77,5kg ớt bột và 258kg gia vị có mầu đỏ vì không đảm bảo vệ sinh an toàn



7

thực phẩm [13]… Điều này hết sức nguy hại đối với sức khỏe người tiêu dùng và

góp phần làm gia tăng trực tiếp số người mắc bệnh ung thư trong cộng đồng.

Hiện ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về phẩm mầu công

nghiệp nhóm azo [7, 8], nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về rhodamine B trong

lĩnh vực thực phẩm. Do đó việc xây dựng một quy trình chuẩn áp dụng cho

phòng thí nghiệm địa phương là rất cần thiết. Tiêu chuẩn giới hạn hàm lượng

phẩm màu rhodamine B trong thực phẩm, hàng tiêu dùng…, và những quy định

tiêu chuẩn sức khỏe liên quan tới sức khỏe cộng đồng của Việt Nam hiện nay

vẫn chưa có.

1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký cổ điển- phƣơng pháp sắc ký giấy hay sắc ký bản

mỏng (TLC)

Phương pháp này khá đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng để

kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích. Phương pháp này có tính ưu việt, tiến

hành nhiều mẫu song song trong một lúc rất tiện lợi. TLC được trang bị phần

phát hiện là một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng [25,26].

Trong phương pháp này, người ta hòa tan Rhodamine B chuẩn trong

ethanol tuyệt đối để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 10g/ml. Rồi tiến

hành xác định định tính trong điều kiện sắc ký sử dụng bản mỏng silicagel

60F254, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Pha động được sử dụng gồm hai hệ:

Hệ 1: CHCl3- MeOH- H2O (65: 35: 10)

Hệ 2: EA- MeOH- H2O (100: 17: 13)

Phát hiện vết bằng cách quan sát vết ở ánh sáng thường hoặc soi dưới đèn

tử ngoại, bước sóng 366nm. So sánh vị trí và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ

của dung dịch thử với vết mẫu của rhodamine B trên sắc ký đồ của dung dịch

chuẩn để đánh giá kết quả [26].



8

1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng vai trò vô cùng

quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau,

nhất là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu,

hoá học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môi

trường,…đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất.

Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định rhodamine B trong

thực phẩm với các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác

vì có độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại cao…

Detectơ ghép nối HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau rửa giải.

Ngày nay có rất nhiều loại detectơ được sử dụng đã mở rộng khả năng phát hiện

nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng thì người

ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD), nhất là tách và phân tích chất trong các

đối tượng phức tạp. Còn thông dụng người ta dùng detectơ UV-Vis hay detectơ

huỳnh quang. Dùng detectơ UV-Vis thì xác định được nhiều loại chất, nhưng

detectơ huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc hơn và ít hơn các tương tác do

các hợp chất có trong nền mẫu. Ngoài ra còn dùng một số detectơ khác như

detectơ điot array (DAD), detectơ điện hoá [16],… các detectơ này cũng thường

được ứng dụng để phân tích các chất có trong phẩm nhuộm.

1.2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC

Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá

trình. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha

động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu

phân tích) theo từng lớp chất trong cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột

tách. Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trong

khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một thành phần pha động nhất định,



9

hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó

luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ dầu cột đên cuối cột sắc ký.

Mặt khác, cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác

nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Khi ở

trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên

pha tĩnh nó lại không dịch chuyển, mà bị pha tĩnh giữ lại. Như vậy là có một

khoảng thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột tách sắc ký, thời gian này

phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như tính chất và cấu trúc

của mỗi chất tan khác nhau đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành

phần pha động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan ít bị lưu giữ, điều đó dẫn

đến kết quả là, có quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký [6].

Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:

Tương tác hấp thụ

Tương tác trao đổi ion

Tương tác theo cơ chế rây phân tử

Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau.

Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP- HPLC và hấp phụ pha ngược

RP- HPLC)

Sắc ký trao đổi ion (EX- HPLC)

Sắc ký rây phân tử (Gel- HPLC)

Vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách

chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa

các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ

thuộc vào hệ số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp

ứng hiệu quả tách sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được

lực rửa giải phù hợp nhất. Sau khi chất tan chuyển tới cuối cột tách được chuyển



10

tới detectơ để phát hiện. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại

detectơ khác nhau [6].

1.2.2.2. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng

Mẫu phân tích trong kỹ thuật HPLC thường ở trạng thái lỏng, đa số các

trường hợp không thể chuyển mẫu trong trạng thái nguyên thủy lên cột tách

được. Phương pháp xử lý mẫu hay được áp dụng trong phân tích là chuyển mẫu

về trạng thái lỏng. Phương pháp chiết lỏng- lỏng được áp dụng để xử lý mẫu cho

sắc ký lỏng. Cơ sở chính của phương pháp này dựa vào cân bằng phân bố của

chất tan trong hai hệ dung môi, hệ dung môi chiết và nền của chất mẫu. Yêu cầu

chủ yếu là chọn được một dung môi chiết thích hợp để chiết chất phân tích cho

hiệu suất thu hồi tốt và không ảnh hưởng cho quá trình chạy sắc ký sau này.

Ví dụ theo thạc sĩ Nguyễn Đắc Kiên- Trường Đại học Nha Trang- Khoa

nuôi trồng thủy sản, để phân tích độc tố aflatoxin B1 trong thức ăn nuôi trồng

thủy sản, mẫu phân tích được cân từ 10- 20 gam cho vào bình nón dung tích

250ml. Chiết mẫu bằng 100ml clorofom (CHCl3), lắc 30 phút, tốc độ 140

vòng/phút. Sau đó tiến hành lọc vào bình 250ml và cô quay cạn ở 400C. Hòa cặn

bằng 10ml diclometan (CH2Cl2), sau đó mẫu phân tích mới được bơm vào cột tách.[5]

Theo tiêu chuẩn xác định hàm lượng Histamin trong sản phẩm thủy sản

bằng phương pháp HPLC dựa theo tiêu chuẩn NMKL số 99-1981(Nordic

committee on food analysis No 99- 1981), mẫu được nghiền bằng máy nghiền

đồng thể, cho vào bình tam giác 150ml, thêm 50ml etanol, lắc đều trong hai

phút. Đặt bình chứa dung dịch mẫu trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 600C trong 15

phút, sau đó chuyển sang bình định mức 100ml, tráng bình tam giác bằng

metanol. Để dung dịch nguội tới nhiệt độ phòng rồi định mức tới vạch bằng

metanol. Lắc đều dung dịch rồi lọc qua giấy lọc. Mẫu đã chiết được bơm vào cột

tách [28].



11

1.2.2.3. Các kết quả nghiên cứu về Rhodamine B bằng phƣơng pháp HPLC

Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu để xác định rhodamine B.

Tháng 2 năm 1989, Carcinogen và Pesticide Branch [13], phòng thí nghiệm

hóa phân tích OSHA, thành phố Salt Lake, Utah, đã xác định rhodamine B bằng

phương pháp HPLC, sử dụng detectơ huỳnh quang với các điều kiện như sau:

Cột tách: hypersil ODS, 100mm x 2,1mm, 5m.

Nhiệt độ: 400C

Pha động: 85% axetonitrile, 15% nước với 0,005M axit 1- heptansunfonic, được

điều chỉnh pH tới 3,5 bằng axit H3PO4.

Tốc độ dòng: 0,2ml/phút

Bước sóng: 556nm

Vòng mẫu: 1,0l.

Với các điều kiện như trên rhodamine B có trong mẫu đã được phát hiện ở

4,5 phút.

Cũng trong năm 1989, R.W. Mason và L.R.Edwards [20] cũng đã tiến

hành thí nghiệm phân tích rhodamine B ở trong huyết tương thỏ và người, sử

dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu DR-3 sử dụng detector huỳnh

quang với các điều kiện:

Cột tách: Bondapak CN (25mm x 4,6mm)

Pha động: axetonitril và nước (35: 65 hoặc 40: 60) chứa 0,1% axit octo-

photphoric.

Tốc độ dòng: 1,8ml/phút.

Nhiệt độ cột: 18 20C

Mẫu huyết tương: 0,5ml huyết tương được pha loãng trong 0,5ml dung dịch

0,05M kali đihidro photphat, pH= 5,5, được chiết trong 5ml etylaxetat.

Kết quả phân tích: Rhodamine B được phát hiện ở 9,7 phút. Mẫu huyết tương

đem phân tích có chứa từ 25 đến 50 ng/ml [25].



12

Tháng 6 năm 1996, L. Gagliardi, D. De Orsi, G. Multari, D. Tonelli [16] đã

phân tích rhodamine B trong mỹ phẩm với các điều kiện phân tích được thực hiện

như sau:

Cột tách: C- 18

Pha động: Axetonitril và nước chứa 0,1M natri peclorat với tỷ lệ thành phần thay

đổi từ 50: 50 đến 70: 30.

Mẫu phân tích được pha trong metanol và nước với tỷ lệ 8: 2

Kết quả phân tích mẫu thực cho thấy dung dịch phân tích có chứa

0,3g/ml rhodamine B, píc xuất hiện ở 9,15 phút [16].

Ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn và sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector

huỳnh quang tác giả J.W.Hofstraat và cộng sự đã xác định rhodamine B trong

nước bề mặt. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 pg/l [17].

Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương [1] đã tiến hành phân

tích Rhodamine B trên các mẫu dược liệu. Các điều kiện sắc ký đã được thực

hiện như sau:

Cột tách: RP- C18 (5m, 4,6mm x 250mm)

Pha động: 50% Axetonitril- 50% đệm kaliđihidrophotphat 20mM- trietylamin

(100: 0,3), điều chỉnh pH tới 3,0 bằng axit photphoric.

Tốc độ dòng: 1,4ml/phút

Detector: UV-Vis

Bước sóng: 525nm.

Lượng tiêm: 20l.

Kết quả phân tích cho thấy trong dược liệu có chứa Rhodamine B[1].

Tháng 4 năm 2011, Việt Nam đã có TCVN 8670-2011, xác định

Rhodamine B bằng HPLC [10] trên cơ sở của viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh

thực phẩm quốc gia đã xây dựng và thực nghiệm cho một số loại thực phẩm có

nhuộm màu.



13

1.2.2. Phƣơng pháp UV- Vis xác định rhodamine B

Để xác định rhodamine B, người ta còn sử dụng phương pháp UV- Vis.

Lấy mẫu chất đem hoà tan trong dung môi thích hợp, lắc, rung siêu âm và chiết

lấy dung dịch. Đem dung dịch chiết được đo bằng máy UV- Vis, dựa vào cực đại

hấp thụ ta có thể định tính và định lượng rhodamine B [11, 15].



14

Chƣơng 2:

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu

Trong luận văn này, hướng nghiên cứu tập trung vào phân tích rhodamine

B có trong thực phẩm, cụ thể là các mẫu thực phẩm: siro dâu, bánh xu xê, hạt

dưa, nước ngọt hương dâu.

Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector hấp thụ phân tử UV-

Vis được lựa chọn. Từ đó xây dựng một quy trình phân tích để áp dụng xác định

rhodamine B trong thực phẩm.

2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu

Với mục tiêu nghiên cứu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu

tách và xác định rhodamine B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC) sử dụng cột tách pha ngược dùng detector UV- Vis.

Xây dựng phương pháp xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ

thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với độ nhạy và độ chính xác cao.Vì vậy, cần

nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau:

1- Tối ưu hóa các điều kiện tách và định lượng Rhodamine B bằng HPLC,

cụ thể là:

Chọn bước sóng của detector.

Chọn pha tĩnh.

Tối ưu hóa pha động: pH, thành phần, tốc độ pha động.

Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.

Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo.

2- Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu phân tích:



15

Chọn phương pháp tiền xử lý mẫu và xác định độ thu hồi.

Chọn dung môi chiết Rhodamine B ra khỏi nền mẫu.

3- Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để xác

định hàm lượng rhodamine B trong một số loại thực phẩm để đánh giá mức độ

an toàn của thực phẩm.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu thực phẩm và chất

phân tích là phẩm mầu. Thông thường, trong các mẫu thực phẩm có rất nhiều

thành phần, nền rất phức tạp. Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp HPLC (High

Performance Liquid Chromatography- Sắc ký lỏng hiệu năng cao) để khảo sát

điều kiện tách và định lượng Rhodamine B.

Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt

như trong hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao



16

2.2.1. Detector UV-Vis

Loại detector này thực chất là các máy đo hấp thụ phân tử vùng tử ngoại

(UV) và vùng khả kiến (Vis). Nhưng ở đây buồng đặt cuvet đo được thay thế

bằng các cuvet đo dòng chảy (flowcell). Việc đo để phát hiện các chất phân tích

hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất

ở trong dung dịch tại một độ dài sóng nào đó, nhưng dung dịch ở đây là pha

động của quá trình sắc ký, nó chứa chất phân tích và chảy liên tục qua buồng đo

(flowcell). Các chất phân tích tan trong pha động có thể cho phổ hấp thụ trực

tiếp của chính nó. Như vậy nói chung tất cả các chât phân tích hay hợp chất của

nó đối với một thuốc thử mà có khả năng hấp thụ quang nhạy tại một bước sóng

nào đó trong vùng phổ UV-Vis đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại

detector này. Nguyên tắc của việc phát hiện định lượng ở đây là dựa theo định

luật hấp thụ ánh sáng

0lg . .I

A l CI

Trong đó:

A là độ hấp thụ quang của chất phân tích hay hợp chất phức của nó với thuốc

thử phân tích ở bước sóng .

là hệ số độ hấp thụ quang phân tử (độ tắt phân tử)

l là bề dầy của lớp hấp thụ (chiều dài của flowcell).

Về nguyên tắc cấu tạo, loại detector này bao gồm các phần chính như sau:

Nguồn sáng điểm S: là đèn D2 (cho vùng phổ UV), hay đèn W- Halid (cho

vùng phổ Vis).

Buồng mẫu và môi trường hấp thụ (flowcell).

Bộ đơn sắc để thu chùm sáng, phân ly và chọn tia sáng cần đo. Trong các

detector đơn giản thì đây là một kính lọc cho các vùng phổ nhất định.

Bộ phận điện tử thu nhận và khuếch đại tín hiện đo.



17

Bộ phận chỉ thị kết quả.

Trong thực tế, rất nhiều chất hữu cơ và hợp chất phức của kim loại với

một thuốc thử phân tích đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại detectơ

này. Detectơ UV- Vis đang được dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật HPLC vì nó

có độ nhạy tương đối cao, đơn giản, dễ dùng và không quá đắt.

2.2.2. Phân tích định lƣợng bằng HPLC

Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là

thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách. Chúng ta có thể dựa vào thời gian lưu

này để định tính (thông qua mẫu chuẩn). Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích

thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất.

Để biết tỷ số khối lượng của chất tan phân bố vào mỗi pha là bao nhiêu, ta

dựa vào hệ số lưu k’i

' 0

0

( )

( )

Ri Ri

R

t tm SPk

m MP t

Trong đó:

k’I là hệ số lưu

m(SP) là khối lượng chất tan phân bố vào pha tĩnh.

m(MP) là khối lượng chất tan phân bố vào pha động.

tRi là thời gian lưu của chất thứ i

tR0 là thời gian chết của cột tách.

Thông thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng

độ chất phụ thuộc vào chiều cao píc hoặc diện tích.

H= k.Cb

S= k. Cb

Trong đó:



18

H là chiều cao pic sắc ký của chất

S là diện tích pic sắc ký của chất

k là hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký

b- là hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b 1

Ở vùng nồng độ nhỏ thì b= 1, mối quan hệ giữa H(S) với C là tuyến tính:

H= k1.C = f(C)

S= k2.C =f(C)

Sử dụng các quan hệ đó có thể xác định nồng độ chất phân tích theo

phương pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn. Dùng phương pháp

đường chuẩn nhanh, đơn giản. Còn khi thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần

xác định nhỏ thì người ta dùng phương pháp thêm chuẩn.

Đối với các píc tách rời nhau hoàn toàn thì biểu diễn mối tương quan của

diện tích píc vào nồng độ chất phân tích cho kết quả vùng tuyến tính lớn hơn.

Tuy nhiên, trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic là dễ dàng hơn đo diện tích.

Nên trong phân tích lượng nhỏ (nồng độ nhỏ) người ta thường đo chiều cao pic.

Tuy nhiên đối với các pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi (peak tailling) thì việc

đo diện tích pic lại chính xác hơn.

Trong luận văn này chúng tôi thiết lập quan hệ diện tích pic phụ thuộc vào

nông độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác định

nồng độ chất theo cả hai phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn.

2.3. Hoá chất và dụng cụ trong nghiên cứu

2.3.1. Hoá chất

Các loại hoá chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích và HPLC

Dung dịch chuẩn:



19

Dung dịch chuẩn gốc 50 ppm: cân một lượng chính xác chất chuẩn

Rhodamine B vào cốc 50 ml, hoà tan và chuyển vào bình định mức 50 ml,

định mức bằng methanol ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ, bảo quản tránh ánh

sáng ở 40 C.

Dung dịch chuẩn 2 ppm: lấy 2 ml dung dịch chuẩn gốc 50 ppm cho vào

bình định mức 50 ml, định mức tới vạch bằng methanol và lắc kỹ, bảo

quản ở 40 C, tránh ánh sáng.

Các dung dịch chuẩn nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm việc, sử

dụng trong ngày.

Các loại hoá chất khác

Methanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

Acetonitril loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

Axit fomic loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

Trietyl amin loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

Natri 1-heptansunfonat của Merk

Ethanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

Axeton loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk

2.3.2. Máy móc và thiết bị

Máy quang phổ UV-Vis 8453 của hãng Agilent- Mỹ với dải phổ từ 190-

1100 nm, điều khiển bằng phần mềm Chemstation.

Máy đo pH TIM 800 của hãng Radiometer- Đan Mạch với điện cực thủy

tinh Red- Rod cho phép đo pH và bổ chính nhiệt độ tự động.

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản

gồm:

Bộ loại khí cho dung môi, Degasser- DGU- 14AM



20

Bộ trộn dung môi FCV- 10ALVP.

Bơm dung môi bốn kênh LC- 10ATVP.

Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO- 10ASVP

Van bơm mẫu 6 chiều VS- 7725i của Rheodyne, Mỹ với thể tích

vòng mẫu (sample loop) 20 l.

Detector UV-Vis SPD- 10AVVP.

Hệ điều khiển SCL- 10AVP.

Phần mềm điều khiển và xử lý LC solution Version 1.11SP1.

Cân phân tích độ chính xác 0,1mg, bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ

sấy

Dụng cụ

Ống đong

Các bình định mức: 5, 10, 20, 50 ml

Lọc chân không

Pipet: 1, 2, 5, 10 ml

Cattrige lọc cỡ 0,45m, 0,2m, cột chiết pha rắn

Pipet man,...



21

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký

3.1.1 Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop)

Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý cơ bản là mẫu ban đầu

được nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xilanh ở áp

suất bình thường, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu được dòng pha động

nạp vào cột tách. Độ chính xác, độ đúng và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách

không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ

thuật nạp mẫu vào trong cột.

Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi

được thể tích mẫu bơm vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần vào sự mở

rộng chân pic sắc ký (doãng pic). Nếu như vòng chứa mẫu quá dài, lượng mẫu

bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng píc xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn

píc trong quá trình tách.

Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta chọn.

Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì bơm mẫu vào cột tách

chiều cao hay diện tích của píc sẽ tăng một cách tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu >

V0, nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao píc sắc ký cũng không tăng

được nữa mà lúc đó píc sắc ký sẽ tù và doãng, không sắc nét nữa. Vì vậy việc

chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng.

Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường chỉ nên dùng vòng mẫu càng nhỏ

càng tốt để tạo nên píc có độ sắc nét cao, tránh sự doãng píc. Trong phân tích

HPLC người ta thường dùng vòng mẫu 10, 20, 50, 100l, trong đó vòng mẫu

20l là phổ biến nhất. Trong trường hợp phân tích Rhodamine B chúng tôi lựa

chọn van bơm mẫu 6 chiều và thể tích vòng mẫu là 20l.



22

3.1.2. Chọn bƣớc sóng của detectơ

Việc chọn bước sóng đo phát hiện chất rất quan trọng vì nó quyết định

trực tiếp tới độ nhạy của phép phân tích. Vì phương pháp nghiên cứu được lựa

chọn là HPLC ghép nối detectơ UV- Vis, detectơ cố định bước sóng do vậy phải

tiến hành khảo sát điều kiện để chọn ra được bước sóng phù hợp nhất cho phân

tích chất.

Việc đo phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó dựa trên cơ sở

tính chất hấp thụ quang phân tử của chất trong dung dịch tại một bước sóng nào

đó. Chính vì thế để thu được pic cao, rõ ràng đủ để định lượng cần phải đo ở cực

đại hấp thụ.

Chúng tôi tiến hành ghi phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến trên

máy UV-Vis 8453 với dung dịch chuẩn rhodamine B được pha trong các thành

phần dung môi khác nhau:

Rhodamine B 1ppm trong 80% methanol- 20% nước

Rhodamine B 1ppm trong 80% methanol- 20% nước có 3% trietylamin

Rhodamine B 1ppm trong 80% axetonitril- 20% nước 0,005M natri 1-

heptansunfonat

Rhodamine B 1ppm trong 100% methanol

Rhodamine B 1ppm trong 100% nước

Kết quả phổ thu được đưa ra trong hình 3.1.



23

Wav elength (nm)300 350 400 450 500 550 600 650 700

Ab

so

rba

nce

(A

U)

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

554

618

736

772

658

Wav elength (nm)300 350 400 450 500 550 600 650 700

Absorb

an

ce (A

U)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

548

771

738

520

(a) (b)

Wav elength (nm)300 350 400 450 500 550 600 650 700

Absorb

an

ce (A

U)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

554

618

639

658

735

771

(c) (d)

Wav elength (nm)300 350 400 450 500 550 600 650 700

Ab

so

rb

an

ce

(A

U)

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

557

657

457

(e)

Hình 3.1. Phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn Rhodamine B

trong các thành phần dung môi khác nhau.

(a) 80% methanol- 20% nước (b) 80% methanol- 20% nước có 3% trietylamin

(c) 80% axetonitril- 20% nước 0,005M natri 1-heptansunfonat

(d) 100% methanol (e) 100% nước

Wav elength (nm)300 350 400 450 500 550 600 650 700

Absorb

an

ce (A

U)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

548

771

738

520



24

Nhìn vào phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn rhodamine B trong

các thành phần dung môi khác nhau ta thấy được cực đại hấp thụ nằm trong

khoảng 520- 555nm.

Tuy nhiên để kết quả chính xác hơn và đánh giá được sự ảnh hưởng của

tốc độ dòng chảy trong quá trình sắc ký cần khảo sát sự thay đổi diện tích pic sắc

ký theo bước sóng của detectơ. Để khảo sát sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký,

chiều cao píc vào bước sóng quan trắc của detectơ, tiến hành bơm rhodamine B

lên cột sắc ký trong cùng điều kiện tách nhưng bước sóng khác nhau.

Chúng tôi tiến hành theo hai phương pháp:

3.1.2.1. Phƣơng pháp 1

Các điều kiện đo được tiến hành như sau:

1. Nồng độ rhodamine B: 2,0 ppm.

2. Thành phần pha động:

75% MeOH- 25% nước(được điều chỉnh tới pH=3 bởi axit fomic)

3. Tốc độ pha động: 0,8ml/phút.

4. Cột tách: RP- C8 (5m, 4,6mm x 150mm)

5. Nhiệt độ cột tách: 250C

Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.1.



