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Einblicke in die Peptidchemie
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EINE EINFÜHRUNG IN DIE WELT DER AMINOSÄUREN UND PEPTIDEpräsentiert von Monika Mergler, Ph.D., Bachem AG
Inhaltsverzeichnis
1. Die Geschäftsfelder der Bachem 03
2. Was sind Peptide? 06
3. Was sind Aminosäuren? 07
4. Herstellung von Peptiden 14
5. Analyse von Aminosäuren und Peptiden 24
6. Modifi zierung von Peptiden 26
Abkürzungsverzeichnis
ADS Analytical Datasheet, auch als Certifi cate of Analysis (CofA) bezeichnet
API Active Pharmaceutical Ingredient (Wirkstoff in Medikamenten)
CCD Counter Current Distribution (Gegenstromverteilung, Reinigungsmethode)
DC, TLC Dünnschichtchromatographie (thin layer chromatography, Analysenmethode)
DMF Dimethylformamid (bei der SPPS verwendetes Lösungsmittel)
GMP Good Manufacturing Practice („Gute Herstellungspraxis“, Richtlinien zur Qualitätssi-
cherung bei der Herstellung z.B. von pharmazeutischen Wirkstoffen)
HPLC High Performance Liquid Chromatography (Analysen- und Reinigungsmethode)
MS. Massenspektrometrie (Analysenmethode)
NCE New Chemical Entity (noch nicht zugelassener Wirkstoff)
NMP N-Methylpyrrolidon (bei der SPPS verwendetes Lösungsmittel)
QCRF Quality Control Release Form
RSLC Rapid Separation Liquid Chromatography (Analysenmethode)
SPPS Solid-phase Peptide Synthesis (Festphasen-Peptidsynthese)
Symbole für chemische Elemente
C Kohlenstoff
H Wasserstoff
N Stickstoff
O Sauerstoff
S Schwefel
* Um nicht ständig aktualisieren zu müssen, soll hier auf konkrete Zahlen verzichtet werden. Die aktuellen Angaben (Anzahl Produkte,
Umsatz etc.) kann man z.B. im Geschäftsbericht oder auf der Bachem Homepage www.bachem.com fi nden.
** GMP = Good Manufacturing Practice, Produktionsrichtlinien, die der Qualitätssicherung dienen. An diese Richtlinien muss man sich
bei der Herstellung von Substanzen, die am Menschen eingesetzt werden, halten. Ihre Einhaltung wird regelmässig von spezialisierten
Behörden (wie Swissmedic in der Schweiz, FDA in den USA) kontrolliert. Unter diese Produktionsrichtlinien fallen u.a. Wirkstoffe in
Medikamenten, Bestandteile von Kosmetika und Zusatzstoffe in Lebensmitteln.
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Die Geschäftsfelder der Bachem
Die Kerngeschäfte der Bachem sind die
Vertragsherstellung von pharmazeutischen
Wirkstoffen, insbesondere Generika, und
die Synthese und der Verkauf von Amino-
säurederivaten, Peptiden und Feinchemi-
kalien*. Bachem produziert sowohl Peptide
als auch “kleine Moleküle” (small molecule
APIs) als Wirkstoffe für die Pharmaindustrie
unter GMP-Bedingungen**.
Die Geschäftsfelder der Bachem sind:
Forschungchemikalien
Katalogprodukte, ab Lager
Diese Aminosäurederivate, Peptide und
weitere Chemikalien werden NICHT unter
GMP-Bedingungen hergestellt und dür-
fen nur für Labor- und Forschungszwecke
eingesetzt werden. Sie dürfen nicht am
Menschen verwendet werden.
Custom Synthesis
Auftragssynthesen, exklusiv für einen
Kunden
Meistens Peptide, die in Mengen von
wenigen Milligramm bis zu einigen Gramm
hergestellt werden. Auf Wunsch können die
Produkte unter GMP-Bedingungen synthe-
tisiert werden.
New Chemical Entities (NCEs)
Auftragssynthesen
NCEs sind patentierte Peptide oder or-
ganische Verbindungen, die die Bachem
exklusiv für den Patentinhaber oder einen
Lizenznehmer herstellt. Bei NCEs ist schon
während der ersten Synthese in kleinem
Massstab zu bedenken, dass sich das
Produkt als pharmazeutisch wirksam
erweisen kann und daher in grösseren
Mengen und evtl. unter GMP-Bedingungen
hergestellt werden muss.
Die Bachem strebt eine langfristige Part-
nerschaft mit solchen Kunden an. Diese
geht von anfänglichen Synthesen von NCEs
im Labormassstab über die Herstellung
von grösseren Mengen unter GMP-Bedin-
gungen für die klinischen Phasen bis zur
Herstellung des Wirkstoffs für das zugelas-
sene Medikament im Grossmassstab.
Generic Active Pharmaceutical Ingre-
dients (Generic APIs)
Pharmazeutisch aktive Verbindungen
Substanzen, die als Wirkstoffe in Medika-
menten eingesetzt werden, MÜSSEN unter
GMP-Bedingungen hergestellt werden. Sie
werden in Grossmengen verkauft.
Abb. 1: Das Bachem 360º Geschäftsmodell.
CATALOG PRODUCTS• more than 7500 products available online• peptides, amino acids, inhibitors, substrates• fast & easy ordering @ shop.bachem.com• bulk quantities according to your needs• excellent customer and technical support
CUSTOM SYNTHESIS• from discovery stages to early clinical candidates• strong focus on quality and timely execution• development of synthetic routes for scale up• best industry practice• highly motivated and experienced team
NCEs• process development, optimization and validation• comprehensive analytical services• supply of cGMP material for all clinical phases• sterile fi ll & fi nish for clinical trials (Clinalfa®) • cGMP-manufacturing of APIs for commercial supply
Research
Dev
elop
men
tContract
Manufacturing
Comm
erci
al
Sup
ply
GENERIC APIs• peptide and small molecule generics• supply of commercial quantities• reputation for sustained quality & supply• high-demand APIs available from stock• close and long term partnerships
Einblicke in die Peptidchemie
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Generic Active Pharmaceutical Ingredients
(Generic APIs)
Generika sind Wirkstoffe bzw. Medikamen-
te, deren Patentschutz abgelaufen ist.
Medikament = „formulierter“ Wirkstoff:
Je nach Art der Verabreichung (als Tablette,
als Injektion etc.) werden diverse nicht-ak-
tive Hilfsstoffe zum eigentlichen Wirkstoff
gemischt. Dieser Prozess wird als Formulie-
rung bezeichnet, er kann unabhängig vom
Wirkstoffpatent geschützt werden. Durch
geeignete Formulierung kann z.B. erreicht
werden, dass der Wirkstoff nur langsam
freigesetzt wird (Depotformulierungen), als
Nasenspray angewendet oder über die Haut
aufgenommen wird. Die Entwicklung und
Patentierung neuer Formulierungen von
generischen Wirkstoffen bietet den Wirk-
stoffherstellern gute, langfristige Absatz-
möglichkeiten.
Die Entdeckung weiterer pharmakologi-
scher Aktivitäten kann zu zusätzlichen
Indikationen für ein Generikum führen und
damit den Bedarf an Wirkstoff erhöhen.
Auch in einem solchen Fall können Patente
(Anwendungspatente) erteilt werden.
Generika werden auch zur Diagnose von
Krankheiten (d.h. als Diagnostika) ein-
gesetzt. Ein weiterer Markt mit grossem
Potential ist die Verwendung von Generika
in der Veterinärmedizin.
Wegen der immensen Bedeutung der APIs
für den Umsatz der Bachem wird das Ange-
bot ständig angepasst.
Der Patentschutz eines Wirkstoffs läuft
meistens nach 18 Jahren aus. Ist ein pepti-
discher Wirkstoff für die Bachem von Inte-
resse, muss die Firma schon Jahre vorher
mit der Syntheseentwicklung beginnen. Ein
Verkauf des Peptids in kleinen Mengen für
Forschungs- und Entwicklungszwecke ist
schon vor Ablauf des Patents möglich (Bolar
Exemption). Einige peptidische APIs der
Bachem und ihre Indikation sind in
Tabelle 1 gelistet.
Die Strukturen von Calcitonin, Glucagon,
Gonadorelin (GnRH oder LHRH), und Sec-
retin entsprechen denen der natürlichen,
körpereigenen Peptidhormone, die anderen
in der Tabelle aufgeführten Produkte sind
modifi zierte natürliche Peptide. Durch
Veränderungen in der Struktur werden sie
im Organismus langsamer abgebaut als
körpereigene Peptide.
Triptorelin wird in zwei Salzformen angebo-
ten, Acetat und Pamoat. Das Pamoat wird
langsamer freigesetzt und daher in Depot-
formulierungen verwendet.
Die von der Bachem angebotenen small mo-
lecule APIs werden von unserer Zweignie-
derlassung in Vionnaz hergestellt (ausser
Antazolin). Beispiele dafür sind Propofol,
das zur Einleitung einer Allgemein-
anästhesie oder Sedierung von beatmeten
Erwachsenen während der Intensivbehand-
lung verwendet wird, oder Zonisamid als
Zusatztherapeutikum bei partiellen Epi-
lepsien. Interessenten können sich über die
angebotenen peptidischen und nicht-pepti-
dischen Generic APIs auf der Homepage der
Bachem (www.bachem.com) informieren,
unseren Generikakatalog herunterladen
und eine Offerte anfordern.
Unter der Marke Clinalfa® bietet die
Bachem Peptide für klinische Studien
und Fertigformulierungen von Peptiden
als zusätzlichen Service an. Es sind zwei
Produktlinien erhältlich. Clinalfa® basic
Produkte sind sterile gefriergetrocknete
oder fl üssige Fertigformulierungen für den
ausschliesslichen Einsatz in genehmigten
klinischen Studien. Sie werden gemäss den
Anforderungen und relevanten Richtlinien
der Aufsichtsbehörden hergestellt und frei-
Tabelle 1: Beispiele einiger peptidischer APIs
der Bachem und deren Indikationen
PeptidPeptid IndikationIndikation
Calcitonin Osteoporose
Deslorelin Fruchtbarkeitskontrolle
(Veterinärmedizin)
Desmopressin Diabetes insipidus
Glucagon Unterzuckerung bei Dia-
betes
Goserelin Krebs
Gonadorelin Reproduktionsmedizin
Leuprolid Krebs
Octreotid Akromegalie
Secretin Diagnostik
(Bauchspeicheldrüse)
Triptorelin Krebs
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gegeben und sind ab Lager erhältlich. Unter
Clinalfa® plus bieten wir die Formulierung
nach Kundenwünschen als zusätzlichen
Service zur Auftragsherstellung von pepti-
dischen Wirkstoffen an.
