Vorkommen von Shigatoxin-bildenden und enteropathogenen ... · 2.1.2 Epidemiologie und Bedeutung...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorkommen von Shigatoxin-bildenden und

enteropathogenen Escherichia coli in

deutschen Streichelzoos

INAUGURAL - DISSERTAION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet)

vorgelegt von

Tanja Bauer

Bad Säckingen

Hannover 2013

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen,

Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. G.-F. Gerlach

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Prof. Dr. G.-F. Gerlach

2. Gutachter: Univ.-Prof.Dr. L. Kreienbrock

Tag der mündlichen Prüfung: 21.05.2013

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... 5

Abbildungsverzeichnis ................................................................................................ 9

Tabellenverzeichnis .................................................................................................. 11

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................. 13

1 Einleitung ........................................................................................................... 17

2 Literatur ............................................................................................................. 19

2.1 Escherichia coli .......................................................................................... 19

2.1.1 Taxonomie .......................................................................................... 19

2.1.2 Epidemiologie und Bedeutung ............................................................ 19

2.1.3 Pathogene Escherichia coli ................................................................. 20

2.2 STEC/VTEC und EHEC ............................................................................. 21

2.2.1 Virulenzfaktoren .................................................................................. 22

2.2.2 Nachweis von STEC ........................................................................... 25

2.2.3 Epidemiologie von STEC/EHEC beim Menschen ............................... 28

2.2.4 EHEC-Erkrankungen beim Menschen ................................................ 31

2.2.5 Epidemiologie von STEC bei Tieren ................................................... 33

2.2.6 EHEC/STEC in Streichelzoos ............................................................. 35

2.3 Haltung von Tieren in Streichelzoos ........................................................... 37

2.3.1 Zoologische Gärten, Tierparks, Tiergärten .......................................... 37

2.3.2 Wildparks, Wildgehege ....................................................................... 38

2.3.3 Freizeitparks mit Tieranteil .................................................................. 39

2.3.4 Streichelzoos, Streichelgehege ........................................................... 39

3 Material und Methoden ...................................................................................... 41

3.1 Material ...................................................................................................... 41

3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien ..................................................... 41

3.1.2 Chemikalien und Reagenzien ............................................................. 42

3.1.3 Nährmedien ......................................................................................... 44

3.1.4 Puffer und Lösungen ........................................................................... 45

3.1.5 Herkunft des Untersuchungsmaterials und Probennahme .................. 47

Inhaltsverzeichnis

3.2 Methoden ................................................................................................... 49

3.2.1 STEC-Isolierung .................................................................................. 49

3.2.2 Herstellen der PCR-Sonde .................................................................. 51

3.2.3 Präparation chromosomaler DNA ....................................................... 54

3.2.4 Testen der Sensitivität für die stx1-, stx2- und eae-Sonden ................ 55

3.2.5 Colony-Blot.......................................................................................... 56

3.2.6 Southern-Hybridisierung ..................................................................... 57

3.2.7 DNA-Analyse mittels Multiplex-PCR ................................................... 58

3.2.8 Gelelektrophorese ............................................................................... 61

4 Ergebnisse ........................................................................................................ 63

4.1 Charakterisierung der beprobten Parks ...................................................... 63

4.1.1 Gehaltene Tierarten ............................................................................ 63

4.1.2 Ställe und Gehege .............................................................................. 64

4.1.3 Gehegehygiene und Management ...................................................... 65

4.1.4 Weitere Angaben zu den beprobten Gehegen .................................... 66

4.1.5 Statistische Auswertung der Fragebögen ........................................... 66

4.2 Nachweis von STEC aus Proben des Jahres 2008 .................................... 66

4.2.1 Nachweis von STEC aus Kaninchen (Wildpark 105) .......................... 67

4.2.2 Nachweis von STEC aus Ziegen (Wildpark 107) ................................ 68

4.2.3 Nachweis von STEC aus Schafen (Wildpark 110) .............................. 68

4.2.4 Isolation von STEC mittels verschiedener Anzucht-Methoden ............ 69

4.3 Nachweis von STEC/EPEC aus Proben des Jahres 2009 ......................... 70

4.3.1 Auswertungen auf Probenebene ......................................................... 72

4.3.2 Auswertungen auf Parkebene ............................................................. 75

4.3.3 Serotypisierung von STEC Isolaten .................................................... 75

4.3.4 Virulenzgene in STEC Isolaten ........................................................... 78

4.3.5 Auswertung auf Isolatebene ................................................................ 88

4.3.6 Vergleich des STEC/EPEC Nachweises zwischen der ersten

Beprobung der Zoos und der Nachuntersuchung .............................................. 89

4.4 Auswertung der Parkarten und Regionen .................................................. 92

4.4.1 Jahr 2008 ............................................................................................ 92

Inhaltsverzeichnis

4.4.2 Jahr 2009 ............................................................................................ 93

5 Diskussion ......................................................................................................... 95

5.1 Material und Methoden ............................................................................... 95

5.2 Parkmanagement ....................................................................................... 98

5.3 STEC/EPEC Prävalenz ............................................................................ 101

5.4 Vorkommen von Serogruppen ................................................................. 104

5.5 Vorkommen von Virulenzgenen ............................................................... 106

5.6 Wiederfindungsrate einzelner Serogruppen in Streichelgehegen ............ 109

5.7 Parkarten und Regionen .......................................................................... 110

5.7.1 Jahr 2008 .......................................................................................... 110

5.7.2 Jahr 2009 .......................................................................................... 111

6 Schlussfolgerung ............................................................................................. 113

7 Zusammenfassung .......................................................................................... 117

8 Summary ......................................................................................................... 121

Literaturverzeichnis ................................................................................................ 127

Danksagung ........................................................................................................... 145

Anhang I (Statistische Auswertung der Fragebögen) ............................................. 147

Anhang II (Deskriptive Auswertung der Fragebögen) ............................................. 151

Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Schichtung Deutschlands in drei Regionen .............................................. 48

Abb. 2: Untersuchter Probenumfang im Jahr 2008 ............................................... 67

Abb. 3: Untersuchter Probenumfang im Jahr 2009 ............................................... 71

Abb. 4: Anzahl positiver Proben der einzelnen Tierarten sowie aller Proben in

Prozent der einzelnen Parks. ................................................................... 72

Abb. 5: Die häufigsten vorkommenden Serogruppen prozentual in 32

beprobten Zoos. ....................................................................................... 77

Abb. 6: Die häufigsten vorkommenden Serogruppen prozentual in 32

beprobten Zoos bei Ziegen, Schafen und Schweinen .............................. 78

Abb. 7: Verteilung der Virulenzmuster der im Jahr 2009 getesteten Zoos. ........... 80

Abb. 8: Die häufigsten Serogruppen bezogen auf die serotypisierte

Gesamtprobenzahl ................................................................................... 84

Abb. 9: Die am häufigsten vorkommenden Serogruppen in den jeweiligen

Postleitzahlengebieten. ............................................................................ 86

Abb. 10: Serogruppenverteilung bei den Tierarten Ziege, Schaf und Schwein ....... 87

Abb. 11: Verteilung der Virulenzmuster anhand der 256 in der Kontroll-PCR

untersuchten Proben ................................................................................ 88

Abb. 12: Anzahl der Isolate der häufigsten Serogruppen ....................................... 89

Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Verwendete Primer (FRANCK et al. 1998): .............................................. 51

Tab. 2: Verwendete Primer ................................................................................... 58

Tab. 3: Tier- und Zoozahlen der Jahre 2008 und 2009. ....................................... 64

Tab. 4: Detektierte STEC im Jahr 2008 ................................................................ 69

Tab. 5: Übersicht STEC-Isolate aus im Jahr 2008 beprobten Streichelgehegen .. 69

Tab. 6: Anzahl STEC Isolate nach verschiedenen Isolierungs-Methoden ............ 70

Tab. 7: Wiederfindungsrate des Virulenzgens stx1 in PCR 1 vs. PCR 2 .............. 73

Tab. 8: Wiederfindungsrate des Virulenzgens stx2 in PCR 1 vs. PCR 2 .............. 74

Tab. 9: Wiederfindungsrate von eae in PCR 1 vs. PCR 2 .................................... 74

Tab. 10: Anzahl positiver Zoos je Serogruppe und Tierart ..................................... 76

Tab. 11: Virulenzgenkombinationen der Serogruppen ........................................... 82

Tab. 12: Auftreten der Serogruppen in geographischer Abhängigkeit. ................... 85

Tab. 13: Übersicht zum Verlauf des STEC/EPEC-Nachweises in der ersten und

zweiten Beprobung in ausgewählten Gehegen. ....................................... 90

Tab. 14: Übersicht zur Wiederfindungsrate einzelner Serogruppen in den

Tierarten ................................................................................................... 92

Tab. 15: Statistische Auswertung der Fragebögen mit Hilfe des Fisher’s exact

test .......................................................................................................... 147

Tab. 16: Deskriptive Auswertung der Fragebögen ............................................... 151

Abkürzungsverzeichnis


μl Mikroliter

μM Mikromolar

A Adenin

APEC Aviär-pathogene Escherichia coli

Aqua bidest Aqua bidestillata

bp Basenpaare

C Cytosin

cDNA complementary DNA

cm Zentimeter

d Tag

DIN Deutsches Institut für Normung e.V.

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynucleotidtriphosphat

eae (eae) Intimin (kursiv: Genbezeichnung)

EAEC Enteroaggregative Escherichia coli

E. coli Escherichia coli

EDEC Edema Disease Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EHEC Enterohämorrhagische Escherichia coli

EIEC Enteroinvasive Escherichia coli

EPEC Enteropathogene Escherichia coli

espP Gen für Serinprotease

et al. (lat. et alli) und andere

etp Gencluster für Typ II- Sekretionssystem

evtl. eventuell

ExPEC extraintestinale pathogene Escherichia coli

FAE Follikel-assoziiertes Gewebe

g Gramm


G Guanin

GALT gut associated lymphoid tissue

Gb3 Globotriacylceramid-Rezeptor

GKZ Gesamtkeimzahl

GN gram-negativ

h Stunde

ha Hektar

HC Hämorrhagische Colitis

H-Antigene Geißel-Antigene

HlyA (hlyA) Hämolysin A (kursiv: Genbezeichnung)

HUS Hämorrhagisches Urämisches Syndrom

i.d.R. in der Regel

Ig Immunglobulin

IMS Immunomagnetische Separation

katP Gen für Katalase-Peroxidase

kb Kilobase(n)

KbE Kolonien bildende Einheiten

kDa Kilodalton

KOH Kalium-Hydroxid

LB lysogeny broth

LEE locus of enterocyte effacement

LFGB Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch

LPS Lipopolysaccharide

mg Milligramm

min Minuten

ml Milliliter

mm Millimeter

mM Millimolar

MNEC Meningitis-assoziierte Escherichia coli

MRB modifizierte Rappaport-Bouillon

mRNA messenger Ribonukleinsäure


mTSB modifizierte Trypton-Soja-Bouillon

n absolute Zahl

ng Nanogramm

O-Antigene Oberflächenantigene

o.ä. oder Ähnliches

PBS phosphate buffered saline (Phosphatgepufferte

Kochsalzlösung)

PCR Polymerase chain reaction

(Polymerasekettenreaktion)

PLZ Postleitzahl

PSB peptone-sorbitol-bile

RKI Robert- Koch Institut

RNA Ribonukleinsäure

rRNA ribosomale Ribonukleinsäure

rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)

RT reverse transcription

s Sekunde

SDS Sodiumdodecylsulfat

SF Sorbitol fermentierend

SMAC Sorbitol-MacConkey

sog. sogenannte(r)

ssp. Subspezies

STEC Shigatoxin-bildende Escherichia coli

Stx (stx) Shigatoxin (kursiv: Genbezeichnung)

T Thymin

TA Tierarzt

Taq Thermus aquaticus

TBA Tris-Bor-EDTA-Puffer

TSA Trypton-Soja-Agar

TSB Tryptone-Soja-Bouillon

TTP trombotisch-trombozytopenische Purpura


U Unit

u.a. unter anderem

UPEC Uropathogene Escherichia coli

Urea Harnstoff

Ure Urease

UV-Licht Ultraviolettes Licht

V Volt

v.a. vor allem

VTEC Verotoxin-bildende Escherichia coli

vWF von-Willebrand-Faktor

WHO World Health Organization

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

Einleitung 17

1 Einleitung

Escherichia coli ist Teil der natürlichen Mikroflora des Intestinaltraktes von Säugern

und Vögeln. Einige Stämme jedoch sind in der Lage, ernsthafte Erkrankungen in

Mensch und Tier auszulösen. Diese pathogenen Stämme werden in sechs

Pathogenitätsgruppen unterteilt, abhängig von ihren Virulenzeigenschaften.

Die 1977 erstmals von KONOWALCHUK et al. (1977) beschriebenen Shiga Toxin-

bildenden Escherichia coli (STEC) sind eine Gruppe davon. In Zusammenhang mit

menschlichen Erkrankungen wurden STEC erstmals 1983 von RILEY et al. (1983)

beschrieben, als 47 Personen bei einem Ausbruch in Oregon und Michigan an

hämorrhagischer Colitis erkrankten. Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC)

stellen eine Untergruppe der STEC dar, welche in der Lage ist, aufgrund ihrer

Virulenzfaktoren hämorrhagische Colitis (HC) und das hämolytisch urämische

Syndrom (HUS) im Menschen hervorzurufen. Die meisten Ausbrüche sind mit der

Serogruppe O157 assoziiert, aber auch so genannte non-O157 Stämme wurden aus

an HUS Erkrankten isoliert (MELLMANN et al. 2008).

Infektionen mit EHEC/STEC erfolgen meist über kontaminierte Lebensmittel oder

durch Mensch zu Mensch Übertragungen (BOUDAILLIEZ et al. 1997). Vor allem

rohe oder ungenügend erhitzte Fleischprodukte von Wiederkäuern, wie Hack oder

Mett, und Rohmilchprodukte führen immer wieder zu EHEC-Ausbrüchen (RANGEL

et al. 2005). STEC wurde bereits in verschiedenen Haus- und Wildtieren

nachgewiesen, kleine und große Wiederkäuer jedoch stellen das

Erregerhauptreservoir da. WERBER et al. (2007) publizierten den Kontakt von

Kindern mit Wiederkäuern als prinzipielles Infektionsrisiko. In North Carolina, Florida

und Arizona (DEBROY u. ROBERTS 2006) sowie in den Niederlanden (HEUVELINK

et al. 2002) konnten Erkrankungen bei Kindern auf den Besuch im Streichelzoo, und

dem damit verbundenen Streicheln von kleinen Wiederkäuern, zurückgeführt

werden. In wieweit STEC in deutschen Streichelzoos verbreitet ist, ist nicht bekannt,

da repräsentative epidemiologische Untersuchungen zuvor noch nicht durchgeführt

wurden.

Ziel dieser vom Zoonoseverbund FBI-Zoo geförderten Arbeit war es, eine

flächendeckende, deutschlandweite Prävalenzerhebung von STEC in Streichelzoos

18 Einleitung

durchzuführen. Gleichzeitig wurde durch Erhebung eines Fragebogens versucht,

potentielle Faktoren, die ein vermehrtes STEC/EPEC-Vorkommen in deutschen

Streichelzos begünstigen und somit eine potenielle Übertragungsgefahr auf den

Menschen erhöhen könnten, zu eruieren.

Literatur 19

2 Literatur

2.1 Escherichia coli

2.1.1 Taxonomie

Escherichia coli aus der Familie der Enterobacteriaceae wurde 1885 erstmalig von

dem Kinderarzt Dr. Theodor Escherich aus dem Stuhl Neugeborener isoliert. Es

handelt sich um ein gramnegatives, fakultativ anaerobes Stäbchenbakterium,

welches zwischen 2,0-6,0 µm lang und 1,1-1,5 µm breit ist. Auf einfachem Columbia-

Schafblutagar wachsen E. coli in Form relativ großer (2-5 mm), grauer, feucht-

glänzender Kolonien mit glattem Rand (smooth-[S]-Form). Es kommen jedoch auch

Formen, die trockene Kolonien mit einem gezahnten Rand aufweisen (rough-[R]-

Form) oder schleimproduzierende Formen vor (ROLLE u. MAYR 2002). Alle E. coli

sind Oxidase negativ, Katalase positiv und in der Lage, Glukose unter Säurebildung

abzubauen. In der Regel können sie Laktose, Sorbitol und weiterhin Arabinose,

Maltose, Trehalose, Mannit und Glycerin verstoffwechseln. E. coli werden anhand

ihrer Oberflächen (O)-, Kapsel (K)- sowie Geißel (H)-Antigene nach einem

modifizierten Kaufmann-Schema in verschiedene Serovare eingeteilt. Mittlerweile

sind 181 verschiedenen O-Antigene bekannt. Die O-Antigene definieren die

Serogruppe, während die verschiedenen Kombinationen aus O- und H-Antigenen

den Serotyp eines E. coli Isolates festlegen (NATARO u. KAPER 1998). E. coli

Erreger sind gegenüber horizontalem Gentransfer sehr empfänglich, weshalb sie

eine große phänotypische und genetische Variabilität aufweisen.

2.1.2 Epidemiologie und Bedeutung

Escherichia coli treten als Kommensalen in der menschlichen und tierischen Flora

des hinteren Dünndarms sowie des Dickdarms (mit Ausnahme von

Meerschweinchen, Chinchillas und körnerfressenden Ziervögeln) auf und haben

neben der Beteiligung an Abbauprozessen auch in der Produktion von Vitaminen

ihre physiologische Aufgabe (ROLLE u. MAYR 2002). Davon abzugrenzen sind

Isolate, die aufgrund der Ausbildung verschiedener Faktoren als virulent angesehen

werden müssen. Bestimmte Serogruppen treten zwar gehäuft mit bestimmten

20 Literatur

klinischen Syndromen auf, jedoch ist nicht das serologisch reaktive Antigen per se

für die Virulenz des Isolates verantwortlich.

2.1.3 Pathogene Escherichia coli

Die Virulenz bestimmter E. coli-Isolate ist v.a. auf Endo-, Entero- und Cytotoxine

sowie Adhäsionsfaktoren zurückzuführen und nur Isolate mit bestimmten

Kombinationen von Virulenzfaktoren (Pathotyp) können persistieren und klinische

Erkrankungen auch in nicht vorgeschädigten Individuen auslösen. Dazu gehören

Pathotypen, welche Darm- und Durchfallerkrankungen, Harnwegsinfektionen sowie

Sepsis und Meningitis auslösen.

Bei den humanpathogenen Darm- und Durchfallerregern sind bisher sechs

Kategorien bekannt: Die enteropathogenen E. coli (EPEC), die

enterohämorrhagischen E. coli (EHEC), enterotoxische E. coli (ETEC),

enteroaggregative E. coli (EAEC) sowie enteroinvasive E. coli (EIEC) und diffus

adhärente E. coli (DAEC). E. coli-Pathotypen, welche mit extraintestinalen

Infektionen in Zusammenhang stehen, werden allgemein als ExPEC bezeichnet,

wovon uropathogene E. coli (UPEC) am frequentesten vorkommen. Immer häufiger

werden jedoch auch mit Sepsis und Meningitis assoziierte E. coli (MNEC)

diagnostiziert.

EPEC, ETEC und EHEC können nicht nur im Menschen, sondern auch in Tieren

klinisch apparente Infektionen auslösen, wobei vorrangig Jungtiere betroffen sind. Im

Einzelnen können bei Tieren die Colienteritis, die Colidiarrhoe sowie die

Coliseptikämie und die Ödemkrankheit der Schweine unterschieden werden.

Zusätzlich sind geflügelpathogene E. coli (APEC) bekannt, die v.a. bei Puten und

Hühnern zu Septikämien, Perikarditiden und primären Atemwegsinfektionen sowie

der Coligranulomatose führen können (KAPER et al. 2004).

Die Colienteritis wird durch enteropathogene E. coli (EPEC) und Shigatoxin-bildende

E. coli (STEC) durch das Anheften und Zerstören der Mikrovilli, sowie bei STEC

durch das Freisetzten von Toxinen ausgelöst. Es kommt zu schleimigen, evtl.

Blutbeimengungen aufweisenden, Durchfällen mit fibrinös-hämorrhagischer

Entzündung des Darms. Meist handelt es sich bei den STEC-Stämmen um die

Literatur 21

Serogruppe O118 (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007). Auf STEC, eine

Gruppe, der die EHEC untergeordnet sind, wird später noch genauer eingegangen.

Die Colidiarrhoe tritt meist in den ersten Lebenswochen bei Kälbern, Lämmern und

Ferkeln auf und wird durch enterotoxische E. coli verursacht. Die ETEC exprimieren

Adhäsionsfaktoren, mit deren Hilfe sie sich an die Enterozyten anheften können. Des

Weiteren bilden sie sog. hitzelabile (LT) und/ oder hitzestabile (ST) Enterotoxine, die

zu einer sekretorischen Diarrhö führen (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007;

ROLLE u. MAYR 2002).

Die Coliseptikämie kommt besonders bei Kälbern, Lämmern, Ferkeln, Fohlen und

Welpen in den ersten Lebenstagen vor. Durch bestehende Abwehrschwäche verläuft

die Infektion mit septikämischen E. coli-Stämmen (meist der Serogruppen O26, O86,

O115 und O78) akut oder perakut (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007).

Die Ödemkrankheit der Schweine wird von einer eigenen Gruppe STEC-Stämmen

ausgelöst, die auch als EDEC (Edema Disease E. coli) bezeichnet wird und denen

die Bildung des Shigaoxin-Typs 2e (Stx 2e) sowie die Ausbildung adhäsiver F18

Fimbrien gemein ist. Das Stx 2e gelangt über die Darmschleimhaut in den

Blutkreislauf und schädigt die Endothelzellen der kleinen Arterien und Arteriolen, was

zur erhöhten Gefäßpermeabitität und schließlich zu Ödemen führt. Nicht selten

bilden sie zusätzlich zu Stx 2e auch α-Hämolysin und andere Enterotoxine. Die am

häufigsten mit diesem Krankheitsbild assoziierten Serogruppen sind O138, O139 und

O141 (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007; ROLLE u. MAYR 2002).

2.2 STEC/VTEC und EHEC

Im Jahr 1977 beschrieben KONOWALCHUK et al. (1977) erstmals das Vorkommen

eines Toxins in cytotoxischen E. coli, welches Vero-Zellen in Kultur beeinflusste und

deshalb von ihm als Verotoxin bezeichnet wurde. O’BRIEN et al. zeigten, dass sich

Verotoxin mit Antitoxin gegen Shigella dysenteriae, Shigatoxin 1, neutralisieren lässt

(O'BRIEN et al. 1982) und schließlich publizierten O’BRIEN et al., dass beide Toxine

identisch sind (O'BRIEN u. LAVECK 1983). Demzufolge wird heutzutage in der

Nomenklatur STEC und VTEC synonym verwendet. STEC sind meldepflichtig nach

der Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten.

22 Literatur

EHEC sind im Gegensatz zu STEC nicht direkt über das Vorliegen bestimmter

Virulenzgene definiert, vielmehr wird diese Untergruppe der STEC vorrangig durch

das im Menschen hervorgerufene Krankheitsbild definiert. Aufgrund der hohen

genetischen Variabiliät der E. coli Isolate empfiehlt das RKI auf nationaler Ebene

jedes STEC-Isolat als potentiellen EHEC anzusehen. Als EHEC definitiv bezeichnet

werden sollen jedoch nur Isolate, welche aus erkrankten Menschen isoliert wurden

(KARCH, persönliche Mitteilung). Die infektiöse Dosis von STEC/EHEC für den

Menschen ist extrem gering und liegt bei 10-100 Bakterien (KAPER et al. 2004).

EHEC sind nach §7 Infektionsschutzgesetz meldepflichtig.

2.2.1 Virulenzfaktoren

In den Untersuchungen der letzten Jahre zur Virulenz von STEC wurde das

Augenmerk vermehrt auf die Kombination von Virulenzgenen und Mechanismen

gelegt, die ein STEC-Isolat zu einem hochpathogenen, humanen EHEC-Isolat

machen. Unbestritten bleibt, dass die Produktion von Shigatoxinen zwar essentiell

ist, nicht aber allein für die Virulenz verantwortlich gemacht werden kann. Eine große

Anzahl weiterer Virulenzfaktoren wurde beschrieben; die meisten von ihnen sind auf

mobilen genetischen Elementen, wie z.B. Plasmiden, Pathogenitätsinseln oder

temperenten lambdoiden Phagen kodiert (CAPRIOLI et al. 2005).

2.2.1.1 Shigatoxine

Zur Familie der Shigatoxine gehören die beiden nicht immunologisch kreuzreaktiven

Hauptgruppen Shigatoxin 1 (Stx 1) und Shigatoxin 2 (Stx 2), deren Strukturgene im

ca. 60 kb großen Genom lambdoider Phagen, lokalisiert liegen. Stx 1 ist zu 98%

identisch mit dem von S. dysenteriae produzierten Toxin, während Stx 2 nur zu 55%

Homologie zeigt. Während Stx 1 nur geringe Sequenzvariationen aufweist, wurden

von Stx 2 bereits die Varianten Stx 2c, Stx 2d, Stx 2e sowie Stx 2f mit jeweils

modifizierten antigenetischen oder biologischen Eigenschaften beschrieben. So ist

z.B. bekannt, dass Stx 2 und Stx 2c vermehrt von Isolaten produziert werden, welche

aus HUS-Patienten stammen (KARCH 2001). Stx 2e und Stx 2f hingegen werden

häufig von Tierisolaten gebildet, welche in diesen Fällen für den Menschen selten

pathogen sind. In der Pathogenese der Ödemkrankheit der Schweine spielt Stx 2e

Literatur 23

eine wichtige Rolle, Stx 2f-produzierende Isolate stammen meist vom Geflügel

(CAPRIOLI et al. 2005).

Die Shigatoxine zählen zu den Ribosomen-inaktivierenden Proteinen und bestehen

aus einer A- und einer B-Untereinheit. Die 32 kDa große A-Untereinheit besteht aus

einem 28 kDa großen A1-Peptid und einem 4 kDa großen A2-Peptid, welche über

eine Disulfidbrücke verbunden sind. Das A1-Peptid besitzt enzymatische Aktivität,

während das A2-Peptid für die Bindung an die B-Untereinheit zuständig ist. Die B-

Untereinheit besteht aus einem Pentamer von fünf identischen, 7,7 kDa großen

Einheiten und bindet das Toxin an den Globotriasylceramid-Rezeptor (Gb3) auf

eukariotischen Zelloberflächen. Das Holotoxin wird über Endocytose in die Zelle

geschleust und verhindert dort die Proteinbiosynthese der Zelle, was schließlich zu

deren Tod führt (FRIEDRICH 2002).

2.2.1.2 EHEC-Hämolysin

Aus pathogener Sicht für den Menschen am bedeutendsten ist die O157-

Serogruppe. Fast alle EHEC O157-Stämme besitzen ein großes Virulenzplasmid

(pO157) von 90 kb, auf dem die unterschiedlichsten zusätzlichen Virulenzfaktoren

lokalisiert sind. Unter anderem trägt es das EHEC hly Gen für das EHEC-Hämolysin,

das katP Gen für eine bifunktionelle Katalase-Peroxidase (BRUNDER et al. 1996),

das espP Gen kodierend für eine Serinprotease und das etp Gencluster, welches für

ein Typ-II-Sekretionssystem kodiert (KARCH 2001). Im Gegensatz zu dem

Virulenzplasmid der O157:H7-Stämme besitzen jene der non-O157-Stämme meist

nicht das komplette Spektrum an Virulenzgenen (KARCH 2001).

Bei dem EHEC-Hämolysin handelt es sich um ein 107 kDa großes porenbildendes

Zytotoxin der RTX-Familie (repeats in toxin), das im Wildtyp sowohl frei als auch

zellassoziiert vorkommt (KARCH et al. 1996a). Seine definitive Rolle in der

Pahogenese von EHEC-Infektionen ist noch nicht ganz geklärt. Es ist jedoch

denkbar, dass durch die Lyse der Erythrozyten in vivo Hämoglobin freigesetzt wird

und E. coli als Eisenquelle dient und somit wachstumsfördernd auf diese wirkt.

Ebenso kann das Toxin bovine Leukozyten lysieren, jedoch nicht humane (NATARO

u. KAPER 1998).

24 Literatur

2.2.1.3 EAST1

Bei EAST1 handelt es sich um ein Toxin, welches erstmals in einem

enteroaggregativen E. coli-Stamm (EAEC) eines an Diarrhö erkrankten Kindes

entdeckt wurde (SAVARINO et al. 1991). Mittlerweile wurde EAST1 jedoch auch in

anderen pathogenen E. coli wie EHEC, EPEC, DAEC oder ETEC und in Salmonellen

gefunden. Auch in Nutztieren, v.a. in Schweinen und Rindern konnten EAST1-

positive Isolate bereits detektiert werden. Das kodierende Gen astA liegt entweder

direkt im Bakterienchromosom oder auf einem Plasmid, häufig in mehreren Kopien.

EAST1 ist ein 4,1 kDa großes Molekül, das aus 38 Aminosäuren besteht (VEILLEUX

u. DUBREUIL 2006). Das hitzestabile Toxin EAST1 weißt 50% Identität mit der

enterotoxischen Dömane des hitzestabilen Toxins STa auf, jedoch sind die beiden

Toxine immunologisch gesehen verschieden (SAVARINO et al. 1991). Welche Rolle

EAST1 in der Pathogenese von EHEC-Infektionen spielt ist noch nicht geklärt,

allerdings ist es möglich, dass nichtblutige Durchfallerkrankungen, wie sie bei einigen

EHEC-Patienten auftreten, durch EAST1 bedingt sind (NATARO u. KAPER 1998).

2.2.1.4 Adhäsionsfaktoren

Für die Adhärenz von EHEC an das Darmepithel sind zahlreiche Faktoren mit ihren

zuständigen Genen beschrieben. Am besten untersucht und in fast allen EHEC-

Stämmen vorkommend ist die 43 kb große Pathogenitätsinsel LEE (locus of

enterocyte effacement). Durch die auf ihr kodierten Proteine sind EHEC in der Lage

sich sehr fest an die Darmepithelzellen anzuheften und dort typische A/E-Läsionen

(„attaching and effacing“) zu verursachen. Die A/E-Läsionen sind durch

zytoskelettalen Umbau, der Zerstörung der Mikrovilli und einer engen Bindung

zwischen Bakterium und Epithelzellmembran gekennzeichnet (CAPRIOLI et al.

2005). Der LEE besitzt drei funktionale Regionen. Auf der ersten Region sind Gene

für ein Typ-III-Sekretionssystem lokalisiert. Die mittlere Region beherbergt das eae-

Gen. Das eae-Gen kodiert für das 94 bis 97 kDa große Außenmembranprotein

Intimin, welches den EHEC zur Adhärenz dient. Gleichzeitig ist auf diesem

funktionalen Modul das tir-Gen lokalisiert, welches den Translokationsrezeptor für

Intimin (Tir) stellt. Der Rezeptor wird über das Typ-III-Sekretionssystem in die

Literatur 25

Plasmamembran der Zielzelle verbracht, so dass das Intimin daran binden kann. Das

dritte funktionelle Modul codiert für die Sekretionsproteine EspA, EspB und EspD,

welche Teil des Typ-III-Sekretionssystems sind (CAPRIOLI et al. 2005; KARCH

2001).