25

Bảng 3.1. Diện tích và chiều cao của píc phụ thuộc vào bước sóng detectơ đối

với pha động: 75% metanol-25% nước.

STT Bƣớc sóng (nm) Chiều cao pic (mAu) Diện tích píc (mAu.s)

1 500 9283 249661

2 505 11270 302940

3 510 13305 361224

4 515 14577 392696

5 520 15798 432875

6 525 18387 502652

7 530 24263 665500

8 535 30325 826225

9 540 36873 1011620

10 545 41471 1132322

11 550 40640 1146803

12 555 35867 1012448

13 560 25810 723269

14 565 17369 486860

15 570 9649 266469

16 575 5514 150735

17 580 2360 56258

18 585 1160 27522

19 590 588 13539

20 595 311 6624

21 600 184 4037

22 605 113 1709



26

Dựa vào các số liệu trên chúng tôi tiến hành biểu diễn mối quan hệ trên đồ thị.

Kết quả biểu diễn như trong hình 3.2.

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

500 505 510 515 520 525 530 535 540 545 550 555 560 565 570 575 580 585 590 595 600

buoc song(nm)

Spic(mAu.s)

Hình 3.2. Diện tích píc sắc ký của rhodamine B

phụ thuộc vào bước sóng của detectơ

Qua bảng kết quả và qua đồ thị nhận thấy rằng, ở bước sóng 550 nm diện

tích píc sắc ký cực đại.

3.1.2.2. Phƣơng pháp 2

Các điều kiện đo được tiến hành như sau:

1. Nồng độ Rhodamine B: 0,5 ppm.

2. Thành phần pha động: 85% ACN- 15% nước( 0,005M 1-heptansunfonat

Natri, được điều chỉnh tới pH= 3 bởi axit fomic)

3. Tốc độ pha động: 0,8ml/phút.

4. Cột tách: RP- C8 (5m/4,6mm x 150mm)

5. Nhiệt độ cột tách: 300C

Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.2.



27

Bảng 3.2. Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector đối

với pha động:85% axetonitril- 15% nước (5mM natri 1-heptansunfonat).

STT Bƣớc sóng (nm) Chiều cao pic (mAu) Diện tích píc (mAu.s)

1 500 10342 190234

2 505 11978 223302

3 510 16325 315104

4 515 18634 354997

5 520 20437 396958

6 525 21324 416820

7 530 24667 537267

8 535 31526 625638

9 540 372354 705281

10 545 428690 924513

11 550 467689 1073161

12 555 483222 1135665

13 560 453425 1049159

14 565 32567 864078

15 570 11765 581695

16 575 97089 433786

17 580 5463 54255

18 585 3215 21523

19 590 1167 16174

20 595 795 5946

21 600 453 4335



28

Dựa vào các số liệu trên chúng tôi tiến hành biểu diễn mối quan hệ trên đồ

thị. Kết quả biểu diễn như trong hình 3.3.

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

500 505 510 515 520 525 530 535 540 545 550 555 560 565 570 575 580 585 590 595 600

buoc song(nm)

Spic(mAu.s)

Hình 3.3. Diện tích píc sắc ký của rhodamine B

phụ thuộc vào bước sóng của detectơ

Qua bảng kết quả và qua đồ thị nhận thấy rằng, ở bước sóng 555 nm diện tích

píc cực đại.

Từ các kết quả thu được khi nghiên cứu phổ hấp thụ ánh sáng của

rhodamine B trong các thành phần pha động khác nhau và sự ảnh hưởng của

diện tích píc vào bước sóng của detectơ với các hệ dung môi khác nhau, chúng

tôi tiến hành khảo sát rhodamine B ở bước sóng 550- 555nm.

3.2. Chọn pha tĩnh

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định tới hiệu quả tách. Bản chất

pha tĩnh quyết định cơ chế tách và khả năng lưu giữ của chất tan. Tùy theo bản



29

chất của chất phân tích mà chọn loại pha tĩnh, kích thước hạt nhồi, chiều dài cột

cho phù hợp quá trình sắc ký.

Hệ pha ngược được ứng dụng phổ biến do độ ổn định, độ lặp lại và khả

năng tách được nhiều loại chất. Ngoài ra dung môi khi sử dụng cho pha ngược

có tính kinh tế hơn. Để nghiên cứu tách và xác định hàm lượng rhodamine B, là

chất có tính phân cực do đó chủ yếu các công trình nghiên cứu được công bố đều

sử dụng cột tách chứa chất nhồi pha đảo như RP- C18, RP- C8,…

Tiến hành nghiên cứu khả năng tách rhodamine B trên cột RP- C18 và RP-

C8 với cùng điều kiện sắc ký: 90% MeOH, 10% đệm axetat có pH=3,01; tốc độ

dòng 0,8 ml/phút, tại bước sóng 576nm, sắc ký đồ được thể hiện trong hình 3.4.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

0.013

0.015

0.018

mAU(x1,000)Detector A Ch2:576nm

1.8

83

1.9

44

(a) (b)

Hình 3.4. Sắc ký đồ của Rhodamine B ở các cột tách khác nhau

(a) RP- C18 (b) RP- C8

Dựa vào việc khảo sát sắc ký đồ của Rhodamine B trên các cột RP- C18

và RP- C8 trong những điều kiện như nhau cho ta thấy khả năng tách Rhodamine

B trên cột RP- C8 là khá hơn.

Vì vậy cột RP- C8 được lựa chọn để tách và xác định hàm lượng

Rhodamine B. Cột RP- C8 được sử dụng có kích thước 4,6mm x150mm, 5m.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

mVDetector A Ch2:576nm

2.0

82

2.5

30

2.6

94



30

3.3. Tối ƣu hóa pha động

Đây là yếu tố quan trọng sau pha tĩnh, nó quyết định hiệu suất tách sắc ký

của mẫu phân tích. Pha động và pha tĩnh là hai yếu tố chính của quá trình sắc ký.

Hai yếu tố này quyết định thời gian lưu giữ chất và hiệu quả tách. Khác với pha

tĩnh, pha động là một yếu tố linh động, có thể thay đổi dễ dàng để được điều kiện

phân tích tối ưu. Do đó sau khi chọn cột pha tĩnh thì thành phần pha động là yếu

tố tiếp theo được khảo sát. Trên cơ sở tổng quan tài liệu thì có hai pha động được

chọn là:

Pha động thứ nhất:

MeOH – nước (được điều chỉnh tới pH= 3 bởi axit HCOOH).

Pha động thứ hai:

ACN- nước (được điều chỉnh tới pH = 3 bởi axit HCOOH, có thêm 5mM natri 1-

heptansunfonat).

3.3.1. Ảnh hƣởng của thành phần pha động tới khả năng tách sắc ký

Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình

rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột tách. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì

lực rửa giải của pha động thay đổi, tức là làm thay đổi thời gian lưu của chất

phân tích, và do đó làm thay đổi hệ số dung lượng của chất phân tích.

Do đó, để có được một thành phần pha động phù hợp thì cần tiến hành

khảo sát các tỷ lệ khác nhau với các thành phần pha động đã lựa chọn gồm:

Pha động thứ nhất:

Dung dịch đệm có pH=3 và dung môi hữu cơ methanol (MeOH), thay đổi

tỷ lệ pha động: 60%MeOH- 40% H2O; 65%MeOH- 35% H2O; 70%MeOH- 30%

H2O; 75%MeOH- 25% H2O; 80%MeOH- 20% H2O; 85%MeOH- 15% H2O;

90%MeOH- 10% H2O; 95%MeOH- 5% H2O; 100%MeOH- 0% H2O.



31

Pha động thứ hai:

ACN- nước được điều chỉnh tới pH=3 bởi axit HCOOH, có thêm 0,005M

natri 1- heptansunfonat, thay đổi tỷ lệ pha động: 60%ACN- 40% H2O;

65%ACN- 35% H2O; 70%ACN- 30% H2O; 75%ACN- 25% H2O; 80%ACN-

20% H2O; 85%ACN- 15% H2O; 90%ACN- 10% H2O; 95%ACN- 5% H2O;

100%ACN- 0% H2O.

Tiến hành lần lượt đối với từng pha động như sau:

3.3.1.1. Pha động thứ nhất

Pha tĩnh: cột RP- C8, 5m, 4,6mm x 150mm

Nhiệt độ cột tách: 250C

Nồng độ rhodamine B: 2,0ppm

Bước sóng của detector: 550nm

pH của dung dịch đệm: 3

Nồng độ của dung địch đệm: 20mM

Tốc độ của pha động: 0,8ml/phút, thành phần như trong bảng 3.3.

Sau khi chạy sắc ký, dựa vào thời gian lưu của rhodamine B, thiết lập

được mối quan hệ giữa hệ số lưu của rhodamine B vào tỷ lệ thành phần pha động

của pha động thứ nhất .

Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.5.

Bảng 3.3. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động

STT %MeOH %H2O tR0(s) tRi(s) ki’=(tRi- tR0)/tR0

1 60 40 2,11 11,812 4,598

2 65 35 2,11 6,476 2,069

3 70 30 2,11 4,190 0,986



32

4 75 25 2,11 4,640 0.890

5 80 20 2,11 3,522 0,669

6 85 15 2,11 2,808 0,331

7 90 10 2,11 2,701 0,280

8 95 5 2,11 2,722 0,290

9 100 0 2,11 2,514 0,191

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

3.500

4.000

4.500

5.000

60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 100.0

Tỷ lệ MeOH(%)

k'

Hình 3.5. Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % MeOH trong pha động

Dựa vào đồ thị nhận thấy rằng ở các tỉ lệ khác nhau của thành phần pha

động thời gian xuất hiện các pic khác nhau. Cụ thể, khi tăng dần tỷ lệ thành phần

đệm fomat trong pha động thì mất nhiều thời gian rửa giải chất ra khỏi cột hơn,

hệ số lưu khác nhau nhiều, cùng với đó là píc sắc ký thu được không gọn và sắc

nét, có hiện tượng doãng píc sắc ký. Nếu chọn tỷ lệ đệm trong pha động thấp

hơn thì píc sắc ký xuất hiện sớm.



33

Dưới đây là sắc ký đồ của các pic sắc ký đã đo được trong các điều kiện trên.

0.0 2.5 5.0 7.5 min

0.00

0.25

0.50

0.75

mAU(x10)Detector A Ch2:576nm

2.2

17

2.3

92

6.4

73

7.2

45

(a) (b)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

0.013

mAU(x1,000)Detector A Ch2:576nm

2.2

69

2.4

03

3.6

07

4.1

90

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0


2.3

04

3.6

01

3.9

87

5.0

19

(c) (d)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0mAU(x10)

Detector A Ch2:550nm

2.4

34

2.8

08

3.4

49

(e) (f)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

mAUDetector A Ch2:576nm

2.2

18

2.3

75

11.8

02

13.5

93

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0


2.3

38

2.5

72

2.8

31

3.2

13

3.5

23

4.3

98



34

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0


2.7

19

(g) (h)

(k)

Hình 3.6. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau

a. 60% MeOH- 40% đệm b. 65% MeOH- 35% đệm

c. 70% MeOH- 30% đệm d.75% MeOH- 25% đệm

e. 80% MeOH- 20% đệm f. 85% MeOH- 15% đệm

g. 90% MeOH- 10% đệm h. 95% MeOH- 5% đệm

k. 100% MeOH

Tuy nhiên, hệ số lưu nhỏ, ảnh hưởng đến diện tích píc sắc ký. Điều này

thể hiện rõ trên đồ thị mối quan hệ tỷ lệ thành phần pha động và hệ số lưu. Để

tránh píc xuất hiện trùng với thời gian chết của cột, và các píc không tách ra khỏi

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


1.5

82

1.9

33

2.5

03

2.7

03

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5


2.5

04



35

nhau. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng khi cho thêm ACN vào

thành phần pha động với các điều kiện sắc ký như nhau.

