Wektory wirusowe

Wykład IV i V

Ideal vector for gene delivery:

• High transduction efficiency

• High and long-lasting transgene expression

• Cell-type specificity

• No cytotoxicity

• No induction of immune response

• High transgene capacity

• Easy for construction and multiplication

Wymagania stawiane wektorom w zależności od rodzaju choroby

1. Długotrwała lub krótkotrwała ekspresja 2. Ekspresja stała lub regulowana 3. Ekspresja systemowa lub lokalna

Wektory wirusowe

Integrujące się do chromosomów nie integrujące się

Adenowirusowe HSV

Retrowirusowe LentiwirusoweAAV

Integracja zależy od:-sekwencji LTR oraz integrazy (retrowirusy) -Sekwencji ITR oraz białka rep (AAV)

Retroviral expression Retroviral expression systemsystem

Wektory retrowirusowe

Oncoretrowirusy: mamamalian and avian C-type

Lentiwirusy: HIV and others

Spumawirusy

Konstrukcja wektorów wirusowych

1. Rozdzielenie genów oraz sekwencji działających in-cis na różne wektory plazmidowe dla uniknięcie odtworzenia wirusa poprzez rekombinację

- sekwencje kodujące niezbędne dla powstania cząstki infekcyjnej działają in-trans - stosowane w postaci plazmidów lub obecne w chromatynie komórek pakujących

2. Konstrukcja plazmidu zawierającego niezbędne sekwencje działające in-cis oraz gen terapeutyczny

Konsekwencje takich modyfikacji

1. Zniszczenie naturalnego, dobrze funkcjonującego zestawu genów, niezbędnego do powstania cząstki infekcyjnej wirusa prowadzi do zaburzenia syntezy wektorów:- mało wydajne pakowanie wektorów w porównaniu z wirusami - powstawanie dużej liczby cząstek defektywnych: niekorzystnie wpływają na transdukcję

Construction of retrovirus vector

1. Construction of retrovirus vector as a recombinant plasmid in E.coli

2. Introduction of a plasmid into a packaging cell line

3. Incorporation of vector transcripts into transmissible virus particles

4. Conversion of the transcripts into double-stranded DNA by reverse transcriptase

Schemat wektora retrowirusowego

Wektory retrowirusowe

Cechy retrowirusów Cechy zmodyfikowane

Zachowane sekwencje LTR 5’ i 3’

zachowana sekwencja ψ

Usunięcie genów gag, pol, env

wprowadzenie markera selekcyjnego

wprowadzenie genu terapeutycznego/reporterowego

cząsteczki infekcyjne wytwarzane są w komórkach pakujących

1. Ectotropic - infect only rodent cells (Eco-R receptor)

2. Xenotropic - infect most mammalianexcept rodent

3. Amphotropic - infect all mammalian (receptor Ram-1 and Glvr-1)

4. Pantropic - infect various species - VSV glicoprotein

Miano (titer)

Stężenie cząstek wirusowych i/lub liczba wirionów zdolnych do trandukcji

Liczba cząstek zdolnych do transdukcji zazwyczaj prezentuje tylko niewielką część całkowitej liczby cząstek wirusowych

Wektory retrowirusowe

Pojemność 8 kb Integracja do genomu komórki Tak Specyficzność tkankowa Tak Właściwości Transfekuje tylko

komórki dzielące się Czas trwania ekspresji DługotrwałaPoziom ekspresji Umiarkowany Bezpieczeństwo ryzyko mutagenezy

insercyjnej

Wektory lentiwirusowe

Transfekują komórki nie dzielące się

Zastąpienie wirusowego genu env (powinowactwo do komórek CD4) genem VSVG - szeroki zakres powinowactwa

Wektory lentiwirusowe oparte są na:HIV-1, HIV-2

SIV FIV

Samo-inaktywujące się wektory lentiwirusowe: delecja dolnego LTR powoduje po transdukcji transkrypcyjna inaktywację gónego LTR, ograniczając ryzyko rekombinacji i mobilizacji wektora

Wykorzystanie wektorów Wykorzystanie wektorów retrowirusowych retrowirusowych

1. Terapia niedoborów odporności – transfer limofocytów (niedobór ADA) lub komórek macierzystych (X-SCID)

2. Transfer genu samobojczego kinazy tymidynowej – zapobieganie reakcji GvH (przeszczep przeciw gospodarzowi) u pacjentów z po przeszczepie allogenicznym szpiku kostnego

Serotypy adenowirusów Serotypy adenowirusów i schorzenia przez nie wywoływane i schorzenia przez nie wywoływane

