vol41-1

Comité Editor

Presidente: Carmen Gallo S., M.V., Ph.D. Jorge Toro Y., M.V., M.Sc., Ph.D. Gustavo Monti, M.V., Mg.Sc., Ph.D. Enrique Paredes H., M.V., Dr. med.vet.

Asistente Editorial: Claudia Cárdenas A., Ing. Agr.

ISSN 0301-732xISSN 0717-6201

Archivos de Medicina VeterinariaVOL. 41, Nº 1, 2009

Universidad Austral de ChileFacultad de Ciencias Veterinarias

Casilla 567 - Valdivia, Chile

Comité Editor Asesor

Arturo Ferreira, M.V., Ph.D. - Universidad de Chile, ChileCarmen Fuentealba, M.V., M.Sc., Ph.D. - University of Calgary, Canadá

Carlos Hermosilla, M.V., Dr. med.vet., DipEVPC - University of London, UKOscar Illanes, M.V., Ph.D. - University of Calgary, Canadá

Raúl Mainar, M.V., M.Sc., Dr. Vet., DipECVPH - Centro de Invest. y Tec. Agroalimentaria, España Claudia Muñoz-Zanzi, M.V., MPVM, Ph.D. - University of Minnesota, USA

Manuel Quezada, M.V., Dr. med.vet. - Universidad de Concepción, Chile Sergio Recabarren, Lic. Biología, M.Sc. - Universidad de Concepción, Chile

Gerhardt Schurig, M.V., Ph.D. - Virginia Tech, USAPedro Smith, M.V., M.Sc.- Universidad de Chile, Chile

Francisco Uzal, M.V., M.Sc., Ph.D., Dipl. ACVP - University of California Davis, USAGerdien van Schaik, M.Sc., Dipl Anim Sci, Ph.D. - Gezondheidsdienst voor Dieren, The Netherlands

VOLUMEN 41, Nº 1, 2009

CONTENIDOS

EDITORIAL ................................................................................................................................................................ V

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Adherencias abdominales postquirúrgicas en equinos: patofisiología, prevención y tratamiento. M Werner, JS Galecio, H Bustamante .......................................................................................................................... 1

ARTÍCULOS ORIGINALES

Prevalencia y distribución espacial de brucelosis, leucosis bovina, diarrea viral bovina y rinotraqueítis infecciosa bovina a partir del análisis ELISA de estanques prediales en lecherías de la IX Región, Chile.R Felmer, J Zúñiga, A López, H Miranda .................................................................................................................... 17

Efecto del grado de competencia por espacio de comedero en el consumo de materia seca y comportamiento del consumo de vacas lecheras.HF Elizalde, CS Mayne ............................................................................................................................................... 27

Uso de suplementación mineral con monensina sódica en corderas Pelibuey durante el crecimiento postdestete.AT Piñeiro-Vázquez, J Oliva-Hernández, JA Hinojosa-Cuéllar ................................................................................... 35

Impacto de la exposición prenatal a testosterona sobre parámetros biométricos y endocrinos en ovinos recién nacidos.SE Recabarren, PP Rojas-García, MP Recabarren, K Norambuena, T Sir-Petermann ............................................... 43

Evaluación de características clínicas y patológicas de 155 caninos con tumores mamarios: un estudio retrospectivo.BH Sontas, H Ozyogurtcu, A Gurel, H Ekici .............................................................................................................. 53

Estudio comparativo de la próstata en perros mediante ecografía transrectal y transabdominal.J Thibaut, J Santander, M Mieres ................................................................................................................................. 61

Salmo salar: morfología ultraestructural de la pared del corion en ovas normales y con problemas de eclosión.R Jaramillo, O Goicoechea, O Garrido, E Molinari .................................................................................................... 67

COMUNICACIONES

Frecuencia de comportamientos anormales estereotipados en caballos Chilenos estabulados.L Muñoz, J Torres, O Sepúlveda, C Rehhof, R Ortiz .................................................................................................. 73

Concentrados autólogos de plaquetas como tratamiento de lesiones de tejidos blandos del aparato locomotor en caballos.JU Carmona, M Prades, D Argüelles ........................................................................................................................... 77

Características citológicas del lavado bronqueoalveolar y respuesta inmune humoral frente a Aspergillus fumigatus en caballos Chilotes con obstrucción recurrente a las vías aéreas.G Morán, O Araya, A Ortloff, H Folch ........................................................................................................................ 83

Caracterización demográfica de la población de perros de Viña del Mar, Chile.MA Morales, C Varas, L Ibarra .................................................................................................................................... 89

VOLUME 41, Nº 1, 2009

CONTENTS

EDITORIAL ................................................................................................................................................................ V

REVIEW ARTICLE

Post-surgical abdominal adhesions in horses: pathophysiology, prevention and treatment.M Werner, JS Galecio, H Bustamante .......................................................................................................................... 1

ORIGINAL ARTICLES

Prevalence and space distribution of brucellosis, bovine leukaemia, bovine viral diarrhea and infectious bovine rhinotracheitis by using bulk milk ELISA test in dairy herds of the IX Region, Chile.R Felmer, J Zúñiga, A López, H Miranda .................................................................................................................... 17

The effect of degree of competition for feeding space on the silage dry matter intake and feeding behaviour of dairy cows.HF Elizalde, CS Mayne ............................................................................................................................................... 27

Use of mineral supplementation with monensin sodium in Pelibuey female lambs during the postweaning growth.AT Piñeiro-Vázquez, J Oliva-Hernández, JA Hinojosa-Cuéllar ................................................................................... 35

Impact of prenatal exposure to testosterone in biometrics and endocrine parameters of newborn lambs.SE Recabarren, PP Rojas-García, MP Recabarren, K Norambuena, T Sir-Petermann ............................................... 43

Evaluation of clinical and pathological characteristics of 155 canines with mammary tumours: a retrospective study.BH Sontas, H Ozyogurtcu, A Gurel, H Ekici .............................................................................................................. 53

Comparative study of the canine prostate using transrectal and transabdominal ultrasonographic techniques.J Thibaut, J Santander, M Mieres ................................................................................................................................. 61

Salmo salar: ultrastructural morphology of chorion, from normal and with hatching problems ova.R Jaramillo, O Goicoechea, O Garrido, E Molinari .................................................................................................... 67

COMMUNICATIONS

Frequency of stereotyped abnormal behaviour in stabled Chilean horses.L Muñoz, J Torres, O Sepúlveda, C Rehhof, R Ortiz .................................................................................................. 73

Autologous platelet concentrates as a treatment for soft tissue musculoskeletal lesions in horses.JU Carmona, M Prades, D Argüelles ........................................................................................................................... 77

Cytologic broncheoalveolar lavage findings and humoral immune response against Aspergillus fumigatus in Chilote horses with recurrent airway obstructions “heaves”.G Morán, O Araya, A Ortloff, H Folch ........................................................................................................................ 83

Demographic characterization of the dog population in Viña del Mar, Chile.MA Morales, C Varas, L Ibarra .................................................................................................................................... 89

Arch Med Vet 41, V (2009)

Editorial

En el ámbito científico, la calidad, velocidad y oportunidad con que ocurren las publi-caciones y su citación son cada vez más valoradas por los autores. Archivos de Medicina Veterinaria busca la calidad y eficiencia, para lo cual ha ido incorporando las características de las publicaciones científicas de mayor reconocimiento internacional.

Archivos de Medicina Veterinaria continúa optimizando sus procesos de edición, es así como ha logrado acortar los tiempos desde la recepción de los manuscritos hasta la disponibilidad para el lector. Para seguir avanzando, forma parte del proyecto de red de revistas ISI chilenas denominado eQuipu, lo que pronto permitirá la realización de todo el proceso editorial online (desde el envío por parte de los autores, hasta la prueba de galera). Esto permitirá apoyar el trabajo de los editores y mejorar la calidad de la revista mediante la adopción de los más altos estándares de la industria editorial.

Uno de los aspectos formales que ayuda a acortar los tiempos editoriales tiene que ver con el estilo, que se define en las instrucciones para autores. Vemos que una cantidad significativa de trabajos son enviados sin cumplirlos, lo que retrasa el proceso, por lo que esperamos que los nuevos trabajos sean enviados según el estilo definido, lo mismo que las indicaciones enviadas a los trabajos en procesos de arbitraje.

Finalmente, nos es grato anunciar que se ha formado un comité editorial asesor in-tegrado por prestigiosos y reconocidos expertos nacionales e internacionales de diversas áreas de las ciencias veterinarias, que nos asesorarán y ayudarán en diversos aspectos relacionados con la revista de manera de poder responder acertadamente a los nuevos desafíos que nos enfrentamos.

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Arch Med Vet 41, 1-15 (2009)

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Aceptado: 17.12.2008.

* [email protected]

Adherencias abdominales postquirúrgicas en equinos: patofisiología, prevención y tratamiento

Post-surgical abdominal adhesions in horses: pathophysiology, prevention and treatment

M Wernerb, JS Galecioa, H Bustamantea, b*

aInstituto de Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

bBiomedical and Veterinary Science Graduate Program, Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, USA.

SUMMARY

Despite the great number of human and veterinary medicine research, abdominal adhesions are still a big concern and a frequent complication for surgeons. The development of abdominal adhesions is a complex and dynamic process that involves a series of different mechanisms that start with an inflammatory process and tissue damage, followed by a fibrinogenic and fibrinolytic unbalance and ends with a change from fibrin deposit to fibrous tissue. In horses, after small intestine surgeries, adhesion incidence ranges from 14 to 22%. It is the most frequent cause of recurrent abdominal pain and the second cause for repeat celiotomy. Nevertheless, when all equine abdominal surgeries are included, the incidence of postoperative adhesions approximates 5%. A better understanding of the cellular mechanisms of adhesion formation and reformation should help to develop better prevention methods. Currently, a variety of prevention measures and treatments, most of them aiming to reduce or avoid adhesions formation, are used in veterinary medicine. The aim of this review is to gather most of the available information and the latest research explaining the pathophysiology, prevention and treatment of abdominal adhesions in horses.

Palabras clave: equinos, adherencias abdominales, postquirúrgicas.

Key words: equine, abdominal adhesions, post-surgical.

INTRODUCCIÓN

Las enfermedades gastrointestinales continúan siendo una de las mayores preocupaciones en la industria de los equinos y una gran proporción de caballos son derivados a centros quirúrgicos debido a desórdenes abdominales (Smith y col 2005). Estas patologías incluyen desórdenes de la motilidad y obstructivos, siendo comunes tanto en medicina humana como en medicina veterinaria. Estas alteraciones tienden a ser clínicamente importantes en ambas disciplinas, con un extensivo impacto en la práctica veterinaria así como también en la salud pública humana (Hudson y Dunlop 2005). Se ha descrito que la formación de adherencias es la causa más común de episodios repetidos de cólico luego de cirugías de intestino delgado en caballos y es la segunda causa más común de celiotomías repetidas en equinos después de cirugías de cólico por otras causas (Baxter y col 1989, Parker y col 1989, Baxter 1991, Mair y Edwards 2003). Estos estudios contrastan con Gorvy y col (2008), quienes no encontraron evidencia que sugiriera a partir del hecho de que las lesiones de intestino delgado o grueso en una primera cirugía lleven a la formación de adherencias. Adicionalmente, se detalla que posterior a

cirugías de intestino grueso el 36% de las adherencias produjeron obstrucción de intestino delgado. Varios estu-dios realizados en los últimos diez años describen que las adherencias postquirúrgicas se presentan entre un 6% y un 27% en equinos con obstrucción de intestino delgado o como un hallazgo de una segunda cirugía de abdomen (Freeman y col 2000, Mair y Smith 2005, Gorvy y col 2008).

En este sentido, estudios realizados previamente in-dican un 14% de adherencias postquirúrgicas (Phillips y Walmsley 1993); por otro lado, Baxter y col (1989) indican que un 22% de adherencias se presentan posterior a cirugías gastrointestinales, detallando además en su estudio que probablemente se haya subestimado la ocurrencia total de adherencias posterior a cirugías de intestino delgado, producto de que en equinos las adherencias intraabdomi-nales que involucran el intestino grueso, incluyendo el ciego, generalmente no llevan a signos clínicos de dolor abdominal. Por su parte, MacDonald y col (1989) estiman que la causa de muerte más común (26%) en casos de ci-rugías de intestino delgado es la formación de adherencias y episodios repetidos de cólico. Vachon y Fischer (1995) establecen en un 6% la formación de adherencias en casos en donde el intestino delgado se encarcela en el foramen epiploico. Sin embargo, el diseño de los distintos estudios es tan variado que hace inapropiada una comparación entre ellos (Gorvy y col 2008).