Kết quả nghiên cứu được trình bày trong hình 3.7.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

mV(x10)Detector A Ch2:555nm

2.3

97

2.6

22

6.5

30

7.0

36

9.0

99

10.7

99

(a) (b)

(c)

Hình 3.7. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần ACN khác nhau

a. 5% ACN- 65%MeOH- 30% đệm

b. 7% ACN- 63%MeOH- 30% đệm

c. 10% ACN- 60%MeOH- 30% đệm

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0


2.3

66

2.6

17

6.6

66

7.1

24

9.0

66

10.8

62

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0


2.3

80

6.7

21

7.2

69

9.3

37

11.0

52



36

Nhìn vào sắc ký đồ, nhận thấy khi cho thêm ACN, píc sắc ký của

rhodamine B doãng hơn.

Với những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi tạm thời lựa chọn tỷ lệ pha

động gồm 70% MeOH- 30% đệm (hình 3.6- c) và tiếp tục nghiên cứu phương

pháp sử dụng pha động thứ hai (ACN- nước được điều chỉnh tới pH=3 bởi axit

HCOOH, có thêm 5mM natri 1- heptansunfonat) để so sánh.

3.3.1.2. Pha động thứ hai

(Pha động: ACN- nước được điều chỉnh tới pH=3 bởi axit HCOOH, có

thêm 5mM natri 1- heptansunfonat).

Pha tĩnh: cột RP- C8, 5m, 4,6mm x 150mm


Nồng độ Rhodamine B: 0,5ppm

Bước sóng của detector: 550nm

pH của dung dịch đệm: 3,0

Nồng độ của dung địch đệm: 20mM

Tốc độ của pha động: 0,8ml/phút

Thành phần pha động như trong bảng 3.4.

Sau khi chạy sắc ký, dựa vào thời gian lưu của Rhodamine B đã thiết lập

được mối quan hệ giữa hệ số lưu của rhodamine B vào tỷ lệ thành phần pha động

của pha động thứ hai. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.8.



37

Bảng 3.4. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động

STT %ACN %H2O tR0(s) tRi(s) ki’=(tRi- tR0)/tR0

1 60 40 2,056 8,282 3.040

2 65 35 2,056 6,238 2.043

3 70 30 2,056 4,920 1.4

4 75 25 2,056 4,112 1.009

5 80 20 2,056 3,636 0.774

6 85 15 2,056 4,029 0.965

7 90 10 2,056 4,569 1.229

8 95 5 2,056 4,848 1.365

9 100 0

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

60 65 70 75 80 85 90 95 100

Tỷ lệ ACN(%)

ki'

Hình 3.8. Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % ACN trong pha động

Dựa vào đồ thị nhận thấy rằng, giống như ở pha động thứ nhất, ở các tỉ

lệ khác nhau của thành phần pha động thời gian xuất hiện các pic khác nhau. Cụ

thể, khi tăng dần tỷ lệ thành phần đệm fomat trong pha động thì mất nhiều thời

gian rửa giải chất ra khỏi cột hơn, hệ số dung lượng khác nhau nhiều, cùng với



38

đó là píc sắc ký thu được không gọn và sắc nét, có hiện tượng doãng pic sắc ký.

Nếu chọn tỷ lệ đệm trong pha động thấp hơn thì pic sắc ký xuất hiện sớm. Dưới

đây là sắc ký đồ của các pic sắc ký đã đo được trong các điều kiện trên.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5


1/4

.521

2/6

.238

(a) (b)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0mV(x10)


1/3

.330

2/4

.119

(c) (d)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

0.013

0.015

mV(x1,000)Detector A Ch2:550nm

1/8

.282

2/8

.616

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


1/3

.769

2/4

.920



39

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0


1/3

.463

2/4

.029

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0


1/3

.463

2/4

.029

(e) (f)

(g) (h)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

-5.0

-2.5

0.0

2.5

mV(x0.1)Detector A Ch2:550nm

(k)

Hình 3.9. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau

đối với pha động thứ hai

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0


1/3

.996

2/4

.569

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0


1/2

.113

2/2

.380

3/4

.538

4/4

.848

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0


1/3

.996

2/4

.569

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0


1/2

.113

2/2

.380

3/4

.538

4/4

.848

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0


1/1

.972

2/3

.092

3/3

.636



40

a. 60% ACN- 40% đệm b. 65% ACN- 35% đệm

c. 70% ACN- 30% đệm d. 75% ACN- 25% đệm

e. 80% ACN- 20% đệm f. 85% ACN- 15% đệm

g. 90%ACN- 10% đệm h. 95% ACN- 5% đệm

k. 100% ACN

Dựa vào đồ thị và sắc đồ pic sắc ký của pha động thứ hai, thấy tại tỷ lệ

85% ACN và 15% đệm thì píc tương đối đẹp, không bị doãng píc.

Qua khảo sát đối với hai hệ pha động khác nhau, nhận thấy hệ pha động

thứ hai là phù hợp hơn.

Vì vậy, chúng tôi chọn hệ pha động gồm 85% ACN và 15% đệm (hình 3.9-f).

3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình tách sắc ký

Tiến hành khảo sát khoảng pH của dung dịch đệm để có được một thành

phần pha động ổn định và cho hiệu quả sắc ký cao. Các giá trị pH được lựa chọn

để khảo sát trong khoảng 2- 4,5. Sau khi chạy sắc ký tiến hành thiết lập mối quan

hệ giữa hệ số lưu của rhodamine B và pH của dung dịch đệm trong pha động.

Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.5, 3.6 và hình 3.10, 3.11, 3.12, 3.13

3.3.2.1. Pha động gồm 70% MeOH- 30% đệm

Bảng 3.5. Sự phụ thuộc k’ vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động

STT pH tR0(s) tRi(s) ki’=(tRi- tR0)/tR0

1 2 2,11 2,958 0.402

2 2,5 2,11 3,492 0.655

3 3 2,11 3,903 0.850

4 3,5 2,11 2,514 0.220

5 4 2,11 2,926 0.387

6 4,75 2,11 4,224 1.002



41

Dựa vào các số liệu trong bảng trên, ta có đồ thị như biểu diễn sự phụ

thuộc của ki’ vào pH của dung dịch đệm.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

2 2.5 3 3.5 4 4.5

pH

ki'

Hình 3.10. Sự phụ thuộc ki’ vào giá trị pH của dung dịch đệm

trong pha động MeOH- đệm.

Các sắc ký đồ đo được ở các giá trị pH khác nhau được biểu diễn ở hình 3.11

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0


1.8

42

1.9

27

2.2

99

2.5

24

3.1

26

3.4

92

(a) (b)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0mV(x10)


2.2

56

2.6

79

2.9

58



42

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0


1.9

36

2.5

74

2.9

40

(c) (d)

(e) (f)

Hình 3.11. Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhau đối với pha động MeOH-đệm

a. pH=2 b. pH=2,5 c. pH=3

d. pH=3,5 e. pH=4 f. pH=4,5

Nhìn vào đồ thị và sắc ký đồ ta thấy đối với hệ pha động MeOH và nước

thì tại pH= 2,5 píc sắc ký gọn nhất (hình 3.11- b).

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5


1.9

83

2.6

24

2.9

26

3.2

72

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0


1.4

70

1.9

42

2.4

38

2.7

41

3.2

60

3.7

53

4.2

24

5.2

31

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5mV(x10)


1.5

67

1.9

16

2.3

01

2.5

04

2.8

78

3.1

01

3.4

07

3.9

03

4.1

84



43

3.3.2.2.Pha động gồm 85% ACN- 15% đệm

Bảng 3.6. Sự phụ thuộc k’ vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động

STT pH tR0(s) tRi(s) ki’=(tRi- tR0)/tR0

1 2 2,056 3,110 0.512195

2 2,5 2,056 3,231 0.576098

3 3 2,056 3,950 0.977073

4 3,5 2,056 3,743 0.81122

5 4 2,056 3,774 0.840976

6 4,75 2,056 3,844 0.875122

Dựa vào các số liệu trong bảng trên, ta có đồ thị như biểu diễn sự phụ

thuộc của ki’ vào pH của dung dịch đệm.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

2 2.5 3 3.5 4 4.5

k'i

pH

Hình 3.12. Sự phụ thuộc ki’ vào giá trị pH của dung dịch đệm

trong pha động ACN- đệm.



44

Các sắc ký đồ đo được ở các giá trị pH khác nhau được biểu diễn ở hình 3.13

(a) (b)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0mV(x10)


1/2

.299

2/3

.210

3/3

.713

(c) (d)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0mV(x10)


1/3

.241

2/3

.844

(e) (f)

Hình 3.13. Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhau

đối với pha động ACN- đệm

a. pH=2 b. pH=2,5 c. pH=3 d. pH=3,5 e. pH=4 f. pH=4,5

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0


1/1

.909

2/2

.398

3/2

.799

4/3

.100

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0


1/1

.878

2/2

.382

3/2

.762

4/3

.040

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0


1/3

.377

2/4

.038

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0


1/2

.295

2/3

.209

3/3

.774



45

Dựa vào đồ thị và sắc đồ píc sắc ký, ta thấy với hệ pha động thứ hai:

ACN- đệm thì tại pH= 3,0, píc sắc đồ gọn và sắc nét hơn (hình 3.13- c).

Vì vậy, chúng tôi lựa chọn dung dịch đệm có pH= 3,0 để khảo sát các yếu

tố tiếp theo.

3.3.3. Ảnh hƣởng của các chất phụ

3.3.3.1. Ảnh hƣởng của trietylamin đối với hệ pha động gồm MeOH và đệm

Trong một số loại tài liệu cho thấy khi tách các chất hữu cơ mang tính chất

bazơ trên cột tách pha đảo thường xảy ra hiện tượng kéo đuôi (peak tailling).

Nguyên nhân chính của hiện tượng này là do tương tác axit- bazơ giữa chất phân

tích và các tâm axit còn lại trên bề mặt pha tĩnh. Để giải quyết hiện tượng kéo

đuôi pic thường đi theo hai hướng hoặc là sử dụng cột endcapping hoặc là sử

dụng chất cải biến hữu cơ (organic modifier) và thường được sử dụng là các

bazơ hữu cơ như trietylamin, trimetylamin,… Trong bài luận văn này sử dụng

chất cải biến hóa học là trietylamin (TEA) với nồng độ thay đổi từ 0ppm-

6000ppm. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.14

Bảng 3.7. Hệ số lưu ki’ phụ thuộc vào nồng độ trietylamin

STT Nồng độ trietylamin

(ppm)

tR0 (s) tRi(s) ki’=(tRi- tR0)/tR0

1 0 2,11 3,817 0.809

2 2000 2,11 5,343 1.532

3 3000 2,11 5,466 1.591

4 4000 2,11 5,683 1.693

5 5000 2,11 5,338 1.530

6 6000 2,11 3,759 0.782



46

0

0.5

1

1.5

2

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

nồng độ TEA(ppm)

k'i

Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hệ số dung lượng vào nồng độ TEA

Dựa vào bảng số liệu và đồ thị trên ta thấy tại điểm nồng độ trietylamin là

4000ppm thì hệ số lưu ki’ là lớn nhất và thích hợp để tách rhodamine B trong hệ

pha động này.

