WILMER GEOVANNY MOSQUERA RIVERA · bjetivos II ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE HONGOS ENDÓFITOS DE...
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I ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE HONGOS ENDÓFITOS DE PLANTAS MEDICINALES Mammea americana (Calophyllaceae) y Moringa Oleífera (Moringaceae). WILMER GEOVANNY MOSQUERA RIVERA UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALÚD MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS BUCARAMANGA 2018
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I
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE HONGOS ENDÓFITOS DE PLANTAS MEDICINALES
Mammea americana (Calophyllaceae) y Moringa Oleífera (Moringaceae).
WILMER GEOVANNY MOSQUERA RIVERA
UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALÚD
MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS BUCARAMANGA
2018
bjetivos
II
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE HONGOS ENDÓFITOS DE PLANTAS MEDICINALES
Mammea americana (Calophyllaceae) y Moringa Oleífera (Moringaceae).
WILMER GEOVANNY MOSQUERA RIVERA 16861001
Trabajo de Grado presentado como parte de los requisitos para la obtención del título de Magíster en Investigación en Enfermedades
Infecciosas.
BEATRIZ ELENA GUERRA SIERRA, PhD. Tutora
LIBETH YAJAIRA CRIADO GUERRERO, MSc.
Co-Tutora
UNIVERSIDAD DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALÚD
MAESTRÍA EN INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES INFECCIOSAS BUCARAMANGA
2018
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IV
Conserva lo que tienes, olvida lo que te duele..Lucha por lo que quieres..Valora lo que posees, perdona a
los que te hieren y disfruta de los que te aman. Nos pasamos la vida esperando que pase algo.. Y lo único que pasa es la vida, no entendemos el valor de
los momentos, hasta que se han convertido en recuerdos.
Por eso.. Haz lo que quieras hacer, antes que se convierta en lo que te "gustaría" haber hecho.
No hagas de tu vida un borrador, tal vez no tengas tiempo de pasarlo en limpio.. Nunca es tarde para
empezar a ser felices.
B. M.
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Con gran esfuerzo, sacrificio y de la mano de Dios culmina una más de mis anheladas metas, en donde estuvieron involucradas grandes
personas que cada día me dieron esa fuerza y apoyo que tanto necesité. A Dios, por su infinita bondad, a mi madre, por su
inalcanzable lucha y mágicas enseñanzas, a mi padre, que sé, que desde el cielo me bendice cada día, a mis hijos Nicole y Nícolas,
quienes con su dulzura y amor me dan la fuerza para seguir adelante, a mis tíos, esposa y familia por darme palabras de confianza y entereza, a mis amigos y compañeros, por esos
momentos inolvidables de felicidad y constante lucha. Muchas Gracias
Dedicatoria
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VI
AGRADECIMIENTOS
A mi Tutora Beatriz Elena Guerra Sierra, por su confianza puesta en mí, para dar un paso más en el campo de la investigación, por sus grandes conocimientos brindados, y por su apoyo en la culminación de mi trabajo de grado. A mi cotutora Libeth Yajaira Criado Guerrero, por sus grandes enseñanzas, paciencia y constancia, en cada uno de los resultados alcanzados en este trabajo. A la doctora Ruth Aralí Martínez, Por su apoyo incondicional, su espíritu de servicio y amor por lo que hace. A la doctora Liliana Torcoroma García, por su ánimo, apoyo y confianza brindada, para alcanzar los logros en el proyecto realizado. Al doctor Fredyc Díaz Castillo, Investigador de la Universidad de Cartagena, por su colaboración y consejería en las diferentes instancias de la investigación. A los diferentes docentes de la Maestría en Investigación de Enfermedades Infecciosas, por darme tantos conocimientos e involucrarme en el maravilloso mundo de la investigación y de las enfermedades infecciosas. Al equipo de trabajo del laboratorio LIBBAM, en especial a Adriana Sandoval por su gran entrega, colaboración y seguimiento en cada uno de los momentos de la investigación. A mis compañeros de lucha de la Maestría, Laura, Raitza, Johana R, Kathe, Rolando, Johana G y Frank, por su apoyo y grandes alegrías. A la Universidad de Santander, por brindarme sus espacios para la realización del proyecto de investigación. .A la Universidad de Cartagena, por su gran colaboración en los diferentes procesos realizados en la investigación. Al Servicio Nacional de Aprendizaje SENA, por el préstamo de sus instalaciones y equipos. Al laboratorio LIBBAM de la Universidad de Santander, por la colaboración, préstamo y servicio, de sus materiales e instalaciones
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VII
TABLA DE CONTENIDO
1INTRODUCCIÓN. .......................................................................................... 01
1.1. Las enfermedades como causa principal de preocupación en el
hombre. ..................................................................................... 04
1.2. Enfermedades Infecciosas .......................................................... 04
1.3. Mecanismos de acción de antimicrobianos ................................. 08
1.3.1. Elementos genéticos de transferencia horizontal.............. 08
1.3.2. Plásmidos ......................................................................... 08
1.3.3. Elementos trasponibles .................................................... 11
1.3.4. Integrones y cassettes genéticos ..................................... 11
1.4. Generalidades de la resistencia a los antimicrobianos ................ 13
1.4.1. Algunos antecedentes y problemática de la resistencia
bacteriana ................................................................................... 15
1.5. Bacterias ..................................................................................... 17
1.5.1. Escherichia Coli. (E. coli). ................................................. 17
1.5.1.1. Generalidades de taxonomía ....................... 17
1.5.1.2. Importancia de morbi-mortalidad de E. coli. . 18
1.5.1.3. Antígenos, patogenicidad, clasificación
Patotipos mencionados de E. coli ................ 19
1.5.1.4. Sensibilidad y Resistencia de E. coli a
antimicrobianos ........................................... 21
1.5.1.5. Mecanismos de resistencia E. coli ............... 22
1.5.1.6. Cepas Escherichia coli (ATCC® 25922™)... 24
1.7.1.6.1 Ficha técnica de la cepa
Escherichia coli. .......................................... 25
1.5.2. Staphylococcus aureus (S. aureus). ................................. 26
1.5.2.1. Staphylococcus aureus (S. aureus), resistente
Meticilina ............................................... 27
1.5.2.2. Importancia de morbi-mortalidad de
Staphylococcus aureus (S. aureus). ............ 28
1.5.2.3. Sensibilidad y resistencia de Staphylococcus
aureus (S. aureus) a antimicrobianos .......... 29
1.5.2.4. Mecanismos de resistencia de Staphylococcus
aureus (S. aureus). ...................................... 31
1.5.2.5. Cepa de Staphylococcus aureus (S. aureus).
(ATCC® 29213™). ...................................... 31
bjetivos
VIII
1.5.2.5.1. Ficha técnica Staphylococcus
aureus (S. aureus). (ATCC® 29213™). ....... 32
1.6. Plantas ........................................................................................ 33
1.6.1. Plantas medicinales ......................................................... 33
1.6.1.1. Planta medicinal Mammea americana ......... 35
1.6.1.1.1. Generalidades y descripción
botánica .................................. 35
1.6.1.1.2. Metabolitos aislados de Mammea
americana ............................... 38
1.6.1.2. Planta medicinal Moringa oleífera ................ 39
1.6.1.2.1. Generalidades y descripción
botánica .................................. 39
1.6.1.2.2. Metabolitos aislados de Moringa
Oleífera ................................... 43
1.7. Generalidades de los hongos ..................................................... 44
1.7.1. Hongos endófitos ............................................................. 47
1.7.1.1. Clasificación de los hongos endófitos .......... 48
1.7.1.2. Hongos Endófitos como fuente potencial de
Metabolitos Secundarios de importancia
médica. ........................................................ 48
1.7.1.3. Tipos de metabolitos secundarios obtenidos
de hongos endófitos y familia de plantas
más reportadas............................................ 51
2. OBJETIVOS .............................................................................................. 59
2.1. Objetivo General ......................................................................... 59
2.2. Objetivos Específicos .................................................................. 59
3. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................... 60
3.1. Diseño de estudio ....................................................................... 60
3.1.1. Tipos de estudio ............................................................... 60
3.2. Recolección de muestras ............................................................ 61
3.3. Lavado y desinfección de material vegetal .................................. 63
3.4. Segmentación y siembra de material vegetal .............................. 63
3.5. Aislamiento de hongos endófitos ................................................ 65
3.5.1 Codificación de hongos endófitos ..................................... 65
3.6. Selección de la actividad antimicrobiana..................................... 66
3.7. Prueba de presentación de endófitos .......................................... 66
3.8. Obtención de biomasa de hongos endófitos ............................... 66
3.9. Preparación de extractos fúngicos .............................................. 67
3.10. Cepas bacterianas ...................................................................... 67
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IX
3.11. Ensayo antimicrobianos In vitro con extractos etanólicos ........... 67
3.11.1 Pruebas estadísticas con extractos etanólicos ................. 67
3.12. Selección de hongos endófitos con actividad antimicrobiana de
extractos etanólicos .................................................................... 68
3.13. Identificación de hongos endófitos .............................................. 68
3.14. Determinación de la concentración mínima inhibitoria y bactericida
......................................................................................... 68
3.15. Prueba de citotoxicidad. .............................................................. 70
3.15.1. Líneas celulares. .................................................... 70
3.15.2. Prueba de citotocixidad en células (Vero, ATCC CCL-
81). ........................................................................ 70
4. RESULTADOS. .................................................................................... 72
4.1. Recolección y desinfección del material vegetal ......................... 72
4.2. Siembra efectiva de fragmentos vegetales de las plantas
medicinales Mammea americana y Moringa Oleífera.................. 72
4.3. Aislamiento de hongos endófitos ................................................ 73
4.4. Prueba de preselección de endófitos .......................................... 74
4.5. Identificación de hongos endófitos .............................................. 78
4.6. Extractos fúngicos....................................................................... 83
4.7. Pruebas estadísticas ................................................................... 84
4.8. Determinación de la concentración Inhibitoria Mínima y
Bactericida. ................................................................................. 87
4.9. Citotoxicidad .............................................................................. 89
4.9.1. Análisis de datos para hallar citotoxicidad ................................... 89
5. DISCUSIÓN. ........................................................................................ 90
6. CONCLUSIONES ................................................................................. 95
7. REFERENCIAS .................................................................................... 96
8. ANEXOS ............................................................................................. 122
bjetivos
X
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de la transmisión de enfermedades infecciosas ............... 06
Figura 2. Historia natural de la enfermedad en el hombre, según el modelo
clásico de Leavel-Clark, 1940. ......................................................................... 07
Figura 3. Imagen estructural de una bacteria, mostrando su cromosoma
bacteriano y estructura plasmídica. ................................................................. 09
Figura 4. Transferencia del plásmido F mediante conjugación. ....................... 09
Figura 5. Clasificación taxonómica de la bacteria Escherichia coli. ................. 18
Figura 6. Complejo ilustrativo de patotipos en E. coli, causante de
enfermedades de importancia clínica en seres humanos................................. 20
Figura 7. Patogenicidad de patotipos de E. coli en células diana. ................... 21
Figura 8. Mecanismos de Resistencia en Gram-negativos.............................. 23
Figura 9. Taxonomía Staphylococcus aureus. ................................................ 26
Figura 10. Mammea americana y su descripción botánica. ............................. 35
Figura 11. Distribución Geográficade la Mammea americana ......................... 36
Figura 12. Distribución geográfica de Mammea americana L. en Colombia. ... 37
Figura 13. Estructura básica de una cumarina. ............................................... 38
Figura 14. Moringa oleífera y su descripción botánica. ................................... 40
Figura 15. Beneficios, Propiedades y aplicaciones de cada una de las
estructuras de la planta Moringa oleífera. ........................................................ 41
Figura 16. Distribución Geográfica de Moringa oleífera .................................. 42
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XI
Figura 17. Distribución de áreas potenciales en Colombia, para el cultivo de
Moringa oleífera. .............................................................................................. 43
Figura 18. Hongos endófitos y sus características como agentes de protección
........................................................................................................................ 47
Figura 19. Propiedades de los metabolitos secundarios, como defensa,
atracción y protección. ..................................................................................... 57
Figura 20. Esquema metodológico. ................................................................. 60
Figura 21: Plantas medicinales y microorganismos materia de estudio. ......... 61
Figura 22. Colección y desinfección de muestras, de plantas medicinales
Mammea americana y Moringa Oleífera. ......................................................... 61
Figura 23. Lugares geográficos de recolección de muestras vegetales. ......... 62
Figura 24. Método de obtención de hongos endófitos de M. americana y M.
oleífera. ........................................................................................................... 64
Figura 25. Siembra de estructuras de plantas medicinales Mammea americana
y Moringa oleífera, en medio APD. .................................................................. 65
Figura 26. Estandarización del protocolo-Concentración Inhibitoria mínima en
placa ................................................................................................................ 69
Figura 27. Proceso de desinfección de muestras vegetales de Mammea
americana y Moringa oleífera. ......................................................................... 72
Figura 28. Crecimiento de hongos endófitos en muestras vegetales de
Mammea americana y Moringa oleífera ........................................................... 73
Figura 29. Aislamiento de hongos endófitos de muestras vegetales de Mammea
americana y Moringa oleífera .......................................................................... 73
Figura 30. Frecuencia de hongos endófitos aislados, según el tipo de tejido
vegetal. ............................................................................................................ 75
bjetivos
XII
Figura 31. Porcentaje de hongos endófitos aislados de Mammea americana y
Moringa oleífera ............................................................................................... 75
Figura 32. Prueba dual – halos de inhibición de hongos endófitos de plantas
medicinales Mammea americana y Moringa oleífera. ...................................... 76
Figura 33. Estructuras microscópicas de hongos endófitos aislados de Moringa
oleífera y Mammea americana......................................................................... 80
Figura 34. Muestras de extractos puros Etanólicos de hongos endófitos de
Mammea americana y Moringa oleífera. .......................................................... 83
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XIII
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Antibióticos disponibles para el tratamiento de S. aureus. ................. 30
Tabla 2. Nomenclatura de cumarinas aisladas de Mammea americana ......... 39
Tabla 3. Clases y grupos de hongos endófitos ................................................ 48
Tabla 4. Compuestos bioactivos aislados de hongos endófitos frente a
microorganismos de interés clínico y su medio de transmisión. ....................... 50
Tabla 5. Esquema de algunos ejemplos de bioactividad de metabolitos
secundarios, obtenidos de hongos endófitos .................................................. 52
Tabla 6. Tratamientos de desinfección de hojas de plantas medicinales M.
americana y M. oleífera .................................................................................. 63
Tabla 7. Codificación de hongos endófitos de cada una de las plantas en
estudio y estructura de aislamiento. ................................................................. 74
Tabla 8. Ensayo dual in vitro, de 14 hongos bioactivos. HI: Halos de inhibición
promedio de cada cepa bacteriana. ................................................................. 76
Tabla 9. Comparación de sensibilidad para Staphylococcus aureus (ATCC®
29213™). Resistente, en ensayo dual. ............................................................ 77
Tabla 10. Comparación de sensibilidad para Escherichia coli (ATCC® 25922™).
Resistente, en ensayo dual. ............................................................................. 77
Tabla 11. Clasificación taxonómica de Hongos endófitos aislados de M,
americana y M. Oleífera y su relación por Grupo Fúngico ............................... 78
Tabla 12. Descripción Morfológica de los Hongos Endófitos aislados de Moringa
oleífera y Mammea americana......................................................................... 81
Tabla 13. Comparación por concentración, para la cepa E. coli sensible y
resistente (prueba estadística Mann Whitney - Kruskal Wallis). ....................... 86
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XIV
Tabla 14. Comparación por concentración, para la cepa S. aureus sensible y
resistente (prueba estadística Mann Whitney - Kruskal Wallis). ....................... 86
Tabla 15. Concentración mínima inhibitoria. .................................................... 88
Tabla 16. Concentración mínima bactericida. .................................................. 89
Tabla 17. Resultados de Citotoxicidad sobre células Vero, de los hongos
HEHMA6, HESMO8, HETMO9 Y HESMA10. .................................................. 89
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XV
LISTA DE ABREVIATURAS
OMS: Organización Mundial de la Salud.
CMI: Concentración Mínima Inhibitoria.
ADN: Ácido desoxirribonucleico.
ARN: Ácido ribonucleico.
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero.
ARNt: Ácido ribonucleico de transferencia.
ARNr: Ácido ribonucleico ribosomal.
TV - TH: Trasferencia vertical - trasferencia horizontal.
APD: Agar papa dextrosa.
UDES: Universidad de Santander.
E. coli: Escherichia coli
S. aureus: Staphylococcus aureus.
ITU: Infección del tracto urinario.
CDC: Centro para el control y prevención de enfermedades.
EIEC: E. colienteroinvasiva.
ETEC: E. coli enterotoxigéanica.
UPEC: E. coli uropatógena.
EHEC: E. coli enterohemorrágica.
EAEC: E. coli enteroagregativa.
DAEC: E. colide adherencia difusa.
STEC: E. coli productora de toxina shiga.
AEEC: E. coli adherente y borradora
ExPEC: E. coli patógena extraintestinal.
MAEC: E. coli asociada a meningitis.
SARM: Meticilinoresistente.
SARM-AC: Meticilinoresistente adquirido en la comunidad.
SARM-AH: Meticilinoresistente adquirido en hospitales o centros médicos.
ATCC: American Type Culture Collection
CLSC: Del inglés Clinical and Laboratory Standards Institute.
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XVI
RESUMEN
Título: ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE HONGOS ENDÓFITOS DE PLANTAS MEDICINALES Mammea americana (Calophyllaceae) y Moringa Oleífera (Moringaceae).
Autor: Wilmer Geovanny Mosquera Rivera
Palabras clave: Actividad antimicrobiana, Escherichia coli, hongos endófitos Staphylococcus aureus. Descripción:
Las enfermedades infecciosas, son la causa principal de muertes en el mundo.
En la actualidad, un factor preocupante, es el aumento de la resistencia
bacteriana a los antibióticos, siendo esto un problema de salud pública. La
Organización Mundial de la Salud (OMS) priorizó la investigación de nuevos
antibióticos para el tratamiento de los patógenos multiresistentes. Por tal motivo
es necesaria una búsqueda de nuevos nichos y hábitats de agentes
antimicrobianos potencialmente eficaces. Siendo asi se evaluó la actividad
antimicrobiana de los hongos endófitos de Mammea americana y Moringa
Oleífera en Staphylococcus aureus (ATCC® 29213™) y Escherichia coli
(ATCC® 25922™).Se llevó a cabo una metodología según un estudio
experimental en 60 muestras vegetales. Se aislaron e identificaron hongos
endófitos, se les evaluó su actividad antimicrobiana mediante ensayo dual in
vitro a través de la presencia de halos de sensibilidad, posteriormente se
realizaron recopilaciones continuas de biomasa de los endófitos para obtener
extractos de las moléculas bioactivas, a las cuales se les midió la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI ), concentración mínima bactericida
(CMB) y citotoxicidad. Las pruebas de antagonismo y sensibilidad in vitro,
permitieron preseleccionar 14 hongos con actividad antimicrobiana, de la clase
Ascomycete y Deuteromycete, aislados en mayor proporción de semillas y
hojas. La mayoría de sus extractos presentaron inhibición tanto de las cepas
sensibles como de las resistentes para las dos bacterias. Considerando los
resultados de las CMI, CMB y citotoxicidad, se demostró que los hongos
endófitos poseen características bactericidas sin ocasionar daño alguno. Las
pruebas de sensibilidad in vitro permitieron seleccionar y conocer los endófitos
con posibles metabolitos secundarios con propiedades antimicrobianas y no
tóxicas, por esta razón los hallazgos encontrados son importantes para
continuar con investigaciones sobre los mecanismos de acción, resaltando que
el aislamiento de endófitos en estas plantas es escaso o desconocido.
bjetivos
XVII
ABSTRACT
Title: ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ENDOCRITARY FUNGI OF
MEDICINAL PLANTS Mammea americana (Calophyllaceae) y Moringa
Oleífera (Moringaceae).
Author: Wilmer Geovanny Mosquera Rivera
Keywords: Antimicrobial activity, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, endophytes. Description:
Infectious diseases are the leading cause of deaths worldwide. Currently, a
worrying factor is the increase in bacterial resistance to antibiotics, being this a
public health problem. World Health Organization (OMS). prioritized research
into new antibiotics for the treatment of multiresistant pathogens. Therefore a
search for new niches and habitats potentially effective antimicrobial agents is
needed. It was evaluated the antimicrobial activity of endophytic fungi Mammea
Americana (Calophyllaceae). and Moringa oleífera in Staphylococcus aureus
(Staphylococcus ATCC® 29213 ™). and Escherichia coli (ATCC® 25922 ™). a
methodology was carried out according to an experimental study in 60 plant
samples. They were isolated and identified endophytes were evaluated for their
antimicrobial activity using assay dual in vitro through the presence of halos of
sensitivity, then continuous collections biomass endophytes were performed to
obtain extracts of bioactive molecules, to which were measured for minimum
inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and
cytotoxicity. The tests of antagonism and sensitivity in vitro, allowed preselecting
14 fungi with antimicrobial activity, of the class Ascomycete and Deuteromycete,
isolated in greater proportion of seeds and leaves. Most extracts showed
inhibition of both sensitive strains as resistant to both bacteria. Considering the
results of the CMI, CMB and cytotoxicity demonstrate that endophytes have
bactericidal properties without causing any damage. Sensitivity tests in vitro
They allowed to meet endophytes with possible secondary metabolites with
antimicrobial and non-toxic properties, for this reason the findings are important
to continue research on the mechanisms of action, noting that the isolation of
endophytes in these plants is scarce or unknown.
bjetivos
Introducción
I
INTRODUCCIÓN
Genéricamente hablando, el término evolución hace referencia a la transformación o el cambio que sucede en determinada cosa o situación, a dicha definición no ha escapado el hombre como ser viviente y pensante, quien a lo largo de la historia ha logrado mutar de acuerdo a sus requerimientos en aspectos tan básicos como vestuario, vivienda y alimentación, o en otros más complejos tales como la implementación de normatividades para una sana convivencia con sus semejantes, la invención de armamento para su defensa y protección, la búsqueda de fórmulas de amparo del medio ambiente y renovación de los recursos naturales y aún más importante, el estudio e investigación de sus enfermedades y la pesquisa de medicamentos para atacar las mismas; respecto a éste tema en específico es donde se ha centrado en la actualidad la mayor cantidad de esfuerzo por parte del hombre, en pro de mejorar la calidad de vida como eje central de sus intereses, puesto que el campo de la salud abarca una extensión considerable de retos diarios que se convierten en un tipo de “obsesión médica” donde la finalidad es controlar o anular las consecuencias adversas que cualquier patología pueda provocar en su bienestar físico y/o mental, debido a que es una realidad innegable que a medida que el hombre evoluciona, junto con él también lo hacen los microorganismos y como consecuencia de ello las enfermedades infecciosas, las cuales se han vuelto resistentes a los métodos que hasta hoy contra ellas se han implementado; cada día vemos la aparición de síntomas desconocidos que desafían los conocimientos y habilidades de los estudiosos del área de la salud, quienes se han visto en la necesidad de utilizar y experimentar diferentes materiales y recursos in vivo o in vitro que le permitan, dilucidar características importantes del objeto en estudio, para establecer procedimientos certeros, contrarrestando la agresión que presentan algunos microorganismos, produciendo algún tipo de enfermedad. Los gérmenes conocidos los encontramos en disímiles escenarios de nuestra habitad y hasta en nuestro organismo, muchos de ellos no causando afectación sino beneficios para el equilibrio de nuestro cuerpo, así mismo hallamos otro tipo de microorganismos causante de diversas enfermedades, provocando diferentes afectaciones, degradando así la salud pública (Gómez & Sabeh, 2001).
