Vpliv mikrovalov na stabilnost dvojne vijačnice DNK ... · časovnem okvirju niso imeli istega...

Magistrsko delo

Vpliv mikrovalov na stabilnost dvojne vijačnice DNK: Računalniški pristop

Avgust, 2017 Uroš Veselič

Uroš Veselič


Magistrsko delo

Maribor, 2017

Vpliv mikrovalov na stabilnost dvojne vijačnice DNK:

Računalniški pristop

Magistrsko delo študijskega programa II. stopnje

Študent: Uroš Veselič

Študijski program: magistrski študijski program II. stopnje Kemija

Predvideni strokovni naslov: magister kemije

Mentor: izr. prof. dr. Urban Bren

Somentor: asist. Martin Gladović, mag. kem.

Maribor, 2017


I

Kazalo

Kazalo ........................................................................................................................................ I Izjava........................................................................................................................................ II

Zahvala ................................................................................................................................... III Povzetek .................................................................................................................................. IV Abstract .................................................................................................................................... V Seznam tabel ........................................................................................................................... VI Seznam slik ........................................................................................................................... VII

Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................ IX

1 Uvod .................................................................................................................................. 1

1.1 Opredelitev problema ................................................................................................. 1 1.2 Pregled literature ........................................................................................................ 1 1.3 Namen, hipoteze in cilji ............................................................................................. 2

2 Teoretični del ..................................................................................................................... 3 2.1 Molekula DNK ........................................................................................................... 3

2.2 Mikrovalovi ................................................................................................................ 6

2.3 Metode računalniške kemije ...................................................................................... 8 2.4 Kvantno-kemijski modeli ........................................................................................... 9

2.4.1 Ab-initio metode ................................................................................................. 9

2.4.2 Semiempirične metode ..................................................................................... 11 2.5 Molekulska mehanika .............................................................................................. 12

2.5.1 Polje sil ............................................................................................................. 12

2.5.2 Monte Carlo simulacije..................................................................................... 18

2.5.3 Molekulska dinamika........................................................................................ 19 2.6 Uporabljeni računalniški programi .......................................................................... 21 2.7 Analiza rezultatov MD simulacij ............................................................................. 23

2.7.1 RMSD ............................................................................................................... 23 2.7.2 RMSF ................................................................................................................ 23

2.7.3 Analiza klastrov ................................................................................................ 24 3 Eksperimentalni del ......................................................................................................... 25

3.1 Računalniška oprema ............................................................................................... 25 3.2 Topologija odseka molekule DNK .......................................................................... 26

3.3 Ustvarjanje sistema map in podmap simulacij ......................................................... 27 3.4 Začetne minimizacije DNK molekule ..................................................................... 28

3.5 Zagon simulacij molekulske dinamike .................................................................... 29

3.6 Programi za analizo trajektorij simulacij ................................................................. 31 4 Rezultati in diskusija ....................................................................................................... 34

4.1 Vizualna predstavitev rezultatov .............................................................................. 34

4.2 Analiza RMSD in RMSF ......................................................................................... 37 4.3 Analiza razdalje med verigama DNK ter števila prisotnih vodikovih vezi ............. 45 4.4 Analiza energijskih trajektorij .................................................................................. 46 4.5 Analiza klastrov ....................................................................................................... 51

5 Zaključek ......................................................................................................................... 52

6 Literatura ......................................................................................................................... 53 7 Življenjepis ...................................................................................................................... 55


II

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko delo izdelal/a sam/a, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledal/a sem literaturo s področja magistrskega dela po naslednjih geslih:

Vir: Science direct (http://www.sciencedirect.com/)

Gesla: Število referenc

Shielding effect AND DNA solutions 4

Molecular dynamics simulation 8

Microwaves OR Microwave energy 5

GROMOS 5

Skupno število pregledanih člankov: 22

Skupno število pregledanih knjig: 6

Maribor, avgust 2017 Uroš Veselič

podpis


III

Zahvala

Zahvaljujem se mentorju, izr. prof. dr. Urbanu Brenu, za

približanje področja kvantne kemije in biomolekularnih simulacij

na predavanjih in za možnost opravljanja magistrskega dela prav

iz tega področja ter za vso pomoč pri izvedbi in pisanju zaključne

naoge. Velika zahvala tudi mag. Martinu Gladoviću za vso pomoč

in podporo pri izvajanju magistrskega dela.

Zahvalil bi se tudi svoji družini za izjemno podporo in motivacijo

skozi študijska leta.


IV


Povzetek

Vplivi sodobne tehnologije na vsakdanjik človeka so že dalj časa tema številnih znanstvenih

raziskav z različnih področij. Ne moremo zanikati, da sodobne tehnologije izredno

pripomorejo k razumevanju sveta okoli nas in nam v veliko primerih olajšajo in rešujejo

življenje. Poleg koristi, ki jih prinaša sodobna tehnologija, pa je potrebno ovrednotiti tudi

njene morebitne stranske učinke oziroma neželjene posledice uporabe sodobne tehnologije v

vsakdanjem življenju. Mikrovalovno valovanje je nedvomno pomemben del sodobne tehnike

v obliki mobilne telefonije, brezžičnih omrežij, radarjev, satelitov in GPS naprav. V zadnjih

letih je bilo opravljenih veliko študij na temo vpliva mikrovalov na človeka in okolje. V sklopu

magistrskega dela smo z računalniškim pristopom ugotavljali, ali elektromagnetno valovanje

v območju mikrovalov vpliva na stabilnost dvojne vijačnice DNK. S simulacijami molekulske

dinamike izbranega segmenta DNK v vodni razopini z razklopom temperature sistema na

translacijsko in rotacijsko temperaturo smo ugotavljali, ali imajo mikrovalovi sposobnost

povečati (ne)stabilnost v dvojni vijačnici DNK oziroma celo povzročiti popoln razpad dvojne

vijačnice. Po izsledkih dosedanjih študij na temo mikrovalov razlog za destabilizacijo dvojne

vijačnice DNK tiči v tem, da mikrovalovi vzbudijo rotacijsko gibanje polarnih molekul vode,

kar pa zmanjša senčenje elektrostatskega odboja med dvema negativno nabitima

komplementarnima verigama DNK. S tem se po poročanju dosedanjih raziskav tako poveča

možnost razpada verige in s tem tudi potencial za morebitne spremembe dednega materiala v

celicah, kar zaradi sprememb v sintezi in strukturi molekule DNK lahko privede celo do

nastanka rakavih obolenj.

Analiza rezultatov simulacij molekulske dinamike je pokazala, da mikrovalovi v 10 ns

časovnem okvirju niso imeli istega vpliva na stabilnost fragmenta DNK kot konvencionalno

termično gretje. Analiza rezultatov je pokazala, da je fragment pri simulacijah mikrovalovnega

gretja ostal v bolj stabilnem stanju kot pri termičnem gretju.

Ključne besede: Mikrovalovi, DNK, molekulska dinamika, ločeni termostati

UDK: 615.849:54.022(043.2)


V

The influence of microwave irradiation on the stability of double-stranded DNA: A computational approach

Abstract

The influence of modern technology on our everyday lives has been a topic of a number of

scientific papers. We cannot deny that modern techologies contribute a great deal to our

understanding of the world and make our lifes easier in so many ways. However, despite all

the benefits that modern techonolgy brings we have to consider possible unwanted side effects

and consicuences of this techonolgy on our everyday live. Microwaves are undoubtely applied

in the most important achievements of modern techonolgy like radars, satellites, mobile

technology, wireless networks and GPS devices. In recent years, there has been quite a lot of

studies reporting the effects of microwaves on people and environment in recent years. In our

study we have been investigating the influence of microwave irradiation on the stability of

double-stranded DNA using a computational approach. We have used molecular dynamics

simulations with separate thermostates for rotational and translational degrees of freedom to

examine whether microwaves decrease the stability of double stranded DNA or even induce a

total destruction of the double helix. So far, studies have showed that the reason behind the

instability of the DNA when exposed to microwave irradiation lies in the increased rotational

temperature of the water molecules which in turn decreases the shielding of electrostatic

charges of the negatively charged chains of double-stranded DNA and hence increases the

potential of possible deffects in the genetic material of the cells and can due to changes in

synthesis and structure of the DNA molecule lead even to carcinogenesis.

The analysis of our results of 10 ns molecular dynamics simulations showed that microwave

irradiation did not have the same influence on the stability of the DNA fragment as did

conventional thermal heating. Analysis showed that the fragment remained in a more stable

state when exposed to microwave irradiation than in simulations of conventional thermal

heating.

Key words: Microwaves, DNA, molecular dynamics, seperate thermostats

UDK: 615.849:54.022(043.2)


VI

Seznam tabel

Tabela 1: RMSD in RMSF analize 10 ns dolgih simulacij .................................................... 37

Tabela 2: TSER analiza 10 ns dolgih simulacij ...................................................................... 45

Tabela 3: Dejanske povprečne temperature posameznih komponent sistema ........................ 46

Tabela 4: Analiza trajektorij neveznih potencialnih energij ................................................... 47

Tabela 5: Analiza klastrov ...................................................................................................... 51


VII

Seznam slik

Slika 1: Osnovni gradniki molekule DNK ............................................................................... 3

Slika 2: 2'-deoksiriboza in riboza ............................................................................................. 4

Slika 3: Zvita oblika dvojne vijačnice DNK pri 300K ............................................................. 5

Slika 4: Dipolna polarizacija pod vplivom oscilirajočega mikrovalovnega sevanja ................ 6

Slika 5: Ionska prevodnost ....................................................................................................... 6

Slika 6: Ponazoritev dihedralnih kotov med atomom klora in vodika (modro), ter dvema

atomoma klora (rdeče) [8] ...................................................................................................... 14

Slika 7: Nepravilni torzijski kot v molekuli benzena. Vodik je izrinjen iz planarne ravnine. 15

Slika 8: Krivulja Lennard-Jones potenciala ............................................................................ 16

Slika 9: Vizualni prikaz Monte Carlo metode. Slikice označene z rdečo piko predstavljajo

zavrnjene konformacije sistema ............................................................................................. 18

Slika 10: Ponazoritev Verletovega algoritma ......................................................................... 20

Slika 11: Koraki simulacije molekulske dinamike ................................................................. 21

Slika 12: VMD program ......................................................................................................... 22

Slika 13: Topologija DNK fragmenta .................................................................................... 26

Slika 14: Datotečna struktura simulacij .................................................................................. 27

Slika 15: Začetna minimizirana in termalizirana konformacija izbranega fragmenta DNK pri

300K ....................................................................................................................................... 28

Slika 16: .arg datoteka ............................................................................................................ 29

Slika 17: .imd datoteka ........................................................................................................... 29

Slika 18: .imd datoteka za pripravo simulacije s povišano rotacijsko temperaturo vode ....... 30

Slika 19: Vhodna datoteka za analizo s programom ene_ana ................................................ 31

Slika 20: Vhodna datoteka za izračun celotnega RMSD ........................................................ 32

Slika 21: Vhodna datoteka za izračun notranjega RMSD ...................................................... 32

Slika 22: Vhodna datoteka za analizo RMSF ......................................................................... 32

Slika 23: Vhodna datoteka za zagon programa Frameout ...................................................... 33

Slika 24: Vhodna datoteka za zagon programa TSER............................................................ 33

Slika 25: Vhodne datoteke za analizo klastrov ....................................................................... 33

Slika 26: Začetna (levo) in končna (desno) konformacija molekule DNK pri 300 K ............ 34

Slika 27: Začetna (levo) in končna (desno) konformacija molekule DNK pri povišani zgolj

rotacijski temperaturi na 400 K .............................................................................................. 34

Slika 28:Začetna (levo) in končna (desno) konformacija molekule DNK pri 400 K ............. 35

Slika 29:Začetna (levo) in končna (desno) konformacija molekule DNK pri povišani zgolj



Slika 31: Začetna (levo) in končna (desno) konformacija molekule DNK pri povišani zgolj



Slika 33: RMSD analiza za simulacijo 300K ......................................................................... 38


VIII

Slika 34: RMSD analiza za simulacijo R400K ....................................................................... 39

Slika 35: RMSD analiza za simulacijo 400K.......................................................................... 39





Slika 40: RMSF analiza simulacije 300K ............................................................................... 42

Slika 41: RMSF analiza simulacije R400K ............................................................................ 42