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M WERNER Y COL

Se ha mencionado una serie de factores de riesgo en la formación de adherencias; cualquier condición infla-matoria dentro de la cavidad peritoneal puede afectar el sistema que deposita y lisa la fibrina y de esa manera predisponer a la formación de adherencias fibrosas (Hay y Mueller 1998). Dentro de los factores que determinan la presentación de adherencias se encuentra el manejo de la técnica anastomótica de intestino (Southwood y col 1997). Al respecto, Sullins y col (1985) determinaron que la eversión de la mucosa aumenta la formación de adhe-rencias durante el período postoperatorio inicial. Otros factores que predisponen a la formación de adherencias son el íleo paralítico postquirúrgico y laparotomías repetidas (Parker y col 1989, Mair y Smith 2005). Por otra parte, Gorvy y col (2008) observaron que el riesgo de desarrollar adherencias disminuye cuando existe un aumento en el volumen globular aglomerado (VGA) y frecuencia cardiaca, lo que sugiere que la formación de adherencias no estaría relacionada con endotoxemia. En el mismo sentido, Collatos y col (1994) reportaron que eventos ocurridos en el sistema vascular no se ven reflejados en la cavidad peritoneal. Otra variable que podría relacionarse con la formación de adherencias son las proteínas totales, las cuales muestran una relación no lineal con el riesgo de formación de adherencias. Esto sugiere que una concentración óptima de proteínas plasmáticas de aproximadamente 63 g/L minimiza el riesgo de adherencias, con un incremento en el riesgo de presentación de ellas cuando las concentraciones son mayores o menores a lo reportado como normal para la especie (Gorvy y col 2008). Otro factor de riesgo es la edad de animal, sugiriéndose que los potrillos son más susceptibles de desarrollar adherencias (Lundin y col 1989). Cable y col (1997) estiman en su estudio que un 33% de los potrillos examinados después de la cirugía original presentaron evidencia de adherencias intraabdominales y un 16% presentó adherencias que causaron problemas clínicos. Además, Singer y Livesey (1997) indican que un 10% de muertes postoperatorias se debería a la formación de adherencias, valor de mortalidad menor al indicado para potrillos por Vatistas y col (1996), el cual sería de aproximadamente un 17%.

De manera interesante, cabe mencionar que las adhe-rencias abdominales se conocen por al menos 1.500 años, siendo descritas por Talmud en Babilonia en el 440 a.C. Algunos datos sugieren que los antiguos egipcios, conocidos por sus detalladas descripciones de la anatomía humana, habrían descrito la presentación de adherencias pélvicas siglos antes que esto. A partir de 1880, comienzan a apare-cer las primeras publicaciones sobre el uso de adyuvantes para la prevención de adherencias. Lo que sigue en los siguientes 100 años es una plétora de reportes científicos y anécdotas que describen el uso de fluidos amnióticos, rumen bovino, peritoneo de tiburón, vejiga de peces, humor vítreo de terneros, variadas gomas, lubricantes, fluidos, geles, polímeros, barreras físicas y una serie de métodos

de separación mecánica para prevenir las adherencias. El objeto de esta detallada descripción histórica es el de enfatizar que las adherencias son descritas desde hace mucho tiempo y los avances que se están haciendo son para entender la fisiología básica de su formación (Becker y Stucchi 2004).

Las membranas serosas de las cavidades peritoneal, pleural y pericárdica son derivaciones embriológicas similares y se encuentran recubiertas por una capa de células mesoteliales, las cuales se mantienen unidas a una membrana basal (Cheong y col 2001). La membrana peritoneal está compuesta por una monocapa de células mesoteliales de origen mesenquimal sobre una membrana basal continua anclada en el submesotelio (van der Wal y Jeekel 2007). Este último consiste en una matriz extrace-lular (MEC) compuesta de diferentes tipos de colágeno, glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos (Cheong y col 2001). Las células mesoteliales presentan una población homogénea con apariencia aplanada, esti-rada y escamosa o cuboidal (van der Wal y Jeekel 2007). La superficie luminal de las células mesoteliales presenta numerosos microvellos, los cuales aumentan la superficie funcional para el intercambio entre células mesoteliales y la cavidad peritoneal. Sin embargo, estos microvellos son estructuras lábiles y el número de éstos presentes en cada célula varía dependiendo de las condiciones fisio-lógicas y patológicas (Mutsaers y col 1996). Las células mesoteliales poseen además cilios en su superficie apical, los cuales son cinco veces más largos que los microvellos adyacentes; la cantidad de cilios en la superficie mesotelial aumenta con incrementos en la densidad celular, lo cual sugiere que ellos juegan un rol esencial en la polaridad de las células mesoteliales y en la adhesión célula-célula (van der Wal y Jeekel 2007). Clásicamente, las funciones primarias atribuidas al mesotelio son proveer una barrera de protección e interfase sin fricción para movimientos libres de aposición de órganos y tejidos. Recientemente, se ha descubierto que este tejido juega un rol en el transporte de fluidos y células, iniciación y resolución del proceso inflamatorio, reparación tisular, lisis de depósitos de fibrina y protección contra microorganismos invasores y, posiblemente, diseminación de tumores (Mutsaers 2002, 2004). La parte intermedia y visceral de las membranas serosas no sólo provee de un mecanismo de suspensión elástico y adaptable, sino que también forma un lecho para estructuras sanguíneas, linfáticas y nerviosas, las que proporcionan vascularización e inervación, encontrándose estas estructuras en el espacio subseroso (Cheong y col 2001, Foley-Comer y col 2002). La superficie libre de las membranas serosas es lisa y está lubricada por una pe-queña cantidad de líquido seroso; de aquí que las vísceras se puedan deslizar sobre la pared de las cavidades o unas sobre otras, con la menor cantidad posible de fricción (Didio 1994). La difusión y reabsorción del fluido ocurre libremente a través del mesotelio y estroma submesotelial (Cheong y col 2001).

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EQUINOS, ADHERENCIAS ABDOMINALES, POSTQUIRÚRGICAS

El peritoneo que recubre el interior del abdomen está compuesto por tejido conectivo bajo una capa simple de células mesoteliales, separado por una membrana basal. Estas capas proveen un soporte externo a la capa muscular del intestino y mantienen una capa lubricada en la superficie serosa (Eggleston y Mueller 2003). En equinos, el líquido peritoneal es un transudado simple y de poco volumen, el cual es producido por el peritoneo semipermeable. Aproximadamente 60 ml de líquido peri-toneal son producidos por hora, pero la cavidad peritoneal normalmente contiene sólo una pequeña cantidad de este líquido (Browning 2005). El líquido peritoneal normalmente contiene muchas de las proteínas plasmáticas, dentro de las cuales el fibrinógeno interviene durante el proceso inflamatorio intraperitoneal, especialmente en el período intra y postoperatorio, en donde se forman las adheren-cias (Duron 2007). De acuerdo a Hanson y col (1992), el líquido peritoneal refleja el estado patofisiológico de las superficies mesoteliales parietales y viscerales, por lo cual manipulaciones adicionales del peritoneo asociadas a resección y anastomosis de dos segmentos de intestino tendrían pequeñas consecuencias comparado con el trauma inducido en una celiotomía exploratoria. El peritoneo se invierte sobre sí mismo para formar dos estructuras, el omento y el mesenterio, los cuales contienen una gran cantidad de vasos linfáticos y sanguíneos. En mamíferos machos, forman un espacio cerrado, mientras que en hembras existe una potencial comunicación al exterior vía cuernos uterinos. El peritoneo parietal se encuentra inervado por ramas de nervios espinales y contiene noci-ceptores térmicos, químicos y mecánicos (Duron 2007), los cuales son capaces de procesar estímulos dolorosos agudos localizados (Hollinshead 1953, Browning 2005). El peritoneo visceral, en contraste, está inervado por aferentes simpatéticos y reacciona a estímulos producidos por dis-tensión, estiramiento, isquemia e inflamación (Browning 2005). Las adherencias se encuentran bien vascularizadas, independiente de su madurez, ubicación o patología in-traperitoneal. Las fibras nerviosas, consistentes en axones mielínicos y amielínicos, son comunes de encontrar en las adherencias. El rol de las adherencias en la etiología del dolor abdominal es aún controversial, pero la presencia de fibras nerviosas dentro de éstas sostiene la teoría de que ellas son capaces de conducir estímulos nociceptivos (Herrick y col 2000).

La mayoría de los eventos patofisiológicos relaciona-dos con el desarrollo de las adherencias intraabdominales se encuentran poco descritos para la especie equina en particular; debido a esta razón la mayor parte de la in-formación presentada a continuación hace referencia a diversos estudios, principalmente llevados a cabo tanto in vitro como in vivo en animales de experimentación y humanos. Estos resultados son extrapolados a la especie equina de la mejor forma posible de acuerdo a lo reportado por la literatura científica veterinaria para dicha especie (Fubini 1990, White 1993, Mueller 2002).

PATOFISIOLOGÍA

Las adherencias son bandas de material fibrinoso que se originan en la superficie de una membrana serosa y forman una conexión con una superficie opuesta (Semrad 1999); se clasifican básicamente en adherencias de tipo inflamatorio y postquirúrgicas. Las adherencias infla-matorias se presentan después de procesos inflamatorios intraabdominales. En cambio, las adherencias postqui-rúrgicas son la consecuencia resultante de un daño a la superficie tisular, que posterior a incisiones, cauterización, sutura u otras formas de trauma se fusionan para formar tejido cicatrizal (Liakakos y col 2001). No obstante, las adherencias pueden ser beneficiosas debido a su habilidad de proveer una fuente adicional de sangre a la serosa o intestino isquémico (Baxter 1991). Igualmente, adherencias perianastomóticas pueden prevenir fugas desde las líneas de sutura y aislar desechos inflamatorios, previniendo así una peritonitis generalizada (Mueller y col 2000b).

Diversas alteraciones inflamatorias del mesotelio peri-toneal promueven el proceso de formación de adherencias a través del inicio de un estado procoagulativo inmediato, caracterizado por la secreción de exudado serofibrinoso y deposición de fibrina (Ellies 1962, Holmdahl 1997). La formación de adherencias finalmente es el resultado de un desbalance entre los procesos de fibrinogénesis y fibrinólisis. La prevalencia de una de éstas sobre la otra produce la variabilidad de la respuesta a adherencias por parte de diferentes pacientes (Di Filippo y col 2006). Durante una cirugía, el daño mesotelial inicial expone una superficie limpia y acelular que sirve como nido para la formación de adherencias del tipo tejido-tejido. Este daño y la ruptura de la matriz submesotelial ocurren junto con la activación de la cascada de la coagulación y la deposición de fibrina en el sitio dañado (Boland y Weigel 2006). Las injurias quirúrgicas del tejido reducen o eliminan el flujo sanguíneo, produciendo isquemia, lo cual lleva a la persistencia de la matriz de fibrina, siendo gradualmente reemplazada por tejido de granulación, el cual atrae la presencia de macrófagos, fibroblastos y células gigantes. Durante este proceso el tejido de granu-lación se caracteriza por poseer variables cantidades de eritrocitos separados por bandas o masas condensadas de fibrina, las cuales se encuentran cubiertas con dos o tres capas de células aplanadas que contienen un infil-trado de células mononucleares (diZerega y Campeau 2001). El mecanismo involucrado en la regeneración mesotelial es controversial y muchas hipótesis se han propuesto para el origen de las células del mesotelio en regeneración (Foley-Comer y col 2002). Actualmente, Duron (2007) señala que se manejan cuatro hipótesis al respecto, las cuales son: a) crecimiento de células periféricas, b) transformación de células mesenquimales totipotenciales subyacentes o células perivasculares en el mesotelio, c) trasplante de células mesoteliales pro-venientes del mesotelio de estructuras adyacentes o de

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M WERNER Y COL

células mesoteliales de libre flotación y d) transformación de células del líquido peritoneal.

Se ha establecido experimentalmente que el daño en el tejido peritoneal produce una reducción en la capacidad fibrinolítica y como consecuencia la formación de adhe-rencias intraabdominales (Thompson 1998). Este sistema fibrinolítico extravascular, independiente de la circulación de la cavidad peritoneal, difiere del sistema fibrinolítico plasmático, en donde un tipo celular (células endoteliales vasculares) secreta un activador de plasminógeno tipo tejido (t-PA) y otros tipos celulares (hepatocitos, células endoteliales y células de Küpffer) son responsables de la depuración de t-PA desde la circulación sanguínea (Sitter y col 1999).

