VPLIV RAZLIČNIH PROBIOTIKOV NA RAST IN PREŽIVETJE … filevzorce smo inkubirali tri dni. Izvedli...

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA ZDRAVSTVENE VEDE

VPLIV RAZLIČNIH PROBIOTIKOV NA RAST

IN PREŽIVETJE BAKTERIJE

Escherichia coli V MLEKU

(Magistrsko delo)

Maribor, 2017 Dunja Šulc

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA ZDRAVSTVENE VEDE

Mentor: izr. prof. dr. Sabina Fijan, univ. dipl. inž. kem. tehnol.

Somentor: viš. znanst. sod. dr. Andrej Steyer, univ. dipl.

mikrobiol.

iii

Zahvala

Zahvaljujem se mentorici, izr. prof. dr. Sabini Fijan in somentorju, viš. znanst. sod.

dr. Andreju Steyerju, za strokovno pomoč in usmerjanje pri raziskovalnem delu, za

neizmeren trud, vse nasvete in vzpodbudne besede.

Hvala vsem, ki ste verjeli vame.

iv

Izvleček

Izhodišča: Probiotiki so živi mikroorganizmi, ki dokazano pozitivno učinkujejo na

zdravje gostitelja, če jih zaužije v zadostnih količinah. Najpogostejše probiotične

bakterije so iz rodu Lactobacillus ter Bifidobacterium, uporabljajo pa se tudi

probiotični sevi drugih vrst bakterij in nekatere kvasovke. Univerzalni probiotik ne

obstaja, probiotični sevi imajo različne mehanizme delovanja in opravljajo specifične

naloge. Na trgu je dostopnih vedno več probiotičnih izdelkov, predvsem v obliki

prehranskih dopolnil. Zaradi potrošniške industrije moramo biti pozorni, da za

probiotike štejemo zgolj izdelke, ki so analizirani in vsebujejo probiotične seve,

katerih učinke potrjujejo klinične raziskave.

Metodologija: V magistrskem delu smo preverili vpliv različnih probiotikov na rast

in preživetje bakterije Escherichia coli v mleku. Vzorci so vsebovali 10 mL mleka,

različne seve bakterije E. coli ter 1 mL suspenzije različnih probiotikov. Pripravljene

vzorce smo inkubirali tri dni. Izvedli smo tudi metodo agar spot.

Rezultati: Ugotovili smo, da so probiotiki znižali koncentracije patogenih sevov E.

coli po treh dneh inkubacije v mleku v povprečju za 1 log10 stopnjo. Rezultati z

metodo agar spot kažejo drugače, saj ponekod nismo zasledili protimikrobnega

učinka. Najšibkejše inhibicije patogenih sevov E. coli ugotavljamo v primerih

probiotikov, ki vsebujejo monokulture probiotičnih sevov.

Sklep: Glede na rezultate lahko povzamemo, da so bili probiotiki pri učinkovanju z

določenimi patogenimi sevi različno učinkoviti. V nobenem primeru probiotik ni

popolnoma inhibiral rasti sevov E. coli po treh dneh inkubacije v mleku, temveč le

zmanjšal njihovo rast.

Ključne besede: probiotiki, pozitivni učinki probiotikov, Escherichia coli, klasične

gojitvene metode štetja mikroorganizmov, PCR, metoda agar spot.

v

Influence of various probiotics on the survival and growth of Escherichia coli in

milk.

Abstract

Introduction: Probiotics are live microorganisms with proven benefits for the host's

health when consumed in required amounts. The most common probiotic bacteria are

Lactobacillus and Bifidobacterium species, while probiotic strains of other types of

bacteria and some yeasts are also used. There is no universal probiotic, probiotic

strains have different function mechanisms and execute specific tasks. The market

offers ever more probiotic products, especially in the form of supplements. The

consumer industry can be treacherous, therefore, we must pay attention and consider

as probiotics only the products that have been analysed and contain probiotic strains

with clinically-proven effects.

Methodology: This master thesis investigates the influence of various probiotics on

the growth and survival of the bacteria Escherichia coli in milk. The samples

contained 10 mL of milk, different strains of E. coli and 1 mL suspension of various

probiotics. The samples were incubated for 3 days.

Results: The findings show that the probiotics lowered the concentration of the

pathogenic strains of E. coli after three days of incubation in milk on average by 1

log10 step. The results using the agar spot method gave different data, since there was

no antimicrobial effect in some probiotics containing the monocultures of probiotic

microorganisms.

Conclusion: Based on different data we can conclude that the probiotics showed to

have a different antagonistic effect against various pathogenic strains of E. coli.

None of the probiotics fully inhibited E. coli, but only decreased its growth.

Keywords: probiotics, the effects of probiotics, Escherichia coli, classical

incubating methods, PCR, agar spot test.

vi

KAZALO

IZVLEČEK ............................................................................................ IV

ABSTRACT ............................................................................................ V

KAZALO ............................................................................................... VI

SEZNAM TABEL ............................................................................. VIII

1 UVOD IN OPIS PROBLEMA ......................................................... 1

1.1 Namen magistrskega dela ............................................................. 4

1.2 Cilji magistrskega dela ................................................................. 4

2 TEORETIČNI DEL .......................................................................... 5

2.1 Črevesna mikrobiota ..................................................................... 5

2.1.1 Mikrobno ravnovesje .............................................................. 6

2.2 Probiotiki ...................................................................................... 7

2.2.1 Pozitivni učinki probiotikov ................................................... 8

2.2.2 Probiotiki in problem trga ................................................... 10

2.2.3 Mikrobiološke analize izdelkov ............................................ 13

2.3 Escherichia coli .......................................................................... 14

2.3.1 Različni sevi in patotipi E. coli ............................................ 16

3 EMPIRIČNI DEL ........................................................................... 20

3.1 Raziskovalna vprašanja .............................................................. 20

3.2 Metodologija ............................................................................... 20

3.2.1 Raziskovalne metode ............................................................ 20

3.2.2 Metoda agar spot ................................................................. 22

3.2.3 Inkubacija probiotikov in različnih sevov E. coli v mleku ... 22

3.2.4 Identifikacija DNA E. coli z molekularno metodo PCR ....... 23

3.3 Raziskovalni vzorec .................................................................... 25

3.4 Postopki zbiranja podatkov ........................................................ 26

4 REZULTATI VPLIVA PROBIOTIKOV NA RAST IN

PREŽIVETJE E. COLI ........................................................................ 27

4.1 Antimikrobni učinek probiotikov z metodo agar spot ............... 27

vii

4.2 Štetje E. coli po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez

dodanega probiotika............................................................................. 29

4.3 Identifikacija DNA E. coli s pomočjo molekularne metode PCR

47

5 INTERPRETACIJA IN RAZPRAVA .......................................... 50

6 SKLEP ............................................................................................. 55

7 LITERATURA ................................................................................ 57

viii

SEZNAM TABEL

Tabela 1: Program PCR za E. coli ............................................................................. 23 Tabela 2: Deklarirane probiotične baterije v raziskovanih probiotičnih izdelkih ...... 25 Tabela 3: Merila razponov inhibicijske cone za ocenjevanje antimikrobnega učinka

probiotikov ......................................................................................................... 27

Tabela 4: Antimikrobni učinek probiotikov proti različnim sevom in patotipom E.coli

z metodo agar spot ............................................................................................. 28 Tabela 5: Štetje E. coli na agarju MacConkey po tridnevni inkubaciji na sobni

temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 1 ...................................... 29 Tabela 6: Štetje Probiotika 1 na agarjih MRS, PCA, KAZ po tridnevni inkubaciji v

mleku, z ali brez dodane E. coli ......................................................................... 30

Tabela 7: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni

temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 2 ...................................... 31 Tabela 8: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 2) na MRS, PCA, KAZ

agarjih po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli .................... 32 Tabela 9: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni



temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 4 ...................................... 35

Tabela 12: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 4) na MRS, PCA, KAZ

agarjih po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli .................... 36

Tabela 13: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni


Tabela 14: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 5) na MYP in PCA




agarjih po tridnevni inkubaciji mleku, z ali brez dodane E. coli ....................... 40 Tabela 17: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni

temperaturi v mleku, z ali brez dodanega probiotika 7 ...................................... 41 Tabela 18: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 7) na MRS in PCA






agarjih po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli .................... 46

Šulc, D. Vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje bakterije Escherichia coli v

mleku, 2017.

1

1 Uvod in opis problema

Probiotiki so živi mikroorganizmi, ki dokazano pozitivno učinkujejo na zdravje

gostitelja, če jih zaužije v zadostnih količinah. Uradno definicijo o probiotikih sta

sprejeli Organizacija za prehrano in kmetijstvo Združenih narodov (Food and

Agriculture Organization of the United Nations [FAO]) in Svetovna zdravstvena

organizacija (World Health Organization [WHO]) (FAO/WHO, 2002).

Najpogostejše probiotične bakterije so točno določeni sevi mlečnokislinskih bakterij

iz rodu Lactobacillus in določeni sevi bakterij iz rodu Bifidobacterium, uporabljajo

pa se tudi sevi drugih vrst bakterij in nekatere kvasovke (Fijan, 2014; Didari, Solki,

Mozaffari, Nikfar, & Abdollahi, 2014; Jiang, et al., 2014). Laktobacili veljajo za

varne bakterije, ki jih človek že tisočletja uživa skupaj s fermentirano hrano (Rogelj,

2009). Status GRAS (Generally Recognized as Safe) imajo tudi bifidobakterije, ki jih

že kar tradicionalno opisujemo skupaj z mlečnokislinskimi bakterijami, čeprav so

filogenetsko precej oddaljene od njih (Biavati, B., & Mattarelli, P., 2006).

Pomembno je razumeti, da vsi laktobacili in bifidobakterije niso probiotiki.

Probiotične bakterije so natančno preučene bakterije s posebnimi, samo zanje

značilnimi lastnostmi (Rogelj, 2009). Probiotični sevi morajo biti odporni proti

želodčnemu soku in žolčnim kislinam, da preživijo prehod skozi prebavila. V

spodnjem predelu črevesja se namnožijo in blagodejno učinkujejo na zdravje (Elmer,

et al., 2007; Fijan, 2014). Vrsta kakovostnih kliničnih raziskav mora potrditi

pozitivni učinek točno določenega seva na zdravje, da se lahko imenuje probiotik

(FAO/WHO, 2002, Rogelj, 2014).

Predstavniki laktobacilov in bifidobakterij so naravni člani zdrave mikrobiote

prebavil (Gomes, et al., 2010). Številni dejavniki lahko porušijo mikrobno

ravnovesje, kar pripelje do prevlade patogenih mikroorganizmov in povzroči

preobrat iz koristnega v škodljivo delovanje. Zunanja podpora s probiotiki v takšnih

primerih pripomore k ponovni vzpostavitvi ravnovesja črevesne mikrobiote (Fijan,

2014; Pavčič, & Vitezić, 2001).


mleku, 2017.

2

Najpogosteje probiotičnim bakterijskim kulturam pripisujejo naslednje pozitivne

učinke: skrajšanje trajanja infekcijske driske (zlasti pri otrocih), preprečevanje

driske, povezane z jemanjem antibiotikov, preprečevanje driske, povezane z

bakterijo Clostridium difficile, vzdrževanje remisije pri ulceroznem kolitisu,

preprečevanje obolevnosti za nekrotizirajočim enterokolitisom, preprečevanje

atopijskega dermatitisa pri dojenčkih, zmanjšanje pogostosti okužb (na primer blagih

virusnih enteritisov) ter izboljšanje imunosti (Sanders, 2014). Zmotno je mišljenje,

da ima ena probiotična bakterija vse zgoraj naštete ugodne učinke. Probiotične

bakterije se med seboj razlikujejo, prav tako se razlikujejo njihovi mehanizmi

delovanja (Rogelj, 2009).

Na trgu so probiotiki na voljo v obliki funkcionalnih živil, prehranskih dopolnil in

zdravil brez recepta (Bogovič Matijašić, Zorič Peternel, & Rogelj, 2010). Zaradi

potrošniške industrije moramo biti pozorni, da za probiotike štejemo zgolj izdelke, ki

so analizirani in vsebujejo seve, katerih pozitivni učinki so že bili dokazani in jih

potrjujejo klinične znanstvene raziskave (Bereswill, et al., 2013; Cao, et al., 2013;

Choi, et al., 2011; Hempel, et al., 2012; Li, Rosito, & Slagle, 2013; Mehta, Arya,

Goyal, Singh, & Sharma, 2013; Savard, et al., 2011; Zelaya, et al., 2014).

Escherichia coli (E. coli) je po Gramu negativna bakterija paličaste oblike.

Najpogosteje jo najdemo kot del normalne črevesne mikrobiote ljudi in toplokrvnih

živali (Palaniappan, et al., 2006). Čeprav je večinoma komenzalna bakterija in

človeku neposredno ne škoduje, so nekateri njeni sevi za človeka zelo škodljivi

(Todar, 2008). Patogenost E. coli je povezana z določeno kombinacijo virulentnih

genov (Trkov, et. al, 2012). Glede na prisotnost različnih virulentnih dejavnikov in

na podlagi povzročanja podobnih bolezenskih simptomov in stanj, jih razvrstimo v

različne patotipe (Centers for Disease Control and Prevention [CDC], 2014).


mleku, 2017.

3

Po drugi strani pa obstaja tudi probiotični sev E. coli Nissle 1917 (EcN), ki nima

nobenih virulentnih dejavnikov. EcN lahko pozitivno vpliva na mehanizme

modulacije imunskega sistema, krepitev črevesne pregrade, ohranja stanje remisije

pri ulceroznem kolitisu ter deluje zaviralno proti drugim patogenim sevom E. coli

(Scaldaferri, et al., 2016; Sonnenborn, & Schulze, 2009; Sturm, et al., 2005).

V magistrskem delu smo raziskovali vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje

bakterije E. coli v mleku. Za primerjavo rezultatov smo antimikrobni učinek

probiotikov ugotavljali tudi z metodo agar spot. Dokazovanje E. coli v združbah z

različnimi probiotiki smo izvedli z molekularno metodo PCR.


mleku, 2017.

4

1.1 Namen magistrskega dela

Namen magistrskega dela je predstavitev vpliva različnih probiotikov na rast in

preživetje potencialno patogene bakterije E. coli po 72 urni inkubaciji v mleku. V

raziskavo smo vključili več različnih probiotičnih prehranskih dopolnil ter

probiotični zdravili, katerih imena smo izpustili, da bi omogočili nepristranskost

raziskave. Naredili smo pregled probiotičnih sevov, ki jih vsebujejo izbrani

probiotiki. Pri analizi smo uporabili različne klinične izolate E. coli, ki pripadajo

različnim patotipom, referenčni sev E. coli K12 in probiotični sev EcN.

Protimikrobni učinek probiotikov smo ugotavljali s klasično gojitveno metodo na

selektivnih gojiščih ter z metodo agar spot za primerjavo dobljenih rezultatov.

Identifikacijo DNA E. coli v združbah z različnimi probiotiki smo opravili z

molekularno metodo PCR. V teoretičnem delu smo predstavili pozitivne učinke

probiotikov na človeka in njihove mehanizme delovanja, značilnosti bakterije E. coli,

opisali patotipe ter izpostavili probiotični sev EcN.

1.2 Cilji magistrskega dela

Cilji v teoretičnem delu so:

- opisati pozitivne učinke probiotikov na človeka, predstaviti lastnosti

probiotičnih mikroorganizmov in različne mehanizme delovanja,

- predstaviti lastnosti bakterije E. coli, opisati razvrščanje v različne patotipe,

predstaviti probiotični sev EcN ter poiskati osnovo za probiotično naravo

seva v genetskem zapisu.

Cilji empirične raziskave so:

- ugotoviti vpliv probiotikov na rast in razmnoževanje potencialno patogenih

sevov bakterije E. coli v mleku,

- spoznati različne metode za ugotavljanje protimikrobnega učinka probiotikov

(klasične gojitvene metode štetja mikroorganizmov, metodo agar spot),

molekularno metodo PCR za identifikacijo izbranih vrst mikroorganizmov v

vzorcu.


mleku, 2017.

5

2 Teoretični del

2.1 Črevesna mikrobiota

Mikroorganizmi v našem črevesju so povezani v kompleksno skupnost, ki ji pravimo

mikrobiota (Sanders, 2014). Strokovnjaki ocenjujejo, da je v prebavilih odraslega

človeka do 100 bilijonov mikroorganizmov (Elmer, McFarland, & McFarland, 2007;

Fijan, & Šostar Turk, 2013; Rogelj, 2009). Število mikroorganizmov v prebavilih za

več kot desetkrat presega število človeku lastnih celic (Fijan, & Šostar Turk, 2013;

Sanders, 2014; Weizman, 2014).

Mikrobiota prebavil je eden izmed najbolj kompleksnih mikrobnih ekosistemov, ki

jih poznamo, saj jo sestavlja več sto različnih vrst, med katerimi številčno

prevladujejo vrste rodov Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Clostridium,

Lactobacillus, Fusobacterium in različni po Gramu pozitivni koki. V manjšem

številu so zastopane tudi vrste rodu Enterococcus (Rogelj, 2014). Porazdelitev

mikrobiote v prebavilih je v posameznih predelih zelo raznolika. Število

mikroorganizmov narašča vzdolž prebavne poti (Fijan, & Šostar Turk, 2013).