Slika 43: RMSF analiza simualcije R500K ............................................................................ 43


Slika 45: RMSF analiza simulacije R600K ............................................................................ 44


Slika 47: Spreminjanje nevezne potencialne energije s časom pri simulaciji 300K. Zelena

barva ponazarja interakcije DNK-DNK. Modra predstavlja energijo DNK-voda. Rdeča

predstavlja povprečje obeh interakcij, svetlo modra barva pa predstavlja vsoto obeh interakcij

................................................................................................................................................. 47

Slika 48: Spreminjanje nevezne potencialne energije s časom pri simulaciji R400K. Zelena

barva ponazarja interakcije DNK-DNK. Modra ponazarja energijo DNK-voda. Rdeča


................................................................................................................................................. 48




................................................................................................................................................. 48




................................................................................................................................................. 49




................................................................................................................................................. 49




................................................................................................................................................. 50




................................................................................................................................................. 50


IX

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli

a Pospešek (𝑚

𝑠2)

ci Koeficient linearne kombinacije (/)

E Energija sistema (𝑘𝑐𝑎𝑙

𝑚𝑜𝑙)

F Sila (N)

H Hamiltonov operator (/)

i Imaginarna komponenta (/)

Kl, Kθ, Kφ Harmonske konstante (različne enote)

l razdalja (m)

m masa (kg)

n multipliciteta (/)

r Krajevni vektor (Ǻ)

t Čas (s)

u dihedralni kot (rad)

V Potencial (𝑘𝑐𝑎𝑙

𝑚𝑜𝑙)

Grški simboli

ℏ Reducirana Planckova konstanta (𝑒𝑉𝑠

𝑟𝑎𝑑)

Δ Razlika/sprememba (/)

θ Valenčni kot (rad)

σ Razdalja trka (m)

ε Globina potencialnega vodnjaka (𝑘𝑐𝑎𝑙

𝑚𝑜𝑙)

ψ Valovna funkcija (/)

𝜕 Parcialni odvod (/)

φ Torzijski kot (rad)

γ Fazni kot (rad)


X

Kratice

AM1, PM3 Semi-empirični metodi

DNK Deoksiribonukleinska kislina (ang. DNA)

HF Hartee-Fock metoda

IR Infrardeče valovanje

MAE Ekstrakcija z mikrovalovi (ang. Microwave Assisted Extraction)

MC Monte Carlo metoda

MD Molekulska dinamika

NMR Nuklearna magnetna resonanca (ang. Nuclear Magnetic Resonance)

RMSD Koren povprečnega kvadrata razlike (ang. Root Mean Square Deviation)

RMSF Koren povprečnega kvadrata fluktuacije (ang. Root Mean Square Fluctuation)

RNK Ribonukleinska kislina (ang. RNA)

SCF Samouglašeno polje (ang. Self-Consistent Field)

XRD Difrakcija z rentgenskimi žarki (ang. X-ray Diffraction)


1

1 Uvod

1.1 Opredelitev problema

Mikrovalovi so del spektra elektromagnetnega valovanja z valovnimi dolžinami od 1 mm do

1 m oziroma frekvencami valovanja od 300 MHz do 300 GHz. Tehnologija nas spremlja že

kar nekaj časa tudi v vsakdanjem življenju. Uporabljamo jo v gospodinjstvu v obliki

mikrovalovnih pečic, v napravah za mobilno telefoniranje, satelitih, radarjih brezžičnih

omrežjih.

Kljub številnim uporabnim in trgovsko zanimivim lastnostim imajo mikrovalovi tudi svojo

temno plat. Raziskave namreč kažejo, da mikrovalovno gretje v primerjavi s konvencionalnim

gretjem spodbuja taljenje DNK, kar lahko vodi do poškodb dednega materiala ter posledično

do nastanka raka [1]. Obsevanje z mikrovalovi vzbudi rotacijsko gibanje polarnih molekul

vode oziroma viša njihovo rotacijsko temperaturo, kar pa lahko povzroči razpad dvojne

vijačnice DNK [1]. To bomo preverili s simulacijo molekulske dinamike z ločenima

termostatoma za rotacijske in translacijske prostostne stopnje.

1.2 Pregled literature

Po pregledu obstoječe literature na temo vpliva mikrovalov na stabilnost DNK smo zasledili,

da je bila dokazana povezava med povišano rotacijsko temperaturo in zmanjšano hidratacijo

polarnih molekul ter povišano hidratacijo nepolarnih zvrsti [2]. Dosedanja literatura prav tako

potrjuje vpliv mikrovalovnega sevanja na razpad dvojne vijačnice deoksioligonukleotidov

krepko pod njihovo termalno talilno temperaturo, in to neodvisno od dolžine

deoksioligonukleotidov [1]. Ugotovitve dosedanjih raziskav [3] kažejo tudi, da rotacijsko

gibanje molekul vode poviša stopnjo združevanja hidrofobnih molekul v bolj kompaktne

strukture zaradi destabilizacije vodnih molekul v njihovi prvi hidracijski lupini. V literaturi

[4] smo prav tako zasledili, da se je uporaba mikrovalov in njihov vpliv na stabilnost DNK že

uveljavila kot tehnika za fragmentacijo genomske DNK. To nam daje dobro iztočnico za

preučitev vpliva mikrovalov na stabilnost dvojne vijačnice DNK in s tem možnost vpogleda v

morebitno povezavo med mikrovalovnim sevanjem in mutagenezo ter posledičnim pojavom

genetskih obolenj.


2

1.3 Namen, hipoteze in cilji

Cilj magistrskega dela je izvesti simulacijo molekulske dinamike z ločenima termostatoma za

rotacijsko in translacijsko temperaturo pri razilčnih temperaturah sistema in na podlagi analize

vrednosti RMSF (root mean square fluctuation), RMSD (root mean square deviation),

vodikovih vezi in radialne porazdelitvene funkcije, klastrov in medsebojnih razdalj med

posameznimi atomi preveriti, ali rotacijsko vroča voda vpliva na stabilnost dvojne vijačnice

DNK.

Osnovna hipoteza magistrskega dela se glasi, da polarne molekule vode z višjo rotacijsko

temperaturo povzročajo taljenje dvojne vijačnice DNK, saj zmanjšajo senčenje

elektrostatskega odboja med negativno nabitima komplementarnima verigama DNK.


3

2 Teoretični del

2.1 Molekula DNK

Molekula DNK oziroma molekula deoksiribonukleinske kisline je poleg RNK ali

ribonukleinske kisline ena izmed glavnih predstavnikov nukleinskih kislin. Te dolge biološke

makromolekule so sestavljene iz dveh verig deoksiribonukleotidov, verigi pa sta stabilizirani

z vodikovimi vezmi med nukleotidi. Na tem mestu je treba razložiti nekaj osnovnih pojmov,

ki se pogosto uporabljajo pri opisovanju funkcije in strukture DNK. To so pojmi nukleobaze,

nukleozida, nukleotida in nukleinske kisline.

Strukturo molekule DNK lahko opišemo kot zaporedje nukleotidov, natančneje

deoksiribonukleotidov. Nadalje pa nukleotide opišemo kot fosfatne estre tako imenovanih

nukleozidov, ki so sestavljeni iz molekule sladkorja in molekule nukleobaze. Skupino

nukleobaz sestavlja pet molekul. To so adenin, gvanin, citozin in timin. Nukleobaze glede na

vrsto molekule delimo na purine in pirimidine. Med purinske molekule spadata gvanin in

adenin, med pirimidinske pa citozin in timin. Na Sliki 1 so ponazorjeni vsi omenjeni gradniki

molekule DNK.

Slika 1: Osnovni gradniki molekule DNK


4

Posamezni gradniki DNK (nukleobaze) so topni v vodi v dokaj širokem območju pH (od 6 do

8) [5]. Pri nižjih pH vrednostih pa nukleozidi postanejo nabiti. Zaradi prisotnosti sladkorjev

so deoksiribonukleozidi bolj topni kot same nukleobaze, vendar je pri pogojih vzdrževanih v

celicah deoksiribonukleozid nevtralna kemijska zvrst. Med posameznimi gradniki DNK imajo

še večjo topnost fosforilirani nukleozidi zaradi prisotnih fosfodiesterskih vezi. Fosfatne

skupine v DNK nosijo negativni naboj, kar omogoči vezavo številnih proteinov in pozitivnih

kovinskih ionov na ogrodje molekule DNK preko elektrostatskih interakcij. Zaradi fleksibilne

strukture pentoznega sladkorja in glikozidne vezi, lahko molekula DNK zavzame več možnih

konformacij, ki vplivajo na obliko oziroma zvitje molekule. V molekuli pentoznega sladkorja

2-deoksi-D-riboze sta zaradi napetosti v obroču eden ali dva ogljikova atoma zamaknjena

izven planarne lege. Na podlagi tega ločimo tako imenovano južno oziroma »south«

konformacijo ter severno oziroma »north« konformacijo [5]. Po dogovoru južna oziroma C2'-

endo konformacija pomeni lego C2' atoma nad planarno ravnino, severna oziroma C3'-endo

konformacija pa pomeni lego C3' atoma nad planarno ravnino sladkorja. Atom leži nad

planarno ravnino, ko je sladkor orientiran tako, da kažeta C5' atom ter nukleobaza proč od

obroča sladkorja. Različne konformacije so možne tudi pri bazah nukleozidov oziroma

nukleotidov. Enojna glikozidna vez namreč omogoča prosto rotacijo, kar privede do tako

imenovane »anti« in »syn« konformacije. Do »anti« konformacije pride, kadar atom H8 pri

purinih oziroma atom H6 pri pirimidinih leži nad molekulo sladkorja, do »syn« konformacije

pa kadar ista dva atoma ležita proč od sladkorja. Vse konformacije skupaj vplivajo na strukturo

dvojne vijačnice DNK.

Slika 2: 2'-deoksiriboza in riboza

Posamezne deoksiribonukleotide v celoto do deoksiribonukleinske kisline povežejo

fosfodiesterske vezi. Te povežejo 5'-hidroksilno skupino enega nukleotida s 3'-hidroksilno

skupino naslednjega nukleotida. Tako se zaporedje verige oligonukleotidov na enem koncu

zaključi s 3'-OH skupino, na drugem pa 5'-OH skupino: 3'-terminus in 5'-terminus. Po

dogovoru privzamemo, da se zaporedje oligonukleotida začne in nadaljuje v smeri od 5'-

terminusa do 3'-terminusa. Polimerizacija se nadaljuje do deoksiribonukleinske kisline

oziroma DNK, ki hrani celoten genetski zapis organizma in predstavlja eno izmed

najpomembnejših makromolekul v živih bitjih. Medtem, ko je hrbtenica (ang. backbone)

DNK dokaj podobna v vseh vrstah DNK (rastline, živali, ljudje), pa se zaporedje in število

posameznih baz v verigi močno razlikuje od organizma do organizma. Zaporedje oziroma

sekvenca baz je namreč razlog za takšno raznolikost in kompleksnost organizmov v naravi.


5

Tako kot pri vseh molekulah, tudi molekula DNK teži k čim nižji potencialni energiji. To

pomeni, da molekula DNK ne predstavlja popolnoma linearno zaporedje

deoksiribonukleotidov, temveč se vsi atomi oziroma gradniki molekule v prostoru razporedijo

tako, da je v molekuli čim manj napetosti oziroma čim manj elektrostatskih odbojev in

steričnih motenj. Izkaže se, da je najugodnejša oblika molekule DNK oblika dvojnega heliksa

ali dvojne vijačnice (Slika 3). Razlog za vijačno obliko je ta, da so v primeru vijačnice

interakcije hidrofobnih nukleobaz z vodo minimalne. V primeru dvojne vijačnice so

interakcije hidrofobnih baz z molekulami vode skoraj popolnoma onemogočene, obenem pa

omogočijo zelo dobro hidratacijo hidrofilnih skupin sladkorja in fosfata. K dodatni stabilizaciji

oblike dvojne vijačnice pa pripomorejo še vodikove vezi, ki se vzpostavijo med

komplementarnimi bazami v vijačnici. Komplenetarne baze so pari na nasprotnih straneh

dvojne vijačnice, ki se preko vodikovih vezi povežejo med seboj. Tako sta komplementarni

bazi s tremi vodikovimi vezmi citozin in gvanin ter komplementarni bazi z dvema vodikovima

vezema adenin in timin.