2.2.2 Nachweis von STEC

Zum Nachweis von STEC stehen heutzutage kulturelle, molekularbiologische und

immunologische Verfahren mit etlichen Vor- und Nachteilen zur Verfügung, von

denen nachfolgend nur einige wichtige exemplarisch erwähnt werden. Während man

nach bekannt werden des ersten EHEC-Ausbruches primär die Diagnostik von

O157-Serovaren vorantrieb, ist man mittlerweile daran interessiert, eine praktikable

Serovar-übergreifende Diagnostikmethode zu etablieren. Dies jedoch erschwert

einen traditionell kulturellen Nachweis, da STEC eine hohe biochemische Ähnlichkeit

zur physiologischen Darmflora aufweisen und sowohl in klinisch Erkrankten wie auch

in Reservoirwirten nur einen kleinen Anteil der vorhandenen E. coli ausmachen

(1/300 Bakterien) (KARCH et al. 1996a). Somit stößt auch der Einsatz von

Selektivmedien aufgrund des starken Überwiegens der Begleitflora in Stuhl- und

Kotproben an Grenzen.

2.2.2.1 Direkter Erregernachweis

Eine beliebte Diagnostikmethode, die i.d.R. zum Nachweis von O157:H7 genutzt wird

stützt sich auf die Tatsache, dass dieser Serotyp im Gegensatz zu 95% der

physiologischen E. coli-Flora kein Sorbit verstoffwechseln kann. So wachsen Sorbitol

negative STEC-Stämme auf dem altbewährten Sorbitol-McConkey-Agar, der als

einzige Kohlenhydratquelle Sorbit enthält, als farblose bis graue Kolonien, während

Sorbitol positive Stämme als pink-farbene Kolonien erscheinen. Um die Spezifität

des Nährmediums zu steigern werden diesem häufig zusätzlich Antibiotika, wie z.B.

Cefixim und Tellurit zugesetzt, welche das Wachstum der Begleitflora hemmen

(ZADIK et al. 1993). Allerdings sind mittlerweile eine große Anzahl an

sorbitfermentierenden STEC-Serovare bekannt, welche sich auf dem beschriebenen

Nährmedium von komensaler Darmflora nicht unterscheiden, was die kulturelle

26 Literatur

Identifikation solcher Stämme auf diesem Nährboden unmöglich macht (KARCH et

al. 1996a).

Eine Alternative stellt der Enterohämolysin-Agar dar, bei dem man sich die

Ausprägung des enterohämolytischen Phänotyps zu Nutze macht. Die meisten non-

O157-STEC-Stämme hämolysieren, ebenso wie das Serovar O157:H7, gewaschene

Schaf- oder Humanerythrozyten in Abhängigkeit von Calcium und bilden auf dem

Enterohämolysin-Agar eine inkomplette Hämolysezone um die Bakterienkolonie. Da

laut BETTELHEIM (1995) und BEUTIN (1989) eine enge Assoziation zwischen

Shigatoxin- und Enterohämolysinproduktion besteht, sieht BETTELHEIM in dem

Enterohämolysin-Agar eine adäquate Diagnostikmethode zur Identifizierung von

STEC-Isolaten. Allerdings prägt nur jedes vierte EHEC-Isolat den hämolytischen

Phänotyp aus, die anderen sind oft Träger des sog. „stillen“ EHEC-Hämolysin Gens

und zeigen auf dem Enterohämolysin-Agar deshalb keine Hämolysezone. Sie

entziehen sich somit der Detektion (KARCH et al. 1996a).

Des Weiteren stehen heutzutage sog. chromogene Nährmedien zur Verfügung, die

neben Sorbit chromogene Substrate für ß-D-Glucuronidase und/oder ß-D-

Galactosidase als Marker einsetzten. Allerdings sind diese Nährmedien sehr teuer,

was den Einsatz beschränkt.

2.2.2.2 Immunomagnetische Separation (IMS)

Bei der immunomagnetische Separation (IMS) handelt es sich eher um eine

Anreicherungsmethode als um ein Nachweisverfahren. Für die IMS werden

magnetische Partikel, die mit Antikörper gegen spezifische Oberflächenantigene

behaftet sind, sog. immunomagnetische Beads, eingesetzt. Diese Beads binden an

das entsprechende O-Antigen und lassen sich durch Anlegen eines magnetischen

Feldes separieren. Durch mehrmaliges Waschen werden begleitende Keime entfernt.

Mit dem sehr sensitiven Verfahren ist es möglich 100 EHEC pro Gramm Stuhl in

Gegenwart von 107 nicht enterohämorrhagischen E. coli zu detektieren. Jedoch kann

man auch mit dieser Methode keine EHEC-Reinkultur gewinnen, so dass der Einsatz

eines Selektivmediums auch hier nicht ausbleibt (KARCH et al. 1996a; KARCH et al.

1996b). Waren bis vor kurzem nur immunomagnetische Beads für

Literatur 27

Oberflächenantigene der O157-Serogruppe kommerziell erhältlich, so sind

mittlerweile auch Beads für die Serovare O111, O145, O26 und O103 im Handel.

2.2.2.3 Toxinnachweis

Die Bildung von Shigatoxinen ist allen STEC gemein, weshalb der Toxin- bzw. der

Toxingennachweis von größtem diagnostischem Interesse ist. Ziel ist es deshalb,

eine Erregerisolierung kombiniert mit einem Toxin- und/ oder Toxingennachweis zu

liefern (www.rki.de, Informationsblätter für Ärzte). Zur Detektion von Shigatoxin bzw.

stx stehen folgende gut etablierte Methoden zu Verfügung:

Verozelltoxizitätstest: Verozellen werden hierbei mit dem Kulturüberstand

überschichtet und nach ca. 48-72 h Inkubation die cytotoxischen Effekte an den

Verozellen beurteilt. Der Test ist in Kombination mit einem Neutralisationstest sehr

sensitiv und spezifisch, allerdings auch sehr zeitintensiv (FRIEDRICH et al. 2002).

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)/ Enzymimmunoassay (EIA): ELISA-

oder EIA-Testsysteme sind in großer Variation kommerziell erhältlich. Sie sind

schnell und einfach anzuwenden und weisen in Kombination mit anderen

Screeningverfahren (PCR, Verozelltoxizitätstest) oder einem kulturellen Nachweis

eine ausreichende Sensitivität und Spezifität auf. Die meisten erhältlichen

Testsysteme arbeiten mit zwei monoklonalen Stx-Antikörpern. Der erste ist fest auf

dem Testsystem fixiert, an ihm bindet das Antigen. Der zweite Antikörper ist mit

einem Enzym (Meerrettich-Peroxidase oder Alkalische Phosphatase) gekoppelt, was

nach Bindung mit dem Antigen und nach Zugabe eines spezifischen Substrates zu

einer Farbreaktion führt. Die Toxine Stx 1 und Stx 2 können von den meisten

Testsystemen getrennt voneinander nachgewiesen werden.

Colonyblot: Der Colonyblot eignet sich sowohl zum Toxingen-Nachweis als auch

gleichzeitig zum Erregernachweis. Mittels einer Shigatoxin-spezifischen Gensonde

kann auf Nitrocellulosemembran gebundene, stx-tragende Bakterien-DNA sichtbar

gemacht werden. Dies geschieht durch radioaktive Markierung oder enzymatische

Reaktionen (HULL et al. 1993; KARCH H. et al. 1986). Die als stx-positiv

identifizierten Kolonien können von der geblotteten Agarplatte isoliert werden. Das

Verfahren ist sensitiv, jedoch auch recht zeitintensiv und deshalb für die

Routinediagnostik nur bedingt geeignet.

28 Literatur

Polymerase-Kettenreaktion (PCR): Die PCR ist eine weitverbreitete, nicht nur in der

STEC-Diagnostik genutzte Methode, die in den meisten Diagnostiklaboren

routinemäßig eingesetzt wird. Ebenso wie der ELISA oder EIA kann die PCR zur

Serovar- unabhängigen Toxingen-Diagnostik eingesetzt werden. Diverse Protokolle

wurden zu diesem Zweck bereits etabliert (FRANCK et al. 1998a; MONDAY et al.

2007; PATON u. PATON 1998; WANG et al. 2002).

Da die EHEC/STEC-Diagnostik bundesweit nicht einheitlich geregelt ist, wurde im

Jahre 2000 ein sog. Stufenplan der EHEC-Diagnostik vom Arbeitskreis „EHEC“ des

Robert-Koch Instituts (RKI), dem Bundesinstitut für gesundheitlichen

Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) mit Unterstützung der Fachgruppe

„Gastrointestinale Infektionen“ der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und

Mikrobiologie (DGHM) entwickelt (FRUTH et al. 2000). Der Plan sieht folgende drei

Diagnostikstufen vor:

Stufe 1: Screening auf Shigatoxinbildner durch Anreicherung der Probe in einem

EHEC-Direktmedium mit anschließendem Toxinnachweiß mittels ELISA. Im positiven

Fall wird eine Verdachtsdiagnose an das zuständige Gesundheitsamt gestellt und

Stufe 2 des Plans wird eingeleitet.

Stufe 2: Isolierung und Charakterisierung der EHEC-Bakterien. Der ELISA-Befund

wird durch PCR bestätigt und durch einen Colony-Immunoblot wird das

entsprechende Agens isoliert. Eine Serotypisierung folgt.

Stufe 3: Typisierung der Erregerisolate zu epidemiologischen Zwecken durch

Lysotypie, Bestimmung des Pulsefeld-Gelelektrophoresemusters, Bestimmung

weiterer Virulenzfaktoren oder Antibiotikaresistenzbestimmungen etc.

2.2.3 Epidemiologie von STEC/EHEC beim Menschen

Aufmerksam auf STEC/EHEC beim Menschen wurde man erstmals 1982 während

eines Ausbruches in Oregon und Michigan, USA, als 47 Menschen nach einem

Besuch in einer Fastfoodkette an abdominalen Krämpfen, anfänglich wässriger und

später blutiger Diarrhö litten. Aus ihren Stühlen konnten Shigatoxin-produzierende E.

coli des Serotyps O157:H7, der EHEC-Prototyp, isoliert werden (RILEY et al. 1983).

Seitdem werden immer wieder Ausbrüche mit diesem Zoonoseerreger verzeichnet.

E. coli O157:H7 ist deutschlandweit mit fast 50% der am häufigsten ursächlich mit

Literatur 29

der Erkrankung Hämolytisch urämisches Syndrom (HUS) assoziierte Serotyp (Gerber

et al. 2002; Karch et al. 2005). In den USA ist dieser Serotyp laut Untersuchungen

sogar an ca. 95% der HUS-Fälle beteiligt (Karch et al. 2005). O157:H7 ist mittlerweile

weltweit Ursache für diverse EHEC-Ausbrüche v.a. in Industrieländern wie

Nordamerika, Japan und Europa. Einer der bisher größten war der von FUKUSHIMA

et al. (1999) in Sakai City beschriebene Fall, bei dem es zu über 12.000 erkrankten

Schulkindern kam.

Der neuste und bisher schwerste EHEC-Ausbruch in Deutschland wurde im Frühjahr

2011 verzeichnet. Von Mai bis Juli wurden insgesamt 3842 offizielle Erkrankungsfälle

gemeldet, die mit dem EHEC-Serotyp O104:H4 in Verbindung standen, wobei 2987

Fälle akuter Gastroenteritis sowie 855 HUS-Fälle dokumentiert wurden. Gemessen

an den HUS-Erkrankungszahlen handelt es sich um den bisher größten Ausbruch

weltweit. Anders als bei den bisherigen Ausbrüchen waren v.a. Erwachsene,

darunter vermehrt Frauen betroffen. Die Mortalität der HUS-Erkrankten betrug 4,1%

(35), die der Gastroenteritis-Erkrankten 0,6% (18). Der Ausbruch fand v.a. in den

nördlichsten fünf Bundesländern Deutschlands statt, obwohl Infektionen aus allen

Bundesländern berichtet wurden. Als Infektionsvehikel konnten

Bockshornkleesprossen aus einem Betrieb in Niedersachsen identifiziert werden

(RKI EHEC-ABSCHLUSSBERICHT 2011).

In den meisten Fällen sind die Infektionen nahrungsmittelassoziiert, wobei

Rindfleischprodukte, insbesondere unzureichend erhitztes Hack und Mett, im

Fordergrund stehen (GRIFFIN u. TAUXE 1991a). Ausbrüche wurden allerdings auch

durch Rohmilch und Rohmilchprodukte, Kopfsalat, Kartoffeln und unpasteurisierten

Apfelsaft verursacht (ARMSTRONG et al. 1996; CODY et al. 1999). Im Jahr 1994

erkrankten 20 Menschen in Washington und Kalifornien nach dem Verzehr von

geräucherter, vorgeschnittener Salami, woraufhin E. coli O157:H7 aus zwei der

Charge entnommenen Salamiproben isoliert werden konnte. Untersuchungen

zeigten, dass der Räuchervorgang zwar die Vermehrung von EHEC in der Salami

verhindert, die vorhandenen Mikroorganismen jedoch nicht abgetötet werden

(ALEXANDER 1995). Der größte mit Trinkwasser in Verbindung stehende Ausbruch

ereignete sich im Jahr 2000 in Kanada. Etwa 2300 Menschen infizierten sich mit

30 Literatur

O157:H7 verseuchtem Wasser, wovon sieben starben (HOLME 2003). Auch hier ist

bekannt, dass E. coli O157:H7 nach einer 12-wöchigen Wasserpassage lediglich

seine Kultivierbarkeit, jedoch nicht seine Infektiösität verliert (KARCH et al. 1999).

Der bis 2011 größte europäische Ausbruch ereignete sich 1996 in Schottland, bei

dem 20 Menschen starben, nachdem sie alle Fleisch aus derselben Fleischerei

konsumiert hatten (DUNDAS et al. 2001). BOUDAILLIEZ et al. (1997) beschrieben

die zwischenmenschliche Infektion durch klassische Schmierinfektionen bei einem

O111-EHEC-Stamm als durchaus ernstzunehmendes, potentielles Risiko.

Obwohl die meisten EHEC-Ausbrüche mit den genannten Risikofaktoren in

Verbindung stehen und schlussendlich darauf zurückzuführen sind, treten bis zu 80%

der diagnostizierten O157-STEC-Infektionen sporadisch. In einer Fall-Kontrollstudie

untersuchten WERBER et al. (2007) neben kontaminierten Lebensmitteln weitere,

mögliche Infektionsquellen, die mit sporadischen EHEC-Infektionen im Menschen in

Zusammenhang stehen. Sie kamen zu dem Schluss, dass sowohl Risikofaktoren als

auch die Verteilung der Serotypen abhängig von der Altersgruppe differieren. So

stellen der Verzehr von Rohmilch und das Spielen im Sandkasten ebenso wie das

Streicheln von großen und kleinen Wiederkäuern bei Kindern unter drei Jahren ein

erhöhtes Risiko dar, wohingegen sich bei Kindern zwischen drei und neun Jahren

eine Korrelation zwischen Erkrankung und Schwimmen in nicht gechlortem Wasser

(Teich, See, privater Swimmingpool) zeigte. Bei Kindern ab zehn Jahren konnte der

Konsum von Lammfleisch und Streichmettwurst als hauptsächlicher Risikofaktor

identifiziert werden (WERBER et al. 2007). O’BRIEN et al. (2001) befragten in einer

englischen Fall-Kontrollstudie 369 Patienten nach ihren Expositionen im Beruf,

Haushalt und Freizeit in den letzten fünf Tagen vor ihrer EHEC-Erkrankung. Sie

kamen zu dem Ergebnis, dass die Gefahr einer STEC-O157-Infektion signifikant

höher war, wenn die Patienten Kontakt zu landwirtschaftlicher Umgebung, mit oder

ohne Tierkontakt, hatten.

Bei E. coli O157:H7 handelt es sich um jenen Serotypen, der am häufigsten mit

schweren Erkrankungen in Verbindung steht, inzwischen jedoch sind eine Vielzahl

weiterer Serogruppen bekannt, welche aufgrund ihrer Virulenzfaktoren zu

pathogenen Veränderungen beim Menschen führen. Die große Variabilität der

Literatur 31

STEC-Serovare, welche in Europa mit Erkrankungen assoziiert sind, konnte in

anderen Kontinenten und Gebieten bisher nicht nachgewiesen werden. Zirka 80%

der durchfallassoziierten STEC gehören sog. non-O157 Serogruppen an,

hauptsächlich O26, O103, O111, O113 und O145. Der O26:H11/ NM-Serotyp ist

nach O157 derjenige in Europa, welcher am häufigsten in Verbindung mit

Erkrankungen nachgewiesen wird. Eine Studie in Deutschland zeigte, dass rund 1/7

aller EHEC-Isolate, welche von HUS-Patienten isoliert werden, diesem Serotyp

angehören (GERBER et al. 2002). Bei der zweithäufigsten non-O157 EHEC

Serogruppe handelt es sich in Deutschland um die O145-Serogruppe. Zusammen

mit EHEC O26 waren diese beiden Serogruppen in den Jahren 1997-2005 für rund

88% der HUS-Fälle in Deutschland verantwortlich (Stand 2005). Die Rolle der non-

O157-Stämme wird jedoch wahrscheinlich immer noch unterschätzt, da die meisten

Labore routinemäßig nicht auf non-O157 Serogruppen untersuchen und auch

sorbitolfermentierende Isolate (wie z.B. SF EHEC O157:NM) auf Sorbitol-McConkey-

Selektivagar selten oder gar nicht diagnostiziert werden (KARCH et al. 1999).

2.2.4 EHEC-Erkrankungen beim Menschen

In den letzten 30 Jahren konnten sich EHEC weltweit und kontinuierlich ausbreiten

und treten mittlerweile nach Salmonellen, Campylobacter und Yersinien als

vierthäufigster bakterieller Enteritiserreger in Erscheinung

(http://www3.rki.de/SurvStat/QueryForm.aspx, letzter Zugriff 30.03.2013). Oft

verlaufen EHEC-Infektionen asymptomatisch und unbemerkt, nicht selten jedoch

sind sog. YOPIs (young, old, pregnant, immunosuppressed), d.h. junge, alte,

schwangere sowie immunsupprimierte Menschen von intestinalen und

extraintestinalen Folgekomplikationen betroffen. Das Krankheitsbild entwickelt sich

nach einer Inkubationszeit von 3-4 Tagen, abhängig von der Infektionsdosis (KARCH

et al. 2005).

2.2.4.1 Hämorrhagische Colitis (HC)

Die HC ist eine Dickdarmentzündung mit zunächst wässriger, später wässrig-blutiger

Diarrhö, die bei 20% der infizierten Kinder und der infizierten über 65-Jährigen auftritt

und als Risikofaktor für weitere Komplikationen gilt. Sie ist neben der Diarrhö durch

32 Literatur

abdominale Krämpfe, Übelkeit, Erbrechen und Fieber gekennzeichnet (KARMALI

1989).

2.2.4.2 Hämolytisch-Urämisches Syndrom (HUS)

Das HUS ist eine extraintestinale Folgekomplikation der HC, die sich bei 5-10% der

manifest Erkrankten entwickelt. Die Inzidenz liegt in Deutschland und Österreich

zwischen 0,7 bis 1,0/100.000 Kinder unter 15 Jahren. In Argentinien liegt diese bei

über 20/100.000. Erfahrungsgemäß treten die meisten HUS-Fälle bei Kindern

zwischen dem ersten und fünften Lebensjahr auf, obwohl die Erkrankung generell

jede Altersgruppe betreffen kann (ZIMMERHACKL et al. 2002).

Das sich zunächst bessernde klinische Erscheinungsbild der anfänglichen Diarrhö

entwickelt sich bei einem kompletten HUS binnen einer Woche zu einem

Symptomtrias, welcher aus einer hämolytischen Anämie, akutem Nierenversagen

und einer Thrombozytopenie besteht (TARR et al. 2005). Die Letalität liegt bei 1-3%,

zwei Drittel der Erkrankten werden dialysepflichtig und bei bis zu 50% kommt es

noch nach 10 bis 15 Jahren zu Folgeerkrankungen wie z.B. chronischer

Niereninsuffizienz, arterieller Hypertonie oder Proteinurie. Neben dem kompletten

HUS werden auch inkomplette Verläufe in Form von isolierter hämolytischer Anämie

mit Pankreatitis oder nicht selten zentralnervösen Störungen als Folge gesehen

(ZIMMERHACKL et al. 2002).

Hauptauslösender Faktor für das HUS sind die von STEC gebildeten Shigatoxine.

Über die Darmwandbarriere gelangen sie in den Blutstrom und mit diesem

schließlich zur Niere. Shigatoxine binden an Glykosphingolipid-Rezeptoren der

Zielzelle, in erster Linie an Globotriaosylzeramid (Gb3), welches in

Nierenendothelzellen besonders präsent ist und hemmen somit die

Proteinbiosynthese der Zelle. Die Endothelzellen werden geschädigt und der von-

Willebrand-Faktor (vWF) wird freigesetzt, was zur Aktivierung der

Gerinnungskaskade führt. Zusammen mit der Endothelschädigung und Freilegung

der Basalmembran werden Thrombozyten verbraucht und es kommt zu einer

generalisierten Thrombozytopenie. Durch das lokale Wirken der Toxine an den

Nierenepithelzellen werden diese ebenfalls zerstört, wodurch es zu tubulären

Nekrosen und somit zu einer eingeschränkten Nierenfunktion kommt.

Literatur 33

2.2.4.3 Thrombotisch-thrombozytopenische Purpura (TTP)

Die TTP, nach ihrem Erstbeschreiber auch Morbus Moschkowitz genannt, weist

klinisch sehr viele Gemeinsamkeiten mit dem HUS auf. In beiden Fällen handelt es

sich um eine mikrovaskuläre Störung aufgrund von Thrombozytenaggregationen,

welche jedoch mit großer Wahrscheinlichkeit auf unterschiedlichen pathologischen

Auslösern beruht. Bei der thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura aggregiert

freigesetzter von-Willebrand-Faktor. Der für die Proteolyse zuständige „vWF-

cleavage factor“ wird allerdings durch Antikörper gehemmt, so dass es zur lokalen

Thrombenbildung kommt (FURLAN et al. 1998). Die beschriebene Symptomtrias

besteht aus einer Thrombozytopenie und damit verbundenen Hautpetechien sowie

durch die mechanische Schädigung und Zerstörung der Erythrozyten aus einer

Anämie. Im Gegensatz zum HUS sind von der TTP häufiger Erwachsene betroffen,

deren Krankheitsbild von neurologischen Dysfunktionen (z.B. Ausfälle der Motorik,

Sensibilität, des Bewusstseins, der Sprache sowie der Sehkraft) dominiert wird.

Trotzdem treten immer wieder Formen der TTP auf, bei denen es zu

schwerwiegenden Nierenproblematiken kommt und gleichzeitig werden auch immer

wieder Formen des HUS mit extrarenalen Komplikationen beschrieben, weshalb eine

exakte Trennung der Syndrome oft schwer ist (GRIFFIN u. TAUXE 1991b).

2.2.5 Epidemiologie von STEC bei Tieren

Shigatoxin-produzierende Escherichia coli wurden bereits in vielen unserer Haus-

und Wildtiere, sowie in deren Produkten nachgewiesen. Untersuchungen zu

Übertragungswegen und den Ursachen menschlicher Infektionen mit STEC haben

gezeigt, dass eine Übertragung auf den Menschen durch Kontakt zu Tieren und

deren Umwelt möglich ist (HEUVELINK et al. 2002; O'BRIEN et al. 2001). Als

wichtigste Infektionsquelle werden große und kleine Wiederkäuer angesehen, welche

in großer Zahl asymptomatische Ausscheider sind (BLANCO et al. 2003b; ORDEN et

al. 2003). Die Zahl von STEC in Wiederkäuerexkrementen variiert unter Umständen

abhängig vom Alter der Tiere. In Infektionsversuchen mit O157 konnte gezeigt

werden, dass die Ausscheidungsrate bei Kälbern höher und länger andauernd war

als in erwachsenen Rindern und dass die Ausscheidungsrate nach dem Absetzen

34 Literatur

überwiegend anstieg (CRAY, JR. u. MOON 1995). Die Prävalenz von STEC in

Rindern ist ebenso abhängig von der Jahreszeit. Höhere Ausscheidungsraten

wurden in den warmen Sommermonaten verzeichnet, ebenso wie höhere

Erkrankungsraten beim Menschen (CHAPMAN et al. 1997). Prävalenzstudien über

das Vorkommen von STEC in europäischen Rinderbständen sprechen von bis zu

83% positiv getesteter Herden. Die dabei am häufigsten isolierten Serovare waren

O8, O20, O22, O77, O113, O126 und O162 (CAPRIOLI et al. 2005). BEUTIN et al.

veröffentlichten 1993 eine Studie über die Prävalenz von STEC rund um Berlin in

sieben verschiedenen, gesunden Haustierarten. Von 720 Tieren waren 208 (28,9%)

STEC positiv, das entsprach 66% der untersuchten Schafe, 56,1% der Ziegen,

21,1% der Rinder, 7,5% der Schweine sowie 13,8% der Katzen, 4,8% der Hunde und

<0,7% der Hühner (BEUTIN et al. 1993). In einer Veröffentlichung aus dem Jahre

2000 sprechen ZSCHOCK et al. (2000) von einer STEC-Prävalenz in Hessen von

18,0% bei Rindern, 32,1% bei Schafen und 75,3% bei Ziegen (ZSCHOCK et al.

2000). Eine Prävalenzstudie von OPORTO et al. (2008) in Nordspanien an 345

Viehherden (17 Schweineherden, 122 Milchschafherden, 124 Mastrinderherden und

82 Milchkuhherden) ergab eine Prävalenz des Serotyps O157:H7 von 8,7% der

Schafherden, 7,0% der Milchkuhherden sowie 1,6% der Mastrinderherden. Das

Vorkommen von non-O157 STEC-Stämmen war vergleichbar mit den Ergebnissen

von ZSCHOCK et al. (in Schafherden 50,8%, in Milchkuhherden 20,7%, in

Mastrinderherden 46,0%). Bei den Schweinen konnten weder O157:H7 positive noch

non-O157 positive Herden identifiziert werden. Um die Präsenz von Shigatoxin-

produzierenden E. coli in Legehennen zu evaluieren, untersuchten DIPINETO et al.

(2006) vier intensiv geführte Legehennenbetriebe in Süditalien. Zwischen November

2004 und November 2005 wurden die Betriebe dreimal beprobt und 720 Proben mit

Hilfe der immunomagnetischen Separation und einer Multiplex-PCR auf STEC

untersucht. Von den 720 untersuchten Proben waren lediglich 26 (3,6%) positiv,

welche aus 50% der Betriebe (2 von 4) stammten. Dennoch sehen DIPINETO et al.

in Hühnern eine neue potentielle Quelle für EHEC-Übertragungen auf den

Menschen. In einem Infektionsversuch konnten SCHOENI und DOYLE (1994) die

Langzeitkolonisation und Langzeitausscheidung von O157:H7 in Hühnern zeigen,

Literatur 35

sowie die Kontamination der Eierschalen mit O157:H7 belegen. Dementsprechend

gehen auch diese Autoren davon aus, dass Hühner möglicherweise neue Überträger

dieses Humanpathogens sein könnten. HOGG und Kollegen (2009) beschrieben in

einem Fallbericht STEC-Übertragungen von Hunden auf Menschen, nachdem diese

mit den Hunden intensiven Kontakt hatten. Aus ihren Stühlen konnten nicht-

sorbitolfermentierende STEC der Seroguppe O157 isoliert werden, ebenso wie aus

Kotproben der zwei Hofhunde. Dieser Report zeigte, dass auch Haustiere, die nicht

zu den klassischen Reservoirtieren gehören, sondern nur als Kurzzeitvektoren

angesehen werden, durchaus STEC auf den Menschen übertragen können. Im

Gegensatz dazu publizierten PIERARD et al. (1999) eine negative Korrelation

zwischen Kontakt zu Hunden und STEC-Infektionen. Die Autoren diskutierten eine

mögliche Immunität, die durch die Langzeitexposition mit geringen Dosen

niedrigpathogener STEC (z.B. Intimin negative Stämme) ausgehend von den

Hunden erlangt werden könnte. Als neues Reservoirtier für STEC beschrieben

GARCIA und FOX (2003) Hauskaninchen, erworben von einem kommerziellen

Händler, sowie SCAIFE et al. (2006) Wildkaninchen. Ausschlaggebend für die

Untersuchungen von SCAIFE et al. waren Besucher eines Wildtierparks, die sich im

Sommer 2001 mit EHEC O157 infizierten. Die Wildkaninchen im Park teilten sich das

Gehege mit O157 positiven Rindern und so untersuchte SCAIFE et. al. 16

Rinderherden, die eng zusammen mit Wildkaninchenpopulationen lebten. In sieben

der 16 Farmen waren die Rinder O157 positiv und in sechs dieser sieben konnten

auch die Wildkaninchen als positiv identifiziert werden. Da Kaninchen oft als

Streicheltiere in Zoos gehalten werden, oder aber Wildkaninchen in Tierparks oft

Zugang zu Picknickwiesen haben, könnten auch Kaninchen potentielle STEC-

Überträger sein.

2.2.6 EHEC/STEC in Streichelzoos

Immer wieder wird von EHEC-Ausbrüchen durch Tierkontakt, insbesondere durch

große und kleine Wiederkäuer, in Streichelzoos und durch Tierkontaktzonen auf

Bauernhöfen berichtet. Trotzdem gibt es bisher nur wenige flächendeckende

epidemiologische Studien über die potentielle Gefahr der Streichelzoos als

Übertragungsweg. HEUVELINK et al. (2002) beschrieben 2002 den Zusammenhang

36 Literatur

eines 17-Monate alten, an HUS erkrankten Jungen mit einem vorangegangenen

Besuch eines Streichelzoos. STEC O157-Stämme konnten aus drei Ziegen und drei

Schafen dieses Zoos isoliert werden. Durch Pulsfeld-Gelelektrophorese konnte

gezeigt werden, dass sich die Isolate weder untereinander noch von dem

Humanisolat des Jungen unterschieden. Daraufhin untersuchten HEUVELINK zwölf

weitere niederländische Streichelzoos und identifizierte drei davon als STEC-positiv.

Eine epidemiologische Studie führten ebenfalls HEUVELINK und Kollegen (2007)

durch, als sie zwischen 2002 und 2004 307 Streichelzoos in den Niederlanden auf

darmpathogene Erreger untersuchten. Als STEC-O157 positiv erwiesen sich rund

12% der untersuchten Institutionen. Allein in den Jahren 2004 und 2005 wurden in

North Carolina, Florida und Arizona drei EHEC-Ausbrüche beschrieben, die jeweils

mit dem Besuch von Streichelzoos und dem damit verbundenen Wiederkäuerkontakt

assoziiert waren. Infektionsquellen waren Ziegen, Schafe und Rinder. In North

Carolina erkrankten 108 Menschen, in Florida handelte es sich um 63 Erkrankte und

zwei Erkrankungen traten in Arizona auf (DAVIES 2005). Im Jahre 2009

veröffentlichte der Morbidity and Mortality Weekly (ALELIS 2009) einen Bericht über

einen STEC-O157 Ausbruch in einem Streichelzoo in Florida im Jahr 2007. Sieben

Kinder einer Tagesferienfreizeit zeigten intestinale Symptome, nachdem sie Kontakt

zu den Streicheltieren hatten. Bei nachfolgenden Untersuchungen konnten aus

Stuhlproben von vier der Patienten ebenso wie aus Ziegenkot und Bodenproben aus

dem Streichelzoo O157-STEC mit identischem Pulsfeld-Gelelektrophorese Profil

isoliert werden (ALELIS 2009). Auch WERBER et al. (2007) identifizierte in seiner

Fall-Kontrollstudie das Streicheln von Wiederkäuern als potentielle Gefahrenquelle.