Količina mikroorganizmov je najmanjša v želodcu (103 do 10

5 bakterij/g vsebine),

največja pa v debelem črevesu (108 do 10

10 bakterij/g vsebine), zlasti v danki (10

11

bakterij/g vsebine) (Seme, 2002). Premalo se zavedamo, da je takšnih bakterij, ki

nam škodujejo malo v primerjavi s številom tistih, ki nam pomagajo živeti in

preživeti. Prebavni trakt deluje v simbiozi s številnimi bakterijami in drugimi

mikroorganizmi. V normalnih pogojih stabilnega delovanja prebavil prevladujejo

nevtralni in zdravju koristni mikroorganizmi, v manjšini so zastopane potencialno

patogene bakterije (Elmer, et al., 2007; Fijan, & Šostar Turk, 2013). Črevesna

mikrobiota ima precej večji vpliv na razvoj številnih bolezni, kot smo mislili doslej

(Rogelj, 2014; Weizman, 2014). Delovanje vseh organov je povezano s prebavnim

sistemom, ki se začne z ustno votlino in konča z anusom (Dragaš, 2010).


mleku, 2017.

6

2.1.1 Mikrobno ravnovesje

Normalna mikrobiota, kjer vlada mikrobno ravnovesje, ima za človeka pomembne

funkcije pri prebavi hrane, proizvodnji vitaminov, spodbujanju imunskega odziva,

preprečevanju razvoja patogenih bakterij. Črevesna sluz in epitel sta pomembna

zaščita pred antigeni iz hrane in mikroorganizmi, ki pridejo v organizem iz okolja.

To predstavlja prvo obrambo gostitelja, ki je usmerjena v regulacijo antigensko

specifičnih imunskih odzivov (Rogelj, 2009).

Ravnovesje mikrobiote se imenuje evbioza. Nasprotno je stanje disbioze. Izraz

disbioza je vpeljal ruski znanstvenik, imunolog Ilya Metchnikoff (1845-1916), ko je

pri svojih raziskavah želel opisati spremenjene patogene bakterije v črevesju

(Walker, & Lawley, 2012). Disbioza je stanje, ko sicer komenzalne črevesne

bakterije povzročajo škodljive učinke zaradi sprememb v črevesni mikrobioti

(Holzapfel, W. H., Haberer, P., Snel, J., Schillinger, U., & Huis in't Veld, J. H., 1998;

Weizman, 2014). Ravnovesje mikrobiote lahko porušijo različni dejavniki, kot so

vsakodnevni stres, staranje, sprememba okolja ali sprememba prehranskih navad,

okužbe, različne bolezni, zdravljenje z antibiotiki, pooperativna stanja in obsevalno

zdravljenje (Elmer, et al., 2007; Rogelj, 2009; Pavčič, & Vitezič, 2001; Weizman,

2014). Na primer, antibiotiki uničijo bakterije, ki so povzročiteljice bolezni, hkrati pa

lahko uničijo nepatogene bakterije in povzročijo disbiozo. Človek je lahko po

prenehanju zdravljenja z antibiotikom izpostavljen invaziji druge patogene bakterije.

V primeru hospitalizacije je tveganje za razvoj nove bolezni v stanju porušene

mikrobiote večje (Elmer, et al., 2007). Ko je mikrobno ravnotežje porušeno, kar

povzroči preobrat iz koristnega v škodljivo delovanje, je zunanja podpora s

probiotiki zelo dobrodošla (Elmer, et al., 2007; Fijan, 2014; Fijan, & Šostar Turk,

2013). Disbiozo so povezali s patogenezo številnih kliničnih motenj. Največ

podatkov izvira iz raziskav, pri katerih so obravnavali vnetne črevesne bolezni

(Weizman, 2014).


mleku, 2017.

7

2.2 Probiotiki

Etimološko je izraz probiotik sestavljen iz latinskega predloga pro (za) in grškega

pridevnika biotik, ki izhaja iz samostalnika bios (življenje) (Elmer, et al., 2007; Fijan,

& Šostar Turk, 2013; Gomes, Pintado, & Malcata, 2010; Rogelj, 2014). Uradno

definicijo o probiotikih sta sprejeli Organizacija za prehrano in kmetijstvo Združenih

narodov ter Svetovna zdravstvena organizacija (FAO/WHO, 2002; Fijan, & Šostar

Turk, 2013; Rogelj, 2014). Probiotike definiramo kot žive mikroorganizme, ki

ugodno vplivajo na zdravje gostitelja, če jih zaužije v zadovoljivi količini

(FAO/WHO, 2002; Fijan, 2014; Gomes, et al., 2010; Jiang, et al., 2014; Sonnenborn,

& Schulze, 2009).

Koristne mikroorganizme so s fermentirano hrano uživali že pred tisočletji, vendar

pa spoznanja, ki bakterije povezujejo z ugodnimi učinki na zdravje, segajo v začetek

dvajsetega stoletja. V splošnem mnenju se je koncept probiotikov začel z Nobelovim

nagrajencem Ilyo Ilyichom Metchnikoffom (1845–1916), ki je velik del svojih

raziskav namenil vlogi zdravega črevesja za dolgo življenje (Rogelj, 2014).

Najpogostejše probiotične bakterije so točno določeni sevi mlečnokislinskih bakterij

iz rodu Lactobacillus in določeni sevi bakterij iz rodu Bifidobacterium, uporabljajo

pa se tudi sevi drugih bakterij (Lactococcus spp., Pediocococcus spp., Leuconostoc

spp., Streptococcus spp., Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Bacillus

coagulans, Escherichia coli itd.) in nekatere kvasovke (Saccharomyces boulardii

itd.) (Didari, Solki, Mozaffari, Nikfar, & Abdollahi, 2014; Fijan, 2014; Jiang, et al.,

2014; Rogelj, 2009).

Za probiotike je zelo pomembna določitev seva (FAO/WHO, 2002). Zmotno je

mišljenje, da so vse mlečnokislinske bakterije ali vsi laktobacili in bifidobakterije

probiotiki. Po drugi strani pa ima probiotične seve kvasovka Saccharomyces

boulardii, probiotični so lahko tudi nepatogeni sevi iz vrst Enterococcus faecium,

Enterococcus faecalis, Bacillus coagulans, itd, probiotični je sev E. coli Nissle 1917

(Fijan, 2014; Fijan, et al., 2017b).


mleku, 2017.

8

Probiotične bakterije morajo imeti posebne lastnosti, da delujejo negativno na

zdravju škodljive bakterije, stimulirajo imunski sistem, spodbujajo delovanje

prebavil in pomagajo pri vzdrževanju normalne mikrobiote. V črevesju lahko svoje

delo opravijo samo v primeru, da se v njem začasno ustavijo ali naselijo (Elmer, et

al., 2007; Rogelj, 2009). Probiotična kultura mora biti humanega izvora, normalni

prebivalec črevesja (Gomes, et al., 2010).

2.2.1 Pozitivni učinki probiotikov

Probiotični sevi se med seboj razlikujejo, kar pomeni, da imajo različne ugodne

učinke (Fijan, 2014). Delujejo na različne načine, nekateri v smeri krepitve

imunskega sistema, drugi so uspešnejši pri boju proti škodljivim bakterijam, tretji

spodbujajo delovanje prebavil in skrbijo za mikrobno ravnovesje v prebavilih.

(Bogovič Matijašič, 2009; Rogelj, 2009).

Najpogosteje probiotičnim bakterijam pripisujejo naslednje pozitivne učinke:

vzdrževanje uravnotežene mikrobiote, preprečevanje oziroma krajšanje časa

infekcijske, potovalne driske in driske povezane z jemanjem antibiotikov,

preprečevanje zaprtja, znižanje ravni holesterola, zmanjševanje pogostih okužb kot

so prehlad, blage trebušne viroze, zmanjševanje pogostosti vaginalnih infekcij, še

posebej glivičnih, vzdrževanje remisije pri ulceroznem kolitisu, preprečevanje

obolevnosti in umrljivosti povezane z nekrotizirajočim enterokolitisom, zmanjšanje

tveganja za nastanek raka na črevesju in za pojav nekaterih alergijskih obolenj,

blažitev simptomov laktozne intolerance (Fijan, et al., 2017a; Fijan, 2014; Pavčič, &

Vitezić, 2001). Glavni namen uživanja probiotikov je ohranjanje, obnavljanje in

bogatenje črevesne mikrobiote s koristnimi bakterijami, s tem pa vzdrževanje

mikrobnega ravnovesja (Rogelj, 2009). Vse pogosteje znanost probiotikom pripisuje

pomembno vlogo pri vzdrževanju imunskega sistema. Z razgradnjo škodljivih snovi,

ki jih zaužijemo, lahko tudi zmanjšajo tveganje za nastanek rakavih celic (Elmer, et

al., 2007; Fijan, & Šostar Turk, 2013; Rogelj 2009).


mleku, 2017.

9

Pozitivne učinke so že dokazali v probiotičnih sevih naslednjih rodov: Lactobacillus

(L. rhamnosus, L. acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. delbrueckii subsp.

bulgaricus, L. brevis, L. johnsonii, L. fermentum, L. reuteri, itd.), Bifidobacterium (B.

infantis, B. animalis subsp. lactis, B. bifidum, B. longum, B. breve, itd.),

Saccharomyces (S. boulardii, itd.), Enterococcus (E. durans, E. faecium, itd.),

Streptococcus (S. thermophiles, itd.), Pediococcus (P. acidilactici, itd.), Leuconostoc

(L. mesenteroides, itd.) in Escherichia coli (sev E. coli Nissle 1917) itd. (Bereswill,

et al., 2013; Cao, et al., 2013; Choi, et al., 2011; Hempel, et al., 2012; Li, Rosito, &

Slagle, 2013; Mehta, Arya, Goyal, Singh, & Sharma, 2013; Savard, et al., 2011;

Zelaya, et al., 2014).

Probiotične bakterije imajo tudi močan vpliv na imunski sistem, saj je črevesje

pomembna komponenta imunskega sistema (gut-associated lymphoid tissue –

GALT) (Fijan, & Šostar Turk, 2013; Rogelj, 2009; Sanders, 2014). Probiotične

črevesne bakterije krepijo epitelno pregrado črevesne stene, ki je zaščita pred

antigeni (Elmer, et al., 2007; Rogelj, 2009; Sanders, 2014) ter pospešijo njeno

obnovo s fermentacijsko tvorbo kratkoverižnih maščobnih kislih (Fijan, & Šostar

Turk, 2013; Sanders, 2014; Weizman, 2014). Neposredno vplivajo na tvorbo

beljakovin ter interlevkinov (na primer IL-6, IL-10) (Fijan, & Šostar Turk, 2013), ki

jih proizvajajo TH2 celice (T helper cell), ki usmerjajo v humoralni ali protitelesni

imunski odziv (Murch, 2014). Probiotične bakterije so z mehanizmom

kompetitivnega izločanja sposobne zasesti mesto na steni črevesne sluznice, kamor

se sicer pripenjajo patogene bakterije, ki lahko povzročajo črevesne okužbe (Fijan, et

al., 2017a; Fijan, & Šostar Turk, 2013). Probiotiki odpornost proti naselitvi

patogenih bakterij dosegajo tudi z ustvarjanjem za njih neugodnih življenjskih

pogojev, kot je tvorba bakteriocinov, ter s tekmovanjem za hranilne snovi (Fijan, et

al., 2017a). Črevesne bakterije pomagajo tudi pri proizvodnji vitaminov B in K

(Sanders, 2014; Seme, 2002; Weizman, 2014).


mleku, 2017.

10

2.2.2 Probiotiki in problem trga

Na trgu so probiotiki na voljo v obliki funkcionalnih živil, prehranskih dopolnil in

zdravil brez recepta (Bogovič Matijašić, Zorič Peternel, & Rogelj, 2010). V

prehranski industriji večinoma vključujejo mlečnokislinske bakterije, največ

laktobacile in laktokoke, uporabljajo pa se tudi bifidobakterije, streptokoki,

enterokoki, itd. (Sonnenborn, & Schulze, 2009). Med funkcionalnimi živili je

fermentirana hrana najpomembnejši način pridobivanja probiotičnih

mikroorganizmov (Bogovič Matijašič, 2010; Fijan, & Šostar Turk, 2013; Gomes, et

al., 2010; Rogelj, 2009), vendar to ne pomeni, da so vsi mlečni izdelki probiotični

izdelki ter vsak jogurt probiotični. Jogurt je še vedno najbolj znan in priljubljen

produkt fermentiranih mlečnih proizvodov (Elmer, et al., 2007; Fijan, & Šostar Turk,

2013). Probiotične jogurte izdelujejo s pomočjo dodatno izbranih probiotičnih

bakterij (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus,

Bifidobacterium bifidum itd.) v procesu fermentacije mleka, kjer se del laktoze

spremeni v mlečno kislino (Fijan, & Šostar Turk, 2013). Jogurtu sledijo probiotični

mlečni napitki in mlečni namazi s probiotiki (Bogovič Matijašić, et al., 2010).

Zakladnico potencialnih koristnih bakterij pa lahko najdemo tudi v drugih izdelkih,

med katere spadajo kefir, pivo, kombuča čaj, kislo zelje, sojina omaka, itd. (Fijan, &

Šostar Turk, 2013).

Prehranska dopolnila in zdravila brez recepta lahko zaužijemo v obliki kapsul, tablet,

pastil, peroralnih praškov in peroralnih kapljic (Gomes, et al., 2010). Pri zdravilih

brez recepta so lahko navedeni učinki na bolezenska stanja, če so dokazani s

kliničnimi raziskavami, medtem ko pri prehranskih dopolnilih napisi, ki kakorkoli

namigujejo na zdravljenje, niso dovoljeni (Bogovič Matijašič, 2009; Rogelj, 2009).

Na trgu je v zadnjih letih na voljo vedno več probiotičnih prehranskih dopolnil, ki

daleč prednjačijo pred ponudbo probiotičnih zdravil brez recepta, saj so regulatorne

zahteve za prehranska dopolnila bistveno blažje od tistih za zdravila (Rogelj, 2009;

Tuš, & Mlinarič, 2007).


mleku, 2017.

11

Na slovenskem trgu je večina izdelkov prehranskih dopolnil (Bogovič Matijašič,

2009), kot so na primer BioGaia, Yogermina 100 neo, Probiolex, Waya AB, itd.

(Zveza potrošnikov Slovenije [ZPS], 2012). V zakonodaji sicer ni predpisano

preverjanje sestave probiotičnih prehranskih dopolnil pred prodajo, obstajajo pa

priporočila, ki so nosilcem dejavnosti lahko v pomoč pri zagotavljanju kakovosti

prehranskih dopolnil in predstavljajo izhodišče za ocenjevanje kakovosti prehranskih

dopolnil na tržišču. Prehransko dopolnilo mora biti varno za uporabo. Označbe na

izdelkih morajo biti predstavljene tako, da ne zavajajo potrošnika, navedeni morajo

biti njihova sestava, rok uporabnosti proizvoda ter navodila za shrambo (Pravst, et

al., 2012; Rogelj, 2009). Ne glede na to ali se probiotiki uporabljajo kot prehranska

dopolnila ali kot zdravila brez recepta, morajo izpolnjevati določena selekcijska

merila. Potrebna je pravilna identifikacija vseh sevov v izdelku. Z vidika varnosti je

pomembno, da probiotični sevi ne povzročajo okužb in prebavnih težav, ne izločajo

toksinov ter encimov s škodljivim delovanjem, ne vsebujejo virulentnih dejavnikov

ter prenosljivih genov za odpornost proti antibiotikom. Merila za zagotavljanje

funkcionalnosti zahtevajo, da so probiotični sevi odporni proti kislini, želodčnemu

soku in žolču, imeti morajo sposobnost vezave na črevesne epitelne celice. Potrebni

sta stabilnost seva in zmožnost, da zraste v velikih količinah ter tako ohranja svojo

dejavnost v črevesju (FAO/WHO, 2002; Rogelj, 2009).

Probiotiki v kapsulah, pa tudi v praških, so ponavadi liofilizirani, kar pomaga

ohranjati njihovo preživetje (število živih organizmov), za dalj časa. Pri probiotičnih

izdelkih, ki so toplotno sušeni lahko proces ogrevanja pri proizvodnji ubije mikrobe

in tako izniči njihov probiotični učinek (Elmer, et al., 2007).

Na trgu se število probiotičnih izdelkov hitro povečuje, čeprav so le redke

probiotične bakterije dovolj klinično proučene v smislu njihovega učinka na zdravje

(Rogelj, 2009). Predpisi v zvezi s probiotiki se razlikujejo od države do države

(Elmer, et al., 2007; Rogelj, 2009). V EU so merila za ustrezno vsebnost probiotičnih

sevov v izdelkih ter standardi, na podlagi katerih bodo predpisali metode za

ugotavljanje ustreznosti probiotičnih izdelkov, še v pripravi (Zveza potrošnikov

Slovenije [ZPS], 2012).


mleku, 2017.

12

V Sloveniji obstajajo različni pravilniki, ki pokrivajo področji prehranskih dopolnil

in funkcionalne hrane. Prvo področje v večji meri obravnava Ministrstvo za zdravje,

drugo pa je bolj v domeni Ministrstva za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano

(Bogovič Matijašič, 2010). Slovenska zakonodaja ne vsebuje predpisov, ki bi

zahtevali preverjanje sestave probiotičnih prehranskih dopolnil pred prodajo (Rogelj,

2009; Bogovič Matijašić, et al., 2010), zato se pogosto zgodi, da se proizvajalci

zanašajo le na uveljavljeni status laktobacilov in bifidobakterij kot varnih bakterij

(Generally Recognized as Safe- GRAS) (Rogelj, 2009; Vandenplas, & Hauser,

2014), pri tem pa zanemarijo pomembne lastnosti probiotičnih izdelkov, kot so

taksonomska razvrstitev probiotičnih bakterij, prisotno število probiotičnih sevov in

viabilnost, odpornost proti antibiotikom in virulentnost (Rogelj, 2009).


mleku, 2017.