Slika 3: Zvita oblika dvojne vijačnice DNK pri 300K


6

2.2 Mikrovalovi

Mikrovalovi so elektromagnetno valovanje in poleg vidne svetlobe, ultravijoličnih,

rentgenskih, infrardečih, radijskih in gama žarkov sestavljajo elektromagnetni spekter. So

nepogrešljivi del elektronskih naprav na vseh področjih življenja. V vsakodnevnem življenju

mikrovalove najpogosteje asociiramo z mikrovalovno pečico. Vendar pa poleg rabe v

gospodinjstvu mikrovalove uporabljamo za delovanje navigacijskih sistemov, mobilnih

telefonov, satelitov, sistemov za nadzor prometa – radarjev ter v raziskovalne namene, kot je

ekstrakcija s pomočjo mikrovalov oziroma tako imenovana MAE (microwave assisted

extraction) in mikrovalovna kataliza.

Gledano iz molekularnega vidika nam mikrovalovi v kemiji omogočajo raznovrstno uporabo

preko dveh osnovnih mehanizmov: dipolne polarizacije in ionske prevodnosti [2]. Dipolna

polarizacija pomeni ureditev molekul vode in ostalih polarnih molekul oziroma njihovo

orientacijo pod vplivom zunanjega oscilirajočega elektromagnetnega polja, ki deluje na

polarne molekule, pri katerih so prisotni dipoli neodvisni drug od drugega in se lahko

neodvisno vrtijo okoli svoje osi, za razliko od ionske polarizacije (Slika 4).

Slika 4: Dipolna polarizacija pod vplivom oscilirajočega mikrovalovnega sevanja

Do pojava ionske prevodnosti pa pride, kadar se hidratizirana nabita molekula ali ion ob

prisotnosti oscilirajočega mikrovalovnega sevanja orientira tako, da se predhodno simetrična

hidratizirana struktura v prisotnem polju deformira pod vplivom oscilirajočega valovanja

(Slika 5)

Slika 5: Ionska prevodnost


7

Oba opisana mehanizma z različnima deležema prispevata k rotacijski vzbujenosti vodnih

molekul v sistemu [2]. Kadar pride do kontinuirnega obsevanja z mikrovalovi, presežna

rotacijska energija ne more povsem disipirati na vibracijsko in translacijsko prostostno

stopnjo, kar privede do povišane rotacijske temperature v primerjavi z vibracijsko in

translacijsko temperaturo. Ravno takšen pojav smo želeli doseči pri preučevanju našega

sistema. To nam je omogočilo, da smo v simulaciji ustvarili približno takšno okolje, kot bi ga

srečali v realnem sistemu gretja raztopine makromolekule z mikrovalovi.


8

2.3 Metode računalniške kemije

Ljude so že od nekdaj želeli avtomatizirati reševanje računskih problemov. Bodisi izvajati

preprostejše izračune v krajšem času kot sicer, preverjati točnost lastnih izračunov ali pa jih

uporabljati kot pomoč pri opravilih na najrazličnejših področjih življenja. Eno izmed teh

področij je nedvomno tudi kemija. Kemiki so že vse od začetka znanosti imeli opravka s

številnimi izračuni, obdelavo podatkov, kot so na primer lastnosti elementov, molekul, reakcij

in informacijami o vedno naraščajočem številu rezultatov eksperimentov, ki so osnova za

nadaljnji razvoj kemijske znanosti (določanje konstante ravnotežja, hitrosti reakcij idr.). Zato

so tudi kemiki imeli željo po uporabi računalnika pri svojem delu, kjer bi hranili vse

pomembne informacije in kar bi jim omogočilo hitrejše reševanje problemov v prihodnosti.

Tako se je začela razvijati veja kemije, ki se imenuje računalniška kemija. Čeprav so

računalniki v obliki, kot jih poznamo danes prisotni že vse od začetka 20. stoletja, je

računalniška kemija kot ločeno področje kemije obveljala šele leta 1998, ko sta Walter Kohn

in John Pople prejela Nobelovo nagrado za uporabo računalniških metod v kemiji.

Pod pojmom računalniške kemije razumemo združeno uporabo fizikalno-kemijskih zakonov

in parametrov, matematičnih modelov ter računalniških programov za reševanje kemijskih

problemov. Primarni namen računalniške kemije je sestaviti tako dovršen matematični model,

ki kar se da podrobno opiše nek pojav v realnem svetu, da ga lahko avtomatiziramo in

uporabimo pri reševanju vseh nadaljnjih podobnih pojavov. Takšni pojavi so lahko

določevanje prehodnih stanj molekul, ravnotežnih konstant, hitrosti kemijskih reakcij, veznih

in neveznih energij sistemov, porazdelitev in gostot elektronov ter nabojev, zvijanja proteinov

v različnih okoljih in določevanje termodinamskih parametrov.

Velike prednosti računalniškega pristopa k reševanju kemijskih problemov so:

• Nizki stroški izvajanja: Računalnik nam omogočam da določen izračun oz. simulacijo

ponovimo večkrat in vsakič po želji spremenimo pogoje in model reševanja, kar bi v

eksperimentalnem laboratoriju vzelo neprimerno več časa in občutno zvišalo stroške

zaradi porabe reaktantov in opreme.

• Spreminjanje pogojev: Uporaba simulacij nam omogoči nastavitev točno takšnih

pogojev, kot jih sami želimo, bodisi izjemno veliki tlaki ali ekstremno visoke

temperature, brez uporabe drage opreme.

• Varnost: V računalniških simulacijah lahko iz varne »razdalje« preko računalnika

izvajamo reakcije ali preučujemo nevarne sisteme, kot so na primer kancerogene,

eksplozivne in strupene spojine.


9

Računalniška kemija zajema veliko število metod za opisovanje vseh vrst sistemov, ki se

nenehno izboljšujejo in dopolnjujejo. Metode lahko razdelimo v dve večji skupini. To so

kvantno-kemijski modeli ter klasični modeli. Metode, ki zajemajo reševanje po kvantno-

kemijskih modelih, uporabljajo osnove kvantne mehanike, to je reševanje Schrödingerjeve

enačbe, za izračun fizikalno-kemijskih lastnosti snovi. Metode, ki uporabljajo klasične

modele, pa se opirajo na izračune na osnovah klasične oziroma Newtonove mehanike, to je

reševanje Newtonovih enačb gibanja.

2.4 Kvantno-kemijski modeli

V to skupino sodijo metode, ki temeljijo na osnovah kvantne mehanike in reševanju

Schrödingerjeve enačbe. Nadalje lahko to skupino razdelimo na dve podskupini. To so ab-

initio metode in semi-empirične metode. Ab-initio metode, kot že ime pove (od začetka), so

metode, pri katerih uporabljamo izključno fizikalne konstante in fizikalne lastnosti atomov v

sistemu ter pridobimo rešitve izključno z reševanjem Schrödingerjeve enačbe. Pri semi-

empiričnih metodah nekoliko popustimo stroge zahteve in v izračunih uporabljamo še

podatke, ki jih pridobimo izkustveno iz eksperimentov, ter približke, ki nam pohitrijo in

poenostavijo reševanje problemov.

2.4.1 Ab-initio metode

Ab-initio metode, osnovane na principih kvantne mehanike, pri izračunih zajemajo izključno

fizikalno-kemijske konstante in reševanje Schrödingerjeve enačbe s čim manj

predpostavkami. Osnova kvantne mehanike je Schrödingerjeva enačba (Enačba 1).

{−ℏ2

2𝑚(

𝜕2

𝜕𝑥2+

𝜕2

𝜕𝑦2+

𝜕2

𝜕𝑧2) + 𝑉} 𝜓(𝑟, 𝑡) = 𝑖ℏ

𝜕𝜓(𝑟, 𝑡)

𝜕𝑡 (1)

Zgornja enačba opisuje valovno funkcijo enega delca ψ (npr. elektrona) v prostoru z zunanjim

poljem V, s koordinatami x, y, z in maso m. ℏ predstavlja Planckovo konstanto deljeno z 2π, i

pa predstavlja kvadratni koren od -1 oziroma imaginarno komponento. ψ(r,t) torej predstavlja

valovno funkcijo delca, to je funkcijo ki opiše in okarakterizira njegovo gibanje. Kadar se

zunanje polje oziroma potencial ne spreminja s časom, lahko enačbo poenostavimo:

{−ℏ2

2𝑚(

𝜕2

𝜕𝑥2+

𝜕2

𝜕𝑦2+

𝜕2

𝜕𝑧2) + 𝑉} 𝜓(𝑟) = 𝐸𝜓(𝑟) (2)

Tu E predstavlja lastno vrednost valovne funkcije, oziroma energijo našega sistema. Obstaja

še alternativni zapis:

{−ℏ2

2𝑚∇2 + 𝑉} 𝜓(𝑟) = 𝐸𝜓(𝑟) (3)

Kjer velja ∇2= (𝜕2

𝜕𝑥2 +𝜕2

𝜕𝑦2 +𝜕2

𝜕𝑧2)


10

Nadalje lahko enačbo 3 še poenostavimo s vpeljavo operatorja – matematične operacije, ki

deluje na našo funkcijo. Takšen operator se imenuje Hamiltonov operator H.

𝐻 = −ℏ2

2𝑚∇2 + 𝑉 (4)

Vpeljava Hamiltonskega operatorja nam Schrödingerjevo enačbo poenostavi v sledeč zapis,

kjer z rešitvijo enačbe dobimo energijo sistema:

𝐻𝜓(𝑟) = 𝐸𝜓(𝑟) (5)

Schrödingerjeva enačba tako spada med parcialne diferencialne enačbe, pri katerih imamo

spremenljivke v odvodih oziroma diferencialih funkcije. Za rešitev takšne enačbe je potrebno

najti takšno funkcijo, imenovano lastna funkcija, pri kateri po delovanju Hamiltonskega

operatorja na to funkcijo kot rezultat dobimo to isto funkcijo in še neko numerično vrednost

E, ki jo imenujemo lastna vrednost funkcije 𝜓(𝑟) in predstavlja skalar, ki ustreza energiji delca

v izbranem sistemu.

Ab-initio metode so zaradi kompleksnosti reševanja Schrodingerjeve enačbe analitično

rešljive samo za majhne sisteme enega elektrona. Kvantno-mehanske metode zato zahtevajo

zelo zmogljive računalniške sisteme, ki so sposobni izvajati operacije z veliko količino

podatkov. So pa rezultati takšnih izračunov izredno točni.

Ena od prvih metod za reševanje Schrödingerjeve enačbe je tako imenovana Hartree-Fock

metoda (krajše HF). Ta metoda upošteva dva približka za lažje računanje. V metodi je

upoštevana neločljivost elektronov, torej možnost njihove zamenjave. Izračunana je torej

povprečna vrednost odbojnih sil med elektroni in ne interakcije vsakega elektrona s vsakim

posebej. S tem poenostavi nalogo izračuna ene Schrodingerjeve enačbe za več elektronov

skupaj v več enostavnejših enačb za en elektron. Rešitev vsake takšne enačbe predstavlja

valovno funkcijo (orbitalo) in njeno energijo, v kateri se elektron nahaja v povprečnem

potencialu oziroma »oblaku« ostalih elektronov. Te eno-elektronske funkcije so imenovane

bazne funkcije. Pri reševanju Schrödingerjeve enačbe za neko molekulo si računanje

poenostavimo s vpeljavo teorije molekulskih orbital (teorija MO). Teorija molekulskih orbital

obravnava molekulo podobno kot atom. Tako kot ima atom svoje orbitale in valovne funkcije,

teorija molekulskih orbital predpostavi da ima molekula molekulske orbitale, ki so

kombinacija posameznih atomskih orbital atomov v molekuli. To pomeni, da lahko valovno

funkcijo molekulske orbitale zapišemo kot linearno kombinacijo N baznih funkcij oziroma

valovnih funkcij N elektronov v sistemu.

𝜓𝑖 = ∑ 𝑐𝑣𝑖𝜙𝑣𝑖 (6)

𝑁

𝑣=1

cvi – koeficient linearnega razvoja

𝜙vi – valovna funkcija posameznega elektrona


11

Koraki izračuna po Hartree-Fock metodi so naslednji:

• Izmislimo si začetni sistem funkcij 𝜓𝑖

• Izračunamo nove koeficiente linearne kombinacije in njihove energije

• Postopek ponavljamo in primerjamo izračunane energije in koeficiente, dokler ne

konvergirajo k izbrani vrednosti.