Im Gegensatz dazu untersuchten KEEN et al. (2007) in den Sommern 2003 und

2004 Streichelzoos in durch die Association of Zoos and Aquariums (AZA)

akkreditierten Zoos in den USA und kamen zu einer nur sehr geringen STEC-O157

Prävalenz von 0,1% der Proben (1 aus 997). Dies erklärten sie unter anderem mit

dem standardisierten Management, den hohen Hygienestandards, routinemäßiger

Quarantäne der Tiere sowie dem geringeren Infektionsdruck durch das Fehlen

angrenzender Landwirtschaft der AZA-akkreditierten Zoos.

Literatur 37

Da die Tiere in der Regel symptomlose Reservoire der Erreger sind, ist es für

Tierparkbetreiber besonders schwer, infizierte Tiere zu identifizieren, weshalb

Besucher auf die bestehende Transmissionsgefahr hingewiesen werden und zur

Vermeidung von Risikoverhalten angehalten werden sollten. Inwiefern Besucher

solches Risikoverhalten ausüben, haben MCMILLIAN et al. (2007) und WEESE et al.

(2007) in ihren Beobachtungsstudien untersucht. Sie fanden heraus, dass nur ca.

38% der Besucher die vorhandenen Händedesinfektionsmittel bzw.

Handwaschbecken benutzen, und dass dies abhängig von der Lokalität dieser war.

Erfreulicherweise verhielten sich Kinder vorbildlicher als Erwachsene. Trotzdem

stellten MCMILLIAN et al. (2007) fest, dass 49% der Besucher unmittelbar nach dem

Streicheln der Tiere mit den Händen auch ihr Gesicht berührten sowie 22% in den

Gehegen aßen oder tranken. Einige Eltern gaben ihren Kindern im Gehege sogar

Babyfläschchen (in 50% der Zoos), Schnuller (in 71% der Zoos) oder Trinklerntassen

(in 56% der Zoos). Aufgrund des fehlenden Bewusstseins der Bevölkerung im

Hinblick auf die Zoonosegefahr ist eine Sensibilisierung sowohl der Besucher als

auch der Parkbetreiber indiziert und nötig.

2.3 Haltung von Tieren in Streichelzoos

2.3.1 Zoologische Gärten, Tierparks, Tiergärten

Die Bezeichnungen Zoo (Kurzform für Zoologischer Garten), Tierpark oder

Tiergarten werden heutzutage größtenteils synonym verwendet, eine klare

Abgrenzung bzw. Definition der einzelnen Begriffe gestaltet sich schwierig. Verstand

man früher unter dem Begriff Tiergarten eine Art Oberbegriff für Schautierhaltungen,

benutzt das Gesetz seit Einführung der EU-Zoorichtlinien 1999 den Begriff Zoo als

Sammelbegriff für Schautierhaltungen, die länger als sieben Tage im Jahr in einer

festen Einrichtung bestehen und eine adäquate Anzahl lebender Wildtiere aufweisen

(EU-Richtlinie [1999/22/EG] über die Haltung von Wildtieren in Zoos, Art. 2).

Dementsprechend können heutzutage laut EU-Zoorichtlinie auch kleinere Betriebe

ohne beachtlich großen Wildtierbestand, den man früher unmittelbar mit jenem

Begriff verband, den Namen Zoo führen (Deutsche Tierparkgesellschaft,

www.deutsche-tierparkgesellschaft.de, letzter Zugriff 15.05.2011). Aufgrund des

38 Literatur

geschichtlichen Hintergrunds versteht man unter einem Zoo jedoch primär einen

wissenschaftlich geführten Park, wobei sich solche Einrichtungen heutzutage ebenso

auch als Tierpark oder Tiergarten benennen (Deutsche Tierparkgesellschaft,

www.deutsche-tierparkgesellschaft.de letzter Zugriff 15.05.2011, Wikipedia,

http://de.wikipedia.org/wiki/Zoo, letzter Zugriff 15.05.2011).

Im Verband deutscher Zoodirektoren (VDZ), der Deutschen Tierpark-Gesellschaft

(DTG) sowie im Deutschen Wildgehege-Verband (DWV) sind deutschlandweit rund

200 Zoos, Tier- und Wildparks organisiert. Hinzu kommen schätzungsweise über 500

kleine, öffentliche Tierhaltungen, von denen ca. 400 Zoos im Sinne der EU-

Zoorichtlinien darstellen. Die jährlichen Besucherzahlen können aufgrund der

zahlreichen nicht in Verbänden organisierten Einrichtungen nur grob geschätzt

werden. Der Verband deutscher Zoodirektoren schätzt die bundesweite

Besucheranzahl auf ca. 60 Millionen pro Jahr, womit Tierparks zu den beliebtesten

Freizeiteinrichtungen mit Bildungsauftrag gehören (VDZ, Verband deutscher

Zoodirektoren, www.zoodirektoren.de, letzter Zugriff 15.05.2011).

Ein Zoo hat sich durchaus als Bildungsstätte zu verstehen, dessen Aufgabe die

Aufklärung der Besucher über die verschiedensten Tierarten und ihre Vielfalt sowie

ökologische und biologische Zusammenhänge sein sollte. Ein weiteres Aufgabenfeld

ist das Betreiben und Vermitteln von Arten- und Naturschutz und dem damit

verbundenen Erhalten bedrohter Tierarten im Rahmen koordinierter

Nachzuchtprogramme. Forschung wird in zoologischen Einrichtungen im Rahmen

der Möglichkeiten v.a. in den Bereichen Tiergartenbiologie vorgenommen, wobei hier

mit Universitäten, Hochschulen und anderen Tierparks kooperiert wird. Nicht zuletzt

sollen Zoos jedoch immer noch Erholungsstätten und Orte der Freizeitgestaltung

sein, an denen Menschen, die sonst keine Möglichkeit zu Tierkontakten haben,

dieser ermöglicht wird (VDZ, Verband deutscher Zoodirektoren,

www.zoodirektoren.de, letzter Zugriff 15.05.2011).

2.3.2 Wildparks, Wildgehege

Die Begriffe Wildpark oder Wildgehege lassen sich im Vergleich zu den

vorhergenannten Begrifflichkeiten recht gut definieren und von Zoos, Tierparks oder

Tiergärten abgrenzen. Während Letztgenannte meist ein weites, durchaus auch

Literatur 39

exotisches Artenspektrum aufweisen, werden in Wildparks und Wildgehegen meist

oder sogar ausschließlich heimische Wildtiere und/oder Haustierrassen gehalten.

Allerdings sind viele dieser Parks trotzdem Zoos im Sinne der EU-Zoorichtlinien

(Deutsche Tierparkgesellschaft, www.deutsche-tierparkgesellschaft.de, letzter Zugriff

15.05.2011). Im Deutsche Wildgehege Verband (DWV) sind zurzeit etwa 150

Einrichtungen organisiert, die eine Gesamtfläche von ca. 25.000 ha und rund 8,8

Millionen Besucher jährlich aufweisen (Deutscher Wildgehege Verband,

www.wildgehege-verband.de, letzter Zugriff 15.05.2011).

2.3.3 Freizeitparks mit Tieranteil

Die meisten Freizeitparks sind definiert als dauerhaft angelegte Vergnügungsparks,

in denen Fahrgeschäfte, Shows, Ausstellungen etc. angeboten werden (Wikipedia,

http://de.wikipedia.org/wiki/Freizeitpark, letzter Zugriff 15.05.2011). Ein weites

Tierartenspektrum weisen solche Parks in der Regel nicht auf, da es sich aus

juristischer Sicht bei Freizeitparks lediglich um Spielplätze, welche auch für die

Erwachsenenwelt angedacht sind, handelt (Wikipedia,

http://de.wikipedia.org/wiki/Freizeitpark, letzter Zugriff 15.05.2011). Nicht wenige

Freizeitparks bieten jedoch zur Steigerung der Parkattraktivität neben

Fahrgeschäften, Shows o.ä. auch Streichelgehege, die eine geringe Auswahl an

Tieren, wie z.B. Ziegen, Schafe oder andere Haustiere beherbergen. Konkrete

Zahlen über die Tierhaltung in Freizeitparks sind nicht bekannt.

2.3.4 Streichelzoos, Streichelgehege

Als sog. Streichelzoos oder Streichelgehege versteht man Tierhaltungen, in denen

Tiere von Besuchern gestreichelt und oftmals auch gefüttert werden können. Sie sind

zumeist Teil größerer Einrichtungen wie Zoos, Wildgehege oder Freizeitparks. Die

ersten Streichelgehege gab es bereits in den 30er Jahren des 20. Jahrhunderts. Der

Begriff Streichelzoo wurde jedoch erst durch den Veterinär Wolfgang Salzert geprägt

(Wikipedia, http://de.wikipedia.org/wiki/Streichelzoo, letzter Zugriff 15.05.2011).

Streichelzoos sind besonders bei Kindern sehr beliebt, v.a. weil nur wenige Kinder

heutzutage noch die Möglichkeit haben, mit Nutztierrassen in so engen Kontakt zu

treten. Kinder, denen eine eigene Tierhaltung verwehrt bleibt, lernen so die

40 Literatur

Bedürfnisse anderer Lebewesen kennen und respektieren. Für viele Stadtkinder ist

ein Streichelgehege die einzige Möglichkeit, Tiere hautnah zu erleben.

Als Bewohner solcher Gehege werden meist Tierarten gewählt, die ruhig und robust

im Umgang mit Besuchern sind, die Kontakt mit Menschen nicht scheuen und von

denen keine ausgesprochene Verletzungsgefahr für die Besucher ausgeht

(Wikipedia, http://de.wikipedia.org/wiki/Streichelzoo, letzter Zugriff 15.05.2011). Dazu

gehören vor allem kleine Wiederkäuer wie Ziegen und Schafe der

unterschiedlichsten Rassen, Kaninchen und Meerschweinchen, aber auch Ponies,

Esel und Rinder erfreuen sich immer größerer Beliebtheit.

In modernen, tiergerechten Streichelgehegen verfügen die Tiere über ein

Rückzugsgebiet, zu dem der Besucher keinen Zutritt hat. Auch das Füttern der Tiere

durch den Besucher geschieht in fast allen Streichelzoos mit streichelzooeigenem,

vom Betreiber zur Verfügung gestelltem Futter.

Material und Methoden 41

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien

A

Analysewaage, (80-400g) Sartorius (Hannover)

Analysewaage, BA 61 (0-60g) Sartorius (Hannover

B

Bio-Linker®BLX (cross linker) über LTF-Labortechnik (Wasserburg)

Blotpapier, Whatman (3mm) Schleicher&Schuell (Dassel)

Bunsenbrenner FIREBOY plus Integra Bioscience (Gießen)

E

Eismaschine, SPR 75 Nordcap New Brunswick Scientific (Edison,

USA)

Elektrophoresekammer (DNA) OWL (Porthmouth, USA)

F

Filterspitzen TipOne® (steril 0,1-1000µl) Starlab (Ahrensburg)

G

Gefrierschrank (-80°C), Sorvall® Heraeus, Kendro (Hanau)

Geldokumentationsgerät, IMAGO B&L Systems (Marsen, Niederlande)

H

Hybridisierungsofen/-flasche Biometra (Göttingen)

K

Kühlbox Cool Fun AS-15 Waeco (Emsdetten)

Kühlschrank (4,0°C) Liebherr

Kühlzentrifuge, Sorvall® RC6 Du Pont (Bad Homburg) mit Rotor SA600

M

Magnethalterung IBA (Göttingen)

Magnetrührer, LR 12, Mettler Landgraf (Hannover)

Mikrowelle Panasonic (Hannover)


Mikrotiterplatte (96-well) Sarstedt (Nümbrecht)

N

Nitrocellulosemembran, Protran BA85 Schleicher & Schuell (Dassel)

P

Pipetteboy TECNOMARA (Fernwald)

Pipetten Eppendorf (Tespe)

Pipetten Gilson (Frankreich)

R

Reagenzglas-Rotator GFL (Burgwedel)

Reaktionsgefäße 1,5ml, 2,0ml Sarstedt (Nümbrecht)

Reaktionsgefäße 0,2ml mit Deckel Bioplastics (Niederlande) (Thin-wall 8-tube strip)

S

Schüttelinkubator, Innova 4000 New Brunswick Scientific

Slot-Blot-Apparatur Hybri.Slot 24 Biometra (Göttingen)

Spannungsgerät, PowerPac 300 Biorad (München)

Sterilbank, NUAIRE® Biologial Zapf Instrumente (Sarstedt) Safety Cabinets

Sterilfilter (0,45µm) Millipore (Eschborn)

T

Thermocycler, Mastercycler Eppendorf (Tespe)

Tischzentrifuge, Centrifuge 5415 C Eppendorf (Tespe)

V

Vortex Heidolph (Hannover)

W

Wasserbad (Schüttel-) GFL (Burgwedel)

Z

Zentrifugenröhrchen (PP 15ml) Greiner Bio-One (Frickenhausen)

3.1.2 Chemikalien und Reagenzien

A

Agar Agar Oxoid (Hampshire, England)


Agarose Biozym Scientific (Hess. Oldendorf)

Albumin-Fraktion V (BSA) Roth (Karlsruhe)

A. bidest (DNase/RNase u. Endotoxin-frei) Sigma (Deisenhofen)

Anti-Digoxigenin-POD (poly), Fab Fragments Roche (Mannheim)

B

Bacto®-Trypton Becton Dickson (Heidelberg)

Borsäure Roth (Karlsruhe)

Bromphenolblau Merck (Darmstadt)

C

Cefixime-Tellurite selective supplement Oxoid (Hampshire, England)

Chloroform Roth (Karlsruhe)

Citronensäure-Monohydrat Merck (Darmstadt)

CTAB Sigma (Deisenhofen) (Hexadexyltrimethylammoniumbromid, 99%)

D

Digoxigenin-11-dUTP Roche (Mannheim)

DNA-Marker 100 bp Roth (Karlsruhe)

Dynabeads Invitrogen (Karlsruhe)

E

EDTA Sigma (Deisenhofen)

Ethanol abs. Roth (Karlsruhe)

Ethidiumbromid Sigma (Deisenhofen)

F

Ficoll® 400 Sigma (Deisenhofen)

G

Glycerin Roth (Karlsruhe)

H

Hefeextrakt Oxoid (Hampshire, England)

I

Isoamylalkohol Merck (Darmstadt)

Isopropanol Roth (Karlsruhe)


K

Kaliumchlorid Roth (Karlsruhe)

L

Lysozym Roth (Karlsruhe)

M

Magermilchpulver Sucofin (EDAKA, Hannover)

N

Natriumchlorid Roth (Karlsruhe)

Natriumacetat Merck (Darmstadt)

Natriumhydroxid Plätzchen Merck (Darmstadt)

Nucleotidtriphosphate (dNTPs) Roth (Karlsruhe)

P

Phenol Roth (Karlsruhe)

Polyvinylpyrrolidon Roth (Karlsruhe)

Proteinase K Merck (Darmstadt)

R

RNase A Sigma (Deisenhofen)

S

Salzsäure Sigma (Deisenhofen)

SDS (Sodiumdodecylsulfat) Roth (Karlsruhe)

T

TMB ready-to-use substrate Serva (Heidelberg)

Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Merck (Darmstadt)

Tris (hydroxylmethyl)-aminomethan Roth (Karlsruhe)

Tween®20 Roth (Karlsruhe)

3.1.3 Nährmedien

Columbia-Schafsblut-Agar Oxoid (Hampshire, England)

Gassner-Selektivagar Oxoid (Hampshire, England)

SMAC-Agar Oxoid (Hampshire, England)

CT-SMAC-Agar Oxoid (Hampshire, England)


LB-Agar-Platten 1% (w/v) Bacto®-Trypton

0,5% (w/v) Hefeextrakt

1% (w/v) NaCl

1,5% Agar Agar

LB-Medium 1% (w/v) Bacto®-Trypton

0,5% (w/v) Hefeextrakt

1% (w/v) NaCl

GN-Bouillon Merck (Darmstadt)

3.1.4 Puffer und Lösungen

Blockpuffer 5% Magermilchpulver (w/v)

9,9 mM Tris

150 mM NaCl

0,005% Tween 20 (v/v)

pH 8,0

CTAB 4,1g NaCl

10g CTAB

A. dest ad 100ml

100x Denhardt’s Lösung 2% (w/v) Ficoll

2% (w/v) Polyvinylpyrrolidon

2% (w/v) BSA Fraktion V

Die Lösung wurde steril filtriert (Filter 0,45µm) und bei -20°C gelagert.

Denaturierungspuffer 0,5 N NaOH

1,5 M NaCl,

autoklaviert

Hybridisierungspuffer SSC 6x

Denhardt’s Lösung 5 x

SDS 0,5% (w/v)

EDTA pH 7,5 2mM


IMS-Waschpuffer 0,138 M NaCl

0,0027 M KCl

0,05% Tween 20

pH 7,4, autoklaviert

6 x Ladepuffer für DNA 0,25% (w/v) Bromphenolblau

0,25% (w/v) Xylencyanol

30% (v/v) Glyzerin

Neutralisierungspuffer 1,5M NaCl

0,5 M Tris/HCl (pH 7,4)

autoklaviert

20x SSC 3 M NaCl

0,3 M Natriumcitrat

autoklaviert

10 x TBE 0,9 M Tris-HCl (pH 7,5)

0,9 M Borsäure

20 mM Na-EDTA (pH 8,0)

pH 7,5, autoklaviert

10 x TBST 0,1 M Tris

1,5 M NaCl

0,05% (v/v) Tween 20

pH 8, autoklaviert

TEN-Puffer 100µl Lysozym (100mg/ml)

50 µl Tris 1 M (pH 8,0)

2 µl EDTA 0,5 M (pH 8,0)

25 µl NaCl 4M

823 µl A. dest.

TMB-Puffer 0,82% (w/v) Natriumacetat

0,315% (w/v) Citronensäure-

Monohydrat pH 5,0


Waschlösungen für Colony Blots

Waschlösung 1 SSC 2 x

SDS 0,1% (w/v)

autoklaviert

Waschlösung 2 SSC 1 x

SDS 0,1% (w/v)

autoklaviert

Waschlösung 3 SSC 0,2 x

SDS 0,1% (w/v)

autoklaviert

3.1.5 Herkunft des Untersuchungsmaterials und Probennahme

Für die epidemiologische Studie wurden insgesamt 126 zoologische Gärten,

Wildparks und Freizeitparks mit Tieranteil ausgewählt. Die Einrichtungen wurden mit

Hilfe des Internets ausfindig gemacht und schriftlich um eine Teilnahme gebeten.

Eine besondere Hilfestellung gab die Internetseite www.zoo-infos.de der

Zoodatenbank Bielefeld, erstellt von der Zoo-AG-Bielefeld der Universität Bielefeld.

Eine Zusage erteilten 56 Einrichtungen, 13 Einrichtungen erteilten eine Absage und

57 Einrichtungen gaben keine Rückmeldung. Die 56 teilnehmenden Betriebe wurden

anhand ihrer Betriebsstruktur in zoologische Parks (Zoo), Wildtierparks und

Freitzeiteinrichtungen mit Tieranteil geschichtet. Da rund 40% der angeschriebenen

Parks ihre Teilnahme an der Studie zusagten, wurde die zweite Schichtung der

Stichprobengröße „Parks“ so vorgenommen, dass Deutschland zunächst anhand der

Parkdichte in drei geographische Teile (Region 1, Region 2 und Region 3) unterteilt

wurde (Abbildung 1). Aufgrund der relativ hohen Parkdichte in Nordrhein-Westfalen

und der gleichzeit relativ geringen Parkdichte in Baden-Württemberg wurden diese

beiden in geographisch unterschiedlichen Bereichen Deutschlands liegende

Regionen in dieser Studie zu einer Region zusammengefasst.


Abb. 1: Schichtung Deutschlands in drei Regionen

In jeder Region sollte von jeder Parkart ein Anteil von 40% beprobt werden. Jeder

Park wurde im Abstand von 14 Tagen zweimal beprobt. Im Beprobungszeitraum von

Mai bis Ende August 2008 wurden 24 Parks beprobt, von April bis Mitte Oktober

2009 wurden 32 Parks beprobt. Die Kotproben aus den Streichelgehegen selbst

stammten von Tierarten, die von den Besuchern gefüttert und/oder angefasst werden

konnten. Dies +waren zum größten Teil Ziegen und Schafe aber auch Schweine,

Kaninchen, Meerschweinchen, Pferde und Ponies, Esel, Rinder, Lamas, Damwild,

Geflügel und Kängurus. Des Weiteren wurde in jedem Park, soweit möglich, ein

Fliegenfänger aufgehängt und davon jeweils zehn Fliegen zur mikrobiologischen

Untersuchung herangezogen. Die Ermittlung des Stichprobenumfangs pro

Streichelzoo erfolgte vor dem Hintergrund einer Auswahl ohne Zurücklegen bei

endlichen Gesamtheiten mit Hilfe des Models der Hypergeometrischen Verteilung.

Bei vorgegebener Größe des Streichelzoos wurde dazu die Prävalenz von 20% mit

einer relativen Genauigkeit von 10%, d.h. absolut zwei Prozentpunkte, vorgegeben

und somit für jeden Streichelzoo individuell ein erforderlicher Stichprobenumfang bei

einer Sicherheitswahrscheinlichkeit von mindestens 95% festgelegt. Die Realisierung

erfolgte unter Verwendung des Statistikprogrammpakets R (www.r-project.org/).

Insgesamt wurden somit im Jahr 2008 566 Kotproben und 17 Fliegenproben


untersucht. Im Jahre 2009 waren dies 951 Kotproben und 24 Fliegenproben. Die

Kotproben wurden als Sammelkotproben vom Gehegeboden in sterilen

Plastikröhrchen gesammelt. Bevorzugt wurde frisch abgesetzter Kot gesammelt,

wobei die Zuordnung zu einem bestimmten Individuum nicht gegeben war. Die

Proben wurden bis zur Aufarbeitung und Untersuchung im Institut für Mikrobiologie

der Stiftung Tierärztliche Hochschule bei 4 °C transportiert und gelagert. Zusätzlich

wurden von den Parks Fragebögen zu den Themen Gehege- und

Gesundheitsmanagement der Tiere sowie Hygiene und Besucherverpflegung

beantwortet. Die Auswertung der Fragebögen in Zusammenhang mit dem

Erregervorkommen erfolgte mit Hilfe des Fisher’s exact test in dem

Statistikprogramm SAS 9.3. Bei dem Fisher’s exact test handelt es sich um einen

Signifikanztest auf Unabhängigkeit in der Kontingenztafel welcher auch bei kleinen

Stichprobenzahlen verlässliche Ergebnisse liefert.

3.2 Methoden

Direkt nach Ankunft wurden die einzelnen Kotproben jeweils mit 3 ml steriler

physiologischer Kochsalzlösung versetzt und homogenisiert. Falls eine

Weiterverarbeitung am selben Tag nicht möglich war, wurden die Proben bei 4 °C bis

zum darauf folgenden Tag gelagert.

Von den Fliegenfängern wurden 10 Fliegen je Fänger entnommen und in 2 ml

physiologische Kochsalzlösung verbracht. Auch diese wurden, falls eine

Weiterverarbeitung am selben Tag nicht möglich war, bei 4 °C gelagert. Die Fliegen

wurden vor der Weiterverarbeitung zusammen mit 4-6 Glaskugeln homogenisiert.

Dieses Homogenat wurde bei Raumtemperatur abzentrifugiert und der Überstand

verworfen.

3.2.1 STEC-Isolierung

3.2.1.1 Bearbeitung der 583 Proben von 2008

Die Isolierung mittels immunomagnetischer Separation (IMS) erfolgte sowohl 2008

als auch 2009 nach KARCH et al. (1996b). Von der zu untersuchenden Kotprobe/

Fliegenprobe wurden ca. 1 g Kot bzw. 1 ml Fliegensuspension in 10 ml GN-Bouillon


überführt. Die Proben wurden bei 37 °C und 150 Umdrehungen pro Minute (rpm) für

4 h schüttelnd inkubiert. Anschließend wurden 100 µl der GN-Bouillon direkt auf einer

SMAC-Platte fraktioniert ausgestrichen. Weiterhin wurden die STEC mittels

immunomagnetischer Separation isoliert. Dazu wurden die 566 Kotproben und 17

Fliegenproben wie folgt bearbeitet: Es wurden 20 µl der Anti-O157-Dynabeads in

einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und 1000 µl der inkubierten GN-Bouillon

hinzu pipettiert. Die Reaktionsgefäße wurden bei Raumtemperatur für 10 min im

Reagenzglas-Rotator schwenkend inkubiert. Anschließend wurden sie in eine

Magnethalterung gestellt und 3 min ohne Rotation inkubiert. Die Dynabeads hafteten

sich nun zusammen mit den an ihnen gebundenen Bakterien an die

Reaktionsgefäßwand an. Der Überstand wurde abgenommen und 1000 µl IMS-

Waschpuffer dazugegeben. Nach der Entfernung des Magneten erfolgte eine

dreiminütige Inkubation, worauf sich erneut eine Inkubation mit Magneten anschloss.

Der Waschvorgang wurde insgesamt dreimal wiederholt und die an den Dynabeads

gebundenen Bakterien schließlich in 50 µl IMS-Waschpuffer aufgenommen, von

denen 25 µl auf einer SMAC-Platte und 25 µl auf einer CT-SMAC-Platte fraktioniert

ausgestrichen wurden. Die Platten wurden bei 37 °C für 18-24 h bebrütet. Nach der

Bebrütungszeit wurden STEC-verdächtige Kolonien, d.h. Bakterien die auf SMAC

und CT-SMAC-Platten sorbitolnegativ wuchsen (auf SMAC gräulich-farbloses

Wachstum, auf CT-SMAC gräuliches Wachstum mit dunkelgrauem bis schwarzem

Zentrum) auf Columbia-Schafsblut-Agar, Gassner-Selektivagar und CT-SMAC-Agar

subkultiviert und bei 37 °C für 18-24 h bebrütet. Je nach Anzahl STEC-verdächtiger

Kolonien wurden bis zu 20 Einzelkolonien subkultiviert. Zeigten die Subkulturen

sowohl auf der CT-SMAC als auch auf Gassner-Selektivagar STEC typisches

Wachstum und wuchsen sie auch auf Columbia-Schafsblut-Agar in E.coli-typischen

Kolonien, wurden die Subkulturen in einem Gemisch aus gleichen Teilen LB-Medium

und 50%igem Glycerin bei -70 °C in Mikrotiterplatten eingefroren. Die Isolate wurden,

bevor sie in Form von Tupfern zur Serotypisierung an das Robert Koch-Institut nach

Wernigerode geschickt wurden, mittels einer Multiplex-PCR auf die Virulenzgene

stx1, stx2, eae und hlyA getestet (siehe 3.2.7).


3.2.1.2 Bearbeitung der 975 Proben von 2009

Zunächst wurden auch hier 1 g Kot bzw. 1 ml Fliegensuspension in 10 ml GN-

Bouillon überführt und bei 37 °C und 150 rpm für 4 h schüttelnd inkubiert. Die

immunomagnetische Separation erfolgte jedoch zusätzlich zu O157 Dynabeads mit

O103, O145, O111 und O26 erweiterten Dynabeads. In 1,5 ml Reaktionsgefäßen

wurden jeweils 5 µl O103, O145, O111, O26 und O157 Dynabeads vorgelegt und

250 µl GN-Bouillon dazu pipettiert. Ab hier wurde die Separation wie oben

beschrieben durchgeführt. Allerdings wurden nach der Bebrütungszeit keine

Einzelkolonien subkultiviert. Die Platten wurden komplett mit insgesamt 1 ml LB-

Bouillon abgeschwemmt und im Verhältnis 1:1 mit 50%igem Glycerin bis zur

Weiterverarbeitung eingefroren.

3.2.2 Herstellen der PCR-Sonde

Zur Detektion der im Genom evtl. vorhandenen Virulenzgene wurde zunächst eine

Gensonde erstellt. Die Herstellung der DIG-11-UTP markierten Sonde erfolgte mittels

einer Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion, wobei die Reagenzien laut

Herstellerangaben (Roche diagnostics mbH Deutschland) eingesetzt bzw. auf einen

50 µl PCR-Ansatz umgerechnet wurden. Als Template dienten 50 ng chromosomale

DNA des Referenzstammes EDL933.

Tab. 1: Verwendete Primer (FRANCK et al. 1998b):

Virulenzfaktor Primersequenz 5’-3’ Produktgröße

(bp)

GenBank

Nummer

Stx1 (forward) TTCGCTCTGCAATAGGTA 555 Z36899

Stx1 (reverse) TTCCCCAGTTCAATGTAAGAT

Stx2 (forward) GTGCCTGTTACTGGGTTTTTCTTC 118 L11078

Stx2 (reverse) AGGGGTCGATATCTCTGTCC

Intimin (forward) ATATCCGTTTTAATGGCTATCT 425 Z11541

Intimin (reverse) AATCTTCTGCGTACTGTGTTCA S90827


Die Primer für die DIG-Sonde wurden von der Firma Biomers.net (Ulm) synthetisiert

und als Lyophilisate geliefert. Die Primer wurden in Wasser gelöst (jeweils 100 µM)

und bei -20 °C gelagert.


Der Primer-Mix wurde wie folgt zusammengesetzt:

Primer-Mix DIG1 Primer-Mix DIG2

dH2O 70 µl dH2O 70 µl

stx1-1 10 µl stx1-2 10 µl

stx2-1 10 µl stx2-2 10 µl

eae-1 10 µl eae-2 10 µl

Der DIG-dNTP-Ansatz wurde folgendermaßen hergestellt:

dATP (25 µmol/100 mM) 5 µl

dCTP (25 µmol/100 mM) 5 µl

dGTP (25 µmol/100 mM) 5 µl

dTTP (25 µmol/100 mM) 4,75 µl

DIG-11-UTP (1 mM) 25,0 µl

Der Mastermix wurde in 0,2 ml Reaktiongefäßen nach folgendem Pipettierprotokoll in

angegebener Reihenfolge hergestellt:

Reagenz Menge/Einzelansatz

dH2O 27,0 µl

10xPCR-Puffer (-MgCl2) 5,0 µl

MgCl2 (1,5 mM) 1,5 µl

DIG-dNTP-Mix (1 mM) 5,0 µl

Primer-Mix 1 (10 µM) 5,0 µl

Primer-Mix 2 (10 µM) 5,0 µl

Taq-Polymerase (5 U/µl) 0,5 µl

Template-DNA (50 ng) 1,0 µl

Gesamtmenge/Einzelansatz 50,0 µl


Die Ziel-DNA wurde in einem Thermocycler der Firma Eppendorf nach folgendem

Programm amplifiziert:

initiale Denaturierung 94 °C 5:00 min

Denaturierung 94 °C 1:00 min

Anlagerung 57 °C 1:15 min 29 Zyklen

Extension 72 °C 1:45 min

finale Extension 72 °C 5:00 min

Nach Beendigung des Programms wurden die Ansätze im Thermocycler auf 7 °C

gehalten.