13

2.2.3 Mikrobiološke analize izdelkov

Mikrobiološke analize probiotičnih izdelkov lahko razkrijejo neskladje med

dejanskim številom probiotičnih mikroorganizmov ter izoliranimi sevi iz izdelka, z

informacijo, ki je zapisana na deklaraciji (Rogelj, 2009).

Leta 2006 so prvič objavlili podatke o ustreznosti probiotičnih izdelkov naprodaj v

Sloveniji (Bogovič Matijašić, & Rogelj, 2006). V raziskavo so zajeli fermentirane

probiotične izdelke, kupljene v supermarketih v Sloveniji, prehranska dopolnila in

zdravila v liofilizirani obliki, kupljena v lekarnah. Rezultati raziskave so pokazali, da

je označevanje probiotikov pogosto pomanjkljivo ali neustrezno glede števila živih

probiotičnih bakterij in navedenih vrst. Zasledili so tudi uporabo neobstoječih imen

bakterij, na primer Lactobacillus sporogenes in Lactobacillus thermophilus (Bogovič

Matijašić, & Rogelj, 2006). Ponovno raziskavo so opravili leta 2009, v katero so

vključili 20 probiotičnih prehranskih dopolnil in dve probiotični zdravili brez

recepta, kupljenih v slovenskih lekarnah. Ugotovili so, da je le pet izdelkov

vsebovalo dovolj živih probiotičnih mikroorganizmov glede na deklaracijo, pri

dvanajstih izdelkih je bilo dejansko število mikroorganizmov nižje od navedenega,

pri dveh število ni bilo navedeno, v enem izdelku pa niso potrdili živih bakterij. V

večini primerov so zasledili zgolj navajanje vrst bakterij, brez oznak sevov.

Navedene vrste so večinoma lahko potrdili, razen v primerih izdelkov z velikim

številom bakterij (6–8). Obe probiotični zdravili sta ustrezali tako po vrsti kot številu

probiotičnih bakterij (Bogovič Matijašić, Zorič Peternel, & Rogelj, 2010). V

raziskavo iz leta 2012 je bilo vključenih 12 probiotičnih prehranskih dopolnil. V

osmih od dvanajst izdelkov so bile vrste deklariranih probiotičnih bakterij potrjene.

V devetih od dvanajstih izdelkov je dejansko število probiotičnih bakterij ustrezalo

deklariranemu. Napredka niso opazili v označbah izdelkov, saj so bile te le v štirih

primerih ustrezne (Zveza potrošnikov Slovenije [ZPS], 2012).


mleku, 2017.

14

2.3 Escherichia coli

Theodor Escherich (1857–1911) je eden prvih, ki so poudarjali pomen raziskave

bakterij v prebavnem traktu in blatu človeka. S svojimi raziskavami je pripomogel h

kasnejšemu razumevanju fiziologije prebave ter patogeneze (Vasiljevič & Shah,

2008). Leta 1885 je Escherich prvi opisal bakterijo Escherichio coli (E. coli), ki

danes velja za enega izmed najbolj raziskanih prokariontskih organizmov. Na E. coli

so proučili zgradbo, rast in metabolizem bakterijske celice. V rabi je kot vektor za

kloniranje genov in testni organizem za preverjanje učinkovitosti protimikrobnih

zdravil in razkužil ter kot indikator fekalne kontaminacije vode in hrane (Andlovic,

2002b; Dragaš, 2010).

E. coli je predstavnica družine Enterobacteriaceae in je po Gramu negativna

fakultativno anaerobna bakterija paličaste oblike (Andlovic, 2002a; Andlovic, 2002b;

Conway, & Cohen, 2016; Dragaš, 2010; Madigan, Martinko, Stahl, & Clark, 2012;

Palaniappan, et al., 2006). V dolžino meri od 2 μm do 6 μm, v širino pa od 1 μm do

1,5 μm (Madigan, et al., 2012). Najpogosteje jo najdemo kot del normalne črevesne

mikrobiote ljudi in toplokrvnih živali (Conway, & Cohen, 2016; Palaniappan, et al.,

2006; Todar, 2008).

E. coli je razvila več sistemov za odpornost proti želodčni kislini, kar ji omogoča

preživetje tudi v ekstremnih razmerah (pH 2 ali manj) (Zhuo, Hope, Don L, Tyrrell,

& Foster, 2002). Princip delovanja enega od sistemov (AR2 sistem) je v regulaciji

genov gadA, gadB in gadC (Castanie-Cornet, Treffandier, Francez-Charlot,

Gutierrez, & Kaymeuang, 2007). Gena gadA in gadB kodirata encim glutamat

dekarboksilazo (glutamate decarboxylase [GAD]), ki sodeluje pri reakciji pretvorbe

glutamata v -aminobutanojsko kislino (-amino butyric acid [GABA]). Gen gadC

deluje kot antiporter, ki uvaža glutamat v celico, istočasno pa izvaža -

aminobutanojsko kislino iz nje (Zhuo, et al., 2002). Kombinirana aktivnost teh genov

zvišuje znotrajcelični pH na raven, ki se približa nevtralnemu (Castanie-Cornet, et

al., 2007).


mleku, 2017.

15

E. coli je genetsko heterogena in nagnjena k mutiranju (naravnemu in bioinženirsko

povzročenemu), kar pojasnjuje njeno dualno naravo (Todar, 2008). Med njenimi sevi

najdemo komenzalne seve, črevesne patogene in zunajčrevesne patogene (Wiles,

Kulesus, & Mulvey, 2008). Večina sevov je za gostitelje nepatogena, nekateri med

njimi pa so med evolucijo s horizontalnim prenosom ali mutacijami pridobili različne

gene, ki so omogočili nastanek in kasneje povečanje virulence. Patogenost E. coli je

povezana s kombinacijo virulentnih genov (Trkov, et. al, 2012).

Koristni sevi E. coli fermentirajo za nas neprebavljive snovi, proizvajajo vitamin K

in biotin. Kot komenzali onemogočajo tudi naselitev oz. kolonizacijo patogenih

bakterij (Madigan, et al., 2012). Komenzalne bakterije, ki kolonizirajo mikrobioto, v

normalnih okoliščinah ne škodujejo gostitelju. Ob zmanjšani odpornosti gostitelja,

pomanjkljivem imunskem odzivu ali ob vstopu v telesne predele, kjer običajno ni

mikrobov, pa lahko povzročijo oportunistične okužbe. (Koren, Ihan, & Gubina,

2002; Scheutz, & Strockbine, 2005; Trkov, et. al, 2008). Zato pravimo, da je E. coli

oportunist oziroma pogojno patogena bakterija (Koren, Ihan, & Gubina, 2002).

Nekateri sevi E. coli imajo zapise za virulentne dejavnike, kot so eksotoksini,

endotoksini, kapsula, bički, fimbrije (Andlovic, 2002b). Za prvi stik z gostiteljem so

potrebni adhezini, ki omogočajo pritrditev bakterije na gostiteljsko celico (Dragaš,

2010; Koren, Ihan, & Gubina, 2002). Najbolje raziskani adhezini so na pilusih ali

fimbrijah (Koren, Ihan, & Gubina, 2002). Patogeni sevi E. coli povzročajo krvavo

drisko, vnetja sečil, pri katerih lahko pride do razkrajanja celic sečnih poti, vnetja in

odpovedi ledvic (Munda, 2011). Okužbe sečil so najpogostejše zunajčrevesne okužbe

(Andlovic, 2002b; Trkov, et. al, 2008). Določeni sevi E. coli lahko povzročajo tudi

neonatalni meningitis. V primerih večjih vnetij ali prehodih patogenih sevov čez

črevesno bariero, lahko povzročijo bolezenske krvavitve raznih organov, sepso in

končno tudi smrt (Munda, 2011). Okužbe, ki jih povzročajo virulentni sevi E. coli

delimo v dve skupini, na črevesne in zunajčrevesne okužbe (Andlovic, 2002b;

Palaniappan, et al., 2006). Glede na prisotnost različnih virulentnih dejavnikov in na

podlagi povzročanja podobnih bolezenskih simptomov in stanj, jih razvrstimo v

različne patotipe ([CDC], 2014; Palaniappan, et al., 2006; Wiles, et al., 2008).


mleku, 2017.

16

2.3.1 Različni sevi in patotipi E. coli

Patotipi E. coli, ki povzročajo črevesne okužbe

ETEC: Enterotoksigene E. coli izdelujejo toplotno labilne (toksin TL) ali pa toplotno

stabilne (toksin TS) enterotoksine (Scheutz, & Strockbine, 2005). Sevi ETEC

pogosto povzročajo potovalno drisko. Prenašajo se predvsem s hrano in vodo, le

redko s stikom (Andlovic, 2002b). Med ETEC lahko sodijo serološke skupine O6,

O8, O25, O78, O153, O128, O86 (Scheutz, & Strockbine, 2005).

VTEC/STEC: Za verotoksigene in šigatoksične E. coli je značilna zmožnost

izdelovanja verotoksinov (VT) (Trkov, et. al, 2012). Ker so podobni toksinom

bakterije Shigella dysenteriae serotiopa 1, zanje uporabljamo tudi okrajšavo Stx

(angl. Shiga toxins) (Andlovic, 2002b; Scheutz, & Strockbine, 2005; Trkov, et. al,

2012).

EHEC ali enterohemoragične E. coli so podskupina VTEC, ki lahko povzročajo

krvavo drisko, ki jo pogosto spremljata bruhanje in povišana telesna temperatura. Pri

majhnih otrocih in starejših ljudeh lahko pride do nevarnega zapleta, hemolitično

uremičnega sindroma (HUS) (Andlovic, 2002b; Trkov, et al., 2008). Najbolj znan

serotip iz te skupine je E. coli O157: H7, ki lahko povzroči epidemije hemoragičnega

kolitisa (Andlovic, 2002b; Gruber, et al., 2013). EHEC imajo na genomu otok

patogenosti LEE (angl. locus for enterocyte effacement), ki nosi zapise za intimin,

sekrecijski sistem III, beljakovino Tir in različne sekrecijske beljakovine, ki

sodelujejo pri pritrjevanju bakterijske celice na evkariontsko celico. Patogena

bakterija si tako izdela lastni receptor, ki ji omogoča pritrjevanje na celice gostitelja

(Trkov, et al., 2012).

EPEC: Enteropatogeni sevi bakterije E. coli ne izdelujejo toksinov, povzročajo pa

histopatološke spremembe črevesnega epitela (Trkov, et al., 2011). Zanje je prav

tako značilen otok patogenosti LEE. Patogeni sevi se tesno pritrdijo na mikroviluse

enterocitov in jih uničijo (Andlovic, 2002b). EPEC najpogosteje povzročajo vodeno

drisko pri majhnih otrocih do 3. leta starosti (Trkov, et al., 2008). Najpogosteje so

vpletene serološke skupine O55, O111 in O142 (Andlovic, 2002b).


mleku, 2017.

17

EIEC: Enteroinvazivne E. coli običajno povzročajo vodeno drisko, včasih

dizenterijo in kolitis (Trkov, et al., 2008). Njihova značilnost je, da vdrejo v epitelne

celice, se v njih razmnožujejo, potujejo v citoplazmi in prehajajo v sosednje celice

(Trkov, et al., 2008). Ob prehodu v sosednje celice močno poškodujejo črevesno

steno. Okužbe najpogosteje povzročajo sevi iz seroloških skupin O124, O143, O152

(Andlovic, 2002b).

EAEC: Enteroagregativni sevi E. coli povzročajo akutno in dolgotrajno drisko

predvsem pri otrocih, manj pri odraslih (Andlovic, 2002b; Trkov, et al., 2011). Po

vezavi na celice izločajo različne enterotoksine, npr. ShET1 (Shigella enterotoksin 1)

EAST1 itd. (Trkov, et al., 2011). Difuzno adherentne E. coli (DAEC) so podskupina

EAEC in povzročajo drisko pri otrocih (Palaniappan, et al., 2006).

Patotipi E. coli, ki povzročajo zunajčrevesne okužbe

UPEC je patotip E. coli, ki povzroča okužbo urinarne poti (UTI), ki je najpogostejša

zunajčrevesna okužba (Trkov, et. al, 2011). Večina bakterij, ki povzročajo okužbo

sečil, izvira iz prebavil (Andlovic, 2002b; Car, & Marinko, 2003). Virulentni

dejavniki fimbrije tipa 1 povzročajo cistitise (okužbo mehurja), fimbrije tipa P pa so

povezane z okužbo ledvic (Andlovic, 2002b; Kaper, Nataro, & Mobley, 2004).

NEMEC je patotip E. coli, ki povzroča neonatalni meningitis. Za te seve so značilni

kapsularni polisaharidni antigeni tipa K1 (Kaper, Nataro, & Mobley, 2004; Andlovic,

2002b). Kapsula jih varuje pred fagocitozo in ovira vezavo protiteles na bakterije

(Andlovic, 2002a).

SEPEC je patotip E. coli, ki povzroča sepso. Ti primeri okužb so pogostejši pri

bolnišničnih bolnikih (Andlovic, 2002b).


mleku, 2017.

18

ESBL pozitivna E. coli

ESBL je kratica za encime, imenovane β- laktamaze razširjenega spektra (iz angl.

extended-spectrum β-lactamase). Več različnih bakterij, ki lahko proizvaja te encime,

je odpornih proti številnim antibiotikom, ki vsebujejo cefalosporin in penicilin, itd.

ESBL pozitivne E. coli lahko povzročijo okužbe sečil, ki lahko napredujejo do

resnejših okužb, kot je sepsa, kar lahko ogrozi življenje (Gudiol, et al., 2010).

Probiotični sev E. coli Nissle 1917

Probiotični sev E. coli Nissle 1917 (EcN) je odkril in izoliral nemški zdravnik in

znanstvenik Alfred Nissle (1874–1965), ko je raziskoval antagonistične aktivnosti E.

coli proti nekaterim patogenim enterobakterijam (Jiang, et al., 2014; Sonnenborn,

2017; Sonnenborn, & Schulze, 2009). Nissle je sev EcN izoliral v času prve svetovne

vojne (leta 1917) iz blata vojaka, ki v nasprotju z ostalimi pripadniki vojske ni razvil

nalezljive driske, ki je razhajala na Balkanskem polotoku (Scaldaferri, et al., 2016;

Sonnenborn, 2017; Sonnenborn, & Schulze, 2009). Nissle je domneval, da je bil v

črevesju vojaka prisoten močan, antagonistično aktiven sev, ki ga je zaščitil pred

okužbo. Prišel je do ugotovitve, da so nekateri fekalni izolati E. coli pokazali

antagonistično delovanje proti enteropatogenim bakterijam, medtem ko drugi niso

zavirali njihove rasti (Sonnenborn, & Schulze, 2009). EcN je nepatogeni sev, ki se

danes uporablja kot probiotik. EcN nima nobenih virulentnih dejavnikov, ne nosi

patogenih adhezijskih dejavnikov, ne proizvaja nobenih enterotoksinov ali

citotoksinov, ni invaziven, ne uropatogen (Scaldaferri, et al., 2016). Odkritih je bilo 5

genomskih otokov (GEIs) in nekaj manjših, na katerih so genski skupki odgovorni za

sintezo dejavnikov, ki prispevajo k probiotični naravi seva. Ti dejavniki so geni za

proizvodnjo mikrocinov, ki zavirajo rast patogenih enterobakterij (Sonnenborn, &

Schulze, 2009; Sonnenborn, 2017). EcN lahko pozitivno vpliva na mehanizme

modulacije imunskega sistema, krepitev črevesne pregrade, ohranja stanje remisije

pri ulceroznem kolitisu ter deluje zaviralno proti drugim patogenim sevom E. coli

(Scaldaferri, et al., 2016; Sonnenborn, & Schulze, 2009; Sturm, et al., 2005).


mleku, 2017.

19

Escherichia coli K-12

E. coli K-12 je benigni komenzal človeškega črevesja (Koli, Sudan, Fitzgerald,

Adhya, & Kar, 2011). Sev je bil izoliran leta 1922 in uveljavljen kot standardni

laboratorijski raziskovalni sev na Univerzi Stanford (Liu, & Reeves, 1994). E. coli

K-12, sicer dobro uveljavljeni zunajcelični komenzal, lahko v določenih specifičnih

gostiteljskih pogojih preide na aktivno invazivno ali patogeno delovanje (Koli, et al.,

2011).


mleku, 2017.

20

3 Empirični del

3.1 Raziskovalna vprašanja

1. Raziskovalno vprašanje: Ali imajo probiotiki vpliv na rast in preživetje

potencialno patogenih sevov bakterije Escherichia coli med inkubacijo v

mleku?

2. Ali po testiranju metod za določanje protimikrobnega učinka probiotikov

opazimo razlike v občutljivosti metod in posledično razlike v dobljenih

rezultatih?

3.2 Metodologija

3.2.1 Raziskovalne metode

V magistrskem delu smo preverili vpliv različnih probiotikov na rast in preživetje

bakterije Escherichia coli v mleku. Vzorci so vsebovali 10 mL mleka, potencialno

patogeno bakterijo E. coli ter 1 mL suspenzije različnih probiotikov. Pripravljene

vzorce smo inkubirali tri dni pri sobni temperaturi. Nato smo preverili antimikrobni

učinek probiotikov s klasično gojitveno metodo štetja. Za E. coli smo uporabili

selektivni agar MacConkey. Za določevanje števila preživelih probiotikov pa smo

uporabili agar PCA, agar MRS, kanamycin eskulin azidni agar in agar MYP.