Temu iterativnemu postopku pravimo SCF (ang. Self-consistent field method) oziroma

metoda samouglašenega polja.

2.4.2 Semiempirične metode

Semiempirične metode ponujajo poenostavitev reševanja zapletenih in dolgotrajnih abinitio

metod. Gre sicer še vedno za metode osnovane na osnovah kvantne mehanike, vendar z

dodatki empiričnih ali izkustvenih približkov in poenostavitev. Pri semiempiričnih metodah

uporabljamo podoben sistem reševanja kot pri Hartree-Fock metodi, vendar kvantne izračune

kombiniramo z eksperimentalnimi podatki. To so lahko na primer eksperimentalno določeni

atomski radiji, ionski potenciali, NMR premiki idr. To privede do pohitritve naših izračunov,

kar je velika prednost semiempiričnih metod pred abinitio metodami. Prav tako nam te metode

omogočajo obravnavanje večjih sistemov do nekaj 100 atomov. Za razliko od abinitio metod

so semiempirične manj natančne, saj moramo upoštevati morebitne sistematične napake, ki

izvirajo iz eksperimentalnih podatkov in uporabljenih približkov. Kljub manjši natančnosti gre

za zanesljive metode, ki lahko zelo dobro napovejo obnašanje sistema in nam dajo pomembne

informacije.

Ena izmed bolj enostavnih semiempiričnih metod je Hückelova metoda. Ta metoda se

osredotoči izključno na obravnavo π-elektronov v aromatskih sistemih. To se zdi kot zelo

obsežna poenostavitev, vendar s to metodo lahko uspešno in preprosto obravnavamo

aromatične sisteme in nam služi za obravnavo aromatičnosti sistemov, teorije barv in tudi

prevodnosti polimerov. Omejitev te metode je, da ne upošteva interakcij z ostalimi atomi.

Kljub temu pa lahko pridobimo uporabne informacije o aromatskih sistemih. Poleg Hückelove

teorije sta med bolj znanimi semiempiričnimi metodami še AM1 in PM3, ki služita za

obravnavo molekularne elektronske strukture; razlika med njima pa je v uporabi različnih

števil Gaussovih baznih funkcij za opis valovnih funkcij v atomih.


12

2.5 Molekulska mehanika

Druga skupina metod, uporabljenih v računalniški kemiji, predstavlja pristop reševanja

lastnosti sistema s strani klasične fizike in z reševanjem Newtonovih enačb gibanja, za razliko

od kvantno-kemijskih modelov, kjer imamo opravka s Schrödingerjevo enačbo. Te metode,

imenovane metode molekulske mehanike, se izognejo reševanju Schrödingerjeve enačbe in

namesto tega uporabijo enačbe klasične fizike za opis večjih molekul na ravni vzmeti in

kroglic, ki posnemajo atome in vezi, namesto določevanja valovne funkcije za vsak posamezni

elektron v molekuli. Te metode lahko obravnavajo velike sisteme, do nekaj 1000 atomov, kar

je praktično neizvedljivo s kvantno-kemijskimi metodami, saj bi zahtevale nepredstavljivo

veliko računalniške moči. Dve najpogostejši metodi molekulske mehanike, ki jih srečamo pri

obravnavi večjih biomolekularnih sistemov, sta molekulska dinamika (MD) in Monte Carlo

(MC). Glavna razlika med tema metodama je, da pri molekulski dinamiki računamo enačbe

gibanja delcev v sistemu v časovnem zaporedju korak za korakom, pri Monte Carlo

simulacijah pa v vsakem koraku spremenimo koordinate naključno izbranega delca v sistemu

in nato preračunamo potencialno energijo sistema.

2.5.1 Polje sil

Molekulska mehanika se izogne reševanju zapletenih kvantno-kemijskih enačb tako, da uvede

tako imenovano molekularno polje sil. Molekularno polje sil je sestavljeno iz empirične

potencialne funkcije in empiričnih parametrov. Empirična potencialna funkcija vsakemu

delcu v sistemu pripiše ustrezno potencialno energijo in nam pove, na kakšen način se

potencialna energija spreminja glede na spremembo položaja v sistemu.

𝑉 = 𝑓(𝑟𝑁) (7)

V – potencialna energija (𝑘𝑐𝑎𝑙

𝑚𝑜𝑙)

r – koordinata (položajni vektor)

N – število atomov v molekuli

Empirična potencialna funkcija se sestoji iz preprostejših enačb klasične Newtonove fizike, ki

dobro opišejo obnašanje molekule z analogijo vzmeti in kroglic. Tako na primer s klasičnimi

enačbami za harmonski oscilator lahko opišemo potencialno energijo vezi, valenčnih,

dihedralnih in nepravih torzijskih kotov. Osnovno obliko empirične potencialne funkcije opiše

enačba 8.

𝑉(𝑟𝑁) = 𝑉𝑣𝑒𝑧𝑛𝑖(𝑟𝑁) + 𝑉𝑛𝑒𝑣𝑒𝑧𝑛𝑖(𝑟𝑁) (8)


13

Vezni del potenciala sestavlja potencialna energija kovalentnih vezi 𝑉𝑘𝑜𝑣𝑎𝑙.𝑣𝑒𝑧𝑖(𝑟𝑁), energija

valenčnih kotov 𝑉𝑣𝑎𝑙.𝑘𝑜𝑡(𝑟𝑁), energija dihedralnih kotov 𝑉𝑑𝑖ℎ.𝑘𝑜𝑡(𝑟𝑁) ter energija nepravih

torzijskih kotov 𝑉𝑛𝑒𝑝.𝑡𝑜𝑟.𝑘𝑜𝑡(𝑟𝑁). K neveznemu delu empirične potencialne funkcije pa

spadata van der Waalsova 𝑉𝑣𝑑𝑊(𝑟𝑁) in elektrostatska interakcija 𝑉𝑒𝑙.𝑠𝑡𝑎𝑡(𝑟𝑁).

𝑉𝑣𝑒𝑧𝑛𝑖(𝑟𝑁) = 𝑉𝑘𝑜𝑣𝑎𝑙.𝑣𝑒𝑧𝑖(𝑟𝑁) + 𝑉𝑣𝑎𝑙.𝑘𝑜𝑡(𝑟𝑁) + 𝑉𝑑𝑖ℎ.𝑘𝑜𝑡𝑖(𝑟𝑁) + 𝑉𝑛𝑒𝑝.𝑡𝑜𝑟.𝑘𝑜𝑡(𝑟𝑁) (9)

𝑉𝑛𝑒𝑣𝑒𝑧𝑛𝑖(𝑟𝑁) = 𝑉𝑣𝑑𝑊(𝑟𝑁) + 𝑉𝑒𝑙.𝑠𝑡𝑎𝑡(𝑟𝑁) (10)

Potencial 𝑉𝑘𝑜𝑣𝑎𝑙.𝑣𝑒𝑧𝑖(𝑟𝑁) opiše Hookov zakon.

𝑉𝑘𝑜𝑣𝑎𝑙.𝑣𝑒𝑧𝑖(𝑟𝑁) = 1

2𝐾𝑙(𝑙 − 𝑙0)2 (11)

𝐾𝑙 – Harmonska konstanta

𝑙 – dolžina skrčene ali raztegnjene vzmeti (vezi)

𝑙0 – ravnovesna razdalja vzmeti (vezi)

Kadar je harmonska konstanta velika, pomeni, da imamo opravka s tršo vzmetjo oziroma

močnejšo vezjo med atomoma. Harmonsko konstanto in ravnovesno razdaljo vzmeti pa

dobimo eksperimentalno, torej sta empirična parametra. Vrednost harmonske konstante

dobimo z IR analizo (infrardeča spektroskopija), vrednost ravnovesne razdalje vezi pa

pridobimo po Braggovem zakonu z meritvami rentgenske difrakcije [6].


14

Podobno zvezo uporabimo za opis potencialne funkcije valenčnih kotov, le da namesto

ravnovesne razdalje vpeljemo pojem ravnovesnega kota med atomi v molekuli, namesto

harmonske konstante vezi pa uporabimo harmonsko konstanto valenčnih kotov

𝑉𝑣𝑎𝑙.𝑘𝑜𝑡(𝑟𝑁) = 1

2𝐾𝜃(𝜃 − 𝜃0)2 (12)

𝐾𝜃 – Harmonska konstanta

𝜃 – trenutni valenčni kot

𝜃0 – ravnovesni valenčni kot

Obnašanje energije dihedralnih kotov opišemo z enačbo 13. Dihedralni kot je kot definiran z

dvema ravninama, ki ju definirajo po trije atomi [7]. Povedano drugače je to kot med dvema

vezema (Slika 6)

Slika 6: Ponazoritev dihedralnih kotov med atomom klora in vodika (modro), ter dvema atomoma klora (rdeče) [8]

𝑉𝑑𝑖ℎ.𝑘𝑜𝑡(𝑟𝑁) = 1

2𝐾(1 + cos(𝑛𝑢 − 𝛾)) (13)

K – amplituda

n – multipliciteta

u – velikost dihedralnega kota

𝛾 – fazni kot


15

Splošna zveza za opis nepravilnih torzijskih kotov je podobna zvezi, ki opisuje valenčne kote.

Nepravilni torzijski kot je kot med dvema ravninama, vsako s tremi atomi, v nelinearni verigi

[7] (Slika 7). Podatek o ravnovesnem kotu pridobimo s kristalografskimi meritvami, vrednost

harmonske konstante za kote pa določimo s kvantno mehanskimi izračuni.

𝑉𝑛𝑒𝑝.𝑡𝑜𝑟.𝑘𝑜𝑡(𝑟𝑁) = 1

2𝐾𝜑(𝜑 − 𝜑0)2 (15)

𝐾𝜑 – Harmonska konstanta nepravilnih torzijskih kotov

𝜑 – trenutni nepravilni torzijski kot

𝜑0 – ravnovesni nepravilni torzijski kot

Slika 7: Nepravilni torzijski kot v molekuli benzena. Vodik je izrinjen iz planarne ravnine.


16

Podobno zvezo, kot smo jo uporabili za opis kovalente vezi in valenčnih kotov, uporabimo

tudi za opis nepravih torzijskih kotov. Pri kotih, ki so prisotni pri π-konjugiranih sistemih,

izpustimo člen ravnovesnega kota, saj je njegova velikost 0°, ker se nahaja v planarni ravnini

molekule. Zato se enačba za opis nepravih torzijskih kotov nekoliko poenostavi:

𝑉𝑛𝑒𝑝.𝑡𝑜𝑟.𝑘𝑜𝑡(𝑟𝑁) = 1

2𝐾𝜑𝜑2 (14)

Potencialno energijo prispevkov neveznih interakcij sestavljajo van der Waalsove in

elektrostatske sile. Van der Waalsove sile so kratkosežne in šibke medmolekulske sile, ki jih

imenujemo tudi Londonove disperzijske sile. van der Waals in London sta namreč ugotovila,

da tudi atomi brez elektrostatskih interakcij, kot so na primer žlahtni plini, ne sledijo

idealnemu obnašanju, ampak se lahko utekočinijo, kar zahteva prisotnost nekakšnih privlačnih

interakcij. To sta opisala kot privlačne disperzijske interakcije, ki so šibke in kratkosežne;

potencial je sorazmeren z 1

𝑟6 , kjer je 𝑟 razdalja med atomoma. Lennard-Jones pa je

disperzijsko interakcijo združil s Paulijevo odbojno silo v enoten Lennard-Jonesov potencial

[6].

Slika 8: Krivulja Lennard-Jones potenciala


17

Pri približevanju dveh neskončno oddaljenih atomov potencialna energija doseže minimum

na določeni negativni vrednosti imenovani globina potencialne jame 𝜖, ki predstavlja

ravnovesno razdaljo med tema dvema atomoma r*AB, σ pa predstavlja razdaljo, kjer

potencialna energija spremeni predznak oziroma kjer so privlačne disperzijske sile enake

odbojnim zaradi Paulijevega izključitvenega načela.

Potencialno funkcijo, ki opisujejo van der Waalsove interakcije, zapišemo z enačbo 16.