Una gran variedad de estímulos inflamatorios pueden resultar en daño peritoneal, lo cual se ha asociado a cam-bios histopatológicos que demuestran una clara secuencia de eventos desde el daño a la formación de adherencias (Thompson 1998). La injuria peritoneal quirúrgica, pro-cesos inflamatorios o isquémicos llevan a una sustancial disminución del flujo sanguíneo y al crecimiento patoló-gico de vasos sanguíneos (Cheong y col 2001), además causa la descamación de células mesoteliales, dejando un área desnuda (van der Wal y Jeekel 2007); esta fase coincide con un aumento en la permeabilidad de los vasos (Duron 2007), lo que lleva a la liberación de células y exudado inflamatorio, el cual es organizado. La invasión de fibroblastos es seguida por deposición de colágeno y formación de tejido fibroso permanente. El organismo, igualmente, posee mecanismos que contrarrestan esta deposición de fibrina, ya que las superficies mesoteliales, tales como el peritoneo, poseen actividad fibrinolítica, la cual, de no ser dañada, produce lisis de fibrina dentro del exudado inflamatorio antes de que este último se organice (Thompson 1998). Las células mesoteliales son células metabólicamente activas que participan en la inflamación serosa a través de la secreción de varios mediadores pro, anti e inmunomoduladores, dentro de los cuales se pueden incluir prostaglandinas y prostaciclinas, quemoquinas, óxido nítrico (ON), especies nitrógeno y oxígeno reactivas, enzimas antioxidantes, citoquinas, factores de crecimien-to, matriz extracelular (MEC), moléculas y productos de la cascada de la coagulación (Mutsaers 2002). Cultivos celulares mesoteliales humanos han demostrado producir grandes cantidades de activador de plasminógeno (PA), tipo tejido (t-PA) y tipo uroquinasa (u-PA), así como tam-bién su inhibidor específico, el inhibidor del activador de plasminógeno tipo 1 (PAI-1). Se reporta que las células mesoteliales no sólo sintetizan activamente PA, sino que también internalizan y degradan eficientemente t-PA y u-PA vía endocitosis mediada por receptores (Sitter y col 1999).

El funcionamiento del sistema fibrinolítico tiene como base la conversión de una proenzima, el plasminógeno, a su enzima proteolíticamente activa, la plasmina, capaz de degradar el coágulo de fibrina. La transformación de

plasminógeno en plasmina activa se produce mediante la acción proteolítica de dos enzimas activadoras de plasminó-geno (PA), denominadas respectivamente activador tisular de plasminógeno (t-PA) y activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (u-PA) (Hellebrekers y col 2000, Cheong y col 2001, Mutsaers 2002, Gilabert 2005). Se cree que el t-PA es responsable primariamente de la remoción de fibrina dentro de la vasculatura a través de su específica afinidad por la fibrina. Alternativamente, u-PA se une a receptores celulares y ha sido tradicionalmente asociado con proteólisis pericelular vía degradación de componentes de la matriz celular y activación de proteasas latentes y factores de crecimiento en sitios extravasculares (Sulaiman y col 2002). A esta tendencia profibrinolítica se opone una antifibrinolítica, la cual está mediada por la acción de los inhibidores naturales de los PA, los cuales se denominan inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) y tipo 2 (PAI-2). Existe un tercer inhibidor denominado inicialmente PAI-3 y que más tarde fue identificado como uno de los inhibidores de la proteína C reactiva en su forma activada (Hellebrekers y col 2000, Cheong y col 2001, Mutsaers 2002, Gilabert 2005, Renckens y col 2005). Se ha sugerido que los componentes del sistema plasmina, particularmente PAI-1, pueden ser usados como marcadores tisulares de la propensión a desarrollar adherencias postqui-rúrgicas, por lo que podría ser un potencial identificador de pacientes de alto riesgo (Di Filippo y col 2006). El inhibidor de PA tipo-2 (PAI-2), a diferencia de PAI-1, no es detectable en plasma y por lo tanto PAI-1 es reconocido como el mayor inhibidor sistémico de fibrinólisis (Ritchie y Booth 1998). Por otro lado, PAI-2 ha sido detectado en epidermis, tejido inflamado y placenta, siendo los tipos celulares que expresan PAI-2 queratinocitos, monocitos y trofoblastos respectivamente. Además, otros tipos ce-lulares expresan PAI-2, incluyendo células endoteliales, células de músculo liso, fibroblastos y muchas líneas celulares transformadas. La ubicación de PAI-2 parece ser específica del tipo celular y las células endoteliales y fibroblastos mantienen PAI-2 casi exclusivamente como molécula intracelular, en cambio los monocitos tienen ambas PAI-2, intracelular y secretoria. La doble ubicación de PAI-2 refleja diferentes funciones en ambos sitios. PAI-2 secretada por monocitos modula eficientemente la migración de células mediada por u-PA, a diferencia de PAI-2 intracelular que ha demostrado prevenir la apoptosis celular (Ritchie y col 1999).

El principal PA en el peritoneo es t-PA, el cual es in-hibido cuando se forma un complejo 1:1 con inhibidor de PA PAI-1. El trauma quirúrgico ha demostrado deteriorar la actividad fibrinolítica peritoneal a través de la reducción de la actividad de PA y/o aumentar la actividad de PAI-1 y PAI-2, siendo estas sustancias encontradas sólo en peritoneo inflamado (Holmdahl 1997, Wang y col 2003, Reed y col 2004, Memisoglu y col 2006, Polubinska y col 2006). El tiempo que toman los cambios fibrinolíticos, posterior a un daño quirúrgico, en pacientes sin inflamación peritoneal

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preexistente, ha sido analizado usando drenajes de líquido peritoneal, encontrándose que éste rápidamente pierde actividad del PA y esta pérdida de actividad se encuentra asociada a una detección de altos niveles de PAI-1 y 2 (Thompson 1998).

La actividad fibrinolítica es t-PA dependiente y su pérdida es el resultado de la producción de PAI-1 y 2 por el tejido mesotelial y submesotelial. Esta producción de PAIs parece ser el resultado del estímulo de citoquinas proinflamatorias de células mesoteliales y mediadores tales como lipopolisacáridos (LPS), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e interleuquin-1 (IL-1), además de mediadores fibrogénicos, tales como factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) y trombina (Thompson 1998, Sitter y col 1999, Mutsaers 2002). En el peritoneo normal y en reparación, un diverso grupo de factores de crecimiento son la llave determinante en la composición de la MEC, y muchas de estas proteínas, tales como TGF-β, factor de crecimiento epitelial (EGF), factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), se encuentran implicadas en la formación de adherencias. La actividad coordinada de estos factores de crecimiento y moléculas bioactivas es responsable de la capacidad metabólica y proliferativa de las células fibroblásticas durante la formación de las adherencias y, por lo tanto, son un blanco atractivo para intervenciones terapéuticas (Cahill y col 2006, Boland y Weigel 2006). Holmdahl (1997) determinó en su estudio la expresión diferencial de PA y PAI tanto en mesotelio como submesotelio peritoneal. En el mesotelio normal, t-PA, u-PA y PAI-1 se encontraron presentes, a diferencia del submesotelio, donde sólo se encontró PAI-1 y u-PA pero no t-PA. En peritoneo inflamado, la expresión de t-PA en el mesotelio se encontró sustancialmente reducida, mientras que la expresión de PAI-1 en el submesotelio estuvo intensifi-cada. La expresión de t-PA en el mesotelio pero no en el submesotelio sugiere que t-PA es el responsable de la depuración de fibrina en la cavidad peritoneal. Estudios que prueban el efecto terapéutico de t-PA en la formación de adherencias postoperatorias han demostrado que la administración de éste en la cavidad peritoneal durante el período postoperatorio disminuye la formación de adherencias (Boland y Weigel 2006). Igualmente, en es-tudios experimentales en ratas se ha descrito un aumento en la síntesis intraperitoneal de t-PA durante los días posteriores a la cirugía, lo cual fue interpretado como una reacción compensatoria para aumentar la deposición de fibrina (Polubinska y col 2006). Esto, debido a que en la cavidad abdominal t-PA sería responsable del 95% de la conversión de plasminógeno (Holmdahl y col 1997); sin embargo, cirugías intraabdominales perturban el balance entre t-PA y PAI-1, lo que lleva a una disminución en la actividad fibrinolítica, a un aumento en el exudado fibrinoso y eventualmente a un aumento en la formación de adherencias (Scott-Coombes y col 1995).

La actividad fibrinolítica peritoneal y la formación de adherencias postoperatorias pueden estar reguladas, en parte, por la sustancia proinflamatoria peptídica P (SP) (Hökfelt y col 2001). Esta SP es un neuropéptido, neuro-transmisor, neuromodulador y posee funciones endocrinas; además se le ha implicado en reacciones inflamatorias. SP es conocida por jugar un importante rol en el proceso de inflamación, proliferación y reparación de heridas. Los efectos conocidos de SP van desde favorecer la trans-cripción de ácido ribonucleico mensajero (mRNA) para favorecer la síntesis de citoquinas proinflamatorias hasta estimular la angiogénesis y proliferación de fibroblastos (Reed y col 2002). Las estructuras neuronales son la fuente primaria de SP, pero linfocitos (Lai y col 1998), monocitos, macrófagos (Ho y col 1997) y eosinófilos (Metwali y col 1994) han sido identificados como fuentes adicionales. La SP se encuentra en líquido peritoneal (Sanfilippo y col 1992) y neuronas sensitivas que contienen SP han sido encontradas en adherencias peritoneales (Sulaiman y col 2001). La multiplicidad de funciones y localizaciones celulares documentadas de SP sugiere un significativo rol en la formación de adherencias (Reed y col 2002). El hecho de que las adherencias se encuentren inervadas con neuronas sensitivas que contienen SP sugiere que son capaces de generar estímulos dolorosos y con esto favorecer el dolor visceral asociado a las adherencias (Becker y Stucchi 2004).

La distinción entre reparación peritoneal normal y formación de adherencias recae en el balance entre la de-posición y degradación de fibrina. Se ha hipotetizado que la actividad fibrinolítica peritoneal juega un importante rol en la formación de adherencias. Si la fibrinólisis local es adecuada, las adherencias fibrinosas son lisadas llevando a una restauración normal del tejido. Sin embargo, si la fibrinólisis es insuficiente, la fibrina persistente se infiltra de fibroblastos y capilares llevando a adherencias fibrosas permanentes (Mueller 2002).

La reparación peritoneal difiere de la reparación de la piel. La reepitelización de la piel ocurre a través de pro-liferación de células epiteliales desde la periferia hacia el centro de la herida. En contraste, el peritoneo se mesoteliza, independiente del tamaño del daño, con nuevo mesotelio desarrollado a partir de islas de células mesoteliales, las cuales proliferan en capas celulares (Liakakos y col 2001). De manera interesante, cabe mencionar que, en el abdomen, la velocidad de reperitonealización es igual (7-10 días) independiente del tamaño inicial del daño; no se encuentra limitado el grado de migración de células desde la periferia (Boland y Weigel 2006). Leucocitos peritoneales, células mesoteliales y macrófagos son importantes componentes celulares en la reparación peritoneal. Este proceso está caracterizado por infiltración celular y una respuesta de crecimiento por parte de las células mesoteliales en el área dañada. En respuesta al daño inicial, las células residentes del peritoneo tales como macrófagos y células mesotelia-les producen mediadores celulares, los cuales sirven para

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modular y ordenar la subsecuente respuesta de las otras células involucradas en la respuesta inflamatoria (Cheong y col 2001). Las células mesoteliales secretan interleuquín 1 (IL-1), 6 (IL-6), 8 (IL-8), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y factor de crecimiento transformante (TGF)-β al ser estimuladas in vitro, además de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y miembros de la familia de factores de crecimiento endotelial (EGF) regulando este proceso (Cheong y col 2001, Mutsaers 2002).

En gran parte del proceso de reparación de heridas (incluidas aquellas en la cavidad peritoneal), la primera fase iniciada por el daño del tejido lleva a la activación de la cascada de la coagulación. La respuesta vascular primaria al daño directo es la vasoconstricción, la cual es una respuesta local vasoactiva. El corto período de vasoconstricción es seguido por vasodilatación y pérdida de tono, permitiendo que factores sanguíneos entren en la herida. Las células invasoras son llevadas por gradiente de quimiotácticos y cambios bioquímicos en el ambiente local, mientras que el ambiente mismo es modificado por varios factores solubles circulantes que se encuentran disponibles en el sitio del daño (Boland y Weigel 2006). Las primeras células en aparecer en el peritoneo dañado son mayormente neutrófilos polimorfonucleares (PMN), los cuales persisten por 1-2 días. Esto es seguido por monocitos, los cuales se diferencian posteriormente en macrófagos que se adhieren a la superficie de la herida peritoneal (DiZerega 1990, DiZerega y Campeau 2001). Se ha demostrado también que el aumento de macrófagos disminuye marcadamente la formación de adherencias postoperatorias. Adicionalmente, se ha reportado que la inhibición en la capacidad de adherencia de los PMN resulta en un aumento en la formación de adherencias (Vural y col 1999).

