Vorlesung: Vorverarbeitung von Affymetrix-Daten 28.10.2003.

Vorlesung:

Vorverarbeitung von Affymetrix-Daten

28.10.2003

Experiment-Design

Experiment(Microarray)

Biologische Verifikation

Bildverarbeitung

Rohe Intensitätswerte

NormalisierungExpressions Level

Analyse: Clustering; Class Discovery; Klassifikation; Differentielle Gene; ....

Vom “Tiff” zum Expressions

Level

Vorverarbeitung von Microarray Daten:Beispiel: Affymetrix

BiologieDiagnostikTherapie

...

?

!


18µm18µm

101066-10-1077 copies of a specific copies of a specificoligonucleotide probe per featureoligonucleotide probe per feature

Bild eines hybridisierten ArraysBild eines hybridisierten Arrays

>450,000 different>450,000 differentprobes probes

Single stranded, Single stranded, labeled RNA targetlabeled RNA target

Oligonucleotide probeOligonucleotide probe

**

**

*

1.28cm1.28cm

GeneChipGeneChip Probe ArrayProbe Array

Compliments of D. Gerhold

Extraktion der Poly-A - RNA

Chip-hybridisierung

Zellpool aus Gewebeproben oder

Zellkulturen

Amplifikation und Markierung der RNA

Auslesen des Fluoreszenzsignals Chipzelle

Oligonukleotid

...

...PMMM

1 2 3 4 ... 17 18 19 20probe pair

probe set

probe cell

... TGTGATGGTGGGAATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGGGTGACGAGGCC TTACCCAGTCTTCCTGAGGATACACCCAC TTACCCAGTCTTGCTGAGGATACACCCAC


PM

MM

BildzelleOligopaar Saturierte Zelle

(A)

(B)


3331.04 1178.82 128 206.46 74.32 357713 2939.71 1053.74270.6 167.4 78 207.5 76.19 14696 108.74 68.25

4009.59 1450.57 122 183.2 78.41 452714 3918.8 1434.41351.81 153.39 98 166.4 69.1 19838 176.04 87.19323.52 152.39 102 159.41 67.85 10792 74.37 45.75

2533 789.54 95 161.26 68.04 209832 2216.25 556.296614.93 2105.24 123 152.99 63.89 1086014 9425.24 2987.65

449.05 156.78 83 158.35 69.38 28666 340.77 142.21011.52 296.56 96 164.46 70.44 55635 605.57 196.273136.51 896.3 121 168.92 69.6 262667 2281.34 727.881591.61 547.79 101 193.76 80.3 80968 762.04 232.46

879.87 388.18 99 190.72 75.02 68256 643.04 288.536840.42 2674.61 131 222.09 83.66 766497 6212.39 2297.011415.85 497.36 93 202.82 73.02 119114 1274.41 388.282121.88 663.31 104 176.59 70.42 182108 1818.55 636.71

929.93 351.67 103 180.81 77.91 66478 628.77 219.12652.06 248.54 110 158.69 68.76 75527 703.35 291.83212.99 135.17 16 163.35 68.26 1352 58.06 23.88

1089.73 368.88 90 157.89 65.12 80666 952.99 312.51282.58 142.43 55 158.36 67.76 9296 122.18 53.3468.83 195.36 79 164.54 71.02 22005 270.1 129.46

6945.94 2500.55 102 175.1 73.52 607270 6369.08 2275.77299.35 156.95 41 183.86 72.1 10433 153.31 89.69

1443.79 540.98 88 191.7 81.41 122311 1485.36 515.21862.38 274.78 123 236.58 90.37 72666 553.8 192.45

3331.04 1178.82 128 206.46 74.32 357713 2939.71 1053.74270.6 167.4 78 207.5 76.19 14696 108.74 68.25

4009.59 1450.57 122 183.2 78.41 452714 3918.8 1434.41351.81 153.39 98 166.4 69.1 19838 176.04 87.19323.52 152.39 102 159.41 67.85 10792 74.37 45.75