𝑉𝑣𝑑𝑊(𝑟𝑁) = 4𝜖 [(𝜎

𝑟)

12

− (𝜎

𝑟)

6

] (16)

oziroma

𝑉𝑣𝑑𝑊(𝑟𝑁) = 𝐴

𝑟12−

𝐵

𝑟6 (17)

kjer sta 𝐴 = 4𝜖𝜎12 in 𝐵 = 4𝜖𝜎6

𝜖 – globina potencialnega vodnjaka

𝑟 – razdalje med atomoma

𝜎 – razdalja trka

Potencialno funkcijo elektrostatskega privlaka pa opišemo s Coloumbovo zvezo.

𝑉𝑒𝑙.𝑠𝑡𝑎𝑡(𝑟𝑁) =𝑒1𝑒2

4𝜋𝜀0𝑟12 (18)

𝑒1 𝑖𝑛 𝑒2 – delna naboja ionov

𝜀0 – dielektrična konstanta

𝑟12 – razdalja med delcema


18

2.5.2 Monte Carlo simulacije

Druga pogosta metoda, ki prav tako uporablja enačbe klasične fizike pri simulacijah fizikalno-

kemijskih sistemov, je metoda Monte Carlo. Gre za stohastično metodo, kar pomeni, da nas

ne zanima stanje oziroma obnašanje sistema po časovnih korakih, kjer iz enega koraka

preidemo v naslednjega po nekem časovnem intervalu, temveč ansambel reprezentativnih

stanj sistema pridobimo z naključnimi spremembami pozicij delcev v sistemu. Koraki metode

Monte Carlo potekajo po naslednjem zaporedju [9]:

• Izberemo si začetne koordinate delcev v sistemu

• Delec naključno premaknemo v drugo lego - generiramo nove naključne koordinate

• Izračunamo razliko potencialov med staro in novo konfiguracijo ΔV

• Naključno generiramo vrednost med 0 in 1

• Če je generirana vrednost manjša ali enaka energijsko pogojeni verjetnosti 𝑒−𝛽∆𝑉,

naključno tvorjeno konfiguracijo sprejmemo v ansambel reprezentetivnih struktur.

• Simulacijo ponavljamo od prvega koraka, le da namesto začetne konformacije

uporabimo zadnjo sprejeto konformacijo

Slabost te metode je, da nam ne nudi spremljanja dinamičnih lastnosti, saj ne pozna časovnega

koncepta, ker nove konformacije izbiramo naključno in ne v časovnem sosledju. Prednost

metode pa je, da lahko hitro določimo ansambel reprezentativnih konfiguracij in na podlagi

tako imenovane ergodijske hipoteze, ki pravi da je časovno povprečje enako ansambelskemu

povprečju, z Monte Carlo simulacijo dobimo povprečje neke količine enako, kot če bi izvajali

simulacijo molekulske dinamike.

Slika 9: Vizualni prikaz Monte Carlo metode. Slikice označene z rdečo piko predstavljajo zavrnjene konformacije

sistema


19

2.5.3 Molekulska dinamika

Pri simulacijah molekulske dinamike privzamemo, da imajo jedra atomov v sistemu dovolj

veliko maso, da jih lahko obravnavamo s klasičnimi enačbami gibanja Newtonove mehanike.

Na podlagi tega približka lahko izvedemo simulacijo molekulske dinamike z reševanjem

diferencialne enačbe 2. Newtonovega zakona. Ta pravi, da če na telo z maso m deluje neka

sila, bo telo začelo enakomerno pospeševati. Z drugimi besedami, sila je enaka produktu mase

in pospeška nekega telesa. Z rešitvijo diferencialne enačbe 2. Newtonovega zakona lahko

dovolj dobro napovemo razvoj našega izbranega sistema pri simulacijah molekulske

dinamike.

−𝑑𝑉

𝑑𝑟= 𝑚

𝑑2𝑟

𝑑𝑡2 (19)

V – potencialna energija sistema

r – vektor, ki vsebuje koordinate delcev v sistemu (vektor z dolžino 3N)

t – čas

Če privzamemo neko skupino delcev s položaji ri, pozicije teh delcev na naslednjem časovnem

koraku t + Δt, lahko opišemo z razvojem v Taylorjevo vrsto.

𝑟𝑖+1 = 𝑟𝑖 +𝜕𝑟

𝜕𝑡(∆𝑡) +

1

2

𝜕2𝑟

𝜕𝑡2(∆𝑡)2 + ⋯ (20)

oziroma

𝑟𝑖+1 = 𝑟𝑖 + 𝑣𝑖(∆𝑡) +1

2𝑎𝑖(∆𝑡)2 + ⋯ (21)

𝑣𝑖 – hitrosti ob času 𝑡

𝑎𝑖 - pospeški ob času 𝑡

Podobno so pozicije istih atomov v prejšnjem koraku podane z zvezo

𝑟𝑖−1 = 𝑟𝑖 − 𝑣𝑖(∆𝑡) +1

2𝑎𝑖(∆𝑡)2 + ⋯ (22)

Če enačbi za predhodni korak (𝑟𝑖−1) in prihodnji korak (𝑟𝑖+1) seštejemo, dobimo enačbo za

izračun položaja atomov v naslednjem koraku iz trenutnih in predhodnih položajev ter

trenutnega pospeška, ki ga izračunamo iz sile ali potenciala. Ta postopek imenujemo Verletov

algoritem.

𝑟𝑖+1 = (2𝑟𝑖 − 𝑟𝑖−1) + 𝑎𝑖(∆𝑡)2 + ⋯ (23)

𝑎𝑖 = 𝐹𝑖

𝑚𝑖= −

1

𝑚𝑖

𝑑𝑉

𝑑𝑟𝑖 (24)


20

Vidimo, da moramo ob vsakem časovnem koraku posebej izračunati sile med delci v sistemu

s katerimi nato izračunamo pozicije delcev v novem časovnem koraku. S krajšanjem

časovnega koraka dobimo boljši približek dejanskemu gibanju delcev v sistemu, vendar je

posledično potrebno opraviti več izračunov v istem časovnem okvirju.

Verletov algoritem si lahko za lažjo predstavo ponazorimo tudi grafično.

Slika 10: Ponazoritev Verletovega algoritma

Pridobitev konfiguracije ri

Pridobitev konfiguracije ri-1

Izračun sil na vse atome Fi

preko ri

Izračun položajev atomov z naslednji korak ri+1

Če je potrebno korake ponovimo


21

2.6 Uporabljeni računalniški programi

Pri izvajanju simulacij in analizi rezultatov tekom raziskovanja smo uporabljali naslednje

računalniške programe:

• GROMOS

• VMD

• PYMOL

GROMOS je kratica za Groningen Molecular Simulation paket. Je računalniški program za

simulacije molekulske dinamike (MD) in modeliranje večjih sistemov biomolekul (nekaj 1000

atomov). Prvotno razvit na Nizozemskem leta 1978, od leta 1990 pa se razvoj programskega

paketa nadaljuje v Švici [10]. Program zajema dve osnovni zmogljivosti: simulacije

molekulske dinamike in simulacije biomolekul z uporabo stohastične dinamike (SD) ter

analizo molekularnih trajektorij in energij pridobljenih z računalniškimi simulacijami z

uporabo polj sil, osnovanih na eksperimentalnih podatkih [11]. Skozi leta se je programski

jezik spremenil iz prvotnega Fortrana v C++. Zato se tudi programski paketi v novejših

verzijah GROMOS-a imenujejo MD++, spremljajoči programi pa GROMOS++. GROMOS

sestavlja 2x105 vrstic programske kode, ki ponuja široko paleto uporabnosti simulacij

molekulske dinamike in možnost analize širokega spektra parametrov ter izdelave vizualne

podpore in grafov za lažjo interpretacijo rezultatov [10]. Shematski prikaz izvedbe simulacije

molekulske dinamike s programom GROMOS, je prikazan na Sliki 9.

Slika 11: Koraki simulacije molekulske dinamike


22

VMD je program, namenjen vizualizaciji rezultatov simulacije, in nam omogoča vizualno

analizo obnašanja sistema tekom simulacije v izbranem časovnem okviru ter omogoči zajem

slik stanja sistema ob izbranem času simulacije [12].

Slika 12: VMD program

PYMOL je podobno kot VMD program, ki nam omogoča vizualno analizo, izvoz grafik in

manipulacijo s strukturami v sistemu ter upravljanje z oznakami posameznih atomov in

dodajanje informacij k delcem v sistemu [13].


23

2.7 Analiza rezultatov MD simulacij

2.7.1 RMSD

Kadar želimo med seboj primerjati vse konformacije, ki smo jih dobili iz simulacije

molekulske dinamike, skoraj vedno uporabimo kriterij RMSD (ang. Root Mean Square

Deviation). Ta kriterij nam pove, ali so si izbrane konformacije nekega sistema med seboj

podobne in koliko se med seboj razlikujejo. RMSD nam poda informacijo o podobnosti

oziroma različnosti dveh konformacij iste molekule.

𝑅𝑀𝑆𝐷 = √∑ ((𝑥𝑖

1 − 𝑥𝑖0)2 + (𝑦𝑖

1 − 𝑦𝑖0)2 + (𝑧𝑖

1 − 𝑧𝑖0)2)𝑁

𝑖=1

𝑁 (25)

Iz enačbe za RMSD, kjer x, y, z predstavljajo koordinate v 3D sistemu atomov, lahko vidimo,

da bi v idealnem primeru, kjer bi se dve konformaciji popolnoma ujemali, RMSD funkcija

imela vrednost 0. To bi pomenilo da se neka konformacija (1) popolnoma ujema s referenčno

strukturo (0), katero pa dobimo na podlagi informacij NMR ali XRD analiz.

Kadar želimo med seboj primerjati dve konformaciji, moramo poiskati minimum RMSD

funkcije. To dosežemo z računanjem najboljšega prekrivanja dveh konformacij z minimizacijo

RMSD. Z drugimi besedami to pomeni poiskati lego, pri kateri sta si dve konformaciji najbolj

podobni (najnižja vrednost RMSD). To dosežemo z odvajanjem funkcije po 𝑥𝑖1, 𝑦𝑖

1 in 𝑧𝑖1 po

algoritmih minimiziranja RMSD Ferro-Hermans ali Kabash.

𝜕𝑅𝑀𝑆𝐷

𝜕𝑥𝑖1 = 0 ,


𝜕𝑦𝑖1 = 0 𝑖𝑛


𝜕𝑧𝑖1 = 0 (26)

2.7.2 RMSF

Funkcija RMSF (ang. Root Mean Square Fluctuation) nam pove, kako se posamezen atom v

molekuli tekom simulacije giba okoli svoje povprečne lege. Nizke RMSF vrednosti pomenijo,

da se položaj delcu manj spreminja skozi simulacijo. RMSF vrednost nam tako lahko da

informacijo o fleksibilnih ali »mehkih« regijah v biomolekuli, saj se fluktuacije različnih regij

v strukturi razlikujejo.

𝑅𝑀𝑆𝐹 = √1

𝑁𝑡∑(𝑟𝑖 − ⟨𝑟⟩)2

𝑁𝑡

𝑖=1

(27)

𝑁𝑡 – število časovnih korakov

𝑟𝑖 – trenutna lega atoma

⟨𝑟⟩ – povprečna lega atoma


24

2.7.3 Analiza klastrov

Analiza klastrov oziroma »grozdov« (ang. Cluster) nam pove, katera konformacija našega

sistema prevladuje tekom naše simulacije in koliko konformacij doseže to najpogostejšo

strukturo v našem časovnem okvirju simulacije [11]. Analizo klastrov tako uporabimo za

identificiranje podobnih ali najpogostejših skupin struktur v našem sistemu. S tem dobimo

dobro predstavo o najpogostejših strukturah, ki so obstojne v sistemu pod izbranimi pogoji.

Analiza in določevanje klastrov je osnovana na računanju RMSD matrike med vsemi pari

struktur, ki smo jih dobili tekom simulacije. Strukture združi v klastre glede na odrezno

vrednost RMSD, ki jo empirično določimo. Za referenčno strukturo najpogosteje vzamemo

strukturo eksperimentalno pridobljeno z NMR ali XRD analizo. Nato konformacije znotraj

ustrezne razdalje od referenčne strukture izločimo iz ponovne analize v naslednjem koraku.

Sledeči korak poteka enako kot prejšnji, z iskanjem naslednje najpogostejše konformacije

glede na vrednosti RMSD.


