Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 2 · Institut für Medizinische Genetik Vom...

Institut fürMedizinische Genetik

Vom Molekül zur Zelle

Block 3

Seminar / Praktikum 2

Präsentation: Ernst Müllner / Georg Weitzer

Diese Präsentation befindet sich auf der Lehr-Inhalts Seite des Inst f. Medizinische Genetik unter

www.meduniwien.ac.at/hp/medizinische-genetik/lehre

Helmut Dolznig Inst. F. Medizinische Genetik MedUni Wien


Der praktische Teil der 2. Übung findet statt am: Zentrum für Pathobiochemie und Genetik Währingerstraße 10 Übungssaal I, 1. Stock


Enzymatische Methoden

Enzymatische Reaktionen •  Enzym = E •  Substrat = S •  Produkt = P •  Coenzym (Cosubstrat) = CoE

E +S ES EP E + P

E + S + CoE ES-CoE EP-CoE´ E + P + CoE´ Coenzym verändert sich zunächst (CoE à CoE’), wird aber in einer anderen Reaktion wiedergewonnen, daher auch der Name “Cosubstrat”


E + S1 + S2 à S1-E-S2 à E-P à E + P

Enzymatische Reaktionen ein anderes Beispiel

Das aktive Zentrum des Enzyms fixiert die Substrate in einer optimalen Position, um deren Reaktion zu erleichtern.


Was Sie wissen sollten: Aktivität von Enzymen (Biokatalysatoren) wird beeinflusst durch •  pH- Wert (Optimum, aber auch Denaturierung) •  Temperatur (Optimum, aber auch Denaturierung) •  Hemmstoffe (in der Medizin: Medikamente!)

–  kompetitive (erhöhen den Km Wert) –  nicht-kompetitive Anmerkung: bei der kompetitiven Hemmung konkurrieren ein Agonist

(Substrat) und ein Antagonist (Hemmstoff) um die Bindungsstelle an einem Enzym. Bei der nicht-kompetitiven Hemmung bindet der Antagonist nicht an der Substrat-Bindungsstelle.


pH-Wert Optimum

am Beispiel der Verdauungs-Enzyme Pepsin (im Magen) und Trypsin (im Darm).

Typisches Temperatur Optimum der Enzymaktivität bei 37°C

Einzelne Enzyme können durchaus davon abweichen.

Enzymatische Reaktionen


[E] x [S] Km = [ES]

vmax x [S] v = [S] + Km

Für die Reaktionsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion gilt:

Michaelis-Menten Gleichung

Die Reak(onsgeschwindigkeit v einer enzyma(schen Reak(on in Abhängigkeit von der Substratkonzentra(on [S] nach der Michaelis-‐Menten Gleichung kann auch grafisch dargestellt werden.

Km entspricht der Substrat-‐Konzentra(on, bei der das Enzym mit der HälGe der maximalen Geschwindigkeit arbeitet.


Graphische Darstellung der Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion

v... Umsatzgeschwindigkeit

vmax ... Maximale Reak- tionsgeschwindigkeit

Km = [S] bei vmax / 2

(Km = Michaelis-Menten Konstante) ([S] = Substratkonzentration) ... daher Km in mol/l

es gilt: [E] = [ES]

v

[S]

In diesem Bereich: Bestimmung der Enzymmenge

In diesem Bereich: Bestimmung der Substratkonzentration

Abbildung aus: Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - Vom Molekül zur Zelle, Facultas Verlag, Hans Goldenberg (Hg.)


Umwandlung der Kurve höherer Ordnung in eine lineare Funktion durch einen doppelt-reziproken Plot


Lineweaver-Burk Diagramm

1 / v = 1 / vmax + (Km / vmax) x 1 / [S]

y = k x x + d → y = d + k x x Geradengleichung k = Steigung

k = (1 / vmax) / (1 / Km)

Durch Umformung der Michaelis-‐Menten Gleichung in eine doppelt-‐reziproke Form kann die Reak(onsgeschwindigkeit einer enzyma(schen Reak(on in einem Lineweaver-‐Burk Diagramm dargestellt werden.

Dies hat vor allem für die Auswertung der Daten Vorteile.


Beispiel 1

v

Kine5sche Untersuchung der Lactatdehydrogenase: Bes5mmung der Km durch Messung der Reak5ons-‐Geschwindigkeit bei verschiedenen Substrat-‐Konzentra5onen

[S] modifiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg


Was macht die Lactatdehydrogenase?