2533 789.54 95 161.26 68.04 209832 2216.25 556.296614.93 2105.24 123 152.99 63.89 1086014 9425.24 2987.65

449.05 156.78 83 158.35 69.38 28666 340.77 142.21011.52 296.56 96 164.46 70.44 55635 605.57 196.273136.51 896.3 121 168.92 69.6 262667 2281.34 727.881591.61 547.79 101 193.76 80.3 80968 762.04 232.46

879.87 388.18 99 190.72 75.02 68256 643.04 288.536840.42 2674.61 131 222.09 83.66 766497 6212.39 2297.011415.85 497.36 93 202.82 73.02 119114 1274.41 388.282121.88 663.31 104 176.59 70.42 182108 1818.55 636.71

929.93 351.67 103 180.81 77.91 66478 628.77 219.12652.06 248.54 110 158.69 68.76 75527 703.35 291.83212.99 135.17 16 163.35 68.26 1352 58.06 23.88

1089.73 368.88 90 157.89 65.12 80666 952.99 312.51282.58 142.43 55 158.36 67.76 9296 122.18 53.3468.83 195.36 79 164.54 71.02 22005 270.1 129.46

6945.94 2500.55 102 175.1 73.52 607270 6369.08 2275.77299.35 156.95 41 183.86 72.1 10433 153.31 89.69

1443.79 540.98 88 191.7 81.41 122311 1485.36 515.21862.38 274.78 123 236.58 90.37 72666 553.8 192.45

3331.04 1178.82 128 206.46 74.32 357713 2939.71 1053.74270.6 167.4 78 207.5 76.19 14696 108.74 68.25

4009.59 1450.57 122 183.2 78.41 452714 3918.8 1434.41351.81 153.39 98 166.4 69.1 19838 176.04 87.19323.52 152.39 102 159.41 67.85 10792 74.37 45.75

2533 789.54 95 161.26 68.04 209832 2216.25 556.296614.93 2105.24 123 152.99 63.89 1086014 9425.24 2987.65

449.05 156.78 83 158.35 69.38 28666 340.77 142.21011.52 296.56 96 164.46 70.44 55635 605.57 196.273136.51 896.3 121 168.92 69.6 262667 2281.34 727.881591.61 547.79 101 193.76 80.3 80968 762.04 232.46

879.87 388.18 99 190.72 75.02 68256 643.04 288.536840.42 2674.61 131 222.09 83.66 766497 6212.39 2297.011415.85 497.36 93 202.82 73.02 119114 1274.41 388.282121.88 663.31 104 176.59 70.42 182108 1818.55 636.71

929.93 351.67 103 180.81 77.91 66478 628.77 219.12652.06 248.54 110 158.69 68.76 75527 703.35 291.83212.99 135.17 16 163.35 68.26 1352 58.06 23.88

1089.73 368.88 90 157.89 65.12 80666 952.99 312.51282.58 142.43 55 158.36 67.76 9296 122.18 53.3468.83 195.36 79 164.54 71.02 22005 270.1 129.46

6945.94 2500.55 102 175.1 73.52 607270 6369.08 2275.77299.35 156.95 41 183.86 72.1 10433 153.31 89.69

1443.79 540.98 88 191.7 81.41 122311 1485.36 515.21862.38 274.78 123 236.58 90.37 72666 553.8 192.45

3331.04 1178.82 128 206.46 74.32 357713 2939.71 1053.74270.6 167.4 78 207.5 76.19 14696 108.74 68.25

4009.59 1450.57 122 183.2 78.41 452714 3918.8 1434.41351.81 153.39 98 166.4 69.1 19838 176.04 87.19323.52 152.39 102 159.41 67.85 10792 74.37 45.75

2533 789.54 95 161.26 68.04 209832 2216.25 556.296614.93 2105.24 123 152.99 63.89 1086014 9425.24 2987.65