Las plaquetas son un importante componente del exu-dado inflamatorio en el momento inicial del daño tisular. Poseen la habilidad de adherirse a los sitios de unión de la matriz extracelular (MEC). Las plaquetas provienen de megacariocitos de la médula ósea y contienen varios tipos de gránulos que liberan proteínas bioactivas en el sitio del daño. En la degranulación de las plaquetas, los gránulos alfa liberan factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y TGF-β, mientras que los cuerpos densos liberan epinefrina y serotonina, contribuyendo a la producción de prostaglandinas y leucotrienos. En el peritoneo existen una serie de vías que llevan a deposición de fibrina posterior a la injuria; sin embargo, mucha de esta fibrina proviene de la deposición y degranulación de plaquetas. La fibrina depositada actúa como un puente o andamio provisional que facilita la conexión entre las superficies superpuestas. Se cree que esta acción de puente forma la arquitectura inicial de la subsecuente formación de adherencias (Boland y Weigel 2006). Para prevenir este proceso, la actividad fibrinolítica lisa y remueve los depósitos de fibrina intra-peritoneal; además, es bien conocido que los macrófagos

secretan activador de plasminógeno y al ser las células más comunes del líquido peritoneal exudativo, proveen la mayor fuente de esta enzima (Ar’Rajab y col 1995).

A partir del tercer día, las células mesoteliales comien-zan a cubrir los macrófagos peritoneales de la superficie de la herida y éstos van quedando cada vez más profundos en la herida. En el día 4-7, las células predominantes en la superficie del peritoneo son células mesoteliales. Después del día 5 postquirúrgico, el mayor tipo celular en el líquido peritoneal son los macrófagos, pero comienzan a declinar en número (DiZerega 1990). En el día 5, las adherencias están pobladas mayormente por racimos de fibroblastos organizados con canales vasculares endoteliales lineales detectables y la matriz extracelular comienza a hacerse más densa y mejor organizada. Por lo tanto, al día 5 el rol local de las células inflamatorias en dirigir y/o modular la formación de adherencias disminuye y los fibroblastos son ahora el tipo celular primario. Estas células son similares a los miofibroblastos encontrados en heridas en otras áreas y expresan marcadores tales como actina muscular lisa alfa (α-SMA) (Boland y Weigel 2006). Luego, estas células mesoteliales proliferan a través de la base de la herida y forman múltiples islas de células. La confluencia de estas islas de células permite que grandes heridas reparen en el mismo tiempo que una de menor tamaño. Esta forma de reparación contrasta con la de la piel en donde la reparación comienza desde los bordes de la herida, es por esto que las grandes lesiones demoran más en sanar que las pequeñas (DiZerega 1990, DiZerega y Campeau 2001). Foley-Comer y col (2002) pudieron demostrar que las células mesoteliales de libre flotación son el origen del mesotelio en regenera-ción, requiriendo del reclutamiento de células inflamatorias hacia la superficie de la herida y la liberación de citoquinas mitogénicas que activen y estimulen la proliferación de células mesoteliales que rodean la herida. Estas células mesoteliales activadas rompen su contacto célula-célula y migran a la superficie de la herida.

PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO

Acorde con Mueller (2002), el énfasis debe ser la prevención de la formación de adherencias, ya que el tra-tamiento después de formadas es complicado y costoso, asociado además a una alta morbilidad y mortalidad de los pacientes. La prevención en la formación de adherencias durante una cirugía exige reducir el trauma quirúrgico y evitar la contaminación de la cavidad abdominal con materiales extraños (Vrijland y col 2002). Sin embargo, el método más efectivo para prevenir las adherencias es una técnica quirúrgica excelente que minimice la inflamación peritoneal (Hay y col 2001). Esto coincide plenamente con Gorvy y col (2008), quienes señalan que el trauma quirúrgico es el estímulo más importante en la formación de adherencias, por lo tanto el manejo estricto de los principios de cirugía moderna de Halsted, inclu-yendo un manejo atraumático de los tejidos, hemostasis

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meticulosa, minimizar la contaminación del tejido por exposición a bacterias de la mucosa, minimizar la exposi-ción a material extraño y disminuir el tiempo de la cirugía son esenciales para reducir la formación de adherencias postoperatorias (Mueller 2002). Estudios en ratones y humanos han demostrado que el talco de almidón usado en guantes quirúrgicos induce inflamación peritoneal y aumenta significativamente la formación de adherencias de una manera dependiente de la dosis (Chegini y Rong 1999, Sjösten y col 2004). Los objetivos primarios en la prevención de adherencias son los siguientes: a) minimizar la inflamación de la serosa, b) minimizar la producción de fibrina, c) estimular una motilidad intestinal adecuada y d) separar las superficies cubiertas por fibrina mecánicamente (Mueller y col 1998).

Las investigaciones acerca de la prevención y trata-miento de las adherencias postoperatorias se han focalizado en mejorar las técnicas quirúrgicas (Gorvy y col 2008), administración sistémica de fármacos antiinflamatorios no esteroidales (AINES) (White 1993), dimetil sulfóxido (DMSO) (Sullins y col 1991), antimicrobianos (White 1993), administración de heparina (Parker y col 1987), lavados peritoneales (Valdez y Wallace 1980, Hague y col 1998), administración intraperitoneal de soluciones de alto peso molecular y omentectomía (Baxter 1991, Murphy y col 2002), así como también la utilización de biomateriales naturales como peritoneo, omento, amnios, gelatina, colágeno y ácido hialurónico en ratas y conejos (Young y col 1991, Edwards y col 1997, Hellebrekers y col 2000, Matsuda y col 2002, Liu y col 2007). Sin em-bargo, los agentes terapéuticos que promueven la actividad fibrinolítica para prevenir la formación de adherencias deben ser usados durante la cirugía o posterior a ella; de acuerdo con Hellebrekers y col (2000), el tratamiento con estos promotores por 24 a 36 hrs previno la formación de adherencias postquirúrgicas en un modelo murino.

Terapia analgésica. El grupo de analgésicos más utilizados para el tratamiento del dolor en patologías quirúrgicas y no quirúrgicas en equinos es el de los antiinflamatorios no esteroidales (AINES) (White 1999), sustancias diferentes a los esteroides que inhiben ciertas etapas y componentes de la cascada de la inflamación (Moses y Bertone 2002). De acuerdo a Hall y col (2001), son ampliamente usados en equinos para proveer analgesia en dolor agudo, debido a su acción antiinflamatoria, antiendotóxica y por además proveer analgesia en casos de dolor crónico. Los AINES difieren tremendamente en potencia y eficacia dependiendo del tipo de dolor e inflamación presentes, siendo lo más importante el realizar una adecuada selección clínica del fármaco a utilizar basándose en la sintomatología y ob-jetivo clínico deseado (Clark y Clark 1999). Los AINES además pueden ser utilizados como agentes profilácticos en contra de la formación de adherencias por su habilidad de suprimir la respuesta inflamatoria fibroproliferativa, aumentar la capacidad fagocítica y la actividad fibrinolítica

de macrófagos, así como reducir y mejorar la organización de fibrina (Semrad 1999). El resultado final depende de la severidad de la lesión, tiempo y cantidad de fármacos administrados y de cada paciente en forma individual (Sullins 1990).

El flunixin meglumine es, por lejos, el AINE más efectivo y más utilizado para tratar dolor visceral en caballos. Este fármaco ha demostrado aliviar cólicos experimentales dentro de los diez minutos posteriores a su administración endovenosa, proveyendo de una a ocho horas de analgesia (Morris 1988, Clark y Clark 1999). Sin embargo, estudios desarrollados en equinos han revelado que la administración de flunixin meglumine en dosis de 1,1 mg/kg retarda la recuperación de la función de la barrera intestinal del yeyuno isquémico y dañado (medido in vitro utilizando parámetros como resistencia eléctrica transmucosa y comparado con hallazgos en tejido no tra-tado) (Blikslager y col 1997, Campbell y Blikslager 2000, Tomlinson y col 2004). Asociado a esto, algunos AINES también pueden contribuir al daño isquémico durante la reperfusión tisular a través de la disminución del flujo sanguíneo local causado por la menor producción de PG (Tomlinson y Blikslager 2003).

Little y col (2007) reportan en su estudio de meloxicam, un AINE con mayor afinidad por ciclooxigenasa 2 (COX-2), que su administración no afecta la recuperación del yeyuno dañado e isquémico, lo que, de acuerdo a los autores, podría deberse a que este fármaco, al no inhibir masivamente la enzima ciclooxigenasa 1 (COX-1), permite su suficiente actividad asociada a procesos de reparación, mediada por prostaglandinas (PG). Esta reparación de la función de ba-rrera intestinal, inhibiendo los efectos perjudiciales de las PG, elaboradas por COX-2, además de los signos clínicos de endotoxemia y dolor, hace que su uso sea considerado por los autores como una buena alternativa al flunixin meglumine en equinos ya que provee un adecuado nivel de analgesia, efectos benéficos sobre variables clínicas, además de permitir la recuperación intestinal.

Lavados peritoneales. El peritoneo, especialmente su por-ción visceral, es una barrera semipermeable con difusión bidireccional de agua y solutos. Las soluciones adminis-tradas en la cavidad peritoneal rápidamente se equilibran con el plasma. Consecuentemente, la administración de fármacos intraperitoneales tiene una absorción similar a la administración intramuscular (Bowman 1990).

Con objeto de reducir el riesgo de peritonitis bacteriana, los lavados peritoneales o lavados locales de una porción intervenida quirúrgicamente son realizados posterior a in-tervención quirúrgica del tracto gastrointestinal (Schneider y col 1988). Los beneficios del lavado peritoneal se pueden atribuir a eliminación de sangre acumulada en la cavidad peritoneal, reducción del número de bacterias, remoción de toxinas y enzimas bacterianas en un área de gran absorción, remoción de materiales extraños (Valdez y Wallace 1980), además de la remoción física de fibrina desde las superficies

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serosas, separación de las asas intestinales y remoción de mediadores inflamatorios (Hague y col 1998).

Los lavados intraabdominales postquirúrgicos han demostrado minimizar la incidencia de adherencias en abrasión de serosa experimental en caballos. La técnica descrita consiste en la infusión de aproximadamente 10 L de suero Ringer lactato tibio en el abdomen a través de un catéter fenestrado 32F puesto en el abdomen ventral derecho previo al acto quirúrgico. El lavado se realiza a las 12, 24 y 36 horas posteriores a la cirugía y luego el catéter es removido (Hague y col 1998).

Los anticoagulantes, en especial heparina, han sido los agentes más investigados para la prevención de adherencias, administrados tanto por vía peritoneal como sistémica (Gupta y Jain 1985, Türkçapar y col 1995, Arikan y col 2005). La heparina es un proteoglicano natural y ha sido descrito como un reductor en la formación de adherencias en modelos de isquemia-reperfusión en ponies (Parker y col 1987). La heparina actúa como un cofactor de antitrombina III para aumentar el grado de antitrombina II, inactivando el factor de coagulación serina proteasa. El resultado es la disminución en la producción de trombina, la cual es la responsable de la conversión de fibrinógeno en fibrina y finalmente de las adherencias fibrosas. Es por esto que la heparina realza la fibrinólisis a través del estímulo de la actividad del PA (Eggleston y Mueller 2003). Igualmente, el efecto de disminución en la formación de adherencias de la heparina de bajo peso molecular puede explicarse por los diferentes mecanismos de acción de la molécula de heparina, la cual al formar el complejo con antitrombina III in vivo previene la formación de trombina, además de aumentar la degradación de trombina (Rosenberg y Damus 1973).