Zur Kontrolle der Sonde wurden vor dem Einsatz im Hybridisierungsschritt aus jedem

Ansatz jeweils 5 µl für 90 min bei 130 V in einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt

(siehe 3.2.8) und dokumentiert.

3.2.3 Präparation chromosomaler DNA

Um die Sensitivität der einzelnen Sonden testen zu können, wurde aus dem

Referenzstamm EDL933 nach folgendem Protokoll chromosomale DNA präpariert:

Der Referenzstamm EDL933 wurde 8-12 h bei 37 °C auf einer Blutplatte

angezüchtet. Material von einer Kolonie wurde in 6 ml LB-Medium überführt und 8-12

h schüttelnd bei 37 °C inkubiert. Von dieser Bakteriensuspension wurden 5 ml in ein

Zentrifugenröhrchen pipettiert und für 10 min bei 4 °C und 8000 rpm (Kühlzentrifuge,

Sorvall® RC6, Rotor SA600) zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das

Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Das Pellet wurde in 275 µl TEN-Puffer

resuspendiert. Nach Zugabe von 10 µl RNAse und 275 µl A.dest. inkubierte der

Ansatz für 30 min bei 37 °C im Wasserbad. Im Anschluss wurden 15 µl 20%iges

SDS sowie 10 µl Proteinase K (20 mg/ml) zugesetzt. Der Ansatz wurde gut gemischt

und erneut bei 37 °C für 1 h im Wasserbad inkubiert. In dieser Zeit wurde das CTAB

auf 50 °C erwärmt. Der Probe wurden nun 125 µl 4 M NaCl zugegeben, der Ansatz

gut gemischt und schließlich 80 µl CTAB hinzugefügt. Der Ansatz wurde für 10 min

im Wasserbad bei 65 °C erwärmt. Nach Ablauf der Inkubationszeit erfolgte eine

Extraktion mittels Zugabe von 780 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1). Die Probe

wurde vorsichtig gemischt. Die entstehende milchig-trübe Suspension wurde für 8


min bei 12000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden 2 flüssige Phasen

und eine feste Interphase sichtbar, von denen lediglich die oberste (wässrige) Phase

in ein neues Reaktionsgefäß überführt wurde; der Rest wurde verworfen. Es folgte

eine weitere Extraktion mit 780 µl Phenol/Chlorophorm/Isoamylalkohol (25:24:1) und

ein weiterer Zentrifugationsschritt (8 min, 12000 rpm). Die oberste Phase wurde in

ein neues Reaktionsgefäß pipettiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 500 µl

Isopropanol präzipitiert und durch nachfolgende Zentrifugation bei 12000 rpm für 30

min pelletiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 500 µl 80%igen Ethanols und

anschließende Zentrifugation gewaschen und das DNA-Pellet bei Raumtemperatur

über Nacht getrocknet. Zur Lagerung wurde das Pellet in TE-Puffer oder A. dest

resuspendiert und bei -20 °C eingefroren.

3.2.4 Testen der Sensitivität für die stx1-, stx2- und eae-Sonden

Da zur Sensitivität der in dieser Arbeit eingesetzten Sonden in einer DIG-markierten

Southern-Hybridisierung keinerlei Daten vorlagen, wurde dies zunächst experimentell

untersucht. Dazu wurden Verdünnungsreihen der chromosomalen DNA des

Referenzstammes EDL933 mit den Konzentrationen 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng,

25 ng und 12,5 ng sowie mit 100 ng, 50 ng, 25 ng, 12,5 ng, 6,25 ng und 3,125 ng

hergestellt. Eine Nitrocellulosemembran wurde auf die Größe der Slot-Blot-Apparatur

Hybri.Slot 24 zugeschnitten und in 20 x SSC für 5-10 min äquilibriert. In dieser Zeit

wurden die DNA-Verdünnungen in 10 µl A. dest. aufgenommen und jeweils mit 30 µl

Denaturierungspuffer versetzt. Diese Ansätze wurden für 15 min bei 100 °C

denaturiert, anschließend direkt auf Eis gestellt und jeweils 40 µl 20 x SSC hinzu

gegeben. An die Hybri.Slot-Apparatur wurde ein Vakuum angelegt, die

Nitrocellulosemembran eingespannt und die Slots mit je 80 µl 20 x SSC gespült.

Nachdem in den Vertiefungen keine Flüssigkeit mehr zu sehen war, wurde das

komplette Volumen der DNA-Verdünnungen in die Slots pipettiert und gewartet, bis

das Vakuum die gesamte DNA-Menge auf die Membran gezogen hatte. Die Slots

wurden erneut mit 80 µl 20 x SSC gespült und das Vakuum final für 5 min

aufrechterhalten. Die Membran wurde aus der Apparatur entfernt und auf Whatman

Filterpapier getrocknet. Die DNA wurde im Crosslinker mit UV-Licht auf der Membran

fixiert. Anschließend wurde die Membran wie unter 3.2.6 beschrieben


weiterverarbeitet. Die niedrigste DNA-Konzentration, bei der eine enzymatische

Farbreaktion sichtbar war, wurde dokumentiert.

3.2.4.1 Prinzip der enzymatischen Farbreaktion

Um virulenzgentragende Bakterien-DNA, welche auf einer Nitrocellulosemembran

fixiert ist, sichtbar machen zu können, bedient man sich der Bindung einer markierten

Sonde an die DNA; die Sonde wird anschließend durch Antikörper detektiert und

durch eine enzymatische Farbreaktion sichtbar gemacht. Die DNA-Sonde wurde wie

bereits in 3.2.2 beschrieben hergestellt, wobei die beiden konkurrierenden Nukleotide

dTTP und DIG-11-dUTP im Verhälnis 65% zu 35% vorlagen und in die Sonde

eingebaut wurden. Die Sonde wurde in der Southern-Hybridisierung an die Ziel-DNA

gebunden. Der im Anschluss benutzte polyklonale Schaf-Anti-Digoxigenin-

spezifische Antikörper war Meerrettichperoxidase-gekoppelt. Durch dreimaliges

Waschen nach der Antikörperreaktion wie in 3.2.6 beschrieben wurde nicht

gebundenes Konjugat entfernt. Das chromogene Substrat Tetramethylbenzidin

(TMB) wurde hinzugegeben. Dessen enzymatische Umsetzung resultierte in einer

blauen Farbreakion.

3.2.5 Colony-Blot

Die Proben aus dem Jahr 2009 wurden mittels Colony-Blot weiterverarbeitet. Dazu

wurden die Bakterienabschwemmungen aufgetaut und gevortext. 2 µl der

Abschwemmung wurden in ein mit 2,5 ml sterilem NaCl gefülltes Flachbodenglas

gegeben und die Trübung wurde auf McFarland 0,5 eingestellt. Aus dieser

Suspension wurden 10 µl in 10 ml steriles NaCl überführt und gut gevortext. Daraus

wurden nun 10 µl mit einem Einmalspatel auf LB-Platten ausplattiert und über 8-12 h

bei 37 °C bebrütet. Drei Plastiktabletts (ca. 30 x 40 cm) wurden mit 3 mm Whatman

Filterpapier ausgelegt und mit Denaturierungspuffer, Neutralisierungspuffer und 2 x

SSC durchtränkt. Als nächstes wurden runde Nitrocellulosemembranen beschriftet

und auf die bewachsenen LB-Platten aufgelegt. Die Position der Membranen wurde

durch einen Kanüleneinstich markiert. Die Membranen wurde für 5 min auf den

Platten belassen und anschließend mit einer Pinzette luftblasenfrei, mit dem

anhaftenden Koloniematerial nach oben, auf den mit Denaturierungspuffer


durchtränkten Filter verbracht und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der

Inkubationszeit wurde die Nitrocellulosemembran auf das mit Neutralisierungspuffer

getränkte Filterpapier gelegt und ebenfalls 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Als

letztes wurde die Membran auf den mit 2 x SSC getränkten Filter gelegt und

ebenfalls 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Nitrocellulosemembranen wurden

abschließend auf trockenem Filterpapier für mindestens 30 min getrocknet. Die DNA

wurde nach dem Trocken durch UV-Bestrahlung im Crosslinker auf der Membran

fixiert.

3.2.6 Southern-Hybridisierung

Vor der eigentlichen Hybridisierung wurden die Membranen in A.bidest angefeuchtet

und für 2 min in 2 x SSC äquilibriert. Anschließend wurden gläserne

Hybridisierungsröhren mit 10 ml Hybridisierungspuffer und den Membranen bestückt

und bei 65 °C 2 h im Hybridisierungsofen unter ständiger Rotation prähybridisiert. 30

µl der PCR-Sonde wurden zur Denaturierung 15 min bei 100 °C in einem

Reaktionsgefäß gekocht und anschließend 5 min auf Eis gestellt. Nach Ablauf der

Prähybridisierungszeit wurde der Hybridisierungspuffer abgegossen und 3 ml frischer

Hybridisierungspuffer zusammen mit 30 µl denaturierter DNA-Sonde in die

Hybridisierungsröhre gegeben. Über Nacht wurden die Sonden bei 65 °C im

Hybridisierungsofen unter ständiger Rotation an die DNA hybridisiert. Am nächsten

Tag wurden die Membranen drei Mal für jeweils 30 min mit Waschpuffer 1,

Waschpuffer 2 und Waschpuffer 3 mit absteigender Salzkonzentration gewaschen.

Anschließend wurden die Membranen mit 50 ml Blockpuffer für eine Stunde

geblockt. Dem folgte dreimaliges Waschen für jeweils 5 min mit 1 x TBST. Nach dem

Waschen wurden 10 µl Anti-Digoxigenin-Antikörper vom Schaf, konjugiert mit

polymerisierter Merrettichperoxidase, und 10 ml 1 x TBST in die Glasröhren gegeben

und bei Raumtemperatur unter ständiger Rotation inkubiert. Nach einer Stunde

wurde zweimal für 5 min mit 50 ml 1 x TBST und anschließend für 5 min mit 50 ml

TMB-Puffer gewaschen. Danach wurde mit 10 ml gebrauchsfertiges TMB-Substrat

unter Sichtkontrolle inkubiert, bis sich eine blaue Farbreaktion der gebundenen DNA

zeigte. Die Reaktion wurde mit A.bidest abgestoppt, die Membranen aus der

Glasröhre entnommen und zwischen zwei Filterpapieren getrocknet. Von den


hybridisierenden Kolonien (Farbreaktion im Colony-Blot) wurde Material von den

ursprünglichen LB-Platte entnommen (maximal fünf Kolonien pro Platte), und in

Mikrotiterplatten in 200 µl eines Gemisches aus gleichen Teilen LB-Mediums und

50%igem Glycerin eingefroren. Zu einem späteren Zeitpunkt wurden diese Isolate in

einer Multiplex-PCR auf die drei Virulenzgene stx1, stx2 und eae hin untersucht.

3.2.7 DNA-Analyse mittels Multiplex-PCR

3.2.7.1 PCR-Kontrolle der Isolate 2008

Die 2008 gewonnenen Isolate wurden in einer Multiplex-PCR (modifiziert nach

[FRANCK et al. 1998a]) auf die Virulenzgene stx1, stx2, eae und hlyA getestet. Die

dafür verwendeten Primer wurden bereits in Punkt 3.2.2 Tabelle 1 aufgelistet. Das

zusätzlich an dieser Stelle getestete Hämolysin A so wie die interne

Amplifikationskontrolle für das Enzym Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase

(gapdh) sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tab. 2: Verwendete Primer

Virulenzfaktor Primersequenz 5’-3’ Produktgröße

(bp)

GenBank

Nummer

hlyA-F (forward) ACGATGTGGTTTATTCTGGA 165 NC_009602

hlyA-R (reverse) CTTCACGTGACCATACATAT

gapdh-F (forward) AAAGGCGCTAACTTCGACAA 359 NC_000913

gapdh-R (reverse) GCAGCTTTTTCCAGACGAA

Für die mPCR wurden zunächst die tiefgefrorenen Isolate aufgetaut und auf

Columbia-Schafblutagar über Nacht bei 37 °C angezüchtet. Für die mPCR wurden

die Primer auf eine Endkonzentration von 100 µM eingestellt. Es wurden folgende

Primermischungen hergestellt:


Primermix 1: Primermix 2:

dH2O 187,5 µl dH2O 187,5 µl

stx1-1 12,5 µl stx1-2 12,5 µl

stx2-1 12,5 µl stx2-2 12,5 µl

eae-1 12,5 µl eae-2 12,5 µl

hlyA-F 12,5 µl hlyA-R 12,5 µl

gapdh-F 12,5 µl gapdh-R 12,5 µl

Zur Erstellung des Templates wurden 100 µl dH2O in einem Eppendorfgefäß

vorgelegt und mit einer Pipettenspitze voll Koloniematerial (max. ½

stecknadelkopfgroße Menge) eine homogene Bakteriensuspension hergestellt.

Dieses Homogenat wurde später als Template in der mPCR verwendet.

Der Mastermix wurde nach folgendem Pipetierschema erstellt:


dH2O 10,625 µl

10xPCR-Puffer 2,5 µl

MgCl2 1,0 µl

dNTPs 0,625 µl

Primer-Mix1 2,5 µl

Primer-Mix2 2,5 µl

Taq-Polymerase 0,25 µl

Template 5,0


Die Ziel-DNA wurde in einem Thermocycler nach folgendem Programm amplifiziert:







Danach wurde mit den Proben wie in Abschnitt 3.2.8 verfahren.

3.2.7.2 PCR- Kontrolle der Isolate 2009

Zur Kontrolle der mit Hilfe des Colony-Blots identifizierten Isolate wurde eine

Multiplex-PCR zur Detektion der Virulenzgene stx1, stx2, und eae durchgeführt

(modifiziert nach [FRANCK et al. 1998c]). Die dafür verwendeten Primer wurden

bereits in Punkt 3.2.2 aufgelistet. Zusätzlich wurden Primer für das Enzym

Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase als interne Amplifikationskontrolle

eingesetzt (GenBank Accession number: NC_000913). Als Template-DNA diente

lysiertes Koloniematerial der eingefrorenen Isolate, welche zuvor in 100 µl LB-

Medium für 8-12 h bei 37 °C angezüchtet wurden. Als Postitivkontrolle diente auch

hier lysiertes Koloniematerial des Isolates E. coli EDL933.

Die einzelnen Primer wurden auf eine Endkonzentration von 100 µM eingestellt und

der Primermix wie folgt zusammengesetzt:

Primermix 1: Primermix 2:

dH2O 214,2 µl dH2O 214,2 µl

stx1-1 25,0 µl stx1-2 25,0 µl

stx2-1 3,6 µl stx2-2 3,6 µl

eae-1 3,6 µl eae-2 3,6 µl

gapdh-L 3,6 µl gapdh-R 3,6 µl


Der Mastermix wurde in 0,2 ml PCR-Gefäßen nach folgendem Pipettierschema in

angegebener Reihenfolge hergestellt:


dH2O 13,625 µl

10xPCR-Puffer 2,5 µl

MgCl2 1,0 µl

dNTPs 0,625 µl

Primer-Mix1 2,5 µl

Primer-Mix2 2,5 µl

Taq-Polymerase 0,25 µl

Template 2,0 µl


Die Ziel-DNA wurde in einem Thermocycler nach folgendem Programm amplifiziert:






Auch hier wurden nach Ablauf des Programms die Amplifikate im Thermocycler auf 7

°C gehalten.

3.2.8 Gelelektrophorese

Mit Hilfe der Gelelektrophorese werden DNA-Moleküle entsprechend ihrer Größe

aufgetrennt und können nach Anfärbung mit Ethidiumbromid mit einem

Geldokumentationsgerät unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Im Falle dieser

Arbeit wurden die Amplifikate zunächst mit einem Ladepuffer beschwert und jeweils

11 µl des Ansatzes anschließend in einem 2%igen Agarosegel bei 130 V für 90 min

aufgetrennt. Zur Herstellung des Agarosegels wurde 0,9 g Agarose in 90 ml 1 x TBE


gelöst und mit 25 ng Ethidiumbromid/ml versetzt. Als Laufpuffer diente 1 x TBE. Die

Geldokumentation erfolgte in dem Geldokumentationsgerät IMAGO.

Die Isolate, welche mindestens eines der Virulenzgene im Bandenmuster erkennen

ließen, wurden zur Serotypisierung an das Robert-Koch Institut nach Wernigerode

geschickt.

Ergebnisse 63

4 Ergebnisse

4.1 Charakterisierung der beprobten Parks

4.1.1 Gehaltene Tierarten

Um das Vorkommen von STEC in deutschen Streichelzoos zu untersuchen wurden

in den Jahren 2008 und 2009 insgesamt 56 Parks mit Streichelgehegen beprobt. Bei

der Auswahl der Parks wurde darauf geachtet, dass diese einer der drei folgenden

Kategorien zugeordnet werden konnten: Zoologischer Garten, Wildpark oder

Freizeitpark mit Tieranteil. Mit der Einteilung der Parks in die verschiedenen

Kategorien sollten eventuelle Unterschiede im Management sowie der

Tierartenvariabilität im Hinblick auf das Erregervorkommen beleuchtet werden.

Insgesamt wurden aus 37 Zoos, 12 Wildparks und 7 Freizeitparks mit Tieranteil

Proben entnommen. Die am häufigsten gehaltene Tierart in deutschen

Streichelgehegen ist die Ziege bzw. Zwergziege, die in 52 der 56 entsprechenden

Parks (93%) angetroffen wurde. Im Durchschnitt lebten in den untersuchten

Gehegen 17,4 Ziegen (Std.-Abw. 10,3). Neben den Ziegen wurden häufig Schafe

gehalten. Die insgesamt 31 schafhaltenden Betriebe (55%) hatten dabei eine

durchschnittliche Herdengröße von 11,0 Tiere (Std.-Abw. 8,3), die sowohl alleine als

auch in Vergesellschaftung mit Ziegen gehalten wurden. Die dritthäufigste Tierart in

den Parks waren Schweine (12 Gehege; 21%). Schweine wurden in der Regel nicht

in von Besuchern begehbaren Gehegen angetroffen, was höchstwahrscheinlich mit

dem im Vergleich zu Schaf und Ziege höherem Unfall- und Verletzungsrisiko der

Besucher zusammenhängt. Allerdings konnten alle in diese Studie miteinbezogenen

Schweine durch Absperrungen hindurch gestreichelt oder gefüttert werden, so dass

die Besucher intensiven Kontakt zu den Tieren haben. Die Schweinehaltungen

wiesen eine durchschnittliche Herdengröße von 6,7 Tieren (Std.-Abw. 5,0) auf.

Weitere häufiger auftretende Tierarten waren Pferde und Ponies (10 Betriebe; Ø 3,6

Tiere) und Kaninchen (8 Betriebe; Ø 20,4 Tiere). Nur vereinzelt in den

Streichelgehegen gehaltene und daher nicht den klassischen Streicheltieren

zuzurechnende Arten waren Rinder, Meerschweinchen, Esel, Geflügel, Damwild,

64 Ergebnisse

Lamas und Kängurus. In Tabelle 3 sind die Tier- und Zoozahlen für die Jahre 2008

und 2009 einzeln sowie insgesamt aufgeführt.

Tab. 3: Tier- und Zoozahlen der Jahre 2008 und 2009.

Tierart Anzahl

Zoos

gesamt

n=56

(%)

Anzahl

Zoos

2008

n=24 (%)

Anzahl

Zoos

2009

n=32 (%)

Tierzahl

gesamt

Tierzahl

2008

Tierzahl

2009

Ziege 52 (93) 20 (83,3) 32 (100) 903 420 483

Schaf 31 (55) 14 (58,3) 17 (53,1) 339 144 195

Schwein 12 (21) 5 (20,8) 7 (21,9) 80 30 50

Rind 4 (7) 1 (4,1) 3 (9,4) 22 1 21

Pferd / Pony 10 (18) 4 (16,6) 6 (18,8) 36 16 20

Esel 8 (14) 3 (12,5) 5 (15,6) 25 4 21

Kaninchen 8 (14) 3 (12,5) 5 (15,6) 163 111 52

Meerschweinchen 3 (5) 2 (8,3) 1 (3,1) 31 9 22

Lama 2 (4) 0 (0) 2 (6,3) 3 0 3

Damwild 3 (5) 2 (8,3) 1 (3,1) 34 20 14

Känguru 1 (2) 1 (4,2) 0 (0) 4 4 0

Geflügel 2 (4) 2 (8,3) 0 (0) 14 14 0

4.1.2 Ställe und Gehege

In fast allen Einrichtungen wurden die Tiere in einer ganzjährigen Offenstallhaltung

gehalten, d.h. die Tiere konnten unabhängig von der Jahreszeit selbst wählen, ob sie

sich im Stall oder im Freigehege aufhielten. Lediglich fünf Betriebe hielten ihre Tiere

während der Wintermonate ausschließlich im Stall. Der Stall diente in der Regel auch

als Rückzugsbereich für die Streicheltiere, da dieser für die Besucher meist nicht

zugänglich war. Die durchschnittliche Größe der Streichelgehege betrug 1.273 qm,

wobei das Minimum bei 20 qm und das Maximum bei 10.000 qm lag. Mit

eingerechnet wurde hierbei die komplette Fläche, die allen im Park lebenden

Ergebnisse 65

Streicheltieren zur Verfügung stand. Das Maximum von 10.000 qm in einem Park

errechnete sich somit aus den Gehegen für Ziegen, Schafe, Schweine, Kaninchen

und Meerschweine sowie Kängurus und dem Damwild, welchem ein erheblicher Teil

der Fläche zustand. In allen Betrieben war die Belegzahl der jeweiligen

Gehegegröße angepasst, so dass den Tieren die Möglichkeit gegeben war, sich

sowohl von Besuchern als auch Artgenossen zurückzuziehen.

4.1.3 Gehegehygiene und Management

Die untersuchten Streichelzoos waren grundsätzlich sehr ähnlich aufgebaut. Der

Untergrund der Stallungen war zumeist gepflastert oder betoniert, wohingegen die

Ausläufe oft unbefestigt waren und aus Wiese, Schotter oder Kies bestanden. In

92,9% der Parks wiesen die Streicheltiergehege einen nur teilweise oder nicht

befestigten Bodenbelag auf. Nur in vier Betrieben (7,1%) war der Bodenbelag des

kompletten Geheges, d.h. Stallbereich und Auslaufbereich befestigt. Im Fall der

teilweise befestigten Bodenbeläge wiesen meist nur der Stallbereich und kleine Teile

des Auslaufbereiches einen befestigten Stein- oder Betonboden auf.

Ein unbefestigter Sand-, Kies oder Wiesenboden erschwert die

Reinigungsbedingungen enorm. Eine Nassreinigung sowie eine regelmäßige

Desinfektion sind auf solchen Böden nicht möglich. Aufgrund dessen gaben 47

(83,9%) der 56 Parks an, ihre Ställe lediglich trocken zu säubern. Auch die Ausläufe

wurden von 49 Betrieben (87,5%) ausschließlich trocken gereinigt. Die Ausläufe

wurden von 49 Zoos täglich, von drei Betrieben wöchentlich und von vier bei Bedarf

gereinigt. Außerdem gaben 16 (28,6%) der 56 Gehegebetreiber an, nach der

Reinigung zu desinfizieren. Die Desinfektion beschränkte sich aufgrund der

Praktikabilität jedoch rein auf das Ausbringen von Brandkalk in maximal jährlichem

Turnus. Das Wechseln des unbefestigten Bodenbelages, vor allem im Bereich der

Ausläufe, nahmen laut Umfrage 18 Parks (32,1%) vor, wobei häufig nicht der

gesamte Belag gewechselt, sondern Sand oder Rollsplitt etc. nachgestreut wird.

Bei der Verwendung der Werkzeuge, wie Schaufel, Harke oder Schubkarre im

Streichelgehege, fiel auf, dass 28 Parks (50%) die Werkzeuge außer im

Streichelbereich auch in anderen Tiergehegen verwendeten. Allerdings führte nur

einer dieser Parks immer eine Reinigung der Werkzeuge zwischen der Nutzung in

66 Ergebnisse

den jeweiligen Gehegen durch. Eine unregelmäßige Reinigung der Werkzeuge

zwischen der Nutzung in den jeweiligen Gehegen fand bei elf der 28 Parks (39%)

statt. In 16 dieser Parks (57%) fand nie eine Reinigung zwischen den

Gehegewechseln statt. Eine regelmäßige Desinfektion der Geräte vor dem

Gehegewechsel wurde in keinem der Parks durchgeführt.

In den meisten Anlagen (96%) waren die Tierpfleger neben den Streicheltieren

zusätzlich auch für andere Tierarten zuständig. Eine Reinigung der Hände vor dem

Gehegewechsel erfolgte jedoch nur in 20 Zoos (35,7%), eine Desinfektion der Hände

sogar nur in acht Parks (14,3%). Stiefel wurden vor einem Gehegewechsel in sieben

Zoos (12,5%) gereinigt und in fünf Zoos (8,9%) desinfiziert.

4.1.4 Weitere Angaben zu den beprobten Gehegen

Die deskriptive Auswertung aller Fragebogenantworten kann dem Anhang (Tabelle

16) entnommen werden.

4.1.5 Statistische Auswertung der Fragebögen

Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Softwareprogramms SAS 9.3. Als

statistischer Test wurde der Fisher’s exact test für kleine Stichprobenanzahlen

gewählt. Aufgrund der geringen Anzahl an STEC/EPEC negativen Parks errechnet

sich in nur einem Fall ein signifikantes Ergebnis. So lassen sich ein Zusammenhang

zwischen landwirtschaftlicher Tierhaltung der Tierpfleger und ein geringerer

Nachweis an STEC/EPEC feststellen (p=0,0033). Die komplette statistische

Auswertung kann der Tabelle 15 im Anhang entnommen werden

4.2 Nachweis von STEC aus Proben des Jahres 2008

Im Jahr 2008 wurden insgesamt 24 Streichelgehege untersucht, wovon 15 Betriebe

der Kategorie „Zoo“, 7 der Kategorie „Wildpark“ und 2 der Kategorie „Freizeitpark mit

Tieranteil“ zugeordnet wurden. Die Streichelgehege beherbergten insgesamt 11

unterschiedliche Tierarten. Zusätzlich zu den untersuchten Ziegen, Schafen,

Schweinen, Kaninchen, Meerschweinchen, Pferden/ Ponies, Eseln, Rindern,

Damwild, Kängurus und Geflügel wurden aus 17 Betrieben (71%) Insektenproben in

Ergebnisse 67

die Untersuchung auf STEC mit einbezogen. In Abbildung 2 ist der Probenumfang

aus dem Jahr 2008 dargestellt.

Die Sammelkotproben und auch die Insektenproben wurden nach einer

Anreicherung sowohl auf Sorbitol MacConkey-Selektivagar (SMAC-Agar)

angezüchtet als auch mit der immunomagnetischen Separation mit Hilfe O157-

spezifischer Antikörper bearbeitet. Hiernach konnten STEC-verdächtige Keime

kulturell isoliert werden. Anschließend wurden die Isolate mit Hilfe einer Multiplex

PCR (mPCR) auf die Virulenzgene eae, stx1, stx2 und hlyA untersucht und

anschließend vom Robert-Koch Institut (RKI) serotypisiert. Aus 566 untersuchten

Sammelkotproben konnten sieben Proben (1,2% der gesammelten Proben) als

STEC-positiv identifiziert werden. Die positiven Proben stammten aus drei

verschiedenen Betrieben (12,5%), die alle der Kategorie „Wildpark“ angehörten. Aus

den 17 Insektenproben konnten keine STEC-positiven Isolate gewonnen werden.

Probenumfang 2008 (n=583) Ziege

Schaf

Damwild

Rind

Schwein

Kaninchen

Meerschweinchen

Pony/ Pferd

Esel

Känguru

Geflügel

Insekten

Abb. 2: Untersuchter Probenumfang im Jahr 2008, n=583

4.2.1 Nachweis von STEC aus Kaninchen (Wildpark 105)

Eine STEC-positive Probe stammte von einem Kaninchen aus Wildpark 105. Dies

entspricht 20% der kaninchenhaltenden Zoos (n=5) und 3,7% der insgesamt in 2008

von Kaninchen gesammelten Proben (n=27; Tabelle 4). Während bei der ersten

Beprobung von Wildpark 105 eine von fünf Proben (20%) STEC-positiv getestet

68 Ergebnisse

wurde, konnte aus den fünf bei der zweiten Beprobung genommenen Proben kein

STEC isoliert werden. Ebenso wurde kein STEC von den in Wildpark 105 gehaltenen

Ziegen (insgesamt vier Proben), Schafen (10) und Schweinen (9), Meerschweinchen

(9), Damwild (10) und Känguru (4) isoliert.

Aus der positiven Kaninchenprobe konnte ein Isolat gewonnen werden. Das Isolat

konnte vom RKI der Serogruppe O157:H- zugeordnet werden und trug alle vier

getesteten Virulenzgene (eae, stx1, stx2 und hlyA; Tabelle 5).

4.2.2 Nachweis von STEC aus Ziegen (Wildpark 107)

In einem weiteren Wildpark (Wildpark 107) konnte aus insgesamt fünf von Ziegen

gesammelten Proben STEC isoliert werden. Dies entspricht 4,8% der

ziegenhaltenden Zoos (n=21) und 2,0% der in 2008 untersuchten Ziegenproben

(n=245; Tabelle 2). In der ersten Beprobung von Wildpark 107 konnten aus vier der

sieben gesammelten Ziegenproben (57%) insgesamt 39 STEC-Isolate angezüchtet

werden, während in der zweiten Beprobung nur noch in einer der sieben Proben

(14%) ein einzelnes STEC-Isolat gefunden wurde. Wildpark 107 hielt keine weiteren

Streicheltiere, von denen STEC hätte isoliert werden können.

Die insgesamt 40 STEC-Isolate wiesen alle dasselbe Virulenzgen-Muster auf (positiv

für stx1, stx2 und hlyA, negativ für eae) und waren serologisch nicht typisierbar (Ont;

Tabelle 5).

4.2.3 Nachweis von STEC aus Schafen (Wildpark 110)

Eine positive Probe stammte von einem Schaf aus Wildpark 110. Dies entspricht

6,7% der schafhaltenden Zoos (n=15) und 0,7% der in 2008 untersuchten

Schafproben (n=142; Tabelle 2). Die positive Probe stammte aus der ersten

Probennahme des Zoos (fünf Schafproben), während bei der zweiten Beprobung

(vier Schafproben) kein STEC detektiert wurde. Von den weiteren in Park 110

gehaltenen Tierarten (Ziegen, 10 Proben) konnte bei keiner der beiden Beprobungen

STEC isoliert werden.

Alle sechs aus der positiven Probe angezüchteten Isolate wiesen dasselbe

Virulenzgen-Muster (positiv für stx2 und hlyA, negativ für stx1 und eae) auf und

waren serologisch nicht typisierbar (Ont; Tabelle 5).

Ergebnisse 69

Tab. 4: Detektierte STEC im Jahr 2008

Tierart Anzahl

Betriebe

(%)

Anzahl

STEC pos.

Zoos (%)

Anzahl STEC-

pos. Proben in

allen Zoos (%)

Anzahl STEC-pos.