25

3 Eksperimentalni del

V sklopu eksperimentalnega dela magistrske naloge smo izvedli simulacije molekulske

dinamike konvencionalnega ter mikrovalovnega gretja vodne raztopine DNK z uporabo dveh

ločenih termostatov za rotacijsko in translacijsko temperaturo vode. Simulacije

konvencionalnega gretja smo izvajali pri temperaturah 300 K, 400 K, 500 K in 600 K. Sistem

pri 300 K je služil za referenco. Simulacije mikrovalovnega gretja smo izvedli tako, da smo

temperaturo DNA in translacijsko temperaturo vode obdržali na 300K, rotacijsko temperaturo

vode pa zvišali na 400 K, 500 K in 600 K. Te simulacije smo poimenovali R400K, R500K ter

R600K. Simulacije smo izvajali 20 ns, razen 300K in R400K, kjer je DNK obstojna dalj časa.

Tu so simulacije potekale 50 ns.

3.1 Računalniška oprema

Ker smo se pri magistrski nalogi lotili reševanja problema z računalniškim pristopom, smo

raziskovalni del naloge opravljali izven laboratorija v računalniškem okolju. Vse simulacije

in analizo smo izvajali na dveh lokalnih računalnikih, vsak s po dvema Intel Xeon E5 2630-

v4 procesorjema, kar skupaj nanese 20 jeder oz. 40 niti, 32 GB delovnega pomnilnika in

grafično kartico GeForce GTX 1050Ti. Vsi programi se izvajajo znotraj operacijskega sistema

Linux X Ubuntu, saj ponuja odprtokodni sistem boljše prilagajanje funkcij uporabniku in ker

vsi uporabljeni programi zaradi učinkovitejšega dela delujejo v sistemu Linux, saj pri

aplikaciji ne uporabljajo uporabniku prijaznega grafičnega vmesnika in s tem pridobijo na

zmogljivosti, ki je potrebna za izvajanje zahtevnih računov.

Računalniški programi v katerih smo izvajali simulacije in analize so bili nameščeni na

lokalnih računalnikih imenovanih Nautilus in Castor. Dostop do teh dveh računalnikov in s

tem do programov pa je bil možen preko domačega računalnika z operacijskim sistemom

Linux preko ukaza SSH. Tako smo se do obeh delovnih računalnikov lahko povezovali od

doma kot tudi iz šolskega računalnika in sproti preverjali potek ter stanje simulacij.

Pri našem delu smo se srečali z naslednjimi najpogostejšimi vrstami datotek:

• .top – vsebuje vse informacije o topologiji naše biomolekule

• .pdb – vsebuje podatke o koordinatah in lastnostih biomolekule in podatke, ki

omogočajo vizualizacijo biomolekule v programih VMD in PYMOL.

• .dat – vsebuje podatke o rezultatih analiz trajektorij naših simulacij

• .out – vsebuje zbrane rezultate energijske analize simulacij molekulske dinamike

• .pdf – vsebuje grafične ponazoritve dobljenih rezultatov

• .arg – vsebuje informacije in navodila za zagon simulacij in analiznih programov


26

3.2 Topologija odseka molekule DNK

Preden smo začeli s simulacijami molekulske dinamike, smo morali izdelati topologijo naše

biomolekule. Topologija vsebuje vse informacije o topološki strukturi, tipu atomov,

konstantah vezi, kotih, elektrostatskih interakcijah in prostorski orientiranosti izbrane

biomolekule.

Slika 13: Topologija DNK fragmenta

Slika 10 prikazuje del podatkov, ki jih vsebuje datoteka s topologijo naše biomolekule. ATNM

predstavlja številko atoma v molekuli, MRES številko nukleotida, PANM ime atoma v

topljencu, IAC kodo tipa atoma, MASS predstavlja maso atoma v topljencu, CG naboj atomov,

CGC kodo skupine naboja (0 ali 1), INE številko izštetih atomov ter INE14 število interakcij.


27

3.3 Ustvarjanje sistema map in podmap simulacij

Preden smo začeli z zagonom začetnih 1 ns simulacij minimizacije smo si ustvarili pregleden

sistem map in podmap, ki nam je v nadaljevanju omogočil nemoteno delo in avtomatično

poganjanje programov za analizo rezultatov simulacij molekulske dinamike. Shema

ustvarjenih map je prikazana na spodnji sliki.

Slika 14: Datotečna struktura simulacij

DNA

Topologija molekule DNK

Simulacije

t300_cv_01ns

t400_cv_01ns

t500_cv_01ns

t600_cv_01ns

t300_cv_50ns

tR400_cv_50ns

t400_cv_20ns

tR500_cv_20ns

t500_cv_20ns

tR600_cv_20ns

t600_cv_20ns

.cnf datoteke


28

3.4 Začetne minimizacije DNK molekule

Preden smo začeli z zagonom simulacije molekulske dinamike z dvema ločenima

termostatoma za rotacijsko in translacijsko prostostno stopnjo vode, smo morali izbrano

začetno molekulo DNK energijsko minimizirati in termalizirati na izbrano temperaturo.

Začetni podatki o molekuli namreč vsebujejo informacije o poziciji in stanju atomov v

molekuli pri izredno nizki temperaturi in v vakuumu. Zato moramo molekulo DNK najprej

postopoma sergrevati do začetne temperature, dodati topilo ter definirati konstanten volumen,

v katerem bodo tekle simulacije. Tako smo pognali 5 0.1 ns simulacij začetnih termalizacij do

temperatur pri katerih smo v nadaljevanju izvajali simulacije molekulske dinamike.

Začetne minimizacije in termalizacije smo izvedli pri naslednjih temperaturah:

• 300 K

• 400 K

• 500 K

• 600 K

Po uspešno izvedenih začetnih simulacijah smo našo molekulo imeli pripravljeno za zagon 50

ns oziroma 20 ns simulacij s konvencionalnim gretjem in ločenima termostatoma za rotacijsko

in translacijsko temperaturo vode.

Slika 15: Začetna minimizirana in termalizirana konformacija izbranega fragmenta DNK pri 300K


29

3.5 Zagon simulacij molekulske dinamike V vse predhodno ustvarjene mape simulacij smo pripravili datoteke .lib, .imd ter .arg, ki so

vsebovale informacije o parametrih simulacije ter ukaze za izračune, katere smo želeli izvesti

na našem sistemu skupaj z navodili o shranjevanju in izpisu rezultatov v ustrezni obliki,

primerni za kasnejšo obdelavo. Za začetno konformacijo pri vsaki simulaciji smo vzeli zadnjo

konformacijo predhodne termalizacijske simulacije in priredili .imd in .arg datoteke pri vsaki

simulaciji, kot je prikazano na spodnjih slikah.

Slika 16: .arg datoteka

.arg datoteki smo za vsako simulacijo določili ustrezno ime, datotečno pot do končne

konformacije predhodne termalizacijske simulacije in z ukazom @script definirali število 1 ns

korakov simulacije, kar bo ustvarilo simulacijo dolgo 50 ns oziroma 20 ns.

Slika 17: .imd datoteka

V .imd datoteki smo za vsako simulacijo nastavili ustrezne parametre simulacije, označene na

mestih vidnih na Sliki 14. Slika prikazuje .imd datoteko za simulacijo, pri kateri so vsi

termostati nastavljeni na 300 K. V nadaljevanju smo izvedli še 3 simulacije pri 400 K, 500 K

in 600 K, kar je pomenilo, da smo zgornjo .imd datoteko priredili tako, da smo v stolpec

TEMP0 vpisali vse tri vrednosti enake temperature. Tako smo imeli pripravljene datoteke za

zagon simulacij z enakimi temperaturami topljenca, translacijske in rotacijske temperature

topila.


30

Cilj magistrskega dela je bil ugotoviti, ali rotacijsko vzbujena voda s strani mikrovalov vpliva

na stabilnost dvojne vijačnice DNK, zato smo nadalje pripravili še 3 simulacije, pri katerih pa

smo povišali samo rotacijsko temperaturo topila, kar je simuliralo eksperiment, kjer bi v

laboratoriju raztopino obsevali samo z mikrovalovi. Te simulacije smo si pripravili na enak

način kot prejšnje, le da smo spremenili vhodne podatke tako, da smo povišali samo

temperaturo tretjega termostata, ki kontrolira rotacijsko temperaturo topila.

Slika 18: .imd datoteka za pripravo simulacije s povišano rotacijsko temperaturo vode

Simulacije smo zagnali na računalniku Nautilus po 5 simulacij naenkrat. Vsaki simulaciji smo

pripisali 3 jedra procesorja od 20 možnih jeder, saj se je to izkazalo za najbolj učinkovit

izkoristek procesorske moči. Vsako simulacijo smo pognali po enakem postopku. Najprej smo

ustrezno uredili in priredili .imd in .arg datoteke, kot je opisano zgoraj. Nato smo s programom

mk_script, ki služi za ustvarjanje potrebnih datotek za zagon simulacije in preverjanje vhodnih

podatkov, preverili ustreznost naših vhodnih podatkov in ustvarili datoteke potrebne za zagon

simulacije - .run, .omd, .imd, .cnf. Nato smo s programom screen odprli novo okno, v katerem

smo z ukazom ./md_dna_1.run pognali simulacijo. Vsaka simulacija je trajala približno 14

dni.


31

3.6 Programi za analizo trajektorij simulacij

Po uspešno zaključenih simulacijah molekulske dinamike z ločenima termostatoma za

translacijsko in rotacijsko prostostno stopnjo vode smo opravili analizo rezultatov, to je energij

in geometrij trajektorij simulacije. Z analiznimi orodji programov GROMOS, VMD in

PYMOL smo iz simulacije zbrali naslednje parametre in jih primerjali med seboj:

• Temperatura sistema (program ene_ana)

• Nevezne energije sistema (program ene_ana)

• RMSD (program RMSD)

• RMSF (program RMSF)

• Analiza klastrov (program cluster)

• Razdalja med verigami (program TSER)

• Prisotnost vodikovih vezi (program TSER)

• Vizualna interpretacija dinamike topljenca (program Frameout)

Analizo trajektorij smo začeli tako, da smo si za vsako simulacijo ustvarili sistem map, kamor

smo shranjevali vhodne podatke za zagon analiz, kakor tudi izhodne podatke analiz trajektorij.

Mape smo poimenovali enako, kot so se imenovali programi, katere smo v nadaljevanju

uporabili, ter za vsako vrsto analize napisali svojo vhodno .arg datoteko z ukazi,

predstavljenimi spodaj.

Datoteka .arg s vhodnimi podatki za zagon analiznega programa ene_ana je vsebovala

datotečno pot do topologije začetne molekule DNK, pot do knjižnice podatkov in pot do

datotek .tre.gz, ki so vsebovale trajektorije energije molekule v simulaciji ter vhodne podatke

@prop, ki definirajo vrsto analize v programu ene_ana. Kot kaže spodnja slika, smo želeli

analizirati celotno, potencialno ter kinetično energijo sistema, izvedeti podatke o temperaturah

posameznih komponent sistema, nevezne energije topljenec-topljenec in topljenec-topilo,

nevezne van der Waalsove in elektrostatske energije ter njihov seštevek.

Slika 19: Vhodna datoteka za analizo s programom ene_ana


32

RMSD analizo smo izvedli v dveh korakih. Najprej smo ustvarili .arg datoteko z navodili za

zagon RMSD analize po celotni DNK molekuli (od 1. do 24. baznega para), nato pa še novo

.arg datoteko, v kateri smo zahtevali RMSD analizo po notranjih baznih parih (od 2. do 23.

baznega para), saj smo predvidevali, da se lahko tekom simulacije končni bazni pari bolj

prosto gibajo kot notranji, zato smo želeli primerjati obe možnosti. Vhodna datoteka za zagon

RMSD programa je izgledala sledeče:

Slika 20: Vhodna datoteka za izračun celotnega RMSD

Slika 21: Vhodna datoteka za izračun notranjega RMSD

RMSF analizo smo pognali na podoben način kot analizo RMSD, le da smo v vhodni datoteki

za RMSF dodali vrstico @atomsfit, ki nam je definirala referenčno konformacijo, na podlagi

katere se je nato računal RMSF. Kot referenčno strukturo smo vzeli DNK fragment v raztopini

pri 300K.