El término de Enfermedades infecciosas, según la Organización Mundial de la salud, es la afectación de alguna o varias partes del cuerpo, con signos y síntomas que varían dependiendo de los patógenos que ocasionan la enfermedad, conocidos como Parásitos, hongos, virus y bacterias. Se conoce que estas enfermedades pueden ser trasmitidas de persona a persona o por picaduras de insectos y animales, también por la ingesta de agua y alimentos contaminados (Gómez & Sabeh, 2001).
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2
Estas patologías son en este momento uno de los temas más importantes a nivel mundial en el campo de la investigación, ya que cada vez se observa la emergencia y reemergencia de enfermedades, dando a conocer una evolución constante de sus patógenos a los fármacos existentes, conllevando a la investigación de nuevas moléculas capaces de equilibrar el daño provocado por alguno de estos microorganismos. Organizaciones a nivel mundial, persisten en dar avances investigativos en moléculas agresivas que sean de característica natural, debido a la biodiversidad que existe en nuestro planeta, y más aun teniendo en cuenta la gran variedad de plantas medicinales que hay en nuestro país, descritas con alto potencial antitumoral, antifúngico, anticancerígeno, y Antimicrobianos, que puedan interrumpir o acabar con la eficaz resistencia que están adquiriendo estos patógenos. Publicaciones científicas han mostrado diferentes biocomponentes activos, que causan beneficio para la salud humana, muchos de ellos obtenidos del material vegetal, como semillas, frutos, hojas, tallos y raíz. Según la prehistoria, las plantas medicinales fueron descritas no para dar tratamiento a enfermedades, si no para tratar los alimentos en climas calurosos evitando su degradación (Tapsell et al., 2006). (Billing & Sherman, 1998), en donde mencionaban a las angiospermas como grupo reconocido de plantas medicinales y por su adaptación a todo tipo de ecosistema en la tierra. En la antigüedad tratar una enfermedad emergente era de gran preocupación debido a que no había ningún tipo de medicamento para realizar seguimiento a una enfermedad que en muy poco tiempo se hacía transmisible, provocando una epidemia y matando a muchos habitantes de la tierra, como fueron el tétano, la lepra, la peste bubónica, la gripe española, la peste de Galeno entre otras. Para los sabios de la época, las plantas eran la única opción curativa para preparar pócimasas medicinales, o cataplasmas vegetales para manejar las afecciones del momento, de ahí los primeros avances de la farmacología para la investigación, en conocer que era lo que ocasionaba el posible alivio para muchos de los pacientes con estas patologías. Debido a la investigación constante, de las moléculas vegetales como componentes curativos, se dan a conocer varios temas de importancia como son, la fitoquímica y el mutualismo facultativo, la fotoquímica a mostrando algunos componentes farmacológicos importantes como son los terpenos, alcaloides, glucósidos y polifenoles, utilizados para el tratamiento de afecciones, y por otro lado la mutualidad con otros seres, como lo hacen las plantas con algunos micro-hongos. Muchos estudios muestran la capacidad de convivencia que tienen las plantas con estos hongos a los que son llamados, hongos endófitos, estos tienen el beneficio de establecer mutualidad sin hacer ninguna afectación a la planta (Arnold, 2005).
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3
Estos microorganismos endófitos han sido descritos en varios documentos como protagonistas de protección de algunas plantas contra infecciones, causadas por otro tipo de patógeno, afectando un tejido vegetal de la misma (Faeth & Fagan, 2002; Arnold et al., 2003; Salazar & de García, 2005 ),los hongos endófitos reportados en su mayoría provienen de las gramíneas, que son plantas monocotiledóneas, de la familia de las plantas herbáceas, y de gran importancia económica en el mundo, por su consumo habitual (Juddet al., 2002).Así mismo como se puede mencionar el beneficio para estas plantas, delimitando infecciones y erradicándolas, también podrán ser de gran utilidad en la medicina como Antimicrobianos natural para el control y eliminación de los patógenos existentes en las enfermedades infecciosas. Muchos interrogantes surgen de este tipo de situaciones naturales, que conllevan a los investigadores a formular nuevas alternativas terapéuticas, con metabolitos secundarios bioactivos, extraídos de hongos endófitos, y observar moléculas que actúen como barrera, o inhibidor de estructuras celulares, para tratar estos microorganismos, que hasta el momento resisten a muchos de los fármacos actuales, para el tratamiento de estas patologías Microbianas. Grupos de bacterias categorizadas como Gram positivas y Gram negativas han mostrado, la resistencia a los tratamientos existentes en el área de la salud pública, Los microorganismos implicados en las enfermedades infecciosas han sido denominados por la Organización mundial de la salud ( OMS ), relevantes como: la Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomona Aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, entre otras; microorganismos patógenos que muestran cada día innovadoras resistencias, debido a los factores adyacentes de adquisición de resistencia, por esta razón el objetivo de este trabajo fue evaluar la bioactividad antagónica de extractos crudos de hongos endófitos aislados de dos plantas medicinales cultivadas a nivel nacional (M. americana y M. oleífera) contra, Staphylococcus aureus(ATCC® 29213™) y Escherichia coli(ATCC® 25922™ ), bacterias de gran importancia en el área investigativa y médica, debido principalmente a la resistencia desarrollada frente a los antibióticos y causantes de gran morbilidad y mortalidad a nivel mundial.
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4
1. Actividad antimicrobiana
1.1 Las Enfermedades como causa principal de preocupación en el
hombre
Las enfermedades fueron unas de las causas fundamentales que desafiaron al
hombre en búsqueda de su bienestar, ya que en algunas ocasiones veía la
decadencia de su salud provocada por un agente desconocido para él, pero que
si no buscaba algo que lo regenerara le podía provocar la muerte; es así como
fue buscando formas de contrarrestar las dolencias y aflicciones que se
colocaban en manifiesto, con lo que veía a su alrededor. Tiempo después
determino que había vida dentro de la vida, provocando en algunas ocasiones
malestares de un momento a otro; de ahí el nacimiento de los seres
microscópicos, llamados en este momento “microorganismos”, protagonistas las
principales causas de las enfermedades en el mundo. Sin embargo día a día los
investigadores estudian más sobre los Microbios que nos mantienen
saludables, así que nos ha permitido comprender que los desequilibrios en
nuestro microbioma, pueden también causar enfermedades y también hemos
entendido que restaurando dicho equilibrio se llega a la curación. Nuestra nueva
comprensión puede conducir a tratamientos más enfocados y efectivos. A
diferencia de los antibióticos modernos, que matan a los microbios buenos junto
con los malos, los nuevos medicamentos pueden matar solo a las bacterias
dañinas y dejar a los amigos solos. Otros pueden nutrir bacterias amigables,
ayudándolas a superar las dañinas.
1.2 Enfermedades Infecciosas
Las enfermedades infecciosas son causados por diversos microorganismos
tales como: bacterias, virus, hongos o parásitos. Muchos de estos organismos
viven en y sobre nuestros cuerpos. Normalmente son inofensivos o incluso
útiles, pero bajo ciertas condiciones, algunos de estos microorganismos pueden
causar enfermedades que pueden llegar a transmitirse de persona a persona.
Algunos se transmiten por picaduras de insectos o animales. Y otros se
adquieren al ingerir alimentos o agua contaminados o al exponerse a
organismos en el medio ambiente. Los signos y síntomas varían según el
organismo que causa la infección, pero a menudo incluyen fiebre y fatiga.
Algunas enfermedades infecciosas, se pueden prevenir con vacunas como el
sarampión y la varicela, El lavado de manos frecuentes y completas también lo
protege de la mayoría de las enfermedades infecciosas. Sin embargo otras
enfermedades pueden llegar a ocasionar la muerte si no son tratadas a tiempo
bjetivos
5
o si el tratamiento resulta inefectivo a causa de la resistencia a los fármacos por
los microorganismos involucrados en la infección (Mandell et al., 1991).
Las enfermedades infecciosas proceden a más del 25% de las asistencias de
pacientes a centros médicos, y se denota como la segunda consecuencia de
tratamientos en empresas farmacéuticas (Paredes & Roca, 2003);estas
enfermedades transmisibles muestran un patrón de evolución que atribuyen a
un cambio en los procedimientos diagnósticos y de tratamiento en las entidades
de salud, promoviendo a estas instituciones a estar encaminadas al el control
de los diferentes pacientes evaluando no solo su parte médica sino también su
parte social, debido a que los agentes etiológicos, sus reservorios, huéspedes y
hospederos también hacen parte importante del control y erradicación de la
enfermedad. La transmisión continua de estas enfermedades, involucran a
estancias investigativas, que ayuden a la observación de la emergencia de
enfermedades por parte de microorganismos que muestran cada vez un mejor
perfeccionamiento genético, para evadir antimicrobianos potenciales, sugiriendo
dar una vigilancia a estos agentes patológicos, contribuyendo a la detección
estructural o molecular de las bases que muestran estos microorganismos
como eslabón de resistencia.
Las enfermedades infecciosas emergentes, son de gran importancia debido a
que la mayoría de ellas muestran características evolutivas persistentes, la
aparición de estas patologías infecciosas, mostraron un relevante estudio en
todo lo que rodeaba esa afectación humanitaria, dimensionando lo que
acontecía o podría suceder, tomando acciones conjuntas y determinando
control de ellas, en ese momento se pensaba que se habían solucionado
muchos de los aspectos que una ocasión fueron alarma de morbimortalidad y
urgencia en la salud pública, dando lugar a las enfermedades crónicas como el
cáncer, problemas cardiovasculares, enfermedades endocrinas y metabólicas
entre otras, que mostraban alto impacto y atención de los entes de salud
(Mandell et al., 1991).
Las enfermedades infecciosas emergentes fueron dando un paso importante
por el resurgimiento o proceder de nuevas afectaciones por causa de los
diferentes microorganismos, como lo son el VIH, Ébola, fiebre hemorrágica y
otras que muestran que las enfermedades infecciosas no han dado un alto en el
camino sino que cada día muestran una fortaleza, evitando el control y
erradicación, dando lugar a resistencias antibióticas y colocando en manifiesto,
la importancia investigativa en el campo Microbiológico, buscando nuevas
bjetivos
6
alternativas y tecnologías para la invención de antimicrobianos naturales con
bioactividad efectiva (Mandell et al., 1991).
El contagio de las enfermedades transmisibles se muestra con características
importantes y se catalogan como enfermedades infecciosas de contacto directo
o indirecto (Figura 1).
Figura 1. Esquema de la transmisión de enfermedades infecciosas
El contacto directo se muestra cuando un paciente que presente la enfermedad
entra en inmediación con un receptor, y se demuestra contacto con secreciones
o fluidos, provocando enfermedades muchas de ellas de transmisión sexual, por
otro lado encontramos el contacto indirecto, que no se muestra contacto entre el
enfermo y un receptor sino con contaminantes de su ambiente.
La visualización y diagnóstico oportuno de este tipo de enfermedades
contagiosas formula hipótesis importantes a partir de la historia natural de las
enfermedades, dando a conocer la importancia de la evolución de patologías no
teniendo mediación con el personal médico, observando su etiología, el
desarrollo de la enfermedad y su desenlace. Las etapas de las enfermedades
son de alta relevancia, mostrando los periodos de determinación de las
patologías como son: Periodo pre-patogénico y patogénico, que comprende
también el periodo de incubación, periodo de latencia y periodo clínico.
bjetivos
7
Interacción
de:
HISTORIA NATURAL DE CUALQUIER ENFERMEDAD EN EL HOMBRE.
Agente de Enfermed
ad
Huésped
Humano
Factores ambientales
que producen estímulos de
enfermedad
Enferme-dad
discern-ible
tempra-
namente
Enfer-medad avanza-
da
Conva-lecen-
cia
Patogé-nesis
Tempra-
na
Antes que el hombre
enferme
Periodo Prepatogénico
Periodo Patogénico
Los Resultados
Curso de la enfermedad en el hombre
Muerte
Estado Crónico
Incapacidad
Recuperación
Curación
Horizonte
Clínico
Estímulo Cambios
Orgánicos Estímulo
Figura 2. Historia natural de la enfermedad en el hombre, según el modelo
clásico de Leavel-Clark. 1940. Doc. Téc. No. 8.99 IMSS/Irapuato
(Carrada-Bravo, 2000).
El periodo pre-patogénico, que se caracteriza por dar a conocer los
componentes e influencia del desarrollo de la enfermedad, de los que pueden
ser de descripción natural, ambiental, riesgos, consumo de sustancias,
infecciones variadas entre otras, no presentando manifestaciones clínicas;
mientras que el periodo patogénico revela una fase pre-sintomática con
cambios internos como por ejemplo de tipo celular, en sus tejidos, órganos o
sistemas, sin signos ni síntomas clínicos, en donde posteriormente se
mostraran otras etapas de este periodo patogénico, como es el periodo de
incubación que muestra el tiempo desde la exposición a la fuente de infección
hasta la aparición del primer síntoma o signo. Dependerá del patógeno, la dosis
del inóculo, portal de entrada, mecanismo de daño tisular y respuesta inmune,
por otro lado el periodo de latencia, que es el ttiempo desde la infección hasta el
inicio del periodo infeccioso y el periodo de transmisibilidad que será el periodo
durante el cual un huésped puede transmitir la infección (Page et al., 1995).
(Webber, 2009).
bjetivos
8
1.3 Mecanismos de Acción de Antimicrobianos
Los mecanismos de acción antibiótica y Antimicrobianos están basados en las
características fundamentales de los microorganismos para evadir su acción
infecciosa, algunos de los mecanismos están direccionados a organelos y
ácidos nucleicos, como son la pared celular, los ribosomas, la membrana
celular, el ADN (ácido desoxirribonucleico).Y RNA (ácido ribonucleico ), la
importancia de cromosoma bacteriano, en la resistencia, nos lleva a conocer su
funcionalidad para ser partícipes de implementar y conocer su funcionalidad
teniendo en cuenta su morfología, se caracteriza por su doble cadena circular
anillada y enlaces covalentes, en varias de las bacterias se han encontrado dos
cromosomas pero uno de tamaño mucho más pequeño, y en algunas otras
cromosomas lineales como en la bacteria Borrelia burgdoferi; Su ubicación y
conformación es la misma a otras células conocidas regulando la transcripción y
función de operones para fomentar los RNAm policistrónicos ( Betancor et al.,
2008).
1.3.1 Elementos genéticos de transferencia horizontal
La trasferencia vertical (TV) se denomina a aquel evento que ocurre del
traspaso genético de padres a hijos (Cavalli-Sforza, & Feldman, 1981). (Boyd &
Richerson, 1985). (Durham, 1991), Por otro lado la trasferencia horizontal (TH)
el traspaso genético se realiza en organismos que no tienen ninguna relación
parental (Rosenwich & Klister, 2000).
Los elementos del genoma replicativo bacteriano también muestran importancia
para la identificación y caracterización de estos microorganismos mostrando
elementos de característica cromosomal bacteriano, de característica
plasmídica y de característica en bacteriófagos.
1.3.2 Plásmidos
El ADN extracrosomal, de algunas bacterias al igual que los cromosomas es
circular y cerrado o lineal.
bjetivos
9
Figura 3. Imagen estructural de una bacteria, mostrando su cromosoma
bacteriano y estructura plasmídica.
(Genemol.org. (2018). (Herveg & Barcia, 2004).).
Los plásmidos son estructuras que resguardan un ADN de doble cadena de
replicación independiente al cromosoma, tienen importancia en las
modificaciones fenotípicas en relación a la adaptación de las bacterias a medio
en el cual se encuentra por ejemplo aquellos plásmidos que contienen un gen
de resistencia a algún antibiótico, otros tienen inferencia en la virulencia, y
traspasarse de una bacteria a otra por conjugación, que consiste en trasferir
material genético de una célula a otra, promovida por plásmidos (figura 3).
Figura 4. Transferencia del plásmido F mediante conjugación. Una célula F+ es capaz de sintetizar un pili especial (factor F) que le permite iniciar el proceso de conjugación para transferir el plásmido F a una célula receptora F.
bjetivos
10
(La imagen
superior fue
modificada de http://www.whfreeman.com/life/uAPDte/.).
Existen plásmidos que participan en el control de replicación, llamados
episomas. Otros como los plásmidos productores de bacteriocinas y
antibióticos, y también aquellos plásmidos modificados para resistencia a
antibióticos y plásmidos de virulencia, esta tipificación se da por su referencia a
su funcionalidad y capacidad de estar en otro organismo para modificar de
alguna forma su genoma.
bjetivos
11
1.3.3 Elementos transponibles
Según B. Mc Clintock, Los elementos transponibles (TE) son aquellas
compilaciones genéticas capaces de movilizarse y cambiar de sitio provocando
alteraciones o mutaciones en el genoma debido a su movilidad.
Los TE pueden estar presentes tanto en eucariotas como en procariotas, los
podemos encontrar clasificados de dos formas, de clase I que serán los que se
transponen por moléculas por intermediación del RNA, el cual se llaman
retroelementos, y las de clase II o también llamadas transposones, que son
transponibles a través del DNA.
La mayoría de ellos se introducen en el genoma en cualquier lugar, y los demás
son más exclusivos y específicos, para una posición o secuencia. Además son
mayormente encontrados en genomas eucariontes, induciendo a
reordenaciones cromosómicas o mutaciones.
La mayoría delos mecanismos que utilizan los procariotas se han visto que son
a causa de los TE, encontrando TE replicativa, que es cuando se da una
transposición de un lugar a otro, en donde la copia quedará en la primera
estación de la transposición, obteniendo dos tipos de categoría, aquella que
tiene transposasa, llamada recesiva trans, y por intermediarios (doble plásmido
), llamada dominante cis; por otro lado tenemos las TE conservativa, que será
cuando se separan en el cromosoma y se transponen en un nuevo sitio, no
teniendo replicación.
Los genes de elementos móviles del genoma son de gran importancia en el
estudio de la resistencia debido a que estos genes pueden infectar plásmidos y
fomentar la estacionalidad de la resistencia a antimicrobianos de carácter
nosocomial, la transposición genética tiene algunos TE de importancia que son:
transposones complejos, los transposones ligados a bacteriófagos, las
secuencias de inserción llamadas (SI).
1.3.4 Integrones y cassettes genéticos
Los integrones son “un elemento dinámico que contiene los determinantes
genéticos de los componentes de un sistema de recombinación específica de
sitio que reconoce y captura genes en casete móviles” (Hall, & Collis, 1995).
bjetivos
12
Los integrones forman parte de un trasposon pueden ser transferidos por
transposición o por conjugación, la primera tiene lugar desde un plásmido al
cromosoma o viceversa y la segunda desde una bacteria a otra, mecanismos
éstos que sin lugar a duda facilitan una rápida propagación de los genes de
resistencia a antibióticos en comunidades bacterianas presentes especialmente
en ambientes hospitalarios (Courvalin, 1994). (Gonzalez, et al., 1998 ),las
bacterias se puede afirmar que aquellas que cuentan con integrones, pueden
llegar a incorporar partículas de material genético presentes en el citoplasma
bacteriano bajo la forma de genes de casete que no son pieza fundamental de
los integrones pero que una vez integrados forman parte de ellos y es así como
los integrones pueden adquirir categóricos de virulencia, resistencia a
antimicrobianos, lo que facilita la adaptación de la bacteria hospedadora frente
a condiciones consideradas extremas (Boucher, et al., 2007). (Holmes, et al.,
2003).
La detección de los integrones se ha dado tanto en bacilos Gram negativos
como en Gram-positivos, los primeros, en fermentadores de las familias
Enterobacteriaceae y Vibrionaceae (Jones, et al., 1997; Schmidt, et al., 2001) y
no fermentadores como Pseudomonas aeruginosas (Bissonnette, & Roy, 1992)
y Acinetobacter baumannii (Gonzalez, el at., 1998), y los segundos, en cepa de
Corynebacterium glutamicum (Nešvera, et al.,1998) y sorprendentemente en el
cromosoma de una cepa de Mycobacterium fortuitum (Lobo, 2010).
De acuerdo a su cadena nucleótida diferenciada en su gen de integrasa, los
integrones fueron definidos mediante una clasificación, la cual inicialmente
estuvo compuesta por tres grupos de familias en los que se ubicaron de
acuerdo a sus características, estableciéndose así sus clases en niveles 1, 2 y
3(Paulsen, et al., 1993), los integrones tipo 1 y 2 han sido observados en
plásmidos y transposones, mientras que el tipo 3 solo se ha detectado en
plásmidos (Arakawa, et al., 1995).
Otros Autores como Sabaté y Prats, manifestaron la existencia de nueve
familias de integrones, los pertenecientes a la clase 1, 2 y 3, se especifican por
contener casetes de resistencia a antibióticos, motivo por el cual se ahondara
en ellos en el actual escrito; por el contrario los integrones de los tipos 4, 5, 6 y
7 presentan casetes que no exhiben resistencia a antibióticos, el integron clase
8 no presenta ningún casete y finalmente el clase 9 demuestra un casete de
resistencia a antibióticos y otros casetes de función desconocida (Sabaté &
Prats, 2002).
bjetivos
13
Sin embargo la anterior clasificación y gracias a la diferente integrasa
observada en variados microorganismos, en la actualidad se habla de dos
grandes conglomerados de integrones, el primero denominado Integrones
móvilies o de resistencia a antibióticos y el segundo como super integrones o
integrones presentes en el cromosoma bacteriano, los cuales se diferencian de
aquel, en que su determinante de resistencia no es constante (Boucher et al.,
2007; Fluit & Schmitz, 2004; Hall & Stokes, 2004; Mabel D, 2006).
1.4 Generalidades de la Resistencia a los Antimicrobianos
El término resistencia está determinado, por la capacidad que tiene un
microrganismo patógeno de evadir los cambios estructurales causados por un
antibiótico, o el impacto sobre el desarrollo y reproducción del mismo, no
causando efecto Antimicrobianos, desinfectante o esterilizante.
En la observación clínica y Microbiológica, y según algunos comités
internacionales como la Mesa Española de Normatización de la Sensibilidad y
Resistencia a los Antimicrobianos (Mensura, 2000), la Clinical and Laboratory
Standards Institute en Estados Unidos(Wayne, 2009) y el European Committee
on Antimicrobial Susceptibility Testing en Europa (Kahlmeter et al., 2006),
establecen los parámetros y descripción de pruebas en antibiogramas,
determinando que un germen es cualitativamente resistente cuando se
establece la cantidad mínima inhibitoria (CMI), de un fármaco capaz de
contrarrestar la acción contra ellos, y que esta sea cuantitativamente menor a la
CMI ; si es un poco mayor de la CMI se establecerá acción cualitativamente
intermedia y si se muestran dosis mayores será cualitativamente sensible, es
decir si el microrganismo es sensible al tratamiento terapéutico, es exitoso,
mostrando que la resistencia o sensibilidad también dependen de la
enfermedad, vía de administración y dosis a la que está sometido e
paciente(Jackson, et al., 1998).
La categorización del resistir de los microorganismos, es variada de acuerdo a
los conceptos brindados por los científicos, nombrando como “resistencia
natural” a aquellos microorganismos que desde épocas muy remotas y hasta el
momento tienen la capacidad intrínseca, de evadir los efectos antibióticos de un
fármaco, y la “resistencia adquirida”, aquella que por algún motivo emerge, o es
cambiante, es decir muta o trasmite material genético de un microrganismo a
bjetivos
14
otro, constituyendo una problemática en la parte clínica de las enfermedades
infecciosas. (Couvalin, 1988).
Por otro lado también se conocen otros conceptos que van de la mano como
son la multiresistencia o resistencia múltiple, la resistencia cruzada, la
corresistencia entre otras, que componen la complicación clínica de las
infecciones y que promueven a la investigación de novedosos antibióticos.
Según la revista Greenfacts, la multiresistencia se muestra cuando un
microrganismo resiste a la acción de varios fármacos, la resistencia cruzada se
menciona en aquellos microorganismos que evaden variadas moléculas y
mecanismos de acción Antimicrobianos, y que la corresistencia, es aquella que
se da en el intercambio de material genético de una especie bacteriana a otra, y
codificando variedad de mecanismos de evasión Microbiana.