Proben im STEC-

pos. Zoo (%)

Anzahl

STEC

Isolate

Ziege 21 (87,5) 1/21 (4,8) 5/245 (2,0) 5/14 (35,7) 40

Schaf 15 (62,5) 1/15 (6,7) 1/142 (0,7) 1/9 (11,1) 6

Kaninchen 5 (20,8) 1/5 (20,0) 1/27 (3,7) 1/10 (10,0) 1

Tab. 5: Übersicht STEC-Isolate aus im Jahr 2008 beprobten Streichelgehegen

Zoo

Nr.

Tierart Anzahl Virulenzgene Serogruppe

Proben Isolate stx1 stx2 eae hlyA

107 Ziege 5 40 + + - + Ont

110 Schaf 1 6 - + - + Ont

105 Kaninchen 1 1 + + + + O157

4.2.4 Isolation von STEC mittels verschiedener Anzucht-Methoden

Die Anzucht von STEC aus den untersuchten Proben erfolgte 2008 mit und ohne

vorherige O157-spezifische immunomagnetische Seperation (IMS). Der Präpara-

tionsanatz ohne vorherige IMS wurde auf SMAC-Agar kultiviert, die Präparation mit

vorangegangener IMS wurde auf SMAC- und CT-SMAC-Agar kultiviert.

Insgesamt wurden 13 der 40 Ont Isolate aus Ziegen (32,5%) auf SMAC-Platten ohne

vorherige IMS isoliert, 15 (37,5%) der Isolate konnten von einer SMAC-Platte nach

IMS gewonnen werden und die verbleibenden 12 Isolate (30,0%) stammten von CT-

SMAC-Platten nach Durchführung der IMS. Die sechs Schafisolate (alle Ont) wurden

alle nach Durchführung einer IMS isoliert, wobei ein Isolat auf CT-SMAC-Agar und

die verbleibenden fünf Isolate auf SMAC-Agar angezüchtet wurden. Das einzige

Kaninchen-Isolat (O157) stammte von einer SMAC-Platte ohne vorangegangene IMS

(Tabelle 6).

70 Ergebnisse

Tab. 6: Anzahl STEC Isolate nach verschiedenen Isolierungs-Methoden

Park Tierart Isolate Sero-

gruppe

ohne IMS mit IMS

SMAC SMAC CT-SMAC

105 Kaninchen 1 O157 1 - -

107 Ziege 40 Ont 13 15 12

110 Schaf 6 Ont - 5 1

4.3 Nachweis von STEC/EPEC aus Proben des Jahres 2009

Im Jahr 2009 wurden im Zeitraum April bis Mitte Oktober 32 Streichelgehege

beprobt. Insgesamt wurden 975 Proben untersucht, wobei es sich um 951

Sammelkotproben und 24 Insektenproben handelte. Die Anzahl der gesammelten

Kotproben variierte je nach Herdengröße und wurde für jeden Park basierend auf der

Hypergeometrischen Verteilung berechnet. Dafür wurde eine Innerherdenprävalenz

von 20% sowie eine Sicherheitswahrscheinlichkeit (1-α) von 95% festgelegt. Der

Probenumfang für das Jahr 2009 ist in Abbildung 3 dargestellt. Auch hier wurden die

Proben zunächst angereichert, um sie anschließend mit der IMS zu bearbeiten. Im

Vergleich zu 2008 wurde die IMS um Antikörper gegen die O-Serogruppen O103,

O145, O111 und O26 erweitert. Nach der IMS wurde das Probenmaterial auf SMAC-

und CT-SMAC-Platten kultiviert. Nach 24 Stunden Inkubation wurde das gesamte

Kulturmaterial abgeschwemmt und mittels mPCR auf Vorhandensein der

Virulenzgene stx1, stx2 und eae getestet („Screening-PCR“, PCR 1). Alle Proben, die

in der mPCR für zumindest eines dieser Virulenzgene positiv getestet wurden,

wurden für die weitere Anzucht ausgewählt. Hierfür wurde verdünntes

Abschwemmungsmaterial auf LB-Platten ausgestrichen und einer Colony-Blot-

Hybridisierung mit Sonden für alle drei Virulenzgene unterzogen. Positive

Einzelkolonien wurden subkultiviert und mit einer weiteren mPCR („Kontroll-PCR“,

PCR 2) auf die Virulenzgene stx1, stx2 und eae geprüft. Neben ausgewählten STEC-

Isolaten wurden aufgrund des humanpathogenen Potentials auch EPEC-Isolate, die

nur Intimin (eae) als Virulenzgen aufwiesen, zur Serotypisierung an das Robert-Koch

Institut geschickt und somit in die Auswertungen miteinbezogen.

Ergebnisse 71

Probenumfang 2009 (n=975) Ziege

Schaf

Damwild

Rind

Lama

Schwein

Kaninchen

Meerschweinchen

Pony/ Pferd

Esel

Insekten

Abb. 3: Untersuchter Probenumfang im Jahr 2009, n=975

Wie viele der untersuchten Proben in den 32 Zoos der einzelnen Tierarten positiv

getestet wurden ist in Abbildung 4 dargestellt. In den einzelnen Parks waren 0% bis

über 80% der Proben für STEC/EPEC positiv. Bei den kleinen Wiederkäuern waren

in einem Zoo sowohl bei der Ziege als auch beim Schaf mehr als 87% der Proben

positiv. Beim Rind dagegen waren maximal 39% der Proben positiv und beim

Damwild 11%. Die Schweineproben waren zwischen 0% und 45% positiv.

72 Ergebnisse

Abb. 4: Anzahl positiver Proben der einzelnen Tierarten sowie aller Proben in

Prozent der einzelnen Parks.

4.3.1 Auswertungen auf Probenebene

Von den 2009 insgesamt untersuchten 951 Kotproben und 24 Insektenproben waren

in der Screening-PCR insgesamt 309 Proben (31,7%) positiv für mindestens eines

der drei getesteten Virulenzgene. Am häufigsten wurde dabei das stx1 Gen detektiert

(66,7%), während das stx2 Gen (33,9%) und das eae Gen (32,0%) weniger oft in der

Screening-PCR nachgewiesen wurden.

Die 309 positiv getesteten Proben wurden weiterführenden Untersuchungen

unterzogen. Da zur Weiterverarbeitung eine stark verdünnte Menge der

Abschwemmungen verwendet wurde, konnten im Colony-Blot nicht alle zuvor in der

Screening-PCR positiven Proben als positiv bestätigt werden. Eine komplette

Übereinstimmung in allen Virulenzgenen zeigten 123 (39,8%) Proben. Eine

Übereinstimmung in mindestens einem detektierten Virulenzgen zeigten 73 (23,6%)

Proben, deren Isolate nachfolgend ebenfalls serotypisiert wurden. Weitere sechs

Proben stimmten in ihrem Virulenzmuster in PCR 1 und PCR 2 zwar nicht überein,

wiesen jedoch in beiden PCR-Reaktionen mindestens ein Virulenzgen auf und

wurden somit auch in die Serotypisierung miteinbezogen. Proben, die zwar in der

Ergebnisse 73

Screening-PCR für ein oder mehrere Virulenzgene positiv waren, deren im Colony-

Blot gewonnene Isolate in der Kontroll-PCR jedoch negativ waren, wurden nicht

serotypisiert.

In 123 (39,8%) der 309 Proben konnten in der Kontroll-PCR die gleichen

Virulenzgene nachgewiesen werden wie in der vorangegangenen Screening-PCR

der Abschwemmung. Betrachtet man die Wiederfindungsrate der einzelnen

Virulenzgene in der Kontroll-PCR (PCR 2) versus der Screening-PCR (PCR 1) so

stellt sich dies für stx1 folgendermaßen dar:

Tab. 7: Wiederfindungsrate von Isolaten mit dem Virulenzgen stx1 in mit der

Screening-PCR (PCR 1) positiv auf stx1 getesteten Proben.

PCR 1

+ - Total

PC

R 2

(Iso

late

) + 137 12 149

- 69 91 160

T 206 103 309

Von den 206 in der Screening-PCR (PCR 1) positiv auf stx1 getesteten Proben

konnten aus 137 Proben (66,5%) E. coli isoliert werden, die mit Hilfe der Kontroll-

PCR (PCR 2) als stx1 positiv bestätigt wurden. Darüber hinaus wurden 103 Proben

weiter untersucht, die in der Screening-PCR negativ für stx1 getestet wurden, jedoch

positiv für mindestens eines der beiden weiteren untersuchten Virulenzgene stx2 und

eae waren. Dabei konnten aus 12 (11,7%) dieser Proben stx1 positive Stämme

isoliert werden.

74 Ergebnisse

Übereinstimmungen des Virulenzgens stx2 sowohl in der Screening-PCR als auch in

der Kontroll-PCR sind in Tabelle 8 dargestellt.

Tab. 8: Wiederfindungsrate des Virulenzgens stx2 in PCR 1 vs. PCR 2

PCR 1

+ - Total

PC

R 2

(Iso

late

) + 61 26 87

- 43 179 222

T 104 205 309

Von den 206 in der Screening-PCR (PCR 1) positiv auf stx2 getesteten Proben

konnten aus 61 (58,7%) Isolate isoliert werden, die mit Hilfe der Kontroll-PCR (PCR

2) als stx2 positiv bestätigt wurden. Des Weiteren konnten aus 12,7% der in der

Screening-PCR negativ für stx2 getestete Proben in der Kontroll-PCR stx2 positive

Isolate bestätigt werden.

Die Übereinstimmungsrate des eae-Gens in PCR1 vs. PCR2 ist in Tabelle 9

dargestellt.

Tab. 9: Wiederfindungsrate von eae in PCR 1 vs. PCR 2

PCR 1

+ - Total

PC

R 2

(Iso

late

) + 48 19 67

- 51 191 242

T 99 210 309

Von den 206 in der Screening-PCR (PCR 1) positiv auf eae getesteten Proben

konnten aus 48 Proben (48,5%) Isolate isoliert werden, die mit Hilfe der Kontroll-PCR

(PCR 2) als eae positiv bestätigt wurden. Des Weiteren konnten aus 9,0% der in der

Ergebnisse 75

Screening-PCR negativ für eae getestete Proben in der Kontroll-PCR eae positive

Isolate bestätigt werden.

4.3.2 Auswertungen auf Parkebene

In 27 der 32 im Jahr 2009 beprobten Parks wurde STEC/EPEC in Kotproben

detektiert, was einer Prävalenz von 84,4% (α=0,05 CI: 71,8%-97,9%) entspricht.

4.3.3 Serotypisierung von STEC Isolaten

Die Serotypisierung der STEC Isolate am Robert-Koch Insitut ergab das

Vorhandensein 32 verschiedener Serogruppen sowie der Gruppe Orauh

(Serogruppe aufgrund Autoagglutination nicht weiter bestimmbar) und weiterer

Isolate, deren Oberflächenantigene nicht typisierbar waren (Ont). Die Isolate

stammten aus Ziegen, Schafen, Rindern, Schweinen, Lamas und Damwild. Die

Anzahl positiver Zoos für die jeweiligen Serogruppen und Tierarten sind in Tabelle 10

einzeln aufgeführt.

Die insgesamt am häufigsten detektierten Serogruppen waren O76 (40,6% der

Zoos), O26 (31,3%) sowie O5 und O103 (jeweils 28,1%). Weitere häufig isolierte

Serogruppen sind in Abbildung 5 dargestellt.

76 Ergebnisse

Tab. 10: Anzahl positiver Zoos je Serogruppe und Tierart

Sero-

gruppe

pos. Zoos

(n=32)

(%)

Anzahl positive Zoos nach Tierart (%)

Ziege

(n=30)

Schaf

(n=17)

Rind

(n=3)

Schwein

(n=7)

Lama

(n=1)

Damwild

(n=1)

O3 1 (3,1) - 1 (5,9) - - - -

O5 7 (21,9)) 6(20,0) 2(11,8) - 1 (14,3) - -

O8 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -

O15 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -

O21 2 (6,3) 2 (6,7) - - - - -

O23 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -

O25 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -

O26 4 (12,5) 2 (6,7) 2 (11,8) 1 (33,3) 1 (14,3) - -

O39 1 (3,1) - 1 (5,9) - - - -

O43 2 (6,3) 2 (6,7) 1 (5,9) - - - -

O55 2 (6,3) 1 (3,3) 1 (5,9) - - - -

O75 2 (6,3) 1 (3,3) 1 (5,9) - - - -

O76 10 (31,7) 8 (26,7) 3 (17,6) - - - -

O83 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -

O84 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -

O91 3 (9,4) 2 (6,7) - - - - 1 (100)

O103 5 (15,6) 4 (13,3) 1 (5,9) - 2 (28,6) 1 (100) -

O113 7 (21,9) 4 (13,3) 3 (17,6) - - - -

O128 2 (6,3) 1 (3,3) 1 (5,9) - - - -

O132 1 (3,1) - - 1 (33,3) - - -

O135 1 (3,1) - 1 (5,9) - - - -

O142 1 (3,1) - - 1 (33,3) - - -

O145 4 (12,5) 3 (10,0) 1 (5,9) - 1 (14,3) - -

O146 6 (18,8) 3 (10,0) 4 (23,5) - - - -

O148 1 (3,1) - 1 (5,9) - - - -

O153 2 (6,3) - 1 (5,9) - - 1 (100) -

Ergebnisse 77

Tab. 10: Anzahl positiver Zoos je Serogruppe und Tierart (Fortsetzung)

Sero-

gruppe

pos. Zoos

(n=32)

Anzahl positive Zoos nach Tierart (%)

Ziege

(n=30)

Schaf

(n=17)

Rind

(n=3)

Schwein

(n=7)

Lama

(n=1)

Damwild

(n=1)

O156 5 (15,6) 3 (10,0) 4 (23,5) - - - -

O157 2 (6,3) 1 (3,3) 1 (5,9) 1 (33,3) - - -

O159 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -

O174 1 (3,1) 1 (3,3) 1 (5,9) - - - -

O176 1 (3,1) - 1 (5,9) - - - -

O179 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -

Orauh 3 (9,4) 3 (10,0) - - - - -

Ont 13 (40,6) 8 (26,7) 9 (52,9) 1 (33,3) 2 (28,6) - 1 (100)

Abb. 5: Die häufigsten vorkommenden Serogruppen prozentual in 32 beprobten

Zoos.

78 Ergebnisse

Die größte Serogruppenvariabilität konnte bei Ziegen und Schafen mit je 22

verschiedenen Serogruppen festgestellt werden, gefolgt vom Schwein mit sieben

Serogruppen. Die vorherrschende Serogruppe bezogen auf die die jeweilige Tierart

haltenden Parks war bei der Ziege O76 (26,7%), beim Schaf O146 und O156 (je

23,6%) und beim Schwein O103 (28,6%). Die jeweils vier am häufigsten detektierten

Serogruppen bei diesen drei Tierarten sind in Abbildung 6 dargestellt.

Abb. 6: Die häufigsten vorkommenden Serogruppen prozentual in 32 beprobten

Zoos bei Ziegen (n=30 Zoos), Schafen (n=17 Zoos) und Schweinen (n=7

Zoos)

4.3.4 Virulenzgene in STEC Isolaten

Die im Jahr 2009 angezüchteten E. coli Isolate wurden mittels mPCR auf das

Vorhandensein der Virulenzgene stx1, stx2 und eae getestet. Aus den untersuchten

Proben konnten Isolate mit allen sieben möglichen Kombinationen dieser

Virulenzgene detektiert werden (Abbildung 7A). Am häufigsten konnten dabei

Stämme mit den Virulenzgenen eae (69%), stx1 (65%) oder stx1/stx2 (47%)

Ergebnisse 79

festgestellt werden. Kombinationen von stx-Genen mit eae (stx1/eae, stx2/eae oder

stx1/stx2/eae) traten dagegen nur in 3 bis 6% der Zoos auf.

Die Parks waren in der Regel positiv für mehrere Virulenzgen-Kombinationen.

Lediglich aus einem Park konnten ausschließlich Isolate gewonnen werden, die nur

das Virulenzgen eae trugen. Die Probe stammte von einem Lama.

80 Ergebnisse

Abb. 7: Verteilung der Virulenzmuster der im Jahr 2009 getesteten Zoos. (A) alle

Zoos; n=32; (B) Zoos mit Ziegenhaltung, n=30; (C) Zoos mit Schafhaltung;

n=17; (D) Zoos mit Schweinehaltung; n=7

Abbildung 7B bis 7D vergleicht die Verteilung der Virulenzgen-Muster in den drei im

Rahmen dieser Studie am häufigsten STEC/EPEC-positiv getesteten Tierarten

Ziege, Schaf und Schwein. Die in dieser Arbeit untersuchten Ziegenproben wiesen

alle sieben möglichen Virulenzgen-Muster auf. Das alleinige Vorkommen von stx1

Ergebnisse 81

war jedoch das am häufigsten detektierte Muster (63,3%) bezogen auf die Ziegen

haltende Gesamtstreichelzooanzahl. Bei den Schafproben konnten sechs

Virulenzmuster nachgewiesen werden, wobei hier eae als alleiniges Virulenzgen am

häufigsten vorkam (64,7%). Beim Schwein wurden insgesamt nur drei verschiedene

Virulenzmuster festgestellt. Dabei handelte es sich um die jeweils einzeln

auftretenden Virulenzgene stx1 (28,6%), stx2 (14,3%) oder eae (42,9%).

Kombinationen dieser Gene konnten beim Schwein im Rahmen dieser Studie nicht

nachgewiesen werden.

Die auftretenden Virulenzgenkombinationen der einzelnen Serogruppen sind in

Tabelle 11 dargestellt.

82 Ergebnisse

Tab. 11: Virulenzgenkombinationen der Serogruppen

Serotyp auftretende Genotypen

stx1 stx1 stx1 - stx1- - -

stx2 stx2 - stx2 - stx2 -

eae - - - eae eae eae

O3 x

O5 x x

O8 x

O15 x

O21 x

O23 x

O25 x

O26 x x

O39 x x

O43 x x

O55 x

O75 x x

O76 x x

O83 x

O84 x

O91 x x x

O103 x x

O113 x x

O128 x

O132 x

O135 x

O142 x

O145 x x x

O146 x x x

O148 x

Ergebnisse 83

Tab. 11: Virulenzgenkombinationen der Serogruppen (Fortsetzung)

Serotyp auftretende Genotypen

stx1 stx1 stx1 - stx1- - -

stx2 stx2 - stx2 - stx2 -

eae - - - eae eae eae

O153 x

O156 x x x

O157 x x

O159 x

O174 x

O176 x

O179 x

Orauh x x x x

Ont x x x x x x

Von den 201 serotypisierten Proben wurde die Serogruppe O146 in 34 (16,9%)

Proben als häufigste Serogruppe detektiert. In 33 (16,4%) Proben wurden E. coli der

Serogruppe O76 nachgewiesen. O157 konnte lediglich in sieben (3,5%) Proben

detektiert werden. Eine Übersicht der häufigsten Serogruppen bezogen auf die

serotypisierte Gesamtprobenzahl ist in Abbildung 8 dargestellt.

84 Ergebnisse

Abb. 8: Die häufigsten Serogruppen bezogen auf die serotypisierte

Gesamtprobenzahl, n=201

Betrachtet man das Auftreten der Serogruppen geographisch unterteilt nach

Postleitzahlengebieten, so wurde die Serogruppe O76 in 50% (5) der PLZ-Gebiete

gefunden. In 30% (3) handelt es sich sogar um die häufigste Serogruppe. In weiteren

30% wurde die Serogruppe O146 detektiert. Das Auftreten der Serogruppen in

geographischer Abhängigkeit ist in Abbildung 9 und Tabelle 12 dargestellt. Die

Unterteilung erfolgte nach Postleitzahlengebieten. Die Serogruppenverteilung

innerhalb der einzelnen Tierarten Ziege, Schaf und Schwein ist in Abbildung 10

dargestellt.

Ergebnisse 85

Tab. 12: Auftreten der Serogruppen in geographischer Abhängigkeit.

PLZ Untersuchte

Zoos (n)

Untersuchte

Proben (n)

pos. Proben

insgesamt (n)

Serogruppenauftreten

in% aus pos. Proben

0 6 186 23 30% O76

26% O146

8,7%O103

1 3 82 9 44% O76

33% O157

22% O23

2 0 - - -

3 1 33 4 75% O156

25% O113

4 1 24 3 100% O76

5 1 37 0 0

6 5 118 54 44% O146

20% O76

13% O21

7 6 182 38 26% O5

18% O76

13% 156

8 3 138 43 40% O26

21% O43

19% O103

9 6 175 28 14% O145

14% O146

11% O5

86 Ergebnisse

Abb. 9: Die am häufigsten vorkommenden Serogruppen in den jeweiligen

Postleitzahlengebieten.

Ergebnisse 87

Abb. 10: Serogruppenverteilung bei den Tierarten Ziege, Schaf und Schwein in%

bezogen auf die serotypisierte Gesamtprobenzahl, n= 201

Das Vorkommen der verschiedenen Genotypen in den untersuchten Proben ist in

Abbildung 11 dargestellt. Shigatoxin 1 wurde in 96 Proben detektiert, Shigatoxin 1

und Shigatoxin 2 in Kombination sowie Intimin als alleiniges Virulenzgen wurden

jeweils in 59 der Proben detektiert. Lediglich in zwei Proben konnten alle drei

Virulenzgene gleichzeitig detektiert werden.

88 Ergebnisse

Abb. 11: Verteilung der Virulenzmuster anhand der 201 in der Kontroll-PCR

untersuchten Proben

4.3.5 Auswertung auf Isolatebene

Eine Auswertung der Serogruppen- und Genotypverteilung auf Isolateebene

erscheint in dieser Studie nur bedingt sinnvoll, da die mittels PCR typisierte

Isolateanzahl aus den Colony-Blots aus Kostengründen auf maximal fünf Kolonien je

Probe begrenzt wurde und mögliche weitere positive Kolonien nicht bearbeitet

wurden. Insgesamt wurden 1222 Isolate nach der Southern Hybridisierung gepickt

und in einer weiteren Kontroll-PCR auf ihre Virulenzgene hin untersucht. Aus jeder

Probe wurden diejenigen Isolate serotypisiert, die unterschiedliche Virulenzmuster

aufwiesen. Es handelte sich dabei um insgesamt 296 Isolate. Bei 64 Isolaten war der

O-Serotyp nicht typisierbar, bei sechs Isolaten entsprach er Orauh. In Abbildung 12

sind die häufigsten Serotypen auf Isolatebene dargestellt.

Ergebnisse 89

Abb. 12: Anzahl der Isolate der häufigsten Serogruppen, serotypisierte

Gesamtisolatanzahl n= 296.

4.3.6 Vergleich des STEC/EPEC Nachweises zwischen der ersten Beprobung

der Zoos und der Nachuntersuchung

Mit der Probennahme in den Zoos im zweiwöchigen Abstand sollte analysiert

werden, inwiefern die einzelnen Serotypen bei der zweiten Beprobung in derselben

Tierart wieder zu finden waren, und ob diese Serotypen auch aus anderen Tierarten

des gleichen Geheges isoliert werden konnten. Durch dieses Verfahren konnte

gezeigt werden, dass einige Streichelgehege lediglich bei einer der zwei

Beprobungen positiv für STEC/EPEC waren, was die These der intermittierenden

Ausscheidung erhärtet (ROBINSON et al. 2004).

4.3.6.1 Verlauf des EPEC-Nachweises in ausgewählten Streichelgehegen.

In den Zoos Nr. 19, 41 sowie 43, welche nur Ziegen hielten, waren die Proben und

somit der Zoo jeweils nur bei einer Beprobung positiv. In Zoo 42 waren die

Damwildproben sowie die Schaf- und Ziegenproben lediglich bei der ersten

90 Ergebnisse

Beprobung positiv, bei der zweiten waren alle Proben der drei Tierarten negativ.

Ebenso verhielt es sich bei Zoo 72, welcher in der ersten Beprobung negativ war, in

der zweiten jedoch sowohl positive Schaf- als auch Ziegenproben aufwies.

Tab. 13: Übersicht zum Verlauf des STEC/EPEC-Nachweises in der ersten und

zweiten Beprobung in ausgewählten Gehegen.

Zoo Tierart Beprobung vorhandene Genkombinationen in den Proben

1 2 stx1 stx2 stx1 /stx2 eae

19 Ziege + - x x

41 Ziege + - x x x

42 Ziege + - x

Schaf + - x x

Damwild + - x

43 Ziege + - x

72 Ziege - + x x

Schaf - + x

4.3.6.2 Wiederfindungsrate der Serogruppen in ausgewählten Zoos:

Zoo 22: In Zoo 22 wurden Kotproben von Schafen, Ziegen und Schweinen

untersucht. Beim ersten Besuch wurde die Serogruppe O26 bei allen drei Tierarten

nachgewiesen. Die Serogruppe O103 wurde zu beiden Beprobungszeitpunkten bei

Schaf und Ziege nachgewiesen, beim Schwein jedoch nur bei der zweiten

Beprobung. Die Serogruppe O43 wurde beim Schaf sowohl in der ersten als auch in

der zweiten Beprobung isoliert, bei der Ziege nur zum ersten Beprobungszeitpunkt.

Zoo 47: In Zoo 47 konnten die Serogruppen O76 und O146 sowohl bei der ersten als

auch der zweiten Probennahme aus Schafkot isoliert werden. Auch in Zoo 73 wurde

O76 und Orauh in beiden Beprobungen aus dem Ziegenkot isoliert.

Die Ziegenkotproben aus Zoo 81 wiesen zu beiden Beprobungszeitpunkten die

Serogruppe O76 auf.

Ergebnisse 91

Zoo 82: In Zoo 82 wurde die Serogruppe O26 und O146 beide Male aus den

Ziegenkotproben isoliert.

Zoo 84: Aus dem Ziegenkot des Zoos 84 wurde sowohl zum Zeitpunkt der ersten

Beprobung als auch zwei Wochen später die Serogruppe O5 isoliert.

Zoo 88: Die Serogruppen O21 und O146 wurden aus den Ziegenproben des Zoos

88 bei beiden Beprobungen isoliert. In der ersten Beprobung waren vier der acht

Proben für O21 positiv, drei der acht für O146. In der zweiten Beprobung waren drei

der acht Proben für O21 positiv, vier der acht für O146.

Zoo 92: In Zoo 92 wiesen nur die Ziegenproben positive Isolate für beide

Beprobungen auf. Sowohl in der ersten als auch zweiten Beprobung konnte O76

detektiert werden. Aus den Schaf- und Schweinekotproben konnte zu keinem der

beiden Zeitpunkte E.coli mit Virulenzgenen isoliert werden.

Zoo 95: Die Ziegenkotproben aus Zoo 95 wiesen sowohl in der ersten als auch in

der zweiten Beprobung je eine positive Probe für O23 und jeweils eine bzw. drei

positive Proben für O76 auf.

Zoo 97: Zoo 97 war beide Male mit je einer Ziegenprobe positiv für die Serogruppe

O21. Tabelle 14 zeigt einen Überblick zu der Wiederfindungsrate einzelner

Serugruppen in einzelnen Tierarten zum Zeitpunkt der ersten und zweiten

Beprobung.

92 Ergebnisse

Tab. 14: Übersicht zur Wiederfindungsrate einzelner Serogruppen in den Tierarten

Zoo Serogruppe Tierart

Beprobung 1 Beprobung 2

22 O26 Schaf, Ziege -

O103 Schaf, Ziege Schaf, Ziege, Schwein

O43 Schaf, Ziege Schaf

47 O76 Schaf Schaf

O146 Schaf Schaf

73 O76 Ziege Ziege

Orauh Ziege Ziege

81 O76 Ziege Ziege

82 O26 Ziege Ziege

84 O5 Ziege Ziege

88 O21 Ziege Ziege

O146 Ziege Ziege

92 O76 Ziege Ziege

95 O23 Ziege Ziege

O76 Ziege Ziege

97 O21 Ziege Ziege

4.4 Auswertung der Parkarten und Regionen

4.4.1 Jahr 2008

Im Jahr 2008 wurden 24 Streichelgehege beprobt, von denen 15 (62,5%) den

zoologischen Gärten, sieben (29,2%) den Wildparks und zwei (8,3%) den

Freizeitparks mit Tieranteil zugeordnet waren. Die drei 2008 STEC/EPEC positiv

getesteten Parks gehörten alle der Kategorie Wildpark an. In den getesteten Zoos

und Freizeitparks ließen sich keine STEC/EPEC nachweisen. Bei der Auswertung

der positiven und negativen Parks anhand der Zookategorien mit dem Fishers exact

Ergebnisse 93

test zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zum Vorkommen von STEC/EPEC

in Wildparks verglichen mit zoologischen Gärten (p=0,0227).

Des Weiteren wurden im Jahr 2008 alle drei Regionen (Region 1, 2 und 3) beprobt.

Sieben mal (29,2%) wurden Parks aus der Region 1, acht mal (33,3%) Parks aus

Region 2 und neun mal (37,5%) Parks aus Region 3 beprobt. Die STEC/EPEC

positiven Wildparks stammten zweimal aus der Region 3 und einmal aus Region 2.

Ein signifikanter Zusammenhang zwischen Region und STEC/EPEC-Vorkommen

konnte jedoch nicht nachgewiesen werden.

4.4.2 Jahr 2009

Im Jahr 2009 wurden 32 Parks beprobt, wovon 23 (71,9%) der Kategorie

zoologischer Garten, fünf (15,6%) der Kategorie Wildpark und vier (12,5%) der

Kategorie Freizeitpark mit Tieranteil angehörten. In 21 Zoos, drei Wildparks sowie

drei Freizeitparks mit Tieranteil konnten STEC/EPEC nachgewiesen werden. Es ließ

sich allerdings kein signifikanter Zusammenhang zwischen Zookategorie und

STEC/EPEC-Vorkommen aufzeigen.

Auch im Jahr 2009 wurden Parks in allen drei geographischen Regionen beprobt.

Zehn Parks (31,3%) lagen in Region 1, elf Parks (34,4%) in Region 2 und ebenfalls

elf Parks (34,4%) in Region 3. STEC/EPEC positive Parks konnten in allen drei

geographischen Regionen nachgewiesen werden. Ein signifikanter Zusammenhang

zwischen geographischer Region und STEC/EPEC-Vorkommen bestand nicht.

94 Ergebnisse

Diskussion 95

5 Diskussion

Shigatoxin produzierende Escherichia coli (STEC) spielen vor allem in

Industrieländern eine immer größer werdende Rolle bei epidemisch auftretenden,

schweren Durchfallerkrankungen. Nicht selten fordern solche Epidemien Todesopfer

oder verursachen Folgeerkrankungen wie HUS oder TTP, die zu Spätschäden wie

Bluthochdruck und Niereninsuffizienz führen können. Die Ansteckung erfolgt meist

über kontaminierte Lebensmittel, welche für den Rohverzehr gedacht sind. Oft

handelt es sich um Lebensmittel tierischen Ursprungs wie Hackfleisch, Mett

(GRIFFIN u. TAUXE 1991b) oder Rohmilch (GUH et al. 2010), aber auch

Übertragungen durch roh verzehrtes Gemüse, Salat, Apfelsaft oder Sprossen sind

beschrieben (ARMSTRONG et al. 1996; BUCHHOLZ et al. 2011; CODY et al. 1999;

FRANK et al. 2011). Kleine und große Wiederkäuer wurden schon vor einiger Zeit als

STEC/EHEC-Reservoir und potenzielle Infektionsquelle für den Menschen

beschrieben (BLANCO et al. 2003a; BLANCO et al. 2003b; HEUVELINK et al. 2002;

O'BRIEN et al. 2001; ORDEN et al. 2003). Weiter besteht der Verdacht, dass der

Erreger nicht nur durch Verzehr kontaminierter Lebensmittel sondern auch durch

direkten Kontakt zu infizierten Tieren übertragen werden kann. Da von einigen

Autoren der Kontakt zu Tieren in Streichelgehegen oder ähnlichen Einrichtungen als

Infektionsquelle und Risikofaktor beschrieben wurde (DEBROY u. ROBERTS 2006;

GOODE et al. 2009; HEUVELINK et al. 2002; WERBER et al. 2007), war es Ziel

dieser Arbeit, das Vorkommen von STEC in deutschen Streichelzoos zu untersuchen

und Risikofaktoren für die Übertragung auf den Menschen zu beschreiben.