Abb. 2: Clinalfa®-Logo.
Forschungschemikalien
„Katalogprodukte“
Diese Produkte werden in verschiedenen
Packgrössen oder in grösserer Menge
(Minibulk und Bulk) ab Lager verkauft. Die
meisten werden bei der BUK in Grossbritan-
nien oder in Bubendorf hergestellt.
Die Katalogprodukte decken einen breiten
Kundenkreis ab. Die Produkte im Haupt-
katalog sind in drei durch unterschiedliche
Farben markierte Kategorien (gelb-blau-
rot) aufgeteilt:
Der gelbe Teil des Hauptkatalogs enthält
Aminosäurederivate und Produkte zur Syn-
these von Peptiden, wendet sich also primär
an Chemiker.
Der blaue Teil ist der bei weitem umfang-
reichste des Katalogs. In ihm sind die
angebotenen Peptide aufgelistet, er wendet
sich vor allem an die biologische und medi-
zinische Forschung.
Der rote Teil enthält Biochemikalien, die kei-
ne Aminosäurederivate oder Peptide sind.
Auch dieser Teil wendet sich an die biologi-
sche und medizinische Forschung.
Diese Aufteilung in 3 Produktkategorien
(Aminosäurederivate und Produkte für die
Peptidsynthese / Peptide / nicht-peptidi-
sche Biochemikalien) fi ndet sich auch im
Onlineshop (ohne Farbcodierung).
Das Kataloggeschäft ist auch wichtig für die
Akquirierung von Kunden für unsere wei-
teren Angebote, z.B. Auftragssynthesen. Es
erlaubt auf einfache Weise, den potentiellen
Kunden die hohe Produktqualität und den
guten Service der Bachem zu zeigen.
Abb. 3:
Einstiegsseite
des Bachem-
Onlineshops.
Einblicke in die Peptidchemie
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Was sind Peptide ?
Peptide sind kleine Proteine.
Peptide und Proteine sind Makromoleküle,
d.h. lange Moleküle aus kleinen Unterein-
heiten. Man könnte sie sich als Perlen-
ketten aus verschieden geformten Perlen
vorstellen. Die “Perlen” sind die 20 prote-
inogenen Aminosäuren (Aminosäuren, die
in der Zelle zum Aufbau von Peptiden und
Proteinen verwendet werden). Sie werden in
beliebiger Kombination verknüpft, d.h. die
Anzahl der Kombinationsmöglichkeiten ist
praktisch unendlich. Dabei können die Ami-
nosäuren in beliebiger Häufi gkeit verwen-
det werden, so fi ndet sich beispielsweise im
Protein Kollagen Glycin (Gly) an jeder dritten
Position der Kette:
...-Xaa (meistens Pro (L-Prolin))-Yaa-Gly-...
Peptide und Proteine unterscheiden sich
nur durch ihre Länge:
Proteine > 100 Aminosäuren
Peptide 2-100 Aminosäuren
Unser Körper besteht, abgesehen vom
Wasser, zum grössten Teil aus Proteinen.
Trotz des gleichen Aufbauprinzips haben sie
die unterschiedlichsten Funktionen (siehe
Tabelle 2). Proteine sind auch ein lebens-
wichtiger Bestandteil unserer Ernährung!
Wie ist diese Vielfalt möglich?
Durch Variation der Aminosäurebausteine
können Makromoleküle mit den unter-
schiedlichsten Eigenschaften „gebaut“
werden!
Biologisch aktive Peptide sind z.B. Hormone
oder Toxine (s.S. 23).
Ein grosser Teil unserer Hormone sind Pep-
tide von recht unterschiedlicher Länge:
TRH (Thyreotropin-releasing hormone), ein
Tripeptid (es besteht aus 3 Aminosäuren).
LHRH (oder GnRH, Gonadotropin-releasing
hormone), ein Peptid aus 10 Aminosäuren
(Decapeptid).
Calcitonin besteht aus 32 Aminosäuren.
pTH (Parathormon), mit seinen 84 Amino-
säuren fast schon ein Protein.
Insulin besteht aus 2 Peptidketten, einer
aus 30 Aminosäuren und einer aus 21, die
miteinander durch Disulfi dbrücken (s. S. 23)
verknüpft sind.
Generell werden Peptidhormone von spezi-
alisierten Zellen produziert, ins Blut abge-
geben und zum Zielorgan transportiert.
Die Zellen, die stimuliert werden sollen, ha-
ben Rezeptoren, die die Hormone erkennen
und spezifi sch binden. Diese Rezeptoren
sind spezialisierte Proteine, die in der Zell-
membran eingelagert sind. Die Bindung des
Hormons wirkt als Signal für die Zelle und
der gewünschte Effekt wird ausgelöst.
Kurze Peptide
• 2 Aminosäuren = Dipeptid
• 3 Aminosäuren = Tripeptid
• 4 Aminosäuren = Tetrapeptid
• 5 Aminosäuren = Pentapeptid etc.
• wenige Aminosäuren = Oligopeptid
Tabelle 2: Körpereigene Proteine und deren Funktionen
Beispiele Vorkommen der Proteine Anforderungen/Funktion
Myosin, Actin Muskelgewebe fl exible Moleküle, kontrahierbar
Kollagen
(das häufi gste Protein im Körper)
Bindegewebe, Sehnen, Haut formstabile Moleküle, zugfest
Hämoglobin, Albumin Blut Transportermoleküle, löslich
Verdauungsenzym Trypsin im
Dünndarm
(Trypsin ist eine sog. Protease,
spaltet Peptide und Proteine)
Gesamter Organismus Enzyme = Katalysatoren
Hormon Thyreotropin (TSH)
(stimuliert die Schilddrüse)
Gesamter Organismus Hormone = Botenstoffe
Antikörper (Immunoglobuline) Blut Immunabwehr
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Mit den 20 Aminosäuren, die im Peptid
mehrfach vorkommen können, sind auch
schon bei kurzen Peptiden viele Kombinati-
onen möglich, z.B. ca. 3.2 Millionen ver-
schiedene Pentapeptide!
Selbst Dipeptide können schon biologisch
aktiv sein:
Leu-Trp und weitere Dipeptide wirken blut-
drucksenkend
Ac-Asp-Glu (NAAG) ist ein wichtiger Neuro-
transmitter, eine Substanz, die die Signal-
übertragung zwischen den Nervenzellen
vermittelt.
Die im Körper vorkommenden Peptide
werden gewöhnlich durch enzymatische
Spaltung von Proteinen erhalten.
Was sind Aminosäuren ?
Aufbau einer α-Aminosäure
An ein zentrales Kohlenstoffatom (dem α-C-
Atom) sind vier verschiedene Substituen-
ten* gebunden:
• die Säuregruppe
(Carbonsäuregruppe = Carboxylgruppe,
COOH, bei der Bachem kurz als -OH ge-
schrieben)
• eine basische Gruppe
(Aminogruppe, NH2, kurz H-)
• die Seitenkette
(R, kann stark variieren, bestimmt so die
Eigenschaften des Peptids!)
• ein Wasserstoffatom
(H)
Das α-C-Atom trägt demnach 4 Gruppen
mit unterschiedlichen chemischen Ei-
genschaften, was im Folgenden eine sehr
grosse Rolle spielt (Abb. 4).
Wie schon erwähnt, gibt es 20 verschiedene
“proteinogene” Aminosäuren, aus denen die
NH2
COOHR
H
C
Abb. 4: α-Aminosäure, das α-C-Atoms mit
den vier verschiedenen Substituenten.
Proteine der Zelle aufgebaut werden. Sie
unterscheiden sich nur in der Seitenkette
R. Daneben fi ndet man in der Natur - frei,
als Stoffwechselprodukte oder in Peptiden/
Proteinen eingebaut - noch viele ande-
re α-Aminosäuren, z.B. L-Hydroxyprolin
(Hyp) im Kollagen oder L-Ornithin (Orn)
frei imHarn. Weitere α-Aminosäuren, z.B.
L-Norleucin (Nle), sind bisher nur durch
chemische Synthese erhalten worden.
Bei der Bachem bezeichnet man nicht-
proteinogene Aminosäuren wie Hyp und
Nle als „unusual amino acids“, da man sie
nicht pauschal „unnatürliche Aminosäu-
ren“ nennen kann (wie es manche anderen
Firmen tun).
Aminosäuren (ob proteinogen oder nicht)
können biologisch aktiv sein, z.B. L-Trypto-
phan, L-Glutaminsäure.
Die Seitenkette R
• kann ein Wasserstoff-Atom sein:
Glycin, die einfachste α-Aminosäure
• kann eine zusätzliche Säuregruppe
(COOH) tragen:
Asparaginsäure, Glutaminsäure, oder eine
veränderte Säuregruppe sein (ein Amid,
CONH2): Asparagin, Glutamin
• kann eine zusätzliche basische Gruppe
tragen:
Arginin (stark basisch), Lysin, Histidin
(schwach basisch)
• kann eine polare Gruppe tragen:
Serin, Threonin
• kann ein Kohlenwasserstoff (unpolar) sein:
Alanin (R = Methyl), Phenylalanin (R = Ben-
zyl), Valin (R = Isopropyl)
• kann Schwefel enthalten:
Cystein, Methionin
Neben den α-Aminosäuren, aus denen
Peptide und Proteine aufgebaut sind, hat
die Bachem noch viele andere Aminosäuren
im Angebot, auch solche, bei denen die Ami-
nogruppe an ein anderes Kohlenstoffatom
gebunden ist.
L- und D-Aminosäuren
Die vier verschiedene Substituenten des
α-Kohlenstoffatom sind nicht in einer
Ebene angeordnet, sondern sitzen an den
*Substituenten sind Atome oder Atomgruppen, die an Stelle von einem Wasserstoffatom an ein zentrales Kohlenstoff-
atom (bei α-Aminosäuren das α-C) gebunden sind.
Einblicke in die Peptidchemie
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vier Ecken eines Tetraeders, in dessen Mitte
das α-C-Atom sitzt (Abb. 5):
Daher sind 2 Formen der Aminosäuremole-
küle möglich, die sich wie Bild und Spiegel-
bild verhalten und als Stereoisomere oder
Enantiomere bezeichnet werden:
In ihren physikalischen Eigenschaften un-
terscheiden sich die beiden Enantiomeren
nicht, ausser dass sie in Lösung die Ebene
des polarisierten Lichts drehen. Verbindun-
Abb. 5: Anordnung der Substituenten um
das α-Kohlenstoffatom (grau).