Slika 22: Vhodna datoteka za analizo RMSF


33

Program Frameout nam kot izhodno datoteko vrne datoteko .pdb, ki je primerna za odpiranje

v programih VMD ali PYMOL in nam omogoča vizualno interpretacijo rezultatov ter možnost

predvajanja animacije naše 50 ns oziroma 20 ns simulacije, ki nam še dodatno pomaga

razumeti dinamiko topljenca tekom simulacij. Vhodna datoteka za zagon programa Frameout

je sledeča:

Slika 23: Vhodna datoteka za zagon programa Frameout

S programom TSER smo določili število in dolžino prisotnih vodikovih vezi v molekuli DNK

tekom 50 ns oziroma 20 ns simulacije, kot tudi razdaljo med verigami in čas razpada fragmenta

DNK. .arg datoteka za zagon programa je bila naslednja:

Slika 24: Vhodna datoteka za zagon programa TSER

Analiza tako imenovanih klastrov nam določi strukture ali konformacije sistema, ki so najbolj

pogoste v naših simulacijah. Poišče nam strukturne »sosede«, ki so po vrednosti RMSD zelo

podobni oziroma imajo razliko RMSD vrednosti manjšo od predhodno izbrane odrezne

razdalje. Za zagon programa CLUSTER moramo ustvariti tri ločene datoteke .arg

predstavljene spodaj.

Slika 25: Vhodne datoteke za analizo klastrov


34

4 Rezultati in diskusija

Po približno 4 tednih izvajanja simulacij smo začeli z analizo trajektorij in rezultatov serije 50

ns oziroma 20 ns simulacij. Pri analizah smo uporabili že prej omenjene programe. V

nadaljevanju so predstavljeni in ovrednoteni rezultati analiz.

4.1 Vizualna predstavitev rezultatov Zaradi lažje predstave nas je najprej zanimala vizualna ponazoritev rezultatov naših simulacij

molekulske dinamike. Tako smo .pdb datoteko izdelano s programom Frameout odprli v

programu za vizualizacijo rezultatov VMD. Začetne in končne konformacije vseh 9 simulacij

so predstavljene na spodnjih slikah.

Slika 26: Začetna (levo) in končna (desno) konformacija molekule DNK pri 300 K

Slika 27: Začetna (levo) in končna (desno) konformacija molekule DNK pri povišani zgolj rotacijski temperaturi na

400 K


35

Slika 28:Začetna (levo) in končna (desno) konformacija molekule DNK pri 400 K

Slika 29:Začetna (levo) in končna (desno) konformacija molekule DNK pri povišani zgolj rotacijski temperaturi na

500 K



36

Slika 31: Začetna (levo) in končna (desno) konformacija molekule DNK pri povišani zgolj rotacijski temperaturi na

600 K



37

Na zgornjih slikah začetnih in končnih konformacij molekule DNK že vidimo nek trend, ki se

pojavlja pri končnih konformacijah vsake simulacije. Pri 300 K vidimo da bistvene razlike,

vsaj vizualno, ne vidimo, kar je tudi v skladu s pričakovanji, saj je DNK pri temperaturi 300

K oziroma 27 °C še stabilna.

Pri simulaciji 400K smo začeli opažati razpad dvojne vijačnice DNK fragmenta. Pri simulaciji

R400K pa nam vizualna analiza pove, da je naša molekula DNK obdržala strukturo približno

enako prvotni. Enako obnašanje opazimo pri vse nadaljnjih simualcijah. Simulacije, ki

simulirajo konvencionalno, termično gretje (500K in 600K) rezultirajo v razpadu dvojne

vijačnice DNK fragmenta. Simualcije, ki simulirajo mikrovalovno gretje, pa se ne končajo z

razpadom dvojne vijačnice.

Na podlagi vizualne analize lahko sklepamo, da pri simulacijah konvencionalnega termičnega

gretja prej pride do razpada dvojne vijačnice DNK, ker je temperatura sistema nad talilno

temperaturo DNK, zato je razpad fragmenta pri simulacijah 400K, 500K in 600K pričakovan.

4.2 Analiza RMSD in RMSF

Tabela 1 prikazuje povprečja in standardne odmike vrednosti RMSD in RMSF za vsako

simulacijo. V tabeli so zbrane RMSD vrednosti dveh različnih sistemov. Prvi stolpec podaja

vrednosti RMSD za notranji del DNK fragmenta, kar pomeni da pri analizi nismo upoštevali

zunanjih dveh baz (na obeh koncih verige), saj nas je zanimalo, ali nestabilni končni deli

fragmenta vplivajo na RMSD analizo. Z primerjavo drugi stolpec RMSD v Tabeli 1 podaja

rezultate analize za celoten DNK fragment.

Simulacija RMSD (res. 2-23)

[nm] RMSD (res. 1-24)

[nm] RMSF (backbone)

[nm]

〈〉 σ 〈〉 σ 〈〉 σ

300K 0,287 0,061 0,299 0,062 0,183 0,090

R400K 0,421 0,124 0,470 0,151 0,273 0,226

400K 1,028 0,287 1,041 0,288 0,721 0,213

R500K 0,277 0,035 0,287 0,036 0,142 0,061

500K 1,295 0,286 1,328 0,292 1,046 0,294

R600K 0,370 0,046 0,379 0,045 0,205 0,128

600K 1,616 0,381 1,687 0,391 1,321 0,257

Tabela 1: RMSD in RMSF analize 10 ns dolgih simulacij


38

Iz analize RMSD in RMSF vrednosti lahko vidimo, da je ponovno prisoten ponavljajoč vzorec,

ki loči simulacije 400K, 500K in 600K od simulacij R400K, R500K in R600K. Opazimo, da

mikrovalovno gretje drugače vpliva na gibanje fragmenta DNK, kot termično gretje. Opaziti

je namreč, da so RMSD vrednosti termičnega gretja višje kot pri simulacijah mikrovalovnega

gretja. Višje vrednosti RMSD pomenijo večje odstopanje od referenčne strukture, kar nakazuje

na bolj fleksibilen fragment DNK pri simulacijah termičnega gretja.

Enako obnašanje posledično ugotovimo tudi pri analizi RMSF funkcije. Simulacije 400K,

500K in 600K imajo večjo fluktuacijo atomov v strukturi kot pa simulacije mikrovalovnega

gretja R400K, R500K in R600K. Ponavljajoč trend lahko ponovno pojasnimo s tem, da v

primeru konvencionalnega termičnega gretja, ko sta poleg rotacijske zvišani še translacijska

temperatura topila in temperatura topljenca, naša molekula DNK razpada hitreje in s tem

posledično v večji meri spremeni strukturo. Na Slikah 33-39 so grafično predstavljeni rezultati

RMSD analiz. Rdeči graf predstavlja RMSD analizo po celotnem fragmentu 24 baznih parov,

zelena barva pa predstavlja analizo po notranjih baznih parih (od 2. do 23. baznega para) brez

baznih parov na vsakem koncu fragmenta.

Slika 33: RMSD analiza za simulacijo 300K


39

Slika 34: RMSD analiza za simulacijo R400K



40




41



Na Slikah 40-46 pa so grafično predstavljeni rezultati RMSF analiz.


42

Slika 40: RMSF analiza simulacije 300K

Slika 41: RMSF analiza simulacije R400K



43

Slika 43: RMSF analiza simualcije R500K



44

Slika 45: RMSF analiza simulacije R600K



45

4.3 Analiza razdalje med verigama DNK ter števila prisotnih vodikovih vezi

S programom za analizo časovno odvisnih parametrov sistema TSER smo zasledovali razdalje

med obema verigama DNK vijačnice ter število prisotnih vodikovih vezi v našem fragmentu

DNK. Na podlagi rezultatov analize smo določili tudi čas razpada dvojne vijačnice tako, da

smo v izhodni datoteki, ki podaja število prisotnih vodikovih vezi ob vsakem času odčitali prvi

čas, ob katerem ni več prisotne nobene vodikove vezi. Vsi omenjeni parametri so prikazani v

Tabeli 2.

Simulacija Razdalja med verigama [nm]

Št. prisotnih H-vezi, ki tvorijo vijačnico

Čas do razpada DNK

(ns)

〈〉 σ 〈〉 σ

300K 0,244 0,030 27,40 2,78 Ni razpada

R400K 0,268 0,039 27,47 2,51 Ni razpada

400K 0,664 0,225 5,87 6,98 2,50

R500K 0,255 0,031 27,81 1,92 6,10*

500K 1,427 0,343 3,19 3,36 1,10

R600K 0,352 0,061 24,86 2,30 4,70*

600K 0,785 0,119 2,39 2,30 0,70

Tabela 2: TSER analiza 10 ns dolgih simulacij

S TSER analizo ponovno opazimo razliko med simulacijami konvencionalngea termičnega

gretja in simulacijami mikrovalovnega gretja. Občutna razlika je opazna pri analizi števila

vodikovih vezi. Simulacije R400K, R500K in R600K imajo povprečno prisotnih kar 5 krat

več vodikovih vezi kot simulacije 400K, 500K in 600K. Izjema je ponovno simulacija 300K,

ki predstavlja DNK fragment pri sobni temperaturi in pričakovano vsebuje večje število

vodikovih vezi.

Analogen vzorec opazimo tudi pri razdalji med verigama DNK in pri času razpada. Sklepamo

lahko, da se zaradi manjšega števila vodikovih vezi, ki držijo verigi dvojne vijačnice DNK v

obliki dvojnega heliksa, poveča tudi razdalja med obema verigama. To potrjujejo tudi rezultati

analize TSER, iz katerih je razvidno, da imajo DNK molekule iz simulacij mikrovalovnega

gretja podobno razdaljo med verigama, kot fragment pri 300 K.


46

Trenda razdalje med verigama in števila vodikovih vezi kažeta, da je v primeru termičnega

gretja fragment DNK vedno manj stabilen. To pomeni, da se vodikove vezi hitreje pretrgajo

in čas do razpada fragmenta se krajša.

V časovne okviru simulacij (10 ns) smo dejanski razpad dvojne vijačnice opazili samo pri

simulacijah 400K, 500K in 600K. Pri simulacijah R500K in R600K smo pri časih, ki so v

tabeli označeni z zvezdico opazili zgolj znaten preskok v vrednosti RMSD, vendar ne

popolnega razpada, kot bi pričakovali.

4.4 Analiza energijskih trajektorij

S programom ene_ana za analizo energij in z njimi povezanih lastnosti smo izvedli analizo

energijskih trajektorij, kjer smo izračunali skupno nevezno potencialno energijo in posamezne

prispevke nevezne potencialne energije – elektrostatsko potencialno energijo ter van der

Waalsovo potencialno energijo. Dobili in analizirali smo tudi temperature komponent sistema

pri vsaki simulaciji, ki so prikazane v Tabeli 3. Do odstopanja dejanskih povprečnih

temperatur posameznih komponent sistema od teoretičnih (300 K, 400 K, 500 K in 600 K)

pride, ker so v kondenziranih sistemih prostostne stopnje sklopljene in se na primer del

energije rotacijskega gibanja preko medmolekulskih trkov (disipacije) pretvori v translacijsko

ali vibracijsko gibanje.