La resistencia a patógenos es uno de los cuestionamientos más importantes en
salud a nivel mundial, debido a que cada día se observa que los diferentes
microorganismos adquieren cierta resistencia, lo que causa una mayor
amenaza (Spellberg, & Gilbert, 2014) en la prevalencia de enfermedades
infecciosas. La evolución, el consumo inadecuado, las barreras farmacológicas,
la prescripción médica inadecuada, y muchas otras, revelan el impacto de
intransigencia que en este momento muestran este tipo de microorganismos,
para diferentes patologías.
La defensa de los microorganismos en las enfermedades nosocomiales a los
fármacos terapéuticos, se muestra como un problema complejo en entidades de
salud, revelando altos niveles de concentración de gérmenes, capaces de
adaptarse al medio, de inhibir los efectos desinfectantes y obtener mecanismos
de defensa contra los antimicrobianos. Por otro lado la multicasualidad de los
efectos de resistencia también se basan, en la migración de población de forma
localizada y extranjera, de la conglomeración de personas en lugares
residenciales, del aumento de pacientes en clínicas y hospitales con
enfermedades graves y del uso incorrecto de antibióticos en tratamientos,
formulando así una problemática en el cuerpo médico para tratar este tipo de
padecimientos (Avorn, & Solomon, 2000).
Aunque en este momento se sabe que los antibióticos actuales en muchas de
las enfermedades infecciosas no funcionan, en algún momento dieron una
pauta positiva en el control de diversas infecciones, lo que conllevó a una
disminución en la mortalidad de sinnúmero de pacientes (Golkar et al., 2014).
bjetivos
15
(Servicio de Investigación del Congreso Informe Esperanza de vida en los
Estados Unidos, 2005).
1.4.1 Algunos Antecedentes y Problemática de la Resistencia Bacteriana
Un tema de relevancia y bastante estudiado por gran cantidad de científicos, es
la resistencia bacteriana, es así que en tiempos pasados, en países como
China, Egipto y Grecia, se demuestra una gran documentación en cuanto a la
utilización y manejo de enfermedades infecciosas con antibióticos (Sengupta et
al., 2013) combatiendo gérmenes causantes de patologías progresivas.
Uno de los precursores de este tema en la era moderna fue el señor Sir
Alexander Fleming, quien en el año de 1928, realizó los primeros avances
mediante el descubrimiento de un antibiótico, “la penicilina” (Sengupta et al.,
2013), capaz de atacar y erradicar diferentes padecimientos que se
mencionaban en aquella época (Gould IM & Bal AM, 2013). (Centros para el
Control y la Prevención de Enfermedades, 2013 ), en el cual en la década de
los 40 mostraban sus primeras prescripciones como principales medicamentos
en el tratamiento de pacientes infectados (Centros para el Control y la
Prevención de Enfermedades, 2013 ), dando un alivio para los investigadores
en el área de salud, pero pocos años después en el año 1950 se anunció la
resistencia que habían tenido ciertas bacterias a la penicilina, provocando así
una crisis clínica en tratamientos no exitosos en pacientes con padecimientos
infecciosos (Spellberg & Gilbert, 2014). Debido a la necesidad presentada,
muchos investigadores promovieron antibióticos nuevos, como eran los
Betalactámicos, dando de nuevo un respiro al cuerpo médico (Spellberg &
Gilbert, 2014; Sengupta et al., 2013 ), puesto que en ese momento se sentían
afectados por la decadencia de muchos de sus pacientes, observando la
resistencia que se veía en la bacteria Staphylococcus aureus, a la metilcilina
(MRSA ), en regiones importantes como lo fue Estados unidos en el año 1968 y
Reino unido en 1962 (Sengupta et al., 2013; Centros para el Control y la
Prevención de Enfermedades, 2013).
La vancomicina es otro antibiótico que en el 1972, fue dado a conocer como
uno de los fármacos capaces de contrarrestar al S. aureus metilcilino resistente
como también a los que se presentaban como cocos coagulasa negativa
(Sengupta et al., 2013). (Centros para el Control y la Prevención de
Enfermedades, 2013 ), en donde en su época se consideró con bastante éxito,
pero en los años 79 y 83, se demostró la resistencia que se observaba en
algunos pacientes con S. aureus coagulasa negativos (Sengupta et al., 2013
bjetivos
16
),es así como en los últimos años las empresas farmacéuticas dieron como
opción dar, a conocer varios antibióticos para diferentes infecciones observando
cada vez más la resistencia que iban adquiriendo los microorganismos y que a
su vez esta progresaba constantemente, dando a conocer que el equipamiento
y los eventos continuos no daban base financiera para seguir produciendo este
tipo de medicamentos (Spellberg & Gilbert, 2014 ),que de alguna u otra forma
ayudaban a contrarrestar la infección en algunos pacientes con patología
bastantes severas.
La resistencia ante los antibióticos ya había sido descrita por el mismo
Alexander Fleming cuando mencionó que se llegaría al abuso y uso excesivo de
ellos dando lugar a una crisis antibiótica (Spellberg & Gilbert, 2014; Bartlett et
al., 2013), conllevando a la evolución de los microorganismos a resistencias
permanentes (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, 2013).
(Lea & Woods, 2014) y colocando en amenaza a la población mundial.
La prescripción médica inadecuada también conlleva a este tipo de problemas
de resistencia adquirida (Centros para el Control y la Prevención de
Enfermedades, 2013 ), ya que se ha comprobado que el uso inadecuado de
tratamientos para algunas patologías es bastante alto, demostrando que los
métodos de detección diagnóstica en algunas entidades de salud son bastante
obsoletos y que se necesita de equipamiento y técnicas moleculares modernas
de rápida identificación para promover tratamientos efectivos a los pacientes
con este tipo de infecciones (Bartlett et al., 2013). Las concentraciones
antibióticas en diferentes tratamientos, también demuestran la importancia en la
resistencia de muchos microorganismos, a muy poca o muy alta concentración
se observa impacto de resistencia y la proliferación bacteriana (Viswanathan,
2014).
El uso agrícola es otro de los aspectos importantes a seguir en este tema,
mostrando una cantidad de problemas que han conllevado a la proliferación
bacteriana con resistencia diferentes medicamentos, debido a que son
utilizados en diferentes campos para disminución de infecciones y progresión
en el crecimiento de animales (Spellberg & Gilbert, 2014). (Bartlett et al., 2013).
(Gross, 2013), por esta razón también se habla que la resistencia que se da en
estos animales es transmitida a los humanos cuando consumimos la carne
contaminada de alguno de ellos (Golkar et al., 2014).). (Bartlett et al., 2013 ), lo
que contribuye a la afectación de la Microbiota de la diversidad ambiental,
debido a que diferentes antibióticos son utilizados como pesticidas,
bjetivos
17
promoviendo la resistencia y dando lugar a afectaciones en humanos por que
impide el control de las infecciones (Golkar et al., 2014).
Y por último podríamos mencionar a las barreras y disponibilidad que hay de
estos medicamentos en el mundo, una de esas barreras podrían ser, que los
centros de investigación que optimizan estos medicamentos, rechazan
continuamente las investigaciones de muchos científicos, y por otro lado la
disponibilidad en donde se mencionan a las empresas farmacéuticas que
demuestran que cada vez más disminuyen la producción de estos
medicamentos conllevando a una crisis antibiótica en nuestro entorno. Es así
que Varios científicos en nuestro país y en América Latina han divulgado sus
hallazgos (Martínez et al., 2010; Villegas et al., 2004; Suárez et al., 2005;
Miranda, et al., 2006; Leal et al., 2006; Gaitán & Espinal, 2009; Espinal et al.,
2004; Cifuentes, et al., 2005; Pérez et al., 2008; Sánchez, Ríos, & Máttar, 2011
), mostrando la dimensión y creciente problema de resistencia a
antimicrobianos, mostrando estudios del año 2003 con solo un9 % de esta
problemática y otros en el año 2007 que demuestran el aumento de problemas
de resistencia a más del 26 %, en las diferentes patologías infecciosas
(Paterson, et al., 2005; Villegas, et al., 2004; Rossi, et al., 2006; Hawser, et al.,
2009; Hawser, et al., 2009).
1.5 Bacterias.
1.5.1 Escherichia coli (E. coli). 1.5.1.1Generalidades y taxonomía El aislamiento de esta bacteria fue descrito por primera vez en 1885, por un
bacteriólogo y pediatra alemán llamado Theodor Escherich, quien denomino a
este microrganismo como “Bacterium coli commune”, que quiere decir
“bacteria común del colon”, ya que se encuentra habitualmente en el tracto
gastrointestinal humano y animales de sangre caliente (Allocati et al., 2013), y
donde además fue encontrada en heces de niños tanto sanos como con
patologías infecciosas. Más adelante los señores (Castellani & Chalmers, 1919;
Allocati et al., 2013; Croxen, et al., 2013; Sejal Makvana & Leonard, 2015), le
denominaron Escherichia coli, en homenaje al señor Theodor, y de donde se
dio inicio al estudio de la biología de las células y de microorganismos, como
este que ha sido uno de los más estudiados. (Donnenberg, 2002).
bjetivos
18
Según manuales de bacteriología como el de Bergey, esta bacteria también es
conocida como E. coli, es un procariota bastante pequeño, puede llegar a medir
desde 2,0 µm a 6,0 µm de largo, por 1,1 µm hasta 1,5 µm de diámetro, es un
bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram(Gram negativo ), con
cualidades oxidasa negativo, quimio heterótrofas facultativas, no formadoras de
esporas, producen catalasa y β-galactosidasa, son reductoras de nitrato, y
pueden ser móviles es decir flageladas o inmóviles, capaces de crecer en
medios tanto aerobios como anaerobios, pero en predilección a los 37 °C
(Croxen et al., 2013). Es del grupo de las enterobacterias (Figura 5) se suele
mencionar que el organismo humano es infectado con esta bacteria en las
primeras 40 horas después del nacimiento, ya que se encuentra en el ambiente,
en el agua y en alimentos que son muy fáciles de introducirse al interior de un
recién nacido, adhiriéndose al moco que recubre el intestino grueso,
persistiendo indefinidamente (Sanpui et al., 2008). (Todar, Pathogenic, 2008).
Figura 5 Clasificación taxonómica de la bacteria Escherichia coli.
1.5.1.2 IMPORTANCIA DE MORBI-MORTALIDAD DE E. coli
E. coli es considerada una de las bacterias de gran importancia en instituciones
de salud y en investigaciones, ya que es una de las enfermedades con alta
transmisión alimentaria, en donde la OMS con el informe de “Estimación de la
carga mundial de las enfermedades de transmisión alimentaria” de expertos a
bjetivos
19
nivel mundial, muestra que 1 de cada 10 personas se enferman cada año al
consumir alimentos contaminados con este tipo de microorganismos y que
420.000 personas mueren a causa de este tipo de patologías infecciosas
(Galindo, 2017). Además este tipo de bacteria se encuentra frecuentemente
asociado con infecciones urinarias y septicemias en humanos y es causante de
630 millones de enfermedades diarreicas en el mundo y aproximadamente
775.000 muertes al año, afectando mayormente a la población infantil de países
menos desarrollados (Blanco et al., 2002).
Otra de las consecuencias graves de infección por E. coli, son las infecciones
urinarias o del tracto urinario (UTI ), que es la existencia de microorganismos
patógenos como este con o sin síntomas(DE LA HOZ & SANTIAGO, ), esta
patología mayormente se ha visto que tienen alta prevalencia en mujeres y
niñas debido a la corta longitud de la uretra (25 a 50 mm ), en paralelo con los
hombres que mide (unos 15 cm). En personas con avanzada edad,
las UTI tienden a ser de la misma proporción entre hombres y mujeres. Los
malos hábitos sanitarios y de higiene también muestran alta predisposición a
tener una infección con E. coli en las vías urinarias, y se dice que del 80 al 90 %
de estas infecciones tienen que ver con cepas de E. coli (Pigrau, 2013).
1.5.1.3 Antígenos, patogenicidad, clasificación y patotipos mencionados
de E. coli
La mayoría de cepas de E. coli, están catalogadas como no patógenas, estando
en el organismo del hospedador sin hacerle ningún daño, es más algunas de
ellas sintetizan cofactores y ayudan a la erradicación de otros patógenos
(Todar, Pathogenic, 2008), pero por otro lado encontramos a otro tipo que si
son cepas patógenas causando enfermedades entéricas, gastrointestinales y
extraintestinales en animales y en el ser humano (Baylis et al., 2006). El género
Escherichia tiene cinco especies distintas: E. coli, E. fergusonii, E. hermanni, E.
vulneris, y E. blattae, teniendo en cuenta que E. hermanni, y E. vulneris, se han
encontrado en infecciones de heridas en humanos, E. coli es la única que tiene
importancia y significancia en el área de la salud (Blanco et al., 2002).
La estructura antigénica de E. coli, muestra una constitución polisacarida y una
constitución proteica y Antígenos menores como proteínas de membrana
externa y fimbrias, la constitución polisacarida está compuesta por los
antígenos K y O, mientras que la constitución proteica está compuesta por el
antígeno H, esta estructura también es utilizada para la clasificación serológica
como la de (Nataro & Kaper, 1998; Kauffmann, 1947; Fratamico et al., 2016).
bjetivos
20
En tanto la patogenicidad de la bacteria E. coli, utilizan varios mecanismos de
invasión, infectando las mucosas, evadiendo mecanismos de defensa y
fomentando el daño tisular (Kaper, Nataro & Mobley, 2004), por esta razón se
menciona que la interacción entre los mecanismos de patogenicidad del
microrganismo y el hospedador permiten clasificar las cepas de esta bacteria,
en patotipos según el lugar y la enfermedad que causa con sus factores de
virulencia (Sousa, 2006). Describiéndose así un gran número de patotipos, y
clasificándose complejamente en lo siguiente (figura 6), entre las cepas de E.
coli patógenas extraintestinales (ExPEC) están incluidas las cepas de E. coli
asociadas a meningitis (MAEC) y las uropatógenas (UPEC), dentro de estas
últimas encontramos aquellas que presentan adherencia difusa (DAEC),
causante de infecciones urinarias y enfermedades diarreicas, por otro lado
también se encuentran las E. coli productoras de toxina shiga (STEC), causante
mayormente de infecciones en el tracto urinario, dentro de estas también se
encuentran otras que son capaces de adherirse a células epiteliales,
condensando la actina del citoesqueleto llamadas E. coli adherente y borradora
(AEEC), estas dos últimas se encuentran en el gran grupo de E. coli
enterohemorrágicas (EHEC), en donde se encuentra el serotipo O157:H7, que
es bastante estudiado.
Figura 6. Complejo ilustrativo de patotipos en E. coli, causante de
enfermedades de importancia clínica en seres humanos.
También encontramos al grupo de E. coli enteroinvasivas (EIEC) causantes de
diarrea sanguinolenta en niños y adultos, y el grupo de las E. coli
bjetivos
21
enteroagregativa (EAEC), que son aquellas que manifiestan en el paciente
diarreas aguadas y persistentes, por esa razón se clasifican los patotipos en 6
grandes grupos como son: E. coli con adherencia difusa (DAEC),E. coli
enterohemorrágica (EHEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli
enteroagregativa (EAEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC) y E. coli enteropatógena
(EPEC) (Kaper, Nataro & Mobley, 2004), en donde estos 6 patotipos tienen
unas interacciones únicas y especificas con la célula eucariota, como se
muestra en la (figura 7), representando las interacciones con cada patotipo y su
célula hospedadora (Kaper, Nataro, & Mobley, 2004).
Figura 7. Patogenicidad de patotipos de E. coli en células diana.
(Kaper, Nataro & Mobley, 2004).
1.5.1.4 Sensibilidad y resistencia de E. coli a antimicrobianos
La resistencia de los microorganismos a antibióticos y antimicrobianos ha ido
evolucionando atreves del tiempo, perjudicando la terapia farmacéutica en
pacientes infectados (De La Salud, 2001). (Villegas et al., 2008). (Tafur, Torres
& Villegas, 2011). Los fármacos como macrólidos, novobiocinas, rifampicinas,
bjetivos
22
actinomicina D y ácido fusídico, son medicinas a los cuales se ha mostrado la
resistencia en las cepas de E. coli (Scheutz, 2005).
Este tipo de cepas bacterianas han mostrado que más del 40 % de ellas
muestran resistencia identificada para tetraciclinas ampicilina, estreptomicina y
sulfamidas, y otras que son un poco más del 15 % son resistentes a neomicina,
kanamicina, cefalosporinas de 1ª generación, quinolonas y cloranfenicol, y las
demás que se han identificado en ellas cierta actividad de resistencia (baja) a,
cefalosporinas de 2ª y 3ª generación, polimixina B, gentamicina, tobramicina,
amoxicilina-ácido clavulánico amicacina y colistina (Blanco et al., 2002).
Frecuentemente se han utilizado varios tratamientos para contrarrestar el efecto
patológico e infectante de E. coli, y más frecuentemente en las que son de tipo
extraintestinal, utilizando quinolonas, cefalosporinas, aminoglicósidos,
amoxicilina, amoxicilina - ácido clavulánico, y cotrimoxazol, pero se ha
demostrado que la sensibilidad de esta cepa va tomando un gran campo de
resistencia tomando así el antibiograma como fuente fundamental para declarar
un diagnóstico diferencial y determinante para este microrganismo (Blanco et
al., 2002).
1.5.1.5 Mecanismos de resistencia de E. coli
Las cepas patógenas de E. coli, han demostrado su capacidad de defensa a
muchos de los fármacos que se encuentra a disposición de la entidades
médicas para el manejo de estas patologías, pero investigadores han visto
como ellas manejan unos mecanismos que le ayudan a dar resistencia y con el
cual han venido evolucionando gradualmente, varios de ellos han sido descrito
como son por ejemplo, el desvío de una etapa metabólica, alteración de dianas,
inactivación enzimática y una disminución en la acumulación intracelular del
Antimicrobianos, para medicamentos como tetraciclinas, betalactámicos,
cloranfenicol, sulfonamidas, trimetoprim y aminoglucósidos (Scheutz, 2005).
Las cepas de E. coli como bacterias Gram-negativas, muestran un gran sin
número de mecanismos de resistencia. Hay cuatro categorías de ellos que son
base fundamental para el estudio de resistencia en este tipo de
microorganismos, que han estado involucrados en fallas terapéuticas como son:
Enzimas modificadoras, bombas de salida, cierre de porinas y proteínas
unidoras de penicilinas (Figura 8).
bjetivos
23
Un primer mecanismo funciona en las bacterias que muestran enzimas capaces
de dañar la estructura de los antibióticos, haciendo que este pierda su
capacidad de acción, estas enzimas son capaces de hacer modificaciones en la
estructura de los antibióticos haciendo reacciones de fosforilación, acetilación
adenilación (lactam antibiotics.Livermore, 1991).
Figura 8. Mecanismos de Resistencia en microorganismos Gram-
negativos, 1.Enzimas modificadoras, 2.Bombas de salida, 3.Cierre de
porinas y 4. Proteínas unidoras de penicilinas.
(Tafur, Torres & Villegas, 2011).
El segundo mecanismo y más utilizado por este tipo de bacterias es el de las
bombas de salida, que no le permite a los antibióticos actuar en su blanco y
realizar su acción Antimicrobianos, tomando el antibiótico en el área
periplásmica y expulsándolo al exterior (Vila, Martí & Sánchez-Céspedes, 2007
), Otro de los mecanismos es el cambio en la permeabilidad de la membrana
que deja pasar a los antibióticos al espacio periplásmico, bloqueando la bicapa
lipídica, realizando cambios en las porinas y en la permeabilidad no dejan pasar
y actuar a los antibiótico (Vila, Martí & Sánchez-Céspedes, 2007 ), y por último
bjetivos
24
el mecanismo que anula y altera el sitio de acción de los antibióticos, y que no
sólo es utilizado por bacterias Gram-negativas sino también por bacterias
Gram-positivas como el Staphylococcus aureus, dando cambios en la estructura
de los antibióticos como en ß-lactámicos a nivel de las proteínas unidoras de
penicilinas (Cavaco et al., 2008).
1.5.1.6 Cepa Escherichia coli (ATCC® 25922™).
La cepa Escherichia coli(ATCC® 25922™ ), se aisló primeramente en muestras
médicas de la clínica de Seattle, Washington en el año de 1946, en donde
habitualmente es utilizada como prueba para control de calidad, también es
utilizada en experimentos de proyección de anticuerpos y sensibilidad, esta
cepa es de serotipo O6 con biotipo 1, y tiene un genoma ensamblado de 5,20
Mb, con más del 50 % de contenido de guaninas y citosinas, incluyendo
también dos plásmidos determinados (Hein-Kristensen, et al., 2013). (Minogue,
et al., 2014), El genoma anotado de Escherichia coli ATCC 25922 está
disponible en GenBank con el número de acceso no. CP009072 (Minogue et al.,
2014).
bjetivos
25
1.5.1.6.1 Ficha Técnica de la Cepa Escherichia coli (ATCC® 25922™).
bjetivos
26
1.5.2 Staphylococcus aureus (S. aureus).
Este microrganismo fue descrito por primera vez por el señor Alexander Ogston
en 1880, cuando se realizaba una curación de un paciente que supuraba
materia (Lowy, 1998), demostrando que estos pequeños microrganismo en
forma de cocos era causante de este tipo de abcesos en la piel de muchos
pacientes, llamándolos en esa época, “Staphylococcus”, de donde significa
Staphile, en griego racimo de uvas y kokkus fruta redonda. Uno de los primeros
fármacos utilizados en 1941 y para la época para el tratamiento de este tipo de
microorganismos fue la penicilina, reportándose un poco más tarde en el año de
1945, una de cepa de Staphylococcus aureus resistente a la penicilina,
mostrando la acción de una molécula denominada β-lactamasa que la destruía
(Hurtado, De La Parte & Brito, 2002). (GIL D de M, M. O. N. I. C. A, 2000 ), este
microrganismo también conocido como S. aureus, se encuentra
fundamentalmente en los tejidos de la piel sana sin provocar daño alguno, se
demuestra enfermedad por este patógeno cuando están las defensas bajas o
heridas abiertas en las que puede provocar infecciones graves, siendo una de
las principales causas de infección en sitios quirúrgicos y nosocomiales, es por
esto que diferentes entidades de salud fomentan el apoyo por las altas tasas de
morbimortalidad de este microrganismo (Olaechea et al., 2010).
Taxonómicamente este microrganismo pertenece a la familia
Staphylococcaceae, al género Staphylococcus y a la especie S. aureus (Figura
9).
Figura 9. Taxonomía Staphylococcus aureus.
Dominio: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Bacillales
Familia: Staphylococcaceae
Género: Staphylococcus
Especie: S. aureus
bjetivos
27
Morfológicamente este microrganismo de forma redonda, inmóvil, puede llegar
a medir entre 0.5 a un 1 µm de diámetro (Murray, Rosenthal & Pfaller, 2009 ),
formando grupo de ellas en forma de racimos de uvas(Alexander, 1984 ), su
color es dorado o mostaza claro (Brooks, Jawetz & Blengio Pinto, 2011 ), el S.
aureus es una bacteria Gram-positiva en tinción de Gram, pero cuando son
fagocitados o son células viejas tienden a dar una coloración como las Gram-
negativas, proveen de una capa de polisacáridos, en donde en este
microrganismo se han podido caracterizar por lo menos 11 serotipos
fundamentando a los serotipos 5 y 8 como los que más se establecen en
enfermedades en humanos y a los que se les atribuye la adhesión evitando de
alguna forma ser reconocido por moléculas destructoras (Emori, & Gaynes,
1993 ), tiene una pared celular provista de peptidoglucano y ácido teicoico, el
primero con función de estabilizante osmótico y lisis de la bacteria por
concentraciones de sal, y el segundo actúa como adherente específico de las
bacterias Gram positivas a las superficies mucosas (Murray, Rosenthal &
Pfaller, 2009). (Winn et al., 2008), contiene catalasa (Brooks, Jawetz & Blengio
Pinto, 2011) que es utilizada en pruebas bioquímicas para la cepa, también
tiene proteína A (U.S. National Library of Medicine, ed.) y además un factor de
agregación llamado coagulasa (Lowy, 1998).