Gly) sind L-Enantiomere (L steht für laevus,
lat. links), z.B. L-Alanin. Ihre „Spiegelbilder“,
die D-Aminosäuren, treten in der Natur viel
seltener auf. D steht für dexter (lat. rechts).
Um es noch einmal zu betonen, L oder D
bezeichnet die Anordnung der vier verschie-
denen Substituenten am α-C-Atom, d.h. das
jeweilige Enantiomer (vgl. Abb. 6). Man kann
nicht von der Bezeichnung L- oder D- auf
den Drehsinn schliessen. Bei L-Aminosäu-
ren kann er positiv oder negativ sein (s.u.),
bei den entsprechenden D-Aminosäuren ist
er immer entgegengesetzt gerichtet.
Die Drehwerte fi ndet man häufi g als [α] auf
den ADS/QCRF (s. S. 24) von Aminosäuren
und ihren Derivaten angegeben, da sie cha-
rakteristisch für die jeweilige Verbindung
sind. Auch bei Peptiden werden oft Dreh-
werte gemessen.
Tabelle 3: Die für Aminosäuren wichtigen funktionellen Gruppen
Bezeichnung Struktur Bezeichnung Struktur
Aminogruppe NH2
Carboxygruppe COOH
Hydroxylgruppe OH Amidgruppe
(Carboxamidgruppe)
CONH2
Thiol- oder Mercaptogruppe
(im Cystein)
SH Guanidinogruppe
(im Arginin)
NH-C(=NH)-NH2
Abb. 6: Absolute Konfi guration der L- und D-Isomere von Aminosäuren.
gen, die das tun, bezeichnet man als “op-
tisch aktiv”. Die optische Aktivität ist in der
Natur sehr weit verbreitet. Ausser Glycin (R
= H, Bild und Spiegelbild identisch) zeigen
alle proteinogenen Aminosäuren dieses
Phänomen. Auch Zucker drehen das Licht,
was man benutzt, um die Konzentration von
Zuckerlösungen zu bestimmen, ebenso die
DNA und ihre Bausteine.
Alle proteinogenen Aminosäuren (ausser
Einige Beispiele:
L-Alanin: + 14.3°
D-Alanin: -13.9°
L-Tryptophan: - 31.8°
D-Tryptophan: + 30.7°
(die Abweichungen liegen im Genauigkeits-
bereich der Methode)
Eine 1:1 Mischung der beiden Enantiomeren
bezeichnet man als Racemat. Die Drehun-
gen von L- und D-Form kompensieren sich.
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In der Bachem-Schreibweise wird die L-
Form wegen ihrer grossen Bedeutung nicht
explizit bezeichnet (z.B. L-Alanin = H-Ala-
OH). Bezeichnet werden nur das D-Enan-
tiomer (D-Alanin = H-D-Ala-OH) und das
Racemat, das mit DL gekennzeichnet wird.
Schreibweisen für Aminosäuren
Schreibt man bei einer Aminosäure den Na-
men aus, bezeichnet man auch die enantio-
mere Form: L-Alanin und D-Alanin.
Beim Racemat wird, wie in der organischen
Chemie üblich, das DL gewöhnlich wegge-
lassen.
Um Aminosäurederivate und Peptide darzu-
stellen, benutzt man den Dreibuchstaben-
Code (3-letter code, meistens die ersten 3
Buchstaben des Namens).
Daneben gibt es den Einbuchstaben-Code
(1-letter code), den man vor allem für länge-
re Peptide und Proteine bevorzugt.
Beispiele:
L-Alanin → Ala, L-Ala, H-Ala-OH (3-letter);
A (1-letter)
L-Arginin → Arg, L-Arg, H-Arg-OH (3-letter);
R (1-letter)
Bachem-Schreibweise:
H-Ala-OH, H-Arg-OH
Die Schreibweise bedeutet, dass es die
L-Form ist und dass die Amino- und die Car-
boxylgruppe frei sind!.
Die Kürzel der 20 proteinogenen Aminosäu-
ren sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Englische Aminosäure-Bezeichnungen:
Ausser beim Tryptophan wird ein -e ange-
hängt, z.B. alanine, valine.
Asparaginsäure = aspartic acid
Glutaminsäure = glutamic acid
Der Einbuchstaben-Code wird nur für die
20 proteinogenen Aminosäuren verwendet,
für D-Aminosäuren schreibt man oft den
Kleinbuchstaben, z.B. f = D-Phe.
Dagegen gibt es für viele der nicht-prote-
inogenen Aminosäuren auch einen verbind-
lichen Dreibuchstaben-Code, z.B. Hyp
(L-trans-Hydroxyprolin), Nle (L-Norleucin),
Orn (L-Ornithin). Nicht alle literaturüb-
lichen Kürzel werden auch bei der Bachem
benutzt. Bei manchen Aminosäuren wird
bei der Bachem der ausgeschriebene Name
gebraucht, z.B. L-Thiazolidine-4-carboxylic
acid (sonst Thz).
Kurze Porträts der 20 proteinogenen Ami-
nosäuren
Ein Organismus, z.B. der menschliche, muss
alle 20 proteinogenen Aminosäuren zur
Verfügung haben, um Proteine synthetisie-
ren zu können. Sie müssen alle in L-Form
vorliegen (ausser Gly).
Man unterscheidet zwischen essentiellen
und nicht-essentiellen Aminosäuren.
Nicht-essentielle Aminosäuren kann der
Körper selbst herstellen, essentielle nicht,
sie müssen also mit der Nahrung zugeführt
werden.
Man kann die Aminosäuren auch nach der
Seitenkette (s.S.7), die ihre Eigenschaf-
ten bestimmt, unterteilen. Es gibt saure,
basische, polare und unpolare Aminosäu-
ren, in der “Periodic Chart of Amino Acids”
Tabelle 4: Kürzel der proteinogenen Aminosäuren (L-Form, ausser Gly)
Name im Peptid* 3-letter 1-letter Name im Peptid 3-letter 1-letter
Alanin alanyl Ala A Leucin leucyl Leu L
Arginin arginyl Arg R Lysin lysyl Lys K
Asparagin asparaginyl Asn N Methionin methionyl Met M
Asparaginsäure aspartyl Asp D Phenylalanin phenylalanyl Phe F
Cystein cysteyl Cys C Prolin prolyl Pro P
Glutamin glutaminyl Gln Q Serin seryl Ser S
Glutaminsäure glutamyl Glu E Threonin threonyl Thr T
Glycin glycyl Gly G Tryptophan tryptophyl Trp W
Histidin histidyl His H Tyrosin tyrosinyl Tyr Y
Isoleucin isoleucyl Ile I Valin valyl Val V
*s.Tab. 5 auf S. 15
Einblicke in die Peptidchemie
10
(s.S.13) werden sie durch verschiedene
Farben unterschieden. Die Eigenschaften
von Peptiden und Proteinen werden von den
Seitenketten der Aminosäuren, aus denen
sie aufgebaut sind, bestimmt.
Glycin (Gly, G)
ist die einfachste Aminosäure und eine
der in Peptiden/Proteinen am häufi gsten
vorkommenden. Gly ist nicht-essentiell.
Seinem süssen Geschmack verdankt Glycin
seinen Namen.
Alanin (Ala, A)
ist die einfachste optisch aktive Aminosäu-
re und die zweithäufi gste in Proteinen. Die
abgebildete L-Form dieser nicht-essentiel-
len Aminosäure wird vom Körper in Proteine
eingebaut, doch fi ndet sich in der Natur
auch D-Alanin recht häufi g in Peptiden.
Alanin wird zu den unpolaren Aminosäuren
gezählt.
Arginin (Arg, R)
ist eine stark basische Aminosäure. Die
stickstoffhaltige Guanidinogruppe in der
Seitenkette ist eine derartig starke Base,
dass sie praktisch mit jeder Säure ein Salz
bildet. Seinen Namen hat Arginin bekom-
men, weil es als Silbersalz isoliert worden
ist. Arg ist halb-essentiell (der Körper kann
es zwar produzieren, aber oft in zu geringer
Menge). Arg-haltige Peptide sind sehr polar
und leicht wasserlöslich
Asparagin (Asn, N)
ist eigentlich ein Derivat der Asparagin-
säure (das Amid) und wie diese wurde Asn
in Spargeln entdeckt. Asn ist eine polare
Aminosäure. In Peptiden und Proteinen ist
Asn relativ labil.
Asparaginsäure (Asp, D)
ist eine saure Aminosäure, weil sie in der
Seitenkette eine weitere Säuregruppe
enthält. Diese bleibt erhalten, wenn Asp in
ein Peptid eingebaut wird. Asparaginsäu-
re wurde in Spargeln entdeckt, was ihr zu
ihrem Namen verholfen hat. Für Säugetiere
ist Asp nicht-essentiell.
Cystein (Cys, C)
ist zwar eine seltene Aminosäure, aber äu-
sserst wichtig für die Struktur von Peptiden
und Proteinen. Das nicht-essentielle Cys
enthält Schwefel in der Seitenkette, als
leicht saure Thiolgruppe. Thiolgruppen las-
sen sich leicht unter Ausbildung einer Disul-
fi dbindung oxidieren. Aus zwei Cysteinmo-
lekülen erhält man ein Cystin (Cyt)-Molekül.
Bei Peptiden, die ein Cys erhalten, werden
zwei Ketten miteinander verknüpft. Sind 2
Cys im Peptid, kann ein Ring entstehen, wie
wir später noch sehen werden.
Glutamin (Gln, Q)
ist eigentlich ein Derivat (das Amid) der
Glutaminsäure. Glutamin ist eine polare
Aminosäure, die in freier Form in grossen
Mengen im menschlichen Körper vorkommt.
Glutamin am Beginn einer Peptidkette
bildet spontan oder mit Hilfe eines Enzyms
Pyroglutaminsäure.
11
Glutaminsäure (Glu, E)
ist eine saure Aminosäure. Glu ist nicht-
essentiell. Die Salze der Glutaminsäure
heissen Glutamate, das Natriumsalz
(Monosodiumglutamate, MSG) ist bekannt
und berüchtigt als Geschmacksverstärker.
Glu hat grosse physiologische Bedeutung in
unserem Nervensystem als Neurotransmit-
ter. Glutaminsäure bildet viel weniger leicht
Pyroglutaminsäure als Glutamin.
Histidin (His, H)
ist eine schwach basische, polare, für Men-
schen essentielle Aminosäure. Der Name
leitet sich von „histos“ (griech. Gewebe) ab.