Además la heparina posiblemente estimula la secreción de activador de plasminógeno (PA) por parte de macró-fagos (Markwardt y Klocking 1977) y también estimula directamente la actividad de PA, por lo tanto, aumenta la acción de plasminógeno (Orita y col 1986). De acuerdo a esto, la deposición de fibrina durante la segunda fase de la formación de adherencias disminuye, lo que resulta en una menor formación de adherencias (Arikan y col 2005). Sin embargo, Sullins y col (2004) establecen en su estudio en potrillos que el rol de la heparina en la prevención de inflamación serosa inducida por isquemia es limitado, ya que los segmentos de intestino delgado tratados con heparina desarrollaron fibrosis aumentada y el mesotelio no regeneró, lo que indicaría que la respuesta inflamatoria no mejora o que el exudado de fibrina aumentó en los segmentos experimentales, los cuales después se organizaron en tejido fibroso, el cual obstaculiza la migración de nuevas células mesoteliales. De igual forma, la heparina ha demostrado ser útil en presencia de sepsis por dos razones, la primera es que hay una directa actividad antibacteriana in vitro de mecanismo desconocido (Rosett y Hodges 1980) y la segunda es que disminuciones en la formación de fibrina resultan en menor formación de abscesos y adherencias,

previniendo el secuestro y aumento de eliminación de microorganismos en perros y ratas (Hau y Simmons 1976, Hau y col 1979, Vela y col 1999). Las dosis recomenda-das en equinos y la(s) vía(s) de administración continúan siendo controversiales. Dosificaciones sistémicas de 20 a 100 UI/kg cada 6 a 12 horas, por 48 a 72 horas en el pe-ríodo postoperatorio, han sido usadas incluso para lavados peritoneales (Mueller 2002).

Ya en 1940, Lehman y Boys detallan que la instilación de heparina en la cavidad peritoneal en perros y conejos era efectiva en la prevención de formación y reformación de adherencias. Sin embargo, Bloor y col (1947) establecen en su estudio que al ser administrada en dosis elevadas no previene la formación o reformación de adherencias intraperitoneales o la deposición de fibrina en la super-ficie de apéndices en conejos. En modelos de peritonitis en diversos roedores, pequeñas dosis de heparina han demostrado disminuir la incidencia en la formación de adherencias, aumentar la supervivencia y la tasa de eli-minación de fibrinógeno intraabdominal (O’Leary y col 1988). Bahadir y col (2007) concluyen de su estudio en ratones que el uso de heparina en dosis bajas contribuye a reducir la incidencia de adherencias; sin embargo, señalan que es necesario realizar más estudios para co-nocer la dosis óptima y evitar así disminuir la severidad de las adherencias, además de hemorragias abdominales. En equinos, ante el riesgo de formación de adherencias, Mueller (2002) señala que la administración de 30.000 UI de heparina diluida en 4 litros de suero Ringer lactato en el abdomen antes del cierre y manteniendo al caballo con 40 UI/kg de heparina sulfato, endovenosa, cada 6 horas por 48 a 72 horas postoperatorio sería de utilidad. La administración sistémica de heparina en caballos produce además una disminución transitoria del VGA, alcanzando hasta 50% después de 3 a 4 días de terapia. Se cree que esta disminución ocurre por aglutinación eritrocitaria y no por hemorragia o hemólisis (Mahaffey y Moore 1986). El VGA vuelve a valores normales dentro de 4 días de finalizada la terapia con heparina (Mueller 2002).

Posterior a una laparotomía, alrededor del 95% de los pacientes humanos desarrollan adherencias. Para prevenir esta formación se han investigado los lavados peritoneales y muchas diferentes soluciones han sido propuestas (Sortini y col 2006). Los lavados intraabdominales intraoperatorios se abocan a prevenir la desecación de las superficies sero-sas, minimizar el trauma seroso durante la manipulación intestinal y remover la sangre, fibrina peritoneal y media-dores inflamatorios (Hague y col 1998). Aparentemente el lavado postquirúrgico crea un efecto de hidroflotación, el cual separa la superficie de la serosa intestinal y además remueve fibrina peritoneal y mediadores inflamatorios (Mueller 2002). Hague y col (1998) concluyen que el lavado peritoneal reduce la frecuencia de adherencias intraabdominales. Sin embargo, Johns (2001) señala que en humanos, a pesar del volumen aplicado, la capacidad de absorción del peritoneo asegura que este fluido es

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reabsorbido al sistema vascular dentro de 24-48 horas, tiempo muy corto como para influir en la formación de adherencias. No existen ensayos clínicos controlados que demuestren que la hidroflotación tenga algún efecto en la formación de adherencias postoperatorias en equinos.

Igualmente, otras combinaciones han sido utilizadas en forma de lavado peritoneal. Un estudio realizado por Wang y col (2003) en perros concluye que el uso de una solución combinada de alantoína, metronidazol y dexametasona (AMD) sería de utilidad por su efecto antiinflamatorio, antibacteriano y antiexudativo, impidiendo que el exudado rico en fibrina quede en la cavidad abdominal, y además aumentaría la actividad del PA de tejido endogenético, lo que prevendría las adherencias intraabdominales postope-ratorias. De acuerdo al estudio piloto, la proporción más adecuada de estos fármacos fue 50:32:1, la cual además demostró ser la combinación más efectiva, mientras que la toxicidad no aumentó. Hague y col (1998) concluyen en su estudio que los lavados para remover sangre peritoneal y fibrina en el período inmediato postcirugía son benefi-ciosos en la prevención de adherencias, siendo mejores que los intraoperatorios ya que permiten la remoción de fibrina que se forma después de la cirugía.

Igualmente, se ha documentado que el uso de solu-ciones protectoras tisulares aplicadas al tejido antes de la manipulación quirúrgica y durante la cirugía protege las superficies mesoteliales directamente y previene o reduce el tejido dañado durante el procedimiento quirúrgico, el cual puede llevar a la formación de adherencias (Murphy y col 2002). Las soluciones o sustancias que previenen las adherencias se caracterizan por inhibir la adhesiogénesis sin restringir la reparación de la herida, son eficaces aún en presencia de sangre u otros fluidos corporales, tienen propiedades antiinflamatorias, ausencia de factores inmu-nológicos, biodegradabilidad, seguridad de permanecer en el lugar después de la aplicación, facilidad de manejo y efecto inmediato (Risberg 1997).

La administración intraperitoneal de soluciones de carboximetilcelulosa sódica (CMC) al 1%, un polisacárido sustituido, ha sido usada con éxito en modelos experimentales para prevenir las adherencias en animales de laboratorio, ovejas y ponies (Hay y col 2001), siendo los volúmenes recomendados entre 1 y 7 mL/kg introducidos dentro del abdomen antes de la manipulación intestinal; sin embargo, algunos cirujanos prefieren depositar una solución de 4-5 mL/kg de CMC al 1% dentro del abdomen justo antes de terminar la sutura de la línea alba (Smith y col 2005). Sullins y col (2004) describen que el uso de una solución de CMC al 3% en potrillos aumentó la fibrosis y disminuyó la regeneración mesotelial, fenómeno relacionado a la irrita-ción de las superficies. La carboximetilcelulosa (CMC) se encuentra actualmente disponible en tres diferentes gamas de pesos moleculares: baja (90 kd), media (250 a 350 kd) y alta (700 a 1000 kd). En estudios en equinos han sido utilizadas soluciones de CMC con moléculas de peso medio como barreras postoperatorias para prevenir adherencias

intraabdominales. Aunque la CMC es biocompatible, cambios leves y transitorios se han observado en variables hematológicas y bioquímicas al usarla intraabdominalmente en caballos (Murphy y col 2002). Los efectos benéficos de CMC derivan de un efecto de hidroflotación, el cual mecánicamente previene la aposición de las superficies serosas o peritoneales, previniendo así la formación de adherencias (Mueller y col 1998).

Lopes y col (1999) observaron que posterior a infusiones con CMC al 1% existe un aumento en la densidad y pro-teínas totales; adicionalmente encontraron un incremento en el conteo de leucocitos, así como también un aumento relativo de neutrófilos, por lo cual concluyen que la CMC causó una respuesta inflamatoria más intensa y con un curso mayor en la cavidad peritoneal y que su excreción ocurre por fagocitosis. Hay y col (2001) reportan que la CMC disminuyó la incidencia de adherencias en respuesta a la abrasión de serosas y resección yeyunal y anastomosis. Un litro de CMC al 1% es suficiente para cubrir todo el yeyuno e íleon, lo que lleva a la lubricación del intestino y guantes de los cirujanos, lo que subjetivamente reduce la fricción durante la manipulación intestinal. Un segundo litro de CMC al 1% es aplicado después de la manipula-ción, llevando a la acumulación de CMC en el lugar de la cirugía. Sin embargo, grandes volúmenes de CMC (2-4 litros) deben ser usados para alcanzar el efecto de hidro-flotación en el abdomen de los equinos. Igualmente, se ha establecido que la absorción sistémica después de la administración intraperitoneal de grandes volúmenes de CMC en caballos resulta en pirexia, depresión y anorexia postoperatoria (Mueller y col 2000a). En este sentido, Hay y col (2001) determinaron en ponies y caballos que el uso de 7 mL/kg de SCMC al 1% no genera complicaciones como las descritas anteriormente. De la misma forma, en su estudio el uso de 4-6 mL/kg de CMC al 1% fue efectivo para prevenir las adherencias y no se observó este tipo de efectos secundarios. Igualmente, el hialuronato de sodio, un polímero hidrofílico natural y excelente lubricante de tejidos, ha demostrado ser efectivo en reducir las adhe-rencias postquirúrgicas después de cirugías abdominales, pericárdicas y ortopédicas, previniendo la formación de adherencias primariamente a través de la formación de una barrera lubricante protectora en la superficie serosa intestinal, parecida a CMC, previniendo el trauma abra-sivo por manipulación y desecación y preservando la integridad del mesotelio. Igualmente, concentraciones de 0,4% de hialuronato de sodio han demostrado inhibir la formación de adherencias en ratas (Burns y col 1995, Peck y col 1995), siendo esta solución reabsorbida de la cavidad peritoneal y excretada dentro de los cinco días de administrada en cerdos (Kramer y col 2002).

Barreras físicas. Un acercamiento a la prevención de las adherencias intraabdominales en equinos es colocar un material absorbible biocompatible en el abdomen, el cual sirve como barrera física durante el período postoperatorio

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cuando se forman las adherencias (Avital y col 2005). Recientemente, una membrana bioabsorbible compuesta de la combinación de hialuronato (HA) y CMC se ha desarro-llado para reducir la formación de adherencias después de cirugías en humanos. Esta membrana translúcida y flexible ha sido evaluada clínicamente en humanos y equinos y es utilizada en la superficie serosa del intestino o peritoneo, formando una barrera protectiva temporal contra la for-mación de adherencias serosa-serosa o serosa-peritoneo durante el período postoperatorio temprano (Mueller y col 2000b, Cohen y col 2005). La combinación de HA y CMC produce un compuesto con una permanencia in vivo mayor comparado con HA o CMC solos. La mem-brana se hidrata a un gel aproximadamente 24 a 48 horas después de su aplicación, pero permanece en el sitio de la aplicación por más de siete días, lo que realza su habilidad de reducir la formación de adherencias (Mueller y col 2000a) en incidencia, extensión y severidad (Vrijland y col 2002). Mueller y col (1998) establecieron que el uso de la membrana bioabsorbible HA previene la formación de adherencias intraabdominales inducidas experimentalmente en todos los caballos tratados, por lo cual se concluye que la membrana HA previene la formación de adherencias por un mecanismo similar al de CMC, que es separar las superficies serosas durante el período postoperatorio temprano de la reparación. Adicionalmente Mueller y col (2000b) describen que mediante evaluación microscópica de los sitios de anastomosis de todos los grupos se pudo observar la evidencia de tejido de granulación con inva-sión de macrófagos y proliferación fibroblástica, típico de la reparación normal de una herida. Sin embargo, la acumulación de fibrina en la superficie serosa del sitio de la anastomosis, en los grupos tratados con membrana de CMC y HA, fue significativamente menor que los caballos controles. Bajo condiciones normales, la fibrina es disuelta por el sistema fibrinolítico y las adherencias son resueltas antes de que haya una maduración fibrosa. Estos mismos autores señalan que esta disminución en la deposición de fibrina en el sitio de la anastomosis en los grupos de caballos tratados con membranas de CMC y HA no comprometió la fuerza o reparación del intestino delgado en el modelo experimental utilizado. Estos resultados concuerdan además con Tarhan y col (2005) quienes al ocupar una membrana de HA y CMC redujeron la incidencia y severidad de las adherencias abdominales en ratas.

Aunque t-PA es el activador de plasminógeno que es responsable del 95% de la actividad, los resultados indican que el efecto de prevenir adherencias de la membrana de HA y CMC no se encuentra relacionado con t-PA. Debido a esto, las propiedades físicas (efecto barrera, hidroflotación y siliconización) de la membrana pueden ser responsables primariamente de la preven-ción de adherencias. Tsai y col (2005) concluyen de su estudio de membranas de colágeno-hialuronato que éstas son resistentes a la digestión de hialuronidasa y no demostraron ser citotóxicas a fibroblastos L929. Al ser

implantadas en ratas por más de cuatro semanas, previ-nieron la formación de adherencias, asociándose sólo a una suave reacción tisular. Por lo cual los resultados de ese estudio sugieren que estas membranas pueden ser una buena barrera mecánica para prevenir las adherencias intraperitoneales postoperatorias.