Protimikrobni učinek probiotikov smo preverili tudi z metodo agar spot. Potrditev

prisotnosti E. coli v vseh vzorcih smo nato izvedli še z molekularno metodo verižne

reakcije s polimerazo (PCR).

3.2.1.1 Gojišča

Agar MacConkey (Becton Dickinson 221601) je selektiven in diferencialni medij za

odkrivanje koliformnih organizmov in enteričnih patogenov. Uporablja se za

identifikacijo Escherichia coli (Difco & BBL, 2009). Odtehtali smo 50 g

dehidriranega medija in ga suspendirali v 1 L destilirane vode.


mleku, 2017.

21

Suspenzijo smo segrevali do vrenja (uporabili smo magnetno mešalo) in 15 min

sterilizirali v avtoklavu pri 121 °C. Ohlajeni agar smo aseptično odlili v petrijevke.

E. coli prepoznamo po 24-urni inkubaciji pri 35 °C po okroglih rožnato rdečih

kolonijah.

Agar de Man, Rogosa and Sharpe (MRS, BioMerieux, 151752) smo uporabili za

identifikacijo bakterij iz rodu Lactobacillus. 70 g dehidriranega medija smo

suspendirali v 1 L destilirane vode, segreli do vrenja in avtoklavirali. Ohlajeni agar

smo aseptično odlili v petrijevke. Mlečnokislinske bakterije prepoznamo po 72-urni

anaerobni inkubaciji pri 35 °C po okroglih belih kolonijah. Za anaerobno inkubacijo

smo uporabili vrečke za anaerobno inkubacijo (GenBag).

Kanamicin eskulin azidni agar (KAZ) je selektivni medij za izolacijo in štetje

enterokokov. Prisotnost enterokokov se dokazuje s hidrolizo eskulina (Sigma-

Aldrich Co., 2011). KAZ (Fluka 17151) smo uporabili za identifikacijo E. faecium.

Odtehtali smo 44,67 g dehidriranega medija, ga suspendirali v 1 L destilirane vode,

segreli do vrenja in avtoklavirali. Ohlajenemu agarju smo aseptično dodali

rehidrirano vsebino ene stekleničke kanamicin sulfata (FD 146). Raztopljen medij

smo dobro premešali in odlili v petrijevke. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C E. faecium

prepoznamo po okroglih sivo belih kolonijah, pod katerimi je substrat obarvan rjavo-

črno.

Mannitol Yolk Polymyxin Agar (MYP) smo uporabili za identifikacijo Bacillus

coagulans. Odtehtali smo 23 g dehidriranega medija, ga suspendirali v 1 L

destilirane vode, segreli do vrenja in avtoklavirali. Bakterije po 48-urni inkubaciji pri

35 °C prepoznamo po okroglih rožnatih kolonijah z oborino.

Plate Count Agar (PCA, Sigma Aldrich, 70152) je neselektivni medij za štetje

mikroorganizmov v mleku, drugih mlečnih izdelkih in živilih (Sigma Aldrich, 2011).

Uporabili smo ga za določitev celokupnega števila živih bakterij. 17,5 g agarja smo

suspendirali v 1 L destilirane vode.


mleku, 2017.

22

Suspenzijo smo segrevali do vrenja in 15 min sterilizirali v avtoklavu pri 121 °C.

Ohlajeni agar smo aseptično odlili v petrijevke. Po nanosu vzorcev smo plošče

inkubirali 48 ur pri 32 °C in prešteli število nastalih kolonij.

3.2.2 Metoda agar spot

Za ugotavljanje protimikrobne aktivnosti probiotikov smo uporabili metodo agar spot

(Kholy, A. M., Shinawy, S. H., Meshref, A.M.S., & Korny, A.M., 2014). 10 μL

suspenzije različnih probiotikov smo točkovno nanesli na gojišče MRS (za vse

probiotike razen probiotika 5) in petrijevke zaradi večje selektivnosti inkubirali

anaerobno pri 35 °C 24 ur ter na gojišče MYP (za probiotik 5) in petrijevke aerobno

inkubirali pri 35 °C 24 ur. Nato smo odpipetirali po 1 mL kulture E. coli in jo dodali

v mehki agar MacConkey (40g/1000 mL) ter prelili preko predhodno pripravljenih

gojišč s probiotiki. Po 24 urah aerobnega inkubacijskega časa smo izmerili in

zabeležili premer inhibicijske cone, brez upoštevanja premera točke kolonij testnih

sevov. Pridobljene vrednosti so povprečja rezultatov enega eksperimenta, v trikratnih

izvedbah za posamezni probiotik.

3.2.3 Inkubacija probiotikov in različnih sevov E. coli v mleku

Po 0,5 mL različnih sevov in patotipov bakterije E. coli smo 72 ur inkubirali pri

sobni temperaturi v 10 mL predhodno steriliziranega kravjega mleka z ali brez

dodanega 1 mL suspenzij različnih probiotikov.

Pred in po inkubaciji smo število mikroorganizmov prešteli z indirektno gojitveno

metodo štetja z uporabo desetiških razredčitev, izračunali smo število nastalih kolonij

(cfu/mL) ter stopnjo zmanjšanja mikroorganizmov po inkubaciji.


mleku, 2017.

23

3.2.4 Identifikacija DNA E. coli z molekularno metodo PCR

Osamitev DNA je potekala s pomočjo reagenta PrepMan Ultra (Life Technologies).

Po 2 mL vzorca smo centrifugirali v mikrocentrifugi 2 min pri 12000 obr/min in

odpipetirali supernatant. Aseptično smo dodali 100 μL PrepMan reagenta ter

inkubirali 10 min pri 100 °C. Sledilo je ponovno centrifugiranje vzorcev za 2 min pri

12000 obr./min in odvzem 50 μL supernatanta z osamljeno DNA.

Reakcija pomnoževanja DNA: za reakcijo pomnoževanja z verižno reakcijo s

polimerazo (PCR, iz angl.: Polymerase Chain Reaction) smo uporabili začetne

oligonukleotide f(5'-ACC TGC GTT GCG TAA ATA-3'), r(5'-GGG CGG GAG

AAG TTG ATG-3'). Bakterijski sev smo identificirali z dokazom gena gadB.

Velikost produkta za E. coli je 670 bp (McDaniels et al., 1996). Skupna reakcijska

mešanica je bila sestavljena iz 1 mM MgCl2, 1,5 mM 10x reakcijskega pufra, 0,2

mM mešanice dNTP, 25 pM začetnega oligonukleotida GADA BF in 25 pM

začetnega oligonukleotida GADA BR in 2,5 U HotStarTaq polimeraze. Z vodo brez

nukleaz smo dopolnili do končnega volumna 50 µL in priključili ustrezen program za

pomnoževanje (Tabela 1). Po končanem programu smo pomnožke analizirali z

agarozno gelsko elektroforezo (Fijan, Rozman, & Šostar Turk (2013)

Tabela 1 prikazuje program reakcije PCR za bakterijo E. coli

Tabela 1: Program PCR za E. coli

Program Proces Temperatura Čas Število

ciklov

Denaturcija Denaturacija ali razdvajanje 94 °C 15 min 1

Pomnoževanje

Razdvajanje 94 °C 30 s

35 Vezava začetnih

oligonukleotidov 52 °C 30 s

Podaljševanje 72 °C 1 min

Končno podaljševanje 72 °C 7 min 1

Konec Ohladitev 10 °C 1

Vir: Fijan, Rozman, & Šostar Turk (2013)


mleku, 2017.

24

Z agarozno gelsko elektroforezo smo ugotavljali velikost pomnožkov PCR. Pripravili

smo 1,5 % agarozni gel v 0,5 kratnem pufru TBE (89 mM Tris HCl baza, 89 mM

borova kislina, 2 mM EDTA, pH= 8 z dodanim 8 μL SYBER Green I (Sigma).

Izvedli smo elektroforezo pri konstantni napetosti 100 V in času 60 min. Z aparatom

Transiluminator Super Bright (Vilber Lourmat) pri valovni dolžini 312 nm smo

poslikali gel s kamero DocPrint VX2 (Vilber Lourmat). Slike smo računalniško

obdelali.


mleku, 2017.

25

3.3 Raziskovalni vzorec

V raziskavo smo vključili 10 probiotikov, katerih imena smo izpustili, da bi

omogočili nepristranskost raziskave. Za probiotike, ki smo jih označili od 1 do 10,

smo poiskali vsebovane probiotične kulture, ki so podane v Tabeli 2.

Tabela 2: Deklarirane probiotične baterije v raziskovanih probiotičnih izdelkih

Oznaka

probiotičnega

izdelka

Deklarirane probiotične bakterije

Probiotik 1

(kapsule)

Lactobacillus acidophilus (L. gasseri)*; Bifidobacterium infantis*;

Enterococcus faecium*

Probiotik 2

(kapljice) Bifidobacterium animalis subsp. lactis, BB-12

Probiotik 3

(kapljice) Lactobacillus reuteri DSM 17938

Probiotik 4

(suspenzija) Lactobacillus casei Shirota

Probiotik 5

(kapsule) Bacillus coagulans LMG S-24828

Probiotik 6

Lactobacillus bulgaricus Lb-64; Bacillus coagulans BC599; Lactobacillus

acidophilus La-14; Bifidobacterium animalis lactis Bl-04; Bifidobacterium

breve Bb-03

Probiotik 7

(suspenzija)

Bifidobacterium lactis Bl-04; Lactobacillus acidophilus La-14;

Lactobacillus plantarum Lp-115; Lactobacillus paracasei Lpc-37

Probiotik 8

(prašek)

Bifidobacterium bifidum NIZO 3804; Bifidobacterium lactis NIZO 3680;

Lactobacillus acidophilus NIZO 3678, NIZO 3887; Lactobacillus paracasei

NIZO 3672; Lactobacillus plantarum NIZO 3684; Lactobacillus rhamnosus

NIZO 3689; Lactobacillus salivarius NIZO 3675; Enterococcus faecium

NIZO3886

Probiotik 9

(prašek)

Lactobacillus acidophilus W55: Lactobacillus acidophilus W37;

Lactobacillus paracasei W72; Lactobacillus rhamnosus W71; Enterococcus

faecium W54; Lactobacillus salivarius W24; Lactobacillus plantarum W62;

Bifidobacterium bifidum W23; Bifidobacterium lactis W18; Bifidobacterium

longum W51

Probiotik 10

(kapsule)

Escherichia coli Nissle 1917

*ni deklariranega seva

Pri raziskavi smo uporabili različne klinične izolate E. coli, ki pripadajo različnim

patotipom (EAEC, EPEC, ETEC), ESBL-pozitivne E. coli ter komenzalni sev E. coli

K12.


mleku, 2017.

26

Predhodno okarakterizirane seve E. coli: EAEC-V7/291/12 (v nadaljevanju EAEC1),

EAEC-V7/64/12 (v nadaljevanju EAEC2), EAEC-V7/129/12 (v nadaljevanju

EAEC3), EPEC-V7/119/12 (v nadaljevanju EPEC1), EPEC-V7/95/12 (v

nadaljevanju EPEC2), ESBL-V7/291/12 (v nadaljevanju ESBL1) ter ETEC-

V7/291/12 (v nadaljevanju ETEC1) smo dobili iz arhiva Univerze v Ljubljani,

Medicinske Fakultete, Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo ter Nacionalnega

laboratorija za zdravje, okolje in hrano. Sev E. coli K12 DSM 1562 (v nadaljevanju

Ec-K12) pa smo uporabili iz zamrznjenih kultur Univerze v Mariboru, Fakultete za

zdravstvene vede.

3.4 Postopki zbiranja podatkov

V teoretičnem delu magistrskega naloge smo s povzemanjem zbrali podatke, ki so

pomembni za raziskavo in razumevanje področja obravnave. Pregledali in primerjali

smo slovensko in tujo literaturo, znanstvene članke in strokovne internetne vire.

Poslužili smo se prosto dostopnih znanstvenih baz: ScienceDirect, PubMed, National

Center for Biotechnology Information, Research Gate.

V drugem, empiričnem delu naloge, smo preverjali vpliv probiotikov na rast in

preživetje različnih sevov bakterije Escherichia coli med inkubacijo v mleku. Delo

smo izvajali v aseptičnih pogojih v mikrobiološkem laboratoriju Fakultete za

zdravstvene vede Univerze v Mariboru. Rezultate smo analizirali in grafično

predstavili s pomočjo programa Microsoft Excel.


mleku, 2017.

27

4 Rezultati vpliva probiotikov na rast in preživetje E. coli

4.1 Antimikrobni učinek probiotikov z metodo agar spot

V naši raziskavi smo pri merjenju inhibicije upoštevali premer inhibicijske cone brez

točke testnih sevov. Pridobljene vrednosti so povprečja rezultatov enega

eksperimenta, v trikratnih ponovitvah za posamezni probiotik. Antimikrobni učinek

probiotikov smo ocenili po različnih merilih, ki so bila določena v naslednjih

raziskavah: Kholy, et al. (2014), Shokryazdan, et al. (2014), Mami, et al. (2014),

Jacobsen, et al. (1999). V omenjenih raziskavah so avtorji ocenjevali antimikrobni

učinek določenih probiotičnih sevov proti različnim patogenim bakterijam. Pri

merjenju inhibicije so upoštevali premer inhibicijske cone brez točke testnih sevov.

Tabela 3: Merila razponov inhibicijske cone za ocenjevanje antimikrobnega učinka probiotikov

Merila razponov inhibicijske cone glede na referenco

oznaka Kholy, et al. Shokryazdan, et al Mami, et al. Jacobsen, et al

+ 5–10 mm < 10 mm >= 2 mm 2–5 mm

++ 11–17 mm 10–20 mm ni merila >5

+++ > 17 mm > 20 mm ni merila ni merila

Tabela 4 prikazuje ocene antimikrobnega učinka izbranih probiotikov proti različnim

sevom E. coli, glede na različna merila razponov inihibicije, ki so predstavljena v

Tabeli 3. Glede na rezultate naše raziskave, je najbolj primerna ocena

antimikrobnega učinka probiotikov po referenci Kholy, et al., ki v primerjavi z

drugimi ocenami prikaže večje razlike uspešnosti probiotikov. Prav tako

ugotavljamo, da so najšibkejše inhibicije dosegli nekateri probiotiki, ki vsebujejo

monokulture živih mikroorganizmov. Rezultati kažejo manjše razlike v ocenah

patogenih sevov, ki pripadajo enaki skupini patotipov, zato smo v nadaljnih

raziskavah upoštevali samo en sev iz vsake skupine.


mleku, 2017.

28

Tabela 4: Antimikrobni učinek probiotikov proti različnim sevom in patotipom E.coli z metodo

agar spot

Sev

E. coli

Probiotik Ocena

antimikrobnega

učinka glede na

referenco 1 2 3 5 6 7 9 10

EAEC1

+ +++ + / ++ ++ +++ - Kholy, et al.

++ ++ + + ++ ++ +++ - Shokryazdan, et al

+ + + + + + + - Mami, et al.

++ ++ + + ++ ++ ++ - Jacobsen, et al

EAEC2

++ + / / + +++ ++ / Kholy, et al.

++ + + + + ++ ++ + Shokryazdan, et al

+ + + + + + + + Mami, et al.

++ ++ + + ++ ++ ++ + Jacobsen, et al

EAEC3

++ + / / ++ ++ ++ / Kholy, et al.

++ ++ + + ++ ++ ++ + Shokryazdan, et al

+ + + + + + + + Mami, et al.

++ ++ + + ++ ++ ++ + Jacobsen, et al

EPEC1

+ + + / + + +++ / Kholy, et al.

++ ++ + + ++ + +++ + Shokryazdan, et al

+ + + + + + + + Mami, et al.

++ ++ ++ + ++ ++ ++ + Jacobsen, et al

EPEC2

++ ++ + / + + + / Kholy, et al.

++ ++ + + + + + + Shokryazdan, et al

+ + + + + + + + Mami, et al.

++ ++ ++ + ++ ++ ++ + Jacobsen, et al

ESBL1

++ + + / + / + + Kholy, et al.

++ ++ ++ + + + + + Shokryazdan, et al

+ + + + + + + + Mami, et al.

++ ++ ++ + ++ + ++ ++ Jacobsen, et al

ETEC1

++ +++ / / + + + / Kholy, et al.

++ ++ + + + + ++ + Shokryazdan, et al

+ + + + + + + + Mami, et al.

++ ++ + + ++ ++ ++ + Jacobsen, et al

Ec-K12

+++ +++ - + + / ++ / Kholy, et al.

++ ++ - + ++ + ++ + Shokryazdan, et al

+ + - + + + + + Mami, et al.

++ ++ - + ++ + ++ + Jacobsen, et al

Kjer pomeni: z 1-10 so označeni izbrani probiotiki (Tabela 5). Kholy, et al. (2014): +, 5-10 mm; ++,

11-17 mm; +++, > 17 mm; Shokryazdan, et al. (2014): +, < 10 mm; ++, 10-20 mm; +++, > 20 mm;

Mami, et al. (2014): +, >= 2 mm; Jacobsen, et al. (1999): +, 2-5 mm; ++, >5. /, minimalna inhibicija

(= inhibicija pod merili) <=1mm; -, ni inhibicije.


mleku, 2017.