Der Imidazolring, den sie in der Seitenkette
trägt, enthält 2 Stickstoffatome. Imidazole
katalysieren viele Reaktionen, daher ist His
(in Kombination mit Cys, Ser oder Thr) oft im
aktiven Zentrum von Enzymen zu fi nden.
Leucin (Leu, L) und Isoleucin (Ile, I)
sind isomere α-Aminosäuren. Isomere
Verbindungen haben die gleiche Summen-
formel und das gleiche Molekulargewicht,
aber sie unterscheiden sich in der Struktur.
Beides sind unpolare Moleküle. Leu und
Ile sind für den Menschen essentiell. Der
Name Leucin rührt von den weissen (griech:
leukos) Blättchen, in denen es kristallisiert.
Beim Isoleucin sind weitere Stereoisomere
möglich (allo-Ile).
Lysin (Lys, K)
ist eine basische Aminosäure, die in ihrer
Seitenkette eine zweite Aminogruppe trägt,
eine α,ε-Diaminosäure. Lysin ist essentiell.
Methionin (Met, M)
ist, wie Cystein, eine schwefelhaltige
Aminosäure. Der Schwefel liegt als Methyl-
thioether vor, worauf der Name anspielt ,
„Me-thio“. Thioether sind oxidationsemp-
fi ndlich, was beim Umgang mit Met-haltigen
Peptiden zu beachten ist. Diese essentielle
Aminosäure zählt zu den unpolaren Amino-
säuren.
Phenylalanin (Phe, F)
ist eine essentielle, unpolare Aminosäure.
Sie zählt, neben His, Tyr (das als Phenyl-
alaninderivat betrachtet werden kann) und
Trp zu den aromatischen Aminosäuren.
Prolin (Pro, P)
ist die einzige cyclische proteinogen
Aminosäure, ein Ring aus 5 Atomen, der
α-Aminogruppe und α-C enthält. Pro ist
unpolar und nicht essentiell. Wegen seiner
speziellen Struktur hat Pro einen immensen
Einblicke in die Peptidchemie
12
Einfl uss auf die räumliche Struktur von
Peptiden und Proteinen.
Serin (Ser, S)
ist dank der Hydroxylgruppe in der Seiten-
kette eine polare Aminosäure. Der Name
dieser nicht-essentiellen Aminosäure leitet
sich von der Seide (lat. sericum) ab
Threonin (Thr, T)
enthält wie Serin eine Hydroxylgruppe in
der Seitenkette, ist jedoch eine essentielle
Aminosäure. Threonin enthält wie Isoleucin
ein zweites asymmetrisches Kohlenstoff-
Atom mit vier verschiedenen Substituenten,
womit weitere Stereoisomere möglich sind
(allo-Thr).
Tryptophan (Trp, W)
ist eine unpolare, essentielle Aminosäure,
ein Indolderivat. Die freie Aminosäure wirkt
antidepressiv, sie ist eine Vorstufe vom
Serotonin. Tryptophan fl uoresziert im UV-
Bereich (308-350 nm).
Tyrosin (Tyr, T)
ist, da es im Organismus aus Phenylalanin
gebildet werden kann, eine nicht-essentiel-
le Aminosäure. Die relativ unpolare Amino-
säure wurde zuerst aus Käse (griech. tyros)
isoliert.
Valin (Val, V)
ist eine unpolare essentielle Aminosäure.
Aminosäurederivate
Generell versteht man in der organischen
Chemie unter Derivaten Abkömmlinge einer
Verbindung.
Ein Derivat einer Aminosäure wird erhalten
durch Modifi kation (chemische Verän-
derung) der Aminogruppe und/oder der
Carboxylgruppe und/oder der Seitenkette.
Wenn diese Modifi kation unter Bedingun-
gen wieder rückgängig gemacht werden
kann, die die Aminosäure nicht verändern,
kann sie als Schutzgruppe dienen. Solche
Derivate sind als Bausteine für die Peptid-
synthese geeignet.
Stamm-
verbindung
Derivat
H-Ala-OH → Ac-Ala-OH
(Aminogruppe blockiert)
→ H-Ala-NH2
(Carboxygruppe blockiert)
→ Fmoc-Ala-OH
(Aminogruppe blockiert)
→ Jedoch kann Fmoc sele-
ktiv unter milden Be-
dingungen abgespalten
werden, ist also eine für
die Peptidsynthese ge-
eignete Schutzgruppe.
13
His
His
tid
ine
H 155.
1613
7.14
C6H
9N3O
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9N3O
2
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e
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14N
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156.
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2
Lys
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e
K 146.
1912
8.17
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14N
2O2
128.
17C
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2
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leu
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e
I 131.
1811
3.16
C6H
13N
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C6H
13N
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F 165.
1914
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11N
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8C
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NO
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Le
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L 131.
1811
3.16
C6H
13N
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13N
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Trp
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W 204.
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top
ha
n
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10N
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Glu
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7NO
2
Einblicke in die Peptidchemie
14
Herstellung von Peptiden
Wie synthetisiert man ein Peptid?
Warum eigentlich Peptide synthetisieren?
Kann es die Natur nicht besser?
Die chemische Synthese
hat Vorteile:
• Beliebiger Massstab möglich
• Bei kürzeren Peptiden einfacher als
biologische Methoden
• BSE/TSE-frei
und zusätzliche Möglichkeiten:
• Veränderung der Aminosäuresequenz
bekannter Peptide
• Modifi kation von Peptiden (s.S.26)
ZIEL: Die Natur verbessern, d.h. die biolo-
gische Aktivität des Peptids zu modifi zieren:
• Erhöhung der erwünschten Aktivität
(biologisch aktive Peptide zeigen gewöhn-
lich mehrere Aktivitäten)
• Optimierung der Stabilität
„nicht besser, aber länger“
(Peptide können nicht oral eingenommen
werden und werden im Körper schnell
abgebaut, was nicht günstig für ein Medika-
ment ist)
• Minimierung von Nebenwirkungen
• Aufklärung von Struktur-Wirkungs-
beziehungen
• Synthese von Peptiden, die es in der Natur
nicht gibt u.v.m.
Synthese eines Dipeptids aus zwei ver-
schiedenen Aminosäuren
Beispiel:
L-Alanyl-L-phenylalanin (H-Ala-Phe-OH)
Zwei Aminosäuren reagieren miteinander zum
Dipeptid unter Abspaltung von Wasser. Das tun
sie nicht spontan, man muss sie aktivieren, da-
mit die Reaktion stattfi ndet. Für diesen Zweck
hat man die sogenannten Kupplungsreagenzi-
en entwickelt. Sie erzeugen reaktivere Derivate
der Aminosäure, und entfernen das Wasser aus
dem System.
Doch wenn man einfach ein Kupplungsreagenz
zu einer Lösung von Alanin und Phenylalanin
gibt, resultiert eine Mischung der 4 möglichen
H-Ala-OH + H-Phe-OH H-Ala-Phe-OH + H2O
Dipeptide, daneben könnenTri- und längere
Peptide entstehen:
Um wirklich nur das gewünschte Dipeptid
H-Ala-Phe-OH und keine Mischung zu erhalten,
braucht es 2 Schutzgruppen. Sie dürfen unter
den Bedingungen der Kupplungsreaktion nicht
abgespalten werden, aber leicht in einem sepa-
raten Schritt nach der Kupplung.
Die Aminogruppe von Alanin muss blockiert
werden:
H-Ala-OH → X-Ala-OH
und die Säuregruppe vom Phenylalanin:
H-Phe-OH → H-Phe-OY
Jetzt kann nur noch die Säuregruppe des
Alanins mit der Aminogruppe des Phenylalanins
reagieren:
X-Ala-OH + H-Phe-OY → nur X-Ala-Phe-OY
Zum Schluss werden die Schutzgruppen
entfernt:
X-Ala-Phe-OY → H-Ala-Phe-OH
d.h. X und Y werden unter den gleichen Bedin-
gungen abgespalten.
Jetzt wählen wir X und Y so, dass X unter Be-
dingungen abgespalten wird, unter denen OY
erhalten bleibt:
H-Ala-Ala-OH
H-Ala-Phe-OH
H-Phe-Ala-OH
H-Phe-Phe-OH
H-Ala-OH+
H-Phe-OH
X-Ala-Phe-OY
H-Ala-Phe-OY
X-Gly-Leu-Ala-Phe-OY
X-Leu-Ala-Phe-OY
H-Gly-Leu-Ala-Phe-OH,
das gewünschte Peptid
Abspaltung X, Kupplung X-Gly-OH
Kupplung X-Leu-OH
Abspaltung X, Abspaltung Y
Abspaltung X
15
So kann man ein Peptid beliebig verlängern.
X nennt man temporäre Schutzgruppe, denn sie
wird nur für den Kupplungsschritt gebraucht.
Y ist eine permanente Schutzgruppe. Sie muss
so stabil sein, dass sie sämtliche Kupplungs-
und X-Abspaltungsschritte aushält. Trotzdem
muss man sie im letzten Schritt abspalten
können, ohne dass das Peptid beschädigt wird.
Ein Peptid hat immer zwei sich unterschei-
dende Endgruppen, und damit eine “Richtung”.
Die endständige Aminogruppe eines Peptids
bezeichnet man als N-Terminus, die endstän-
dige Carboxylgruppe als C-Terminus. Bei der
chemischen Synthese wird das Peptid vom
C-Terminus ausgehend in Richtung N-Terminus
aufgebaut, daher muss die endständige
Carboxylgruppe während der ganzen Synthese
geschützt sein. Unabhängig von der verwende-
ten Schreibweise beginnt man bei der Darstel-
lung einer Peptidsequenz am N-Terminus, s.
Tabelle 5.
Aminoschutzgruppen
In Tabelle 6 sind die bei der Bachem gebräuch-
lichsten Schutzgruppen für die α-Aminogruppe
zusammengestellt. Sie werden mit unter-
schiedlichen Methoden abgespalten. Beispiele
für Nα-geschützte Aminosäurederivate:
Z-Leu-OH
Boc-Ala-OH
Fmoc-Phe-OH
Tabelle 5: Schreibweisen für Peptide
Schreibweise Erklärung
H-Gly-Leu-Ala-
Phe-OH
Bachem-Schreibweise,
hier sind N- und C-
Terminus leicht zu erken-
nen, beide sind „frei“, nicht
modifi ziert
Gly-Leu-Ala-
Phe
Endgruppen werden
nur explizit angegeben,
wenn sie nicht frei sind
GLAF 1-letter code, Endgrup-
pen werden nur explizit
angegeben, wenn sie
nicht frei sind
Glycyl-L-
leucyl-L-ala-
nyl-L-phenyl-
alanine
“ausgeschrieben”, vor
allem bei kürzeren
Peptiden üblich
Viele Boc- oder Z-Aminosäurederivate werden
als DCHA- oder CHA-Salze ((Di)cyclohexylam-
monium-Salze) angeboten. Salzbildung verbes-
sert die Lagerstabilität bei säureempfi ndlichen
Derivaten, denn auch eine Aminosäure ist eine
Säure, stärker als Essigsäure!. Manche Boc-
oder Z-Derivate sind Öle, sie lassen sich nur als
Salz in fester, kristalliner Form erhalten. Feste
Produkte lassen sich viel leichter handhaben
als Öle, z.B. beim Abwägen.