The simplest of adenoviral life cycle

Entry into the cellEntry into the cell

Uncoating ofUncoating of DNADNA

replicationreplicationtranscriptiontranscription

translationtranslation

Assembly of progeny Assembly of progeny virus particlesvirus particlesand exit from celland exit from cell

DNADNARNARNA

Funkcje genów adenowirusowych

E1A – reguluje ekspresję genów niezbędnych do replikacji genomu Ad- wyłącza nadzór białka Rb nad genami kontrolującymi metabolizm nukleotydów

i replikację DNA - interakcja z modulatorami transkrypcji:

deacetylazami histonowymi, acetylotransferazą histonową - w konsekwencji dochodzi do stabilizacji i akumulacji p53 - ponieważ nadekspresje p53 prowadzi do apoptozy komórek, wirusy uruchamiaja mechanizmy temu zapbiegające – zależne od genow E1B oraz E40rf6

E2 – koduje trzy białka zaangazowane w replikacji DNA – polimeraza DNA, białko wiążące jednoniciowe DNA oraz białko preterminalne

E3 – funkcje immunosupresyjne: gp19 – hamuje prezentację antygenów w kontekście antygenów MHC klasy II 14,7 oraz 10,4 kDa – hamuje apoptoze komórek inicjowana przez fas/fas ligand oraz TNFaPromotor białek E3 wymaga białek kodowanych przez E1

E4 – białka niezbędne do selektywnej ekspresji białek wirusowych kosztem genów komórkowych – np.. zahamowanie przenoszenia do cytoplazmy transkryptów genów komórkowych na rzeczgenów wirusowych

cdkCyclin A Rb

E2F

TTTCGCGC

c-mycc-mybcdc2 kinasePCNA

silent

cdkCyclin A Rb

E2FTTTCGCGC

c-mycc-mybcdc2 kinasePCNA

transactivate

P

Transcription factor E2F

Mann MJ, Mol Med. Today 2000

Quiescence

Proliferation

E1A Ad protein

Wejscie do komorki DNA wirusowe

NamnazanieDNAProdukcja

bialekwirusowych

Powstawnie wirusow

potomnych

Schemat dzialania adenowirusa w komórce

Receptor dla adenovirusów: CAR

Wejscie do komorki DNA wektora

NamnazanieDNAProdukcja

leczniczegobialka

Schemat dzialania wektora adenowirusowegopierwszej generacji

Adenoviruses

•• ~40 ~40 serotypes of adenovirusesserotypes of adenoviruses (for (for gene therapy typegene therapy type 2 2 andand 5 5 were usedwere used), ), causing usually mild illness in humans causing usually mild illness in humans

•• Genome consistsGenome consists a 36 a 36 kb doublekb double--stranded linearstranded linear DNA DNA withwith ITR ITR sequences at each sequences at each endend, , withwith::

Early genesEarly genes ((responsibleresponsible for for viral gene transcriptionviral gene transcription, DNA , DNA replicationreplication, , host immune host immune suppression and host cell apoptosissuppression and host cell apoptosis

Late genesLate genes ((coding proteins requiredcoding proteins required for for virus assemblyvirus assembly))

•• E1 E1 early gene is essentialearly gene is essential for for the subsequent adenoviral gene expressionthe subsequent adenoviral gene expression

leczniczy gen

region E1DNA adenowirusa

DNA wektora adenowirusowego pierwszej generacji

Adenoviral vectors

E1 E3

E2 E4

DeletionsVector Production Capacity Features

Viral protein neosynthesis, viral replicationdespite lack of E1

E1 (and E3) 7.5 kb∆E1 E1 complementing cells

Reduced viral proteinneosynthesis,

E1 and E4complementing cells

10 kbE1,E4 (and E3)∆E1E4

E1,E2A or E2B(and E3)

E1 and E2complementing cells

9 kb∆E1E2 Block of viral replicationsever inhibition of viralprotein synthesis

Benihoud K. et al. 1999. Current Opinion in Biotechnology 10: 440.

Wykorzystanie wektorów Wykorzystanie wektorów adenowirusowych adenowirusowych w terapii genowej w terapii genowej

1. Terapia błędów metabolicznych – niedobór OCT 2. Terapia chorób monogenowych – mukowiscydoza – brak efektów 3. Terapia chorób układu krążenia – transfer genów czynników angiogennych 4. Terapia nowotworów – możliwe, że toksyczność i nasilenie immunogenności

przyniesie dodatkowy efekt terapeutyczny

Adenoviral vectors of the first generation GreatGreat::•• Very high transduction efficiencyVery high transduction efficiency•• Broad host and cell type rangesBroad host and cell type ranges•• CanCan be be prepared in high titersprepared in high titers•• Can transduce mitotic andCan transduce mitotic and postpost--mitotic cellsmitotic cells•• Do not Do not integrate with genomeintegrate with genome•• Can harbor Can harbor ~ 7 ~ 7 kb of transgenekb of transgene