Aunque no utilizado en equinos, el quitosán es otro tipo de membrana utilizado para la prevención de adhe-rencias. Éste es un derivado de la quitina obtenida después de deacetilación, siendo la quitina el principal ingrediente del caparazón de los artrópodos (tales como camarones, cangrejos, insectos, etc.), el cual es una fuente renovable natural y de gran cantidad. Al ser el quitosán inocuo, biodegradable y con una biocompatibilidad ideal, ha sido ocupado para desarrollar biomateriales. La actividad bio-lógica del quitosán incluye: inhibición del crecimiento de bacterias, actividad antineoplásica, aumento inmunológico, actividad anticoagulante, promoción de la reparación tisular y hemostasis (Zhang y col 2006). Sin embargo, Zhang y col (2006) concluyen en su estudio que las membranas de quitosán pueden no prevenir las adherencias por su baja velocidad de degradación in vivo; además las mem-branas mezcladas con gelatina pueden incluso exacerbar las adherencias peritoneales. Igualmente, señalan que el gel de quitosán tiene un buen efecto en la prevención de adherencias peritoneales causadas por isquemia, pero no un efecto evidente en adherencias causadas por polvo de talco. Otros autores (Kennedy y col 1996, Costain y col 1997) han probado el uso de N,O-carboximetilquitosán (NOCC); esta molécula es parecida al ácido hialurónico y la CMC, los cuales han demostrado ser beneficiosos en la reducción de adherencias. Una serie de estudios se han realizado en distintos tipos de cirugía. Sin embargo, Diamond y col (2003) determinaron la eficacia promisoria en modelos animales de NOCC al reducir adherencias postoperatorias, demostrando su habilidad de disminuir la ocurrencia, extensión y severidad en humanos, por lo cual ofrecería grandes beneficios en la reducción de la formación de adherencias.

Otro material utilizado como membrana es el ácido poliláctico, el cual está compuesto de un copolímero de dos formas de ácido láctico (L-lactida y D,L-lactida). Este polímero es degradado en el cuerpo por hidrólisis seguido de metabolismo hepático. Es un material flexible que no se dobla o arruga fácilmente y puede ser manejado fácilmente con guantes. Al respecto, estos autores señalan que el uso experimental de esta membrana en ratas estuvo asociado a una reducción del 42,1% de las adherencias intraabdo-minales postoperatorias así como también su severidad, haciendo notar que estos resultados se alcanzaron en un modelo que desarrolla un ciento por ciento de adherencias en las ratas no tratadas (Avital y col 2005).

Schneider y col (2006) establecen el uso de una esponja de colágeno derivada de tendones equinos (TachoComb H), un agente hemostático, el cual está cubierto de una capa de factores de coagulación tales como fibrinógeno

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(humano) y trombina (humana) y un inhibidor de fibri-nólisis aprotinina (bovino). Estos autores describen una disminución significativa en la formación de adherencias en el grupo tratado comparado con el grupo control. Sin embargo, señalan que es necesario realizar más investi-gaciones comparando este producto con otras barreras mecánicas.

Drenajes. Los drenajes abdominales han sido usados para muchas patologías, incluyendo peritonitis, abscesos intraabdominales, hemorragias y filtraciones de anasto-mosis. Igualmente son usados postoperatoriamente para prevenir la formación de adherencias o la acumulación de sustancias irritantes como sangre, bilis o enzimas pancreáticas (Nieto y col 2003). Los drenajes son implantes quirúrgicos, los cuales proveen y mantienen un canal de salida con el propósito de remover fluidos o gases desde una herida o cavidad corporal (Williams y col 1992). Celsius fue la primera persona en utilizar drenajes en el abdomen para remover fluido ascítico. Galen en el siglo II y Avicena en el XI aplicaron este tratamiento para ascitis; después de este tiempo no existen registros de su uso, hasta que Chauliac aparentemente lo redescubrió en el siglo XIV. Paré y Ryff, en el XVI, Scultetus en el XVII y Heister en el siglo XVIII usaron tubos metálicos ensanchados como drenajes de fluido intraabdominal (Jennings 1937).

Los drenajes pueden ser pasivos o activos. Los pasivos funcionan por desbordamiento, gravedad o acción capilar y los activos por aplicación de una fuente externa de vacío al drenaje (Arighi 1992). El uso de una fuente de succión externa para crear presión negativa tiene ventajas sobre los drenajes pasivos (Stone 1992). Los drenajes pasivos más comúnmente usados son los drenajes de Penrose, gomas de látex dental y drenajes corrugados (Williams y col 1992). Los activos promueven el drenaje peritoneal, están asociados a una reducción en la incidencia de infecciones y complicaciones relacionadas a los drenajes y el volumen de egreso puede ser medido. Cuando se usan los drenajes pasivos en la cavidad abdominal, se recomienda proteger el extremo del drenaje para prevenir infecciones ascendentes (Stone 1992). De acuerdo a Eggleston y Mueller (2003) y Nieto y col (2003) las complicaciones asociadas a drenajes abdominales y lavados en otras especies incluyen hipopro-teinemia, pérdida de fluidos y electrolitos, perforación de vísceras, infecciones ascendentes, herniación del omento o intestino a través de la salida del drenaje y obstrucción del drenaje, además de edema ventral localizado en el sitio donde se encuentra el catéter. En caballos, drenajes pasivos y lavados han sido usados en el tratamiento de peritonitis sépticas y experimentalmente para minimizar la formación de adherencias. Nieto y col (2003) consideran que debido a la ausencia de complicaciones severas y a la aparente mejora clínica, la utilización de sistemas de drenajes activos puede ser una terapia alternativa adecuada para el tratamiento y prevención de peritonitis como también

para la disminución en la presentación de adherencias postquirúrgicas en equinos.

Manejo quirúrgico. Otro tipo de tratamiento recomendado para las adherencias abdominales involucra repetir la ce-liotomía con objeto de eliminar las adherencias formadas. Desafortunadamente, este es un procedimiento invasivo, el cual ha resultado en la formación de futuras adherencias en humanos y animales de laboratorio (Lansdowne y col 2004). La relaparotomía en equinos (previo al alta desde el hospital veterinario) es altamente aceptada como una opción de tratamiento en el manejo de cólico postqui-rúrgico (Ducharme 2002), aunque de acuerdo a Hay y Mueller (1998) en equinos la ruptura de las adherencias durante una cirugía generalmente lleva a que se formen nuevamente debido a la naturaleza altamente irrigada de la zona afectada y a la severidad asociada del daño de la adherencia original. Además, la repetición de una celioto-mía para corregir problemas asociados a las adherencias abdominales o el manejo de episodios recurrentes de cólico atribuibles a las adherencias son por lo general no factibles económicamente (Fubini 1990, Sullins 1990, Baxter 1992), por lo cual los propietarios frecuentemente eligen eutanasiar al caballo (Bouré y col 2002).

La laparoscopia diagnóstica es usualmente usada para identificar patologías intraabdominales específicas como el caso de dolor abdominal y pélvico crónico (Shayani y col 2002). Exitosas adhesiólisis laparoscópicas han sido descritas en equinos; las ventajas reportadas de esta técnica incluyen excelente observación de las adherencias abdominales y mínimo trauma del peritoneo parietal y visceral comparado con laparotomías (Bleyaert y Brown 1997, Bouré y col 1998). Lansdowne y col (2004) reportan en su estudio en potrillos que la instilación de hialuronato férrico 0,5% en gel posterior a la disección laparoscópica de adherencias es más efectiva que la disección laparos-cópica sola, además de ser una técnica segura y efectiva de realizar en potrillos. Lansdowne y col (2004) reportan en su estudio laparoscópico en ponies realizado siete días después de la celiotomía inicial que, independiente del uso de la misma técnica quirúrgica para inducir las adherencias y el mismo equipo quirúrgico, ocurrió una reformación de adherencias. Extensivos estudios se han desarrollado para determinar el mejor tratamiento de adherencias abdomina-les postquirúrgicas en humanos (Caspi y Halperin 1981, François y col 1994). Sobre el 80% de pacientes humanos con dolor abdominal crónico son aliviados o presentan mejorías clínicas después de adhesiólisis laparoscópica (Borellino y col 1998). En medicina humana, el tiempo ideal para realizar adhesiólisis laparoscópica no ha sido aún determinado, pero en general es aceptado que este procedimiento debe ser realizado después de la reparación de la serosa y antes de que se desarrollen las adherencias fibrosas (Jansen 1988).

En equinos, la realización de omentectomía es aún con-troversial (Hay y Mueller 1998). Kuebelbeck y col (1998)

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encontraron en su estudio que el omento frecuentemente se encuentra relacionado a las adherencias causando dolor abdominal por la formación de éstas en el intestino o pared abdominal que llevan a obstrucción o estrangulación, además de que la omentectomía reduce el grado de formación de adherencias postoperatorias, siendo un procedimiento seguro, el cual debe ser considerado profilácticamente para atenuar la formación de adherencias después de cirugías abdominales en caballos. En contraste, Mueller (2002) indica que a pesar de que las adherencias omentales pueden causar signos de dolor abdominal a través de la creación de una tensión anormal en el mesenterio, o como foco de obstrucción o estrangulación intestinal, se ha descrito que proveen un aporte vascular al tejido potencialmente isquémico, de tal modo, facilita la reparación y prevendría la formación de adherencias.

RESUMEN

A pesar del gran número de investigaciones realizadas tanto en medicina humana como en medicina veterinaria, las adherencias intraabdominales continúan siendo una complicación para los cirujanos en la actualidad. El desarrollo de adherencias intraabdominales es un proceso dinámico y complejo que involucra una serie de eventos que comienzan con un proceso inflamatorio y daño tisular, seguido de desbalances en los procesos de fibrinogénesis y fibrinólisis, terminando con la conversión de fibrina a tejido fibroso. En cirugías de intestino delgado en equinos, la incidencia de adherencias va de 14 a 22%, siendo la causa más común de dolor abdominal recurrente y la segunda causa de celiotomías repetidas. Sin embargo, al incluir todas las causas de cirugías abdominales, en esta especie la incidencia de adherencias es de aproximadamente un 5%. El mayor conocimiento del mecanismo celular de la formación y reformación de adherencias debe llevar a reducir su incidencia. Actualmente, existen una serie de métodos de prevención y tratamientos destinados a disminuir o evitar la aparición de adherencias intraabdominales. El objetivo de esta revisión bibliográfica fue el de recopilar la mayor información disponible e investigaciones que expliquen de mejor manera la fisiopatología, prevención y tratamiento de la formación de adherencias intraabdominales.

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Arch Med Vet 41, 17-26 (2009)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 30.07.2008.# Proyecto FIA BID-PI-C-2001-1-P-035.

* Casilla 58-D, Temuco, Chile; [email protected] http://www.sag.gob.cl

Prevalencia y distribución espacial de brucelosis, leucosis bovina, diarrea viral bovina y rinotraqueítis infecciosa bovina a partir del análisis ELISA

de estanques prediales en lecherías de la IX Región, Chile#

Prevalence and space distribution of brucellosis, bovine leukaemia, bovine viral diarrhea and infectious bovine rhinotracheitis by using bulk milk ELISA test in dairy herds

of the IX Region, Chile

R Felmera*, J Zúñigaa, A López b, H Mirandab

aLaboratorio de Biotecnología Animal, Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA-Carillanca, Casilla 58-D, Temuco, Chile.bFacultad de Ciencias Agropecuarias y Forestales, Universidad de La Frontera, Casilla 54-D, Temuco, Chile.

SUMMARY

Chile is internationally recognized for its good zoo-sanitarian situation as the country has been able to reach and maintain a status of officially free from the main diseases of the OIE List, including foot and mouth disease and classical swine fever. However, several infectious diseases are known to remain among herds, which produce a major effect in production due to losses by abortion, decrease of fertility and what it is more important, some of them represent barriers for export and constitute a risk of zoonosis for the population. In this work, a monitoring system based on the analysis of bulk milk antibodies by means of ELISA test, was implemented to study the epidemiology and distribution of 4 of the main bovine diseases that currently affect the IX Region of Chile (brucellosis, bovine leukaemia, IBR and BVD). The system allowed the surveillance of 279 dairies, which represented 43% of the dairies registered in IX the Region, and included 19,635 milking cows (14%). With this system, a high prevalence for leukaemia (59%), IBR (76%) and BVD (96%) could be established, whereas it was confirmed that brucellosis is restricted to a few dairies (5%). The surveillance system coupled to the satellite geographic information analysis, allowed to establish the space distribution of these diseases in the different communes of the Region, demonstrating to be an excellent and low cost support tool for the monitoring of the diseases in the herd, which guarantees the possibility of establishing this platform in the Region and its feasibility to project it at national level.