Các sắc đồ píc sắc ký được thể hiện ở hình 3.15

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5


1.9

33

2.3

79

2.5

87

3.2

67

3.8

17

4.4

05

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0


1.8

70

2.3

66

2.5

75

3.2

42

3.7

58

4.3

37

(a) (b)



47

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0


2.3

59

2.5

64

4.2

98

5.3

38

6.2

46

0.0 2.5 5.0 7.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0


2.3

61

2.5

64

4.5

54

4.7

78

5.6

83

6.6

36

(c) (d)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0mV(x10)


2.3

68

2.5

79

4.4

26

4.6

33

5.4

66

6.3

44

0.0 2.5 5.0 7.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0


1.5

42

2.3

61

2.5

64

4.3

10

5.3

43

6.1

54

(e) (f)

Hình 3.15. Sắc đồ píc sắc ký của các Rhodamine B với các nồng độ TEA

a. 0ppm b. 2000ppm c. 3000ppm d.4000ppm

e. 5000ppm f. 6000ppm

Nhìn vào đồ thị và sắc đồ pic sắc ký, nhận thấy với hệ dung môi thứ nhất:

MeOH- nước thì nếu thêm nồng độ TEA 4000ppm thì píc sắc đồ gọn và sắc nét

nhất. Vì vậy đối với hệ dung môi thứ nhất, chọn nồng độ TEA thêm vào là

4000ppm. Khi thêm TEA vào hệ dung môi trên, ta nhận thấy pic thu được sắc

nét hơn, hiện tượng doãng pic ít hơn. Tuy nhiên, khi thêm TEA vào thì các pic

thu được có vai nhỏ bên cạnh (hình 3.15), điều này không có lợi cho việc xác

định các chất. Như vậy hệ dung môi thứ nhất không nên cho thêm TEA.



48

3.3.3.2. Ảnh hƣởng của natri 1- heptansunfonat tới dung môi ACN và đệm

fomat có pH=3

Đây là phương pháp tạo cặp ion. Rhodamine B là một chất phân cực mạnh

tạo cation, khi cho natri 1- heptansunfonat là một muối rất phân cực, dễ dàng

phân ly tạo ra các anion, các anion này sẽ tạo cặp với các cation của rhodamine

B nên sự phân tách được dễ dàng hơn.

Trong bài luận văn bày sử dụng chất tạo cặp ion là natri 1- heptansunfonat

với nồng độ thay đổi từ 0mM đến 10mM.

Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 và hình 3.16

Bảng 3.8. Diện tích píc phụ thuộc vào nồng độ natri 1- heptansunfonat

STT Nồng độ natri

heptansunfonat

(mM)

Diện tích píc

(mAu.s)

1 0 0

2 3 1101785

3 5 1163957

4 7 1200245

5 10 853890



49

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

nồng độ natriheptansunfonat(mM)

diện tích píc(mAu.s)

Series1

Hình 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ natri1- heptansunfonat

Dựa vào bảng số liệu và đồ thị, chọn nồng độ natri 1-heptansunfonat là

7mM.

Các sắc đồ píc sắc ký được thể hiện ở hình 3.17

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0


1/2

.274

2/3

.809

3/4

.509

(a) (b)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

mVDetector B Ch2:550nm

1/3

.608

2/3

.944



50

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0


1/2

.155

2/3

.382

3/4

.296

(c) (d)

0.0 2.5 5.0 7.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0


1/2

.160

2/3

.392

3/3

.853

4/4

.255

(e)

Hình 3.17. Sắc đồ píc sắc ký của Rhodamine B với các nồng độ

natri heptansunfonat

a.0 mM b. 3mM c. 5mM

d. 7mM e. 10mM

Nhìn vào hình 3.17, ta thấy píc sắc ký của rhodamine B khi thêm 7mM

natri 1- heptansunfonat vào hệ pha động thứ hai là cân đối và gọn nhất.

So sánh các số liệu và píc sắc ký thu được ở cả hai hệ pha động, chúng tôi

chọn nồng độ chất thêm vào của hệ pha động thứ hai là 7mM natri 1-

heptansunfonat (hình 3.17- d).

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0


1/2

.151

2/3

.514

3/3

.911

4/4

.670



51

3.3.4. Khảo sát tốc độ pha động

Cùng với yếu tố thành phần pha động, thì tốc độ pha động khi chạy sắc ký

cũng ảnh hưởng không ít đến kết quả tách sắc ký. Tốc độ pha động cũng là một

yếu tố quyết định đến quá trình rửa giải các chất trong cột sắc ký vì nó ảnh

hưởng đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan giữa hai pha tĩnh và pha

động. Tốc độ pha động quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng píc, thời gian rửa

giải các chất lớn làm giảm tính kinh tế của phương pháp. Nhưng tốc độ pha động

lớn quá có thể làm cho các chất trong mẫu không kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến

hiện tượng doãng pic. Vì vậy cần lựa chọn được tốc độ pha phù hợp.

Đối với một hệ pha tĩnh và thành phần pha động đã lựa chọn thì khả năng

tách chất phụ thuộc vào tốc độ pha động. Đối với một cột tách xác định thì sẽ có

một tốc độ tối ưu.

3.3.4.1. Hệ pha động MeOH – đệm

Tiến hành khảo sát với thành phần pha động gồm 70% MeOH- 30% đệm,

nhiệt độ cột 250 C, dung dịch đệm có pH=3 gồm HCOOH và 0,4% TEA, tốc độ

dòng thay đổi từ 0,5ml/phút tới 0,9ml/phút. Kết quả thu được trình bày trong

bảng 3.7 và hình 3.18, hình 3.19.

Bảng 3.9. Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động

STT Tốc độ pha động

(ml/phút)

Diện tích píc (mAu.s)

1 0,5 1527978

2 0,6 1276632

3 0,7 1102412

4 0,8 1088450

5 0,9 914004



52

0

500000

1000000

1500000

2000000

0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

F(ml/phút)

Spic (mAu.s)

Hình 3.18. Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0


9.9

58

10.0

14

13.3

33

14.5

17

14.5

95

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

0.013

0.015

0.018

0.020


7.7

59

10.4

63

11.7

98

(a) (b)

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

0.013

0.015

0.018


7.5

38

10.3

74

12.0

54

(c)



53

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 min

0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

0.013

0.015

0.018


8.4

76

10.2

17

10.2

75

(d) (e)

Hình 3.19. Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động

a. 0,5 ml/phút b. 0,6 ml/phút

c. 0,7 ml/phút d. 0,8 ml/phút

e. 0,9 ml/phút

Nhìn vào đồ thị sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động và

các píc sắc đồ đối với hệ pha động thứ nhất, nhận thấy tại tốc độ 0,6 ml píc sắc

đồ thu được gọn nhất (hình 3.19- b).

3.3.4.2. Hệ pha động ACN – đệm

Tiến hành khảo sát với thành phần pha động gồm 85%ACN- 15% đệm,

nhiệt độ cột 300 C, dung dịch đệm có pH=3 gồm HCOOH và 7mM natri 1-

heptansunfonat, tốc độ dòng thay đổi từ 0,6ml/phút đến 1,5ml/phút. Kết quả thu

được trình bày trong bảng 3.10. và hình 3.20., hình 3.21.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

0.000

0.003

0.005

0.007

0.010

0.013

0.015

0.018

0.020mV(x1,000)


6.6

45

9.2

09

10.9

00

10.9

70



54

Bảng 3.10. Diện tích píc của rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động

STT Tốc độ dòng (ml/phút) Diện tích píc (mAu.s)

1 0,6 861612

2 0,7 831974

3 0,8 725970

4 0,9 639085

5 1,0 603698

6 1,1 510903

7 1,2 480186

8 1,3 461264

9 1,4 440632

10 1,5 376066

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

F(ml/phút)

Spic(mAu.s)

Hình 3.20. Sự phụ thuộc của diện tích píc vào tốc độ pha động



55

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5


1/2

.649

2/2

.865

3/3

.300

4/3

.905

5/4

.342

6/4

.820

7/5

.164

8/6

.298

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


1/2

.304

2/2

.499

3/2

.863

4/3

.700

5/4

.249

(a) (b)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0


1/1

.714

2/2

.029

3/2

.198

4/3

.136

5/3

.605

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


1/1

.826

2/1

.966

3/2

.754

4/3

.145

(c) (d)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0


1/1

.719

2/1

.952

3/2

.469

4/2

.808

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0


1/2

.432

(e) (f)



56

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


1/1

.490

2/1

.914

3/2

.210

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


1/1

.783

2/2

.063

(g) (h)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0mV(x10)


1/1

.660

2/1

.917

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5


1/1

.547

2/1

.788

(i) (k)

Hình 3.21. Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động

a. 0,6 ml/phút b. 0,7 ml/phút

c. 0,8 ml/phút d. 0,9 ml/phút

e. 1,0 ml/phút f. 1,1 ml/phút

g. 1,2 ml/phút h. 1,3 ml/phút

i. 1,4 ml/phút k.1,5 ml/phút

Dựa vào các bảng số liệu, đồ thị và sắc đồ píc sắc ký, chọn được tốc độ

dòng phù hợp để thời gian lưu tốt nhất, píc gọn, sắc nét, không bị doãng là

0,8ml/phút (hình 3.21- c).



57

Vì vậy, chúng tôi chọn tốc độ dòng là 0,8 ml/phút là tốc độ phù hợp nhất.

Pha động thứ hai gồm ACN và đệm được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích

3.4.1. Tổng kết các điều kiện đã chọn

Từ các điều kiện đã khảo sát theo hai hệ dung môi ở phía trên thì điều kiện

tối ưu được lựa chọn cho quá trình phân tích như sau:

Pha tĩnh: RP- C8 (4,6 x 150 mm, 5m)

Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri 1- heptansunfonat),

pH=3

Tốc độ pha động: 0,8 ml/phút


Thể tích vòng mẫu: 20l

Detector: UV-Vis 550 nm

3.4.2. Khảo sát lập đƣờng chuẩn trong khoảng nồng độ 0,01- 2,00ppm với

pha động ACN- đệm

Pha tĩnh: RP- C8 (4,6x150 mm, 5m)

Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri 1- heptansunfonat), pH=3





Khoảng nồng độ: 0,01ppm- 2,00ppm

Phương pháp định lượng: diện tích píc

Mẫu gốc ban đầu được pha vào trong ACN, các dung dịch loãng được pha

từ dung dịch gốc với dung môi là pha động nhằm tránh các píc ảo do sự sai khác



58

thành phần dung môi trong quá trình chạy sắc ký gây ra, tiến hành siêu âm loại

khí, sau đó chuyển vào bộ phận mẫu của HPLC.

Kết quả được trình bày trong bảng 3.11.

Bảng 3.11. Diện tích píc sắc ký phụ thuộc vào nồng độ rhodamine B

STT Nồng độ (ppm) Lần đo Diện tích píc sắc ký

(mAu.s)

1

0,01

Lần 1 14836

Lần 2 14245

Trung bình 14541

2 0,05

Lần 1 74617

Lần 2 73904

Trung bình 74261

3 0,1

Lần 1 137403

Lần 2 136067

Trung bình 136735

4 0,5

Lần 1 612153

Lần 2 610352

Trung bình 611253

5 1,0

Lần 1 1184233

Lần 2 1228887

Trung bình 1206560

6 2,0

Lần 1 2540712

Lần 2 2190054

Trung bình 2365383



59

Dựa vào số liệu bảng trên, sử dụng phần mềm Orgirin version 7.5 của hãng

Microcal xây dựng đường chuẩn. Kết quả thu được trình bày trong hình 3.22

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

Sp

ic(m

Au

.s)

nong do RhodamineB(ppm)

Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 15842.96822 5536.57418

B 1.1786E6 5911.7569

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99995 10290.53328 6 <0.0001

---------------------------------------------------

Hình 3.22. Đường chuẩn theo diện tích píc trong khoảng nồng độ

(0,01ppm 2ppm) đối với hệ ACN- đệm

Dựa vào đường chuẩn hình 3.22 ta thấy giá trị P< 0,05 chứng tỏ x và y có

quan hệ tuyến tính.

Theo các kết quả trên ta có: a= 15842,968; b= 1178600; Sa=5536,574; Sb

= 5911,757. Độ lệch chuẩn của phương trình là: Sy= 10290,533. Hệ số tương

quan r= 0,99995, độ phân giải R2 = 0,9999, pic cân đối, độ nhạy của phương

pháp khá cao.