Benzyloxycarbonyl (Z oder Cbz) ist übrigens
die älteste brauchbare Nα-Schutzgruppe für
Aminosäuren (Bergmann & Zervas 1932). Die
Entwicklung von Z brachte den Beginn der
modernen Peptidsynthese, daher auch die
Abkürzung Z zu Ehren von Leonidas Zervas. Die
Z-Gruppe wird heute noch häufi g zum Schutz
der Aminogruppe, auch in der organischen
Synthese, benutzt.
Schutzgruppen für Carboxylgruppen
Im Gegensatz zur α-Aminogruppe muss die
endständige Säuregruppe während der ganzen
Peptidsynthese geschützt sein. Die gebräuch-
lichsten Schutzgruppen sind in Tabelle 7
zusammengestellt.
Beispiele für Ester von Aminosäuren:
H-Ala-OtBu · HCl
H-Val-OMe · HCl
H-Glu(OBzl)-OBzl · p-tosylate
Ester von Aminosäuren sind nur in Form ihrer
Salze mit starken Säuren wie Salzsäure (Hydro-
chloride) oder p-Toluolsulfonsäure (p-Tosylate)
lagerstabil. Diese Salze sind auch leichter in
kristalliner Form zu erhalten als die freien
Aminosäureester.
Die Wahl der Amino- und Carboxylschutzgrup-
pe hängt auch von der Synthesemethode ab.
Die beiden wichtigsten Methoden werden im
nächsten Kapitel vorgestellt. Bei der Festpha-
sensynthese (SPPS) ist die C-terminale Schutz-
gruppe ein unlösliches Polymer.
Seitenkettenschutzgruppen
Die Vielfältigkeit der Seitenketten der Amino-
säuren und ihre grosse Bedeutung für die Ei-
genschaften der Peptide wurde schon erwähnt.
Während der Peptidsynthese müssen manche
Seitenkettengruppen permanent geschützt
werden.
Schauen wir uns die 20 proteinogenen Amino-
säuren genauer an:
Einblicke in die Peptidchemie
16
Tabelle 8: Beispiele für Aminosäurederivate aus dem Katalog
Derivat Verwendung
Fmoc-Arg(Pbf)-OHStandardderivat von Arginin für die Fmoc SPPS, muss akti-
viert werden
Fmoc-Asn(Trt)-OPfp Standardderivat für die Fmoc-SPPS, schon aktiviert ("Ak-
tivester"), kann direkt eingesetzt werden
Z-Glu(OtBu)-OSu Derivat für die Lösungssynthese, schon aktiviert
Boc-Ser(tBu)-OHNUR für N-terminales Serin! Nα- und Seitenkettenschutz
werden unter den gleichen Bedingungen abgespalten
Tabelle 9: Gebräuchliche Seitenkettenschutzgruppen
Aminosäure Schutzgruppe Hauptsächliche Verwendung
Arg Pbf, Pmc Fmoc-SPPS
Arg (Salzbildung) Lösungssynthese
Asp, Glu OtBu Fmoc-SPPS, Lösungssynthese
Asp, Glu OBzl Lösungssynthese
Asn, Gln Trt, Mtt Fmoc-SPPS
Cys Trt Fmoc-SPPS, Lösungssynthese
Cys Acm SPPS, Lösungssynthese
His Trt Fmoc-SPPS
Lys Boc Fmoc-SPPS, Lösungssynthese
Lys Z Lösungssynthese
Ser tBu Fmoc-SPPS, Lösungssynthese
Ser Bzl Lösungssynthese
Thr, Tyr tBu Fmoc-SPPS
Trp Boc Fmoc-SPPS
Tabelle 6: Gebräuchliche temporäre Aminoschutzgruppen
Abk. Chemische Bezeichnung Spaltreagenz
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Piperidin
Boc t-Butoxycarbonyl Trifl uoressigsäure
Z Benzyloxycarbonyl katalytische Hydrierung
Wasserstoff / Palladium
Tabelle 7: Gebräuchliche permanente Säureschutzgruppen für den C-Terminus
und die Seitenketten von Asp und Glu
Abk. Chemische Bezeichnung Spaltreagenz
OtBu t-Butylester Trifl uoressigsäure
OBzl Benzylester katalytische Hydrierung
Wasserstoff / Palladium
OMe Methylester Basen
17
Tabelle 11: Methodenvergleich Lösungssynthese versus SPPS
Lösungssynthese Festphasensynthese (SPPS)
Reaktionsmedium Reaktionen in Lösung Gel
(gequollenes unlösliches Polymer)
Batchgrösse beliebig (vor allem gross) beliebig (auch sehr klein)
Schnelligkeit der Synthese langsam schnell
Automatisierung schwierig zu realisieren halbautomatisch oder kommerziell
erhältliche Vollautomaten
Synthesestrategie meistens konvergent* meistens stufenweise
temporäre Schutzgrupppe meistens Boc oder Z Fmoc (Fmoc-SPPS), Boc (Boc-SPPS)
Seitenkettenschutz Minimum Maximum
Materialverbrauch
(Aminosäurederivate)
mässig hoch
Optimierung möglich möglich
Reinigung + Analyse von
Zwischenstufen
üblich nicht möglich
Endreinigung relativ einfach aufwendig
*konvergente Synthese von längeren Peptiden: Zuerst werden mehrere Teilstücke synthetisiert, die am Schluss zum
Endprodukt zusammengesetzt werden. Konvergent geht es etwas schneller als stufenweise, denn man kann gleich-
zeitg mehrere Fragmente aufbauen. Auch die Kombination „SPPS der geschützten Fragmente, danach Kupplung in
Lösung“ ist möglich (z.B. Synthese von Enfuvirtid).
Tabelle 10: Bedeutung der Abkürzungen für die Seitenkettenschutzgruppen
Abkürzung Bedeutung Hauptsächliche Verwendung
Acm Acetamidomethyl Cys, Fmoc-SPPS, Lösungssynthese
Boc t-Butyloxycarbonyl Lys & Trp, Fmoc-SPPS
tBu t-Butyl Ser, Thr & Tyr, Fmoc-SPPS
Bzl Benzyl Ser (Thr, Tyr) Lösungssynthese
OtBu t-Butyl ester Asp & Glu, Fmoc-SPPS
OBzl Benzyl ester Asp & Glu, Lösungssynthese
Pbf 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl Arg, Fmoc-SPPS
Pmc 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl Arg, Fmoc-SPPS
Trt Trityl (Triphenylmethyl) Cys, His, Asn & Gln, Fmoc-SPPS
Z Benzyloxycarbonyl Lys, Lösungssynthese
Ala, Leu und Phe haben Seitenketten, die unter
den Bedingungen der Peptidsynthese nicht
reagieren. Ebenso Ile, Pro und Val.
Andere Seitenkettenfunktionen können wäh-
rend der Peptidsynthese modifi ziert werden,
wenn man sie nicht blockiert.
Die Carboxylgruppen von Asp und Glu und die
Aminogruppe von Lys können an der Kupplung
teilnehmen. Es ensteht ein Peptid mit einer fal-
schen Verknüpfung oder ein verzweigtes Peptid.
Andere Nebenreaktionen gibt es mit den Sei-
tenkettenfunktionen von
Cys
Ser, Thr, Tyr
Arg
His
Asn, Gln
Trp
Met (Schutz nur in Sonderfällen)
Einblicke in die Peptidchemie
18
Abb. 7: Synthesizer, Vollautomaten für die Festphasen-Peptidsynthese.
Das linke Bild zeigt Reaktoren, in denen gerade eine Synthese läuft.
• Lösungssynthese
(„Klassische Peptidsynthese“)
Gemeinsamkeiten und Unterschiede der beiden
Methoden sind in Tabelle 9 zusammengefasst.
Die meisten Peptide, die die Bachem anbietet
oder als Auftragssynthese herstellt, werden per
SPPS synthetisiert. Die Lösungssynthese wird
noch gewählt für die Synthese von einem Teil
unserer peptidischen Generika, von sehr kurzen
Peptiden (z.B. Dipeptide) und von am C-Termi-
nus modifi zierten Peptiden.
Die wesentliche Vorteile der Festphasensyn-
these gegenüber der Lösungssynthese sind ihre
Schnelligkeit und Automatisierbarkeit.
Allerdings gilt: Je grösser der Ansatz, umso
langsamer läuft die SPPS, da die „Handarbeit“
zunimmt.
Kleine und mittlere Peptidmengen können in
vollautomatischen “Synthesizern” hergestellt
werden (Abb. 7). Sehr grosse Mengen (mehrere
kg Rohpeptid) werden in Halbautomaten (nur
noch die Waschprogramme laufen automa-
tisch) oder manuell produziert.
Die Automatisierung ist möglich, weil das
Peptid stufenweise vom C-Terminus bis zum
N-Terminus aufgebaut wird. Man kuppelt eine
Aminosäure nach der anderen.
Vier Schritte wiederholen sich dabei immer
wieder:
Die Seitenkettenfunktionen von Lysin und Cys-
tein müssen während des Peptidaufbaus per-
manent blockiert sein, bei den anderen hängt
es von der Peptidsequenz und der Synthese-
methode ab, ob man dauerhaft schützt oder auf
eine Schutzgruppe verzichten kann.
Die gebräuchlichsten Seitenkettenschutz-
gruppen sind in Tabelle 9 zusammengestellt, in
Tabelle 10 sind die Abkürzungen erklärt.
Bei Lösungssynthesen müssen die Seiten-
ketten von Asn, Gln, His, Thr, Trp, und Tyr nicht
unbedingt geschützt werden. Beim Arg kann
die Salzbildung mit einer starken Säure wie HCl
genügen. Die Lösungssynthese stellt auch nicht
ganz so hohe Ansprüche an die Stabilität von
Schutzgruppen wie die SPPS.