5.1 Material und Methoden

Um unter den teilnehmenden Zoos vergleichbare Populationen zu erhalten, wurde

zunächst eine geographische Schichtung Deutschlands in drei Regionen (Region 1,

Region 2 und Region 3) sowie eine Schichtung der Zoos anhand der Betriebsstruktur

vorgenommen. Ziel war die Beprobung von mind. 40% aller angefragten Parks. In

jeder Region sollten 40% jeder Parkart (Zoo, Wildpark, Freizeitpark mit Tieranteil)

vertreten sein. Dadurch sollte eine Aussagekraft der Ergebnisse für

Gesamtdeutschland erreicht werden.

96 Diskussion

Die Parks wurden in logistisch sinnvoller Reihenfolge angefahren. Mit der im ersten

Jahr angewandten Methodik wurden die Proben selektiv für O157-positive E. coli

Isolate angereichert und ausschließlich sorbitolnegativen Isolate wurden

weitergehend untersucht. Im zweiten Jahr konnte die Anreicherung auf weitere

Serogruppen erweitert werden, da ein entsprechendes Testsystem kommerziell

erhältlich war. Da in diesem Zeitraum auch schwere EHEC-Ausbrüche durch

sorbitolpositive Isolate bekannt geworden waren, wurde das Untersuchungsverfahren

auch auf sorbitolpositive Isolate hin erweitert.

Aufgrund der unbedingten Notwendigkeit, die Untersuchungstechnik an den

Erkenntnisfortschritt anzupassen, musste die Auswertung des STEC/EPEC

Aufkommens in den Jahren 2008 und 2009 getrennt ausgewertet werden. Damit

wurde die Wahrscheinlichkeit, statistisch signifikante Risikofaktoren anhand der

Fragebögen zu ermitteln, verringert.

Bei der Untersuchung von Kotproben auf STEC spielt die Entnahmetechnik eine

bedeutende Rolle zur Prävalenzerhebung. So zeigten PHILLIPS et al. (2000), dass

ein gewisser Gewebetropismus von O157:H7 zu follikelassoziiertem Gewebe,

insbesondere den Peyer’schen Platten des Rektums, besteht. Dies könnte der Grund

sein, weshalb in einigen Arbeiten, in denen Rektaltupfer untersucht wurden, höhere

Nachweisraten gezeigt werden konnten als im Falle der Untersuchung von

Sammelkotproben (BLANCO et al. 2003b; STIRLING et al. 2008; ZSCHOCK et al.

2000). Darüber hinaus besteht bei der Entnahme von Rektaltupfern eine geringere

Kontaminationsgefahr durch Umweltkeime. Bei dem großen Tierkollektiv in dieser

Studie war aufgrund des hohen Zeitaufwandes und der Notwendigkeit einer weiteren

Hilfsperson zur Fixierung der Tiere eine rektale Probennahme nicht möglich, wobei

bei einem Teil der Tiere die rektale Beprobung aufgrund fehlender Kooperation

ohnehin nicht möglich gewesen wäre (Känguru, Lama). Trotzdem wurde in dieser

Studie ein Prozentsatz STEC/EPEC positiver Parks von 12,5% im Jahr 2008 (nur

O157) und 84,4% im Jahr 2009 (O157 und andere Serogruppen) festgestellt. Dass

diese Prävalenz trotz der Untersuchung von Sammelkotproben ermittelt wurde,

könnte mit der doppelten Beprobung jedes Zoos im Abstand von 2 Wochen

Diskussion 97

zusammenhängen. So wurden intermittierende Ausscheider mit einer höheren

Wahrscheinlichkeit entdeckt (ROBINSON et al. 2004).

Um eine höhere Nachweisrate zu erlangen, wurden sowohl im Jahr 2008 als auch im

Jahr 2009 die gewonnenen Proben vorangereichert wie in anderen Studien

beschrieben (SANDERSON et al. 1995). In beiden Jahren wurde als Teil der

Voranreicherung die immunomagnetische Separation (IMS) angewandt, welche laut

KARCH et al. (1996b) eine 100-fach höhere Sensititvität gegenüber anderen

Anreicherungsmethoden aufweist. Mit Hilfe der IMS ist es möglich 100 KbE E. coli

O157 pro Gramm Kot zu detektieren. Auch für die im Jahr 2009 erweiterte IMS sind

ähnliche Nachweisgrenzen genannt (Mellmann, persönliche Mitteilung). Diese Werte

beziehen sich allerdings auf menschliche Stuhlproben. Es wäre möglich, dass die

Nachweisgrenze in tierischem Kot, v.a. in faserreichem Pflanzenfresserkot, etwas

geringer ausfällt, da pathogene Keime evtl. trotz mehrmaligem Waschen an den

Pflanzenfasern haften bleiben und somit nicht detektiert werden. Hinweise auf eine

Reduktion der Sensitivität der erweiterten Anreicherung gegenüber der O157-

spezifischen Anreicherung gab es nicht. So erbrachte die erweiterte IMS im Jahr

2009 ähnliche Nachweisraten für O157 (6,3%) wie die O157-spezifische

Anreicherung im Jahr 2008 (4,2%).

Im Jahr 2009 wurden häufig Serogruppen identifiziert, die nicht spezifisch durch die

O-spezifischen Antikörper der IMS erfasst wurden. Dies beruht vermutlich auf einer

geringeren Spezifität der erweiterten IMS und der nachfolgenden Abschwemmungs-

methode mit anschließender Colony-Hybridisierung. So waren im Jahr 2008 maximal

20 morphologisch verdächtige STEC-Kolonien auf CT-SMAC-Agar, Gassner-Agar

und Schafblut-Agar subkultiviert worden und nur bei STEC-typischem Wachstum auf

allen drei Platten fand eine Weiterbearbeitung statt. Trotz der insgesamt deutlich

verbesserten Sensitivität wird auch mit der im Jahr 2009 eingesetzten Methodik die

Prävalenz möglicherweise unterschätzt, da aus der abgeschwemmten

Bakteriensuspension lediglich 2 µl entnommen und die Abschwemmung somit um

den Faktor 106 verdünnt wurde, um für die Colony-Hybridisierung in Einzelkolonien

bewachsene Agarplatten zu erhalten. Zwar sind Verdünnungen dieser Art durchaus

üblich (SCHILLING et al. 2012), allerdings muss eine niedrigere Sensititvität in Kauf

98 Diskussion

genommen werden. In der darauf folgenden Hybridisierung wurde zunächst ein

Sondengemisch aus Shigatoxin 1-, Shigatoxin 2- und Intiminsonden zu gleichen

Teilen eingesetzt. Das Blotverfahren zeigt im Vergleich zur später eingesetzten

Kontroll-PCR eine relativ gute Sensitivität (stx1: 90,6%, stx2: 82,6%, eae: 73,5%)

jedoch eine nur sehr mäßige Spezifität (stx1: 50,4%, stx2: 34,1%, eae: 35,7%). Da

laut Literatur in der Regel keine Sondengemische eingesetzt werden, ist über

Sensitivität und Spezifität dieser Gemische nichts bekannt. Problematisch bei

Sondengemischen ist, dass die für die Spezifität maßgeblichen Waschbedingungen

nicht sondenspezifisch optimiert werden können. Auch sehr kurze Sonden können

vermehrt zu unspezifischen Bindungen führen. Da die stx2-Sonde lediglich 118 bp

lang war, könnte dies für die geringe Spezifität von 34,1% mit verantwortlich sein. Die

Colony-Hybridisierung wurde trotz der geringen Spezifität eingesetzt, da sie als

Screening-Methode diente, um die Zahl der erforderlichen PCR-Untersuchungen zu

reduzieren. So wurden abschließend bis zu fünf im Colonyblot postive Isolate in einer

Multiplex-PCR mit guter Sensitivität und Spezifität auf das Vorhandensein der

Virulenzgene getestet (FRANCK et al. 1998a). Die Detektion von insgesamt 32

verschiedenen Serogruppen mit unterschiedlichen Virulenzgenkombinationen war

bezeichnend für die gute Sensitivität der Gesamtmethodik.

5.2 Parkmanagement

Streichelgehege, in denen Besucher direkten Kontakt zu Wiederkäuern und anderen

Streicheltieren pflegen können, erfreuen sich immer größer werdender Beliebtheit.

Jedoch standen solche Einrichtungen schon des Öfteren mit STEC/EHEC-

Erkrankungen in Verbindung (DEBROY u. ROBERTS 2006; HEUVELINK et al. 2002)

weshalb sich ein Teil dieser Arbeit mit Unterschieden im Parkmanagement und dem

gleichzeitigen Mehr- oder Mindervorkommen von STEC/EPEC beschäftigt.

Im Allgemein kann gesagt werden, dass die hier untersuchten Streichelgehege sehr

ähnlich aufgebaut waren und sich auch im Gehegemanagement nur unwesentlich

unterschieden. So standen allen Streicheltieren ein Freilauf sowie ein Stallgebäude,

welches gleichzeitig als Rückzugsort diente, zur Verfügung. Die meisten

Streichelgehege wiesen einen unbefestigten Untergrund auf, welcher in der Regel

nicht nass gereinigt wurde. Ein signifikant erhöhtes STEC-Vorkommen konnte im

Diskussion 99

Vergleich zu Parks mit befestigtem Untergrund und regelmäßiger nasser Reinigung

zwar nicht festgestellt werden, eine geringere Infektionsgefahr kleiner Kinder ist

trotzdem wahrscheinlich, da eine nasse Reinigung i.d.R. gründlicher ist als eine

Säuberung durch Besen oder Harke. Ebenso führte eine regelmäßige Erneuerung

der Bodenbeläge oder eine regelmäßige Desinfektion der Böden mittels Brandkalk

zu keiner signifikant niedrigeren STEC-Detektionsrate. Es ist jedoch davon

auszugehen, dass die Re-Infektion der Tiere in solchen Gehegen gemindert wird,

was wiederum die Ausscheidungsrate und somit die Infektionsgefahr der Besucher

senkt (CRAY, JR. u. MOON 1995; KUDVA et al. 1995). Des Weiteren gaben 50%

der Parkbetreiber an, Reinigungswerkzeuge wie Schaufel oder Harke außer im

Streichelgehege auch in anderen Gehegen zu benutzen. Doch nur rund 4% (1) der

28 Zoos nehmen eine regelmäßige und 39% (11) eine unregelmäßige Reinigung der

Werkzeuge vor. Eine Verschleppung der Erreger in andere Tiergehege ist daher

durchaus denkbar und birgt Infektionsrisiken für Tierarten, welche empfindlicher

gegenüber STEC/EPEC sein könnten. Gerade in Zoologischen Gärten sind somit die

wertvollen, exotischen Tierbestände besonders gefährdet. Eine gründliche Reinigung

zwischen der Nutzung in unterschiedlichen Gehegen oder eigenes Werkzeug für

jedes Gehege würde dieses Risiko zweifelsohne verringern.

Ein weiteres potentielles Verschleppungsrisiko entsteht durch das

Tierpflegerpersonal selbst, denn in 96% der Parks sind die Tierpfleger neben dem

Streichelbereich zusätzlich noch für andere Tierarten zuständig. Eine Reinigung der

Hände vor Gehegewechsel erfolgt aber lediglich in 35,7% der Zoos, eine

Händedesinfektion nur in 14,3%. Stiefel werden sogar nur von 12,5% des Personals

gereinigt und von 8,9% desinfiziert. Ein signifikant höheres Erregervorkommen in

Parks, in denen Hände und Stiefel nicht gereinigt oder desinfiziert werden, konnte

jedoch nicht bestätigt werden, da die zusätzlich vom Tierpfleger versorgten

Tiergehege in dieser Studie nicht auf das Vorhandensein von STEC/EPEC

untersucht wurden. Erstaunlicherweise wurde in jenen Parks, in denen die

Tierpfleger selbst landwirtschaftliche Tierhaltung zu Hause betrieben, signifikant

weniger STEC/EPEC (P= 0,0033) detektiert. Möglicherweise ist dies damit zu

erklären, das solche Pfleger eher mit der Thematik der Infektionsgefahren und ihrer

100 Diskussion

Vermeidung vertraut sind, was zu sorgfältigerem Hygienemanagement und somit

geringerer Reinfektion der Streicheltiere führt.

Zwar werden in rund 79% der Parks Speisen und Getränke im Umkreis von 100 m

verkauft, das Verpflegungspersonal steht aber nur in 5,4% der Zoos in direktem

Kontakt zu den Tieren. Somit ist eine Kontamination der Speisen durch

Küchenpersonal sehr unwahrscheinlich. Das mögliche Kontaminationsrisiko der

Speisen durch Fluginsekten wird in dieser Studie ebenso als gering eingeschätzt, da

in keiner der untersuchten Fliegen STEC/EPEC detektiert wurde. Der an anderer

Stelle (BUTIKOFER et al. 2005) beschriebene Zugang der Streicheltiere zu

Picknickwiesen spielt in dieser Studie kaum eine Rolle. In 96,4% der Zoos hatten die

Tiere keinen Zugang zu Picknickplätzen.

In 31 (55,4%) der Parks dürfen die Besucher die Streicheltiere füttern. Häufig (24/31;

77,4%) verfüttern die Besucher energiereiches, pelletiertes Mischfutter.

Energiereiche Fütterung führt zu einem Absenken des pH-Wertes im Magen-Darm-

Trakt der Wiederkäuer, was zwar die Vermehrung der STEC hemmt, die

Ausscheidung säureresistenter STEC allerdings fördert. STEC bilden ebenso wie

andere E. coli Resistenzmechanismen gegen eine zu hohe Protonenkonzentration in

ihrer Umgebung aus. Diese Säureresistenz ist auch nach der Ausscheidung

vorhanden, was dazu führt, dass säureresistente STEC auch durch die

Magenpassage nach humaner Infektion nicht inaktiviert werden (BALJER u. WIELER

1999). Eine rohfaserreiche, energiearme Fütterung in Form von z.B. Heucobs o.ä.

durch die Besucher wäre somit empfehlenswerter.

In nur 53,6% der Parks stehen den Besuchern Handwaschbecken mit fließend

Wasser in unmittelbarer Nähe (10 m) zum Streichelgehege zur Verfügung. Allerdings

wird nur in 12,5% der Parks auf diese hingewiesen. Dementsprechend muss davon

ausgegangen werden, dass längst nicht alle Besucher des Geheges eine

anschließende Händehygiene durchführen. Nach WEESE et al. (2007) hängt die

Händehygiene nach dem Streicheln der Tiere wesentlich mit der Entfernung der

Sanitäranlagen zusammen. Je weiter diese vom Streichelgehege entfernt liegen,

desto weniger werden sie in Anspruch genommen. Dies ist in Anbetracht der

Tatsachen, dass lediglich 41% der Zoos in dem Fragebogen angeben, dass das

Diskussion 101

Essen im Streichelbereich untersagt ist, aber nur neun Zoos (39%) mündlich oder

durch Schilder darauf auch hinweisen, kritisch zu sehen. Es muss davon

ausgegangen werden, dass die Besucher in vielen Streichelzoos Essen zu sich

nehmen, ohne zuvor eine adäquate Händereinigung durchgeführt zu haben. Eine

Infektion der Besucher während des Essens mit kontaminierten, ungewaschenen

Händen ist daher durchaus denkbar. Bereits MCMILLIAN et al. (2007), WEESE et al.

(2007) und BUTIKOFER et al. (2005) konnten in ihren Untersuchungen eine

mangelhafte Aufklärung der Besucher in Form von Informationstafeln etc. feststellen.

In einer Studie von LOCKING et al. (2001) konnte ein signifikanter Zusammenhang

zwischen dem Kontakt mit Tierexkrementen und sporadischen EHEC O157:H7

Infektionen festgestellt werden. Der Kontakt der Besucher mit Tierexkrementen z.B.

durch kotkontaminiertes Fell der Tiere kann so gut wie nicht verhindert werden.

Deshalb wäre die wichtigste und sinnvollste Maßnahme zur Vermeidung von

Infektionen der Besucher mit STEC/EPEC durch Streichelzootiere die Installation

geeigneter Sanitäranlagen direkt am Streichelgehege, sowie eine verbesserte

Aufklärung und Sensibilisierung der Besucher und der Betreiber über

Hygienemaßnahmen und potentielle Zoonosegefahren. Die englische „Farming and

Countryside Education (FACE)“ (Stiftung, welche Kinder und Jugendliche über

nachhaltig gewonnene Lebensmittel und Landwirtschaft aufklärt) reagierte bereits

darauf und erstellte eine Hygieneleitlinie zur Minimierung des Infektionsrisikos der

Besucher (http://www.face-online.org.uk, letzter Zugriff 15.10.2012). Nach dem

EHEC-Ausbruch 2011 in Deutschland verfasste auch das Bundesinstitut für

Risikobewertung (BfR) ein Verbraucherinformationsblatt, in dem neben Hinweisen

zur Vermeidung von lebensmittelassoziierten Übertragungen, auch auf die

Vermeidung von Schmierinfektionen durch Tiere oder erkrankte Mitmenschen

eingegangen wird (http://www.bfr.bund.de, letzter Zugriff 15.10.2012).

5.3 STEC/EPEC Prävalenz

Neben Rindern sind unlängst auch kleine Wiederkäuer wie Schafe und Ziegen als

Erregerreservoir für STEC identifiziert worden. In Streichelgehegen sind diese

Spezies überdurchschnittlich häufig repräsentiert, was sie zu potentiellen

Überträgern der STEC auf die Risikogruppe „Kleinkinder“ macht. In diversen Studien

102 Diskussion

wurde von Herdenprävalenzen für non-O157-STEC für Schafe und Ziegen von bis zu

100% berichtet (ZSCHOCK et al. 2000). Innerherdenprävalenzen betragen

durchschnittlich ~36% bei Schafen und ~75 % bei Ziegen (BLANCO et al. 2003b;

ZSCHOCK et al. 2000), doch nur selten werden die angegebenen Prävalenzen in der

Literatur in Herden- und Innerherdenprävalenzen unterteilt. So detektierten WANI et

al. (2006) in Indien in 275 Ziegenkotproben 37 virulenzgentragende Stämme, was

einer Gesamtprävalenz von 16,8% entspricht. Die STEC/EPEC-Prävalenz der

untersuchten Stallziegen betrug 13,6% (28/206) und die der Wanderziegen 13,0%

(9/69). Allerdings wurden die Kotproben in dieser Arbeit nicht vorangereichert, bzw.

einer IMS unterzogen. PRITCHARD et al. (2009) hingegen untersuchten in einem

Zeitraum von zehn Jahren insgesamt 1715 Kotproben von Tieren aus 31 öffentlichen

Freizeiteinrichtungen und konnte mittels Voranreicherung und IMS in 61,3% der

untersuchten Einrichtungen O157-STEC nachweisen. Die Gesamtprävalenzen

betrugen für Rinder 29,0%, für Schafe 24,4%, für Esel 14,6%, für Schweine 14,3%,

für Pferde 12,3% und für Ziegen 9,9%. Auch ORDEN et al. (2003) beschreiben eine

STEC-Gesamtprävalenz von 24,4% bzw. 16,2% bei Schafen und Ziegen, allerdings

ohne Voranreicherung. In der vorliegenden Arbeit konnten für das Jahr 2009

Gesamtprävalenzen in ähnlichen Größenordnungen ermittelt werden (Rind 34,6%,

Schaf 31,2%, Ziege 29,0% und Schwein 18,8%). Bei einer Untersuchung klinisch

gesunder Haustiere auf STEC konnten allerdings deutlich höhere Prävalenzen von

66,6% bei Schafen und 56,1% bei Ziegen festgestellt werden (BEUTIN et al. 1993).

Die in BEUTINS Studie ermittelte Prävalenz für Rinder lag jedoch nur bei 21,1%, die

für Schweine bei 7,5% und die für Katzen und Hunde bei 13,8% bzw. 4,8%.

Möglicherweise sind die von ihm benutzen Rektaltupfer (ohne Voranreicherung) eine

sensitivere Probenentnahmetechnik als von der Erde aufgenommene

Sammelkotproben. Allerdings verwendet auch er zur Isolierung der Bakterienstämme

eine Colony-Blot-Hybridisierung mit DIG-markierten Sonden, allerdings ohne

anschließende PCR, wodurch ein Teil der Methodik mit der hier angewandten

vergleichbar ist.

Bereits 2003 beschrieben GARCIA u. FOX (2003) Kaninchen als neues Reservoir

und potentielle Infektionsquelle von STEC. Sie untersuchten 34 Kotproben der Rasse

Diskussion 103

Holländerkaninchen sowie 15 Proben der Rasse Weiße Neuseeländer. Obwohl keine

Voranreicherung durchgeführt sondern lediglich Selektivmedien verwendet wurden,

wurden in 25% (7/28) der Holländerkaninchenproben stx1 und eae nachgewiesen.

Intimin als alleiniges Virulenzgen konnte in 39% (11/28) der Proben detektiert

werden. Die sechs Holländerkaninchen aus einem weiteren Bestand waren

STEC/EPEC negativ. Aus den Proben der Weißen Neuseeländer Kaninchen konnte

in 9% (1/11) das Stx1-Gen nachgewiesen werden, vier weitere Proben aus einem

Streichelzoobestand waren negativ für alle getesteten Virulenzgene. Somit liegt die

in der vorliegenden Studie im Jahr 2008 ermittelte Prävalenz für STEC in Kaninchen

mit 3,7% (1/27) zwar deutlich unter der von GARCIA u. FOX (2003), trotzdem konnte

gezeigt werden, dass Kaninchen als Reservoir und somit als Infektionsquelle für

Menschen auch in Deutschland in Betracht gezogen werden müssen. Des Weiteren

konnten in der vorliegenden Studie zusätzlich die Serogruppe O157 aus Kaninchen

isoliert werden, was die Untersuchung von SCAIFE et al. (2006) bestätigt wonach

nicht nur domestizierte Kaninchen sondern auch Wildkaninchen als Vektoren

anzusehen sind und auch Träger der Serogruppe O157 sein können.

Die Familie der Kamele gehört zwar nicht direkt zu den klassischen

Streichelzootieren, ist mittlerweile aber in immer mehr Streichelgehegen anzutreffen.

Im Jahr 2009 konnten in diesen Untersuchungen drei von vier Lamaproben in einem

Zoo als STEC/EPEC positiv identifiziert werden. Bei der ersten Beprobung wurde

eine von zwei Proben eae positiv getestet. Die vier Isolate gehörten der Serogruppe

O153 an. In der darauf folgenden Beprobung zwei Wochen später wurden 10 stx1

positive Isolate aus zwei von zwei Proben der Serogruppe O103 isoliert. Im Jahre

2001 wurden Lamas erstmals auf E.coli O157 hin untersucht. Im Rahmen dieser

Untersuchung wurden Kotproben von 354 Lamas aus 33 verschiedenen

Einrichtungen analysiert, allerdings konnten nach Anreicherung in modifizierter

Trypton-Soja-Bouillon, Anzucht auf McConkey-Agar und anschließender

Immunfluoreszenzmikroskopie keine E.coli der Serogruppe O157 identifiziert werden

(RULOFSON et al. 2001). Hingegen gelang wenige Jahre später die Isolierung von

E.coli der Serogruppe O26:H11 aus einer Kotprobe eines an Diarrhoe erkrankten

Guanako (Lama guanicoe), der Stammform des domestizierten Lamas. Das Isolat

104 Diskussion

wies die typischen Virulenzgene stx1 und eae des Ehly-Phänotyps auf (MERCADO

et al. 2004). Kürzlich veröffentlichten FEATHERSTONE et al. (2011) die Ergebnisse

einer zwölfmonatigen Studie, in der sie Kamele, Lamas und Alpakas auf E. coli O157

untersuchten. Dazu wurden 168 Alpakakotproben, 18 Lamakotproben und zwei

Kamelkotproben aus insgesamt 96 verschiedenen Betrieben analysiert. Insgesamt

konnten drei O157-positive Alpakaproben mit den Virulenzgenen stx2 und eae (aus

einem Bestand stammend) isoliert werden, sowie zwei shigatoxin-negative O157-

positive Isolate aus zwei unterschiedlichen Alpakabeständen, die lediglich das

Intimingen beherbergten. Die hier vorliegende Studie bestätigt damit, dass

STEC/EPEC auch in Schwielensohlern zu finden sind. Streichelgehege, welche

solche halten, sollten sich der Zoonosegefahr bewusst sein und den Besuchern

entsprechende Hygienehinweise an die Hand geben.

5.4 Vorkommen von Serogruppen

Die in dieser Arbeit untersuchten Isolate weisen eine große Serogruppendiversität

auf. Unter allen untersuchten Tierarten konnten 32 verschieden Serogruppen

identifiziert werden. In Ziege und Schaf, den beliebtesten Tierarten in deutschen

Streichelgehegen, traten jeweils 22 unterschiedliche Serogruppen auf. Die häufigsten

Serogruppen, die in dieser Studie detektiert wurden, waren die Serogruppe O146

(34/201) und O76 (33/201). O76 konnte in insgesamt 10 (31,7%) der im Jahr 2009

untersuchten Zoos nachgewiesen werden, O146 in 6 Zoos (18,8%). In 26,7% der

Ziegen haltenden und 17,6% der Schafe haltenden Parks konnte E. coli O76 aus 33

Proben isoliert werden. Auch geographisch betrachtet, ist O76 am weitesten

verbreitet. In 50% der Postleitzahlengebiete trat diese Serogruppe in den

Streichelgehegen auf. ORDEN et al. (2003) isolierten in ihren Untersuchungen

ebenfalls etliche unterschiedliche Serogruppen (13 aus gesunden Ziegen, 12 aus

gesunden Schafen). Sie isolierten O76 jedoch nur einmal aus Ziegenkot und nicht

aus Schafkotproben. In Spanien untersuchten REY et al. (2003) 697 Rektaltupfer von

Schafen und isolierten dabei ebenfalls 22 unterschiedliche Serogruppen. Die

Serogruppe O76 wurde dabei achtmal gefunden. In einer weiteren spanischen Studie

wurden gesunde Milchziegen auf STEC und EPEC untersucht und dabei 25

verschieden Serotypen identifiziert (CORTES et al. 2005). Am häufigsten wurde

Diskussion 105

unter anderem der Serotyp O76:H19 ermittelt. Weiterhin wurde E. coli O76 in Ziegen

in Indien identifiziert (WANI et al. 2006). Betrachtet man weiterhin die Parkprävalenz

der Serogruppen, so wurden in der vorliegenden Arbeit O5 und O113 als

zweithäufigste Serogruppen identifiziert. Sieben der 32 Parks aus dem Jahr 2009

waren für diese Serogruppen positiv, welches die Untersuchung von CORTES et al.

(2005) bestätigt.

Um die Ausbeute an ausgewählten, häufig mit humanen Erkrankungen in

Zusammenhang stehende Serogruppen zu maximieren, kamen in vorliegender Arbeit

diverse Anreicherungsmethoden, u.a. die immunomagnetische Separation (IMS) zum

Einsatz. In Studien in denen keine serogruppenspezifische magnetische Beads zum

Einsatz kamen (BEUTIN et al. 1993; REY et al. 2003), fiel der Nachweis von O26,

O145, O111, O103 und O157 deutlich geringer aus als in der vorliegenden Arbeit.

BEUTIN et al. (1993) serotypisierten 208 Isolate, konnten jedoch keine der oben

genannten Serogruppen identifizieren. Auch ZSCHOCK et al. (2000) konnten ohne

Voranreicherungen lediglich ein bovines Isolat der Serogruppe O26 isolieren, die

Serogruppen O111 und O157 konnten nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz

dazu wurden in der hier vorliegenden Untersuchung mit Hilfe der Dynabeads die

Serogruppe O26 in 10,4% (21) der Proben, O103 in 7,0% (14), O157 in 3,5% (7) und

O145 in 3,0% (6) der Proben detektiert. Andererseits fanden SCHILLING et al.

(2012) in einer Untersuchung ohne Voranreicherung STEC in 100% der beprobten

Parks. Bei den insgesamt 193 serotypisierten Isolaten handelte es sich in 14% (27)

um O157. Drei der Isolate (1,6%) gehörten der Serogruppe O26 an und sechs Isolate

(3,1%) wurden der Serogruppe O103 zugeordnet. Die in dieser Studie beschriebene

Häufung von O157 in Schafen und Ziegen konnte bisher jedoch von keiner anderen

Studie und auch von der vorliegenden nicht bestätigt werden. Allerdings existieren

momentan nur wenige groß angelegte Untersuchungen über das Vorkommen von

STEC-Serogruppen in Ziegen und Schafen und in keiner der aktuellen Studien wurde

eine serogruppenerweiterte IMS durchgeführt, so dass eine abschließende

vergleichende Bewertung nicht möglich ist.

Um das Serovarvorkommen in humanen Krankheitsfällen zu eruieren, wurden von

BEUTIN et al. über 700 Stuhlproben analysiert. Die Charakterisierung der

106 Diskussion

STEC/EPEC-Isolate zeigte einerseits, dass die klassischen EHEC wie O145, O111,

O103, O26 und O157 zwar überwiegend in Patienten mit HUS oder blutiger Diarrhö

vorkamen, andererseits aber auch, dass Serovare wie O118 oder O121 von den

Patienten isoliert werden konnten (BEUTIN et al. 1998; BEUTIN et al. 2004). Des

Weiteren wurden in den Stuhlproben auch STEC mit den O-Antigenen O146, O76,

O5 oder O113 detektiert, welche in der vorliegenden Studie gehäuft in Streichelzoos

nachgewiesen werden konnten. Somit wurden in gegenwärtiger Arbeit STEC und

EPEC Serogruppen erfasst, welche bereits im Zusammenhang mit humanen

Krankheitsfällen beschrieben wurden (BEUTIN et al. 1998; BEUTIN et al. 2004;

GERBER et al. 2002) und somit durchaus humanpathogenes Potential besitzen

könnten. Deshalb sei an dieser Stelle erneut auf die Notwendigkeit hingewiesen,

Besucher von Streichelgehegen über potentielle Infektionsrisiken in Kenntnis zu

setzen und Maßnahmen zu ergreifen, die die Wahrscheinlichkeit einer zoonotischen

Übertragung minimieren.