1.5.2.1 Staphylococcus aureus resistente a Meticilina
Poco tiempo después de la aparición de la penicilina y observar que esta cepa
de Staphylococcus de alguna u otra forma era controlada con este
medicamento, el señor Rammelkamp, en el año de 1942, menciona las
primeras resistencias a este fármaco (Rammelkamp, & Maxon, 1942 ), dando
un primer descontento a los entes médicos ya que en la década de los
cincuenta este medicamento pierde su utilidad en tratamientos que se pensaba
era la solución para este tipo de patologías, la introducción de la meticilina
como nuevo antibiótico semisintético, potente y capaz de resistir a el efecto de
las β.lactamasas, dio un suspiro a pacientes que en ese momento tenían ese
tipo de padecimientos, pero poco tiempo paso al encontrarse que esta cepa del
microrganismo mostraba un gen que le daba resistencia a este otro antibiótico,
(Fitzgerald et al., 2001; Weese et al., 2005), convirtiéndose en una problemática
para la salud humana (Fitzgerald et al., 2001; Weese et al., 2005; Lee, 2003;
Pinho, de Lencastre, & Tomasz, 2001), reportándose esta resistencia mas que
todo en las entidades de salud y en sitios quirúrgicos, convirtiéndose en un
desafío para muchos investigadores (Lee, 2003; Center, A. O. C. 2006).
(Middleton et al., 2005).
bjetivos
28
Bastante preocupante fue la situación cuando se empezaron a dar las
resistencias en sitios quirúrgicos o en personas que habían asistido a un centro
de salud a algún tratamiento que en ocasiones era invasivo, ya que
presentaban gran cantidad de infecciones aparentes sin saber el porqué, a
estas cepas muy comúnmente se les empezaron a llamar cepas de S. aureus
meticilinoresistente hospitalarias (SARM-AH), pero también unas muy
importantes que se adquirían por fuera de entidades de salud y que eran
transmitidas por personas o personal médico que lo trasportaban de lugares
externos llamadas cepas de S. aureus meticilinoresistente comunitarias o
adquiridas en la comunidad (SARM – AC; Weese et al., 2005; Lee, 2003; Cuny
et al., 2006; Otter, & French, 2010), y otras cepas de interés son aquellas que
también infectan a otro tipo de mamíferos y aves (Cuny et al., 2010; Van Den
Broek, et al., 2009).
S. aureus resistente a meticilina (SARM) produce PBPs de poca afinidad por los
β-lactámicos denominadas PBP2´ o PBP2a, que conservan la síntesis de la
pared de las bacterias cuando se presentan estos antibióticos. Su obtención
está regulada por un gen llamado mecA (Pinho, de Lencastre, & Tomasz,
2001), por esta razón se hace indispensable establece estudios en los más
conocidos mecanismos de resistencia SARM a los β -lactámicos que son,
resistencia por proteínas fijadoras de penicilina (PBP) modificadas o
supernumerarias, conocida como resistencia intrínseca a meticilina, producción
de β –lactamasas y por último fenómenos de tolerancia.
1.5.2.2 Importancia de morbi-mortalidad de S. aureus.
S. aureus, es una de los microorganismos que causa infecciones en cualquier
persona y a cualquier edad, en la población de edades bajas la tasa de
infección es de 30 casos por cada 100.000 habitantes (AVANCES, &
CONTROVERSIAS, 2007). y se menciona que más o menos el 50 % de los
adultos esta colonizado por esta bacteria, y que el 20 % de ellos están
colonizados persistentemente (Hurtado, De La Parte, & Brito, 2002 ), teniendo
estas personas un riego demasiado alto a sufrir complicaciones con este tipo de
infecciones (Winn et al., 2008 ), los grupos con más riesgo de infecciones
graves son los pacientes que están hospitalizados y en quirófanos (Weinstein,
1959 ), pacientes inmunocomprometidos (Weinke et al., 1992 ), personas con
azúcar en la sangre (Tuazon et al., 1975 ), pacientes con hemodiálisis y diálisis
bjetivos
29
(Yu et al., 1986) y pacientes con fórmulas intravenosas (Tuazon & Sheagren,
1974).
Epidemiológicamente hablando el S. aureus SARM-AC, en países en
desarrollo, muestra que es uno de los patógenos responsables de infecciones
en tejidos blandos y en la piel en un 80% establecida en la comunidad (Moran,
et al., 2006), y las tasas de infección en niños oscila entre más de 50 casos por
S. aureus 1000. Habitantes (Fridkin et al., 2005 ), en donde estudios recientes
muestran el aumento de pacientes pediátricos con infecciones con S. aureus
SARM-AC, de un 31 % en los años 90 a más del80 % en los últimos años (Mera
et al., 2011 ), El centro para el control y prevención de enfermedades (CDC ),
estima que en los últimos años más de 16.500 muertes son atribuidas a
infecciones invasivas con S. aureus SARM-AC, y que es de gran importancia
debido a que esta estimación es comparable con otras enfermedades de alta
mortalidad (Klevens et al., 2007). En Latinoamérica los primeros casos fueron
reportados en los años 2002 y 2003 (Nimmo & Coombs, 2008). (Galiana Villar,
2003) en países como Uruguay y Brasil, en Colombia en diferentes estudios se
ha mostrado la alta prevalencia en infecciones con S. aureus en más de un 45
% y de SARM-AC Y SARM-AH en más del 3.2 % (Reyes et al., 2009).
1.5.2.3 Sensibilidad y resistencia de S. aureus a antimicrobianos
Estas cepas S. aureus, han evolucionado gradualmente con el hecho de
sobrevivir a los β-lactámicos y a otro tipo de antibióticos que lo puedan combatir
(GIL D de M, Mónica, 2000).
Muchos de los estudios basados en la búsqueda del porque se ocasiona un
rápido avance el resistencia, muestra los diferentes mecanismos que van
adquiriendo estos microorganismos para contrarrestar los efectos
antimicrobianos de un fármacos, es así que muchos medicamentos no tienen
efecto enfocándonos en cada caracterización de estructuras y métodos de
evasión es así como la resistencia a oxacilina, meticilina y nafcilina, muestran
que están reguladas y codificadas por casetes genéticos cromosomales, otras
resistencias como a la vancomicina muestran que en países desarrollados, S.
aureus es resistente a vancomicina la cantidad mínima inhibitoria del fármaco,
si CMI ≥ 16 mcg/ml, será moderadamente resistente si CMI está entre 2 y
8 mcg/ml y será susceptible si CMI ≤ 2 mcg/ml (Brooks, Jawetz, & Blengio
Pinto, 2011 ), otro tipo de resistencia se da cuando la resistencia es adquirida
por plásmidos en fármacos como los aminoglucósidos,
bjetivos
30
tetraciclinas, eritroMicina, entre otros, y otras resistencias y la más mencionada
a la meticilina, que posee un gen llamado mecA, que es bastante estudiado en
la resistencia en este tipo de microorganismos estableciendo gran importancia
en las medidas de control y prevención de este tipo de resistencias (Sopena &
Sabrià, 2002).
Es así como se muestran muchas fallas en las terapias con medicamentos que
en algún momento mostraron ser eficaces para este tipo de patologías y que
ahora, la opción mientras se buscan nuevos antimicrobianos es saber manejar
la dosificación con los fármacos conocidos, dando así un tratamiento transitorio,
un ejemplo de esto se muestra en la (tabla 1).
Tabla 1. Antibióticos disponibles para el tratamiento de S. aureus.
Dándose también otras alternativas para otro tipo de cepas como son,
Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM), se recomienda
clindaMicina, trimetoprim-sulfametoxazol o doxiciclina (Murray, Rosenthal, &
Pfaller, 2009), para Staphylococcus aureus con resistencia intermedia a
vancomicina la oxazolinidonas y Quinutripsina/Dalfopristina (Brooks, Jawetz, &
Blengio Pinto, 2011) y para Staphylococcus aureus con resistencia a
vancomicina (VRSA). Solicitando antibiograma, y por otro lado fármacos como
la moxifloxacina y la gatifloxacina son bastante eficaces contra S. aureus y
presentan menos posibilidad de seleccionar cepas resistentes (Kanafani &
Fowler Jr, 2006).
bjetivos
31
1.5.2.4 Mecanismos de resistencia de S. aureus
Al observar el incremento en la resistencia y los múltiples procesos de cambio
que han realizado este tipo de microorganismos como lo es Staphylococcus, se
puede ver como algunos de los mecanismos evidenciados, muestran su alto
nivel de caracterización en la evasión del enfoque terapéutico de muchos
fármacos, orientando la investigación en sistemas o mecanismos basados en la
reproducibilidad de moléculas, la aparición de genes de resistencia, las
mutaciones esporádicas, las alteraciones en estructuras internas y otras que
conllevan, a dar con un blanco terapéutico sin que la cepa del microrganismo
pueda ser resistente.
Los mecanismos más estudiados pueden ser, -1-. Los genes de resistencia,
que como se ha podido evidenciar en las cepas S. aureus SARM, hay un gen
llamado mecA que es el garante de la síntesis de la proteína ligadora de
penicilina 2a (PBP2a o PBP2), confiriendo resistencia a todos los antibióticos
beta-lactámicos, incluyendo a las cefalosporinas, -2-. Los derivados de
mutaciones cromosomales que puedan codificar la producción de
topoisomerasas, que ocurre generalmente en este tipo de bacterias Gram-
positivas (Sanders, 2001), -3-. La introducción de una bomba de salida de
resistencia multiantibió-ticos, -4-. Las alteraciones en la pared celular, el cual
inhibe la síntesis de la pared celular al acoplarse con las terminaciones D-ala-D-
ala de las unidades precursoras de la pared, inhibiendo las reacciones de
polimerización de péptido-glicanos y la transpeptidación, -5-. La producción de
penicilinasas, inactivando el fármaco por hidrolización del anillo beta-lactámico
a través de la producción de una enzima conocida como beta-lactamasa (Zhang
et al., 2001), -6-. Y otros mecanismos de resistencia a tetraciclinas y linezolid,
que actúan en sitios específicos como en las subunidades ribosomales 30S y
los de resistencia a Trimetoprim y sulfametoxazol que son dos antimetabolitos
que privan la síntesis de tetra-hidrofolato, el cual es importante para la síntesis
de timidina, purina, ADN y otros aminoácidos (Lowy, 2003). (Moreillon, Que, &
Glauser, 2005).
1.5.2.5 Cepa Staphylococcus aureus (ATCC® 29213™).
La cepa Staphylococcus aureus (ATCC® 29213™ ), es un aislado clínico, se
obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivó durante la
noche a 37 ° C en caldo Mueller-Hinton (Becton, Dickinson) y el ADN genómico,
se extrajo utilizando QiAmp DNA minikit (Qiagen), es habitualmente utilizada
bjetivos
32
como prueba para control de calidad, sensible a muchos antibióticos incluyendo
SARM, y tiene un genoma ensamblado de 2.773.559 pb, con más o menos del
34 % de contenido de guaninas y citosinas (Aziz et al., 2008), El genoma
anotado de Staphylococcus aureus (ATCC® 29213™) está disponible en
GenBank con el número de acceso no.LHUS00000000
1.5.2.5.1 Ficha técnica de la cepa Staphylococcus aureus (ATCC®
29213™).
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33
1.6 Plantas
1.6.1 Plantas medicinales
Se cree que las especies de plantas medicinales han estado proporcionando
beneficios al ser humano desde tiempos muy remotos, es más, se dice que
están en el ambiente desde mucho antes de que el ser humano habitara este
planeta, constituyéndose en un recurso biológico de gran importancia, en la
atención de personas enfermas, con heridas e infecciones graves.
Hasta hace pocos años se trataban las plantas como recurso de cierta forma
farmacéutico realizando diferentes mezclas o realizando ensayos de error, para
observar sus características curativas, y denominándola medicina tradicional,
escritos de época muy antiguas más o menos de 6000 años de antigüedad
muestran que las plantas eran la única opción de cura y que más adelante
personas que laboraban como curadores o sabios de la época, las utilizaban en
la tratamiento de varios de sus pacientes, la cultura egipcia en muchas de sus
regiones fomentaron el uso de plantas medicinales y conformaron una escuela
de medicina, contribuyendo a tratamientos terapéuticos y a la conformación de
la ciencia que hoy se conoce como farmacognosia, encargada de estudiar las
plantas medicinales, sus antecedentes, cuáles son sus características para
seleccionarlas e identificarlas, como es el marketing, y como deben ser
preservadas, para la elaboración de materia prima de algunos fármacos (Gupta
M, 1995).
Los principios activos de las plantas medicinales han sido muy poco estudiados,
con el progreso de la ciencia e innovadores equipos se han podido destacar
moléculas de interés biológico y medicinal de este tipo de plantas, de allí los
estudios en medicamentos de base natural a el que llamaron medicina
alopática, medicina moderna o también llamada medicina científica,
considerando una de las nuevas pautas de medicamentos bioactivos para el
tratamiento de una gran cantidad de enfermedades en especial de aquellas que
son infecciosas y que de cierta forma causan una gran mortalidad a nivel
mundial.
Por esta razón es que es de gran importancia catalogar a la medicina tradicional
y alopática como unas de las mejores bases para la formulación de nuevos
compuestos bioactivos, capaces de actuar en tratamientos y tener eficacia
como antimicrobianos para disminuir e porcentaje y evolución de los
microorganismos causantes de muchas patologías infecciosas y que en este
bjetivos
34
momento muestran resistencia a muchos de los fármacos reconocidos.
(Fonnegra, 2007).
La resistencia a un gran número de medicamentos químicos sintéticos, han
llevado a la búsqueda y estudios de diversas moléculas bioactivas, es así como
la OMS promulga a los expertos que deben desarrollar e investigar compuestos
de base natural que contribuyan eficazmente a la exterminación de muchos de
los microorganismos altamente infecciosos con capacidad de resistencia. (OMS
2013 – 2017).
Diferentes estudios se han enfocado a las interacciones de algunas moléculas
bioactivas de plantas medicinales, sus metabolitos secundarios y agentes
infecciosos, con el fin de desarrollar metodologías sostenibles, que tengan un
bajo impacto ambiental, y que de alguna u otra forma se desarrolle
investigaciones que conlleven a la búsqueda de nuevos recursos naturales, que
no solo sean materia de estudio si no que sirvan como sustancias que ayuden a
disminuir e erradicar las diferentes patologías infecciosas.
En Colombia las plantas medicinales para el tratamiento y prevención de
enfermedades habituales e infecciosas es una práctica común, principalmente
en áreas rurales, cultivándose primordialmente para afecciones con procesos
inflamatorios e infecciosos, y aquellas con las que se muestran trastornos que
tengan que ver con radicales libres (Krishnaiah, Sarbatly & Nithyanandam,
2011).
Según el Instituto Humboldt (2011-2012 ), las alternativas para el desarrollo de
investigaciones en base a plantas constituyen una estrategia importante, debido
a la gran diversidad de plantas medicinales que hay en nuestro país y en el
trópico, contribuyendo al desarrollo de nuevos medicamentos de base natural
que puedan ser utilizadas para contrarrestar enfermedadese infecciones en los
que fallan los tratamientos, siendo una estrategia más para proporcionar una
esperanza de vida a los pacientes, debido a que los microorganismos cada día
van dando un paso gigante en el área de la resistencia, si no se buscan nuevas
estrategias para el tratamiento de las enfermedades infecciosas para
controlarlas y erradicarlas, serían causantes de muchas muertes en el mundo
como fue en tiempos atrás cuando no se conocía de ellos.
bjetivos
35
1.6.1.1 Planta medicinal Mammea americana 1.6.1.1.1Generalidades y descripción botánica
Mammea americana L. (Calophyllaceae J. Agardh). (Figura 10), es una planta
que tiene una altura entre 20 y 25 metros, su follaje es de color verde oscura
con una disposición en su copa alta y densa, su tronco puede medir hasta un
metro de ancho, que segrega un tipo de látex amarillento, sus hojas de un verde
brillante pueden medir de10 a 20 cm de largo y 5 a 1 0 cm de ancho, flores
formadas por 2 cépalos y entre 4 y 6 pétalos de coloración blanca (Mahecha
Vega & Echeverry Restrepo, 1983 ), su fruta es de forma redonda de color café
que puede medir entre 8 y 15 cm y puede llegar a pesar entre 400 y 2000
gramos (Liogier 1978), la pulpa es de color amarillento-cobrizo y sus semillas
pueden medir de 6 a 8 centímetros y tener entre 1 y 4 de ellas en el mismo fruto
(Little & Wadsworth, 1989), son plantas hermafroditas o de características
masculinas, esta planta es más comúnmente conocida como Mamey, mamey
dominicano (español), abricó, abricó do Pará (portugués), mamme, mammee-
apple (inglés), Abricot de Saint Domingue (francés)originaria de América tropical
(norte de Sudamérica) y de las Antillas (Cuba, Santo Domingo y Jamaica). El
área de distribución natural de la Mammea ocupa todo el alrededor de la latitud
20° N. a la 12° N. (Figura 11). Se menciona que crece preferiblemente en
climas húmedos con precipitaciones desde 1500 mm/ año hasta 3000 mm/año,
en temperaturas de 27 a 30°, con suelos de calidad y profundos (Bailey, 1941).
(Poupon & Chauvin, 1983), y con pH de 5.1 a 7.8, no es capaz de soportar
heladas ni vientos muy fuertes, frecuentes y constantes.
Figura 10. Mammea americana y su descripción botánica.
Reino: Plantae
División: Angiospermae
Clase: Magnoliopsida
Orden: Malpighiales
Familia: Clusiaceae
Tribu: Calophyleae
Género: Mammea
Especie: Mammea americana.
bjetivos
36
Se cultiva en las Bahamas y en menor escala en Venezuela, Guyana, Surinam,
Guyana francesa, Ecuador y norte de Brasil. En Colombia (figura 12). se
encuentra en el bosque seco tropical, bosque húmedo tropical, bosque húmedo
premontano y bosque muy húmedo premontano (Barrero Barrero et al., 2012 ),
se le conoce como mamey de Cartagena de Indias, o en inglés como Mammee-
apple (Little & Wadsworth, 1989 ), se cultiva principalmente en áreas tropicales,
su fruto es de buen sabor, y la madera se utiliza como beneficio económico, de
igual forma sus frutos son altamente consumidos en varias regiones, ya que su
fruto tiene una constitución porcentual de 18% de cáscara, 20% de semilla y
62% de pulpa, teniendo un valor nutricional muy importante.
Genéticamente hablando se conocen unas cuatro especies del género
Mammea, procedes 3 de ellas de regiones Africanas y otra de las partes
tropicales de América (Liogier, 1978), estudiosos en el tema proponen que la
selección genética de esta plantación, dará una mejor calidad de sus frutos
(Bailey, 1941).
Figura 11a. 11b Distribución Geográfica natural y general de la Mammea
americana.
11a
bjetivos
37
11b.
Figura 12. Distribución geográfica de Mammea americana L. en Colombia.
Tomado de: Celis, M. 2017-1- 09. Mammea americana L. En Bernal, R., S.R. Gradstein & M. Celis
(eds.). 2015. En: Catálogo de plantas y líquenes de Colombia. Instituto de Ciencias Naturales,
Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. http://catalogoplantasdecolombia.unal.edu.co.
bjetivos
38
1.6.1.1.2 Metabolitos aislados de Mammea americana
Los medicamentos sintéticos preocupan a la medicina actual, debido a que ha
sido demostrado en algunos estudios sus efectos secundarios desfavorables,
estimulando así, a la búsqueda de nuevas moléculas en vegetales. En plantas
como Mammea americana se pueden obtener dichos productos naturales
beneficiando al hombre sin tener algún efecto negativo sobre la salud humana
(Yang et al., 2006).Mammea americana se maneja en la medicina alternativa
para el procedimiento de enfermedades como parásitos, flema, ácido úrico,
fiebre, hipertensión, infecciones de la piel, raquitismo, pérdida de cabello, entre
otros. En el área científica se ha podido demostrar que esta planta produce
unos compuestos cumarínicos llamados “Mammeas cumarinas”, a estas se les
ha atribuido propiedades antioxidantes, antimicrobianos, antiinsecticidas,
anticancerígenas, antitumorales, y antifúngicas. (Yang et al., 2006).
Las cumarinas son compuestos que de cierta forma han sido de mucha
relevancia en el estudio químico y fitoquímico de muchas plantas, se debe tener
en cuenta sus características medicinales y compuestos importantes que
podrían estar infundiendo e interviniendo con los hongos endófitos de esta
planta para el beneficio de ella y por ende para el estudio de bases
farmacológicas, ya que se han mencionado que estos compuestos cumarínicos
en la Mammea llamados Mammeas cumarinas han en otro tipo de plantas
mostrado sus beneficiosos efectos.
Figura 13. Estructura básica de una cumarina. 2H-chromen-2-one.
Las cumarinas o también llamadas benzopironas (Figura 13 ), son de gran
interés biológico (Santana et al., 2006 ), informes de la revista SciFinder
database, describen que del género Mammea se han aislado aproximadamente
120 tipos de cumarinas y otros estudios muestran que 39 cumarinas de
Mammea han sido obtenidas e identificadas, de las diferentes estructuras de la
bjetivos
39
planta Mammea americana (Piot et al., 1988 ), una de las primeras cumarinas
fue aislada de las semillas del árbol Coumarona Odorata Aube (Soine, 1964) de
donde se deriva el nombre de la familia de estos compuestos, sus
características farmacológicas son de gran importancia ya que se observa que
tienen capacidad antimicrobianos (Sardari et al., 1999; Xie, Takeuchi,
Cosentino, & Lee, 1999) Antivirales (De Clercq, 2000; Emmanuel‐Giota et al.,
2001 ), antiinflamatorias(Delgado, et al., 2001; Kaneko, Baba & Matsuo, 2001 ),
antihelmínticas inhibidoras enzimáticas, antiespasmódicas, y antioxidantes
(Sporn et al., 1986). Existen además derivados tricíclicos o tetracíclicos de
cumarinas que son intercalantes del ADN que son de interésantitumoral.
Además para realizar la nomenclatura se han mostrado algunas reglas para
nombrarlas, iniciando con en el nombre 'mammea'' colocando “una primera letra
que indica la sustitución en C-4 (carbono cuatro). Una segunda letra indica si el
grupo acilo está en C-6 (carbono seis) o C-8 (carbono ocho). Una tercera letra
está relacionada con el tipo de sustituyentes acilo. Cuando el sustituyente
prenilo ha sido posteriormente ciclado, la tercera letra va seguida del prefijo
ciclo y una cuarta letra que indica el tipo de heterociclo implicado” (Tabla 2).
Tabla 2. Nomenclatura de cumarinas aisladas de Mammea americana
(Ibid. p. 64).
bjetivos
40
1.6.1.2 Planta medicinal Moringa Oleífera 1.6.1.2.1 Generalidades y descripción Botánica
Esta planta medicinal Moringa oleífera se conoce con su nombre común como
Moringa, a esta planta se le han dado nombres como Guilandina moringa, en
épocas del señor Linneo en el año 1753, y también Hyperanthera moringa (L.)
por el señor Vahl, en muchos escritos es común encontrar que algunos autores
empleen el nombre Moringa pterygosperma Gaertn. (p.ej. Morton, 1991).
(Morton, 1991), siendo un nombre irreal según las reglas de nomenclatura
botánica a nivel mundial. Estas normas también revelan que G. moringa y H.
moringa no son nombres propicios ni verdaderos, mientras M. oleifera tiene
prioridad y es el nombre válido hasta el momento.