Palabras clave: ELISA, estanque predial, enfermedades, SIG.Key words: ELISA, bulk milk, diseases, GIS.

regiones y sectores del país, como en el caso de la diarrea viral bovina (DVB), rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR) y leucosis (Hochstein-Mintzel y col 1986, Reinhardt y col 1990, Celedón y col 1996, Zúñiga y col 2004). La falta de datos claros sobre la prevalencia de una enfermedad repercute negativamente, ya que no se puede cuantificar apropiadamente el impacto que ésta tiene en los sistemas productivos y menos tomar decisiones para su control y eventual erradicación. Las características de los análisis de diagnóstico actualmente empleados requieren de muestras individuales de suero de cada animal, lo cual impide una vigilancia adecuada de toda la masa bovina susceptible de contagios. Del mismo modo, una vez que se produce la erradicación de una enfermedad en los predios se debe monitorear la salud del rebaño constantemente, a fin de detectar nuevos brotes para poder controlarlos a tiempo (Lindberg y Alenius 1999). Diversos estudios en Europa han demostrado la factibilidad de diagnosticar algunas de las principales enfermedades del ganado bovino a partir de las inmunoglobulinas presentes en la leche, permitiendo de esta forma controlar el rebaño lechero mediante el método de ELISA aplicado a la detección de anticuerpos presentes

INTRODUCCIÓN

Chile es reconocido internacionalmente por poseer una buena situación sanitaria, pues el país ha podido alcanzar y mantener el estado de oficialmente libre de las princi-pales enfermedades de la lista de la OIE (Organización Internacional de Epizootias), incluyendo la fiebre aftosa y la peste porcina clásica1. Sin embargo, aún coexisten en nuestros rebaños bovinos una serie de enfermedades, las cuales tienen un directo impacto en la producción, por cuanto disminuyen la fertilidad, producen pérdidas por aborto, alargan el lapso interparto y fundamentalmente constituyen barreras sanitarias para la exportación. Si bien la prevalencia e impacto económico de algunas de estas enfermedades no están claras, existen estudios e informes que evidencian prevalencias altas en diversas

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R FELMER Y COL

en la leche del estanque predial (Kerkhofs y col 1990, Paton y col 1998, Wellenberg y col 1998, Lindberg y Alenius 1999, Nylin y col 2000, Pritchard y col 2002). Este sistema ELISA ha mostrado poseer una mayor sen-sibilidad y especificidad que los métodos tradicionales de diagnóstico, permitiendo además su automatización para realizar la vigilancia de los rebaños a un costo mucho menor (Nielsen y col 1996, Vanzini y col 2001). Más aún, algunos de los métodos desarrollados ya han sido reconocidos como métodos oficiales en EE.UU., Canadá y otros países de Europa y son recomendados actualmente por la OIE 2 para su incorporación en programas de control y prevención de enfermedades (Simard y col 2000). De esta forma, en este trabajo se implementó un sistema de vigilancia predial basado en el análisis ELISA para estudiar la epidemiología de cuatro de las principales enfermedades bovinas de la IX Región (brucelosis, leucosis DVB e IBR). Esta plataforma de vigilancia, acoplada a un sistema de información geográfica satelital (SIG), permitió además realizar un análisis espacial de la prevalencia de estas enfermedades en los predios y establecer su distribución en las diferentes comunas de la Región.

MATERIAL Y MÉTODOS

REGISTRO DE LECHERÍAS Y FRECUENCIA DE MUESTREOS

Se registraron y muestrearon 279 lecherías de la IX Región que contaban con estanque de enfriamiento de leche. De los predios registrados se pudieron obte-ner datos poblacionales de 245 lecherías mediante una encuesta realizada en terreno con el dueño o encargado de los predios. Estos datos representaron el 37,4% de las lecherías de la Región y el 46,8% de aquellas presentes en las 17 comunas del estudio, incluyendo un universo de 19.635 vacas equivalente al 14% de las vacas lecheras de la IX Región (INE 2003). De acuerdo al segmento poblacional de animales, el 60% de las lecherías tenían menos de 50 animales, mientras que el 40% restante estaba constituido por lecherías en el rango de 51-100 animales (13,5%), 101-150 animales (11,4%) y más de 151 animales (15,1%) (cuadro 1). En conjunto, las lecherías en el rango sobre 150 animales representaron más de la mitad (52%) del total de animales de la muestra (cuadro 1). La comuna de Freire concentró la mayoría de los predios con más de 100 animales y comunas como Pitrufquén y Vilcún concentraron preferentemente a pequeños productores. El número de lecherías muestreadas en cada una de las tres oportunidades correspondió a 187 para el primer muestreo, 216 para el segundo y 246 para el tercero, representando el 67, 77 y 88% del total, respectivamente. Asimismo, 6, 11 y 41 muestras se recibieron exclusivamente en el primero, segundo o tercer muestreo y sólo 158 se recibieron en las

2 http://www.oie.int/eng/en_index.htm

tres ocasiones, correspondiendo estas muestras al grupo de lecherías de seguimiento para efectos de este estudio.

UBICACIÓN GEOGRÁFICA Y DISTRIBUCIÓN

DE LOS PREDIOS

La ubicación geográfica de cada uno de los predios que participó en este estudio se obtuvo aprovechando los recorri-dos habituales de los camiones recolectores de las empresas lecheras de SOPROLE (Freire), SURLAT (Pitrufquén) y PARMALAT (Victoria), las que participaron desinteresa-damente de este estudio. Una vez en el predio, se ubicó el lugar donde se almacenaba el estanque predial, punto en el cual se tomó la lectura de su ubicación geográfica mediante un receptor GPS (Garmin Etrex). Esta lectura fue utilizada posteriormente para la generación de representaciones geográficas, empleando para este fin el programa Arcview GIS Versión 3.3, 2003 (Esri Inc.) y bases de datos de la región. En total se determinó la localización geográfica de 235 lecherías (84%) de las 279 efectivamente muestreadas. A partir de este conjunto de datos se pudo determinar que la mayoría de las lecherías muestreadas se localizaron en el valle central y preferentemente en las comunas de la provincia de Cautín. Esta distribución estuvo naturalmente condicionada por el área de cobertura de las plantas lecheras que colaboraron con este estudio, lo que excluyó del mues-treo áreas lecheras importantes como Renaico, Villarrica y Loncoche, que entregan mayoritariamente su leche a la planta lechera de Loncoche (que declinó participar de este estudio) o de áreas que entregan la producción a plantas queseras como ciertas comunas de la costa. Los predios muestreados estuvieron distribuidos en 17 de las 26 comunas, incluyendo a Cunco, Curacautín, Ercilla, Freire, Galvarino, Gorbea, Lautaro, Loncoche, Padre Las Casas, Perquenco, Pitrufquén, Temuco, Traiguén, Victoria, Imperial y Vilcún (cuadro 2). De esta forma, las 279 lecherías representaron el 43% de las lecherías de la Región y el 53% del universo de lecherías existentes a nivel de las 17 comunas muestreadas (cuadro 2). El número de lecherías muestreadas en cada comuna varió entre 1 (Ercilla e Imperial) y 57 (Vilcún), estando la mayoría concentradas en las comunas de Vilcún,

Cuadro 1. Distribución de vacas lecheras por segmento pobla-cional en una muestra de lecherías de la IX Región (n = 245). Distribution of milking cows in a sample of dairies of the IX Region (n = 245).

Segmento poblacional

Nº de lecherías % Nº de vacas por

segmento poblacional %

< 50 147 60,0 3.537 18,0

51 a 100 33 13,5 2.401 12,2

101 a150 28 11,4 3.488 17,8

> 151 37 15,1 10.209 52,0

Total 245 100 19.635 100

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ELISA, ESTANQUE PREDIAL, ENFERMEDADES, SIG

Cuadro 2. Distribución de las lecherías muestreadas en las diferentes comunas de la IX Región. Distribution of dairies sampled in different communes of the IX Region.

Comuna Universo lecherías IX Región

Total de lecheríasmuestreadas

Participación por comuna (%)

Lecherías grupo seguimiento

Participación por comuna (%)

Angol 9 8 89 0 0Collipulli 2 0 0 0 0Cunco 18 18 100 10 56Curacautín 10 6 60 6 60Ercilla 7 1 14 1 14Freire 84 56 67 29 35Galvarino 2 2 100 2 100Gorbea 40 35 88 6 15Imperial 1 1 100 0 100Lautaro 21 10 48 6 29Loncoche 91 17 19 6 7Los Sauces 1 0 0 0 0Padre Las Casas 11 8 73 7 64Perquenco 3 3 100 3 100Pitrufquén 137 40 29 24 18Pucón 1 0 0 0 0Puerto Saavedra 3 0 0 0 0Purén 9 0 0 0 0Renaico 80 0 0 0 0Temuco 7 4 57 2 29Teodoro Schmidt 15 0 0 0 0Toltén 7 0 0 0 0Traiguén 10 2 20 2 20Victoria 11 11 100 7 64Vilcún 61 57 93 47 77Villarrica 14 0 0 0 0Total 655 279 158

Freire, Gorbea y Pitrufquén y la proporción del universo comunal varió entre 14% (Ercilla) y 100% (Cunco, Galvarino, Imperial, Perquenco y Victoria) (cuadro 2).

TOMA DE MUESTRAS DE LECHE Y PROCESAMIENTO

Las muestras de leche de los estanques prediales fueron recolectadas en frascos plásticos conteniendo dicromato de potasio (0,1% p/v) como preservante y remitidas directamente al laboratorio de Biotecnología Animal de INIA-Carillanca, distante 20 km de la ciudad de Temuco. A su llegada al laboratorio, se procedió inmediatamente al descremado de las muestras mediante su centrifugación por 10 minutos a 3.500 r.p.m., dejando la fracción clarificada almacenada a -20 ºC para su posterior análisis mediante ELISA.

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO

La detección de anticuerpos a Brucella abortus, VLEB, VDVB y VHB-1, en las muestras de leche, se realizó

mediante la técnica de enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA-i) empleando un kit comercial (Svanovir® SVANOVA, Suecia) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las lecturas espectrofotométricas se realizaron en un lector ELISA (Labsystems, Multiskan EX) a 450 nm para VLEB, VDVB y VHB-1 y a 650 nm para Brucella abortus. Para cada prueba, los valores de absorbancia de las muestras fueron estandarizados contra un control positivo y su clasificación como positivas o negativas se estimó de acuerdo al valor de cut-off sugerido por el fabricante.

ANÁLISIS KRUSKALL-WALLIS

La relación entre la presencia de las enfermedades y el número de vacas en ordeña por predio se estableció empleando la prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis, con el programa SPSS versión 11.5 para Windows (SPSS Inc., Chicago Il, USA), considerando como significativo el resultado si P < 0,05.

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R FELMER Y COL

ANÁLISIS DE DENSIDAD DE NÚCLEO (KERNEL)

El análisis de núcleo se realizó empleando las coorde-nadas obtenidas mediante la lectura GPS y el programa JMP (SAS Institute, 2003), considerándose para cada análisis la reactividad de las enfermedades y su relación espacial en los predios.