29

4.2 Štetje E. coli po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez

dodanega probiotika

PROBIOTIK 1

Tabela 5: Štetje E. coli na agarju MacConkey po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v

mleku, z ali brez dodanega probiotika 1

E. coli

Začetno

stanje

E. coli

(cfu/mL)

Koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)

E. coli +

mleko RedM

E. coli +

mleko +

probiotik

RedP

EAEC1 7,60 × 108 7,40 × 10

8 0,01 7,10 × 10

7 1,03

EPEC1 7,90 × 107 5,25 × 10

7 0,18 4,70 × 10

7 0,23

ESBL1 5,50 × 108 5,55 × 10

8 0,00 3,10 × 10

7 1,25

ETEC1 6,30 × 108 1,91 × 10

8 0,52 8,50 × 10

6 1,87

EcN 9,70 × 108 8,60 × 10

8 0,05 5,30 × 10

7 1,26

Ec-K12 8,80 × 108 1,62 × 10

8 0,73 3,40 × 10

7 1,41

RedM: stopnja zmanjšanja mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku, RedP: stopnja zmanjšanja

mikroorganizmov E. coli po inkubaciji v mleku z dodanim probiotikom

Graf 1: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v


Glede na rezultate v Tabeli 5 ugotavljamo, da so se koncentracije različnih sevov E.

coli po treh dneh inkubacije v mleku znižale, vendar v nobenem primeru razlike v

koncentracijah ne dosežejo 1 log10 stopnje. Dodan probiotik 1 je po tridnevni

inkubaciji v mleku znižal koncentracije različnih sevov E. coli za več kot 1 log10

stopnjo, razen ob dodanem patogenem sevu EPEC1.


mleku, 2017.

30

Tabela 6: Štetje Probiotika 1 na agarjih MRS, PCA, KAZ po tridnevni inkubaciji v mleku, z ali

brez dodane E. coli

agar

Začetno

stanje

probiotika

(cfu/mL)

koncentracije vzorcev po 72 h inkubaciji (cfu/mL)

Probiotik +

mleko Probiotik + mleko + E. coli

Razlika po

inkubaciji

MRS

1,18 × 107 9,00 × 10

8 EAEC1 6,70 × 10

8 -2,30 × 10

8

6,20 × 106 1,55 × 10

9

EPEC1 1,20 × 109 -3,50 × 10

8

ESBL1 8,80 × 109 7,25 × 10

9

ETEC1 2,40 × 109 8,50 × 10

8

1,32 × 107 7,60 × 10

8

EcN 9,50 × 108 1,90 × 10

8

Ec-K12 8,00 × 108 4,00 × 10

7

PCA

1,08 × 105 5,40 × 10

6 EAEC1 1,70 × 10

8 1,65 × 10

8

7,00 × 106 1,30 × 10

9

EPEC1 3,20 × 108 -9,80 × 10

8

ESBL1 2,30 × 109 1,00 × 10

9

ETEC1 5,30 × 108 -7,70 × 10

8

1,35 × 107 1,78 × 10

7

EcN 9,40 × 107 7,62 × 10

7

Ec-K12 1,92 × 107 1,40 × 10

6

KAZ

1,64 × 105 2,00 × 10

6 EAEC1 1,10 × 10

8 1,08 × 10

8

4,90 × 106 3,00 × 10

7

EPEC1 3,00 × 107 0,00

ESBL1 3,00 × 107 0,00

ETEC1 3,00 × 107 0,00

3,60 × 107 5,50 × 10

7

EcN 3,90 × 107 -1,60 × 10

7

Ec-K12 5,60 × 107 1,00 × 10

6

Razlika po inkubaciji med cfu (probiotik + mleko + E. coli) in cfu (probiotik + mleko)

Želeli smo izvedeti, ali je tridnevna inkubacija probiotika z ali brez dodanih sevov E.

coli v mleku vplivala na število nastalih kolonij probiotičnih bakterij. Glede na

rezultate v Tabeli 6 lahko povzamemo, da so dodani sevi E. coli na agarju MRS

povzročili manjše spremembe v številu probiotičnih mikroorganizmov, ki so bili

inkubirani v mleku. Nekoliko večjo razliko v številu probiotičnih mikroorganizmov

ugotavljamo v primeru dodanega patogenega seva ESBL1, kjer smo opazili

povečano rast probiotičnih mikroorganizmov. Na agarju PCA se je število

probiotičnih mikroorganizmov povečalo v primeru dodanega patogena seva ESBL1,

zmanjšalo pa ob dodanima patogenima sevoma EPEC1 in ETEC1. Na agarju KAZ se

je število probiotičnih mikroorganizmov povečalo ob dodanem patogenem sevu

EAEC1, v ostalih primerih dodani sevi E. coli niso povzročili sprememb.


mleku, 2017.

31

PROBIOTIK 2

Tabela 7: Štetje E. coli na MacConkey agarju po tridnevni inkubaciji na sobni temperaturi v


E. coli

Začetno

stanje

E. coli

(cfu/mL)


E. coli + mleko RedM

E. coli +

mleko +

probiotik

RedP

EAEC1 4,20 × 108 3,60 × 10

8 0,07 8,40 × 10

7 0,70

EPEC1 4,70 × 108 8,00 × 10

8 -0,23 5,10 × 10

6 1,96

ESBL1 3,40 × 108 1,48 × 10

8 -0,64 1,10 × 10

7 1,49

ETEC1 1,85 × 108 2,45 × 10

8 -0,12 7,20 × 10

6 1,41

EcN 5,60 × 108 2,80 × 10

8 0,30 8,60 × 10

5 2,81

Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10

8 0,05 8,20 × 10

7 1,00





Glede na rezultate v Tabeli 7 ugotavljamo, da so se koncentracije patogenih sevov

EPEC1, ETEC1 ter ESBL1 po treh dneh inkubacije v mleku povišale, koncentracije

patogenega seva EAEC1, komenzalnega seva Ec-K12 ter probiotičnega seva EcN pa

so se po treh dneh inkubacije v mleku znižale. Razlike v koncentracijah v nobenem

primeru ne dosežejo 1 log10 stopnje. Dodan probiotik 2 je po treh dneh inkubacije v

mleku v vseh primerih znižal koncentracije različnih sevov E. coli za najmanj 10-

krat, razen pri patogenem sevu EAEC1, kjer je razlika v koncentraciji 0,7 log10.


mleku, 2017.

32

Tabela 8: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 2) na MRS, PCA, KAZ agarjih po

tridnevni inkubaciji v mleku, z ali brez dodane E. coli

agar

Začetno

stanje

probiotika

(cfu/mL)


Probiotik +

mleko Probiotik + mleko+ E. coli

Razlika po

inkubaciji

MRS

6,90 × 106 7,50 × 10

8

EAEC1 6,50 × 108 -1,00 × 10

8

EPEC1 2,70 × 108 -4,80 × 10

8

ESBL1 4,80 × 108 -2,70 × 10

8

ETEC1 7,70 × 108 2,00 × 10

7

6,30 × 104 6,00 × 10

8

EcN 5,90 × 108 -1,00 × 10

7

Ec-K12 9,10 × 108 3,10 × 10

8

PCA 7,20 × 106 9,20 × 10

7

EAEC1 2,75 × 108 1,83 × 10

8

EPEC1 1,95 × 107 -7,25 × 10

7

ESBL1 2,73 × 108 1,81 × 10

8

ETEC1 2,19 × 108 1,27 × 10

8

KAZ

1,21 × 107 5,80 × 10

5

EAEC1 1,01 × 106 4,30 × 10

5

EPEC1 1,40 × 107 1,34 × 10

7

ESBL1 1,20 × 107 1,14 × 10

7

ETEC1 1,03 × 108 1,02 × 10

8

2,10 × 105 1,50 × 10

4

EcN 5,90 × 107 5,90 × 10

7

Ec-K12 7,00 × 107 7,00 × 10

7


Glede na rezultate v Tabeli 8 lahko povzamemo, da so dodani sevi E. coli na agarju

MRS povzročili manjše spremembe v številu probiotičnih mikroorganizmov, ki so

bili inkubirani v mleku. Nekoliko večjo razliko v številu probiotičnih

mikroorganizmov ugotavljamo v primeru dodanega patogenega seva EPEC1, kjer

smo opazili zmanjšano rast probiotičnih mikroorganizmov. Na agarju PCA se je

število probiotičnih mikroorganizmov povečalo v vseh primerih, razen ob dodanem

patogenem sevu EPEC1. Na agarju KAZ se je v vseh primerih število probiotičnih

mikroorganizmov ob dodanih sevih E. coli povečalo.


mleku, 2017.

33

PROBIOTIK 3



E. coli

Začetno

stanje

E. coli

(cfu/mL)



E. coli +

mleko +

probiotik

RedP

EAEC1 7,60 × 108 7,40 × 10

8 0,01 1,00 × 10

7 1,88

EPEC1 2,20 × 108 9,60 × 10

8 -0,64 5,60 × 10

6 1,59

ESBL1 4,70 × 108 3,20 × 10

8 0,17 6,00 × 10

6 1,89

ETEC1 6,00 × 108 5,10 × 10

8 0,07 5,10 × 10

7 1,07

EcN 5,60 × 108 2,80 × 10

8 0,30 3,00 × 10

6 2,27

Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10

8 0,05 6,20 × 10

7 1,12






coli po treh dneh inkubacije v mleku znižale, razen v primeru dodanega patogenega

seva EPEC1, vendar pa razlike v koncentracijah v nobenem primeru ne dosežejo 1

log10 stopnje. Dodan probiotik 3 je po treh dneh inkubacije v mleku v vseh primerih

znižal koncentracije različnih sevov E. coli za več kot 1 log10 stopnjo.


mleku, 2017.

34



agar

Začetno

stanje

probiotika

(cfu/mL)


Probiotik +


Razlika po

inkubaciji

MRS

3,40 × 107 8,30 × 10

8

EAEC1 1,15 × 109 3,20 × 10

8

EPEC1 7,00 × 108 -1,30 × 10

8

ESBL1 8,10 × 108 -2,00 × 10

7

ETEC1 8,20 × 109 7,37 × 10

9

5,00 × 107 2,90 × 10

8

EcN 1,80 × 109 1,51 × 10

9

Ec-K12 4,00 × 108 1,10 × 10

8

PCA

1,00 × 103 1,08 × 10

6

EAEC1 4,10 × 108 4,09 × 10

8

EPEC1 1,27 × 107 1,16 × 10

7

ESBL1 4,70 × 107 4,59 × 10

7

ETEC1 2,20 × 108 2,19 × 10

8

2,00 × 103 4,50 × 10

8

EcN 8,60 × 108 4,10 × 10

8

Ec-K12 3,60 × 108 -9,00 × 10

7

KAZ

1,00 × 103 4,00 × 10

5

EAEC1 7,80 × 107 7,76 × 10

7

EPEC1 5,80 × 106 5,40 × 10

6

ESBL1 7,90 × 106 7,50 × 10

6

ETEC1 1,00 × 108 9,96 × 10

7

1,00 × 103 1,10 × 10

8

EcN 1,30 × 108 2,00 × 10

7

Ec-K12 1,50 × 108 4,00 × 10

7


Glede na rezultate v Tabeli 10 lahko povzamemo, da sta večje spremembe v

povišanju števila probiotičnih mikroorganizmov na agarju MRS povzročila patogeni

sev EAEC1 in probiotični sev EcN. Na agarju PCA se je število probiotičnih

mikroorganizmov povečalo v vseh primerih, razen ob dodanem komenzalnem sevu

Ec-K12, kjer ugotavljamo rahlo zmanjšanje rasti probiotičnih mikroorganizmov. Na

agarju KAZ se je v vseh primerih število probiotičnih mikroorganizmov ob dodanih

sevih E. coli povečalo.


mleku, 2017.

35

PROBIOTIK 4



E. coli

Začetno

stanje

E. coli

(cfu/mL)



E. coli +

mleko +

probiotik

Redp

EAEC1 7,60 × 108 7,40 × 10

8 0,01 6,20 × 10

7 1,09

EPEC1 2,20 × 108 9,60 × 10

8 -0,64 3,80 × 10

7 0,76

ESBL1 4,70 × 108 3,20 × 10

8 0,17 5,30 × 10

6 1,95

ETEC1 6,00 × 108 5,10 × 10

8 0,07 1,16 × 10

7 1,71

EcN 5,60 × 108 2,80 × 10

8 0,30 1,50 × 10

5 3,57

Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10

8 0,05 5,50 × 10

7 1,17






coli po treh dneh inkubacije v mleku znižale, razen pri patogenem sevu EPEC1.

Razlike v koncentracijah v nobenem primeru ne dosežejo 1 log10 stopnje. Dodan

probiotik 4 je po tridnevni inkubaciji v mleku znižal koncentracije vseh sevov E.

coli. Rezultati kažejo 10-kratno znižanje koncentracij patogenih sevov EAEC1,

EPEC1 in ETEC1 ter 100-kratno znižanje koncentracije patogenega seva ESBL1. Pri

EcN lahko opazimo znižanje koncentracije po inkubaciji v mleku za več kot 3 log10

stopnje.


mleku, 2017.

36



agar

Začetno

stanje

probiotika

(cfu/mL)


Probiotik +


Razlika po

inkubaciji

MRS

6,60 × 107 8,50 × 10

8

EAEC1 4,90 × 108 -3,60 × 10

8

EPEC1 4,40 × 109 3,55 × 10

9

ESBL1 8,60 × 109 7,75 × 10

9

ETEC1 4,10 × 109 3,25 × 10

9

4,60 × 106 2,80 × 10

8

EcN 7,40 × 108 4,60 × 10

8

Ec-K12 8,20 × 108 5,40 × 10

8

PCA

4,20 × 107 6,10 × 10

6

EAEC1 6,30 × 107 5,69 × 10

7

EPEC1 5,90 × 107 5,29 × 10

7

ESBL1 6,70 × 106 6,00 × 10

5

ETEC1 5,00 × 108 4,94 × 10

8

5,00 × 106 4,50 × 10

8

EcN 5,50 × 108 1,00 × 10

8

Ec-K12 4,90 × 108 4,00 × 10

7

KAZ

6,80 × 107 7,00 × 10

6

EAEC1 3,60 × 107 2,90 × 10

7

EPEC1 4,20 × 107 3,50 × 10

7

ESBL1 1,52 × 106 -5,48 × 10

6

ETEC1 7,40 × 107 6,70 × 10

7

4,30 × 106 3,10 × 10

7

EcN 6,10 × 107 3,00 × 10

7

Ec-K12 8,70 × 107 5,60 × 10

7


Glede na rezultate v Tabeli 12 lahko povzamemo, da so večje razlike v povišanju

števila probiotičnih mikroorganizmov v mleku na agarju MRS povzročili patogeni

sevi EPEC1, ESBL1 in ETEC1. Na agarju PCA se je v vseh primerih število

probiotičnih mikroorganizmov povečalo. Minimalno rast probiotičnih

mikroorganizmov ugotavljamo ob dodanem patogenem sevu ESBL1, probiotičnem

sevu EcN in komenzalnem sevu Ec-K12. Na agarju KAZ se je v večini primerov ob

dodanih sevih E. coli število probiotičnih mikroorganizmov povečalo, razen ob

dodanem patogenem sevu ESBL1, kjer ugotavljamo zmanjšano rast probiotičnih

mikroorganizmov.


mleku, 2017.

37

PROBIOTIK 5



E. coli

Začetno

stanje

E. coli

(cfu/mL)



E. coli +

mleko +

probiotik

RedP

EAEC1 7,60 × 108 7,40 × 10

8 0,01 4,00 × 10

7 1,28

EPEC1 2,20 × 108 9,60 × 10

8 -0,64 3,90 × 10

7 0,75

ESBL1 4,70 × 108 3,20 × 10

8 0,17 9,00 × 10

7 0,72

ETEC1 6,00 × 108 5,10 × 10

8 0,07 2,10 × 10

8 0,46

EcN 5,60 × 108 2,80 × 10

8 0,30 3,60 × 10

7 1,19

Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10

8 0,05 6,70 × 10

8 0,09






coli po treh dneh inkubacije v mleku znižale, razen pri patogenem sevu EPEC1, kjer

lahko opazimo povišanje koncentracije. Dodan probiotik 5 je po tridnevni inkubaciji

v mleku znižal koncentracije vseh sevov E. coli. V večini primerov so razlike v

zmanjšanju koncentracije manjše od 1 log10 stopnje, razen pri dodanem patogenem

sevu EAEC1 in probiotičnem sevu EcN.


mleku, 2017.

38

Tabela 14: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 5) na MYP in PCA agarjih po


agar

Začetno

stanje

probiotika

(cfu/mL)


Probiotik +


Razlika po

inkubaciji

MYP

1,13 × 106 1,50 × 10

7

EAEC1 1,30 × 108 1,15 × 10

8

EPEC1 4,00 × 108 3,85 × 10

8

ESBL1 8,30 × 107 6,80 × 10

7

ETEC1 1,40 × 108 1,25 × 10

8

7,60 × 1011

6,60 × 108

EcN 7,30 × 108 7,00 × 10

7

Ec-K12 6,00 × 109 5,34 × 10

9

PCA

4,70 × 109 3,20 × 10

7

EAEC1 1,08 × 108 7,60 × 10

7

EPEC1 3,40 × 108 3,08 × 10

8

ESBL1 5,10 × 109 5,07 × 10

9

ETEC 1 7,20 × 108 6,88 × 10

8

9,80 × 107 5,80 × 10

8

EcN 2,10 × 109 1,52 × 10

9

Ec-K12 1,50 × 109 9,20 × 10

8


Glede na rezultate v Tabeli 14 lahko povzamemo, da se je število probiotičnih

mikroorganizmov na agarju MYP ob dodanih sevih E. coli v vseh primerih povečalo.