Tra bảng giá trị chuẩn t với bậc tự do f= 5, độ tin cậy 95% có t= 2,571 nên

phương trình hồi qui sẽ có dạng: Y= (b t. Sb) X+ (a t. Sa)

Hay Y= (1178600 15199,13)X +(15842,968 14234,53)

Ngoài ra, các thông số trong bảng phân tích phương sai cũng cho biết mô

hình xây dựng được là phù hợp với thực nghiệm.

Đánh giá phương trình hồi quy của đường chuẩn:



60

Trong phương trình hồi qui y= a+ bx, trường hợp lý tưởng xảy ra khi a=0

(khi không có chất phân tích thì không có tín hiệu). Tuy nhiên, trong thực tế các

số liệu phân tích thường mắc sai số ngẫu nhiên luôn làm cho a 0. Nếu giá trị a

khác “0” có nghĩa thống kê thì phương pháp phân tích sẽ mắc sai số hệ thống. Vì

vậy trước khi sử dụng đường chuẩn cho phân tích công cụ cần kiểm tra xem sự

khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 có ý nghĩa thống kê không.

Giả sử phương trình có dạng: y= a+ bx

Nếu xem a 0 => y= B’x

Thay các giá trị xi và yi vào phương trình y= B’x sẽ tìm được Bi’ và tính

B’ là trung bình cộng của các giá trị Bi’. Các giá trị Bi’ được tính như bảng dưới đây

x (ppm) 0,01 0,05 0,1 0,5 1 2

x. 106, M 0,0209 0,1044 0,209 1,044 2,09 4,18

Y 14541 74261 136735 611253 1206560 2365383

Bi’ 695742 711312 654234 585491 577301 565881

Từ đó ta có B’= 631660,17

Phương sai của hai phương trình sẽ được tính như sau:

2

2

2

i i

y

y a bxS

n

2

' 2'

3

i i

y

y B xS

n

Ta có: Ftính = S’2/ S

2 = 1,68.

So sánh với giá trị Fbảng tại P= 0,95, f1 = n-3 = 3, f2 = n-2 = 4.

Có : F(0,95; 3; 4)= 6,5914

=> Ftính < Fbảng , có nghĩa là sự sai khác giữa giá trị a và 0 không có ý nghĩa thống

kê hay phương pháp không mắc sai số hệ thống.



61

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0

25000

50000

75000

100000

125000

Hình 3.23 Sắc đồ píc sắc ký tại các nồng độ khác nhau của Rhodamine B

(từ dưới lên: 0,01ppm; 0,05ppm; 0,1ppm; 0,5ppm; 1ppm; 2ppm)

3.4.3. Giới hạn phát hiện (limit of detection- LOD)

Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà phương

pháp phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu

trắng hay tín hiệu nền, hay píc sắc ký của chất phân tích phải có chiều cao H thoả mãn:

H 3 x n

Trong đó:

H là chiều cao pic

n là độ lệch chuẩn của tín hiệu nền.

Từ đó xác định giới hạn phát hiện theo hai phương pháp sau:

3.4.3.1. Phƣơng pháp tính toán theo đƣờng chuẩn

Dựa vào đường chuẩn ta có:

LOD = 3 x SB/b



62

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0


/1.7

53

/1.9

92

/2.1

46

/2.4

87

/2.5

59

/2.6

21

/2.7

50

/2.8

80

/3.1

39

/3.5

93

Trong đó:

b là hệ số góc của phương trình hồi quy

SB là độ lệch chuẩn của mẫu trắng, cũng được xác định theo phương trình

hồi quy.

Như vậy theo phương trình hồi quy ta có:

LOD= 0,015 g/ml

Hay LOD= 15ppb

3.4.3.2. Phƣơng pháp trực tiếp

Dùng chính chất phân tích tiến hành pha loãng liên tục chất phân tích

trong pha động, rồi cho chạy sắc ký tới khi nào chiều cao pic thu được vẫn còn

khả năng phân biệt được với tín hiệu nền thì nồng độ đó được coi là giới hạn

phát hiện.

Tiến hành pha loãng dung dịch gốc 50 ppm thành các dung dịch thử 1ppm,

0,5ppm, 0,1ppm, 0,01ppm, 0,001ppm, tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện

tối ưu đã lựa chọn thu được các sắc đồ píc sắc ký được biểu diễn ở hình 3.24.

(a) (b)

0.0 2.5 5.0 7.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0


/2.0

01

/2.1

52

/3.1

29

RT

3.7

75/3

.573



63

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

-1.50

-1.25

-1.00

-0.75

-0.50

-0.25

0.00

0.25

0.50


/2.0

07

/2.1

81

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

-0.75

-0.50

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75


/1.6

42

/1.7

67

/1.9

92

/2.2

14

RT

3.7

75/3

.775

(c) (d)

(e)

Hình 3.24. Sắc đồ píc sắc ký mẫu chuẩn rhodamine B tại các nồng độ

a. 1ppm b. 0,5ppm c. 0,1ppm

d. 0,01ppm e. 0,001ppm

Dựa vào hình 3.24 nhận thấy tại nồng độ 0,001ppm chiều cao pic thu được

vẫn còn khả năng phân biệt được với tín hiệu nền, có chiều cao gấp hơn ba lần so

với tín hiệu nền.

Vì vậy giới hạn phát hiện là 0,001ppm (hay 1ppb).

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0


/1.9

86

/2.1

75

/2.4

69

/2.5

34

/2.7

29

/2.8

45

/3.1

91

RT

3.7

75/3

.626



64

3.4.4. Giới hạn định lƣợng (limit of quanlity- LOQ)

Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ

thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định

lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền (blank or background).

LOQ = 10 x SB/b

Trong đó:

b là hệ số góc của phương trình hồi quy

SB là độ lệch chuẩn của mẫu trắng, cũng được xác định theo phương trình

hồi quy.

Như vậy theo phương trình hồi quy ta có:

LOQ= 0,0502 g/ml

Hay LOQ= 50,2 ppb

Theo phương pháp trực tiếp, giới hạn phát hiện là 3,33 ppb.

3.4.5. Độ chính xác của phép đo

Độ chính xác của phép đo được đánh giá thông qua phần trăm sai số.

Chọn các mẫu phân tích có nồng độ tại điểm đầu, cuối và giữa khoảng tuyến tính

đã khảo sát. Chúng tôi tiến hành chuẩn bị 3 mẫu chuẩn có nồng độ lần lượt là

0,1ppm; 0,5ppm; 1,0ppm rồi tiến hành chạy sắc ký, mỗi mẫu chạy lặp 8 lần.

Phần trăm sai số được tính theo công thức sau:

% 100i t

t

S SX x

S

Trong đó: Si là diện tích tính từ đường chuẩn

St là diện tích theo sắc đồ

Tiến hành khảo sát các mẫu chuẩn với cùng điều kiện sắc ký với các nồng độ

khác nhau

Pha tĩnh: RP- C8 (4,6x150 mm, 5m)

Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 0,007M natri heptansunfonat), pH=3



65





Kết quả thu được đối với mẫu chuẩn rhodamine B 0,1ppm được thể hiện ở

bảng 3.12. và hình 3.25.

Bảng 3.12. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 0,1ppm

Lần Si (mAu.s) St(mAu.s) %X

1 133703 158610 15,7

2 133703 172011 22,3

3 133703 158329 15,6

4 133703 153114 12,7

5 133703 156156 14,3

6 133703 164426 18,7

7 133703 134911 0,9

8 133703 177861 24,8

Trung bình 133703 159427 16,1



66

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 min

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

Hình 3.25. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 0,1ppm

Đối với mẫu chuẩn rhodamine B 0,5ppm, kết quả được thể hiện ở bảng 3.13 và

hình 3.26


Lần Si (mAu.s) St (mAu.s) %X

1 603643 636591 5,200

2 603643 603835 0,032

3 603643 571106 5,700

4 603643 604149 0,084

5 603643 605637 0,330

6 603643 632199 4,520

7 603643 639441 5,600

8 603643 620651 2,740

Trung bình 603643 614201 1,650



67

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000


Đối với mẫu chuẩn rhodamine B 1ppm, kết quả được thể hiện ở bảng 3.14

và hình 3.27.


Lần Si (mAu.s) St (mAu.s) %X

1 1194443 1094436 9,14

2 1194443 1174836 1,67

3 1194443 1176335 1,54

4 1194443 1242369 3,86

5 1194443 1179170 1,30

6 1194443 1210724 1,35

7 1194443 1210573 1,33

8 1194443 1164153 2,60

Trung bình 1194443 1181575 1,09



68

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000


Như vậy tại mọi điểm trên đường chuẩn, sai số của phép đo đều nằm trong

giới hạn cho phép. Cận dưới của đường chuẩn 0,1ppm mắc phải sai số tương đối

lớn (từ 0,9- 24%, trung bình 16%).

3.4.6. Độ lặp lại của phép đo

Một phương pháp phân tích tốt ngoài việc có sai số nhỏ còn yêu cầu có độ

lặp lại cao. Theo lý thuyết thống kê, các đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại là độ

lệch chuẩn SD và hệ số biến thiên CV (RSD). Độ lặp lại được đánh giá thông

qua việc tính toán với ba nồng độ: 0,1ppm; 0,5ppm; 1ppm như khi khảo sát độ

chính xác

2( )

1

i tbS SSD

n

% 100tb

SDCV x

S

Trong đó: Si là diện tích pic sắc ký thứ i

Stb là diện tích trung bình của n lần chạy

n là số lần lặp lại



69

Bảng 3.15. Độ lặp lại của các phép đo tại các nồng độ

Nồng độ Rhodamine

B(ppm)

Độ lệch chuẩn SD Hệ số biến thiên CV

(%)

0,1 12965 8,13

0,5 22813 3,71

1,0 43690 3,70

Nhận xét: theo AOAC, CV% cho phép tại cấp độ 100ppb là 15%, 1ppm là

11%. Tại những cấp độ khảo sát, CV% của phương pháp nằm trong khoảng

3,7% đến 8,13 % là phù hợp với yêu cầu của AOAC.

3.5. Phân tích mẫu thực phẩm, quy trình xử lý và kết quả phân tích

3.5.1. Khảo sát dung môi chiết lấy rhodamine B

3.5.1.1. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích

Áp dụng các điều kiện tối ưu được để phân tích bốn đối tượng mẫu là hạt

dưa, bánh xu xê, nước ngọt hương dâu và siro dâu.

Tống số mẫu phân tích là 3 mẫu/đối tượng x 4 đối tượng (hạt dưa, bánh xu

xê, nước ngọt hương dâu và siro dâu). Cứ ba đơn vị mẫu của một đối tượng thu

thập được trộn với nhau thành mẫu phức hợp để phân tích.

Phương pháp chọn mẫu: Mẫu được chọn theo phương pháp chủ định có

định hướng tại 3 chợ, mỗi chợ mua một đơn vị mẫu trên một đối tượng mẫu.

Mẫu thực phẩm được mua tại một số chợ ở Hà Nội: chợ Đồng Xuân, chợ Mơ,

Chợ Ngã Tư Sở.

Mẫu thực phẩm mua về được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C, mẫu

đem phân tích được sấy khô ở nhiệt độ 400C, nghiền nhỏ, cân với lượng cân

chính xác và được chiết trong dung môi chiết thích hợp.



70

3.5.1.2. Chọn dung môi chiết

Dung môi chiết là một yếu tố vô cùng quan trọng quyết định hiệu suất của

quá trình xử lý mẫu. Các dung môi chiết chúng tôi sử dụng ở đây là ACN-

axeton, etanol- nước, nước- KCl, ACN- axeton- nước, nước, etanol.

Chúng tôi tiến hành xử lý sơ bộ mẫu hạt dưa rồi chiết với các dung môi

chiết khác nhau để lựa chọn dung môi chiết tốt nhất.

Cân chính xác 1,0000gam hạt dưa vào bình 25ml, thêm 10ml hỗn hợp các

dung môi (4 mẫu vào 4 bình):

100% etanol

50% etanol- 50% nước

100% nước có thêm KCl

20% ACN- 20% axeton- 60% nước

Siêu âm 60 phút, lọc qua giấy thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45m,

lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC.

Kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.16 và hình 3.28.

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới hàm lượng rhodamine B

trong mẫu hạt dưa

Dung môi chiết Khối lƣợng mẫu (gam) Nồng độ rhodamine B

(ppm)

Etanol 1,000 0,46

Etanol- nước 1,001 143

ACN- Axeton- nước 1,000 20

Nước- KCl 1,003 1,08



71

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75


1/1

.997

2/2

.380

3/2

.665

4/3

.103

5/3

.584

(a) (b)

0.0 2.5 5.0 7.5 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0


/1.5

41

/1.6

62

/1.7

77

/2.0

35

/2.1

60

/2.5

51

/2.7

98

/2.9

03

/3.0

49

/3.3

92

/3.8

53

/4.2

55

(d) (c)

Hình 3.28. Sắc đồ píc sắc ký mẫu hạt dưa với các dung môi chiết

(a) 100% etanol (không pha loãng)

(b) 50% etanol- 50% nước (pha loãng 100 lần)

(c) 20% ACN- 20% axeton- 60% nước (pha loãng 100 lần)

(d) 100% nước- KCl (không pha)

Căn cứ vào bảng số liệu và sắc đồ píc sắc ký nhận thấy sử dụng dung môi

chiết etanol- nước sẽ thu được hàm lượng rhodamine B lớn nhất. Vì vậy, chúng

tôi đã lựa chọn dung môi chiết là etanol- nước (hỗn hợp b) để chiết rhodamine B

trong các mẫu hạt dưa.

0.0 2.5 5.0 7.5 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0


1/2

.085

2/2

.357

3/2

.434

4/2

.621

5/3

.098

6/3

.529

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

-1.25

-1.00

-0.75

-0.50

-0.25

0.00

0.25

0.50

0.75


1/1

.501

2/1

.965

3/2

.240

4/2

.509

5/3

.582



72

Với dung môi chiết đã lựa chọn, tiến hành khảo sát tỷ lệ etanol- nước thích

hợp nhất.

Tiến hành xử lý mẫu: cân 0,5 gam mẫu hạt dưa, cho vào bình 25 ml, thêm 10

ml hỗn hợp etanol và nước theo các tỷ lệ khác nhau, siêu âm 60 phút, lọc qua

giấy lọc thường, rồi lọc qua màng lọc Whatman 0,45m, pha loãng 5 lần lấy 2ml

dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC.

Kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.17 và hình 3.29.

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới diện tích píc Rhodamine B

trong hạt dưa

Dung môi chiết Khối lƣợng mẫu (gam) Diện tích píc (mAu.s)

40% nước- 60% etanol 0,500 78797

50% nước- 50% etanol 0,501 584883

60% nước- 40% etanol 0,501 1609291

70% nước- 30% etanol 0,502 830214

80% nước- 20% etanol 0,500 856503

(a) (b)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5


1/3

.521

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0


1/3

.522



73

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0mV


1/3

.509

(c) (d)

(e)

Hình 3.29. Sắc đồ píc sắc ký rhodamine với các tỷ lệ dung môi chiết

(a) 80% nước- 20% etanol (b) 70% nước- 30% etanol

(c) 60% nước- 40% etanol (d) 50% nước- 50% etanol

(e) 40% nước- 60% etanol

Với các số liệu đã khảo sát được đối với mẫu hạt dưa trên các tỷ lệ dung

môi chiết etanol- nước khác nhau, nhận thấy dung môi chiết thích hợp nhất là

60% nước- 40% etanol (hình 3.29- c) vì pic thu được gọn và diện tích lớn nhất.

Ba mẫu còn lại: bánh xu xê, nước ngọt vị dâu và siro dâu, chúng tôi tiến

hành khảo sát xử lý mẫu với các điều kiện tương tự xử lý mẫu hạt dưa, từ hiệu

suất thu hồi của các quá trình chiết ba loại mẫu trên nhận thấy dung môi chiết

thích hợp nhất cũng là 60% nước- 40% etanol.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0


1/3

.514

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0


1/3

.522



74

3.5.2. Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết

3.5.2.1. Mẫu hạt dƣa

Sau khi tìm được các điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu, chúng tôi

tiến hành phân tích mẫu thực thế trong các đối tượng mẫu: hạt dưa, bánh xu xê,

nước ngọt, tương ớt

Đối với mẫu hạt dưa,quy trình chiết như sau: mẫu hạt dưa được cân chính

xác 0,5g trên cân phân tích rồi chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10ml hỗn

hợp etanol và nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút. Sau khi chiết, lấy

2,0ml dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 10ml và định mức bằng pha

động, lắc đều lọc qua giấy lọc thường, rồi lọc qua màng lọc Whatman 0,45m,

lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với các điều kiện sắc ký như đã

chọn (mục 3.4.1).

Đối với các chất mẫu phân tích thêm chuẩn thì lượng chất chuẩn được

thêm vào ngay từ đầu trước khi chiết. Các quá trình chiết cũng được tiến hành

trong các điều kiện tương tự các mẫu phân tích không thêm.

Xác định hàm lượng rhodamine B trong mẫu hạt dưa theo phương pháp

thêm tiêu chuẩn, thông qua cách lập phương trình hồi quy của đường thêm chuẩn

dạng y= a+ bx.

Ta có:

x

aC

b và 2 2( ) ( )x a b

x

S S S

C a b

Trong đó:

Cx : nồng độ chất phân tích có trong dung dịch bơm vào cột tách

a, b là hệ số trong phương trình hồi qui

Sa, Sb: sai số của hệ số trong phương trình hồi qui

Sx : sai số nồng độ xác định theo phương pháp thêm chuẩn

Khối lượng chất phân tích có trong a mg mẫu cân ban đầu là:



75

mcpt= V*Cx*F*10-3

Trong đó:

mcpt: khối lượng chất phân tích trong a mg mẫu (mg)

V: thể tích dung dịch được pha từ a mg

F: hệ số pha loãng

Cx: nồng độ của chất phân tích xác định được từ phương trình hồi qui

10-3

: hệ số chuyển từ g sang mg

Kết quả phân tích mẫu rhodamine B được trình bày trong bảng 3.18

Bảng 3.18. Kết quả phân tích mẫu hạt dưa

TT Khối lƣợng mẫu

thực (mg)

Lƣợng rhodamine

B chuẩn thêm vào

(ppm)


1 500 0,0 546419,0

2 500 0,5 1295550

3 500 1,0 2364128

Kết quả được tính toán theo phần mềm thống kê Origin 7.5 như sau:

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

(a) (b)

Hình 3.30. Đường thêm chuẩn (a) và sắc đồ (b) khi thêm chuẩn

đối với mẫu hạt dưa

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

Sp

ic(m

Au

.s)

nong do Rhodamine B(ppm)

Y = A + B * X

he so gia tri sai so

------------------------------------------------------------

A 1.03868E6 17297.10384

B 2.2321E6 26796.55804

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99993 18948.02791 3 0.00764

------------------------------------------------------------



76

Ta có:

Cx= a/b = 0,465 (ppm)

Theo công thức tính hàm lượng chất phân tích trong 500mg mẫu ban đầu,

tính được:

mx = 0,02325(mg)

Hay khối lượng rhodamine B có trong 1 gam mẫu hạt dưa là 0,0465 mg/g

Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức sau:

0

.100%xCH

C

Với 0( ) 1. .

y

x

S S aC F

b m

Trong đó:

a,b là hệ số hồi qui trong phương trình đường chuẩn

F là hệ số pha loãng

m là khối lượng cân của mẫu phân tích

Cx là lượng chất tính từ đường chuẩn hồi qui

C0 là lượng chất thêm chuẩn ban đầu

Dựa vào công thức này tính được hiệu suất thu hồi đối với chất phân tích

là

H= 0,465/0,5 x 100=93%

Nhận xét: Với các kết quả phân tích trên, nhận thấy rằng, trong đối tượng

mẫu hạt dưa, hàm lượng Rhodamine B nằm trong giới hạn phát hiện và giới hạn

định lượng của phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt (93%). Như vậy với

đối tượng phân tích là mẫu hạt dưa thì dung môi chiết và phương pháp tối ưu lựa

chọn là phù hợp và cho hiệu quả phân tích tốt. Kết quả phân tích cũng cho thấy



77

trong mẫu hạt dưa được phân tích có chứa rhodamine B 0,0465mg/g, là chất bị

cấm sử dụng trong chế biến và bảo quản thực phẩm.

3.5.2.2. Mẫu bánh xu xê

Giống như mẫu hạt dưa ở trên, chúng tôi tiến hành chiết mẫu và phân tích

theo quy trình tương tự nhưng không pha loãng.

Đối với mẫu bánh xu xê,quy trình chiết như sau: mẫu bánh xu xê được cân

chính xác lượng 1,030g trên cân phân tích rồi chuyển vào bình định mức 25ml,

thêm 10ml hỗn hợp etanol và nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút.

Sau khi chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết , lắc đều lọc qua giấy lọc thường, rồi lọc

qua màng lọc Whatman 0,45m, lấy dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với

các điều kiện sắc ký như đã chọn (mục 3.4.1).

Kết quả phân tích mẫu rhodamine B trong bánh xu xê được trình bày trong

bảng 3.19

Bảng 3.19. Kết quả phân tích mẫu bánh xu xê

TT Khối lƣợng mẫu

thực (mg)

Lƣợng Rhodamine


(ppm)


1 1030,4 0,0 305 245

2 1030,0 0,2 657 811

3 1035,0 0,4 1 044 941




78

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0

10000

20000

30000

40000

(a) (b)

Hình 3.31. Đường chuẩn và sắc đồ khi thêm chuẩn đối với mẫu bánh xu xê

Ta có:

Cx= a/b = 0,162 (ppm)

Theo công thức tính hàm lượng chất phân tích trong 1030mg mẫu ban

đầu, tính được

mx = 0,000324(mg)

Hay khối lượng rhodamine B có trong 1 gam mẫu là: 0,000315mg/g

Hiệu suất thu hồi của chất phân tích trong mẫu là

H= 0,162/0,2 x 100=81%


mẫu bánh xu xê, hàm lượng rhodamine B nằm trong giới hạn phát hiện và giới

hạn định lượng của phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt (81%), hàm

lượng Rhodamine B thu được là 0,162mg/kg. Như vậy với đối tượng phân tích là

mẫu bánh xu xê thì dung môi chiết và phương pháp tối ưu lựa chọn là phù hợp

và cho hiệu quả phân tích tốt. Kết quả phân tích cũng cho thấy trong mẫu bánh

xu xê được phân tích có chứa 0,000315mg/g rhodamine B.

-0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

Sp

ic(m

Au

.s)


Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 299484.33333 12881.24226

B 1.84924E6 49888.83676

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99964 14110.69391 3 0.01717

------------------------------------------------------------



79

3.5.2.4. Mẫu siro dâu

Quá trình chiết mẫu và phân tích cũng được tiến hành tương tự mẫu hạt

dưa và mẫu bánh xu xê, không pha loãng.

Đối với mẫu siro dâu,quy trình chiết như sau: mẫu siro dâu được lấy chính

xác 0,5ml bằng pipet rồi chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10 ml hỗn hợp

etanol và nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút. Sau khi chiết, lấy

2,0ml dung dịch chiết lọc qua giấy lọc thường, rồi lọc qua màng lọc Whatman

0,45m, lấy dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với các điều kiện sắc ký như

đã chọn (mục 3.4.1).

Kết quả phân tích mẫu rhodamine B trong mẫu siro dâu được trình bày

trong bảng 3.20.

Bảng 3.20. Kết quả phân tích mẫu siro dâu

TT Lƣợng mẫu thực

(ml)

Lƣợng rhodamine


(ppm)


1 0,5 0,00 28047

2 0,5 0,01 61781

3 0,5 0,02 96730




80

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

-1000

0

1000

2000

3000

(a) (b)

Hình 3.32. Đường chuẩn (a) và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu siro dâu.