But:But:•• Strong immune responseStrong immune response to to viral proteins eliminate virally transduced cells withinviral proteins eliminate virally transduced cells within 30 30

daysdays•• Neutralizing antibody response prevents readministration of adenNeutralizing antibody response prevents readministration of adenovirus vector of theovirus vector of the

same same serotypeserotype

ThusThus:: Adenoviral vectors provide the highAdenoviral vectors provide the high but but transienttransient (<4 (<4 weeksweeks) )

transgene expression transgene expression

Helper-dependent adenoviral vectors

•• Very high transduction efficiencyVery high transduction efficiency

•• Broad host species and cell type rangeBroad host species and cell type range

•• CanCan transducetransduce mitotic and postmitotic and post--mitotic cellsmitotic cells

•• Can harbor ~ 35 kb (!) of Can harbor ~ 35 kb (!) of transgenetransgene

•• Do not integrate with genomeDo not integrate with genome

•• Do not produce any viral proteinsDo not produce any viral proteins

•• Show significantly reduced Show significantly reduced immunogenicityimmunogenicity in vivoin vivo

Drawback:Drawback:•• Difficult for producing in high titersDifficult for producing in high titers

Wypelniacz (intron)moze byc zastępowany leczniczym

genemSekwencja ITR(konieczna do powielenia DNA) ITRITRleczniczy genleczniczy gen

Sekwencja Ψ(konieczna zapakowania DNA do kapsydu)

Konstrukcja wektorów Konstrukcja wektorów helperhelper--dependent dependent

Sygnal pakowania DNA do kapsydu

Sygnal pakowania DNA do kapsydu

Wirus pomocniczy

loxP loxPmolekularne nozyczki

Leczniczy gen

Wektor gutless

Komorki

Powielanie DNA w komorkach

Produkuje bialka kapsydow,

NIE pakuje sie do kapsydow

Sygnal pakowania DNA do kapsydu

zostal wyciety Pakuje sie do gotowych kapsydow

Adenoviral vectorsAdenoviral vectors

No viral protein neosynthesis, No viral replication, Helpervirus contaminants (<0.1%)

∆E1 E1 (and E3) E1 complementing cells 7.5 kb Viral protein neosynthesis, viral replicationdespite lack of E1

∆E1E4 E1,E4 (and E3) E1 and E4complementing cells

10 kb Reduced viral proteinneosynthesis,

∆E1E2 E1,E2A or E2B(and E3)

E1 and E2complementing cells

9 kb Block of viral replicationsever inhibition of viralprotein synthesis

Gutless All viral genes E1 complementing cells,helper virus

36 kb

Vector Deletions Production Capacity Features

E1 E3

E2 E4

Benihoud K. et al. 1999. Current Opinion in Biotechnology 10: 440.

Wektory AAV Wektory AAV

Wirusy związane z Wirusy związane z adenowirusamiadenowirusami (AAV) (AAV)

Małe, niepatogenne wirusy DNA jednoniciowe

Do replikacji wymagają dodatkowych genów dostarczanych przez inne wirusy (adenowirusy lub wirusa opryszczki)

Integrują do DNA w chromosomie 19

Infekują wiele typów komórek: Wiązanie AAV-2 do komórek odbywa się poprzez siarczan heparanu. Wejście do komórek –poprzez integrynę αVβ5 oraz receptor dla FGF-2

Wirusy związane z Wirusy związane z adenowirusamiadenowirusami (AAV) (AAV)

Małe, niepatogenne wirusy DNA jednoniciowe

Do replikacji wymagają dodatkowych genów dostarczanych przez inne wirusy (adenowirusy lub wirusa opryszczki)

Genom AAV – 4681 nukleotydów, na końcach 145 nukleotydowe ITR (inverted terminal repeats)

ITR – niezbędne in cis – miejsce inicjacji replikacji - sygnał pakowania do kapsydu - integracja do genomu komórki - uwolnienie z chromosomu (w przypadku wektorów z rekombinantowego plazmidu)

SiteSite--specificspecific integrationintegration• AAV integrates usually stably into

a specific site on chromosome19q13.3 (AAVS1)

• Integration region- AAVS1 (RBS,TRS)

• Rep78 and Rep68 bind to a 109 bp DNA fragment near AAVS1 andcan mediate complex formation(DNA of chromosome 19 andAAV harpin DNA)

• Viral DNA replication withinAAVS1 are likely involved in site-specific integration;