Simulacija T DNK [K] T vode, trans. [K] T vode, rot. [K]

〈〉 σ 〈〉 σ 〈〉 σ

300K 299,799 0,090 299,655 0,008 301,306 0,014

R400K 300,219 0,062 303,312 0,014 397,693 0,020

400K 399,878 0,100 399,579 0,016 401,595 0,030

R500K 300,898 0,057 308,389 0,016 492,619 0,027

500K 499,623 0,101 499,442 0,014 501,779 0,032

R600K 301,636 0,068 314,101 0,022 586,800 0,033

600K 599,336 0,104 599,357 0,020 602,052 0,029

Tabela 3: Dejanske povprečne temperature posameznih komponent sistema


47

Simulacija Nevezna energija (DNK-

topilo + DNK - DNK) [kcal/mol]

Nevezna energija VDW (DNK - topilo + DNK-

DNK) [kcal/mol]

Nevezna energija EL.STAT (DNK - topilo +

DNK -DNK) [kcal/mol]

〈〉 σ 〈〉 σ 〈〉 σ

300K -5812,35 349,17 -1735,12 47,42 -4077,23 347,69

R400K -6281,07 546,74 -1793,71 59,72 -4487,36 512,71

400K -6593,51 719,65 -1633,90 75,99 -4959,61 712,91

R500K -6042,06 319,55 -1773,15 36,83 -4268,91 317,83

500K -6571,07 613,54 -1537,23 83,55 -5033,84 598,71

R600K -6316,57 333,84 -1765,54 43,00 -4551,02 330,76

600K -6428,59 720,78 -1353,74 113,17 -5074,84 679,97

Tabela 4: Analiza trajektorij neveznih potencialnih energij

Analiza trajektorij skupne nevezne potencialne energije in potencialne energije njenih

komponent iz Tabele 4 nam poda zanimive rezultate. Če pogledamo vrednost nevezne van der

Waalsove energije opazimo, da pri simulacijah konvencionalnega termičnega jakost van der

Waalsovih interakcij z višanjem temperature pada. To je v skladu s pričakovanji, saj se z

zmanjšanjem števila prisotnih vodikovih vezi povečajo razdalje med verigama, kar vpliva na

znižanje potencialne van der Waalsove energije, ki je kratkosežna in hitro pada z večanjem

razdalje. Jakost nevezne elektrostatske energije pa pri istih simulacijah narašča s temperaturo,

prav tako tudi jakost celokupne nevezne potencialne energije. To bi lahko razložili s tem, da

sistem z višanjem temperature dobiva bolj neurejeno strukturo, ki odstopa od začetne, in s tem

se negativno nabite fosfatne skupine bolj izpostavijo hidrataciji vode. Večanje jakosti

elektrostatskih interakcij pri simulacijah mikrovalovnega gretja pa si lahko razlagamo kot

posledico povečanega in ne zmanjšanega senčenja nabojev fosfatne skupine s strani vode

Slika 47: Spreminjanje nevezne potencialne energije s časom pri simulaciji 300K. Zelena barva ponazarja

interakcije DNK-DNK. Modra predstavlja energijo DNK-voda. Rdeča predstavlja povprečje obeh interakcij, svetlo

modra barva pa predstavlja vsoto obeh interakcij

[kcal/m

ol]


48

Slika 48: Spreminjanje nevezne potencialne energije s časom pri simulaciji R400K. Zelena barva ponazarja

interakcije DNK-DNK. Modra ponazarja energijo DNK-voda. Rdeča predstavlja povprečje obeh interakcij, svetlo





[kcal/m

ol]

[kcal/m

ol]


49







[kcal/m

ol]

[kcal/m

ol]


50







[kcal/m

ol]

[kcal/m

ol]


51

4.5 Analiza klastrov

Analiza klastrov nam je pomagala določiti skupine najpogostejših konformacij tekom naših

simulacij. Klaster oziroma »grozd« predstavlja skupino podobnih konformacij molekule

oziroma konformacijskih sosedov. Več različnih klastrov kot zasledimo v simulaciji, bolj

nestabilna je naša preiskovana struktura. V primeru, ko bi se ves čas simulacije molekula zgolj

malo spreminjala, bi posledično zasledili več podobnih struktur, katerih vrednost RMSD ne bi

presegala odrezne vrednosti, skupno število klastrov pa bi bilo majhno.

Rezultati analize klastrov posameznih simulacij so prikazani v Tabeli 5.

Temperatura Št. clustrov, ki so

prisotni vsaj 5% časa

Št. clustrov, ki skupaj predstavljajo več kor

95% vseh struktur

Št. vseh clustrov v

10ns

300K 2 2 4

R400K 2 1 5

400K 5 42 59

R500K 2 1 2

500K 0 153 178

R600K 5 4 6

600K 0 425 450

Tabela 5: Analiza klastrov

Vidimo, da lahko potegnemo vzporednice z rezultati ostalih analiz. Kot smo predvidevali, je

struktura DNK pri simulaciji 300K ostala stabilna, kar nam potrjuje tudi analiza klastrov, ki

nam pove, da so bili v času 10 ns simulacije prisotni zgolj 4 klastri. To pomeni, da so si bile

strukture DNK tekom simulacije 300K tako podobne, da smo jih lahko razvrstili v samo 4

različne skupine klastrov, glede na izbran odrezni kriterij RMSD (vrednost 0,3 nm). Naša

pričakovanja, da se bo tudi pri analizi klastrov pokazal enak trend kot pri prejšnjih analizah,

smo lahko potrdili. Pri vseh simulacijah termičnega gretja 400K, 500K in 600K namreč

opazimo izjemno veliko število prisotnih klastrov napram simulacijam mikrovalovnega gretja

R400K, R500K in R600K.


52

5 Zaključek

Rezultati magistrske naloge so pokazali, da mikrovalovi v naših simulacijah molekulske

dinamike v 10 ns časovnem okvirju niso imeli istega vpliva na stabilnost fragmenta DNK kot

konvencionalno termično gretje. Analiza rezultatov je pokazala, da je fragment pri simulacijah

mikrovalovnega gretja ostal v bolj stabilnem stanju kot pri termičnem gretju.

Ker je analiza neveznih interakcij nakazala večanje senčenja nabojev fosfatne skupine s strani

vode poseldično jačanje elektrostatskih interakcij, v našem časovnem okvirju ni prišlo do

razpada ali vidne destabilizacije fragmenta DNK. Ta ugotovitev lahko pomaga pri bodočih

raziskavah stabilnosti DNK pod vplivom mikrovalov pri določevanju časa razpada in njene

stabilnosti v različnih topilih. Iz dobljenih rezultatov magistrske naloge lahko sklepamo, da

mikrovalovi celo pripomorejo k stabilizaciji molekule DNK, podobno kot pripomorejo k

stabilizaciji hidrofobnih beljakovin, kajti podobno kot beljakovine bi se lahko obnašale tudi

nukleobaze, ki predstavljajo hidrofobni del DNK. Pridobljeni rezultati so nam dali dobro

izhodišče za nadaljevanje raziskovanja na področju vpliva mikrovalov na stabilnost DNK, saj

je to področje še dokaj neraziskano in ponuja možnost številnih novih spoznanj, ki lahko

pripomorejo k zagotavljanju večje varnosti potrošniških izdelkov, kot so na primer mobilni

telefoni, mikrovalovne pečice navigacijske naprave idr. Poleg tega ima lahko preučevanje

stabilnosti DNK pomembne posledice v genetiki in genomiki, predvsem pri preučevanju

hibridizacije molekul DNK in mehanizmov transkripcije, ki so pomembni pri odkrivanju in

zdravljenju genetskih bolezni. Rezultati, ki smo jih pridobili pri raziskovanju nenazadnje

potrjujejo uspešno izvedbo magistrskega dela oziroma simulacij, saj različne analize podatkov

nakazujejo isti vzorec obnašanje in se med seboj dopolnjujejo, kar kaže na kvalitetno izvedene

simulacije in uspešno opravljeno analizo.


53

6 Literatura

[1] W. F. Edwards, D. D. Young,A. Deiters The effect of microwave irradiation on DNA

hybridization, Org Biomol Chem, 7 (12), 2009

[2] U. Bren, D. Janezic Individual degrees of freedom and the solvation properties of

water, J Chem Phys, 137 (2), 2012

[3] T. Mohoric, U. Bren, V. Vlachy Fast rotational motion of water molecules increases

ordering of hydrophobes in solutions and may cause hydrophobic chains to collapse, J Chem

Phys, 143 (24), 2015

[4] Y. Yang, J. Hang Fragmentation of genomic DNA using microwave irradiation. J

Biomol Tech, 24 (2), 2013

[5] T. M. Devlin Textbook of biochemistry: with clinical correlations. Hoboken: Wiley-

Liss, 2006

[6] C. J. Cramer Essentials of Computational Chemistry, Theories and Models. Wiley:

Chichester, England, 2002

[7] R. Richard Oxford Dictionary of Chemistry. Oxford University Press, 2016

[8] UCLA, Dihedral angle,

http://www.chem.ucla.edu/~harding/IGOC/D/dihedral_angle.html (14.8.2017)

[9] A. R. Leach Molecular Modeling: Principles and Applications 2nd Edition. Pearson

Education Limited, 2001

[10] U. o. Groningen, About the GROMOS software for biomolecular simulation,

http://www.gromos.net/ (12.8.2017)

[11] H. J. C. B. W. F. van Gunsteren The GROMOS Software for (Bio)Molecular

Simulation. Groningen: Biomos, 2016

[12] T. a. C. B. Group, VMD - Visual Molecular Dynamics,

http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ (12.8.2017)

[13] Schrodinger PyMOL, https://pymol.org/ (12.8.2017)

[14] C. R. Calladine, H. R. Drew, B. F. Luisi,A. A. Travers Understanding DNA, Third

Edition. Oxford: Academic Press, 2004

[15] R. Cammack Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. New York:

Oxford University Press, 2000

[16] G. F. Clifford E. Dykstra, Kwang S. Kim and Gustavo E. Scuseria Theory and

Applications of Computational Chemistry: The First Forty Years. Elsevier, 2005

[17] J. A. Glasel Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid

Research. San Diego: Academic Press, 1995

[18] D. J. Griffiths Introduction to quantum mechanics. New Jersey: Prentice Hall, 1995

[19] A. Hinchliffe Molecular modeling for begginers. West Sussex: John Wiley & Sons

Ltd, 2003

[20] F. Jensen Introduction to computational chemistry 2nd edition. West Sussex: John

Wiley & Sons Ltd, 2007

[21]

[22] G. R. Clark, C. J. Squire, L. J. Baker, R. F. Martin,J. White Intermolecular interactions

and water structure in a condensed phase B-DNA crystal. Nucleic Acids Research, 2000

[23] V. Garaj-Vrhovac, D. Horvat,Z. Koren The effect of microwave radiation on the cell

genome. Mutat Res, 1990

[24] E. D. Kadtsyn, A. V. Anikeenko,N. N. Medvedev Molecular dynamics simulation of

a DNA duplex labeled with triarylmethyl spin radicals. Journal of Molecular Liquids, 2016


54

[25] C. Leal, E. Moniri, L. Pegado,H. Wennerström Electrostatic Attraction between DNA

and a Cationic Surfactant Aggregate. The Screening Effect of Salt. The Journal of Physical

Chemistry B, 2007

[26] T. Mohoric, U. Bren,V. Vlachy Effects of Translational and Rotational Degrees of

Freedom on the Hydration of Ionic Solutes as Seen by the Popular Water Models. Acta Chim

Slov, 2015

[27] K. M. Rahman,D. E. Thurston Effect of microwave irradiation on covalent ligand-

DNA interactions. Chem Commun (Camb), 2009

[28] N. Schmid, C. D. Christ, M. Christen, A. P. Eichenberger,W. F. van Gunsteren

Architecture, implementation and parallelisation of the GROMOS software for biomolecular

simulation. Computer Physics Communications, 2012

[29] J. Šponer, G. Bussi, P. Stadlbauer, P. Kührová, P. Banáš, B. Islam, S. Haider, S.

Neidle,M. Otyepka Folding of guanine quadruplex molecules–funnel-like mechanism or

kinetic partitioning? An overview from MD simulation studies. Biochimica et Biophysica

Acta (BBA) - General Subjects, 2017

[30] T. Špringer, H. Šípová, H. Vaisocherová, J. Štěpánek,J. Homola Shielding effect of

monovalent and divalent cations on solid-phase DNA hybridization: surface plasmon

resonance biosensor study. Nucleic Acids Research, 2010

[31] Z.-J. Tan,S.-J. Chen Nucleic Acid Helix Stability: Effects of Salt Concentration,

Cation Valence and Size, and Chain Length. Biophysical Journal, 2006

[32] S. Yuan, H. C. S. Chan, S. Filipek,H. Vogel PyMOL and Inkscape Bridge the Data and

the Data Visualization. Structure, 2016

[33] H. Zhao,K. Shen Microwave-induced inactivation of DNA-based hybrid catalyst in

asymmetric catalysis. International Journal of Biological Macromolecules, 2016

[34] Zhi-Jie Tan,S.-J. Chen Nucleic Acid Helix Stability: Effects of Salt Concentration,

Cation Valence and Size, and Chain Length. Biophysical Journal, 2006

[35] L. B. Jassie, Microwave heating: Theory and Practice,

http://allchemy.iq.usp.br/agregando/wpa/Palestra2.pdf (25.5.2017)


55

7 Življenjepis


56

Vpliv mikrovalov na stabilnost dvojne vijačnice DNK ... · časovnem okvirju niso imeli istega...

Documents

Transcript of Vpliv mikrovalov na stabilnost dvojne vijačnice DNK ... · časovnem okvirju niso imeli istega...