Generell gilt:
Aminosäurederivate für die Peptidsynthese
sollten möglichst feinkristallin (keine amorphe
Masse oder Öl) und gut löslich sein. Die Fmoc-
Derivate sollten sich gut und schnell in DMF
(oder NMP) lösen, besonders wichtig ist dieser
Punkt bei der vollautomatisierten Fmoc-SPPS.
Methoden der Peptidsynthese
Wie schon erwähnt, gibt es 2 Standardmetho-
den der Peptidsynthese:
• Festphasensynthese
(Solid-Phase Peptide Synthesis, SPPS)
19
1. Abspalten der temporären Schutzgruppe
2. Auswaschen
3. Kuppeln der nächsten geschützten
Aminosäure
4. Auswaschen
Ein Nachteil der SPPS ist, dass erst am Ende
der Synthese, nachAbspaltung des Peptids
vom Harz, gereinigt werden kann. Das bedeutet
auch, dass während der Synthese am Harz kein
Fehler (z.B. Kuppeln der falschen Aminosäure)
passieren darf! Die Konsequenzen sind viel
schlimmer als bei Fehlern bei Lösungssyn-
thesen, bei denen man zuerst Teilsequenzen
aufbaut und diese am Ende zusammensetzt
(s.S. 17 und 21).
Als Trägermaterial (Harz) wird bei der SPPS
meistens vernetztes Polystyrol verwendet. Die-
ses erhält man in Form von feinen Kügelchen.
Bei der Bachem wird als Trägermaterial nur
mit 1% Divinylbenzol vernetztes Polystyrol
(polystyrene-co-1% divinylbenzene) verwendet
bzw. angeboten. Es stehen zwei Korngrössen
zur Auswahl:
200 - 400 mesh = 38 - 75 mm
100 - 200 mesh = 75 - 150 mm
(mesh: die bei der Polymerisation erzeugten Kü-
gelchen werden durch Aussieben in Fraktionen
einer gewissen Korngrösse aufgetrennt)
Die Polystyrol-Kügelchen sind dank der Vernet-
zung zwar in keinem Lösungsmittel löslich, aber
in manchen quellen sie auf zu einem Gel (s. Abb.
8). Erwünscht ist eine gute Quellung in Dime-
thylformamid (DMF) oder N-Methylpyrrolidon
(NMP), den Standardlösungsmitteln der SPPS.
Je besser die Quellung, desto gelartiger die
Kugeln, umso schneller laufen die Reaktionen
am Harz.
Man unterscheidet nach der Art der tem-
porären Nα-Schutzgruppe zwischen Fmoc-
und Boc-SPPS, ein Wechsel Fmoc <-> Boc
während der Synthese ist nicht möglich.
Boc- und Fmoc-SPPS unterscheiden sich
auch in der Auswahl der Seitenketten-
schutzgruppen.
Wegen ihrer immensen Bedeutung für die
Bachem soll hier nur die Fmoc-SPPS näher
besprochen werden. Sie hat sich gegenüber
der billigeren Boc-SPPS wegen der milde-
ren Reaktionsbedingungen und der daher
besseren Qualität des Rohpeptides nicht
nur bei der Bachem durchgesetzt.
Wang-Harz (4-Alkoxybenzyl alcohol resin)
und 2-Chlortrityl-Harz (2-chlorotrityl chlo-
ride resin) sind die gebräuchlichsten Harze
Tabelle 12: Schutzgruppen für die Fmoc-SPPS
Gruppe Schutzgruppe Spaltreagenz Stabil gegen
Nα Fmoc Piperidin Trifl uoressigsäure
Seitenketten Boc, tBu, OtBu,
Trt, Pbf
Trifl uoressigsäure
(spaltet auch vom Harz)
Piperidin
Abb. 9: Unvollständige Kupplung.
Die Farbe zeigt nicht umgesetzte Amino-
gruppen an.
Abb. 8: Gequollene Harzkügelchen unter
dem Mikroskop.
Einblicke in die Peptidchemie
20
Abb. 10: Synthese von H-3528 Ac-Asp-Arg-Gly-Asp-Ser-OH (Ac-DRGDS).
TBTU (Q-1665) ist ein gebräuchliches Kupplungsreagenz. Um die Fmoc-Aminosäure mit TBTU
zu aktivieren, muss man noch eine äquivalente Menge Base (DIPEA, Diisopropylethylamin)
dazugeben.
1. Piperidin/DMF
2. Waschritte
Abspaltung Fmoc
Piperidin muss komplett entfernt werden
3. Fmoc-Asp(OtBu)-OH
TBTU/DIPEA/DMF
4. Waschschritte
1. und 2. wie oben
werden im Überschuss eingesetzt
koplettes Auswaschen der Kupplungsreagentien
3. Fmoc-Gly-OH
TBTU/DIPEA/DMF
4. Waschschritte
1. und 2. wie oben
3. Fmoc-Arg(Pbf)-OH
TBTU/DIPEA/DMF
4. Waschschritte
1. und 2. wie oben
3. Fmoc-Asp(OtBu)-OH
TBTU/DIPEA/DMF
4. Waschschritte
1. und 2. wie oben
3. Acetanhydrid/Pyridin/DMF
4. Waschschritte
Endspaltung
95% TFA
Fmoc-Ser(tBu)-Wang-Resin
Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin
H-Ser(tBu)-Wang-Resin
Ac-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin
Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin
Fmoc-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin
Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin
H-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Wang-Resin
H-Asp-Arg-Gly-Asp-Ser-OH
Rohpeptid
21
für die Fmoc-SPPS von Peptiden mit freiem
C-Terminus. Das Beladen des Harzes mit
der carboxyterminalen Fmoc-Aminosäure
ist nicht so einfach, daher bietet die Ba-
chem eine grosse Auswahl von beladenen
Harzen an. Man spaltet die Fmoc-Gruppe
ab (nur bei Wang-Harz) und kuppelt die
nächste Fmoc-Aminosäure. Die Vollstän-
digkeit der Kupplung wird mit Farbtests be-
stimmt (positiv: freie Aminogruppen werden
“angefärbt”; negativ: farblos, da es keine
freien Aminogruppen mehr gibt). Abb. 9
zeigt, wie der Test bei einer unvollständigen
Kupplung unter dem Mikroskop aussieht.
Da das Peptid am Schluss der Synthese
mit Trifl uoressigsäure vom Harz gespalten
wird, müssen auch die Seitenkettenschutz-
gruppen gegen diese Säure labil sein. Die
verwendeten Schutzgruppen sind in Tabelle
12 zusammengefasst.
Abb. 10 gibt ein Beispiel für eine SPPS eines
sogenannten RGD-Peptides .
Möchte man ein C-terminales Peptidamid
synthetisieren, braucht man ein anderes
Harz als im Beispiel, z.B. Ramage-Harz
D-2200 oder Rink amide AM-resin D-1675.
Nach Abspaltung von Fmoc vom Harz kup-
pelt man die C-terminale Fmoc-Aminosäure
drauf und verfährt weiter wie oben be-
schrieben.
Harze wie 2-Chlorotrityl-Harz oder SASRIN
erlauben es, auch vollgeschützte Peptid-
fragmente zu synthetisieren.
Lösungssynthese
Eine Lösungssynthese muss sorgfältig
geplant werden. Für die Fmoc-SPPS gibt
es Standardprotokolle, nach denen die
Synthese der meisten Peptide gelingt (wenn
auch die Qualität des Rohpeptids schlecht
sein kann), für die Lösungssynthese nicht.
Nicht nur bei den möglichen Schutzgrup-
penkombinationen, sondern auch bei
den Kupplungsmethoden, verwendeten
Lösungsmitteln und Aufarbeitungsmetho-
den herrscht bei der Lösungssynthese die
grössere Vielfalt.
Nicht jede denkbare Schutzgruppenkom-
bination funktioniert. Hat man sich auf
eine α-Aminoschutzgruppe (Z, Boc, Fmoc...)
festgelegt, hat man damit auch die Aus-
wahl an Seitenkettenschutzgruppen stark
eingeschränkt, vor allem, wenn man sie
alle in einem Schritt am Ende der Synthese
abspalten möchte.
Die Schutzgruppenkombination Fmoc/tBu
Boc-Ala-OH + H-Ala-Pro-OBzl
Boc-Ala-Ala-Pro-OH
+ H-Arg-pNA . 2 HCl
(die Salzbildung wirkt auch
als Seitenkettenschutz)
H-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA · HCl
Reaktion mit
Bernsteinsäure-
anhydrid
Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA
(wird als Acetat verkauft)
1. Kupplung mit DCC
(ein Kupplungsreagenz)
2. Entfernung von Bzl (Hydrierung)
1. Kupplung mit DCC/Base
2. Abspaltung von Boc
(mit Salzsäure)
Abb. 11: Synthese von L-1720 Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA in Lösung.
Einblicke in die Peptidchemie
22
Abb. 12: Lösungssynthese, Kupplung mit Aktivester.
Boc-Ala-OSu + H-Glu(OBzl)-OBzl
Boc-Ala-Glu(OBzl)-OBzl
nicht wasserlöslich, löslich in
organischen Lösungsmitteln
HOSu
gut wasserlöslich
+
EXTRAKTION Abspaltung von Boc...
ist besonders effi zient und beliebt in der
SPPS, weil man die Gruppen selektiv und in
beliebiger Reihenfolge abspalten kann. Eine
vergleichbare Kombination in der Lösungs-
synthese ist Boc/Bzl bzw. Z/tBu, wie in
Tabelle 13 zusammengefasst.
Ein Beispiel für eine Lösungssynthese von
einem am C-Terminus modifi zierten Peptid,
ein sogenanntes Peptidsubstrat, fi ndet sich
in Abb. 11.
Das Beispiel zeigt auch den Nutzen des
Baukastenprinzips:
Das Fragment Boc-Ala-Ala-Pro-OH wird
auch in der Synthese von anderen Substra-
ten wie L-1180 (Boc-Ala-Ala-Pro-Ala-pNA)
und Inhibitoren wie N-1280 (MeOSuc-Ala-
Ala-Pro-Ala-chloromethylketone) verwen-
det.
Alle Zwischenstufen werden isoliert, cha-
rakterisiert und falls nötig gereinigt. Dies
kostet natürlich viel Zeit.
Man kann aber häufi g benötigte Fragmente
in grösseren Mengen auf Vorrat synthetisie-
ren und somit wieder Zeit sparen.
Peptide, die in Lösung synthetisiert worden
sind, werden oft per Gegenstromverteilung
(Counter-Current Distribution, CCD) gerei-
nigt. Mit dieser Methode kann man sehr
grosse Mengen aufs Mal reinigen, sie dient
aber meistens nur der Vorreinigung.