Ta có:

Cx= a/b = 0,0081(ppm) (nhỏ hơn LOQ)

Theo công thức tính hàm lượng chất phân tích trong 0,5ml mẫu ban đầu,

tính được

mx = 1,62.10-5

(mg)

Hay khối lượng rhodamine B có trong 1l mẫu siro dâu là 0,0324mg/l


H= 0,0081/0,01 x 100=81%


mẫu siro dâu, hàm lượng rhodamine B nằm trong giới hạn phát hiện và giới hạn

định lượng của phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt. Như vậy với đối

tượng phân tích là mẫu siro dâu thì dung môi chiết và phương pháp tối ưu lựa

chọn là phù hợp và cho hiệu quả phân tích tốt. Kết quả phân tích cũng cho thấy

trong mẫu siro dâu được phân tích không chứa rhodamine B.

3.5.2.5. Mẫu nƣớc ngọt hƣơng dâu

-0.010 -0.005 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

Spic

(m

Au.s

)

nong do RhodamineB(ppm)

Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 27844.5 452.80377

B 3.43415E6 35074.02885

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99995 496.02167 3 0.0065

------------------------------------------------------------



81

Quá trình chiết mẫu và phân tích nước ngọt hương dâu cũng được tiến

hành tương tự mẫu siro.

Đối với mẫu nước ngọt hương dâu,quy trình chiết như sau: mẫu nước ngọt

được đong chính xác 1ml bằng pipet rồi chuyển vào bình định mức 25ml, thêm

10 ml hỗn hợp etanol và nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút. Sau khi

chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết lọc qua giấy lọc thường, rồi lọc qua màng lọc

Whatman 0,45m, lấy dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với các điều kiện sắc

ký như đã chọn (mục 3.4.1).

Kết quả phân tích mẫu rhodamine B trong mẫu nước ngọt hương dâu được

trình bày trong bảng sau:

Bảng 3.21. Kết quả phân tích mẫu nước ngọt hương dâu

TT Lƣợng mẫu thực

(ml)

Lƣợng rhodamine


(ppm)


1 1,0 0,0 96898,0

2 1,0 0.1 169861

3 1,0 0.2 248919




82

-0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

220000

240000

260000

Spic

(m

Au.s

)


Y = A + B * X


------------------------------------------------------------

A 95882.16667 2271.47239

B 760105 17594.74945

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99973 2488.27333 3 0.01473

------------------------------------------------------------

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min

0

2500

5000

7500

10000

( a) (b)

Hình 3.34. Đường chuẩn (a) và sắc đồ (b) khi thêm chuẩn đối với

mẫu nước ngọt hương dâu

Ta có: Cx= a/b = 0,126(ppm)

Theo công thức tính hàm lượng chất phân tích trong 1ml mẫu ban đầu, tính

được

mx =0,1386 (mg)

Hay khối lượng rhodamine B trong 1l mẫu nước ngọt hương dâu là 138,6mg/l


H= 0,126/0,1 x 100=126%


mẫu nước ngọt, hàm lượng Rhodamine B nằm trong giới hạn phát hiện và giới

hạn định lượng của phương pháp, hiệu suất thu hồi tốt (126%). Như vậy với đối

tượng phân tích là mẫu nước ngọt hương dâu thì dung môi chiết và phương pháp

tối ưu lựa chọn là phù hợp và cho hiệu quả phân tích tốt.

Kết quả phân tích cũng cho thấy trong mẫu nước ngọt được phân tích có

chứa 138,6mg/l rhodamine B .



83

KẾT LUẬN

Trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật

phân tích HPLC sử dụng detector UV-Vis để xác định hàm lượng rhodamine B

trong thực phẩm, chúng tôi thu được một số kết quả sau đây:

1. Đã chọn được các điều kiện phù hợp cho việc xác định hàm lượng

rhodamine B có trong các mẫu thực phẩm bằng kỹ thuật HPLC sử dụng

detetơ UV-Vis:

Pha tĩnh: RP- C8 (4,6 x 150 mm, 5m)

Pha động: 85% ACN- 15% đệm (HCOOH- 7mM natri heptansunfonat),

pH=3





2. Đã đánh giá phương pháp phân tích:

Khoảng tuyến tính của Rhodamine B: 0,01- 2ppm

Giới hạn phát hiện:

+ Theo phương pháp phân tích trực tiếp là 1ppb

+ Theo phương pháp đường chuẩn là 15ppb

Giới hạn định lượng:

+ Theo phương pháp phân tích trực tiếp là 3,33ppb

+ Theo phương pháp đường chuẩn là 50,2ppb

3. Khảo sát mẫu thực

Đã chọn được quy trình phân tích và khảo sát được các dung môi chiết

tách đối với các loại thực phẩm là 60% nước- 40% etanol.



84

Trên cơ sở quy trình tối ưu tìm được đã tiến hành xác định được hàm

lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm gồm mẫu hạt dưa, mẫu

bánh xu xê, mẫu siro dâu, mẫu nước ngọt hương dâu với độ lặp lại tốt.

Kết quả xác định các mẫu thực cho thấy: trong các mẫu thực phẩm

đang được lưu hành trên thị trường đã lấy mẫu, hàm lượng rhodamine

B xác định được đều nằm trong giới hạn phát hiện và giới hạn định

lượng của phương pháp. Chứng tỏ mặc dù bị cấm sử dụng trong chế

biến và bảo quản thực phẩm, nhưng rhodamine B vẫn đang được sử

dụng khá phổ biến trong một số loại thực phẩm đã kiểm tra.

Từ kết quả thu được, chúng tôi thấy phương pháp HPLC sử dụng detectơ

UV-Vis có độ nhạy cao, thích hợp cho việc xác định hàm lượng rhodamine B có

trong các loại thực phẩm với cách xử lý mẫu thích hợp.

Chúng tôi hy vọng những nghiên cứu trên sẽ góp phần vào việc ứng dụng

kỹ thuật HPLC sử dụng detectơ UV-Vis nói riêng và các kỹ thuật HPLC nói

chung để xác định rhodamine B trong các đối tượng mẫu thực phẩm, phục vụ

trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng.



85

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Thái Bình (18/ 11/2009), “Rhodamine B có trong vị thuốc đông y là chất

gây ung thư”, báo Sức khoẻ và đời sống.

2. Nguyễn Thạc Cát, Từ Vọng Nghi, Đào Hữu Vinh (1980) “Cơ sở ký thuyết

hoá học phân tích”, nhà xuất bản Đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội.

3. Nguyễn Xuân Dũng, Từ Vọng Nghi, Phạm Luận (1986) “Các phương

pháp tách- Sắc ký lỏng cao áp”, Đại học Tổng hợp Amsterdam, Hà Nội.

4. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung

(2003), “Hoá học phân tích- Phần II- Các phương pháp phân tích công

cụ”, ĐHQG Hà Nội.

5. Nguyễn Đắc Kiên (2009- 2010), “Nghiên cứu sự hình thành và tích lũy

độc tố afltoxin trong bảo quản thức ăn thủy sản”, luận văn thạc sỹ khoa học-

Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia, Hà Nội.

6. Phạm Luận (1999), “Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao”,

Đại học Tổng hợp Hà Nội.

7. Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Đào Tố Uyên, Phạm Văn Hoan (2009), “Xác

định Sudan I trong một số loại gia vị bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng

cao (HPLC)”, tạp chí y học thực hành, số 1 (641+642), trang 58-60.

8. Đỗ Văn Quân (2007), “Xác định các hợp chất Sudan bằng phương pháp

sắc ký lỏng có độ phân giải cao”. Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học

Quốc gia Hà Nội.

9. TCVN 8670-2011 về việc xác định Rhodamine B bằng HPLC

10. An activity of asean committee on science and technology federation of

institutes of food science and technology in asean (2005), “identification



86

of prohibited colorants in cosmetic products by TLC and HPLC”, ACM

SIN 02, pp 1-6.

11. Brian Stuart and M.Walker (2006) “Analysis of illegal Dyes in Chili

Powder by LC- UV”, Statutory analysis government chemist: Programme

ad hoc project 1, pp 1-11.

12. C.Minier (1996) “Rhodamine B accumulation and MXR protein

expression in musscle blood cells: effects of exposure to vicristine”

Marine ecology progress series vol 142 pp 165-173.

13. Carcinogen, Pesticide Branch, (2/1989), Rhodamine B, OSHA analytical

Laboratory- Salt Lake city- Utah.

14. Geertruida Sihombing (2001), “An Exploratory Study on three Synthetic

Colouring Matters Commonly Used as Food colours in Jakarta”, Master

Theses from JKPKBPPK.

15. Hu- sheng cheng (2007) “Indentification of Rhodamine B 6g and

Rhodamine B dyes present in ballpoint pen ink using high performance

liquidchromatography and UV vis spectro mettry”, Frorensic science

journal pp21-37.

16. L.Gagliardi, D.De Orsi, G.Cavazzutti, G.Multari, D. Tonelli, (6/1996),

“HPLC determination of rhodamine B (C.I. 45170) in cosmetic products”,

Chromatographia Vol.43.ultari

17. Noureddine Barka and CS(2008) “Factors influencing the photocatalytic

degradation of Rhodamine B by TiO2- coated non- woven paper” journal

of photochemistry and photobiology A: Chemistry 195, pp 346-351.

18. Giao Xuân, (1/2/2010), “Chili powder maker suspended for Rhodamine B

contaminnation health news”, báo Sức khoẻ và đời sống.



87

19. Petr botek, Jan Poustka (2007). “Determination of banned dyes in spices

by liquid chromatography- Mass spectrometry”, Czech J. Food Sci,

vol.25, No.1, pp 17- 24.

20. R.W. Mason và L.R.Edwards (1989), “High-performance liquid

chromatographic determination of rhodamine B in rabbit and human

plasma”, Journal of Chromatography, 491 page 468- 472.

21. Wirasto, Skrisi (2008). “Analisis Rhodamine B dan metanil yellow danam

minuman jajana anak sd di kecamatan laweyan kotamadya surakarta

dengan metade kromatography lapis tipis” Fakultas Farmasi,

Muhammaadiyah surakarta, Indonesia, pp 2-17

22. http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodamine_B (7/2011)

23. http://vietbao.vn/Suc-khoe/Phat-hien-chat-doc-Rhodamine-B-trong-gia-

vi/70077015/248/ (9/2/2007)

24. http://wordpress.com/2010/03/02/vấn-đề-an-toàn-thực-phẩm-tại-việt-

nam-nổi-cộm-trở-lại-với-vụ-bột-gia-vị-nhiễm-rhodamine B/Tonelli 2.

25. http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/SKLM.htm (6/2011)

26. www.asean.org/MRA-Cosmetic/Doc-2.pdf (02/12/2005)

27. http://www.leo.com (9/2008) “Using LC- TOFMS for screening of Sudan

Dyes in food”.

28. http://duocphamvn.com/baiviet/6159-28-TCN198-2004-Histamin-trong-

san-pham-thuy-san-Phuong-phap-dinh-luong-bang-sac.thuoc

29. http://3c.com.vn/Story/vn/tintucvasukien/diemtin/2007/2/8174.htmlc

(6/2011) “khâu liên quan đến quá trình sản xuất lương thực và thực phẩm”

http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodamine_B

http://vietbao.vn/Suc-khoe/Phat-hien-chat-doc-Rhodamine-B-trong-gia-vi/70077015/248/

http://vietbao.vn/Suc-khoe/Phat-hien-chat-doc-Rhodamine-B-trong-gia-vi/70077015/248/

http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/SKLM.htm

http://www.leo.com/

http://3c.com.vn/Story/vn/tintucvasukien/diemtin/2007/2/8174.htmlc

Xác định rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật HPLC dùng detector UV - VIS

Documents

Transcript of Xác định rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật HPLC dùng detector UV - VIS