Wektory AAV

usunięcie genów rep i cap wprowadzenie genu terapeutycznego

ITRITR

Wektory AAV Wektory AAV

- utrata zdolności do specyficznej integracji w chromosomie 19spowodowane brakiem białek Rep68 oraz Rep78

- integracja niespecyficzna (z niską, około 5-10 % wydajnośćia) - wystepują w postaci episomalnej

Serotypy AAV

5 serotypów (ostatnio doniesienia o szóstym)

Wystepują przeciwciała neutralizujące, ale nie zapobiegają ponownej infekcji – istotne dla Wykorzystania AAV w terapii genowej

- receptorem dla serotypu AAV-5 - PDGFR

AAV Helper-Free System

Do powstania AAV potrzebne sa tylko następujące geny adenowirusa: E1, E2A, E4 oraz VA

AAV Helper-Free System

- Safe, no adenovirus required - Stable expression in dividing and non-dividing cells - Broad host range - Infects both dividing and non-dividing cells - High titer virus - Up to 100% transduction efficiency, even on

difficult-to-transfect cell lines - Lower toxicity vs. non-viral methods of gene

delivery

Vectors in Vectors in AAV AAV helperhelper--free free systemsystem

HelperHelper--free production of free production of AAV AAV vectors vectors (2) (2)

Cechy wektorów AAV Cechy wektorów AAV

Zalety

1. Długotrwała ekspresja – integracja do genomu, także postać episomalna

2. Slutecznie transdukują wiele typów komórek, także w stanie spoczynku;

3. Wirusy niepatogenne, prawdopodobnie niskie ryzyko komórkowej odpowiedzi immunologicznej, ograniczone ponadto przez usunięcie sekwencji wirusowych

Ograniczenia

1. Niespecyficzna integracja (po usunięciu sekwencji rep)2. Mała pojemność – maks. 4 kb 3. Problemy z transdukcją niektórych typów komórek – próby ukierunkowania4. Trudność uzyskania odpowiednio dużej ilości cząstek wirusa5. Możliwość odpowiedzi humoralnej – przeciwciała rozpoznające białka otoczki

AAVAAV-- konkatameryzacjakonkatameryzacja

Zastosowanie wektorów AAV w terapii genowej Zastosowanie wektorów AAV w terapii genowej

1. Choroby układu nerwowego – np. choroba Canvana 2. Mukowiscydoza 3. Hemofilia – transfer genu czynnika IX do mięśni nóg

Wirus opryszczki (HSVWirus opryszczki (HSV--1)1)

Zalety bardzo duży genom – 152 kbp – liniowy, dwuniciowy DNA, zawiera przynajmniej 84 geny (ciągłe) – około połowa tych genów jest zbędna dla replikacji wirusa.

Możliwość wprowadzania transgenów o długości przynajmniej 30 kb

Możliwość uzyskiwania dużej liczby kopii cząstek wirusa

Nieotksyczne, mogą przebywać w stanie latencji przez długi okres czasu w komórkach

Transdukują liczne typy komórek

Ograniczenia

Brak doświadczenia z zastosowaniem rekombinowanych herpeswirusów u pacjentów

Problemy z nacelowaniem transdukcji na określony typ komórek

Zastosowanie wektorów HSVZastosowanie wektorów HSV--1 1

Badania eksperymentalne:

1. Nowotwory, w tym nowotwory układu nerwowego2. Choroby obwodowegi układu nerwowego 3. Chorby centralnego układu nerwowego 4. Uszkodzenie rdzenia kręgowego5. Leczenie bólu – transfer do nerwów czuciowych wydaje się być najbardziej obiecujący

Inne wektory wirusowe Inne wektory wirusowe

1.Retro-adenowirusy2. Wirus opryszczki 3. Wirus polio, zapalenia wątroby typu A4. Wirus Ebola...

wektor lentiwirusowy zawierający białka osłonki wirusa Ebola – transdukuje komórki nabłonka oddechowego

Wektory mieszane

1. AAV - HSV - gen Rep AAV umożliwia integrację wektora w określone miejsce na chromosomie 19

2. Retrovirus-HSV

3. Retro-adeno - wprowadzenie sekwencji LTR pozwala na integrację wektora do chromosomów komórki

- wektor taki może transfekować komórki nie dzielące się (jak adenowirus) a zarazem umożliwia trwałą ekspresję

Problemy wirusowej strategii dostarczania genów

1. Toksyczność2. Ograniczona specyficzność komórkowa 3. Ograniczona pojemność wektora 4. Problemy z syntezą i przechowywaniem 5. Ryzyko rekombinacji 6. Ryzyko transferu do komórek linii płciowej 6. Wysoki koszt