Im Beispiel wurde Boc als temporäre Nα-
Schutzgruppe verwendet. Generell werden
in der Lösungssynthese für den temporären
Schutz Boc oder Z eingesetzt.
Anstelle von einem Kupplungsreagenz
werden oft auch reaktive “Aktivester” von
geschützten Aminosäuren verwendet. In der
Lösungssynthese werden gerne Hydroxy-
succinimid-ester eingesetzt (Bachem: OSu,
Abb. 12).
Reinigung des Rohprodukts
Die Reiningung des Rohpeptids durch prä-
parative HPLC kann bei schlechter Qualität
sehr aufwendig werden. Speziell bei gro-
ssen Peptidmengen kann sich die Reinigung
Tabelle 13: Schutzgruppen für die Lösungssynthese
GruppeGruppe SchutzgruppeSchutzgruppe SpaltreagenzSpaltreagenz Stabil gegenStabil gegen
Nα Boc Trifl uoressigsäure katalytische Hyd-
rierung
Seitenketten
evtl. C-terminal
Bzl, OBzl, Z katalytische Hyd-
rierung
Trifl uoressigsäure*
Nα Z katalytische Hyd-
rierung
Trifl uoressigsäure*
Seitenketten
evtl. C-terminal
tBu, OtBu, Boc Trifl uoressigsäure katalytische Hyd-
rierung
C-terminal OMe** Basen TFA, katal. Hydrie-
rung
*nicht absolut stabil gegen Trifl uoressigsäure, aber genügend stabil für die Lösungssynthese. **der C-terminale Methylester wird häufi g bei mittleren Fragmenten eingesetzt. Bei Behand-
lung mit der Base Hydrazinhydrat erhält man aus dem Methylester das Hydrazid ( …-Xaa-
OMe → …Xaa-NHNH2). Dieses Derivat kann man „aktivieren“ (als Azid) und auf ein anderes
Fragment mit freiem N-Terminus kuppeln (“Azidkupplung”).
23
als Engpass erweisen.
Sowohl bei der CCD als auch bei der präp.
HPLC erhält man das gereinigte Peptid
als Lösung. Das Lösungsmittel wird auf
schonende Weise durch Gefriertrocknung
(Lyophilisation) entfernt und man erhält ge-
wöhnlich ein feines, weisses Pulver. Wasser
lässt sich praktisch nie komplett entfernen,
ist aber weder nötig noch sinnvoll.
Enthält ein Peptid basische Gruppen (N-
Terminus, Arg, Lys, His), bindet es Trifl u-
oressigsäure (per Fmoc-SPPS erhaltene
Peptide) oder Essigsäure als Salz. Diese
lässt sich nicht entfernen. Mit wenigen
Ausnahmen liegen unsere Katalogpeptide
als Trifl uoroacetate oder Acetate vor.
Disulfi dbrücken
Viele Peptide im Katalog haben den Zusatz
„Disulfi de bond“ im Namen. Eine solche
Bindung wird durch die Oxidation der
Thiolgruppen von zwei Cysteinen in der Pep-
tidkette gebildet. Bei der SPPS wird diese
Oxidation nach der Spaltung vom Harz, bei
der auch das Trt vom Cys abgespalten wird,
durchgeführt. Acm-Gruppen werden bei
gleichzeitiger Oxidation zur Disulfi dbrücke
mit Iod abgespalten.
Ein Peptid kann mehrere Disulfi dbrücken
enthalten. Disulfi dbrücken und die kor-
rekte Verknüpfung der Cysteinpaare (falls
es mehrere Brücken sind) sind äusserst
wichtig für die biologische Aktivität eines
Peptids. Peptide liegen nicht als langge-
streckte Ketten vor, sie bilden dreidimen-
sionale Strukturen, die durch Disulfi dbin-
dungen stabilisiert werden. Abb. 13 und 14
zeigen Beispiele.
• Eine Disulfi dbrücke enthalten:
z.B. Calcitonin, Somatostatin, Vasopres-
sin, Oxytocin (natürliche Peptidhormone);
Octreotide, Desmopressin (Hormonanaloge,
APIs)
• Mehrere Disulfi dbrücken fi nden sich in
z.B. in Endothelin (2), Conotoxin (3) GaTx1,
Hepcidin-25 (4) (Peptidhormone und Toxine)
• Zwei Peptidketten, durch Disulfi dbrücken
verbunden:
Insulin, Relaxine (Peptidhormone)
Abb. 13: omega-Conotoxin MVIIA.
Quelle: PDB 1OMG
Kohno, T., Kim, J. I., Kobayashi, K., Kodera, Y.,
Maeda, T. and Sato, K.
Three-dimensional structure in solution of
the calcium channel blocker omega-conoto-
xin MVIIA.
Biochemistry 34, 10256-10265 (1995)
Abb. 14: Humanes Relaxin (ein Hormon, hat
eine ähnliche Struktur wie Insulin).
Quelle: PDB 6RLX
Eigenbrot, C., Randal, M., Quan, C., Burnier, J.,
O‘Connell, L., Rinderknecht, E. and Kossia-
koff, A. A.
X-ray structure of human relaxin at 1.5 A.
Comparison to insulin and implications for
receptor binding determinants.
J. Mol. Biol. 221, 15-21 (1991)
Einblicke in die Peptidchemie
24
Analyse von Aminosäuren und Peptiden
Nach SPPS, Reinigung und Lyophilisation
hat man ein weisses Pulver erhalten. Dieses
muss jetzt in der Analytik (Quality Control,
QC) genauer untersucht werden, um Ant-
worten auf folgende Fragen zu fi nden:
• Ist es überhaupt das gewünschte Produkt?
• Wie sauber ist das Produkt?
• Welche Nebenprodukte enthält es?
• Wie hoch ist der Produktgehalt?
Unseren QC-Abteilungen steht ein grosses
Arsenal an Geräten und Methoden zur Ana-
Abb. 15:
QCRF und ADS von
Fmoc-Phe-OSu.
einem Aminosäure-
derivat.
lyse unserer Produkte zur Verfügung. Die
Wahl der analytischen Methoden hängt
auch davon ab, um was für ein Produkt es
sich handelt: Eine Aminosäure, ein sehr
kurzes Peptid oder ein Peptid. Manche
Analysen werden auch extern durchge-
führt.
Identität
Ist es das gewünschte Produkt?
Dann entspricht ein gemessener Wert
der Literaturangabe oder dem Wert der
mit einer Referenz erhalten wurde.
Abb. 16:
QCRF und ADS von
Octreotid, einem
Peptid, das von der
Bachem auch als
pharmazeutischer
Wirkstoff hergestellt
wird.
25
Zur Feststellung der Identität dienen:
• Schmelzpunkt
• Optischer Drehwert [a] (vgl. S.8)
• Der Rf-Wert wird mit Dünnschichtchroma-
tographie (DC oder TLC) bestimmt:
Rf-Wert = Quotient Laufstrecke des
Substanzfl ecks/Laufmittelfront. Er hängt
vom Laufmittel ab
(Rf immer <1)
• Koelution mit Referenz (DC):
Mischung Produkt mit Referenz gibt einen
Fleck (und nicht zwei)
• Das Molekulargewicht wird per Massen-
spektrometrie bestimmt.
• Die chemische Zusammensetzung der
Verbindung wird per Elementaranalyse
bestimmt:
Man bestimmt den Gehalt an Kohlenstoff,
Wasserstoff und Stickstoff und vergleicht
diesen mit den Werten, die sich aus der
Summenformel CxH
yN
zO
wS
v.. berechnen
lassen. Sauerstoff wird nur ausnahmsweise
bestimmt. Im Haus kann auch Schwefel
bestimmt werden.
• Spektroskopische Methoden:
IR-, NMR-, UV-Spektroskopie, bei Amino-
säurederivaten (keine Standardmethoden!)
• Koelution mit Referenz (analytische
HPLC):
Hauptsächlich bei Peptiden.
• Aminosäurezusammensetzung:
Aminosäureanalyse (AAA), das Peptid
wird mit starker Säure in die einzelnen
Aminosäuren gespalten, die resultierende
Mischung wird chromatographisch aufge-
trennt und die Aminosäuren quantifi ziert.
Die Korrektheit der Aminosäuresequenz
lässt sich mit dieser Methode nicht über-
prüfen.
Reinheit
Die Reinheit wird bestimmt per:
• Dünnschichtchromatographie (DC), bei
Aminosäurederivaten,
sehr kurzen Peptiden, Biochemikalien:
Die DC ist eine oft unterschätzte Methode!
Man kann auch Referenzmaterial von po-
tentiellen Verunreinigungen, z.B. die Edukte,
mitlaufen lassen und hat eine grosse Aus-
wahl an Detektionsmethoden.
• Analytische Hochdruckfl üssigkeitschro-
matographie (analytische HPLC oder die
schnellere Variante RSLC): Standardmetho-
de bei Peptiden
• “Optische Reinheit”: Gehalt am falschen
Enantiomer, (s.S. 7).
Ein wichtiger Wert bei Aminosäurederivaten
und beladenen Harzen.
Produktgehalt
Neben während der Synthese entstande-
nen Verunreinigungen enthalten unsere
Produkte oft auch geringe Mengen Rest-
lösungsmittel und/oder Wasser. Peptide
enthalten meistens auch Trifl uoressigsäure
oder Essigsäure, die fest als Salz gebunden
Abb. 17: Spezifi -
kationen für das
von der Bachem
angebotene Trip-
torelin Pamoat.
TRIPTORELIN ACETATE DMF
H-4075-GMP, 4008442
Triptorelin Acetate is a synthetic decapeptide LHRH agonist. Continuous administration results in a sustained decrease
of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) secretion followed by a marked reduction of testicular
and ovarian steroidogenesis. The suppressive effect on gonadal steroid concentrations is indicated for the treatment of
hormone-dependent prostate cancer, endometriosis, central precocious puberty, and assisted conception.