Aunque sus árboles no son muy grandes pueden llegar a medir de 10 a 12
metros de altura (Tobias, 2010), dispone de hojas color verde claro, que miden
de 30 a 60 centímetros de largo, tiene flores de color blanco o crema que miden
2.5 centímetros de diámetro, tiene vainas colgantes color marrón, que miden de
30 a 120 centímetros por 1,8 centímetros de ancho, con forma triangular, sus
semillas son de color marrón oscuro con tres pequeñas alas (Duke, 1983),
Figura 14. Moringa oleífera y su descripción botánica.
Fuente: http: //plants.usda.gov/java/profilesymbol=mool.
Es un árbol de procedencia de los Himalaya de India, pero fue introducido a
otras partes el mundo como Afganistán, Asia occidental, África del Oeste,
Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Súper División: Spermatophyta
Clase: Magnoliopsida
Sub-clase: Dileniidae
Orden: Capparales
Faimilia: Moringaceae
Géreno: Moringa
Especie: Oleifera Lam
bjetivos
41
Bangladesh, Pakistán, Sri Lanka, el Sureste asiático, la Península Arábiga,
Madagascar, el sur de la Florida, las islas del Caribe, América del Sur, desde
México a Perú, Paraguay y Brasil (Figura 16 ), creciendo de manera ágil en
lugares propicios (Sánchez-Peña et al., 2013 ), es un árbol bastante flexible a
diferentes climas, aunque se encuentra más frecuente en climas templados, y
menos tolerable en bajas temperaturas, tiene alta resistencia a enfermedades
en sus estructuras y a diferentes patógenos que la puedan afectar, su
precipitación debe estar entre los 1000 y 2000mm, aunque pueden encontrarse
plantaciones con precipitaciones hasta de 400mm, también deben tener un pH
óptimo que varía entre 4.5y 9.
Figura 15. Beneficios, Propiedades y aplicaciones de cada una de las
estructuras de la planta Moringa oleífera.
(Castro Márquez, 2014).
Esta planta tiene amplios beneficios (Figura 15).y un sabor agradable, de forma
de que se pueden comer todas sus partes sin ningún problema, en especial las
flores y las hojas, no tiene efectos secundarios, y sus hojas presentan una gran
cantidad de proteínas, vitaminas, minerales y aminoácidos (Mathur, 2005 ), y el
aceite de sus semillas es bastante utilizado ya que contiene un 73% de ácido
oleico, similar al aceite de oliva, de sus semillas también se han visto
características como las de presentar coagulantes naturales, aclaramiento de
aguas, indicador de contaminación. Que conlleva a la mejora en de las
condiciones sanitarias de varios países menos desarrollados. (Alfaro &
Martínez, 2008).
En Colombia se sabe que hay plantaciones de Moringa en los departamentos
de Bolívar, Tolima, Meta, Santander, Norte de Santander y Antioquia, aunque
bjetivos
42
en algunas otras regiones se muestra que es comercializado debido a sus
beneficios en la agricultura y complemento nutricional en una dieta balanceada
(Ayerza, 2012; Madrigal & Avalos, 2008), proponiendo a las regiones andina y
caribe como principales regiones de desarrollo de plantaciones de moringa por
sus condiciones medioambientales (Castro Márquez, 2014). (Figura 17).
Figura 16. Distribución Geográfica natural y general de la Moringa oleífera.
Figura 17. Distribución de áreas potenciales en Colombia, para el cultivo
de Moringa oleífera.
bjetivos
43
(Castro Márquez, 2014).
1.6.1.2.2 Metabolitos aislados de Moringa Oleífera
Los metabolitos secundarios como hemos visto son de gran importancia en
muchos de los campos de la investigación estos son derivados de hongos
endófitos que de cierta forma le están dando beneficio a la planta, estudios
como el de Souza y colaboradores en el 2016 (Souza et al., 2016 ), muestra
como los hongos endófitos se encuentran involucrados en este tipo de plantas
medicinales como lo es la moringa, y que pueden ser aislados y procesados sus
metabolitos para beneficio, en área farmacéutica. Aunque este estudio realizado
en hojas de Moringa por estos investigadores muestra una alta cantidad de
endófitos bacterianos, presentan más o menos 29 hongos endófitos aislados
(Souza et al., 2016), que pueden en gran parte, aportar grandes beneficios, a la
identificación de toxinas y moléculas que ayuden a contrarrestar patologías
infecciosas.
bjetivos
44
Otros estudios muestran como los hongos endófitos están presentes en este
tipo de plantas, y que tienen actividad antimicrobiana, el hongo endófito
nigrospora aislado es el sp. LLGLM003, siendo seleccionado para
investigaciones químicas y biológicas debido a la fuerte actividad antifúngica y
antimicrobianos del extracto crudo contra los hongos patógenos de plantas B.
cinérea, debido a que sus metabolitos secundarios daban resultados
satisfactorias al ser utilizados (Zhao et al., 2012).
Los metabolitos secundarios mayormente obtenidos de la planta medicinal
Moringa oleífera son: los flavonoides, flavonoles, antocianinas, polifenoles,
alcaloides y taninos (Echavarria et al., 2016), los cuales son metabolitos de gran
importancia en la agricultura y en la medicina. También se puede dar a conocer
algunas sinergias bioactivas ya que en este tipo de plantas se muestra que la
unión entre toninas y flavonoides dan como resultado un alto beneficio como
propiedad antioxidante y además mostrando una mayor capacidad de captación
de radicales libres.
1.7 Generalidades de los Hongos
Los microorganismos eucariotas llamados hongos, son organismos que se
reproducen tanto de forma asexual como sexual (Steinberg, 2007). Constituyen
un grupo bastante diverso en cuanto a su morfología, tamaño, hábitat y formas
de nutrición. Están relacionados de forma lejana con las plantas y más
estrechamente relacionados con los animales, pero son diferentes de
cualquiera de los dos grupos. En su mayoría desarrollan cuerpos muy difusos
formados por una red de filamentos muy estrechos, tubulares y ramificados
llamados hifas. Estos filamentos o hifas, exudan enzimas y absorben los
alimentos y su crecimiento se realiza apicalmente. Aunque estos filamentos son
muy estrechos, son colectivamente muy largos y pueden explorar y explotar
sustratos de alimentos de manera muy eficiente. Usualmente se reproducen por
medio de esporas, y posteriormente son liberadas al medio ambiente por
diversos mecanismos, conformando una gran diversidad morfológica de
estructuras tanto macroscópicas como Microscópicas .El número de hongos
que existe en el planeta no se puede determinar con exactitud pues hay aún
muchos subregistros y especies nuevas por estudiar, en una reciente
publicación de Hawksworth & Lücking, (2017 ), se estima que el número de
especies podría estar entre 2.2 y 3.8 million. Sin embargo un pequeño número
de especies entre los estimados de millones de especies de hongos en el
bjetivos
45
planeta Tierra, pueden llegar a causar enfermedades en humanos, y de estas
especies son muy pocas las que afectan a personas sanas (O'Brien et al., 2005
), de ahí que a las infecciones causadas por hongos en la salud humana, en su
gran mayoría se les conoce como “infecciones oportunistas”, en especial en
pacientes inmunocomprometidos, o con enfermedades de base severas, o
aquellos que han sido sometidos a terapias prolongadas.
El gran número de especies fúngicas que existen en el planeta tienen más
efectos benéficos que deletéreos, así, tienen diferentes roles en los
ecosistemas, principalmente se les ha atribuido su importante papel en el
equilibrio ecológico de la Tierra y en el reciclaje de nutrientes. Los hongos son
vitales para el buen desarrollo del 80% de plantas vasculares del planeta a
través de las asociaciones micorrizas, proporcionándole a las plantas nutrientes
esenciales como el fósforo asimilable y protegiendo al huésped vegetal contra
patógenos del suelo entre otras funciones conocidas, también algunas especies
de hongos han sido reconocidos como alimentos, en este papel muchas
especies de macromycetes han sido utilizadas en la mesa, otras especies de
microhongos han sido utilizados en los procesos de biofermentación, siendo las
levaduras pioneras en el desarrollo de bebidas fermentadas como el vino y la
cerveza y la producción de pan, que han sido ampliamente documentados
desdelos inicios de la era de la Biotecnología, otros usos que se les ha dado ha
sido como biocontroladores de plagas en el campo agrícola. En la medicina, sin
duda alguna los hongos ocupan un papel muy importante, en la obtención de
antibióticos, de moléculas inmunosupresoras, y compuestos para el control del
colesterol.
De otro lado, se sabe que existen hongos dentro de los tejidos de las plantas a
los que se han llamado, “hongos endófitos” proporcionado un equilibrio y
protección a su planta hospedera contra patógenos. Actualmente los trabajos
relacionados al estudio de microorganismos endófitos de plantas han sido
encaminados a la búsqueda de compuestos con actividad antibiótica entre otros
usos.
La palabra antibiótico fue utilizada por primera vez por Selman Waksman, en
1941 para describir cualquier molécula pequeña producida por un Microbio que
antagoniza el crecimiento de otros Microbios, en este proceso de antagonismo
microbiano, los hongos fueron descubiertos por primera vez en 1928 por
Alexander Fleming como productores de un antibiótico llamado Penicilina.
Desde entonces los hongos han sido materia de estudio de diversos
metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana contra un amplio número
bjetivos
46
de microorganismos (Brakhage et al., 2004). Las investigaciones en la
obtención de nuevos antibióticos y moléculas con diferentes actividades
biológicas de origen fúngico, han sido muy importantes en el control de las
enfermedades infecciosas, algunos ejemplos son la obtención de la
cefalosporina a partir de un hongo filamentoso llamado Cephalosporium y el
ácido fusídico, un antibiótico producido a partir del hongo Fusidium coccineum
(estos dos últimos son útiles contra las bacterias resistentes a la penicilina ), y
la griseofulvina, utilizada para controlar infecciones fúngicas de la piel, uñas y
cabello, fue obtenida como una micotoxina producida por varias especies de
Penicillium, incluyendo : P. griseofulvum Dierckx, P. janczewski, P. nigricans y
P. patulum (De Carli & Larizza, 1988).
Además de la actividad antibiótica, los metabolitos obtenidos de los hongos se
les atribuyen un papel inmunosupresor importante en el trasplante de órganos
en medicina, mostrado capacidad de suprimir la respuesta inmune del receptor
para evitar el rechazo de órganos. El producto fúngico llamado ciclosporina
obtenido del hongo Trichoderma polysporum (Dreyfuss et al., 1976, es
reconocido como un importante inmunosupresor que aumenta en gran medida
la tasa de éxito de las operaciones de trasplante. Otro producto fúngico, la
gliotoxina, ha mostrado actividad en la regulación del sistema inmune y también
puede ser útil para el manejo postoperatorio de pacientes trasplantados. En la
actualidad se vienen realizando investigaciones enfocadas al descubrimiento de
nuevas moléculas fúngicas por su actividad antimicrobiana, inmunosupresora o
para tratar enfermedades metabólicas. Un ejemplo de un compuesto fúngico
utilizado para la disminución del colesterol es el mevinolin, un compuesto de
naturaleza hidroxiácido, obtenido a partir del hongo Aspergillus terreus, este
compuesto actúa disminuyendo los niveles de colesterol al interferir con las
enzimas que producen colesterol en los mamíferos, estos son algunos
ejemplos de la utilidad de los hongos en la medicina y su papel en las
enfermedades infecciosas o metabólicas, sin embargo queda aún más por
describir de las investigaciones realizadas con compuestos fúngicos y por
descubrir nuevos metabolitos de la gran diversidad fúngica como es el caso de
los hongos Macromycetes que viven en ecosistemas boscosos o de los hongos
endófitos que viven dentro de los tejidos de las plantas, cuyos metabolitos han
sido escasamente estudiados en plantas tropicales.
bjetivos
47
1.7.1 Hongos endófitos
Los hongos endófitos fueron descubiertos más o menos en el año de 1898,
pero se predice que su concepto o su palabra como tal “endófito” fue descrita
por el señor Bary en 1866,( Bary, 1866).con muy poca importancia en su
tiempo, pero que en años siguientes tomo fuerza en el área investigativa, dando
a conocer su capacidad de colonizar tejidos de plantas, sin ser patógeno para
ellas y que conforman una importante base de investigación farmacológica,
dándonos a conocer su gran importancia como agente Antimicrobianos por la
producción de metabolitos secundarios, ayudando a la disminución de
infecciones causadas por patógenos adyacentes.
Figura 18. Hongos endófitos y sus características como agentes de
protección
(Investigaciones científicas),
(http://mimedicinatropical.blogspot.com.co/2016/01/micologia.html).
Los microorganismos endófitos son aquellos hongos que permanecen dentro de
tejidos vivos de su hospedero, como agentes de protección de los mismas
(figura 18), mostrando su aparición en una gran diversidad de plantas, dando
características adaptativas bióticas y abióticas, bióticas como el actuar ante
patógenos e insectos, y abióticos como su intervención en el control de la
bjetivos
48
resequedad en las estructuras de la planta, la adquisición de metales en ella y
la absorción de luz (Steinberg, 2007).
1.7.1.1 Clasificación de hongos endófitos de acuerdo a la planta
hospedera
Los hongos endófitos han sido ampliamente estudiados en diversas zonas
geográficas y climas (Krings, et al., 2007) y en un número considerable de
plantas.
En el pasar del tiempo se han clasificado los hongos endófitos en dos tipos: los
Clavicipitáceos y no Clavicipitáceos (Tabla 3) los primeros se caracterizan por
estar en los pastizales, mientras que los segundos están en las coníferas, las
angiospermas y helechos denominados como plantas no vasculares, además
su clasificación también se muestra según sus funciones, taxonomía y
evolución.
Tabla 3. Clases y grupos de hongos endófitos
(Sánchez-Fernández et al., 2013).
1.7.1.2 Hongos Endófitos como fuente potencial de metabolitos
secundarios de importancia médica
La relación entre los hongos endófitos y las plantas sugiere una producción
activa de los metabolitos secundarios, segregados por los dos organismos, el
vegetal proporcionara defensas y el hongo fomentara metabolitos de
característica virulenta como los fitotóxicos y además algunas enzimas dañinas
bjetivos
49
como las exoenzimas. Por esta razón requiere un equilibrio conocida como la
relación endofítica, si no se da una relación equilibrada, el hongo por su
capacidad virulenta se mostrará como agente patógeno. (Schulz & Boyle, 2005;
Kusari, Hertweck, & Spiteller, 2012).
Una de las plantas más estudiadas para este tipo de microorganismo son las
gramíneas, en donde se ha reportado la existencia de hongos endófitos y se
han podido dilucidar algunas investigaciones en el tema, varios investigadores
se han dado a la tarea de dar a conocer la importancia que tienen estos
microorganismos tanto en la agricultura como en la medicina, por su gran
diversidad de componentes que no han sido estudiados a fondo, pero si
mostrando su gran calidad como portadores de agentes productores de
metabolitos bioactivos, que le sirven como defensa a sus hospederos, ante un
agente patógeno, su utilidad también se ha estudiado como reservorio de
diversidad genética, y se conoce que sus metabolitos se activan al interaccionar
con las vías metabólicas de su hospedero(Guo et al.,2000).
Algunos estudios realizados han demostrado, que los metabolitos secundarios
biosintetizados por hongos endófitos, poseen una actividad biológica en un
promedio alto, demostrando así su gran relevancia como agente fitotóxico y
Antimicrobianos, esto conlleva a la búsqueda de diferentes especies habitantes
de tejidos vegetales, en especial de plantas tropicales en donde existe un alto
potencial para la investigación de nuevos compuestos bioactivos, pues se ha
mencionado en algunos artículos de evidencia científica que justifican la
producción de podofilotoxina, esteroides, alcaloides y otros que sirven de gran
beneficio para la salud humana como métodos de tratamiento en enfermedades
de interés.
Gran variedad de compuestos por lo menos 100 de ellos que contrarrestan el
cáncer, son pertenecientes a 19 clases químicas diferentes, aislados de más de
50 especies de hongos pertenecientes a este grupo de microrganismo de
importancia, y de homología a compuestos ya conocidos de base farmacológica
en la salud humana (Kharwaret al., 2011). Uno de los estudios más importantes
tomando como referencia los hongos endófitos, es la composición del taxol, uno
de los fármacos obtenidos de hongos endófitos del árbol Taxus brevifolia, por el
señor Wani y colaboradores en el año 1971 (Wani et al., 1971). El cual es un
fármaco bastante potente y utilizado en el tratamiento del cáncer y conocido
como “paclitaxel”.
bjetivos
50
Tabla 4. Compuestos bioactivos aislados de hongos endófitos frente a
microorganismos de interés clínico y su medio de transmisión. (Goudaet
al., 2016). (Ver ANEXO 2).
Algunos de los métodos utilizados para la obtención de metabolitos
secundarios, se basa en el aislamiento preliminar de hongos endófitos de
hospederos seleccionados, como también análisis detallados de su morfología
a través de estudios de macro y microscopía, complementando con estudios y
técnicas moleculares de la actualidad. Otro paso importante en el estudio de los
hongos endófitos, es realizar cultivos en pequeña y gran escala para evaluar
sus metabolitos secundarios y determinar el potencial antibacteriano para
observar y medir los efectos en el crecimiento de diversos microorganismos
resistentes a fármacos Para evaluar su capacidad antimicrobiana, hoy día se
utilizan varios métodos que diferentes técnicas microbiológicas como
crecimiento en agares específicos, pruebas de antagonismo dual, difusión en
disco y prueba para la inhibición de crecimiento de microrganismos patógenos
(Rubalcava et al., 2010) sobre diversas líneas tumorales para la detección
anticancerígena, como también estudios en modelos murinos acerca de la
actividad antidiabética y procesos antivirales de interés
Gran variedad componentes bioactivos se han sacado de hongos endófitos
pero todavía se menciona que es un campo novedoso en la investigación ya
que falta conocimiento en observar el potencial e identificación de inductores y
la visión y aclaramiento de los procesos biosintéticos de los metabolitos para
este tipo de microorganismos.
Diferentes investigaciones han mostrado la relevancia de los hongos endófitos,
como importantes en diferentes áreas, muchos de ellos de beneficio para la
salud humana, los hongos más estudiados son los miembros de la división
Ascomycetos, aunque también se han evidenciado en los Zygomycota,
Oomycotay Basidiomycota (Bary, 1866 ), algunas referencias como las de
Schulz et al., (2002) y Strobel, (2002) que tratan de experiencias en laboratorios
con investigaciones en endófitos, otras de revisiones como la de Gusman y
Vanhaelen (Tan & Zou, 2001) que muestran como 38 hongos endófitos revelan
su actividad de característica biológica a partir de sus metabolitos secundarios,
y otras revisiones más complejas como las deTan y Zou (Schulz et al., 2002)
que estudian una gran cantidad de endófitos antes del año 2000 mostrando 138
metabolitos secundarios caracterizados, estos resultados soportan la
importancia de los hongos endófitos.
bjetivos
51
En conclusión, los hongos endófitos son recursos biológicos, de gran
importancia y calidad, para la obtención de metabolitos secundarios, aunque los
estudios son aún pocos con plantas tropicales, se quiere obtener más
información científica y dar avance acerca de la valoración de estos agentes
para atacar microorganismos patógenos con fármacos bioactivos e innovadores
en el área de la biotecnología moderna.
1.7.1.3 Tipos de metabolitos secundarios obtenidos de los hongos endofíticos y familias de plantas más reportados
Los metabolitos secundarios obtenidos de hongos endófitos presentan una gran
diversidad bioquímica (Tabla 5), con estructuras biosintéticas solo aisladas de
este tipo de microorganismos.
Las principales pruebas fotoquímicas de identificación de metabolitos
secundarios son: pruebas de Mayer y de Wagner que permiten identificar
alcaloides, El ensayo de Baljet que es aquel que permite reconocer en un
extracto la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico, el ensayo de
Bornträguer utilizado para la identificación de quinonas, el ensayo de
Liebermann – Burchardutilizado para identificación detriterpenos y esteroides, el
ensayo de Shinoda que permite reconocer la presencia de flavonoides, el
ensayo de Antocianidinas utilizado para identificar en los extractos la existencia
en estas estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides, y el
ensayo de espuma que permite reconocer la presencia de saponinas (Tan &
Zou, 2001).
bjetivos
52
Tabla 5. Esquema de algunos ejemplos de bioactividad de metabolitos
secundarios, obtenidos de hongos endófitos
Hongo endófito/platna hospedera
Metabolito secundario / Núcleo base
Actividad biológica
Aspergillus tamarii
(Trichocomaceae).
Endófito de
Ficus carica
(Moraceae)
Pullularia sp. BCC 8613
(Dothioraceae).
Endófito de
Calophyllum sp.
(Calophyllaceae).
Neonectria ramulariae.
WollenW KS-246
(Nectriaceae).
Endófito de
Un árbol no identificado
Cephalosporium sp.
IFB-E001
(Incertae sedis).
Endófito de
Tracheluspermum jasminoides
(Apocynaceae)
Epichloe festucae
(Clavicipitaceae).
Endófito de
Varias especies de pastos
(Poaceae)
Antifúngico
Activo contra los fitopatógenos
Fusarium graminearum, Botrytis
cinérea, Phytophthora capsici,
phytophthora oryzae
Antiplasmódico
Contra Plasmodium falciparum K1.
Antiviral
Contra el virus del herpes simple
(HSV-1)
Inhibidor enzimático.
Actúa sobre la prolipolipeptidasa
Antioxidante
Inhibe la peroxidación del ácido
linoleico
Atractor de insectos
Atractor de la mosca Botanophila para
la propagación de esporas
Pulularina A. 63
Depsipéptido
Fumitremorgina B. 42 Alcaloide Indolil dicetopiperazinico
Bispirrocidina. 61 Alcaloidedimero
de la pirrocidina
Grafislactona A. 65 Benzocromeno
policétido
Chokol K.66 Sesquiterpeno (2,6-ciclofarnesano, esqueleto reportado sólo
en endófitos).
bjetivos
53
Neotyphodium lolli
(Clavicipitaceae).
Endófito de
Lolium perenne
(Poaceae).
Endothia gyrosa IFB-E023
(Cryphonectriaceae).
Endófito de
Vatica mangachapo
(Dipterocarpaceae).
Mycoleptodiscus sp.
(Magnaporthaceae).
Endófito de
Desmotes
incomparabilis
(Rutaceae)
Penicillium sp.
(Trichocomaceae).
Endófito de
Mauritia flexuosa
(Arecaceae)
Aspergillus niger IFB-
E003
(Trichocomaceae).
Endófito de
Cynodon dactylon
(Poaceae).
Neurotóxico
Inhibidor de los canales
de calcio activados por
potasio
Cototóxico
En líneas celulares de
leucemia K562
Citotóxico
En líneas celulares de
fibroblastos humanos
IMR-90
Antimicrobiano.
Contra Staphylococcus
aureus. micrococcus
luteus y E. Coli.
Citotóxico
En líneas celulares de los
carcinomas nasofaríngeo
epidermoide, cervical
Hela y colorectal SW1116
Micoleptodiscina B59
Alcaloide Indolterpénico.
Glandicolina B60
Alacaloide α-carbolínico
Aspernigerina 61
Alcaloide piperazinico
Hongo endófito/platna hospedera
Metabolito secundario / Núcleo base
Actividad biológica
Lolitrem B57 Alcaloide Indolterpénico
Citocalasina Z1058
Alcaloide Policétido Isoindólico
bjetivos
54
Hongo endófito/platna hospedera
Metabolito secundario / Núcleo base
Actividad biológica
Hongo CR115 no
identificado.
Endófito de
Daphnopsis americana
(Thymelaeaceae).
E. gomezpompae
(Pleosporaceae).
Endófito de
C. acuminata
(Verbenaceae).
Chaetomium globosum
(Chaetomiaceae).
Endófito de
Ginkgo biloba
(Ginkgoaceae).
Dwayaangam colodena
(Orbiliaceae).
Endófito de
Picea rubens (Pinaceae).
Myrothecium roridum IFB-
E091 (incertae sedis).