5.5 Vorkommen von Virulenzgenen

Die im Jahr 2008 gewonnen 47 Isolate entstammten sieben unterschiedlichen

Proben aus drei Tierarten (Ziege, Schaf, Kaninchen). Ein Isolat wurde als E. coli

O157 identifiziert, die anderen 46 Isolate waren nicht typisierbar. Alle 40

Ziegenisolate aus Park 107 trugen die Virulenzgene stx1 und stx2. Die sechs nicht

typisierbaren Schafisolate wiesen die Virulenzgene stx2 und hlyA auf. Das

Kaninchenisolat der Serogruppe O157 beherbergte sogar alle vier getesteten

Virulenzgene stx1, stx2, eae und hlyA. In einer Studie von GARCIA u. FOX (2003), in

der ebenfalls Kaninchen auf STEC untersucht wurden, konnten keine Gene für stx2

oder Varianten davon nachgewiesen werden. Allerdings trugen sieben der in der

Studie untersuchten Kaninchen Isolate mit den Virulenzgenen stx1 und eae sowie

ein Tier ein Intimin-positives Isolat. Da das in vorliegender Studie gewonnene

Kaninchenisolat alle vier Gene trägt, welche maßgeblich für die Virulenz

humanpathogener Isolate verantwortlich sind, ist davon auszugehen, dass ein

potentielles Risiko der Übertragung auf Besucher oder auf im Gehege lebende

Wiederkäuer durch Kaninchen vorhanden ist.

Diskussion 107

Betrachtet man die Genvariationen der aus Ziege und Schaf gewonnen Isolate, so

konnten in einer ähnlichen Untersuchung, im Gegensatz zu dieser Arbeit, nur in

einem von 70 untersuchten Ziegenisolaten stx1 in Kombination mit stx2

nachgewiesen werden (ZSCHOCK et al. 2000). In der angesprochenen Studie waren

jedoch 67 Isolate positiv für stx1 und hlyA und ein Isolat für stx1, eae und hlyA. Auch

in den Schafisolaten unterscheidet sich das 2008 am häufigsten gefundene

Virulenzgenmuster von dem ZSCHOCKS et al (2000). In vorliegender Studie trugen

die sechs Isolate die Virulenzgene stx2 und hlyA, während ZSCHOCK et al. (2000)

stx1 und hlyA als häufigste Virulenzgenkombination dokumentierten. Andere

Untersuchungen hingegen zeigen, dass 50,4% der untersuchten Ziegen- und

Schafisolate stx1-positiv und 47,8% stx1- sowie stx2-positiv waren. Das Gen für hlyA

war in 58,7% der Isolate nachweisbar, eae jedoch nur in 3,7% (ORDEN et al. 2003).

Die in dieser Arbeit ermittelten Virulenzgenkombinationen von stx1, stx2 und hlyA bei

Ziegen sowie stx2 und hlyA bei Schafen wurden in anderen Studien so bisher nicht

beschrieben (ORDEN et al. 2003; ZSCHOCK et al. 2000).

Betrachtet man die Genotypvarianzen der in der vorliegenden Studie isolierten E. coli

aus dem Jahr 2009, so konnte Intimin in 69% der Parks als häufigstes Virulenzgen in

deutschen Streichelgehegen detektiert werden. Stx1 alleine wurde in 65% der Zoos

und stx1 in Kombination mit stx2 in 47% der Zoos detektiert. Wertet man das

Vorkommen der Virulenzgene auf Probenebene aus, so sind 37,5% der Proben stx1-

positiv und jeweils 23% positiv für das eae-Gen alleine sowie für die Kombination aus

stx1 und stx2. In den Untersuchungen von ZSCHOCK et al. (2000) in hessischen

Rinder-, Ziegen- und Schafherden konnten in 53,6% der beprobten Betriebe

Shigatoxine nachgewiesen werden. Von den untersuchten Schafproben trug jedoch

nur eines der neun STEC-Isolate das alleinige Gen für Stx1. Die Kombination des

stx1 Gen und dem Gen für Enterohämolysin A trat bei fünf Isolaten auf. Auch in 96%

der Ziegenproben konnte diese Kombination detektiert werden. Dagegen trug nur ein

Ziegenisolat das Gen für stx1 und stx2.

Kürzlich wurde das Vorkommen u.a. von STEC auf sieben Stadtbauernhöfen und

einem Abenteuerspielplatz in Bayern und Baden-Württemberg untersucht

(SCHILLING et al. 2012). Auf allen acht Höfen und Spielplätzen konnten

108 Diskussion

shigatoxinbildende E. coli nachgewiesen werden. Die Schafproben waren zu 100%

(20/20), die untersuchten Ziegenproben zu 89,3% (25/28) STEC-positiv. Die

Kombination von stx1 und stx2 Genen konnten SCHILLING et al. (2012) in rund zwei

Dritteln (63,2%) der Isolate nachweisen, während stx1 allein in 34,4% und stx2 allein

nur in 2,4% der Isolate auftraten. Hämolysin A konnte, häufiger als in anderen

Studien, in 73,6% der Isolate detektiert werden. Des Öfteren war hlyA mit

Shigatoxingenen vergesellschaftet (35/48), wohingegen das Intimingen nur in zwei

Proben (4,2%) nachgewiesen werden konnte (SCHILLING et al. 2012).

Das Vorkommen der einzelnen Virulenzgenkombinationen in vorliegender Arbeit

unterscheidet sich somit deutlich von vorangegangenen Studien (SCHILLING et al.

2012; ZSCHOCK et al. 2000). Allerdings differieren sowohl die Methoden von

SCHILLING et al. (2012) als auch von ZSCHOK et al. (2000) insofern, als dass in

beiden Arbeiten keine Voranreicherung und keine IMS durchgeführt wurden.

Entweder wurden Colony-Hybridisierungen direkt von McConkey-Agarplatten

angefertigt und die positiven Isolate nachfolgend einer PCR-gestützten Kontrolle

unterzogen oder die Proben wurden auf Gassner-Agar kultiviert und Lactose-positive

Isolate mittels PCR auf Virulenzgene hin untersucht (SCHILLING et al. 2012;

ZSCHOCK et al. 2000). Durch die hier angewandte IMS wurden zwar einerseits

ausgewählte Serogruppen angereichert und somit auch häufiger detektiert,

andererseits waren, v.a. aufgrund der nachfolgenden Colony-Hybridisierung,

mehrere Passageschritte nötig, was zu einem eventuellen Verlust der

phagenvermittelten Shigatoxine geführt haben könnte. Auch BEUTIN et al. (1993)

untersuchten unter anderem das Auftreten unterschiedlicher Virulenzgene in einigen

Haustierarten und konnte aus Ziegenproben v.a. E. coli Isolate isolieren, die stx1 und

stx2 positiv waren. Allein stx1 positive E. coli konnten in Ziegenkotproben am

seltensten nachgewiesen werden. Auch in den Schafproben wurden primär E. coli

mit der Kombination von stx1 und stx2 detektiert, das Vorhandensein von Intimin

wurde allerdings nicht untersucht (BEUTIN et al., 1993). Im Gegensatz dazu konnte

in den eigenen Untersuchungen Intimin als häufigstes Virulenzgen bei den isolierten

E. coli nachgewiesen werden. Wie in anderen Studien (BEUTIN et al. 1993;

BOTTELDORN et al. 2003) beschrieben, wurde auch in den eigenen

Diskussion 109

Untersuchungen in Schweinekotproben kein E. coli mit einer Kombination der

Shigatoxine nachgewiesen. BOTTELDOORN et al. (2003) isolierten vom Schwein

am häufigsten E. coli mit stx2 Gen oder mit der Genvariante stx2e, welche für die

Ödemkrankheit der Ferkel verantwortlich ist (ROLLE u. MAYR 2002). Isolate, die

ausschließlich dieses Gen tragen, sind für den Menschen i.d.R. apathogen, da sie

nicht in der Lage sind den menschlichen Verdauungstrakt zu besiedeln

(BOTTELDOORN et al. 2003). In der eigenen Studie wurden nur wenige stx2-

positive E. coli aus Schweinekotproben isoliert. Obwohl in den meisten EHEC-Fällen,

die mit HUS und blutiger Diarrhö einhergehen, stx2 nachgewiesen werden kann

(CAPRIOLI et al. 2005), sind die hier gewonnenen Schweineisolate als nicht

humanpathogen anzusehen, da humanpathogene EHEC zusätzlich zu den

Shigatoxingenen i.d.R. noch weitere Virulenzgene wie z.B. Intimin- und/oder

Hämolysingene tragen (CAPRIOLI et al. 2005).

Auch wenn sich das in dieser Studie nachgewiesene Muster des

Virulenzgenvorkommens sowohl in Ziegen als auch in Schafen und Schweinen von

denen anderer Publikationen (BEUTIN et al. 1993; BOTTELDOORN et al. 2003;

SCHILLING et al. 2012) unterscheidet, unterstreicht die vorliegende Arbeit, dass

sowohl in kleinen Wiederkäuern als auch anderen Streicheltieren deutscher

Streichelzoos STEC in großer Anzahl nachgewiesen werden kann. Da die Isolate

teilweise zusätzlich zu den Shigatoxinen weitere Virulenzgene tragen, ist ein

potentielles Infektionsrisiko für die Besucher somit nicht völlig von der Hand zu

weisen.

5.6 Wiederfindungsrate einzelner Serogruppen in Streichelgehegen

Mit der zweimaligen Beprobung der einzelnen Gehege jeweils im Abstand von zwei

Wochen sollte zum einen erreicht werden, dass auch intermittierende Ausscheider

mit höherer Sicherheit detektiert werden, zum anderen konnte untersucht werden,

inwiefern Serogruppen in Tierarten persistieren und somit auch nach zwei Wochen

noch nachweisbar sind.

In vier Gehegen konnten STEC/EPEC jeweils nur in der ersten Beprobung

nachgewiesen werden, in der zweiten Beprobung waren diese vier Streichelgehege

negativ für STEC/EPEC. Ein weiterer Streichelzoo wiederum war in der ersten

110 Diskussion

Beprobung negativ für STEC/EPEC, jedoch waren in der zweiten Beprobung sowohl

die Ziegen als auch die Schafe positiv für STEC/EPEC. Da die beschriebene

Methode zur Ermittlung der Stichprobenanzahl sicherstellt, dass die jeweiligen

Stichproben ausreichend groß waren, unterstreicht das Ergebnis die Notwendigkeit

der mindestens zweimaligen Beprobung und die Annahme der intermittierenden

Ausscheidung auch bei kleinen Wiederkäuern sowie Damwild.

Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass mit der angewandten Methodik in

beiden Beprobungen STEC/EPEC-Stämme übereinstimmender Serogruppen in den

Streichelgehegen nachgewiesen werden konnten. In neun Zoos waren die

nachgewiesenen Serogruppen in beiden Beprobungen jeweils in der gleichen Tierart

zu detektieren. Lediglich in einem Zoo konnte die Serogruppe O26 in der zweiten

Beprobung in keiner der Tierarten nachgewiesen werden. Die Serogruppe O43, die

bei der ersten Probenentnahme zuerst in Schafen und Ziegen auftrat, war in der

Nachbeprobung nur noch aus Schafkotproben isolierbar. Die Serogruppe O103 aus

demselben Gehege wurde hingegen in der Nachbeprobung neben Schaf und Ziege

zusätzlich in Schweinekot nachgewiesen. Der wiederholte Nachweis der

Serogruppen in 10 der untersuchten Zoos ist zum einen bezeichnend für eine gute

Gesamtmethodik, zum anderen konnte gezeigt werden, dass auch unter kleinen

Wiederkäuern sowohl intermittierende als auch Langzeitausscheider von

STEC/EPEC zu finden sind. Für große Wiederkäuer sind intermittierende sowie

persistierende Ausscheider von STEC bereits beschrieben (ROBINSON et al. 2004),

eine groß angelegte Studie über das Ausscheidungsmuster von STEC in kleinen

Wiederkäuern fehlt bisher in der Literatur.

5.7 Parkarten und Regionen

5.7.1 Jahr 2008

Die 24 beprobten Streichelgehege gehörten zu 62,5% den zoologischen Gärten, zu

29,2% den Wildparks und zu 8,3% den Freizeitparks mit Tieranteil an. Die Wildparks

waren 2008 signifikant häufiger von STEC/EPEC betroffen als die zoologischen

Gärten (p= 0,0227). Allerdings muss bedacht werden, dass sich die Methodik im Jahr

2008 lediglich auf Isolate der Serogruppe O157 stützte und somit auch

Diskussion 111

sorbitolpositive Isolate nicht weiter bearbeitet wurden. Weshalb nur Wildparks

betroffen waren bleibt spekulativ. Da sich das Gehege- und Hygienemanagement im

vergleich zu Zoos und Freizeitparks nicht unterschied, bleibt zu überlegen, ob sich im

Park frei bewegende Wildwiederkäuer (z.B. Rehwild) eventuell zu einer Übertragung

und stärkeren Belastung des Streichelgeheges geführt haben könnte.

Untersuchungen an Rehwild in Hessen zeigten, dass 19,2% der auf Jagden erlegten

und untersuchten Tiere positiv für STEC waren (A.BARTELS; 2012, Tagungsband

11. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zootier-, Wildtier- und

Exotenmedizin (DVG)). Für die drei beprobten Regionen konnten keinerlei

Signifikanzen im Hinblick auf das Erregervorkommen aufgezeigt werden.

5.7.2 Jahr 2009

Die 32 beprobten Parks gehörten zu 71,9% den zoologischen Gärten, zu 15,6% den

Wildparks und zu 12,5% den Freizeitparks mit Tieranteil an. In 27 Parks (84,4%)

konnte STEC/EPEC mit Hilfe der Serogruppen erweiterten IMS nachgewiesen

werden. Ein signifikant höheres Vorkommen in einer der Parkkategorien ist bei einer

solch allgemein hohen Prävalenz nicht zu erwarten. Auch signifikante Unterschiede

in den geographischen Regionen waren im Jahr 2009 nicht gegeben.

112 Diskussion

Schlussfolgerung 113

6 Schlussfolgerung

In der in den Jahren 2008 und 2009 durchgeführten Prävalenzstudie zum

Vorkommen von STEC/EPEC in deutschen Streichelzoos wurden insgesamt 1511

Kotproben sowie 43 Insektenproben untersucht. Die Proben stammten aus 56

Einrichtungen, die anhand des Parkmanagements in die Gruppen zoologischer

Garten, Wildpark sowie Freizeitpark mit Tieranteil unterteilt wurden. Zusätzlich zur

bakteriologischen Untersuchung wurden von den Parks anhand von Fragebögen

Angaben zu Futter- und Hygienemanagement, Besucherverpflegung und

Tiergesundheit ermittelt.

Die Parkprävalenz beider Beprobungsjahre für das Vorkommen von STEC lag

zusammen bei 54% (30/56). Dabei wurden im Jahr 2008 die Proben nur auf STEC

der Serogruppe O157 untersucht und die Prävalenz von O157-positiven Parks betrug

12,5%. Im Jahr 2009 stand eine serotyperweiterte IMS zur Verfügung, mit der vier

weitere Serogruppen detektiert werden konnten (O26, O103, O111, O145). Mit

dieser neuen Methode untersucht betrug die Parkprävalenz 84,4%. Gelang 2008

bedingt durch die Methodik der Nachweis von nur einer Serogruppe, konnten 2009

22 unterschiedliche STEC/EPEC-Serogruppen identifiziert werden. Der Nachweis

von STEC/EPEC gelang insgesamt aus sieben verschiedenen Tierarten, darunter

auch Kaninchen, Damwild und Lama, aus welchen bisher relativ selten STEC/EPEC

isoliert wurde. Die Prävalenz von E. coli O157 war mit 5,4% der Zoos relativ gering

und entspricht den Angaben aus anderen Veröffentlichungen.

Die Auswertung der Fragebögen sollte auf mögliche Risikofaktoren hinweisen, die zu

einer erhöhten Erregerprävalenz führen könnten und Indizien für mögliche

Übertragungswege auf den Menschen liefern. Allerdings waren aufgrund des

Methodenwechsels und der damit verbundenen Stichprobenmenge bei einer

Gesamtprävalenz von 54% keine Signifikanzen erkennbar. Lediglich Parks, deren für

den Streichelbereich zuständige Pfleger selbst landwirtschaftliche Nutztierhaltung zu

Hause betrieben, waren signifikant weniger häufig von STEC/EPEC betroffen (p =

0,0033). Weiterhin konnte in der deskriptiven Auswertung der Fragebögen gezeigt

werden, dass in Fragestellungen, welche die STEC/EPEC-Übertragung auf Besucher

betrifft, einige Zoos zu Lösungsansätzen beitragen. So ist z.B. das Essen in

114 Schlussfolgerung

Streichelgehegen in vielen Parks untersagt und Streicheltiere haben keinen Zugang

zu Picknickwiese oder Restaurantbereich, so dass die Besucher während der

Mahlzeiten keinen Kontakt zu den Tieren haben. Ebenso erfreulich ist, dass das

Personal, welches für die Tierpflege verantwortlich ist, nicht gleichzeitig im Bereich

der Besucherverpflegung (Kiosk, Restaurant etc.) tätig ist. Somit wird das Risiko

einer Übertragung durch infiziertes Personal bei der Zubereitung und Abgabe von

Lebensmitteln minimiert.

Um die Übertragung von STEC/EPEC-Erregern auf den Menschen und

insbesondere auf die Risikogruppen (Kinder, Schwangere, immunsuppremierte und

ältere Personen) zu minimieren, ist eine praktizierte Händehygiene oberstes Gebot

(http://www.bfr.bund.de; http://www.face-online.org.uk, letzter Zugriff 15.10.2012). Zu

diesem Zwecke ist es unbedingt erforderlich, dass in direkter Nähe zum

Streichelgehege Handwaschvorrichtungen mit Seife und Trockentüchern angebracht

sind. Diese Maßnahme wurde in vielen deutschen Streichelgehegen bereits

getroffen. Ein Großteil der Besucher ist sich jedoch des Zoonoserisikos nicht

bewusst und geht wenig sorgsam mit der Händehygiene um. Daher sollte

insbesondere die Sensibilisierung der Besucher aber auch die der Parkbetreiber für

Zoonosen verbessert werden. Eine Aufklärung mithilfe von Schildern oder

entsprechend gestaltete Unterrichtsstunden in Zooschulen wären denkbar. Auch

sollte das Pflegerpersonal über entsprechende zwischentierartliche

Weiterverbreitung von Krankheitserreger, z.B. über Schuhwerk oder

Reinigungswerkzeug aufgeklärt werden, um die Infektion wertvoller Tierbestände, die

möglicherweise wesentlich empfindlicher auf STEC/EPEC reagieren, zu vermeiden.

Abschließend bleibt zu sagen, dass Streichelgehege in der immer urbaner lebenden

Gesellschaft oftmals die einzige Möglichkeit für einen intensiveren Mensch-

Tierkontakt bieten. Vor allem Stadtkindern ist es nicht immer möglich, ein eigenes

Haustier zu halten; es ist jedoch gesellschaftlich von großer Bedeutung, dass Kinder

lernen auch Bedürfnisse anderer Lebewesen zu akzeptieren und respektieren.

Streichelgehege bieten diese Möglichkeit und vergleicht man die jährlichen

Besucheranzahlen mit den wenigen nachgewiesenen EHEC-Infektionen die auf

einen Besuch im Streichelgehege zurückzuführen sind, stellen diese trotz hoher

Schlussfolgerung 115

Prävalenz, ein geringes Risiko für die Übertragung auf den Menschen dar, solange

grundlegende Hygieneregeln beachtet werden.

116 Schlussfolgerung

Zusammenfassung 117

7 Zusammenfassung

Bauer, Tanja:

Vorkommen von Shigatoxin-bildenden und enteropathogenen Escherichia coli

in deutschen Streichelzoos

Unter den humanpathogenen Darm- und Durchfallerregern spielen STEC/EPEC

mittlerweile v.a. in den Industriestaaten eine immer größer werdende Rolle. Bei

STEC/EPEC handelt es sich um den Darmkomensalen Escherichia coli, der jedoch

im Fall von STEC/EPEC oder EHEC durch das Beherbergen von Virulenzfaktoren zu

einem pathogenen Erreger wurde. Unzählige, meist durch diverse Lebensmittel

ausgelöste Epidemien, die nicht selten Todesopfer fordern, sind in der Literatur

beschrieben. Häufig liegt der Ursprung solcher Krankheitsausbrüche jedoch auch im

engen Kontakt des Menschen zu großen und kleinen Wiederkäuern. Diese

Tierspezies gelten als symptomlose Reservoirtiere und können STEC/EPEC auf den

Menschen übertragen. Besonders gefährdet an schweren Folgeerkrankungen wie

HUS (hämolytisch urämisches Syndrom) oder TTP (Thrombotisch-

thrombozytopenische Purpura) zu erkranken sind sog. YOPIs (junge, alte,

schwangere und immunsuppremierte Menschen). Da in Streichelzoos v.a. die

Risikogruppe der Kinder vertreten ist, sollte in dieser Studie das Vorkommen in

solchen Einrichtungen untersucht werden. Ziel dieser Arbeit war eine

Prävalenzerhebung von STEC/EPEC in deutschen Streichelzoos sowie das Eruieren

von eventuellen Faktoren, die das STEC-Vorkommen in den Reservoirtieren erhöhen

bzw. Risikofaktoren welche eine Übertragung auf den Menschen potenzieren.

Dazu wurden zunächst 126 Tierparks um ihre Teilnahme an dem Projekt gebeten.

Aus arbeitstechnischen, personellen sowie Kostengründen konnte ein Maximum von

50 Zoos (40% der angeschriebenen Zoos) deutschlandweit beprobt werden. Von den

angefragten Parks nahmen 56 teil, somit wurde das mögliche Maximum deutlich

erreicht. Um die Ergebnisse später auf ganz Deutschland zu projizieren und

eventuelle Störvariablen zu kontrollieren, wurden die Parks, nach Ermittlung der

118 Zusammenfassung

regionalen Zoodichte, je nach Betriebsstruktur in zoologische Gärten, Wildparks und

Freizeitparks mit Tieranteil unterteilt. Außerdem wurde Deutschland in drei Regionen

(Region 1, 2 und 3) unterteilt. Von jeder Parkart sollten nun 40% in jeder der drei

Regionen beprobt werden. Die Beprobungen begannen für das Jahr 2008 im Mai

und endeten Ende August (24 Zoos). Im Jahr 2009 dauerten sie von April bis Mitte

Oktober (32 Zoos) an. Alle Parks wurden zweimal im Abstand von zwei Wochen

beprobt. Die zu ziehende Stichprobengröße wurde individuell anhand der

hypergeometrischen Verteilung mit einer Sicherheitswahrscheinlichkeit (1-α) von

95% und einer angenommenen Prävalenz (P) von 20% berechnet. Die insgesamt

1558 Proben (1517 Kotproben und 41 Insektenproben) aus beiden Jahren wurden im

Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover weiter bearbeitet.

Zusätzlich wurden die Parkbetreiber mittels eines Fragebogens über die

Gehegehygiene und das Gehegemanagement, den Gesundheitsstatus der Tiere

sowie der Besucherverpflegung befragt. Die Fragebögen wurden anschließend mit

Hilfe des Statistikprogramms SAS ausgewertet.

Die Proben aus dem Jahr 2008 wurden mittels immunomagnetischer Separation mit

O157 serogruppenspezifischen Beads und mPCR auf die Virulenzgene Intimin

(eaeA), Hämolysin A (hlyA), Shigatoxin 1 (stx1) sowie Shigatoxin 2 (stx2) untersucht.

Von den 566 Sammelkotproben waren sieben Proben (1,2%) aus drei verschiedenen

Parks (12,5%) STEC positiv. Die 17 untersuchen Insektenproben waren

STEC/EPEC-negativ. Die vom Robert-Koch Institut vorgenommene Serotypisierung

der Isolate ergab die Serogruppe O157 eines Kaninchenisolates aus Park 105 mit

allen getesteten Virulenzgenen. Die Schafisolate aus Park 110 und die Ziegenisolate

aus Park 107 waren nicht typisierbar (Ont). Die Isolate aus Park 107 beherbergten

die Virulenzgene stx1, stx2 sowie hlyA. Die Isolate aus Park 110 trugen die

Virulenzfaktoren stx2 und hlyA. Alle STEC-positiven Parks waren der Kategorie

„Wildpark“ zugeordnet.

Die 975 Proben aus dem Jahr 2009 wurden ebenfalls mittels immunomagnetischer

Separation vorangereichert. Allerdings wurde die IMS aufgrund neuer

wissenschaftlicher Erkenntnisse um vier weitere serogruppenspezifische Beads

erweitert (O26, O103, O111 und O145). Nach einer Screening-PCR wurden die

Zusammenfassung 119

mittels Colony-Hybridisierung gewonnen Isolate in einer Kontroll-PCR auf die

Virulenzgene stx1, stx2 und eae getestet. Auch 2009 waren alle 24 Insektenproben

STEC-negativ. In 27 der 32 untersuchten Parks konnte STEC/EPEC in Kotproben

nachgewiesen werden, das entspricht einer Prävalenz von 84,4% der 2009

untersuchten Zoos. In der Screening-PCR waren 309 (31,7%)

Probenabschwemmungen positiv für mindestens eines der getesteten Virulenzgene.

Insgesamt wurden 297 Isolate aus 201 Proben zur Serotypisierung an das Robert-

Koch Institut weitergeleitet. Es konnten 32 verschiedene Serogruppen aus sechs

verschiedenen Tierarten (Ziege, Schaf, Rind, Schwein, Lama, Damwild) identifiziert

werden. Zu den häufigsten isolierten Serogruppen auf Probenebene gehörten O146

(16,9%), O76 (16,4%) und O26 (10,4%). Die größte Serogruppenvariabilität konnte

bei Ziegen und Schafen, sowie bei Schweinen aufgezeigt werden. Am häufigsten

wurde bei den Ziegen auf Probenebene O76 (13,9%), bei den Schafen O146 (5,5%)

und bei den Schweinen O103 (2,5%) detektiert. Betrachtet man die Virulenzgene der

gewonnen Isolate auf Probenebene, so konnte stx1 in 96 Proben als häufigstes

Virulenzgen, gefolgt von eae (59 Proben) sowie stx1 in Kombination mit stx2 (59

Proben), detektiert werden. Auf Zooebene wurde eae in 68,8% der Parks besonders

oft nachgewiesen. Das Vorkommen dieser Virulenzgene in dieser Häufigkeit und in

diesen Kombinationen konnte von anderen Studien bisher nicht aufgezeigt werden.

Sowohl 2008 als auch 2009 wurden jeweils zu etwa gleichen Teilen (ca. 30%) Parks

in der Region 1, 2 sowie Region 3 beprobt. Bei den 2008 als STEC-positiv

identifizierten Parks handelte es sich um drei Wildparks. Ein signifikanter

Zusammenhang zum Vorkommen von STEC/EPEC in Wildparks zeigte sich

verglichen mit zoologischen Gärten (p=0,0227). Die positiven Parks stammten aus

Region 2 und 3. Das Kaninchenisolat der Serogruppe O157 stammte aus der Region

2. Im Jahr 2009 konnten STEC/EPEC positive Parks in allen drei Regionen und in

jedem Zootyp detektiert werden. Somit konnten keine signifikanten Unterschiede

zwischen dem Vorkommen von STEC/EPEC und der Region oder dem Zootyp

festgestellt werden.

Das Gehegemanagement unterschied sich in allen 56 Parks nur unwesentlich und

hatte keinen Einfluss auf das Vorkommen von STEC/EPEC. Lediglich Parks, in

120 Zusammenfassung

denen der Tierpfleger selbst landwirtschaftliche Nutztierhaltung betrieb, waren 2009

signifikant (p=0,0033) weniger STEC/EPEC-positiv. Möglicherweise sind diese

Tierpfleger was die Infektions- und Seuchengefahr betrifft sensibilisierter, was evtl.

zu einer besseren Hygiene und somit geringerer Reinfektion der Tiere führt. Die

Gehege wurden zum größten Teil (87,5%) täglich, jedoch sowohl Ställe als auch

Ausläufe zu über 80% nur trocken gereinigt. Ein Handwaschbecken für Besucher in

unmittelbarer Nähe zum Streichelgehege gab es erfreulicherweise in über der Hälfte

(53,6%) der untersuchten Zoos, doch leider werden die Besucher nur in 12,5% auf

die Möglichkeit des Händewaschens hingewiesen. Allerdings ist eine abschließende

Beurteilung z.B. der Erregerverschleppung innerhalb des Zoos sowie die

Übertragung auf Besucher nicht möglich, da weder Nichtstreicheltiere noch Besucher

bezüglich STEC/EPEC untersucht wurden.

Abschließend bleibt zu sagen, dass in Anbetracht der jährlichen Besucherzahlen und

den bisher nur wenigen nachgewiesenen Infektionen, die tatsächlich auf einen

Besuch im Streichelgehege zurückzuführen sind, die Infektionsgefahr in deutschen

Streichelzoos trotz der hohen STEC/EPEC-Prävalenz relativ gering ist. Die

gewissenhafte Einhaltung einiger einfacher Hygieneregeln seitens der Besucher wird

dafür jedoch vorausgesetzt. Die sachliche Aufklärung und Sensibilisierung der

Besucher sowie Tierpfleger gegenüber Zoonoserisiken ist Aufgabe des

Parkbetreibers und sollte in den meisten deutschen Streichelzoos verbessert

werden. Die vorliegende Arbeit ist die bisher umfangreichste durchgeführte Studie

zur Erhebung des STEC/EPEC-Vorkommens in deutschen Streichelgehegen. Auch

wenn in diesen Untersuchungen keine signifikanten regionalen, den Zootyp

betreffenden oder Gehegemanagement bedingten Unterschiede bezüglich des

STEC/EPEC-Vorkommens belegt werden konnten, so sind die gewonnenen

Ergebnisse trotz des Methodenwechsels zumindest bedingt auf die STEC/EPEC-

Situation in den gesamten deutschen Streichelzoos übertragbar.

Summary 121

8 Summary

Bauer, Tanja:

Occurrence of shigatoxin-producing and enteropathogenic Escherichia coli in

German petting zoos

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and enteropathogenic E. coli (EPEC)

play an important role as causative agents of diarrhoea in humans with increasing

relevance particularly in the industrial states. STEC/EPEC are descendants of

commensal E. coli, which gained pathogenicity by acquisition of virulence factors.

The majority of outbreaks is considered to be food-associated and numerous

epidemics including fatal diseases in humans have been reported. In addition, close

contact to ruminants is described to be a potential source of STEC/EPEC infections.

Ruminants serve as clinically healthy reservoir hosts of these pathogens and may

transmit it to humans. Young, old, pregnant and immunocompromised patients

(YOPIs) are known to be at higher risk for exacerbated and often fatal courses of

STEC infections, such as the haemolytic-uraemic syndrome (HUS) or the thrombotic-

thrombocytopenic purpura (TTP). In petting zoos children may come into close

contact with STEC/EPEC reservoir species, such as sheep and goats. Thus, the aim

of the study was to determine the STEC/EPEC prevalence in petting zoos and to

analyse risk factors influencing its occurrence, as well as the possibility of

transmission.