Najmanjšo spremembo rasti ugotavljamo v primeru dodanega probiotičnega seva

EcN. Število probiotičnih mikroorganizmov se je v vseh primerih povečalo tudi na

agarju PCA.


mleku, 2017.

39

PROBIOTIK 6



E. coli

Začetno

stanje

E. coli

(cfu/mL)



E. coli +

mleko +

probiotik

RedP

EcN 5,60 × 108 2,80 × 10

8 0,30 3,00 × 10

6 2,27

Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10

8 0,05 2,60 × 10

8 0,50





Glede na rezultate v Tabeli 15 ugotavljamo majhne spremembe v koncentracijah

probiotičnega seva EcN ter komenzalnega seva Ec-K12 po treh dneh inkubacije v

mleku. Dodan probiotik 6 je po tridnevni inkubaciji v mleku zmanjšal koncentracijo

EcN za več kot 2 log10 stopnji.


mleku, 2017.

40


tridnevni inkubaciji mleku, z ali brez dodane E. coli

agar

Začetno stanje

probiotika

(cfu/mL)


Probiotik +


Razlika po

inkubaciji

MRS 2,20 × 108 4,60 × 10

8

EcN 6,30 × 108 1,70 × 10

8

Ec-K12 5,10 × 108 5,00 × 10

7

PCA 3,00 × 106 5,70 × 10

8

EcN 5,40 × 108 -3,00 × 10

7

Ec-K12 6,00 × 108 3,00 × 10

7

KAZ 5,10 × 106 3,80 × 10

7

EcN 1,15 × 108 7,70 × 10

7

Ec-K12 1,49 × 108 1,11 × 10

8


Glede na rezultate v Tabeli 16 lahko povzamemo, da sta probiotični sev EcN in

komenzani sev Ec-K12 na agarjih MRS in PCA povzročila manjše spremembe v

rasti probiotičnih mikroorganizmov v mleku. Na agarju KAZ ugotavljamo večjo rast

probiotičnih mikroorganizmov ob dodanih EcN in Ec-K12.


mleku, 2017.

41

PROBIOTIK 7



E. coli

Začetno

stanje

E. coli

(cfu/mL)



E. coli +

mleko +

probiotik

RedP

EAEC1 3,12 × 109 6,29 × 10

8 0,70 2,90 × 10

8 1,03

EPEC1 7,90 × 107 5,25 × 10

7 0,18 5,80 × 10

7 0,13

ESBL1 5,50 × 108 5,55 × 10

8 0,00 5,50 × 10

7 1,00

ETEC1 6,30 × 108 1,91 × 10

8 0,52 1,68 × 10

8 0,57





Glede na rezultate v Tabeli 17 ugotavljamo, da so se koncentracije patogenih sevov

EAEC1, EPEC1 in ETEC1 po treh dneh inkubacije v mleku znižale, pri ESBL1 pa ni

sprememb v koncentraciji. Dodan probiotik 7 je po tridnevni inkubaciji v mleku

znižal koncentracije vseh patogenih sevov E. coli. Razliko v koncentraciji za 1 log10

stopnjo ugotavljamo v primeru patogenih sevov EAEC1 ter ESBL1.


mleku, 2017.

42

Tabela 18: Štetje probiotičnih mikroorganizmov (Probiotik 7) na MRS in PCA agarjih po


agar

Začetno

stanje

probiotika

(cfu/mL)


Probiotik +


Razlika po

inkubaciji

MRS

6,80 × 1012

1,40 × 109 EAEC1 8,60 × 10

8 -5,40 × 10

8

3,50 × 106 3,50 × 10

9

EPEC1 5,10 × 108 -2,99 × 10

9

ESBL1 4,30 × 109 8,00 × 10

8

ETEC1 4,70 × 109 1,20 × 10

9

PCA 4,30 × 106 1,00 × 10

9

EPEC1 2,70 × 108 -7,30 × 10

8

ESBL1 1,80 × 108 -8,20 × 10

8

ETEC1 2,40 × 109 1,40 × 10

9


Glede na rezultate v Tabeli 18 lahko povzamemo, da sta večje spremembe v številu

probiotičnih mikroorganizmov na agarju MRS povzročila patogena seva EAEC1 in

EPEC1, ki sta zmanjšala rast probiotičnih mikroorganizmov. Število probiotičnih

mikroorganizmov se je nekoliko povečalo ob dodanih patogenih sevih ESBL1 in

ETEC1. Na agarju PCA ugotavljamo zmanjšanje števila probiotičnih

mikroorganizmov ob dodanih patogenih sevih EPEC1 in ESBL1.


mleku, 2017.

43

PROBIOTIK 8



E. coli

Začetno

stanje

E. coli

(cfu/mL)



E. coli +

mleko +

probiotik

RedP

EAEC1 1,94 × 109 6,85 × 10

8 0,45 4,10 × 10

8 0,68

EPEC1 7,90 × 107 5,25 × 10

7 0,18 4,30 × 10

7 0,26

ESBL1 5,50 × 108 5,55 × 10

8 0,00 3,20 × 10

7 1,24

ETEC1 6,30 × 108 1,91 × 10

8 0,52 4,60 × 10

7 1,14

EcN 5,60 × 108 2,80 × 10

8 0,30 1,10 × 10

6 2,71

Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10

8 0,05 3,70 × 10

7 1,35





Glede na rezultate v Tabeli 19 ugotavljamo, da so se koncentracije različnih sevov

E. coli po treh dneh inkubacije v mleku znižale, razen pri patogenem sevu ESBL1 in

komenzalnem sevu Ec-K12, kjer ni sprememb v koncentraciji oziroma so

spremembe minimalne. Dodan probiotik 8 je po tridnevni inkubaciji v mleku znižal

koncentracije vseh sevov E. coli. Opazimo lahko najmanj 10-kratno znižanje

koncentracij sevov E. coli, razen pri patogenima sevoma EPEC1 ter EAEC1, kjer ni

znižanja v stopnji (cfu/ml).


mleku, 2017.

44



agar

Začetno stanje

probiotika

(cfu/mL)


Probiotik +


Razlika po

inkubaciji

MRS

6,70 × 1010

2,60 × 109 EAEC1 1,10 × 10

9 -1,50 × 10

9

9,60 × 107 4,00 × 10

9

EPEC1 3,20 × 109 -8,00 × 10

8

ESBL1 6,30 × 109 2,30 × 10

9

ETEC1 2,50 × 109 -1,50 × 10

9

3,30 × 109 7,60 × 10

8

EcN 1,01 × 109 2,50 × 10

8

Ec-K12 3,90 × 109 3,14 × 10

9

PCA

7,00 × 108 4,00 × 10

7 EAEC1 1,36 × 10

8 9,60 × 10

7

8,00 × 107 2,50 × 10

9

EPEC1 2,20 × 109 -3,00 × 10

8

ESBL1 5,20 × 109 2,70 × 10

9

ETEC1 3,20 × 108 -2,18 × 10

9

4,40 × 109 1,10 × 10

9

EcN 1,90 × 109 8,00 × 10

8

Ec-K12 2,50 × 109 1,40 × 10

9

KAZ

2,57 × 108 3,90 × 10

7 EAEC1 4,50 × 10

7 6,00 × 10

6

4,30 × 106 3,00 × 10

7

EPEC1 3,00 × 107 0,00

ESBL1 3,00 × 107 0,00

ETEC1 4,00 × 107 1,00 × 10

7

9,20 × 106 1,00 × 10

7

EcN 3,00 × 107 2,00 × 10

7

Ec-K12 2,60 × 107 1,60 × 10

7



mikroorganizmov na agarju MRS povečalo v primeru dodanega probiotičnega seva

EcN, komenzalnega seva Ec-K12 ter patogenega seva ESBL1. Na agarju PCA se je

število probiotičnih mikroorganizmov povečalo v vseh primerih, razen ob dodanima

patogenima sevoma ETEC1 ter EPEC1. Na agarju KAZ se je število probiotičnih

mikroorganizmov najbolj povečalo v primeru dodanega probiotičenga seva EcN in

komenzalnega seva Ec-K12, v ostalih primerih ni sprememb v rasti probiotičnih

mikroorganizmov ali pa so spremembe minimalne.


mleku, 2017.

45

PROBIOTIK 9



E. coli

Začetno

stanje

E. coli

(cfu/mL)



E. coli +

mleko +

probiotik

RedP

EAEC1 1,94 × 109 6,85 × 10

8 0,45 4,03 × 10

8 0,68

EPEC1 7,90 × 107 5,25 × 10

7 0,18 8,60 × 10

6 0,96

ESBL1 5,50 × 108 5,55 × 10

8 0,00 5,20 × 10

7 1,02

ETEC1 6,30 × 108 1,91 × 10

8 0,52 3,30 × 10

8 0,28

EcN 5,60 × 108 2,80 × 10

8 0,30 2,20 × 10

6 2,41

Ec-K12 8,20 × 108 7,30 × 10

8 0,05 3,10 × 10

7 1,42






coli po tridnevni inkubaciji v mleku znižale, razen pri patogenem sevu ESBL1 in

komenzalnem sevu Ec-K12, kjer ni sprememb v koncentraciji oziroma so

spremembe minimalne. Dodan probiotik 9 je po tridnevni inkubaciji v mleku znižal

koncentracije vseh sevov E. coli. Razliko v koncentraciji za najmanj 1 log10 stopnjo

ugotavljamo v primeru sevov EcN in Ec-K12 ter patogenega seva ESBL1.


mleku, 2017.

46



agar

Začetno stanje

probiotika

(cfu/mL)


Probiotik +


Razlika po

inkubaciji

MRS

3,40 × 109 1,48 × 10

9 EAEC1 9,60 × 10

8 -5,20 × 10

8

1,11 × 108 3,90 × 10

9

EPEC1 3,70 × 109 -2,00 × 10

8

ESBL1 1,90 × 109 -2,00 × 10

9

ETEC1 7,70 × 109 3,80 × 10

9

7,00 × 107 3,20 × 10

8

EcN 1,21 × 109 8,90 × 10

8

Ec-K12 1,30 × 109 9,80 × 10

8

PCA

2,18 × 108 5,00 × 10

8 EAEC1 5,80 × 10

7 -4,42 × 10

8

1,05 × 108 2,20 × 10

9

EPEC1 7,00 × 108 -1,50 × 10

9

ESBL1 4,40 × 108 -1,76 × 10

9

ETEC1 2,60 × 109 4,00 × 10

8

3,50 × 107 7,10 × 10

8

EcN 8,40 × 108 1,30 × 10

8

Ec-K12 4,90 × 108 -2,20 × 10

8

KAZ

1,30 × 108 7,30 × 10

6 EAEC1 2,50 × 10

6 -4,80 × 10

6

1,70 × 106 5,00 × 10

6

EPEC1 5,80 × 106 8,00 × 10

6

ESBL1 3,00 × 107 2,50 × 10

7

ETEC1 6,00 × 105 -4,40 × 10

6

8,60 × 106 6,20 × 10

6

EcN 1,05 × 108 9,88 × 10

7

Ec-K12 7,60 × 107 6,98 × 10

7



mikroorganizmov na agarju MRS povečalo v primeru dodanega patogenega seva

ETEC1, probiotičnega seva EcN ter komenzalnega seva Ec-K12. Na agarju PCA

ugotavljamo zmanjšanje števila probiotičnih mikroorganizmov v vseh primerih,

razen v primeru patogenega seva ETEC1 ter probiotičnega seva EcN, kjer so

spremembe v rasti probiotičnih mikroorganizmov minimalne. Na agarju KAZ se je

število probiotičnih mikroorganizmov najbolj povečalo v primeru dodanega

probiotičenga seva EcN, komenzalnega seva Ec-K12 ter patogenega seva ESBL1.

Zmanjšanje števila probiotičnih mikroorganizmov ugotavljamo v primeru dodanega

patogenega seva ETEC1.


mleku, 2017.

47

4.3 Identifikacija DNA E. coli s pomočjo molekularne metode PCR

Slika 1: Agarozna gelska elektroforeza pomnožkov PCR za identifikacijo vzorcev DNA različnih

sevov bakterije E. coli

Vir: lasten arhiv (2017)

Kjer pomeni: Ec1: EAEC1, Ec2: EAEC2, Ec3: EAEC3; Ec4: EPEC1, Ec5: EPEC2; Ec6: ESBL1;

Ec7: ETEC1.

Pozitivne rezultate pomnožkov PCR bakterije E. coli smo dobili pri vseh vzorcih (pri

velikostnem razredu 670 bp).


mleku, 2017.

48

Slika 2: Agarozna gelska elektroforeza pomnožkov PCR za identifikacijo vzorcev DNA

bakterije E. coli Nissle 1917 ob dodanih probiotikih


Kjer pomeni: 1: Escherichia coli sev Nissle 1917 (v nadaljevanju EcN) + probiotik 1; 2: EcN +

probiotik 3; 3: EcN + probiotik 5; 4: EcN + probiotik 6; 5: EcN + probiotik 8; 6: EcN + probiotik 2; 7:

EcN + probiotik 4; Neg. kontr.: negativna kontrola.




enteropatogene E. coli (EPEC1) ter ESBL-pozitivne E. coli (ESBL1) ob dodanih probiotikih


Kjer pomeni: 1: EPEC1 + probiotik 1; 2: EPEC1 + probiotik 3; 3: EPEC1 + probiotik 5; 4: EPEC1 +

probiotik 8; 5: EPEC1 + probiotik 4; 6: EPEC1 + probiotik 9; 7: EPEC1 + probiotik 2; 8: EPEC1 +

probiotik 7; 9: ESBL1 + probiotik 1; 10: ESBL1 + probiotik 3; 11: ESBL1 + probiotik 5; 12: ESBL1

+ probiotik 8; 13: ESBL1 + probiotik 4; 14: ESBL1 + probiotik 9; 15: ESBL1 + probiotik 2; 16:

ESBL1 + probiotik 7; Neg. kontr.: negativna kontrola.




mleku, 2017.

49


enterotoksigene E. coli (ETEC1) ter enteroagregativne E. coli (EAEC1) ob dodanih probiotikih


Kjer pomeni: 1: ETEC1 + probiotik 1; 2: ETEC1 + probiotik 3; 3: ETEC1 + probiotik 5; 4: ETEC1 +

probiotik 8; 5: ETEC1 + probiotik 4; 6: ETEC1 + probiotik 9; 7: ETEC1 + probiotik 2; 8: ETEC1 +

probiotik 7; 9: EAEC1 + probiotik 1; 10: EAEC1 + probiotik 3; 11: EAEC1 + probiotik 5; 12: EAEC1

+ probiotik 8; 13: EAEC1 + probiotik 4; 14: EAEC1 + probiotik 9; Neg. kontr.: negativna kontrola.




enterotoksigene E. coli (ETEC1) ob dodanih probiotikih


Kjer pomeni: 1: ETEC1 + probiotik 1; 2: ETEC1 + probiotik 3; 3: ETEC1 + probiotik 5; 4: ETEC1 +

probiotik 6; 5: ETEC1 + probiotik 8; 6: ETEC1 + probiotik 2; 7: ETEC1 + probiotik 4; Neg. kontr.:

negativna kontrola.




mleku, 2017.

50

5 Interpretacija in razprava

V magistrskem delu smo preverili vpliv probiotikov na rast in preživetje bakterije

Escherichia coli med inkubacijo v mleku. Imena probiotikov smo izpustili, da bi

omogočili nepristranskost raziskave. Probiotični sevi imajo različne mehanizme

delovanja, s čimer tudi njihovi pozitivni učinki niso splošni. To pomeni, da vsi

probiotiki niso enako uspešni pri preprečevanju driske, ampak se na primer bolje

izkažejo pri znižanju ravni holesterola. Univerzalni probiotik ne obstaja (FAO/WHO,

2002). Različno učinkovanje probiotikov poudarjata tudi prof. dr. Rogelj in prof. dr.

Orel (Širca, 2013). Tudi farmacevtska podjetja za posamezne probiotične izdelke

poudarijo namen uživanja.

Raziskovalno vprašanje 1: Ali imajo probiotiki vpliv na rast in preživetje

bakterije Escherichia coli med inkubacijo v mleku?

Po rezultatih lahko povzamemo, da so probiotiki uspešno znižali koncentracije

patogenih sevov bakterije E. coli po treh dneh inkubacije v mleku v povprečju za 1

log10 stopnjo. Glede na razultate prav tako ugotavljamo, da so bili različni patogeni

sevi E. coli po treh dneh inkubacije s probiotiki še vedno viabilni.

Učinkovanje probiotikov smo preverjali s patogenimi sevi različnih skupin patotipov,

ki imajo različne zapise za virulentne dejavnike. Ugotovili smo, da so bili probiotiki

pri učinkovanju z določenimi patogenimi sevi različno učinkoviti. Probiotik 1, ki je

uveljavljen kot probiotično zdravilo brez recepta, je imel najvišjo stopnjo reduciranja

(Tabela 5) proti patogenemu sevu, ki pripada patotipu ETEC, ki pogosto povzroča

potovalno drisko in se prenaša predvsem s hrano in vodo (Andlovic, 2002b;

Elsinghorst, 2002). Od uporabljenih probiotičnih vrst (Tabela 2) so s kliničnimi

raziskavami potrjeni pozitivni učinki delovanja Lactobacillus acidophilus proti

potovalni driski (Cortés-Zavaleta, López-Malo, Hernández-Mendoza, & García,

2014), infekcijski driski (McFarland, 2007), preprečevanju driske, povezane z

bakterijo Clostridium difficile (Phavichitr, Puwdee, & Tantibhaedhyangkul, 2013).


mleku, 2017.