Endófito de
raíces de Artemisia
annua (Asteraceae).
Antibacterial.
Contra S. aureus y
Enterococcus faecium
Antifúngico.
Contra P. capsici, P.
parasitica, F. oxysporum y
A. solani.
Antifúngico.
Activo contra Mucor
miehei.
Tóxico para Artemia
salina.
Insecticida.
Contra el lepidóptero
Choristoneura
fumiferana.
Citotóxico.
En líneas celulares de
carcinoma gástrico SGC-
7901 y hepatocarcinoma
SMMC-7721.
Guanacastepeno.67 Diterpeno
(guanacastano, esqueleto
reportado sólo en endófitos).
Preusomerina EG1 . 25 Bisnaftoespirocetal.
Quetomugilina D.68
Isocromano policétido.
Cordianhídrido B.69 Anhídrido derivado de
ácidos grasos.
Roritoxina E.60 Macrólido tipo tricoteceno.
bjetivos
55
(Sánchez-Fernández, 2013).
Hongo endófito/platna hospedera
Metabolito secundario / Núcleo base
Actividad biológica
Pestalotiopsis fici
(Amphisphaeriaceae).
Endófito de
un árbol no identificado
colectado en Hangzhou,
República Popular China.
Pestalotiopsis fici
(Amphisphaeriaceae).
Endófito de
un árbol no identificado
colectado en Hangzhou,
República Popular China
Morinia logiappendiculata
(Amphisphaeriaceae). Endófito de
Santolina rosmarinifolia (Asteraceae), Helichrysum
stoechas (Asteraceae), Thymus mastichina
(Lamiaceae) y Calluna vulgarisin (Ericaceae).
Phoma sp.
(Incertae sedis).
Endófito de
Costus sp. (Costaceae).
Chaetomium sp.
(Chaetomiaceae).
Endófito de
Salvia officinalis
(Lamiaceae).
Antiviral.
Inhibe la replicación del
virus de inmunodeficiencia
humana
(HIV-1).
Antifúngico.
Contra Candida albicans,
Geotrichum candidum y
Aspergillus fumigatus.
Antifúngico.
Contra Cryptococcus
neoformans, C. albicans,
C. glabrata, C.
parapsilosis, C. krusei y
C. lusitaniae.
Antifúngico.
Contra Phytophthora
infestans, Botrytis
cinerea, Pyricularia
oryzae y Ustilago
violacea.
Citotóxico.
Contra líneas celulares de
linfoma murino t L5178Y.
Cocliodinol.56 Alcaloide indólico.
Cloropupukeananina.70 Dímero
policétido prenilado.
Pestalofona C.42 Dímero policétido prenilado.
Moriniafungina.71 Diterpeno tipo sordiarina
Formaxantona A.72 Dímero
de xantona policétida.
bjetivos
56
Los metabolitos secundarios obtenidos de hongos endófitos, se han
caracterizado porsus propiedades (figura 19 ), y actividad química específica,
solo reportada para este tipo de microorganismos, algunos artículos mencionan
los más importantes tipos de metabolitos derivados de hongos endófitos con
nombres muy particulares como los de estructura de 8 anillos heterocíclicos
fusionados, llamados indoloditerpenicos, otros como los alcaloides del ergot que
pueden mostrar dos tipos como lo son ergopeptina y ergoclavina, y los de 7
anillos, llamados indoditerpenicos paspalitrem, muchos ellos mostrando su
capacidad bioactiva como metabolitos secundarios. Los alcaloides lolinay,
spiroquinazolínicos, los alcaloides isoindólicos como los quetoglobosinas y las
citocalasinas. Y por otro lado también se han demostrado el aislamiento de
compuestos activos como los ciclopéptidos, anhidropéptidos, lipociclopéptidos y
pirazodiónicos. (Sánchez-Fernandez et al., 2013; Widden, 1997; Schulz &
Boyle, 2005; Kusari Hertweck, & Spiteller, 2012).
Gran cantidad de compuestos destacados y metabolitos secundarios
demuestran su relevancia en la investigación, y su potencial uso de estas
moléculas, no solo en el campo de la medicina, sino también en la agricultura y
otras áreas de conocimiento. Muchos compuestos aislados muestran que son
de origen aromático como antracenos, bencenos, benzofuranos, naftalenos,
piranos, furanos, cromanos, dépsidos, xantanos y oxepanos; y otros de origen
policétido, los chokoles A-K que son compuestos de metabolitos secundarios
con estructuras monoterpenicas, y otros compuestos derivados específicamente
de hongos endófitos son los guanacastepenos, eudesmanos, diterpenos
tricotecenos, fusiococanos y calamenos. (Sánchez-Fernandez et al., 2013;
Widden, 1997; Schulz & Boyle, 2005; Kusari, Hertweck & Spiteller, 2012).
Gran variedad de metabolitos y moléculas adyacentes de ellos muestran su
gran bioactividad, es así que son utilizados como base de muchos fármacos y
productos agroquíMICos, como los fungicidas,herbicidas e insecticidas, y
además se ha demostrado su alta capacidad como agentes antimicrobianos.
(Guo et al., 2000; Widden, 1997).
Varios compuestos obtenidos de estos metabolitos se han destacado en la
formulación de insecticidas y herbicidas abarcando un importante conocimiento
en el área química de estos compuestos, es así que muchos insectos,
himenópteros, coleópteros, áfidos y lepidópteros, muestran afectación al ser
intervenidos con estos tipos de compuestos alcaloides obtenidos de metabolitos
endofíticos.
bjetivos
57
De gran importancia y relevancia en la medicina se han mostrado aquellos
metabolitos de hongos endófitos capaces de realizar efectos antimicrobianos y
especialmente bactericida, utilizados en bacterias tanto Gram-positivas como
Gram-negativas de interés clínico, y que de alguna manera dan a conocer la
importancia en la farmacología de estas moléculas y su bioactividad, en donde
algunos investigadores muestran y reconocen a los hongos endófitos como
fuente de la medicina natural capaz de contrarrestar los efectos infecciosos de
muchas bacterias, estudios como los de los señores Zhao y colaboradores
(2012).(Schulz et al.,2002), que se dieron en la tarea de investigar y reportar
compuestos derivados de Gliomastix murorum Ppf8 un endófito aislado de Paris
polyphylla var yunnanensis (Trilliaceae) mostrando un esterol el ergosta-5, 7,22-
trien-3 -ol y un benzofurano el 2,3 -dihidro-5-hidroxi-a, a-dimetil-2-
benzofuranometanol. Ambos compuestos presentaron valores de CI50 entre
55.65 a 145.36 mg/mL capaz de contrarrestar el efecto de las
bacterias Escherichia coli, Staphylococcus haemolyticus, Pseudomonas
lachrymans, y Bacillus subtilis (Schulz et al., 2002). Por otra parte, en una
investigación ejecutada por Rukachaisirikul en 2008 (Strobel, 2002), se
mencionó una amida novedosa, la fomoenamida, que presenta actividad
antifúngica contra Mycobacterium tuberculosis cepa H37Ra. Este compuesto se
obtuvo del endófito Phomopsis longicolla aislado a partir del árbol Garcinia
dulcis (Clusiaceae), Como se puede observar a través de diversos estudios, la
diversidad de hongos endófitos y sus metabolitos secundarios, han mostrado su
utilidad en medicina, agricultura y otros campos de estudio.
Figura 19. Propiedades de los metabolitos secundarios, como defensa,
atracción y protección.
.
bjetivos
58
Por otro lado otros datos de las plantas reportadas con captación de
metabolitos secundarios de hongos endófitos son: la guayaba (Psidium guajava,
Rosaceae), las hojas de Callicarpa acuminata (Verbenaceae), el árbol Garcinia
dulcis (Clusiaceae), la planta medicinal Bauhinia guianensis (Fabaceae), entre
otras.
bjetivos
Objetivos
59
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antimicrobiana de hongos endófitos de Mammea
americana y Moringa Oleifera en Staphylococcus aureus y Escherichia
coli.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Aislar hongos endófitos de tejidos vegetales de las plantas Mammea
americana y Moringa Oleífera.
Evaluarla actividad antimicrobiana de extractos crudos de endófitos de
M. americana y M. oleífera en Staphylococcus aureus y Escherichia coli
bjetivos
Materiales y Métodos
60
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Diseño de estudio Figura 20. Esquema metodológico.
3.1.1Tipo de estudio Es un estudio experimental in-vitro de carácter factorial. La metodología que se
llevó a cabo, se orientó en la búsqueda, aislamiento y caracterización de
hongos endófitos presentes en las diferentes estructuras vegetales, como hojas,
tallos y semillas de plantas medicinales Mammea americana y Moringa oleífera
(60 muestras vegetales), para determinar su actividad antimicrobiana en dos
cepas de interés clínico (sensible – resistente) como lo son Staphylococcus
aureus (ATCC® 29213™) y Escherichia coli (ATCC® 25922™).
Figura 21: Plantas medicinales y microorganismos materia de estudio.
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bjetivos
Materiales y Métodos
61
3.2 Recolección de muestras
La colección de tejidos vegetales (hojas, semillas, tallos). (Figura 22) tanto de
plantas sanas de Mammea americana y de Moringa oleífera fueron tomadas
totalmente al azar para cada especie de planta de 15 árboles sanos. Las
muestras de M. americana fueron tomadas en una plantación en producción, de
árboles en el municipio de Turbaco departamento de Bolívar: (10°19´30´´00N
1°1729´´W), de la Costa Atlántica Colombiana. Los tejidos vegetales de Moringa
oleífera fueron recolectados de plantaciones en el municipio de Floridablanca-
Santander (07°06”44”S 73°1041W) de la finca Manzanares (Figura 23) (Para la
colecta de material vegetal se presentaron los permisos de rigor ante el comité
de ética).
Figura 22 (a – b). Recolección y desinfección de muestras, de plantas
medicinales Mammea americana y Moringa Oleífera-
a.
b.
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bjetivos
Materiales y Métodos
62
Figura 23. Lugares geográficos de recolección de muestras. Municipio de
Turbaco departamento de Bolívar: (10°19´30´´00N 1°1729´´W), de la Costa
Atlántica Colombiana, de donde fueron tomadas las muestras de la planta
medicinal, Mammea americana y municipio de Floridablanca- Santander
(07°06_44_S 73°1041W) de la finca Manzanares, de donde fueron tomadas
las muestras de la planta medicinal, Moringa oleífera. (Colombia).
Tomadodegooglemaps,(https://www.google.com/maps/place/Turbaco,+Bol%C3%ADvar/@
6.0039408,82.358217,5z/data=!4m8!1m2!2m1!1zZWwgbXVuaWNpcGlvIGRlIFR1cmJhY28gZ
bjetivos
Materiales y Métodos
63
GVwYXJ0YW1lbnRvIGRlIEJvbMOtdmFyOiAoMTDCsDE5wrQzMMK0wrQwME4gMcKwMTc
yOcK0wrRX!3m4!1s0x8ef620e02fa9013f:0x1f09c5899b5832bc!8m2!3d10.334638!4d75.4126
72).
3.3 Lavado y desinfección del material vegetal
El material vegetal fue superficialmente esterilizado por el método descrito por
Unterseher y Schnittler (2009), con algunas modificaciones en los porcentajes y
tiempos de acción del alcohol y el hipoclorito, en tres tiempos (T1). (T2). (T3),
como se muestra en la siguiente (Tabla 6).
Tabla 6. Tratamientos de desinfección de hojas de plantas medicinales M.
americana y M. oleífera (la misma técnica de desinfección se utilizó para las
demás estructuras vegetales).
3.4 Segmentación y siembra de material vegetal
Las muestras consistieron en diferentes tejidos, de las dos plantas, estas fueron
cortadas por separado en segmentos de 1 cm y transferidas asépticamente, en
4 fragmentos por caja de Petri, Uno alejado del otro ocupando la mayor
distancia posible entre ellos, y este mismo proceso por triplicado de cada
bjetivos
Materiales y Métodos
64
tratamiento en agar APD suplementado con Cloranfenicol de 100 ppm con el fin
de evitar el crecimiento bacteriano, posteriormente fueron incubados a 30◦C por
25 días, diariamente se llevó un registro del crecimiento de los endófitos y todas
las colonias se aislaron y se purificaran en APD (figura 24).
Figura 24. Método de obtención de hongos endófitos de M. americana y M.
oleífera.
bjetivos
Materiales y Métodos
65
Figura 25. Siembra de estructuras de plantas medicinales Mammea
americana y Moringa oleífera, en medio APD.
3.5 Aislamiento de hongos endófitos
Los diferentes tejidos vegetales (hojas, tallos, semillas), de las dos plantas una
vez desinfectadas de acuerdo al protocolo descrito, se llevaron a agares
micológicos (APD, Malta), temperatura de 25°C, y se dejaron crecer durante 8
días con observaciones periódicas, observado el crecimiento de hongos
endófitos en cada una de las muestras vegetales dispuestas en los medios
micológicos. Para el aislamiento de colonias puras, se procedió a repicar en
nuevos medios micológicos, a partir de colonias fúngicas visiblemente
diferentes, y se procedió a sembrar en medio APD por triplicado y
posteriormente fueron incubados a 25◦C por 8 días, con observaciones
periódicas.
3.5.1 Codificación de endófitos aislados
Codificación por letra y dígito: Primera letra: H: Hongo
Segunda letra: E: Endófito.
Tercera letra: H: Hoja, T: Tallo, S: Semilla.
Cuarta y Quinta letra: MO: Moringa oleífera, MA: Mammea americana.
Dígito: Número de aislado (1 – 14).
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bjetivos
Materiales y Métodos
66
3.6 Selección de la actividad antimicrobiana
Se utilizaron, 4 cepas de bacterias se utilizaron para la evaluación preliminar de
la actividad antimicrobiana de los endófitos aislados de M. americana y M.
oleífera: Staphylococcus aureus, (resistente a fármacos de elección y cepa
sensible), E. coli (resistente a fármacos de elección y cepa sensible), las
bacterias fueron suministradas por el laboratorio de Bacteriología de la
Universidad de Santander (UDES).
3.7 Prueba de preselección de endófitos
Los hongos endófitos fueron sometidos a un ensayo dual in vitro que permitió
una selección rápida y cualitativa de los microorganismos bioactivos. Los
hongos endófitos son cultivados en la superficie de APD a 30 ° C, durante 7
días. Luego, fueron extraídos porciones del hongo con ayuda de la punta de
pipetas estériles de un tamaño de 6 mm de diámetro, y transferidos a la
superficie de placas de Petri previamente sembradas con cada una de las
bacterias (Müller-Hinton agar por el método de Kirby Bauer) y los hongos
(Sabouraud dextrosa agar APD). Las cajas de Petri se dejaron a 37ºC durante
12 -18 horas para el crecimiento bacteriano y se evalúo la bioactividad de los
hongos. Seleccionando aquellas cepas fúngicas que presentaron mayor
actividad. Todos los ensayos fueron evaluados por triplicado, para comparar el
valor de las medias de los halos de cada uno de los endófitos aislados,
midiendo los halos de inhibición y seleccionando los hongos endófitos con
mayor bioactividad.
3.8 Obtención de biomasa de hongos endófitos
Para la obtención de biomasa de los hongos endófitos con mayor bioactividad,
se sembraron, un promedio de 20 cajas de Petri por cada hongo para obtener
biomasa suficiente para la realización de los extractos fúngicos, (14 cepas de
hongos endófitos fueron preseleccionados y aislados en cultivos puros para el
ensayo), la biomasa se obtuvo después de dejar crecer los hongos endófitos
con las especificaciones anteriores.
bjetivos
Materiales y Métodos
67
3.9 Preparación de los extractos fúngicos
Los extractos fúngicos se realizaron teniendo en cuenta P/V (1:1), biomasa:
etanol puro, para la preparación de soluciones stock o madre, para la obtención
de extracto crudo puro. Posteriormente se preparó una solución 3:1 (tres partes
de etanol por una parte de biomasa), se adicionaron en frascos ámbar y se
refrigeraron por 15 días, hasta su posterior separación y filtración.
3.10 Cepas bacterianas
Los microorganismos a ensayar fueron Escherichia coli ATCC 25922 y
Staphylococcus aureus ATCC 29213 (Resistente – Sensible).
3.11 Ensayo Antimicrobianos in vitro con extractos etanólicos crudos de
endófitos
Se llevaron los extractos etanólicos a las placas de Petri previamente
sembradas con cada una de las bacterias (Müller-Hinton agar por el método de
Kirby Bauer), se realizaron pozos donde se colocaron soluciones de 35 – 70 y
105 µl, tres pozos para cada hongo y para cepa bacteriana, Las cajas de Petri
se dejaron a 37ºC durante 18 - 24 horas para el crecimiento bacteriano y se
evalúo la bioactividad de los extractos de hongos endófitos. Seleccionando
aquellas cepas fúngicas que presentaron mayor actividad. Todos los ensayos
fueron evaluados por triplicado, para comparar el valor de las medias de los
halos de cada uno de los endófitos aislados.
3.11.1Pruebas estadísticas con extracto etanólicos
Los diferentes valores fueron introducidos en una base de datos Excel, para
analizar el ensayo dual de extractos etanólicos por triplicado con las cepas
bacterianas en estudio, teniendo en cuenta el grupo control (Gentamicina), se
realizó la prueba estadística no paramétrica de Mann Whitney para comparar
los halos de inhibición, en mm dados por las diferentes concentraciones, entre
el grupo intervenido y el grupo control tanto para las cepas sensibles como las
resistentes, y también se realizó la comparación entre las cepas sensibles y
resistentes. Se consideró una diferencia estadísticamente significativa cuando
la p fue <0,05.
bjetivos
Materiales y Métodos
68
3.12 Selección de hongos endófitos con actividad antimicrobiana de
extractos etanólicos
Pasadas las 18 - 24 horas en espera del crecimiento bacteriano, se observan
cada una de las cajas para medir los halos de inhibición y seleccionar los
hongos endófitos con mayor bioactividad.
3.13 Identificación de hongos Endófitos
La identificación de los hongos endófitos, que resultaron con bioactividad fue
realizada en el Laboratorio de investigación en Biotecnología-Liibaam, sección
Micología de acuerdo a las claves taxonómicas para identificación de
Deuteromycetes y Ascomycetes, así como la descripción morfológica y
estructuras de reproducción asexual.
3.14 Determinación de la concentración inhibitoria mínima y bactericida
Muestras: Extractos de hongos endófitos y cepas de Escherichia coli ATCC
25922 y Staphylococcus aureus ATCC 29213
Se determinó cuantitativamente la actividad in vitro de tres extractos fúngicos
obtenidos de endófitos aislados de Mammea americana y Moringa oleífera que
fueron preseleccionados ´por las pruebas de halos descritas anteriormente,
frente a las cepas control Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus
aureus ATCC 29213, sugeridas por CLSI (del inglés Clinical and Laboratory
Standards Institute).
Pruebas de concentración inhibitoria mínima: El método utilizado para evaluar la
sensibilidad de los microorganismos frente a los extractos ensayados fue la
Concentración Inhibitoria Mínima (CMI), la cual es definida como “la mínima
concentración de un Antimicrobianos que previene el desarrollo visible de un
Microorganísmo en una prueba de sensibilidad por dilución en caldo o agar”.
Para el ensayo, se utilizó una placa de polietileno de fondo redondo a la cual se
le agregó 200 μl en el pozo 1 de la fila A y B, y se le adicionó 100 μl al pozo 2
de la fila A y B del caldo M.Hinton, realizando las diluciones seriadas hasta el
pozo No. 11de cada uno de los extractos fúngicos seleccionados: No.6, No.8,
No.10 en concentraciones de 4000, 2000, 1000, 500, 250 μg/mL
respectivamente y posteriormente se le adicionó 100 μlde una suspensión
bjetivos
Materiales y Métodos
69
estandarizada del microrganismo a evaluar, correspondiente al tubo No.2 de la
escala de Mac Farland (Figura 26).
Figura 26. Estandarización del protocolo-Concentración Inhibitoria mínima
en placa (Autor: –Manual de protocolos Lab. Liibaam-UDES).
1. Pozo del 2 al 12 fila A y B llevan 100 L de Muller Hilton.
2. Pozo 1 fila A y B lleva 200 L de extracto a ensayar y de ahí se parte
para realizar las diluciones seriadas 1:2 hasta el pozo 11 descartándolos 100 L
sobrantes.
3. Pozo 12 fila A y B son el control del medio Muller Hilton más el inoculo
bacteriano; a diferencia del pozo 12 de la fila C el cual corresponde al control
del medio Muller Hilton.
4. La fila C pozo 1 corresponde a la fila control del extracto a ensayar más
el medio, según la dilución efectuada. El primer pozo de la fila contiene 200 L
de extracto a ensayar. El pozo 2 contiene 100 L del anterior y 100 L de Muller
Hilton. A partir de esta se hacen diluciones seriadas 1:2 hasta el pozo 11
descartando en este pozo 100 L.
Como control de antibiótico se utilizó Gentamicina a una concentración de
4μg/mL., preparada a partir de una concentración de 50g/mL, la cual se obtuvo
100 µL caldo muller Hilton
200 µL de extracto a ensayar
100 µL l de Inoculo bacteriano
200 µL de Gentamicina
bjetivos
Materiales y Métodos
70
realizando una dilución 1:100 en solución salina. (1 L de Gentamicina + 99L
de solución salina estéril). De la dilución realizada se tomó 16 L + 1984 L de
solución salina. Seguidamente se adicionaron 200 L de la concentración de
trabajo en el pozo 1 de la fila A y B, y se le adicionó 100 μl del caldo M. Hinton
al pozo 2 de la fila A y B de inoculo quedando en una concentración de 2 g/L
(1:2).
El experimento se realizó en tres momentos diferentes, por duplicado en cada
tratamiento. La placa se incubó a 37± 2 durante 24 horas.
Para la determinación de la capacidad bactericida por parte de los hongos, se
sirvieron cajas de petri con agar Muller Hilton; donde se tuvo en cuenta las
concentraciones obtenidas en el ensayo de CMI realizando una siembra por el
método de estría. En base a una temperatura de 37 ° y al cabo de las 18 a 24
horas se observó la concentración de colonias.
3.15 Prueba de citotoxicidad
3.15.1Lineas Celulares
Células epiteliales procedentes de Riñón de Mono Verde Africano (VERO,
ATCC CCL-81), fueron cultivadas en medio DMEM (Tabla 6). (Life Technology,
CA, USA) suplementado con Suero Fetal Bovino Inactivo al 10% (SFBi). (Life
Technology, CA, USA), 1000 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina
e incubadas a 37°C, 90% de humedad y 5% de CO2
3.15.2 Prueba de citotoxicidad en células (VERO, ATCC CCL-81).
Para la prueba de citotoxicidad se utilizaron 4 extractos de hongos endófitos
HEHMA6, HESMO8, HETMO9 Y HESMA10, los cuales presentaron una mayor
actividad antimicrobiana en las pruebas in vitro. Los extractos fueron disueltos
en 100µl de DMSO. Se utilizaron células Vero, que corresponden a un linaje
celular utilizado en cultivos celulares (Sheets, 2000), Es un aislado de las
células epiteliales del riñón de un mono verde africano (Chlorocebus sp.;
anteriormente llamado Cercopithecus aethiops). (3x105 cel/mL) fueron
incubadas en placas fondo plano de 96 pozos a 37°C, 5% CO2 y 95% de
humedad por 24 horas hasta la formación de la monocapa. Seguidamente, las
células fueron expuestas durante 70 horas a los diferentes compuestos,
evaluando 4 concentraciones por triplicado (1000, 500, 250 y 125 µg/mL).
bjetivos
Materiales y Métodos
71
La viabilidad celular se determinó empleando el reactivo de proliferación celular
WST-1 (Roche, Mannheim, Germany). Para ello, las células tratadas fueron
expuestas durante 2 horas más con la sonda WST-1 y posteriormente la
densidad óptica fue determinada por espectrofotometría a una longitud de onda
de 450 nm. El porcentaje de citotoxicidad fue calculado mediante la siguiente
ecuación: ((DO grupo control – DO grupo tratado). / DO grupo control). x 100.
bjetivos
Resultados
72
4. RESULTADOS
4.1 Recolección y desinfección del material vegetal Se evidenció un crecimiento restringido de colonias fúngicas de las muestras previamente desinfectadas (Figura 27), demostrando la eficacia del tratamiento, mientras que en el control sin desinfectar creció un mosaico de colonias fúngicas, demostrando el crecimiento de hongos epífitos y ambientales en el control. . Figura 27. Proceso de desinfección de muestras vegetales de Mammea americana y Moringa oleífera. 4.2 Siembra efectiva de fragmentos vegetales de las plantas medicinales Mammea americana y Moringa oleífera Al realizar la siembra de los diferentes tejidos de las plantas medicinales en estudio, y ser repartidas en la superficie del agar APD, suplementado con cloranfenicol a 100ppm, se pudo evidenciar el crecimiento de hongos endófitos en cada uno de los fragmentos y en algunos casos en la misma caja de Petri se pudo observar la variedad de ellos (Figura 28) y la expresión que daba al mantenerlo por varios días con una temperatura constante de 25°C. Figura 28. Crecimiento de hongos endófitos, en muestras vegetales de Mammea americana y Moringa oleífera.