449.05 156.78 83 158.35 69.38 28666 340.77 142.21011.52 296.56 96 164.46 70.44 55635 605.57 196.273136.51 896.3 121 168.92 69.6 262667 2281.34 727.881591.61 547.79 101 193.76 80.3 80968 762.04 232.46

879.87 388.18 99 190.72 75.02 68256 643.04 288.536840.42 2674.61 131 222.09 83.66 766497 6212.39 2297.011415.85 497.36 93 202.82 73.02 119114 1274.41 388.282121.88 663.31 104 176.59 70.42 182108 1818.55 636.71

929.93 351.67 103 180.81 77.91 66478 628.77 219.12652.06 248.54 110 158.69 68.76 75527 703.35 291.83212.99 135.17 16 163.35 68.26 1352 58.06 23.88

1089.73 368.88 90 157.89 65.12 80666 952.99 312.51282.58 142.43 55 158.36 67.76 9296 122.18 53.3468.83 195.36 79 164.54 71.02 22005 270.1 129.46

6945.94 2500.55 102 175.1 73.52 607270 6369.08 2275.77299.35 156.95 41 183.86 72.1 10433 153.31 89.69

1443.79 540.98 88 191.7 81.41 122311 1485.36 515.21862.38 274.78 123 236.58 90.37 72666 553.8 192.45

3331.04 1178.82 128 206.46 74.32 357713 2939.71 1053.74270.6 167.4 78 207.5 76.19 14696 108.74 68.25

4009.59 1450.57 122 183.2 78.41 452714 3918.8 1434.41351.81 153.39 98 166.4 69.1 19838 176.04 87.19323.52 152.39 102 159.41 67.85 10792 74.37 45.75

2533 789.54 95 161.26 68.04 209832 2216.25 556.296614.93 2105.24 123 152.99 63.89 1086014 9425.24 2987.65

449.05 156.78 83 158.35 69.38 28666 340.77 142.21011.52 296.56 96 164.46 70.44 55635 605.57 196.273136.51 896.3 121 168.92 69.6 262667 2281.34 727.881591.61 547.79 101 193.76 80.3 80968 762.04 232.46

879.87 388.18 99 190.72 75.02 68256 643.04 288.536840.42 2674.61 131 222.09 83.66 766497 6212.39 2297.011415.85 497.36 93 202.82 73.02 119114 1274.41 388.282121.88 663.31 104 176.59 70.42 182108 1818.55 636.71

929.93 351.67 103 180.81 77.91 66478 628.77 219.12652.06 248.54 110 158.69 68.76 75527 703.35 291.83212.99 135.17 16 163.35 68.26 1352 58.06 23.88

1089.73 368.88 90 157.89 65.12 80666 952.99 312.51282.58 142.43 55 158.36 67.76 9296 122.18 53.3468.83 195.36 79 164.54 71.02 22005 270.1 129.46

6945.94 2500.55 102 175.1 73.52 607270 6369.08 2275.77299.35 156.95 41 183.86 72.1 10433 153.31 89.69

1443.79 540.98 88 191.7 81.41 122311 1485.36 515.21862.38 274.78 123 236.58 90.37 72666 553.8 192.45

LokalisationIntensitätAnnotationPM-MMSequenz...

(1) Hintergrund

(2) PM / MM (perfect match / mismatch)

(3) “Summary statistics” ?

...

...PMMM

1.5 2.4 10.4 0.1 ... 1.3 3.4

Vorverarbeitung von Microarray Daten:Probleme

Vorverarbeitung von Microarray Daten:Beispiele:

MAS 5.0 (Affymetrix Microarray Suite, Affymetrix Software)

Li/Wong: PNAS 2001 vol 98 (1), pp31-36

RMA: Robust Multiarray Analysis, Irizarry/Bolstad/Speed (NAR, 2003 31(4), e15)

(1 - u2)2 for |u| <= 1

0 else

Vorab: Was ist Tukeys Biweight ?