51

Če upoštevamo rezultate vseh sevov E. coli, ki smo jih zajeli v raziskavi, smo dobili

minimalno stopnjo reduciranja v združbi s komenzalnim sevom Ec-K12 (Probiotik

5), kar je bilo za pričakovati, saj ne gre za patogeni sev. Rezultat z maksimalno

stopnjo reduciranja (Red = 3,57) smo dobili v združbi s probiotičnim sevom EcN pri

probiotiku 4. V tem primeru smo lahko opazili tudi največjo rast probiotičnih

mikroorganizmov na agarjih MRS, KAZ in PCA.

Po izračunu stopenj reduciranja, kjer smo upoštevali samo virulentne tipe E. coli,

smo na primeru patogenega seva EPEC1 pri različnima probiotikoma dobili

vsesplošno najboljši in najslabši rezultat reduciranja. Najboljše delovanje proti

patogenemu sevu EPEC1 ugotavljamo pri probiotiku 2 (Red = 1,96). Najslabše

delovanje proti patogenem sevu EPEC1 ugotavljamo pri probiotiku 7 (Red = 0,13).

Največ probiotikov (probiotki 1, 4, 7, 8) je imelo najnižji rezultat reduciranja v

primeru patogenega seva EPEC1, kar pomeni, da je bilo učinkovanje proti tem

patogenu nasplošno najslabše. Vsesplošno najboljši rezultat učinkovanja različnih

probiotikov (probiotki 3, 4, 8, 9) pa ugotavljamo proti ESBL-pozitivni E. coli

(ESBL1). Vsi probiotki, ki so dosegli najvišje rezultate reduciranja proti ESBL1

vsebujejo bodisi monokulture ali multikulture probiotičnih sevov iz rodu

Lactobacillus. Tudi v raziskavi Heshmatipour, et. al (2015) so ugotovili, da so

probiotične bakterije iz rodu Lactobacillus, ki so jih izolirali iz domačega

probiotičnega jogurta, pokazale antibakterijske učinke proti ESBL- pozitivni E. coli.

Najboljši povprečen rezultat učinkovanja proti vsem patogenim sevom E. coli je

dosegel probiotik 3, ki vsebuje mono kulturo Lactobacillus reuteri DSM 17938.


mleku, 2017.

52

Podobne ugotovitve lahko opazimo v raziskavi Fijan (2016), kjer so več različnih

kombinacij sevov probiotikov ter mikrobiota kefirja uspešno zmanjšali koncentracijo

potencialno patogene Pseudomonas aeruginosa za 3 log10 stopnje po štirih dneh

inkubacije v mleku. Tudi v tej raziskavi nobena kombinacija probiotičnih

mikroorganizmov ni popolnoma zavirala rasti patogene bakterije (Fijan, 2016). V tej,

kakor tudi v drugih raziskavah (Atkinson, & Williams, 2009) ugotavljajo, da ob

različnih okoljskih izzivih, bakterije opustijo svoje individualno delovanje in aktivno

sodelujejo z drugimi mikroorganizmi tako, da uspešno ustvarjajo komunikacijska

omrežja zaznavanja kvorum. Raziskava, kjer smo preverjali antagonistični učinek

različnih probiotikov na rast potencialno patogene E. coli po tridnevni inkubaciji v

mleku, je tako vključevala simulacijo, kjer domnevamo, da so probiotični

mikroorganizmi imeli priložnost aktivnega delovanja komuniciranja in koordiniranja

odzivov na nivoju skupnosti. Glede na rezultate ugotavljamo, da noben probiotik ni

popolnoma zaviral patogenih sevov, temveč le zmanjšal njihovo rast. Domnevamo

lahko, da so tudi različni sevi in patotipi bakterije E. coli ustvarili regulatorno mrežo,

saj so uspešno preživeli antagonistična prizadevanja vseh probiotičnih bakterij.

Rezultati z metodo agar spot kažejo drugače, saj ponekod nismo zasledili

protimikrobnega učinka. Najšibkejše inhibicije patogenih sevov E. coli ugotavljamo

v primerih probiotikov, ki vsebujejo monokulture probiotičnih sevov. Iz tega lahko

domnevamo, da so probiotiki med inkubacijo v mleku z mikrobnimi populacijami

ustvarili sinergijo, s tem dopolnjevali medsebojni učinek in se povezali v učinkovito

skupnost, ki tekmuje proti patogenim mikroorganizmom. Prvotno so bile bakterijske

celice obravnavane kot samostojne, nepovezane.

Želeli smo izvedeti, ali je tridnevna inkubacija z ali brez dodanim sevom E. coli

vplivala tudi na število probiotičnih bakterij. Skupno število nastalih kolonij

(cfu/mL) vseh vzorcev, ki smo jih inkubirali s probiotikom in brez E. coli znaša okoli

108 cfu/mL. Dodani sevi E. coli so ponekod povzročili 10-kratno povečanje

celotnega števila nastalih kolonij.


mleku, 2017.

53

Na agarju MRS, selektivnem predvsem za laktobacile, je v večini primerov število

probiotičnih mikroorganizmov ob dodanih patogenih bakterijah narastlo, kar kaže na

antagonistična prizadevanja probiotičnih bakterij. Zmanjšanje probiotičnih

mikroorganizmov pa smo v največ primerih zasledili ob dodani EAEC1 (Probiotiki

7, 8, 9). Podobne ugotovitve lahko opazimo v raziskavi Fijan (2016), kjer je dodana

potencialno patogena bakterija Pseudomonas aeruginosa v nekaterih primerih

povzročila 10-kratno zmanjšanje celotnega števila nastalih kolonij probiotičnih

bakterij na triptičnem sojinem agarju; ti vzorci so pokazali nižja zmanjšanja

koncentracij potencialno patogene Pseudomonas aeruginos na selektivnem

cetrimidnem agarju.

Raziskovalno vprašanje 2: Ali po testiranju metod za določanje

antagonističnega učinka probiotikov opazimo razlike v občutljivosti metod in

posledično razlike v dobljenih rezultatih?

Za ugotavljanje protimikrobne aktivnosti probiotičnih bakterij smo najprej uporabili

metodo agar spot po postopku Kholy, et al. (2014). Rezultate smo ovrednotili v tri

razpone inhibicije ( +, ++, +++, ) oziroma brez inhibicije. Najšibkejše inhibicije so

dosegli nekateri probiotiki, ki vsebujejo monokulture živih mikroorganizmov. Pri

metodi agar spot ni predpisanega oziroma poenotenega merila razpona inhibicije.

Razliko možne ocene rezultatov smo prikazali z vrednotenjem po različnih avtorjih:

Kholy, et al. (2014), Shokryazdan, et al. (2014), Mami, et al. (2014), Jacobsen, et al.

(1999) (Tabela 24). Za naše rezultate lahko rečemo, da sta merili razpona po avtorjih

Mami, et al. (2014) in Jacobsen, et al. (1999) manj primerni kot ostala oziroma nam

ostala merila razponov prikažejo večje razlike pri uspešnosti probiotikov. Prav tako

moramo upoštevati različne načine merjenja inhibicijskih con. Nekateri pri računanju

upoštevajo premer inhibicijske cone brez premera spot točke kolonij testnih sevov

(Georgievaa, et al., 2015; Jacobsen, et al., 1999; Kholy, et al., 2014; Mami, et al.,

2014; Shokryazdan, et al., 2014), drugi računajo premer inhibicijske cone z

upoštevanjem premera (spot) točke, zasledimo pa lahko tudi merjenje od roba točke

testnega seva do zunanjih robov inhibicije (Ayeni, et al., 2009).


mleku, 2017.

54

Rezultati, kjer smo protimikrobni učinek probiotikov preverjali s tridnevno

inkubacijo E. coli v mleku, z ali brez dodanih probiotikov, kažejo razlike. Ugotovili

smo, da so probiotiki uspešno znižali koncentracije patogenih sevov bakterije E. coli

v povprečju za 1 log10 stopnjo. E. coli smo najprej identificirali s klasično gojitveno

metodo na agarju MacConkey. Tudi molekularna metoda PCR je pokazala, da je bil

DNA E. coli ob dodanih probiotikih prisoten v vseh vzorcih. Clark (2005)

predstavlja verižno reakcijo s polimerazo kot najpomembnejšo molekularno biološko

tehniko. PCR omogoča tudi zelo specifično detekcijo določenih (pod) vrst, na primer

Escherichia coli: EHEC, ETEC, STEC, UPEC itd (Köster, et al., 2003), vendar te

metode nismo izvedli v naši raziskavi. Z metodo PCR lahko sicer dobimo rezultate

tudi v primerih, ko je količina mikroorganizmov tako majhna, da jih ne moremo

identificirati s pomočjo gojenja na agarjih (Madigan, et al., 2012).


mleku, 2017.

55

6 Sklep

V okviru raziskave smo se soočili s problematiko literature, ki obravnava probiotike.

Spoznanja, ki bakterije povezujejo s pozitivnimi učinki na zdravje sicer segajo v

začetek dvajsetega stoletja, šele v zadnjih letih pa se znanstveniki zavedajo

pomembne vloge mikrobiote črevesja pri zdravju ljudi ter proučevanja probiotikov z

vidika potencialnega pozitivnega učinkovanja na mikrobno ravnovesje. V zadnjih

desetih letih se je znatno povečalo število objav v povezavi s probiotiki in njihovimi

protimikrobnimi učinki. Ker je veliko raziskav še v teku, lahko dnevno prihaja do

novih spoznanj. Pri pregledu literature smo naleteli na naslednje nepravilnosti:

uporabo izraza mikroflora namesto mikrobiota, razvrščanje bifidobakterij kot

mlečnokislinskih bakterij, nepravilno razvrščanje fermentiranih izdelkov med

probiotične.

Probiotiki imajo velik potencial pozitivnega učinkovanja na mnogih področjih.

Nekatere probiotične bakterije lahko pripomorejo k ohranjanju mikrobnega

ravnovesja v črevesju, druge lahko vzdržujejo stanje remisije pri različnih boleznih

ali pa se borijo proti različnim patogenim organizmom, itd. Pri probiotikih je

ključnega pomena določitev probiotičnega seva, iz stališča področja učinkovanja, kot

tudi iz varnosti. Nadaljnje raziskave lahko pripeljejo do večje specifične izbire sevov,

med katerimi bodo sevi, ki so v primerjavi z drugimi, bodisi uspešnejši v kolonizaciji

črevesja, imajo boljšo sposobnost vezave na črevesne epitelne celice ali pa aktivnejše

mehanizme delovanja, itd.

Kljub specifičnosti delovanja različnih bakterij, le-te ne moremo obravnavati zgolj

kot individualiste, na kar opozarjajo tudi rezultati iz naše raziskave. Ob določenih

pogojih ali spremembah okolja, lahko bakterije opustijo svoje primarno delovanje,

aktivno komunicirajo z drugimi mikroorganizmi in se z njimi povežejo v skupnosti, v

katerih dopolnjujejo medsebojne učinke.


mleku, 2017.

56

Glede na različne rezultate vpliva probiotikov na rast in preživetje potencialno

patogene bakterije Escherichia coli v mleku, ki so prikazani v tem magistrskem delu,

velja izpostaviti pomembnost kvalitetnih raziskav probiotikov z večkratnimi

ponovitvami različnih »in vitro« metod ter ključnimi kliničnimi raziskavami.


mleku, 2017.

57

7 Literatura

Andlovic, A. (2002a). Patogene bakterije: Enterobakterije. V M. Gubina, & A. Ihan

(Ured.), Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo (str. 179-184).

Ljubljana, Slovenija: Medicinski razgledi.

Andlovic, A. (2002b). Patogene bakterije: Escherichia coli. V M. Gubina, & A. Ihan

(Ured.), Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo (str. 185-188).


Atkinson, S., & Williams, P. (2009). Quorum sensing and social networking in the

microbial world. J. R. Soc. Interface 6, 959–978.

Ayeni, F. A., Adeniyi, B. A., Ogunbanwo, S. T., Tabasco, R., Paarup, T., Pelaez, C.

& Requena, T. (2009). Inhibition of uropathogens by lactic acid bacteria

isolated from dairy foods and cow’s intestine in Western Nigeria. Arch

Microbiol, 191, 639-648

Bereswill, S., Fischer, A., Dunay, I.R., Kühl, A.A., Göbel, U.B., Liesenfeld, O., &

Heimesaat, M.M. (2013). Pro-inflammatory potential of Escherichia coli

strains K12 and Nissle 1917 in a murine model of acute ileitis. European

Journal of Microbiology and Immunology, 3, 126–134.

Biavati, B., & Mattarelli, P. (2006). The family bifidobacteriaceae. V M. Dworkin, S.

Falkow, E. Rosenberg, K. H. Schleifer, & E. Stackebrandt (Ured.), The

prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria (str. 383-321). New

York: Springer Science+Business Media.

Bogovič Matijašić, B., & Rogelj, I. (2006). Demonstration of suitability of probiotic

products. An emphasis on survey of commercial products obtained on

Slovenian market. Agro Food Ind Hi Tech, 17(3), 38-40.

Bogovič Matijašić, B. (2010). Različne oblike probiotičnih izdelkov. Naša lekarna -

revija za zdrav življenjski slog, 43, 32-37.

Bogovič Matijašić, B., Zorič Peternel M., & Rogelj, I. (2010). Ugotavljanje

deklariranih bakterij v probiotičnih prehranskih dopolnilih in zdravilih na

slovenskem trgu. Farmacevtski vestnik, 61, 263- 269.


mleku, 2017.

58

Cao, G.T., Zeng, X.F., Chen, A.G., Zhou, L., Zhang, L., Xiao, Y.P., & Yang, C.M.

(2013). Effects of a probiotic, Enterococcus faecium, on growth performance,

intestinal morphology, immune response, and cecal microflora in broiler

chickens challenged with Escherichia coli K88. Poulty Science, 92, 2949–

2955.

Car, J., Marinko, T. (2003). Zdravljenje nezapletene okužbe sečnega mehurja pri

ženskah v družinski medicini. Zdravstveni vestnik, 72, 79 – 83.

Castanie-Cornet, M. P., Treffandier, H., Francez-Charlot, A., Gutierrez, C., &

Kaymeuang, C. (2007). The glutamate-dependent acid resistance system in

Escherichia coli: essential and dual role of the His–Asp phosphorelay

RcsCDB/AF. Microbiology, 153, 238–246.

Centers for Disease Control and Prevention CDC. (2014). Escherichia coli. Prevzeto

5. marec 2016 iz http://www.cdc.gov/ecoli/general/index.html#what-are-shiga-

toxin

Choi, C.H., Jo, S.Y., Park, H.J., Chang, S.K., Byeon, J.S., & Myung, S.J. (2011). A

randomized, double-blind, placebo-controlled multicenter trial of

Saccharomyces boulardii in irritable bowel syndrome: Effect on quality of life.

Journal of Clinical Gastroenterology, 45, 679–683.

Conway, T., & Cohen, P. (2016). Commensal and Pathogenic Escherichia coli

Metabolism in the Gut. Microbiology Spectrum, American Society for

Microbiology, 3, 1-15.

Cortés-Zavaleta, O., López-Malo, A., Hernández-Mendoza, A., & García, H.S.

(2014). Antifungal activity of Lactobacilli and its relationship with 3-

phenyllactic acid production. Int. J. Food. Microbiol. 2014, 30–35.

Difco™ & BBL™ Manual. (2009). MacConkey II Agar. Prevzeto 8. november iz

http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/212306.pdf

Didari, T., Solki, S., Mozaffari, S., Nikfar, S., & Abdollahi, M. (2014). A systematic

review of the safety of probiotics. Expert Opin Drug Saf., 13, 227–239.

Dragaš, A. Z. (2010). Mikrobiologija z epidemiologijo. Ljubljana, Slovenija: DZS.

Elmer, G. W., Mcfarland, L. W., & Mcfarland, M. (2007). The Power of Probiotics:

Improving Your Health with Beneficial Microbes. New York: The Haworth

Press Inc.

http://www.cdc.gov/ecoli/general/index.html#what-are-shiga-toxin

http://www.cdc.gov/ecoli/general/index.html#what-are-shiga-toxin

http://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/212306.pdf


mleku, 2017.

59

Elsinghorst, E. A. (2002). Enterotoxigenic Escherichia coli. V M. S. Donnenberg

(Ured.), Escherichia coli. Virulence mechanisms of a versatile pathogen (str.

155-187). San Diego, United States: Academic Press.

Fijan, S. (2016). Influence of the Growth of Pseudomonas aeruginosa in Milk

Fermented by Multispecies Probiotics and Kefir Microbiota. Journal of

probiotics & health, ISSN 2329-8901, 4, 1-6. doi:10.4172/2329-

8901.1000136

Fijan, S. (2014). Microorganisms with Claimed Probiotic Properties: An Overview of

Recent Literature. International Journal of Enviromental Research and Public

Health, 11, 4745- 4767.

Fijan, S., Lorber, M., Povalej, P., Štante, A., Lončarič, J., Šulc, D., Petek Regoršek,

V., Galun, T., Jelen, Š., Nemet, U., & Belinc, J. (2017a). Vpliv različnih

sevov probiotikov na zdravje: elaborat v okviru projekta SezMiPro. Maribor:

Univerza v Mariboru, Fakulteta za zdravstvene vede.