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bjetivos
Resultados
73
4.3 Aislamiento de hongos endófitos
Después de ser examinadas cada una de las cajas de Petri, y observar el crecimiento de los diferentes hongos endófitos de las estructuras vegetales, se aislaron por separado cada uno de ellos, determinando el crecimiento continuo de los endófitos en cada una de las nuevas cajas, preservándolos y dándoles una codificación para tener en cuenta durante el estudio (Figura 29). (Tabla 7). Figura 29. Aislamiento de hongos endófitos de muestras vegetales de Mammea americana y Moringa oleífera.
Tabla 7. Codificación de hongos endófitos de cada una de las plantas en estudio y estructura de aislamiento.
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bjetivos
Resultados
74
Codificación Tipo de Planta Estructura
HESMA1 Mammea americana Semilla
HEHMO2 Moringa oleífera Hojas
HEHMO3 Moringa oleífera Hojas
HEHMA4 Mammea americana Hojas
HESMA5 Mammea americana Semilla
HEHMA6 Mammea americana Hojas
HETMO7 Moringa oleífera Tallo
HESMO8 Moringa oleífera Semilla
HETMO9 Moringa oleífera Tallo
HESMA10 Mammea americana Semilla
HEHMO11 Moringa oleífera Hojas
HEHMO12 Moringa oleífera Hojas
HESMA13 Mammea americana Semilla
HEHMA14 Mammea americana Hojas
4.4 Prueba de preselección de endófitos De las 60 muestras vegetales, se aislaron 14 hongos endófitos, además se
determinó la frecuencia de los aislados según el tipo de tejido vegetal (Figura
30) y los géneros (Figura 31). Se observa que en toda la muestra, en la planta
Mammea americana, se aislaron en mayor proporción hongos de semillas y
hojas en cambio en la planta Moringa oleífera se aislaron principalmente
hongos endófitos de hojas tallos y en menor proporción en semillas, en donde
se observaron la mayor parte de hongos como, el género Aspergillus y
Helmintosporum.
bjetivos
Resultados
75
Figura 30. Frecuencia de hongos endófitos aislados, según el tipo de tejido vegetal.
Figura 31. Porcentaje de hongos endófitos aislados de Mammea americana y Moringa oleífera
Los hongos endófitos aislados permitieron dar a conocer que el 100% (14-hongos) de los hongos ensayados mostraron actividad antimicrobiana. (Figura 32) (Tabla 8).
bjetivos
Resultados
76
Figura 32. Prueba dual. Halos de inhibición de hongos endófitos de plantas medicinales Mammea americana y Moringa oleífera
Tabla 8. Ensayo dual in vitro, de 14 hongos bioactivos. HI: Halos de inhibición promedio de cada cepa bacteriana.
Al analizar el ensayo dual, por triplicado, teniendo en cuenta el grupo control (Gentamicina), observando la media y el nivel de significancia con IC95%, presentando inhibición con el 100% de los hongos ensayados, (Tabla 8.). El
Codificación
HIE. coli
Sensible
(mm).
HIE. coli
Resistente
(mm).
HI S. aureus
Sensible
(mm).
HI S. aureus
Resistente
(mm).
HESMA1 25 13.6 25 24.3
HEHMO2 28.3 13.3 28.3 25.3
HEHMO3 24.3 17.6 25 23.6
HEHMA4 23.3 16.3 23.6 23.6
HESMA5 30.6 22.3 24.6 25
HEHMA6 30.3 19 23.3 23.3
HETMO7 25 11.6 29 28.6
HESMO8 27.6 18.6 28.6 28
HETMO9 27 17.3 26.3 26.6
HESMA10 20.6 16.3 27.6 27.6
HEHMO11 25.6 22.6 32.6 32
HEHMO12 31.3 19.6 29 25.6
HESMA13 30 21.6 25.6 25.6
HEHMA14 14 12.6 26 26
WM – MINEI - 86161001
bjetivos
Resultados
77
promedio de inhibición para esta prueba por halos fue de 24 mm y además se demostró la comparación de sensibilidad para las dos cepas bacterianas en estudio (Tabla 9). (Tabla 10). Tabla 9. Comparación de sensibilidad para Staphylococcus aureus (ATCC® 29213™) resistente, en ensayo dual.
Cód. hongo Promedio (mm). grupo
tratado Promedio (mm). grupo
Control p valor
HESMA1 24.33 0 <0.0001
HEHMO2 25.33 0 <0.0001
HEHMO3 23.66 0 <0.0001
HEHMA4 23.66 0 <0.0001
HESMA5 25 0 <0.0001
HEHMA6 28.33 0 <0.0001
HETMO7 28.66 0 <0.0001
HESMO8 28 0 <0.0001
HETMO9 26.66 0 <0.0001
HESMA10 27.66 0 <0.0001
HEHMO11 32 0 <0.0001
HEHMO12 25.66 0 <0.0001
HESMA13 25.66 0 <0.0001
HEHMA14 26 0 <0.0001
Tabla 10. Comparación de sensibilidad para Escherichia coli (ATCC® 25922™) resistente, en ensayo dual.
Cód. hongo Promedio (mm). grupo
tratado Promedio (mm). grupo
Control p valor
HESMA1 25 0 <0.0001
HEHMO2 28.33 0 0.0001
HEHMO3 24.33 0 <0.0001
HEHMA4 23.33 0 0.0002
HESMA5 30.66 0 <0.0001
HEHMA6 30.33 0 <0.0001
HETMO7 25 0 <0.0001
HESMO8 27.66 0 0.0006
HETMO9 27 0 <0.0001
HESMA10 20.6 0 <0.0001
HEHMO11 25.66 0 <0.0001
HEHMO12 31.33 0 <0.0001
HESMA13 30 0 <0.0001
HEHMA14 14 0 0.0002
bjetivos
Resultados
78
4.5 Identificación de hongos endófitos
Los 14 hongos filamentosos, aislados de los tejidos de M. americana y M.
oleífera, que presentaron actividad antimicrobiana contra E. coli y S. aureus, se
identificaron en la división Ascomycota y Deuteromycota, además se
clasificaron y se les dio la descripción morfológica (Tabla11). (Tabla12). Un alto
porcentaje de ellos (85 %), se clasificaron como miembros de Ascomycota, y de
estos un 75%presentaron pigmentos intrínsecos en sus hifas y esporas por lo
cual se denominan Dematiaceos y el 25% correspondieron a hongos de hifas
hialinas. Los Deuteromycota aislados fueron hongos clasificados como micelio
estéril, puesto que estos géneros de hongos pertenecen a hongos imperfectos
que no presentaron esporulación, estos representaron solo el 15% de los 14
hongos que presentaron actividad antimicrobiana contra las dos bacterias
ensayadas.
Tabla 11. Clasificación taxonómica de Hongos endófitos aislados de M,
americana y M. Oleífera
CODIFICACIÓN FÚNGICA (En este estudio).
ENDÓFITO AISLADO
TAXONOMIA
CLASE FÚNGICA (De
acuerdo a la presencia o ausencia de
pigmento en las hifas).
HESMA1 Bipolaris spp.
Reino: Fungi División: Ascomycota,
Clase: Dothideomycetes, Order: Pleosporales
Familia: Pleosporaceae Género: Bipolaris
Dematiaceo
HEHMO2 Mycelia sterilia
División: Ascomycota Clase:Dothideomycetes
Orden:Pleosporales Familia:Pleosporaceae
Dematiaceo
HEHMO3 Curvularia spp.
División: Ascomycota Clase:Dothideomycetes
Orden:Pleosporales Familia:Pleosporaceae
Dematiaceo
HEHMA4 Aspergillus ssp.
División: Ascomycota Clase: Eurotiomycetes
Orden: Eurotiales Familia: Trichocomaceae
Género:Aspergillus
Hialino
HESMA5 Mycelia sterilia Reino: Fungi
División: Deuteromycota Dematiaceo
bjetivos
Resultados
79
CODIFICACIÓN FÚNGICA (En este estudio).
ENDÓFITO AISLADO
TAXONOMIA
CLASE FÚNGICA (De
acuerdo a la presencia o ausencia de
pigmento en las hifas).
Clase: Agonomycetes Orden:Aganomycetales Género: Mycelia sterilia
HEHMA6 Penicillium ssp.
División: Ascomycota Clase: Eurotiomycetes
Orden: Eurotiales Familia: Trichocomaceae
Género:Penicillium
Hialino
HETMO7 Alternaria ssp.
División: Ascomycota Subdivisión:
Pezizomycotina Clase: Dothideomycetes
Orden: Pleosporales Familia: Pleosporaceae
Género: Alternaria
Dematiaceo
HESMO8 Cladosporium spp.
Reino: Fungi División: Ascomycota
Clase: Dothideomycetes Orden: Capnodiales
Familia: Davidiellaceae Género:Cladosporium
Dematiaceo
HETMO9 Aspergillus spp.
Reino: Fungi División: Ascomycota
Clase: Eurotiomycetes Orden: Eurotiales
Familia: Trichocomaceae Género:Aspergillus
Hialino
HESMA10 Cladosporium 002
Reino: Fungi División: Ascomycota
Clase: Dothideomycetes Orden: Capnodiales
Familia: Davidiellaceae Género:Cladosporium
Dematiaceo
HEHMO11 Nigrosporaspp.
Division: Ascomycota Subdivision:
Pezizomycotina Clase: Sordariomycetes Orden: Trichosphaeriales
Genero: Nigrospora
Dematiaceo
HEHMO12 Acremonium spp. Kingdom: Fungi Division: Ascomycota Ordern Hypocreales
Hialino
bjetivos
Resultados
80
CODIFICACIÓN FÚNGICA (En este estudio).
ENDÓFITO AISLADO
TAXONOMIA
CLASE FÚNGICA (De
acuerdo a la presencia o ausencia de
pigmento en las hifas).
Familia: Hypocreaceae Género : Acremonium
HESMA13 Nigrospora spp.
Reino: Fungi Division: Ascomycota
Subdivision:Pezizomycotina Clase: Sordariomycetes Orden: Trichosphaeriales
Género: Nigrospora
Dematiaceo
HEHMA14 Mycelia sterilia
Reino: Fungi División: Deuteromycota Clase: Agonomycetes Orden:Aganomycetales Género: Mycelia sterilia
Dematiaceo
Los hongos endófitos clasificados en las divisiones Ascomycota y
Deuteromycota fueron identificados hasta el nivel de género de acuerdo a sus
características Macroscópicas y Microscópicas como se muestra en las (Figura
33).
Figura 33. Estructuras Microscópicas de Hongos endófitos aislados de
Moringa oleífera y Mammea americana (a). Mycelia sterilia, (b). Cladosporium
spp, (c). Penicillium spp, (d). Bipolaris spp, (e). Nigrospora spp, (f). Aspergillus
spp, (g). Curvularia spp, (h). Alternaria spp, (i). Acremonium spp. (j).
Cladosporium (002). spp, (k). Mycelia sterilia.
bjetivos
Resultados
81
Tabla 12. Descripción Morfológica de los Hongos Endófitos aislados de
Moringa oleífera y Mammea americana
CODIFICACIÓN FÚNGICA
GÉNERO FÚNGICO
DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA
HESMA1 Bipolaris spp.
Colonias: de color gris a café negruzco,
reverso: negro, Conidióforos: raquis
ramificados, cortos, geniculados o en zig-
zag Conidios: elipsoidales, redondeados
en ambos extremos y lisos
HEHMO2 Mycelia sterilia
Morfología similar a muchos hongos que
se caracterizan porque no producen
ningún estado de conidios sexual /
asexual reconocible en el cultivo. A nivel
Microscópico se observan hifas con
pigmentos oscuros septadas, por
conveniencia se clasificaron en Mycelia
sterilia.
HEHMO3 Curvularia spp.
Colonias: de crecimiento rápido,
parecidas a las de la gamuza, de color
marrón a marrón negruzco con un
reverso negro. Conidióforos erectos, de
forma recta, septados, conidios en
sucesión simpodial. Conidios de forma
semilunar, redondeados en los extremos,
marrón pálido, De 3-tabiques.
HEHMA4 Aspergillus ssp.
Colonias: color verde claro con presencia
de cleistotecio marrón rojizo oscuro,
reverso: oliva a marrón púrpura,
conidióforos: cortos, parduscos y lisos,
conidios: globosos y de paredes rugosas
HESMA5 Mycelia sterilia
Morfología similar a muchos hongos que
se caracterizan porque no producen
ningún estado de conidios sexual /
asexual reconocible en el cultivo. A nivel
Microscópico se observan hifas con
pigmentos oscuros septadas, por
conveniencia se clasificaron en Mycelia
sterilia.
HEHMA6 Penicillium ssp.
Colonias: verdes con periferia blanca,
reverso: pardo a marrón, Conidióforos:
se presentaron hialinos, lisos o de
paredes rugosas, Conidios: Formando
largas cadenas, globosas en sucesión
basípeta de una célula conidiógena
especializada llamada fiálide
HETMO7 Alternaria ssp.
Colonias: De color negro a oliváceas-
negras, Envés: pardas oscuras,
Conidióforos: ramificados, cortos,
Conidios: conidios multicelulares,
oblicuos, café claro de paredes lisas
bjetivos
Resultados
82
CODIFICACIÓN FÚNGICA
GÉNERO FÚNGICO
DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA
HESMO8 Cladosporium spp.
Colonias: verde oliva a negro. El reverso es oliváceo-negro Conidios y conidióforos pigmentados, formándose en cadenas simples
yramificadas.
HETMO9 Aspergillus spp.
Colonias granulares, amarillo-marrones;
el reverso -marrón
Los conidióforos largos, vesícula globosa
.Fiálides, que surgen
circunferencialmente, biseriadas.
conidios redondos y pequeños, formando
largas cadenas
HESMA10 Cladosporium 002
Colonias: grises que se torna a negro. De
aspecto similar a la gamuza
El reverso es oliváceo-negro. Los conidios se producen en cadenas acropetales ramificadas, equinuladas, de una a cuatro células
HEHMO11 Nigrosporaspp.
Colonias: Se presentaron blancas al
principio, posteriormente al cabo del
tercer dia de colorpardas a negras,
reversas: negras, Conidióforos:
ramificados, incoloras a pardas,
Conidios: negros brillantes, solitarios,
simples y esféricos.
HEHMO12 Acremonium spp.
Colonias: De color blanco a gris. Las
hifas delgadas e hialinas conidios
unicelulares (ameroconidios), hialinos,
alargados y algunos cilíndricos, formando
agregados en cabezas viscosas en el
ápice de cadafilamento o conidióforo.
HESMA13 Nigrospora spp.
Colonias: Se presentaron blancas al
principio, posteriormente al cabo del
tercer día de colorpardas a negras,
reversas: negras, Conidióforos:
ramificados, incoloras a pardas,
Conidios: negros brillantes, solitarios,
simples y esféricos.
HEHMA14 Mycelia sterilia
Morfología similar a muchos hongos que
se caracterizan porque no producen
ningún estado de conidios sexual /
asexual reconocible en el cultivo. A nivel
Microscópico se observan hifas con
pigmentos oscuros septadas, por
conveniencia se clasificaron en Mycelia e
bjetivos
Resultados
83
4.6 Extractos fúngicos Los extractos fúngicos, de característica etanólica (EtOH) y pura, se obtuvieron de acuerdo al peso de las biomasas, adicionándole Etanol puro, en una proporción 3:1(Figura 34), para cada uno de las 14 muestras bioactivas según el ensayo dual. Figura 34. Muestras de extractos puros Etanólicos de hongos endófitos de Mammea americana y Moringa oleífera.
Después de obtener los extractos etanólicos de los 14 hongos endófitos de las
plantas en estudio, se ejecutó nuevamente el ensayo dual in vitro en pozos,
colocándose soluciones de 35 µl, 70 µl y 105 µl, es decir tres pozos para cada
hongo y para cada cepa bacteriana. Las cajas de Petri se dejaron a 37ºC
durante 18 - 24 horas para el crecimiento bacteriano y se evalúo la bioactividad
de los extractos de hongos endófitos con aquellas cepas fúngicas
seleccionadas porque presentaron mayor actividad por triplicado. En la cepa E.
coli sensible se observaron halos de inhibición en los hongos, HESMA1,
HEHMA4, HESMA5, HEHME6, HESMO8, HETMO9, HESMA10, HEHMO11,
HEHMO12, HESMA13 Y HEHMA14. Por otro lado, para la cepa E. coli
resistente, se encontró actividad en los hongos HESMA1, HEHMA4, HESMA5,
HEHME6, HESMO8, HETMO9, HESMA10, HEHMO11.
En cuanto a la cepa de S. aureus sensible, los hongos con bioactividad fueron
HEHMO3, HESMA5, HEHME6, HESMO8, HETMO9, HESMA10, HEHMO11,
HESMA13 y en la cepa S. aureus resistente se encontraron HEHMO3,
HESMA5, HEHME6, HESMO8, HETMO9, HESMA10, HEHMO11, HESMA13.
WM – MINEI - 86161001
bjetivos
Resultados
84
4.7 Pruebas estadísticas
Se observó inhibición en el 80% de los hongos ensayados, (Tabla 13). Además
se muestra la cepa E. coli sensible, observando que no hubo ningún tipo de
efecto con ninguna concentración de los hongos endófitos HEHMO2 Y
HETMO7, de igual forma para las concentraciones de 35 y 70 µl para el hongo
HESMA5, y para la concentración 35 µl en los hongos HESMA1 y HEHMA14.
En la cepa E. coli resistente se observan más variaciones, los endófitos que no
presentaron ninguna actividad fueron HEHMO2, HEHMO3, HETMO7 y
HEHMA14, tampoco en las concentraciones 35 y 70 µl los hongos HESMA1 y
HESMA5, y en la concentración de 35 µl los hongos HEHMA4 Y HESMA13
(Tabla 13).
Además al comparar el efecto de los hongos endófitos que tuvieron actividad
inhibitoria en las cepas sensibles de E. coli con el control se observó que la
mayoría presentaron diferencias estadísticamente significativas, presentando
halos más pequeños de inhibición, por ejemplo HESMA 1 (mediana 18mm;
p=0,0495), HEHMA4 (mediana 12mm; p=0.0339). El único que mostró mayor
halo de inhibición que el control fue HEHMA6 (mediana 24 mm; p=0.0339).
En cuanto a las cepas resistentes de E. coli se observó que la mayoría de los
hongos endófitos presentaron actividad estadísticamente mayor al control con
halos de inhibición que oscilaron entre 12 mm y 24 mm (p<0,005). (Tabla 13).
Además al comparar los halos de inhibición entre las cepas de E. coli sensibles
y resistentes utilizando la misma concentración, la mayoría de hongos endófitos
no presentaron diferencia significativa, exceptuando HEHMA4 a 35 µl que
produjo inhibición en la cepa sensible pero no en la resistente, y HETMO9,
HESMA10 y HEHMO11 que presentaron un mayor halo de inhibición en la
sensible que en la cepa resistente.
Tabla 13. Comparación por concentración, para la cepa E. coli sensible y resistente (prueba estadística Mann Whitney - Kruskal Wallis). * Control
sensible= 23 mm (tres repeticiones). **Control resistente= 0 mm (tres repeticiones).
HONGO CONCENTRACION SENSIBLE mm
Mediana (min-max).
RESISTENTE mm
Mediana (min-max).
P Valor Sensibles
vs resistente
P Valor sensible
Vs Control*
P Valor resistente
Vs control**
HESMA1 35 0 0 - 0.0495 -
HESMA1 70 16 (16 – 16). 16 (16 – 16). - 0.0495 0.0253
bjetivos
Resultados
85
HONGO CONCENTRACION SENSIBLE mm
Mediana (min-max).
RESISTENTE mm
Mediana (min-max).
P Valor Sensibles
vs resistente
P Valor sensible
Vs Control*
P Valor resistente
Vs control**
HESMA1 105 18 (17 – 18). 17 (17 – 17). 0.11 0.0495 0.0253
HEHMO2 35 0 0 - 1 -
HEHMO2 70 0 0 - 1 -
HEHMO2 105 0 0 - 1 -
HEHMO3 35 0 0 - 1 -
HEHMO3 70 0 0 - 1 -
HEHMO3 105 0 0 - 1 -
HEHMA4 35 12 (11 – 12). 0 0.0339 0.0339 -
HEHMA4 70 16(15 – 16). 17 (16 – 17). 0.099 0.0339 0.0339
HEHMA4 105 20(15 – 20). 18 (18 – 18). 0.48 0.0339 0.0253
HESMA5 35 0 0 - 0.0253 -
HESMA5 70 0 0 - 0.0253 -
HESMA5 105 19(19 – 19). 19 (18 – 19). 0.32 0.0253 0.0339
HEHMA6 35 17(17 – 18). 17 (17 – 17). 0.32 0.0339 0.0253
HEHMA6 70 23(22 – 23). 20 (20 – 22). 0.07 0.32 0.0339
HEHMA6 105 24(24 – 25). 24 (23 – 24). 0.20 0.0339 0.0339
HETMO7 35 0 0 1 -
HETMO7 70 0 0 1 -
HETMO7 105 0 0 1 -
HESMO8 35 12(12 – 12). 12 (11 – 12). 0.32 0.0253 0.0339
HESMO8 70 20(19 – 20). 21 (17 – 21). 0.32 0.0339 0.0339
HESMO8 105 22(22 – 22). 22 (20 – 22). 0.32 0.0253 0.0339
HETMO9 35 14(13 – 14). 14 (12 – 14). 0.80 0.0339 0.0339
HETMO9 70 21(21 – 21). 21 (20 – 21). 0.32 0.0253 0.0339
HETMO9 105 23(23 – 23). 22 (22 – 22). 0.0253 -- 0.0253
HESMA10 35 17(17 – 17). 12 (12 – 13). 0.0339 0.0253 0.0339
HESMA10 70 20(20 – 20). 20 (17 – 21). 1 0.0253 0.0369
HESMA10 105 20(20 – 20). 20 (19 – 20). 0.32 0.0253 0.0339
HEHMO11 35 20(20 – 20). 18 (18 – 18). 0.0253 0.0253 0.0253
HEHMO11 70 21(21 – 21). 20 (20 – 20). 0.0253 0.0253 0.0253
HEHMO11 105 22(22 – 22). 22 (22 – 22). 1 0.0253 0.0253
HEHMO12 35 12(12 – 12). 0 0.0253 0.0253 -
HEHMO12 70 18(18 – 18). 12 (11 – 12). 0.0253 0.0253 0.0495
HEHMO12 105 18(18 – 18). 15(14 – 15). 0.0253 0.0253 0.0495
HESMA13 35 0 0 0.0253 -
HESMA13 70 14(14 – 14). 14(13 – 14). 0.32 0.0253 0.0339
HESMA13 105 21(21 – 21). 20(20 – 21). 0.11 0.0253 0.0339
HEHMA14 35 0 0 0.0253 -
HEHMA14 70 12(12 – 15). 0 0.0253 0.0339 -
HEHMA14 105 16(15 – 16). 0 0.0253 0.0339 -
Por otro lado al realizar la comparación de los halos de inhibición entre los tres
tipos de concentraciones de cada hongo con prueba estadística Kruskal Wallis
se observó que para la cepa sensible:
> Los hongos 4 y 5, 10,12 tuvieron una tendencia de incremento de la inhibición
al aumentar la concentración (p = 0.0563 y p = 0.0672, respectivamente).