For this purpose 126 animal parks were contacted. Due to restrictions in time and

financial capacities, a maximum of about 50 parks, equalling about 40% of the

originally contacted parks, was intended to be tested. In total, 56 parks participated in

the study. To control for interfering variables and to allow extrapolation of the results

for whole Germany, parks were divided into three categories: zoological gardens

(zoos), wild parks and amusement parks with animal husbandry. Furthermore,

Germany was divided into three regions (region 1, region 2 and region 3). The aim

for each region and category was to include 40% of the originally contacted zoos in

122 Summary

the study. The study was divided into two sampling periods, with period 1 (24 zoos)

ranging from May to August 2008 and period 2 (32 zoos) lasting from April to October

2009. Each park was sampled twice in an interval of two weeks. Pooled faecal

samples and insects were collected, cooled and transported to the laboratory of the

Institute for Microbiology, University of Veterinary Medicine Hanover, as quickly as

possible. Survey sample sizes were calculated for each park and animal species

according to the herd size, using the hypergeometric distribution with a level of

confidence (1-α) of 95% and an assumed prevalence (P) of 20%. In total, 1,558

samples (1,517 faecal samples and 41 insect samples) were analysed. The park

direction answered a questionnaire about the compound hygiene, the compound

management as well as the health situation of the petting animals and the attendees

fare. The questionnaires were analysed by the statistics program SAS.

In 2008 (sampling 1) E. coli cultures were enriched for serogroup O157 by

immunomagnetic separation with specific antibodies prior to cultivation. Selected

colonies were tested for the presence of intimin (eae), haemolysin A (hlyA),

shigatoxin 1 (stx1) and shigatoxin 2 (stx2) genes by multiplex polymerase chain

reaction (mPCR). STEC was isolated from seven out of 566 faecal samples (1.2%)

originating from three different parks (12.5%; n=24). No STEC was isolated from 17

insect samples. Serotypes of all Isolates were determined by the Robert-Koch

Institute (RKI). One isolate from a rabbit from park 105 was identified as serogroup

O157 and carried all virulence genes tested. Isolates from sheep from zoo 110 and

goats from park 107 were serologically not typeable. The isolates from zoo 110

possessed virulence genes stx2 and hlyA, while isolates from park 107 were positive

for stx1, stx2 and hlyA. All STEC positive parks belonged to the category “wild

parks”.

In 2009 (sampling 2) the immunomagnetic separation was modified to enrich for

serogroups O26, O103, O111 and O145 in addition to O157. STEC strains of these

genotypes are commonly associated with disease in humans and bead-conjugated

antibodies specific for their O-antigens had become commercially available. The

enriched cultures were screened for the presence of stx1, stx2 and eae by mPCR

(screening PCR). For PCR-positive samples individual STEC/EPEC colonies were

Summary 123

selected by colony-hybridisation for stx1, stx2 and eae genes. The presence of these

genes in the isolates was confirmed by mPCR (colony PCR). Again all insect

samples (n=24) were negative for STEC/EPEC. In contrast, 309 out of 975 faecal

samples (31.7%) were tested positive for at least one virulence gene in the screening

PCR. Positive samples originated from 27 out of 32 parks (84%) and six different

animal species (goat, sheep, cattle, pigs, lama and fallow deer). The maximal

proportion of positive samples within an individual park was as high as 80%. A total

of 291 STEC/EPEC isolates from 201 different samples were serotyped by the RKI

and at least 32 different serogroups were identified. Most prevalent serogroups were

O146 (16.9% of all samples with serotyped isolates; n=201), O76 (16.4%) and O26

(10.4%). Serogroup O76 had the broadest geographical distribution, since it was

present in five out of ten postal code zones in Germany and the predominant

serogroup in three of these areas. The highest serotypical variability was observed in

sheep and goats with 22 detected serogroups each. Seven different serogroups were

isolated from pigs. The predominant serogroups in goats, sheep and pigs were O76

(13.9% of all samples with serotyped isolates; n=201), O146 (5.5%) and O103

(2.5%), respectively. The virulence genes eae, stx1 and stx2 were detected in 68.8%,

65.6% and 46.9% of all parks, respectively. Isolates carrying only stx1 were detected

in 96 positive samples, followed by eae alone (59 samples) and the combination of

stx1 and stx2 (59 samples). This is the first study to report these high prevalences of

STEC/EPEC isolates with these virulence gene combinations.

Since STEC/EPEC are known to be shed intermittently by their reservoir host,

sampling of each park was repeated two weeks later to reduce false negative result.

In 2009 five out of 27 positive parks were found positive in only one of the two

samplings. Analysis of serotypes revealed repeated isolation of the same serotypes

in some of the parks, although sometimes in different host species. In some parks, in

which STEC/EPEC was isolated from some host species, other species kept in

parallel remained negative during both samplings.

In both sampling periods (2008 and 2009) approximately equal proportions of parks

from the three regions (about 30% each) were tested. All three parks tested STEC-

positive in 2008 belonged to the category “wild parks” and originated from regions 2

124 Summary

and 3. The STEC/EPEC detection rate in “wild parks” was significantly higher as

compared to zoological gardens during this sampling period. In contrast, in 2009

parks from all categories and regions were tested positive and no significant

differences in detection rates were observed. Serogroup O157 was detected in a

park in region 2 in 2008 and two parks in regions 1 and 3 in 2009.

No remarkable differences were observed between the petting zoo managements of

the tested parks, regardless of their affiliation to the categories of zoological gardens,

wild parks or amusement parks and factors determining the risk for STEC/EPEC

infections in a park were not identified. Only the employment of animal caretakers

which are privately keeping farming animals was significantly associated with a

decreased STEC/EPEC detection rate (p=0.0033). It may be speculated, that these

animal caretakers were more aware of the risks of infections and epidemic plaques.

This awareness may have improved hygiene measures and thereby reduced

STEC/EPEC re-infection rates. The petting zoo enclosures were cleaned daily in the

majority of parks (87.5%), but in more than 80% of the parks only dry cleaning of

both stables and outer parts of the enclosures was performed. Wash-hand basins

were available for the visitors in more than half of the petting zoos (53.6%). However,

the possibility of hand washing was announced to the visitors by signs in only 12.5%

of the parks. A final analysis of STEC/EPEC transmission within zoos or between

petting animals and visitors is not possible, since neither visitors nor zoo animals

other than those in the petting zoos were tested during this study.

Only few human STEC/EPEC infections related to petting animals have been

described so far. Thus, it can be concluded that the risk of transmission to visitors is

low, despite the high STEC/EPEC prevalence in petting animals in Germany

detected in this study. However, the careful performance of simple hygiene

measures, such as hand washing after contact to the animals, appears necessary to

maintain the low risk of transmission. To inform visitors and animal caretakers about

possible risks of zoonotic infections is part of the responsibility of the park direction.

The results of this study have shown that this communication needs to be improved

in most German petting zoos.

Summary 125

This work comprises the most extensive study performed on the presence of

STEC/EPEC in petting zoos in Germany. In summary, no significant differences

between prevalences in different park categories or German regions have been

observed. Management factors influencing the STEC/EPEC detection rates were not

observed. Nevertheless, the results of this study can be extrapolated to the

STEC/EPEC situation in petting zoos throughout Germany, despite the use of

different diagnostic methods during the two sampling periods of this study.

126 Summary

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Danksagung 145

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. P. Valentin-Weigand, Herrn Prof. Dr. G.-

F. Gerlach und Frau Dr. J. Verspohl für die Überlassung des interessanten Themas

sowie das entgegengebrachte Vertrauen und die wissenschaftliche Betreuung

danken. Des Weiteren möchte ich mich bei Frau Dr. P. Grüning für die gründliche

Einarbeitung in die labortechnischen Methoden bedanken. Mein weiterer Dank gilt

dem Zoonoseverbund FBI Zoo für die finanzielle Unterstützung dieses Projektes

sowie dem Robert-Koch Institut und Frau Dr. A. Fruth für die Serotypisierung der

gewonnenen Isolate.

Meinen Mitstreitern und Kollegen des Instituts für Mikrobiologie der Tierärztlichen

Hochschule Hannover danke ich für die tolle Zeit, viel Spaß und der fachlichen als

auch seelischen Unterstützung. Mein besonderer Dank gilt Anna Drees und Beatrice

Neise für die unermüdliche Hilfe bei der Bearbeitung der Probenmassen sowie

Kerstin Habighorst für die Hilfe im Labor und die aufbauenden Kaffeepausen.

Herrn Henstorf danke ich für das Gießen und Bereitstellen der Unmengen an

Agarplatten und Anzuchtbouillon. Herrn Merkel danke ich für die Hilfe bei sämtlichen

EDV-Problemen sowie Frau Baumert für die Unterstützung in allen organisatorischen

Dingen.

Den Mitarbeitern des Instituts für Biometrie, Epidemiologie und

Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover, v.a. Frau Dr. M.

Heskamp und Frau Dr. A. Ovelhey, danke ich für die Hilfe bei der Erarbeitung und

Auswertung der Fragebögen sowie bei allen Epidemiologischen Fragestellungen.

Meinen Mädels aus Hannover (Caro, Christine, Emy, Isa, Linda, Svenja, Fabienne

und Betty) danke ich für die wunderschöne und lustige Zeit und für die immer wieder

aufbauenden Worte in teils schwierigen Zeiten. Vielen Dank v.a. Christine und Heike

für das schnelle und gründliche Korrekturlesen.

Mein größter Dank geht an Dennis Rubbenstroth, ohne ihn wäre diese Arbeit nie

fertig gestellt worden. Vielen Dank für die ehrlichen, nicht immer leicht zu

146 Danksagung

verdauenden Worte, die langen unermüdlichen Diskussionen und den nicht enden

wollenden Glauben an mich und diese Arbeit.

Mein besonderer Dank geht an meine Eltern. Durch euch war das alles hier erst

möglich und ohne euch wäre ich nicht das was ich jetzt bin.

Anhang I 147

Anhang I (Statistische Auswertung der Fragebögen)

Tab. 15: Statistische Auswertung der Fragebögen mit Hilfe des Fisher’s exact test

STEC total Two-tailed Fisher´s exact test (p value)

pos. neg.

n = (%) 26 (81,2) 6 (18,8) 32 (100)

Frage 1: Wie ist die Bodenbeschaffenheit des Geheges

befestigt/ teils befestigt 20 (62,5) 6 (18,8) 26 (81,3) 0,5645

unbefestigt 6 (18,8) 0 (0,0) 6 (18,8)

Frage 2: Welche Tränkeart wird im Streichelgehege verwendet?

Selbsttränke 12 (37,5) 1 (3,1) 13 (40,6) 0,3606

andere Tränke 14 (43,8) 5 (15,6) 19 (59,4)

Frage 3: Woher wird das Tränkewasser bezogen?

Brunnen/ Grundwasser 10 (31,3) 1 (3,1) 11 (34,4) 0,6367

Stadtwasser 16 (50,0) 5 (15,6 21 (65,6)

Frage 4: Haben die Tiere Zugang zu zusätzlichen Wasserquellen?

ja 26 (81,3) 6 (18,7) 32 (100) -

nein 0 0 0 (0)

Frage 5: Werden die Reinigungswerkzeuge noch in weiteren

Wiederkäuergehegen benutzt?

ja 7 (21,9) 1 (3,1) 8 (25,0) 1,0

nein 19 (59,4) 5 (15,6) 24 (75,0)

Frage 6: Werden die Werkzeuge vor der Benutzung gereinigt?

ja 9 (28,1) 0 (0,0) 9 (28,1) 0,1499

nein 17 (53,1) 6 (18,8) 23 (71,9)

Frage 7: Werden zugekaufte Tiere vorher gesundheitlich untersucht?

ja 23 (71,9) 5 (15,6) 28 (87,5) 1,0

nein 3 (9,4) 1 (3,1) 4 (12,5)

148 Anhang I


pos. neg.

n = (%) 26 (81,2) 6 (18,8) 32 (100)

Frage 8: Gibt es eine Quarantänephase für zugekaufte Tiere?

ja 17 (53,1) 4 (12,5) 21 (65,6) 1,0

nein 9 (28,1) 2 (6,3) 11 (34,4)

Frage 9: Wie oft werden die Streichelgehege gereinigt?

täglich 24 (75,0) 4 (12,5) 28 (87,5) 0,1504

nicht täglich 2 (6,2) 2 (6,2) 4 (12,5)

Frage 10: Wird das Streichelgehege nach der Reinigung desinfiziert?

ja 7 (21,9) 3 (9,4) 10 (31,3) 0,3461

nein 19 (59,4) 3 (9,4) 22 (68,8)

Frage 11: Wird der Bodenbelag in regelmäßigen Abständen erneuert??

ja 8 (25,0) 3 (9,4) 11 (34,4) 0,3897

nein 18 (56,3) 3 (9,4) 21 (65,6)

Frage 12: Betreibt das tierversorgende Personal selbst landwirtschaftliche

Nutztierhaltung?

ja 4 (12,5) 5 (15,6) 9 (28,1) 0,0033

nein 22 (68,8) 1 (3,1) 23 (71,9)

Frage 13: Wurden die Tiere in den letzten 4 Wochen medikamentös behandelt

(außer Antibiotika)?

ja 9 (28,1) 2 (6,3) 11 (34,4) 1,0

nein 17 (53,1) 4 (12,5) 21 (65,6)

Frage 14: Gibt es einen Vertragstierarzt oder einen festangestellten Tierarzt?

Vertragsttierarzt 13 (40,6) 4 (12,5) 17 (53,1) 0,6586

festangestellter Tierarzt 13 (40,6) 2 (6,3) 15 (46,9)

Frage 15: Gibt es landwirtschaftliche Nutztierhaltung im Umkreis von 5-10km?

ja 18 (56,3) 4 (12,5) 22 (68,8) 1,0

nein 8 (25,0) 2 (6,3) 10 (31,3)

Anhang I 149


pos. neg.

n = (%) 26 (81,2) 6 (18,8) 32 (100)

Frage 16: Gibt es Rinderhaltung im Umkreis von 5-10km?

ja 16 (50,0) 4 (12,5) 20 (62,5) 1,0

nein 10 (31,3) 2 (6,3) 12 (37,5)

Frage 17: Dürfen die Tiere durch die Besucher gefüttert werden?

ja 14 (43,8) 4 (12,5) 18 (56,3) 0,6722

nein 12 (37,5) 2 (6,3) 14 (43,8)

Frage 18: Mit was werden die Tiere von den Besuchern gefüttert

(Mehrfachnennung möglich)?

Mischfutter (Pellets) 14 (43,8) 2 (6,3) 16 (50,0) 0,6539

Rauhfutter (Heucobs, ect.) 12 (37,5) 4 (12,5) 16 (50,0)

Frage 19: Dürfen Besucher im Streichelbereich essen?

ja 16 (50,0) 3 (9,4) 19 (59,4) 0,6664

nein 10 (31,3) 3 (9,4) 13 (40,6)

Frage 20: Wird auf das Essensverbot im Streichelbereich hingewiesen?

ja 21 (65,6) 5 (15,6) 26 (81,3) 1,0

nein 5 (15,6) 1 (3,1) 6 (18,8)

Frage 21: Werden Snacks und Speisen im Umkreis von ca. 100m zum

Streichelgehege verkauft?

ja 18 (56,3) 4 (12,5) 22 (68,8) 1,0

nein 8 (25,0) 2 (6,3) 10 (31,3)

Frage 22: Gibt es ein Handwaschbecken in unmittelbarer Nähe des

Streichelgeheges?

ja 17 (53,1) 1 (3,1) 18 (56,3) 0,0636

nein 9 (28,1) 5 (15,6) 14 (43,8)

150 Anhang I


pos. neg.

n = (%) 26 (81,2) 6 (18,8) 32 (100)

Frage 23: Werden die Besucher auf die Möglichkeit zum Händewaschen

hingewiesen?

ja 5 (15,6) 2 (6,3) 7 (21,9) 0,5896

nein 21 (65,6) 4 (12,5) 25 (78,1)

Frage 24: Welche Tiere versorgt der für den Streichelbereich zuständige

Tierpfleger noch?

andere Nutztiere und/oder Vögel 18 (56,3) 5 (15,6) 23 (71,9) 0,6482

sonstige Tiere 8 (25,0) 1 (3,1) 9 (28,1)

Anhang II 151

Anhang II (Deskriptive Auswertung der Fragebögen)

Tab. 16: Deskriptive Auswertung der Fragebögen

Frage A1: Art und Anzahl der Tiere, die in den Streichelgehegen gestreichelt

werden können.

Tierart Anzahl Zoos (%)

n=56

Mittelwert

± Std.-Abw.

Minimum Maximum

Ziegen 52 (92,86) 17,37 ± 10,33 5,00 47,00

Schafe 31 (55,36) 11,03 ± 8,34 1,00 35,00

Schweine 12 (21,43) 6,67 ± 5,05 2,00 19,00

Pferde / Ponies 10 (17,86) 3,60 ± 2,63 1,00 8,00

Lamas 2 (3,57) 1,50 ± 0,71 1,00 2,00

Geflügel 2 (3,57) 7,00 ± 1,41 6,00 8,00

Kaninchen 8 (14,29) 20,38 ± 20,05 2,00 50,00

Meerschweinchen 3 (5,36) 10,33 ± 10,12 4,00 22,00

Sonstige Tiere 10 (17,86) 8,50 ± 8,14 2,00 24,00

Frage A2: Welche Tiere leben zusätzlich in den Streichelgehegen, lassen sich

jedoch nicht anfassen?


n=56

Mittelwert

± Std-Abw.

Minimum Maximum

Geflügel 9 (16,07) 15,00 ± 17,27 5,00 58,00

Wildvögel 56 (100,00) k.A. k.A. k.A.

Sonstige Tiere 5 (8,93) 5,20 ± 3,42 1,00 10,00

152 Anhang II

Frage A3: Leben die Tiere ganzjährig in Offenstallhaltung?

Offenstallhaltung Anzahl Zoos (%) n=56

Ja 51 (91,07)

Nein 5 (8,93)

Frage A4: Wie groß ist ca. die Fläche der Streichelgehege?

Anzahl Zoos (%)

n=56

Mittelwert

± Std-Abw.

Minimum Maximum

Gehegegröße (qm) 53 (94,64) 1273,25 ± 1840 20,00 10000,00

Keine Angaben 3 (5,36)

Frage A5: Wie ist die Bodenbeschaffenheit der Gehege?

Bodenbeschaffenheit Anzahl Zoos (%) n=56

Befestigt 4 (7,14)

Teilweise befestigt 38 (67,86)

Unbefestigt 14 (25,00)

Frage A6: Wie viele Besucher haben die Zoos jährlich im Durchschnitt?

Anzahl Zoos (%)

n=56

Mittelwert

± Std-Abw.

Minimum Maximum

Zoo gesamt 55 (98,21) 274.164 ± 290.351 11.000 1.300.000


Streichelgehege 45 (80,35) 187.689 ± 205.061 8.000 1.100.000


Anhang II 153

Frage B1: Womit werden die Tiere gefüttert?

Zooeigenes Futter vom Tierpfleger verfüttert Anzahl Zoos (%) n=56

Heu 54 (96,43)

Stroh 31 (55,36)

Getreide 15 (26,79)

Pelletiertes Mischfutter 29 (51,79)

Brot 9 (16,07)

Obst/ Gemüse 30 (53,57)

Grünfutter 45 (80,36)

Küchenabfälle 1(1,79)

Zooeigenes Futter vom Besucher verfüttert Anzahl Zoos (%) n=56

Heu 21 (37,50)

Stroh 0 (0,00)

Getreide 3 (5,36)


Brot 3 (5,36)


Grünfutter 0(0,00)

Küchenabfälle 0 (0,00)

Vom Besucher verfüttertes, mitgebrachtes Futter Anzahl Zoos (%) n=56

Heu 1 (1,79)

Stroh 0 (0,00)

Getreide 1 (1,79)


Brot 5 (8,93)


Grünfutter 0 (0,00)

Küchenabfälle 2 (3,57)

154 Anhang II

Frage B2: Welche Tränkearten verwenden die Zoos? (Mehrfachnennungen

möglich)

Tränkeart Anzahl Zoos (%)

Tränkeeimer 17 (30,36)

Trog 19 (33,93)

Selbsttränke 25 (44,64)

Frage B3: Woher beziehen die Zoos das Tränkewasser?

Bezugsquelle Anzahl Zoos (%)

Stadtwasser/ Trinkwasser 39 (69,64)

Brunnen-/ Grundwasser 17 (30,36)

Frage B4: Haben die Tiere zusätzlich zu den Tränken noch Zugang zu anderen

Wasserquellen?

Zusätzliche Wasserquelle Anzahl Zoos (%)

n=56

Art der zus.

Wasserquelle

Anzahl Zoos (%)

n=9

Ja 9 (16,07) Bach 6 (10,71)

Teich 2 (3,57)

Sonstiges 1 (1,79)

Nein 46 (82,14)


Frage C1: Darf im Streichelbereich gegessen werden?

Anzahl Zoos (%) n=56

Ja 33 (58,93)

Nein 23 (41,07)

Anhang II 155

Frage C2: Wird darauf hingewiesen, wenn im Streichelbereich nicht gegessen

werden darf?

Anzahl Zoos (%) n=23 Hinweisart Anzahl Zoos (%) n=9

Ja 9 (39,13) Mündlich 6 (66,67)

Hinweisschilder 3 (33,33)

Nein 13 (56,52)

Nicht bekannt 1 (4,35)

Frage C3: Haben die Streicheltiere Zugang zum Restaurantbereich oder einer

Picknickwiese?


Ja 1 (1,79)

Nein 54 (96,43)


Frage C4: Werden Snack und Speisen im Umkreis von ca. 100 m zum

Streichelgehege verkauft?

Anzahl Zoos (%) n=56 Art der verk. Speisen Anzahl Zoos (%) n=44

Ja 44 (78,57) Kuchen 27 (61,36)

Warme Speisen 41 (93,18)

Belegte Brötchen 17 (38,64)

Kugeleis (offen) 13 (29,55)

Stieleis (verpackt) 40 (90,90)

Sonstiges 11 (25,00)

Nein 12 (21,43)

156 Anhang II

Frage C5: Hat das Personal, das für die Besucherverpflegung zuständig ist, Kontakt

zu den Tieren?


Ja 3 (5,36)

Nein 53 (94,64)

Frage D1: Werden dieselben Reinigungsgeräte außer im Streichelgehege auch bei

anderen Tieren des Parks benutzt? (Mehrfachnennung Tierart möglich)

Anzahl Zoos (%)

n=56


n=28

Ja 28 (50,00) Wiederkäuer 13

Pferde 7

Schweine 5

Vögel 5

Sonstiges 0

Nein 28 (50,00)

Anhang II 157

Frage D2: Wenn Geräte in anderen Gehegen benutzt werden, werden diese Geräte

vor der Nutzung im Streichelbereich gereinigt/ desinfiziert?

Reinigung der Geräte Anzahl Zoos (%) n=28

Immer 1 (3,57)

Nicht immer 10 (35,71)

Nie 16 (57,14)

Nicht alle Geräte 1 (3,57)

Desinfektion der Geräte Anzahl Zoos (%) n=28

Nicht immer 4 (14,29)

Nie 22 (78,57)

Nicht alle Geräte 1 (3,57)


Frage D3: Wie lange bleiben Ziegen/ Schafe durchschnittlich im Streichelgehege?


Zeitlebens 22 (39,29)


Anzahl Zoos

(%)

Mittelwert (Jahre)

± Std.-Abw.

Minimum

(Jahre)

Maximum

(Jahre)

Verbleib Böcke 14 3,86 ± 1,83 2,00 9,00

Verbleib Jungtiere 23 0,71 ± 1,17 0,25 6,00

158 Anhang II

Frage D4: Werden Tiere zugekauft und wenn ja, wie viele pro Jahr?


Zukäufe 8 (14,29)

Keine Zukäufe 26 (46,43)

Austausch Böcke 19 (33,93)



Anzahl Zoos (%)

n=56

Mittelwert ±

Std.-Abw.

Minimum Maximum

Zukauf Tiere 8 (14,29) 8,88 ± 16,87 1,00 50,00

Frage D5: Wenn Tiere zugekauft werden, werden diese zuvor gesundheitlich

untersucht?


Ja 30 (53,57)

Nein 6 (10,71)

Unterschiedlich 9 (16,07)



Entfällt 9 (16,07)

Anhang II 159

Frage D6: Wenn Tiere zugekauft werden, gibt es eine Quarantänephase?


Ja 20 (35,71)

Nein 18 (32,14)

Unterschiedlich 3 (5,36)

Bei Bedarf 6 (10,71)


Entfällt 8 (14,29)

Frage D7: Ist ein Handwaschbecken in der unmittelbaren Nähe (10m) des

Streichelbereiches?

Waschbecken für

Besucher

Anzahl Zoos (%)

n=56

Ausstattung Anzahl Zoos (%)

n=30

Ja 30 (53,57) Fließend kaltes

Wasser

29 (96,67)

Fließend warmes

Wasser

5 (16,67)

Seife 12 (40,00)

Handtücher 7 (23,33)

Trockengebläse 6 (20,00)

Nein 26 (46,43)

160 Anhang II

Frage D8: Werden die Besucher auf die Möglichkeit zum Hände waschen

hingewiesen?

Anzahl Zoos (%) n=56 Hinweisart Anzahl Zoos (%) n=7

Ja 7 (12,50) Mündlich 2 (28,57)

Hinweisschilder 5 (71,43)

Nein 47 (83,93)


Frage D9: Wie oft werden die Ausläufe der Tiere gereinigt?


Täglich 49 (87,50)

Wöchentlich 3 (5,36)

Nach Bedarf 4 (7,14)

Frage D10: Wie werden die Ställe gereinigt?


Trocken 47 (83,93)

Trocken und Nass 9 (16,07)

Frage D11: Wie werden die Ausläufe gereinigt?


Trocken 49 (87,50)

Trocken und nass 6 (10,71)


Anhang II 161

Frage D12: Wird während/nach der Reinigung desinfiziert?

Anzahl Zoos (%)

n=56

Zu desinfizierender

Bereich


Ja 16 (28,57) Ställe 15 (93,75)

Ausläufe 4 (25,00)

Nein 38 (67,86)


Frage D13: Wird der Bodenbelag im Streichelgehege von Zeit zu Zeit gewechselt?


Ja 18 (32,14)

Nein 35 (62,50)



Frage D14: Welche Tierart(en) versorgt der für den Streichelzoo zuständige

Tierpfleger noch?

Tierart Anzahl Zoos (%) n=56

Heimische Nutztiere 34 (60,71)

Heimische Wildtiere 29 (51,79)

Vögel 29 (51,79)

Nicht heimische Tiere 29 (51,79)

Sonstige Tiere 11 (19,64)

Keine weiteren Tiere 2 (3,57)

162 Anhang II

Frage D15: Hat das Personal, das Kontakt zu den Tieren hat selbst

landwirtschaftliche Tierhaltung zu Hause?


Ja 14 (25,00)

Nein 40 (71,43)


Frage D16: Welche Art von Reinigung erfolgt zwischen dem Versorgen der

unterschiedlichen Gehege?

Reinigung Anzahl Zoos (%) n=56

Hände Stiefel

Ja 20 (35,71) 7 (12,50)

Nein 35 (62,50) 45 (80,36)

Nicht bekannt 1 (1,79) 2 (3,57)

Keine Angaben 0 (0,00) 2 (3,57)

Desinfektion Anzahl Zoos (%) n=56

Hände Stiefel

Ja 8 (14,29) 5 (8,93)

Nein 13 (23,21) 8 (14,29)

Weder Reinigung noch Desinfektion 35 (62,50) 43 (76,79)

Anhang II 163

Frage D17: Welche Berufsausbildung haben die für das Streichelgehege zuständigen

Tierpfleger?

Berufsausbildung Anzahl Zoos (%) n=56

Staatl. geprüfter (Zoo-)Tierpfleger 43 (76,79)

Andere Tierpflegerausbildung 12 (21,43)

Tierarzt 2 (3,57)

Schulung/ Seminar 2 (3,57)

Keine spez. Tierpflegerausbildung 19 (33,93)

Frage E1: Sind/ waren Tiere des Streichelzoos in den letzten vier Wochen erkrankt?


Ja 10 (17,86)

Nein 46 (82,14)

Frage E1-a: Welcher Art war die Erkrankung?

Erkrankung Anzahl Zoos (%) n=10

Abszess 1 (10,0)

CAE-Verdacht 1 (10,0)

Diarrhoe 2 (20,0)

Gastritis 1 (10,0)

Kokzidien 1 (10,0)

Koliken 1 (10,0)

Mastitis 1 (10,0)

Nasenausfluss, Hautkrusten 1 (10,0)

Todesfall bei Zwillingsgeburt 1 (10,0)

164 Anhang II

Frage E2: Um welche Tierart handelte es sich bei den erkrankten Tieren?

Tierart Anzahl Zoos (%) n=56

Ziegen 8 (14,29)

Schafe 2 (3,57)

Pferde/Ponies 1 (1,79)

Frage E3: Wurden Tiere des Streichelzoos in den letzten vier Wochen

medikamentös behandelt?

Medikamentenbehandlung Anzahl Zoos (%)

n=56

Medikament Anzahl Zoos (%)

n=25

Ja 25 (44,64) Antiparasitika 12 (48,0)

Antibiotika 2 (8,0)

Impfungen 12 (48,0)

Nein 29 (51,79)



Frage E4: Werden die Tiere vom Tierarzt regelmäßig auf das Vorhandensein

bakterieller Erreger untersucht?

Untersuchung Anzahl Zoos (%)

n=56

Untersuchungshäufigkeit Anzahl Zoos (%)

n=43

Ja 43 (76,79) Regelmäßig 6 (13,95)

Nach Bedarf 35 (81,4)


Nein 13 (23,21)

Anhang II 165

Frage E5: Wenn ja, worauf werden die Tiere untersucht?

Erreger Anzahl Zoos (%) n=43

Salmonellen 13 (30,23)

Campylobakter 5 (11,63)

Yersinien 3 (6,98)

Andere bakt. Erreger 17 (39,53)


Frage E6: Ist ein Tierarzt fest angestellt oder gibt es einen Vertragstierarzt?

Angestellter

Tierarzt

Anzahl Zoos (%),

n=56

Anstellungsart Anzahl Zoos (%),

n=53

Ja 53 (94,64) Festangestellter TA 21 (39,62)

Vertrags-TA 32 (60,38)

Nein 2 (3,57)


Frage E7: Gab es generell im Zoo schon einmal Probleme mit Salmonellen

und/oder EHEC?

Erregervorkommen Anzahl Zoos (%), n=56

Ja, bei Zootieren 20 (35,71)

Nein 30 (53,57)


166 Anhang II

Frage F1: Gibt es landwirtschaftliche Nutztierhaltung in der näheren Umgebung

(Umkreis 5-10km)?

Nutztiere in

näherer

Umgebung

Anzahl Zoos (%),

n=56

Tierart Anzahl Zoos (%),

n=36

Ja 36 (64,29) Schweinehaltung 20 (55,56)

Geflügelhaltung 12 (33,33)

Rinderhaltung 31 (86,11)

Andere Nutztiere 7 (19,44)

Nein 13 (23,21)


Frage F2: Wie häufig erfolgt eine Fliegenbekämpfung im Stall?

Fliegenbekämpfung Anzahl Zoos (%), n=56

Permanent 4 (7,14)

Bei starkem Befall 14 (25,00)

Nie 37 (66,07)


Frage F3: Wie häufig erfolgt eine Nagerbekämpfung?

Nagerbekämpfung Anzahl Zoos (%), n=56

Permanent 31 (55,36)

Bei starkem Befall 9 (16,07)

Bei geringem Befall 3 (5,36)

Nie 11 (19,64)


Vorkommen von Shigatoxin-bildenden und enteropathogenen ... · 2.1.2 Epidemiologie und Bedeutung...

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