Coenzym / Cosubstrat

C2H5OH-COOH + NAD+ CH3CO-COOH + NADH + H+ Pyruvat Lactat

Diagnose von Herzinfarkt durch die Aktivitätsbestimmung von herzspezifischen Enzymen im Blut

•  Kreatinkinase (CK-MB) •  Laktatdehydrogenase (LDH) LDH in der Leistungs-Diagnostik im Sportbereich

gemessene Reaktionsrichtung

COO HO C H

CH3

COO C O

CH3


Was macht NAD+?

Nico(namid-‐Adenin-‐Dinucleo(d ist ein Elektronen transpor(erendes Coenzym, das an zahlreichen Redox-‐Reak(onen des Stoffwechsels beteiligt ist. Dabei kann es reduziert werden und maximal zwei Elektronen (dann geschrieben als NADH) aufnehmen.

Hier gezeigt am Beispiel der Umwandlung (Oxida(on) von Ethanol zu Acetaldehyd, durch das Enzym Alkohold-‐dehydrogenase, ADH.


Absorptionsspektrum von NAD+ und NADH

340

Im Gegensatz zu NAD+ zeigt NADH ein starkes Absorptionsmaximum bei 340 nm (langwelliges UV-Licht).

Im Zuge der Reaktion von Pyruvat zu Lactat nimmt (durch gleich-zeitige Umwandlung von NADH in NAD+) die Absorption von UV-Licht ab.

modiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg


-1 / Kapp

Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität ...

... und Darstellung der Ergebnisse in einem Lineweaver-Burk Diagramm

LDH spielt vor allem eine Rolle bei einer Nebenreaktion der Glykolyse im Citratzyklus.

Durch die Umwandlung von Lactat zurück zu Pyruvat in der Leber (Cori Zyklus) wird NADH produziert, das seinerseits als energielieferndes Co-enzym der Atmungskette zur ATP Bildung beiträgt.

Im Praktikum wird hingegen die Umwandlung von Pyruvat in Lactat gemessen, wobei NAD+ gebildet wird.


Messen der Umsatzgeschwindigkeít bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] = [Pyruvat]

nochmals: gemessen wird die Reaktion in der Richtung vom Pyruvat zum Lactat, wobei NADH in NAD+ umgewandelt wird.

zunächst Herstellung einer Verdünnungsreihe

„Ergänzung“, H. Goldenberg


alle Volumina in µl

Probenvorbereitung

Durch Zugabe von 20 µl Lactatdehydrogenase wird die Reaktion gestartet



k = v für gegebene [S]

Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität

Zusatz von LDH

niedrige Pyruvatkonzentration

hohe Pyruvatkonzentration



E = ε x c x d

Küvette d = 1 cm

Prisma Lichtquelle

E = log (1/T) = log (I0/I)

Detektor

I I0

Lambert-Beersches Gesetz

E = Extinktion ε = spez. Molarer Extinktionskeoff. c = Konzentration d = Schichtdicke T = Transmission

Photometer


Photometer


Messung der Extinktionsänderung bei jeder Substratkonzentration

E = ε x c x d

c = E / (ε x d)

Δc / Δt = ΔE / (ε x d x Δt) = v

Abnahme der Extinktion in Abhängigkeit von der Dauer der Reaktion messen (wie in der Grafik zuvor dargestellt).


Arbeitsplatz


Zusatz von LDH

Auswertung der Messdaten durch Umwandlung in ein Lineweaver-Burk Diagramm ...

Jedes “k” (Steigung links) entspricht einem Punkt im Diagramm rechts.


... durch Eingabe in ein Computer-Datenblatt (Excel, I)


... durch Eingabe in ein Computer-Datenblatt (Excel, II)

nicht alles muss immer stimmen ...


Δc(s) / Δt = ΔE / (ε x d x Δt) = v

Berechnung der vmax



Geschafft!


v

[S]

in diesem Bereich (= bei hoher Substrat-Konzentration) arbeitet man zur Bestimmung der Enzymmenge ...

Beispiel 2

Bestimmung der LactatdehydrogenaseAKTIVITÄT im Serum

bei verschiedenen Enzymmengen



Beispiel 2

v

[S]

... während man eine (relativ) große Enzymmenge einsetzt um Substratkonzentrationen zu bestimmen.



Experimentelle Vorbereitungen

1. Lösungen 2 bis 4 mischen 2. LDH Lösung zugeben 3. Abnahme der NADH Konzentration messen



k = ΔE / min

Aktivität (U/l) = ΔE / min x Konstante

Gemessen wird wieder die Abnahme der Extinktion pro Zeiteinheit, aber diesmal in Abhängigkeit von der Enzymmenge

Zusatz von LDH

wenig Enzym

viel Enzym


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