Fijan, S., Lorber, M., Povalej, P., Klinc, I., Štante, A., Šulc, D., Lončarič, J., Jelen,

Š., Petek Regoršek, V., Galun, T., Nemet, U., & Tašner, S. (2017b).

Določevanje dejanskega števila bakterij v izbranih prehranskih dopolnilih z

indirektno gojitveno metodo štetja: elaborat v okviru projekta SezMiPro.

Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za zdravstvene vede.

Fijan, S., Rozman, U., & Šostar Turk, S. (2013). Comparing the Detection of Various

Microorganisms on Metal and Glass Surfaces Using Incubation Methods on

Selective Agars, Modifield PCR Methods and Simultaneous Detection by A

Unified Parallel PCR Method. Journal of Pure and Applied Microbiology, 7,

1636-1546.

Fijan, S., & Šostar Turk, S. (2013). Probiotiki in kefir. Kefir je pomembna združba

probiotičnih mikroorganizmov. Naša lekarna - revija za zdrav življenjski slog,

78, 36- 43.

Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization

FAO/WHO. (2002). Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food; Joint

FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of

Probiotics in Food: London, Ontario, Kanada.


mleku, 2017.

60

Georgievaa, R., Yochevab, L., Tserovskab, L., Zhelezovab, G., Stefanovaa, N.,

Atanasovaa, A., Dangulevaa, A., Ivanovaa, G., Karapetkova, N., Rumyana,

N., & Karaivanovaa, E. (2015). Antimicrobial activity and antibiotic

susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacterium spp. intended for use as

starter and probiotic cultures. Biotechnology & Biotechnological Equipment,

29, 84-91.

Gomes, A. M., Pintado, M. E., & Malcata, X. (2010). Probiotics. V L. M. L Nollet,

& F., Toldra (Ured.), Handbook of Dairy Foods Analysis (str. 503 – 541).

Florida, United States of America: CRC Press Taylor & Francis Group.

Gruber, I., Heudorf, U., Werner, G., Pfeifer, Y., Imirzalioglu, C., Ackermann, H.,

Brandt, C., Besier, S., & Wichelhaus, T.A. (2013). Multidrug-resistant bacteria

in geriatric clinics, nursing homes, and ambulant care-prevalence and risk

factors. International Journal of Medical Microbiology, 303, 405–409.

Gudiol, C., Calatayud, L., Garcia-Vidal, C., Lora-Tamayo, J., Cisnal, M., Duarte, R.,

Arnan, M., Marin, M., Carratala, J., & Gudiol, F. (2010). Bacteraemia due to

extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli (ESBL-EC) in

cancer patients: clinical features, risk factors, molecular epidemiology and

outcome. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 65, 333-341.

Hempel, S., Newberry, S.J., Maher, A.R., Wang, Z., Miles, J.N., Shanman, R.,

Johnsen, B., & Shekelle, P.G. (2012). Probiotics for the prevention and

treatment of antibiotic- associated diarrhea: A systematic review and meta-

analysis. JAMA, 307, 1959–1969.

Heshmatipour, Z., Aslikousha, H., Mohamadiebli, F., & Ashrafi Eslami, A. (2015).

Antibacterial Activity Lactic Acid Bacteria (LAB) Isolated Native Yogurt

against ESBL Producing E. coli Causing Urinary Tract Infection (UTI).

International Journal of Life Sciences Biotechnology and Pharma Research, 2,

117-121.

Holzapfel, W. H., Haberer, P., Snel, J., Schillinger, U., & Huis in't Veld, J. H.

(1998). Overview of gut flora and probiotics. International Journal of Food

Microbiology, 41, 85-101.


mleku, 2017.

61

Jacobsen, C. N., Rosenfeldt, V. N., Hayford, A. E., Møller, P. L., Michaelsen, K. F.,

Perregaard, A., Sandstrom, B., Tvede, M., & Jakobsen, M. (1999). Screening

of Probiotic Activities of Forty-Seven Strains of Lactobacillus spp. by In

Vitro Techniques and Evaluation of the Colonization Ability of Five Selected

Strains in Humans. Applied and environmental microbiology, 65, 4949–4956.

Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Wolf A., & Curtiss, R. (2014). Multiple effects of

Escherichia coli Nissle 1917 on growth, biofilm formation and inflammation

cytokines profile of Clostridium perfringens type A strain CP4. Pathog Dis.,

70, 390 – 400

Kaper, J. B., Nataro, J. P., & Mobley, H. L. (2004). Pathogenic Escherichia coli.

Nature Reviews Microbiology 2, 123-140.

Kholy, A. M., Shinawy, S. H., Meshref, A.M.S., & Korny, A.M. (2014). Screening

of Antagonistic Activity of Probiotic Bacteria against Some Food-Borne

Pathogens. Journal of Applied & Environmental Microbiology, 2, 53-60.

Koli, P., Sudan, S., Fitzgerald, D., Adhya, S., & Kar, S. (2011). Conversion of

Commensal Escherichia coli K-12 to an Invasive Form via Expression of a

Mutant Histone-Like Protein. mBio, 5, 1-13.

Koren, S., Ihan, A., & Gubina, M. (2002). Patogeneza in širjenje bakterijskih okužb.

V M. Gubina, & A. Ihan (Ured.), Medicinska bakteriologija z imunologijo in

mikologijo (str. 65-73). Ljubljana, Slovenija: Medicinski razgledi.

Köster, W., Egli, T., Ashbolt, N., Botzenhart, K., Burlion, N., Endo, T., Grimont, P.,

Guillot, E., Mabilat, C., Newport, L., Niemi, M., Payment, P., Prescott, A.,

Renaud, P. & Rust, A. (2003). Analytical methods formicrobiological water

quality testing. V A. Dufour, M. Snozzi, W. Koster, et al. (Ured.), Assessing

microbial safety od drinking water: improving approaches and methods (str.

237-242). London: IWA Publishing.

Li, D., Rosito, G., & Slagle, T. (2013). Probiotics for the prevention of necrotizing

enterocolitis in neonates: An 8-year retrospective cohort study. Journal of

Clinical Pharmaceutic Therapy, 38, 445–449.

Liu, D., & Reeves, P. R. (1994). Escherichia coli K12 regains its O antigen.

Microbiology, 140, 49 - 57.


mleku, 2017.

62

Madigan, M. T., Martinko, J. M., Stahl, D., & Clark, D. (2012). Brock Biology of

microorganisms. United States of America, Boston: Benjamin Clummings.

Mami, A., Ahmedb, K., & Mebroukc, K. (2014). Study of the Antimicrobial and

Probiotic Effect of Lactobacillus Plantarum Isolated from Raw Goat's Milk

from the Region of Western Algeria. International Journal of Sciences: Basic

and Applied Research (IJSBAR), 13, 18-27.

McDaniels, A., Rice, E., Reyes, A., Johnson, C., Haugland, R. & Stelma, G. (1996).

Confirmational identification of Escherichia coli, a comparison of genotypic

and phenotypic assays for glutamate decarboxylase and beta-D-

glucuronidase. Applied and Environmental Microbiology, 62, 3350-3354.

McFarland, L.V. (2007). Meta-analysis of probiotics for the prevention of traveler’s

diarrhea. Travel Med. Infect. Dis., 5, 97–105.

Mehta, R., Arya, R., Goyal, K., Singh, M., & Sharma, A.K. (2013). Bio-preservative

and therapeutic potential of pediocin: Recent trends and future perspectives.

Recent Patology in Biotechnology, 7, 172–178.

Munda, M. (2011). Kaj je bakterija E. coli? Prevzeto 4. marec 2016 iz

http://www.aktivni.si/zdravje/preventiva/kaj-je-bakterija-e-coli/

Murch, S. (2014). The Immune System and Intestinal Microbiota. V R. Orel (Ured.),

Intestinal microbiota probiotics and prebiotics: comprehensive textbook for

health professionals (str. 38-51). Ljubljana, Slovenija: Institute for Probiotics

and Functional Foods

Palaniappan, R. U. M., Zhang, Y., Chiu, D., Torres, A., DebRoy, C., Whittman, T.S.,

& Chang, Y. (2006). Differentiation of Escherichia coli Pathotypes by

Oligonucleotide Spotted Array. Journal of Clinical Microbiology, 44, 1495 –

1501.

Pavčič, M., & Vitezić, N. (2001). Uvodnik. V M. Pavčič, & N. Vitezić (Ured.),

Probiotiki in možnosti njihove uporabe : zbornik predavanj (str. 5). Ljubljana,

Slovenija: Zbornica nutricionistov in dietetikov.

Phavichitr, N., Puwdee, P., & Tantibhaedhyangkul, R. (2013). Cost-benefit analysis

of the probiotic treatment of children hospitalized for acute diarrhea in

Bangkok, Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 44, 1065–

1071.

http://www.aktivni.si/zdravje/preventiva/kaj-je-bakterija-e-coli/


mleku, 2017.

63

Pravst, I., Blaznik, U., Krbavčič, A., Kreft, S., Kušar, A., Mičović, E., Razinger, B.,

Recek, M., Repe, J., Rogelj, I., & Stibilj, V. (2012). Priporočila za

zagotavljanje kakovosti prehranskih dopolnil. Farmacevtski vestnik, 63, 216-

224.

Rogelj, I. (2009). Črevesna mikrobiota in probiotiki: Mikrobi – naši nepogrešljivi

sopotniki. Prevzeto 5. marec 2016 iz

http://www.waya.eu/fileadmin/medis/waya.eu/documents/Irena_Rogelj_-

_Crevesna_mikrobiota_in_probiotiki.pdf

Rogelj, I. (2014). Probiotics – Historical Overview, General Concepts and

Mechanism of Action. V R. Orel (Ured.), Intestinal microbiota probiotics and

prebiotics: comprehensive textbook for health professionals (str. 59-71).

Ljubljana, Slovenija: Institute for Probiotics and Functional Foods.

Sanders, M. E. (2014). Overview of the Human Intestinal Microbiota. V R. Orel

(Ured.), Intestinal microbiota probiotics and prebiotics: comprehensive

textbook for health professionals (str. 27-37). Ljubljana, Slovenija: Institute

for Probiotics and Functional Foods.

Savard, P., Lamarche, B., Paradis, M.E., Thiboutot, H., Laurin, E., & Roy, D. (2011).

Impact of Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 and, Lactobacillus

acidophilus LA-5-containing yoghurt, on fecal bacterial counts of healthy

adults. International Journal of Food Microbiology, 149, 50–57.

Scaldaferri, F., Gerardi, V., Mangiola, F., Lopetuso, L. R., Pizzoferrato, M., Petito,

V., Papa, A., Stojanovic, J., Poscia, A., Cammarota, G., & Gasbarrini, A.

(2016). Role and mechanisms of action of Escherichia coli Nissle 1917 in the

maintenance of remission in ulcerative colitis patients: an update. World J

Gastroenterol, 22, 5505-5511.

Scheutz, F., & Strockbine, NA. (2005) Escherichia. V DJ. Brenner, NR. Krieg, JT.

Staley, & GM. Garrity (Ured.), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology

(str. 607-624). New York: Springer.

Seme, K. (2002). Normalna mikrobna flora. V M. Gubina, & A. Ihan (Ured.),

Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo (str. 59 – 64).


http://www.waya.eu/fileadmin/medis/waya.eu/documents/Irena_Rogelj_-_Crevesna_mikrobiota_in_probiotiki.pdf

http://www.waya.eu/fileadmin/medis/waya.eu/documents/Irena_Rogelj_-_Crevesna_mikrobiota_in_probiotiki.pdf


mleku, 2017.

64

Shokryazdan, P., Sieo, C. C., Kalavathy, R., Liang, J. B., Alitheen, N. B., Jahromi,

M. F., & Ho, Y. W. (2014). Probiotic Potential of Lactobacillus Strains with

Antimicrobial Activity against Some Human Pathogenic Strains. Hindawi

Publishing Corporation BioMed Research International, 1-16

Sigma-Aldrich Co. (2011). Methods and Techniques for Detection of Coliforms.

Microbiology Focus, 3.2, 1-8.

Sonnenborn, U. (2017). 100 years of E. coli strain Nissle 1917. Prevzeto 20. junij

2017 iz https://blog.oup.com/2017/04/e-coli-strain-nissle-1917-timeline/

Sonnenborn, U., & Schulze, J. (2009). The non-pathogenic Escherichia coli strain

Nissle 1917 – features of a versatile probiotic. Microbial Ecology in Health

and Disease, 21, 122-158.

Sturm, A., Rilling, K., Baumgart, D. C., Gargas, K., Abou-Ghazale T., Raupach,

Eckert, J., Schumann, R. R., Enders, C., Sonnenborn, U., Wiedenmann, B., &

Dignass, A. U. (2005). Escherichia coli Nissle 1917 Distinctively Modulates

T-Cell Cycling and Expansion via Toll-Like Receptor 2 Signaling. Infection

And Immunity, 73, 1452 – 1465.

Širca, S. (2013). Probiotiki in prebiotiki v praksi. Naša lekarna, 69, 34-37.

Todar, K. (2008). Pathogenic E. coli. Prevzeto 15. januar 2016 iz Todar's Online

Textbook of Bacteriology: http://textbookofbacteriology.net/e.coli.html

Trkov, M., Andlovic, A., Berce, I., Štorman, A., Ravnik, M, & Paragi, M. (2012).

Verotoksigeni sevi bakterije Escherichia coli, osamljeni v Sloveniji iz

humanih vzorcev. Zdravniški Vestnik, 81, 32 – 43.

Trkov, M., Grilc, E., Andlovic, A., Berce, I., Štorman, A. , Ravnik, M. , Drinovec,

B., Orešič, N., & Paragi, M. (2011). Spremljanje E. coli, ki povzročajo

črevesne okužbe s poudarkom na spremljanju verotoksigenih E. coli. Prevzeto

10. junij 2017 iz http://www.spm.si/wp-content/uploads/2013/10/Trkov-

Marija.pdf

Trkov, M., Berce, I., Dovečar, D., Grilc, E., Bujko, M., & Kraigher, A. (2008).

Odkrivanje nekaterih genov, povezanih z virulenco, pri sevih E.coli , ki

povzročajo črevesne okužbe. Zdravstven varstvo, 47, 81-88.

Tuš, M., Mlinarič, A. (2007). Prehranska dopolnila – zakonodaja, problematika,

primeri. Farmacevtski vestnik, 58, 72-73.

https://blog.oup.com/2017/04/e-coli-strain-nissle-1917-timeline/

http://textbookofbacteriology.net/e.coli.html

http://www.spm.si/wp-content/uploads/2013/10/Trkov-Marija.pdf

http://www.spm.si/wp-content/uploads/2013/10/Trkov-Marija.pdf


mleku, 2017.

65

Vandenplas, Y., Hauser, B. (2014). Probiotics and Prebiotics in Infant Formula. V R.

Orel (Ured.), Intestinal microbiota probiotics and prebiotics: comprehensive

textbook for health professionals (str. 93-109). Ljubljana, Slovenija: Institute

for Probiotics and Functional Foods.

Vasiljević, T., & Shah, NP. (2008). Probiotics - From Metchnikoff to bioactives.

International Dairy Journal 18, 714-728.

Walker, A. W., & Lawley, T. D. (2012). Therapeutic modulation of intestinal

dysbiosis. Pharmacological Research, 69, 75-86.

Weizman, Z. (2014). Dysbiosis – the Concept of Dysfunctional Intestinal

Microbiota. V R. Orel (Ured.), Intestinal microbiota probiotics and prebiotics:

comprehensive textbook for health professionals (str. 52-58). Ljubljana,

Slovenija: Institute for Probiotics and Functional Foods.

Wiles, T. J., Kulesus, R. R., & Mulvey, M. A. (2008). Origins and Virulence

Mechanisms of Uropathogenic Escherichia coli. Exp Mol Pathol, 85, 11-19.

Zelaya, H., Tsukida, K., Chiba, E., Marranzino, G., Alvarez, S., Kitazawa, H.,

Agüero, G., & Villena, J. (2014). Immunobiotic Lactobacilli reduce viral-

associated pulmonary damage through the modulation of inflammation-

coagulation interactions. International Immunopharmacology, 19, 161–173.

Zhuo, M., Hope, R., Don L, T., Tyrrell, C., & Foster, J. W. (2002). Collaborative

Regulation of Escherichia coli Glutamate-Dependent Acid Resistance by Two

AraC-Like Regulators, GadX and GadW (YhiW). Journal of Bacteriology, 24,

7001–7012.

Zveza potrošnikov Slovenije [ZPS]. (4. april 2012). Test - probiotična prehranska

dopolnila. Prevzeto 21. april 2017 iz https://www.zps.si/index.php/hrana-in-

pijaa-topmenu-327/kakovost-ivil/5413-test-probiotina-prehranska-

dopolnila#probiotična-prehranska-dopolnila-na-testu

https://www.zps.si/index.php/hrana-in-pijaa-topmenu-327/kakovost-ivil/5413-test-probiotina-prehranska-dopolnila#probiotična-prehranska-dopolnila-na-testu



VPLIV RAZLIČNIH PROBIOTIKOV NA RAST IN PREŽIVETJE … filevzorce smo inkubirali tri dni. Izvedli...

Documents

Transcript of VPLIV RAZLIČNIH PROBIOTIKOV NA RAST IN PREŽIVETJE … filevzorce smo inkubirali tri dni. Izvedli...