• Angabe der Tendenz• Maß für den Mittelwert• sehr robust gegenüber Ausreißern

Vektor: X = (x1,...,xn)

Berechne Tukey´s Biweight von X: T(X)

(1) Berechne die absolute Distanz von jedem Datenpunkt zum Median(2) Berechne S = Median der absoluten Abweichungen (MAD)(3) Definiere u = (Datenpunkt-Median(Datenpunkte) )/(Konstante*S + )(4) Konstante = 5; = 0.00001(5) Gewichtsfunktion:

w(u) =

T(x) = i w(u) xi / i w(u)

Vorab: Was ist Tukeys Biweight ?

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

xxxxx x

X = 1,2,3,2,4,20

Median 2.5Mittelwert 5.3

Tukeys Biweight 2.3

Vorverarbeitung von Microarray Daten:Beispiel 1: MAS 5.0

Array:

k = 16 (zB)

Kontrollzellen und leere Spots werden nicht weiter beachtet


Alle Zellen eines Sub-Arrays (=Zone) werden der Größe nach geordnet

Jeder Zelle wird ein Rang zugeordnet

C1C2C3C4…Cn

Definition von Hintergrund eines Sub- Arrays:

Zbg = niedrigsten 2% des jeweiligen Subarrays

.


Problem:

Bei dieser Definition von Hintergrund (Zbg) gibt es “scharfe” Grenzen zwischen den einzelnen “Subarrays”

Lösung:

Glättung der Übergänge

dk(x,y) = Distanz vom Mittelpunkt (.) des k-ten Segments zu einem Punkt mit den Koordinaten (x,y)

Gewichtung:

wk(x,y)=1/(dk2 + s)

(default s=100)


Glättung der Übergänge

..

Neuer Hintergrund:

b(x,y) = k wk(x,y) Zbg / k wk(x,y)

..



Perfect match und Mismatch (PM MM)

...

...PMMM

Definitionen:

Adjustierte Intensität: A(x,y) = maxInt(x,y) – b(x,y) | NoiseFrac * n(x,y)

NoiseFrac = 0.5 default

n(x,y) = 1 / w(x,y) * (w(x,y) n Zk)

n Zk = Standardabweichung (niedrigste 2% Intensitäten)

Int(x,y) = max Int(x,y) , 0.5



...

...PMMM

Definitionen:

Idealer Mismatch:

IM i,j = PM i,j / 2 Sbi MM i,j > PM i,j ; Sbi >

MM i,j MM i,j < PM i,j

PM i,j / 2 a MM i,j > PM i,j ; Sbi <=

a = / (1+(( -Sbi)/ ’)))

= 0.03’ = 10Sbi = biweight specific background



...

...PMMM

Definitionen:

Neuer Signalwert (Intensität):

i = 1,…,n probe pairj = 1,…,m array probe set

V i,j = max(PM i,j - IM i,j , ) = 2 –20

PV i,j = log(V i,j) für alle j

Neuer Signalwert = Tbi (PV i1, … , PV in )

Li/Wong (PNAS 2001 vol 98 (1), pp31-36)

Modell: MMij = j + i j +

PMij = j + i j + i j +

j Baselinei Expression eines Gens in der i ten Probej Anstiegsrate: MM im j ten “probe pair”j zuätzliche Anstiegsrate im korrespondierenden PM Wert Zufälliger Fehler

Vorverarbeitung von Microarray Daten:Beispiel 2: Li/Wong


Vorab: Was ist “Least Square Fit” (= Methode kleinster Fehlerquadrate)

0

1

2

3

4

5

6

7

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50

0

1

2

3

4

5

6

7

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50



Summe der Fehlerquadrate ist minimal



X=(1,2,3,4,5)Y=(1,1,2,2,4)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0,00 2,00 4,00 6,00


X=(1,2,3,4,5); Y=(1,1,2,2,4)

Y= ß0+ ß1*x

Es werden ß1 und ß0 so geschätzt, daß die

Summe der Quadrate der Residuen minimal werden:

Min

y = 0,7x - 0 ,1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0,00 2,00 4,00 6,00

2 2

1

ˆ( )

. : / 0

n

res i i ii

res

SQ e y y

bzw x SQ


i xi yi (xi)2 xi * yi

12…

n

x1x2…

xn

y1y2…

yn

y12

y22

…

yn2

x1y1x2y2

…

xnyn

xi yi (xi)2 xi * yi

i xi yi (xi)2 xi * yi

12345

12345

11224

149

1625

1 268

20

xi = 15 yi = 10 (xi)2 = 55 xi * yi = 37



5

1

5 52 2 2

1 1

1

0

1 153

5 5

2

1 1( ) 55 15 10

5

137 15*10 7

57

0.710

2 0.7*3 0.1

0.1 0.7

ii

xx i ii i

xy

XY

XX

X x

Y

SQ X Xn

SQ

SQ

SQ

Y X

Modell: MMij = j + i j + PMij = j + i j + i j +

=> PMij - MMij = i j + ij

Angenommen: ij ~ N(0,2)

Least Square Fit von PMij - MMij = i j + ij

Li/Wong:


RMA: Irizarry/Bolstad/Speed (NAR, 2003 31(4), e15)

Modellannahme:

Signal PM = Hintergrund + Signal = hg + s = + =

Optisches Rauschen+

unspezifische Bindung

Hintergrund Korrektur:B(PM) = E(s|PM)

s ~ exponentialhg ~ normal

Vorverarbeitung von Microarray Daten:Beispiel 3: RMA

PM, MM: “Forget about MM”

Grund: was immer da auch gemessen wird; momentan laesst sich das nicht sinnvoll in biologische Interpretationen fassen

ev. kann man in der Zukunft die Hintergrundkorrektur etwas besser durchführen, indem man die MM-Werte benutzt.

RMA


RMA

Summary Statistic: Yijn = jn + jn + ijn

i=1,...,I (chips)j=1,...,J (probes)n=1,...,n (probe set)

jn “probe affinity effect”

jn “log scale expression level”

ijn error iid N(0, 2)

j j= 0 n

-> median polish



RMA

Was ist “Median Polish”:

An eine Matrix M wird ein additives Modell gefittet:

Konstante + Spalten + Zeilen.

Im Algorithmus werden abwechselnd Zeilen- bzw Spalten Mediane entfernt und wird solange durchgefuehrt, bis die proportionale Reduktion in der Summe der absoluten Residuen kleiner epsilon ist oder bis zu einem Max von Iterationsschritten.

all spots “MAS 5.0” Li/Wong pm only

Li/Wong pm-mm RMA

Av Diff pm only

bgMAS+Av Diff pm only Av Diff pm - mm

Macht es etwas aus, welche Methode ich wähle?

Reference distribution is normal for the log fold changefrom: Terry Speed, Summarizing and comparing GeneChip data

Macht es etwas aus, welche Methode ich wähle?

Vergleich von mehreren Proben

cDNA Arrays Oligonucleotide Arrays


GC AC

GC AC

Patient Kontrolle GC AC

GC AC

Patient Kontrolle


Affymetrix in MAS5.0:

- nicht einzeln auswerten der Chips sondern direkter paarweiser Vergleich:

( 1,... )

( 1,..., )

q q qn

z z zn

qi PM MM

Zi PM b

“Balancing factors”

Wilcoxon Ranksummen Test

• Open source-open development software Projekt• seit 2001• erste Bioconductor software release, May 2002• R basiert

• http://www.bioconductor.org

Software

library(affy)x = ReadAffy(celfile.path="/project/gene_expression/spikein/")data.rma = express ( x,

subset = NULL , bg.correct = bg.correct.rma , pmcorrect.method="pmonly" , summary.stat = medianpolish , normalize=F , verbose = TRUE )

Software

Vorlesung: Vorverarbeitung von Affymetrix-Daten 28.10.2003.

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