> Los hongo 1, 6, 8, 9, 11,13 presentaron un incremento de la inhibición al
aumentar la concentración (p = 0.0273) igual que el hongo 14 (p = 0.039).
bjetivos
Resultados
86
Al comparar los halos de inhibición entre los tres tipos de concentraciones de
cada hongo se observó que para la cepa resistente:
> El hongo 5 tuvo una tendencia de incremento de la inhibición al aumentar la
concentración (p = 0.0672), similar al hongo 8 (p = 0.0509), y al hongo 10 (p =
0.0665).
> Los hongos 1, 4, 6, 9, 11, 12,13 presentaron un incremento de la inhibición al
aumentar la concentración (p = 0.0273).
La tabla 14 muestra la cepa S. aureus, donde se observó de igual forma a la
cepa E. coli la mayoría de los hongos endófitos presentaron actividad
estadísticamente mayor al control con halos de inhibición que oscilaron entre 12
mm y 24 mm (p<0,005) (Tabla 14).
De igual forma al comparar los halos de inhibición entre las sepas de S.aureus
sensibles y resistentes utilizando la misma concentración, la mayoría de hongos
endófitos no presentaron diferencia significativa, exceptuando HEHMO3 a 35 y
70 µl, otras produjeron inhibición en la cepa sensible pero no en la resistente,
HEHMO3, HEHMA6, HESMO8, HETMO9, HESMA10 y HEHMO11 que
presentaron un mayor halo de inhibición en la sensible que en la cepa resistente
Tabla 14. Comparación por concentración, para la cepa S. aureus sensible y resistente (prueba estadística Mann Whitney - Kruskal Wallis). * Control
sensible= 22 mm (tres repeticiones). **Control resistente= 0 mm (tres repeticiones).
HONGO
CONCENTRACION SENSIBLE
mm Mediana
(min-max).
RESISTENTE mm
Mediana (min-max).
P Valor Sensibles
vs resistente
P Valor sensible
Vs Control*
P Valor resistente
Vs control**
HESMA1 35 0 0 - 0.0253 0.0253
HESMA1 70 0 0 - 0.0253 0.0253
HESMA1 105 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMO2 35 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMO2 70 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMO2 105 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMO3 35 13 (13 – 13). 0 0.0253 0.0253 0.0253
HEHMO3 70 22 (22 – 22). 0 0.0253 - 0.0253
HEHMO3 105 22 (22 – 22). 12 (12 – 12). 0.0253 0.0143 0.0253
HEHMA4 35 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMA4 70 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMA4 105 0 0 - 0.0253 0.0253
HESMA5 35 0 0 - 0.0253 0.0253
HESMA5 70 15 (15 – 16). 15 (15 – 15). 0.3173 0.0339 0.0253
HESMA5 105 17 (17 – 23). 20 (20 – 21). 0.6531 0.1213 0.0339
HEHMA6 35 12 (12 – 12). 11 (11 – 11). 0.0253 0.0253 0.0253
bjetivos
Resultados
87
HONGO
CONCENTRACION SENSIBLE mm
Mediana (min-max).
RESISTENTE mm
Mediana (min-max).
P Valor Sensibles
vs resistente
P Valor sensible
Vs Control*
P Valor resistente
Vs control**
HEHMA6 70 18 (18 – 19). 18 (18 – 18). 0.1138 0.0339 0.0253
HEHMA6 105 22 (22 – 22). 21 (21 – 21). 0. 0253 - 0.0253
HETMO7 35 0 0 - 0.0253 0.0253
HETMO7 70 0 0 - 0.0253 0.0253
HETMO7 105 0 0 - 0.0253 0.0253
HESMO8 35 15 (15 – 16). 12 (12 – 13). 0.0431 0.0339 0.0339
HESMO8 70 18 (18 – 19). 17 (17 – 18). 0.0431 0.0339 0.0339
HESMO8 105 20 (20 – 21). 21 (19 – 21). 0.3458 0.0339 0.0369
HETMO9 35 20 (20 – 20). 15 (16 – 15). 0.0339 0.0253 0.0339
HETMO9 70 23 (23 – 24). 24 (23 – 24). 0.0431 0.0339 0.1138
HETMO9 105 24 (24 – 24). 25 (18 – 25). 1 0.0253 0.4867
HESMA10 35 19 (19 – 19). 15 (15 – 16). 0.0339 0.0253 0.0339
HESMA10 70 20 (20 – 20). 21 (18 – 21). 1 0.0253 0.0369
HESMA10 105 20 (20 -20). 20(19 -20). 0.3173 0.0253 0.0339
HEHMO11 35 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMO11 70 16 (16 – 16). 15 (15 – 15). 0.0253 0.0253 0.0253
HEHMO11 105 18 (18 – 18). 15 (15 – 15). 0.0253 0.0253 0.0253
HEHMO12 35 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMO12 70 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMO12 105 0 0 - 0.0253 0.0253
HESMA13 35 0 0 - 0.0253 0.0253
HESMA13 70 0 0 - 0.0253 0.0253
HESMA13 105 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMA14 35 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMA14 70 0 0 - 0.0253 0.0253
HEHMA14 105 0 0 - 0.0253 0.0253
De igual forma para la cepa S. aureus se realizaron comparaciones de los halos
de inhibición entre los tres tipos de concentraciones de cada hongo con prueba
estadística Kruskal Wallis se observó que para la cepa sensible:
> El hongo 10 tuvo una tendencia de incremento de la inhibición al aumentar la
concentración (p = 0.0183).
> Los hongos 3, 5, 6, 8, 9 y 11 presentaron un incremento de la inhibición al
aumentar la concentración (p = 0.0183, p = 0.0234, p = 0.0204, p = 0.0249, p =
0.0289 y p = 0.0273 respectivamente).
Al comparar los halos de inhibición entre los tres tipos de concentraciones de
cada hongo se observó que para la cepa resistente:
> El hongo 3 tuvo una tendencia de incremento de la inhibición al aumentar la
concentración (p = 0.0672).
bjetivos
Resultados
88
> Los hongos 5, 6, 8 y 9 presentaron un incremento de la inhibición al aumentar
la concentración (p = 0.0673 y p = 0.0608 respectivamente).
4.8 Determinación de la concentración inhibitoria mínima y bactericida
La concentración mínima inhibitoria (CMI) es la concentración más baja de un
antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microrganismo después
de la incubación durante 24 horas.
En cada experimento se utilizó un control positivo con gentamicina. Los
experimentos se hicieron por duplicado en cada placa y en tres momentos
diferentes con tres hongos endófitos. Todas las repeticiones fueron
consistentes, arrojando el mismo valor de CMI.
La concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida, dieron
valores absolutos iguales, por esta razón se evidencia que los extractos
etanólicos de hongos endófitos muestran una capacidad bactericida muy
importante (Tabla 15 y Tabla 16).
Tabla 15. Concentración mínima inhibitoria
Cepa Extracto 6 Extracto 8 Extracto 10
Gentamicina
S. aureus 29213
2000 µg/ml 1000 µg/ml >4000 µg/ml
0.125 µg/ml
E. coli 25922 1000 µg/ml 2000 µg/ml 1000 µg/ml 0.250 µg/ml
El control con gentamicina fue óptimo según lo reportado por CLSI, la CMI del
extracto 6 frente al Staphylococcus aureus fue necesaria mayor concentración
del extracto, mientras que para Escherichia coli requiere la mitad de la
concentración; lo que indica que el extracto 6 tiene mejor bioactividad frente a
Eschericia coli. También se observó que el extracto 8 tiene mejor bioactividad
en Staphylococcus aureus.
En el caso del extracto HESMA10 no presentó bioactividad en las
concentraciones utilizadas con Staphylococcus aureus, lo cual mostró que se
requiere una concentración mayor a 4000 µg/mL. Mientras que frente a
Escherichia coli se observó que tiene una mayor bioactividad CMI de 1000
µg/mL.
bjetivos
Resultados
89
Los resultados de esta prueba coincidieron con la CMI. Para esta prueba se consideraba CBM cuando se tenían ≤ de 3 Unidades Formadoras de Colonia (UFC) por caja de MH sembrado a partir de las diluciones de cada concentración del extracto obtenida en la CMI. Tabla 16. Concentración mínima bactericida.
Cepa Extracto 6 Extracto 8 Extracto 10
Gentamicina
S. aureus 29213
2000 µg/ml 1000 µg/ml >4000 µg/ml
0.125 µg/ml
E. coli 25922 1000 µg/ml 2000 µg/ml 1000 µg/ml 0.250 µg/ml
4.9 Citotoxicidad 4.9.1 Análisis de datos para hallar citotoxicidad
Para realizar los análisis de datos se utilizó el Software estadístico MsxlfitTM (ID
Business Solution, Guildford, UK) para calcular mediante análisis de regresión
sigmoidal, la concentración citotóxica 50 (CC50) de cada uno de los extractos
etanólicos de hongos endófitos de M. americana y M. oleífera.
Los experimentos se realizaron por triplicado en tres momentos independientes,
con cuatro hongos seleccionados.
La citotoxicidad de los extractos evaluados en células mamíferas presentó
concentraciones superiores a 1000 µg/mL (Tabla 17), lo que indica que el
tratamiento con los extractos probados (HEHMA6, HESMO8, HETMO9 Y
HESMA10) no son perjudiciales en células de determinación citotóxica.
Tabla 17. Resultados de Citotoxicidad sobre células Vero, de los hongos HEHMA6, HESMO8, HETMO9 Y HESMA10.
bjetivos
Resultados
90
Extracto Vero
CC50 ± DE (µg/ml)
6 >1000
8 >1000
9 >1000
10 >1000
bjetivos
Discusión
91
5. DISCUSIÓN
La desinfección con hipoclorito al 3% es muy importante (Zanardi, 2010)
teniendo en cuenta que la eliminación de microorganismos epífitos existentes
en la superficie de las estructuras de las plantas puede perjudicarla
identificación de endófitos, por eso realizar este paso con precisión, asegura un
buen aprovechamiento de hongos endófitos y declara la buena relación con el
hospedero (Márquez et al., 2007).
Al realizar la siembra de las diferentes estructuras vegetales de las plantas
medicinales Mammea americana y Moringa oleífera, se observó el crecimiento
masivo de hongos endófitos, en cada uno de las fracciones, es así que es
bastante recomendable realizar el cultivo en pequeños fragmentos (Bernardi-
Wenzel et al.,2010 ), tal y como se realizó en el presente trabajo, con una
medición entre 0.8 a 10mm de diámetro, garantizando una buena cantidad de
biomasa endofítica, para poder ser analizada y realizar el aislamiento de cada
uno de ellos.
Los medios de cultivo suplementados con cloranfenicol, mostraron un excelente
y específico crecimiento de los diferente hongos endófitos que se vieron
expuestos en cada uno de los fragmentos vegetales, manteniendo a tope la
interferencia que podrían haber causado otros microorganismos en la
investigación. Aunque se pudo observar en los medios de cultivo utilizados
como control sin antibióticos, un mayor crecimiento de microorganismos
posiblemente epifitos y ambientales. Estos microorganismos de acuerdo a
(Zhang, Wei, & Wang, 2012; Sieber, 2007) tienen de alguno u otra forma
características mutualistas con la planta hospedadora.
Altos contenidos de biomasa fúngica y crecimiento de distintos tipos de
morfologías, en algunas de ellas de coloraciones y texturas, muy vistosas se
pudieron representar en el primer ensayo de obtención de hongos endófitos en
cada una de las cajas de Petri, mostrando que este tipo de aislamientos en
primera instancia es bastante común (Procopio et al., 2009). Aprovechando esta
biomasa es recomendable la realización de repiques en cajas limpias y
esterilizadas para asegurar que cada obtención de líneas endofíticas
permaneciera constante durante el estudio (Ragozine, 2008).
bjetivos
Discusión
92
Se lograron aislar 14 hongos endófitos de las diferentes estructuras vegetales,
el cual fue el objeto de estudio, obteniendo líneas puras de cada uno de ellos,
realizando repiques en medio APD suplementado, con un orificio en el medio,
colocando un trozo redondeado del hongo endófito, para posteriormente ser
incubados, este proceso mostro alta reproducibilidad de biomasa para realizar
los diferentes ensayos.
Los hongos endófitos aislados de cada una de las plantas, Mammea americana
y Moringa oleífera, obtuvieron un porcentaje según la estructura vegetal de
donde fueron tomados, en la primera planta, M. americana, se observa una
buena proporción de endófitos aislados de semillas con un 85 %, seguido de un
40 % en hojas; por otro lado para M. oleífera, se encontraron hongos endófitos
en las tres estructuras vegetales implementadas en el estudio, en las semillas
con un 8%, en los tallos un 13% y en las hojas un 28%.
La denominación o codificación como lo mencionan diferentes investigadores
(Orlandelli, et al., 2012), debe realizarse de manera oportuna y veraz, con
características del estudio para llevar un exhausto control de los resultados
obtenidos en cada una de las experimentaciones, en este caso la denominación
se le dio a cada hongo endófito, según de la estructura de aislamiento y la
planta medicinal hospedera.
Los hongos endófitos se identificaron como morfo especies teniendo en cuenta
sus aspecto macroscópico y estructuras de reproducción asexual, las cuales
fueron visualizadas a través de estudios de microscopia y con tinciones de
Fuschina y azul de lactofenosl, y con el apoyo de claves de identificación
internacional, otros trabajos como (Gamboa-Gaitán, 2006). (Ramírez et al.,
2006).también han mostrado la identificación hasta morfo especie, dado que la
extracción e identificación del ADN es riguroso y demanda costos, por lo cual no
fue objetivo de este trabajo.
.
La complejidad en la identificación de hongos endófitos, se debe a la diversidad
morfológica, observando las diferentes variaciones de estos microorganismos
fúngicos (Zhao, et al., 2010), por esto se hace necesario la utilización de
técnicas moleculares especializadas, para aislar muchas especies que no son
cultivables en medios comunes y para poder llegar conformar un mapa
genómico completo del mismo (Watanabe, 2010).
bjetivos
Discusión
93
La frecuencia porcentual de hongos endófitos aislados mostro en primera
instancia que los géneros más habituales eran Aspergillus con un 36% y
Helmintosporum con un 29%, mientras que otros géneros como Cladosporium
spp, Penicillum spp, micelio esteril, Bipolaris spp y Nigrospora se encontraron
con baja frecuencia, es importante mencionar que el género Nigrospora, era el
hongo endófito con más alta reproducibilidad y por ende su cantidad de
biomasa fue mayor en comparación con los demás hongos.
Los hongos endófitos fueron sometidos a un ensayo dual in vitro que permitió
una selección rápida y cualitativa de los microorganismos bioactivos, Los
aislados de hongos endófitos al ser sometidos a ensayo dual, evidenciaron la
importancia de esta metodología, para realizar un primer screening de selección
rápida y cualitativa de los microorganismos, determinando la capacidad
Antimicrobianos que tienen los 14 hongos endófitos estudiados en las cepas
bacterianas Staphylococcus aureus (ATCC® 29213™) y Escherichia coli
(ATCC® 25922™ ), el cual fueron utilizadas por ser bacterias de interés clínico
a nivel mundial por su alta capacidad de resistencia. Al terminar este primer
ensayo dual y realizar las diferentes mediciones de los halos de inhibición,
todos los hongos preseleccionados mostraron actividad bactericida en las cepas
bacterianas en estudio, presentando inhibiciones altas de 28 a 32 mm de
diámetro en algunos hongos como el HEHMA6, HESMO8, HEHMO9 Y EL
HESMA10.
Al realizar los extractos fúngicos etanólicos de cada uno de los hongos, dio
positividad en el ensayo dual, de halos de sensibilidad, en un 80% de los
hongos endófitos ensayados, mostrando similaridad con otros trabajos al tomar
extractos en base alcohólica, mostrando actividad antibacteriana significativa
(Martínez Aguilar et al., 2012 ), estos resultados sugieren que hongos endófitos,
presentan metabolitos secundarios que tienen la característica de ser solubles
en etanol, proporcionando actividad antimicrobiana ante bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas (Bhandari,et al., 2000).
Se pudo corroborar lo mencionado en otros estudios como los de Tortora y
colaboradores (2001), que la cepa S. aureus, suele presentar una fluctuación en
la inhibición a comparación de otras cepas, debido a que estas bacterias Gram-
positivas presentan una pared celular reforzada con muranilpéptidos, que
actúan como primera barrera Antimicrobianos y muestran en algunos pre
bjetivos
Discusión
94
ensayos mediciones de halos medianamente significativos (Tortora, Funke,
Case, 2001).
Los análisis estadísticos de los datos obtenidos por triplicado en el ensayo dual
mediante el ttest, permitieron demostrar que existe una inhibición significativa
de todos los hongos ensayados, observando la media y el nivel de significancia
con IC95%, obteniendo un promedio de estos halos de inhibición de las dos
cepas en 24 mm, prometiendo ser parte de compuestos bioactivos capaces de
evadir la acción resistente de estos microorganismos a comparación de
inhibiciones citadas en la literatura (Ausina Ruiz, et al., 2006).
El fármaco gentamicina, utilizado como principio activo de control, mostro una
inhibición significativa de todos los hongos ensayados, observando la media y el
nivel de significancia con IC95%, promediando estos halos de inhibición de las
dos cepas en 24 mm, prometiendo ser parte de compuestos bioactivos capaces
de evadir la acción resistente de estos microorganismos a comparación de
inhibiciones citadas en la literatura (Ausina Ruiz, et al., 2006).
Los ensayos preliminares en antagonismo dual, en medios de cultivo,
permitieron evidenciar la presencia de actividad antimicrobiana por parte de los
hongos endófitos y es una prueba básica para determinar otros procedimientos
(Tan, & Zou, 2001). (Kusari, Hertweck, & Spiteller, 2012 ), por lo cual se
procedió a realización de extractos puros etanólicos, ejecutando nuevamente el
ensayo de plato dual, a diferentes concentraciones extracto ( 35 µl, 70 µl y 105
µl ), lo que permitió observarla actividad antibacteriana de los hongos HESMA1,
HEHMA4, HESMA5, HEHME6, HESMO8, HETMO9, HESMA10, HEHMO11,
sobre las cepas de E. coli resistentes; y de los hongos HEHMO3, HESMA5,
HEHME6, HESMO8, HETMO9, HESMA10, HEHMO11, HESMA13, en la cepa
de S. aureus resistente, estos resultados permitieron concluir que en algunos
hongos, se veía la similitud en la capacidad de actuar como antimicrobianos en
las dos cepas bacterianas, estos hongos que mostraron esta capacidad fueron
Penicillium, Cladospurium, Aspergillius.
Al realizar la prueba estadística Mann Whitney, y efectuar las diferentes
comparaciones de los halos de inhibición obtenidos, entre el grupo intervenido y
el grupo control en las 4 cepas estudiadas (sensibles – resistentes), se
evidencio una diferencia significativa, con una inhibición del 80 % de los
extractos de los hongos ensayados.
bjetivos
Discusión
95
Por otro lado al realizar la comparación de los halos de inhibición entre los tres
tipos de concentraciones de cada hongo con la prueba estadística Kruskal
Wallis se observó que para las cepas sensibles y resistentes de cada una de las
bacterias, algunos tuvieron una tendencia de incremento de la inhibición al
aumentar la concentración y otros mostraron notable incremento de inhibición al
aumentar la concentración.
Algunos Extractos fúngicos al ser evaluados, dieron satelitismo de colonias en
los halos de inhibición, teniendo en cuenta estas características se tomó como
un factor de exclusión en la determinación de la bioactividad efectiva de cada
uno de los extractos, como también otros no mostraron actividad
antimicrobiana, estos hongos que presentaron estos atributos fueron, HEHMO2,
HETMO7en las dos cepas bacterianas.
Las pruebas realizadas con los diferentes extractos demuestran que a
concentraciones CC50 para hallar citotoxicidad en líneas celulares Vero, no
producen ningún tipo de daño, confirmando la utilidad de estos extractos para
identificar posibles moléculas bioactivas de interés y uso en el ser humano,
teniendo en cuenta que otros trabajos como los de Castro-Cevallos, (2016),
también constituyen que no hay efectos citotóxicos de endófitos probados en
otro tipo células como son células germinales de anfibios.
bjetivos
Conclusiones
96
6. CONCLUSIONES
.
Existe un potencial antimicrobiano de los extractos crudos de hongos endófitos
de Mammea americana y Moringa Oleífera, para Staphylococcus aureus y
Escherichia coli. Estos resultados sugieren continuar con estudios específicos
dirigidos a la identificación de las moléculas activas
Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron una gran diversidad de
hongos endófitos, que fueron identificadas a nivel de morfo especie, muchas de
las cuales han sido reportados como endófitos comunes en plantas.
Aspergillius spp. Fue el hongo endófito más frecuentemente aislado, sin
embargo no presento actividad antimicrobiana, por el contrario Cladosporium
spp que fue el hongo que se encontró en menor proporción si presentó
actividad antimicrobiana, estos resultados demuestran que este tipo de eventos
se presentan de manera aislada.
Tanto la concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida
coincidieron, sin embargo los extractos evaluados presentaron diferencias
frente a las bacterias, siendo el extracto 10 el que mostro mayor actividad
antimicrobiana frente a la E. coli (Bacteria Gram-negativa). con una
concentración de 1000 ug/ml, mientras que en el S. aureus no presento
actividad en las concentraciones ensayadas, los extractos 6 y 8 obtuvieron una
MIC Y MBC entre 1000 y 2000 ug/ml
Los resultados que arrojo este proyecto constituyen la base de posteriores
estudios para el desarrollo de nuevos antimicrobianos de origen natural que
controlen las cepas resistentes.
bjetivos
Referencias
97
7. REFERENCIAS
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bjetivos
Anexos
123
8. ANEXOS
ANEXO 1
1. CÁLCULO PARA LA PREPARACIÓN DEL INÓCULO
A partir de la dilución que corresponde al tubo 0,5 de la escala de
McFarland (1x 108). se hace:
Dilución Cepa Caldo
Muller
Hinton
Volumen
Final
1:10 100 μL
900 μL
1000μL
1:10 1000μL
9000μL
10000μL
1:2 100μL
100μL
200μL
1 extracto (24 pozos cada uno con 100 μL ). 2400 μL
4 (3 extractos + 1 control de Gentamicina). X
X= 9600 μL de inoculo Bacteriano tanto de Escherichia coli
ATCC 25922 y Staphylococcusaureus ATCC 29213
Por lo anterior se toma a partir de 1x108
Dilución Cepa Caldo
Muller
Hinton
Volumen
Final
1:10 200 μL
1800 μL
2000μL
1:10 Se toma
todo el
volumen
de la
dilución
Se le
adicionan
18000μL
20000μL
bjetivos
Anexos
124
del
inoculo
anterior
es decir
2000μL
1:2 A partir
de la
dilución
anterior
se toman
5000μL
Se le
adicionan
5000μL
10000μL
ANEXO 2
Tabla 2. Compuestos bioactivos aislados de hongos endófitos frente a
microorganismos de interés clínico y su medio de transmisión. (Goudaet
al., 2016). (Abajo).
bjetivos
Anexos
125
bjetivos
Anexos
126
bjetivos
Anexos
127