Amino acid sequence Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, acetate salt
International non-proprietary names Triptorelin Acetate (USAN)
Triptorelin (INN; BAN)
(D-Trp6)-LHRH, acetate salt
Molecular formula, relative molecular mass C64
H82
N18
O13
· C2H
4O
2
1311.5 (net) + 60.1 (acetate) = 1371.6 (1)
CAS-Number [140194-24-7]
Bachem regulatory documentation Drug Master File (CTD)
Tests Specifications
Appearance white to off-white powder
Appearance of solution clear, colorless to slightly colored solution in water
(10 mg/ml)
Identification by TLC complies
Identification by HPLC complies
Identification by amino acid analysis Arg 0.9 - 1.1 His 0.9 - 1.1 Ser 0.7 - 1.0
Glx 0.9 - 1.1 Leu 0.9 - 1.1 Trp detected
Gly 0.9 - 1.1 Pro 0.9 - 1.1 Tyr 0.9 - 1.1
Specific optical rotation [α]D
20 (1% in 1% acetic acid) = - 69.0 ± 3.0°
(corrected for net assay)
(1) Triptorelin Acetate exists essentially as the monoacetate equivalent to 4.4% acetic acid. The acetic acid is mainly bound to the arginine
residue and, to a lesser degree, bound to the histidine residue. Its level depends on the final freeze-drying process.
GENERIC APIsWater content by Karl Fischer titration ≤ 7.0%
Acetic acid content by HPLC 3.0 - 8.0%
Assay by HPLC 95.0 - 105.0%
(water- and acetic acid-free substance)
Related substances by HPLC ≤ 0.5% D-Ser4-Triptorelin
≤ 0.5% D-Tyr5-Triptorelin and
Triptorelin free acid (combined peak)
≤ 0.5% D-Leu7-Triptorelin
≤ 0.5% each individual unknown
report each individual unknown ≥ 0.10%
≤ 1.5% total
Heavy metals by ICP-MS ≤ 1 mg/kg palladium
Residual organic solvents by GC ≤ 880 mg/kg DMF
≤ 5000 mg/kg n-butanol
Bacterial endotoxins (Ph. Eur. 2.6.14, USP <85>) ≤ 10 IU/mg
Microbial limit test (Ph. Eur. 2.6.12, USP <61>)
Total aerobic microbial count (TAMC)
Total yeasts and moulds count (TYMC)
≤ 103 CFU/g (0.5 g tested)
≤ 102 CFU/g (0.5 g tested)
Further Information
Additional solubility information 1% in water: clear, colorless solution
5% in water: clear, colorless solution
1% in 1% acetic acid: clear, colorless solution
5% in 1% acetic acid: clear, colorless solution
1% in PBS-buffer pH 7.2: not soluble
5% in PBS-buffer pH 7.2: not soluble
Handling and storage The product remains stable for at least 36 months when stored at
≤ -15°C or 2-8°C. Prolonged exposure to elevated temperatures
(> 25°C) and light should be avoided.
Active substance Triptorelin Acetate is a synthetic decapeptide analog of lutein-
izing hormone-releasing hormone (LHRH or GnRH) with a higher
potency than the naturally occurring LHRH.
Continuous administration of Triptorelin Acetate results, after a
short initial stimulation, in a sustained decrease in luteinizing hor-
mone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) secretion with
a consequent reduction of ovarian and testicular steroidogenesis.
These effects are usually reversible after cessation of therapy.
Fields of application
Treatment of prostate carcinoma Administration of Triptorelin Acetate leads to suppression of go-
nadotropins and a subsequent fall in peripheral circulating levels
of testosterone and dihydrotestosterone in male. In hormone-
dependent prostate carcinoma, a tumor remission or retardation
of tumor progression is frequently observed after treatment with
Triptorelin Acetate. This is accompanied by an improvement of
function and objective symptoms.
Management of endometriosis Continued administration of Triptorelin Acetate suppresses
estrogen secretion which results in a shrinking of the uterine and
ectopic endometrial tissue and in the relief from the symptoms of
abdominal pain, dysmenorrhoea, and menorrhagia.
Treatment of central precocious puberty Triptorelin Acetate reduces the premature stimulation of gonado-
tropin secretion in children with central precocious puberty and
allows normal physiological growth and development. Normal pu-
bertal development is resumed after discontinuation of Triptorelin
Acetate therapy.
Einblicke in die Peptidchemie
26
ist. Diese Verbindungen werden mit den
Methoden, mit denen man die Reinheit des
gewünschten Produkts bestimmt, nicht
erfasst. Um z.B. einen Reaktionsansatz
zu berechnen, müssen Parameter wie der
Wassergehalt bekannt sein.
• Wassergehalt: Bestimmung mit Karl-
Fischer-Titration (KF-Titration).
• Restlösungsmittel: Bestimmung per Gas-
chromatographie.
• Essigsäuregehalt: Mit HPLC oder Ionen-
chromatographie.
• Rest-TFA, bei unseren API-Peptiden, die
als Acetat verkauft werden: per Ionenchro-
matographie
• Titration mit Säure- oder Basenlösungen:
Bei Produkten, die Basen oder Säuren sind.
• Halogenidbestimmung: Der Chlorid- oder
Bromidgehalt kann bei Produkten, die als
die entsprechenden Salze verkauft werden,
per Titration mit Silbernitratlösung be-
stimmt werden.
• Stickstoffgehalt (aus Elementaranayse):
Dieser ist bei Peptiden ein Mass für den
Peptidgehalt.
Die Ergebnisse der Analysen werden auf
dem QCRF (Quality Control Release Form),
welches nur für den internen Gebrauch
bestimmt ist, hinterlegt. Eine Auswahl der
erhaltenen Ergebnisse fi ndet sich auf dem
ADS (Analytical Data Sheet) das den Kun-
den, die das Produkt kaufen, zur Verfügung
steht (s. Abb. 15 und 16).
Bei GMP-Produkten kommen auch noch
mikrobiologische Analysen dazu, die bei
der Bachem in einem spezialisierten Labor
durchgeführt werden (s.Abb. 17)
Bei vielen unserer Generika sind die durch-
zuführenden Analysen durch die Europä-
ische Pharmakopöe* vorgeschrieben. Das
Pharm. Eur. im Namen bedeutet, dass die
Wirkstoffe den Spezifi kationen der Phar-
makopöe entsprechen. z.B. Deslorelin High
Acetate Pharm. Eur.
Modifi zierung von Peptiden
Die Modifi kation eines Peptides bedeutet
eine bleibende chemische Veränderung des
Moleküls, im Gegensatz zu den Schutzgrup-
pen, die nach der Synthese wieder abge-
spalten werden.
Peptide können auf verschiedenste Weise
modifi ziert werden.
Auch in der Natur fi ndet man eine grosse
Anzahl von Peptid/Proteinmodifi kationen.
Einige sind wichtig für die Bioaktivität oder
die Funktion des Moleküls (z.B. Pro im
Kollagen wird enzymatisch zu Hydroxyprolin
oxidiert; Seitenketten-Phosphorylierung
von Ser, Thr oder Tyr), andere sind “uner-
wünscht”, sogar Indikatoren für pathologi-
sche Prozesse.
Modifi kationen wie N-terminale Acety-
lierung oder Pyroglutaminbildung und
C-terminale Amidierung dienen auch in
der Natur zur Stabilisierung von Peptiden.
“Blockierte” Peptide werden weniger schnell
enzymatisch abgebaut.
Natürliche Peptidhormone sind häufi g an
den Endgruppen modifi ziert, z.B. Gona-
dorelin, TRH. Die C-terminale Amidgruppe
wird durch enzymatischen Abbau von einem
Glycinrest erhalten, ein anderes Enzym
katalysiert die Zyklisierung von Gln zu Pyr:
H-Gln-Xaa-Yaa-…-Zaa-Gly-OH
→ Pyr-Xaa-Yaa-…-Zaa-NH2
Da die Oxidation von Methionin (s.S.11) in
Peptiden häufi g zur Deaktivierung führt,
werden biologisch aktive Peptide durch den
Ersatz von Met durch das analog gebau-
te, aber nicht oxidierbare Norleucin (Nle)
stabilisiert.
Chemische Modifi kationen erlauben auch,
die räumliche Struktur eines Peptids zu
fi xieren oder zu verändern.
Bei der chemischen Synthese von Peptiden
hat man viele Möglichkeiten zur Modifi zie-
rung. Der N-Terminus lässt sich am ein-
fachsten verändern. Es braucht nur einen
zusätzlichen Schritt bei der SPPS.
Wichtige N-terminale Modifi kationen:
• Acetylierung
*Eine Pharmakopöe (Arzneimittelbuch) ist eine Zusammenstellung anerkannter pharmazeutischer Regeln über
die Qualität, Prüfung, Lagerung und Bezeichnung von Arzneimitteln und die bei ihrer Herstellung und Prüfung
verwendeten Stoffe, Materialien und Methoden. In der Schweiz gilt die Europäische Pharmakopöe.
• Biotinylierung - Biotin (= Vitamin B7)
(Im Katalog lassen sich viele Beispiele für
acetylierte und biotinylierte Peptide fi nden.)
Biotinylierte Peptide binden spezifi sch an
das Protein Avidin.
• “Fluorophore” - Mca, Abz, FITC
(Die modifi zierten Peptide fl uoreszieren und
sind in geringsten Mengen detektierbar.)
Auch die Seitenketten von Cys und Lys las-
sen sich leicht modifi zieren, hierfür fi nden
sich einige Beispiele im Katalog.
H-Lys(biotinyl)-Lys-Glu-Asp-Val-Val-Abu-
Cys-Ser-Abu-Ser-Tyr-Lys-Lys-NH2 (M-2130)
Das “Rückgrat” des Peptids lässt sich durch
Einbau von speziellen Aminosäuren verän-
dern:
• D-Aminosäuren
• N-Methyl-Aminosäuren
• Nicht-proteinogene Aminosäuren
(“unusual amino acids”)
• Ersatz der Peptidbindung durch andere
Bindungen (z.B. “reduzierte Peptide“)
• Ringschluss, z.B. Disulfi dbrücke (s.S.23)
Peptidamide, die wichtigste Modifi kation
der endständigen Carboxylgruppe, sind
leicht zugänglich per SPPS. Man syntheti-
siert sie auf einem der speziell dafür entwi-
ckelten Harze wie “Ramage-Harz” (D-2200).
Für andere C-terminale Modifi kationen
braucht es viel Aufwand.
Ein Beispiel für Modifi kationen:
natürliches Peptid
Leu-Enkephalin (H-2740)
H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH
leicht modifi ziert
(3,5-Dibromo-Tyr1)-Leu-Enkephalin
(H-2575)
H-3,5-Dibromo-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH
Leu-Enkephalin amide (H-2745)
H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NH2
stark modifi ziert
DAMGO (H-2535)
H-Tyr-D-Ala-Gly-N-Me-Phe-glycinol
(D-Pen2,p-chloro-Phe4,D-Pen5)-Enkephalin
(H-8875)
H-Tyr-D-Pen-Gly-p-chloro-Phe-D-Pen-OH
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