RESULTADOS

ANÁLISIS DE ANTICUERPOS A BRUCELLA ABORTUS,

VLEB, VDVB Y VHB-1 EN MUESTRAS DE LECHE

DEL ESTANQUE PREDIAL

Se detectaron anticuerpos a Brucella abortus en 6, 5 y 5%, respectivamente, de los estanques prediales muestreados en cada oportunidad (figura 1), mientras que para leucosis, se detectaron anticuerpos en 63, 57 y 57%, respectiva-mente (figura 1). Una mayor proporción de anticuerpos se detectó para VDVB, con 98, 96 y 93%, respectivamente (figura 1). Esta situación fue similar a la observada para VHB-1, con 78, 76 y 72%, respectivamente (figura 1). Los valores obtenidos para estas cuatro enfermedades fueron similares en las 158 lecherías del grupo de seguimiento (cuadro 3). La distribución geográfica de las lecherías positivas a brucelosis permitió establecer su localización principalmente en las comunas de Freire y Vilcún (figura 2)

y en su gran mayoría correspondieron a predios de más de 100 vacas por lechería (dato no mostrado). En el caso de leucosis, se observó una distribución más uniforme, estando presente la enfermedad en todas las comunas analizadas, con la excepción de aquellas con una baja representación de predios (Temuco, Ercilla y Perquenco). En el caso de DVB e IBR, debido a que el número de lecherías libres de anticuerpos fue muy baja (figura 1), se realizó un análisis en base al título de anticuerpos, lo cual permite clasificar a aquellas lecherías donde existe mayor probabilidad de estar cursando infección activa (Niskanen y col 1991, 1993). La figura 3 muestra la variación de las proporciones relativas de los estanques en cada clase obtenida durante el primer muestreo realizado a las 158 lecherías de seguimiento. La mayor proporción de predios con una alta probabilidad de infección activa en ambas enfermedades se encontró en las comunas de Vilcún, Freire y Pitrufquén, consistente con la mayor representación de predios en estas comunas. Aun cuando la mayoría de las lecherías positivas se mantuvo relativamente constante durante los muestreos sucesivos, la fracción de lecherías en clase 3 tendió a disminuir durante el período de observación (cuadro 3).

El análisis de brucelosis, leucosis y diarrea viral bovina, mediante la prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis, permitió establecer que no existe una relación entre el número de vacas en ordeña y la presencia de estas enfer-medades en la muestra analizada. Sin embargo, en el caso

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% P

redi

os

BrucelosisM1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3

M: Muestreo

– +

DVBLeucosis IBR

Figura 1. Prevalencia de las cuatro enfermedades evaluadas en una muestra de lecherías de la IX Región en cada uno de los tres muestreos realizados.M: Muestreo, M1: 187 lecherías, M2: 216 lecherías, M3: 246 lecherías. Prevalence of the 4 diseases evaluated in a sample of dairies of the IX Region in each one of three samplings carried out.M: Sampling, M1: 187 dairies, M2: 216 dairies, M3: 246 dairies.

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650000 700000 750000 800000

570000575000

565000575000

565000

570000

N

650000 700000 750000 800000

650000 700000 750000 800000

570000575000

565000575000

565000

570000

650000 700000 750000 800000

N

VictoriaVilcún

TraiguénToltén

TemucoPitrufquénPerquencoPadre Las CasasLoncocheLautaro

GorbeaGalvarinoFreireErcillaCuracautínCunco

Comunas en estudio

Leucosis 1 Muestreo- +

VilcúnVictoriaTraiguénToltén

TemucoPitrufquénPerquencoPadre Las CasasLoncocheLautaro

GorbeaGalvarinoFreireErcillaCuracautínCunco

Comunas en estudio

Brucelosis 3 Muestreo- +

Figura 2. Localización geográfica de predios positivos a brucelosis y leucosis en una muestra de 158 lecherías de la IX Región. Geographic location of herds positive to brucellosis and leucosis in a sample of 158 dairies of the IX Region.

B)

Rebaños

CO

MU

NA

S

50403020100

Cunco

Vilcún

Temuco

Victoria

Freire

Galvarino

Perquenco

Curacautín

Pitrufquén

Loncoche

Gorbea

Lautaro

Traiguén

Padre Las Casas

Padre Las Casas

Ercilla

A)

CO

MU

NA

S

Cunco

Vilcún

Temuco

Victoria

Freire

Galvarino

Perquenco

Curacautín

Pitrufquén

Loncoche

Gorbea

Lautaro

Traiguén

Ercilla

5040302010

Rebaños

0

D1

Alta (+) Media (+) Baja (+) Muy baja (-)

Muy baja (-)

I1

Alta (+) Media (+) Baja (+)

Figura 3. Clasificación de las lecherías de acuerdo al nivel de anticuerpos en la leche del estanque predial y su asociación con la probabilidad de ocurrencia de infección activa. Panel A: DVB, Panel B: IBR. Classification of dairies according to the level of antibodies in bulk milk samples and its association with the probability of occurrence of active infection. Panel A: BVD, Panel B: IBR.

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R FELMER Y COL

Cuadro 3. Prevalencia de brucelosis, leucosis, DVB e IBR observada en una muestra de lecherías de la IX Región, en base al análisis ELISA aplicado a la leche del estanque predial. Prevalence of brucellosis, leukaemia, BVD and IBR observed in a sample of dairies of the IX Region, on the basis of bulk milk ELISA test.

Total por muestreo Grupo de seguimiento

Lecherías analizadas 187 216 246 158

Fecha muestreo Jun-03 Dic-03 Sep-04 Jun-03 Dic-03 Sep-04

positivas a brucelosis 6% 5% 5% 6% 4% 4%

positivas a leucosis 63% 57% 57% 62% 61% 60%

positivas a DVB 98% 96% 93% 98% 97% 95%

Clase 3 DVB 39% 44% 25% 37% 44% 19%

positivas a IBR 78% 77% 72% 77% 80% 77%

Clase 3 IBR 62% 55% 41% 61% 56% 43%

de rinotraqueítis infecciosa bovina, en los tres muestreos realizados, se obtuvo una relación altamente significativa (P ≤ 0,05), confirmando en este caso que hay una relación entre el número de animales en ordeña y la presencia de esta enfermedad en los predios (cuadro 4).

El análisis de la distribución espacial y su relación con las enfermedades, mediante la prueba no paramétrica de Kernel, permitió establecer los puntos de mayor concen-tración o densidad que determinan por tanto los lugares de mayor riesgo entre las comunas. De esta forma, para el caso de brucelosis (figura 4) las curvas de densidad confirman que las comunas de Vilcún y Freire concentran la mayor cantidad de predios positivos. De acuerdo a este análisis, la comuna que presenta el mayor riesgo de contagio corresponde a la comuna de Vilcún (coordenadas 720.000, 5.710.000), la cual presenta una mayor densidad y cercanía de predios negativos a los focos de infección. En el caso de leucosis, en los puntos de mayor densidad se encuentra el mayor porcentaje de predios positivos (coordenadas 720.000, 5.710.000 y 740.000, 5.710.000). Esta área de mayor densidad confirma el hecho de que la muestra tiene un gran componente debido al efecto de la comuna, que en el caso de Vilcún corresponde a la comuna con mayor participación de predios. Este análisis permitió además identificar zonas de una alta densidad de rebaños negativos para leucosis, tales como los que se encuentran en la comuna de Pitrufquén. Por otra parte,

hay sectores en que a pesar de que las densidades son bajas todos los rebaños se presentan positivos frente al análisis de ELISA, como es el caso de la comuna de Cunco (figura 4).

DISCUSIÓN

En este estudio se registraron y muestrearon 279 lecherías distribuidas en 17 comunas de la IX Región, lo que equivale al 43% de las lecherías oficialmente reconocidas en la Región (cuadro 2). El análisis de anticuerpos realizado en los tres muestreos efectuados entre junio de 2004 y septiembre de 2005 indica que la situación para las cuatro enfermedades estudiadas es muy diversa. Mientras brucelosis se encuentra bajo control y restringida a unas pocas comunas, con una prevalencia predial de la muestra que no supera el 5%, leucosis, DVB e IBR se encuentran presentes en la mayoría de las comunas estudiadas con una prevalencia promedio de la muestra de 59, 96 y 76%, respectivamente (figura 1). La baja prevalencia de brucelosis se explica por el programa de control y erradicación implementado por el SAG que permitió disminuir la prevalencia descrita en el año 1982 de un 20,4% a nivel de rebaños y un 7% en los animales a alrededor de un 3% del censo de bovinos (Amthauer 1993, SAG 2005). Actualmente, la vigilancia de esta enfermedad se basa, entre otras acciones, en el análisis trimestral de

Cuadro 4. Prueba de Kruskall-Wallis para establecer la relación entre el número de vacas en ordeña y la presencia de las cuatro en-fermedades en la muestra de 158 lecherías. Kruskall-Wallis test, to establish the relationship between the number of milking cows and the presence of the four diseases in a sample of 158 dairies.

B1 B2 B3 LEB1 LEB2 LEB3 DVB1 DVB2 DVB3 IBR1 IBR2 IBR3

χ2 0,468 5,842 2,138 0,816 0,623 0,328 3,980 4,818 2,379 11,921 14,008 7,566

Gl 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

P 0,791 0,054 0,343 0,665 0,732 0,849 0,137 0,090 0,304 0,003 0,001 0,023

Variable de agrupación analizada: vacas en ordeña por predio (0-100) (101-200) (201≥300).

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muestras de leche del estanque predial mediante la Prueba del Anillo en leche (Ring test)(SAG 2004). Si bien esta prueba permite un monitoreo a bajo costo del estatus de anticuerpos en una lechería determinada, la clasificación de esta prueba es subjetiva y el nivel de anticuerpos no se puede cuantificar, impidiendo de esta forma un adecuado seguimiento entre los distintos muestreos, situación que es crítica para detectar a tiempo a aquellas lecherías que están en las primeras etapas del proceso de infección (Vanzini y col 2001). En este estudio, el análisis mediante ELISA permitió detectar anticuerpos en 12, 10 y 12 lecherías en cada muestreo, representando una prevalencia de 6, 5 y 5%, respectivamente, del total de muestras recibidas en cada oportunidad, lo que confirma la baja presencia de esta enfermedad en la Región y su tendencia gradual a la erradicación. Esta favorable situación se confirma al exa-minar la evolución de la inmunidad de esta enfermedad en un grupo de 158 lecherías de seguimiento, cuyas muestras pudieron ser recibidas y analizadas en las tres oportuni-dades. En este grupo, el porcentaje de lecherías positivas en cada uno de los muestreos realizados correspondió a 6, 4 y 4%, respectivamente (cuadro 3), observándose una disminución sostenida de la detección de anticuerpos en aquellos predios donde efectivamente se implementaron medidas de control en los rebaños. Esta situación quedó mejor evidenciada en un estudio de caso realizado a una lechería que pasó de una reacción altamente positiva en el estanque predial a negativa. En esta oportunidad, el cambio de reacción en el estanque predial se pudo asociar a la remoción de tres animales positivos detectados luego de analizar serológicamente a todos los animales del rebaño,

empleando esta misma prueba ELISA (Zúñiga y col 2004). Geográficamente, las lecherías positivas a brucelosis se localizaron principalmente en las comunas de Freire y Vilcún (figura 2) que en su mayoría correspondieron a predios de más de 100 vacas por lechería. Estas lecherías representaron los puntos de mayor riesgo, al encontrarse en zonas de alta densidad y colindantes a predios negativos (figura 4). En efecto, en algunos predios fue posible asociar la infección con la compra de animales infectados desde predios vecinos previamente infectados (datos recabados directamente con el encargado de la lechería), lo que re-salta la importancia de la implementación en los predios de medidas de bioseguridad para evitar el contagio.

La situación de leucosis en Chile es muy diversa, dependiendo de la zona del país evaluada. Los primeros estudios disponibles se enfocaron a determinar la prevalen-cia intrapredial de la enfermedad, permitiendo confirmar distintas prevalencias desde la III a la X Región y con zonas endémicas como la VIII (Reinhardt y col 1988, Naranjo 1989, Islas y col 1990). Estudios posteriores realizados por el SAG, en el marco del Proyecto de Vigilancia Pecuaria, permitieron establecer prevalencias prediales de 87% para la Región Metropolitana, 38% para la IX Región y 21% para la X Región (González 1996). En nuestro caso y a diferencia de los registros anteriores, se estableció una prevalencia predial más elevada para la IX Región, detectándose anticuerpos en 117, 124 y 139 lecherías, lo que correspondió a una prevalencia de la muestra equivalente a 63, 57 y 57%, respectivamente (cuadro 3). La disminución de la prevalencia entre el primer y segundo muestreo (6%) obedeció más bien a

Figura 4. Análisis de densidad no paramétrica Kernel ajustada a ordenada por abscisa para brucelosis (Panel A) y leucosis (Panel B) indicando la presencia de anticuerpos a la enfermedad en los predios (puntos negros). Nonparametric density estimation (Kernel), fit to ordered by abscissa for brucellosis (Panel A) and leukaemia (Panel B) indicating the presence of antibodies to the disease in the herds (black points).

A B

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R FELMER Y COL

la inclusión de un mayor número de lecherías negativas en el segundo muestreo que a una tendencia neta a la disminución de la prevalencia, como ocurrió en el caso de brucelosis, situación que se confirma con el grupo de lecherías de seguimiento, donde se registró una caída de la prevalencia de sólo un 1% (cuadro 3). En este mismo grupo, la incidencia de la enfermedad entre el primer y segundo muestreo correspondió a un 3,8%, proceso que pudo estar relacionado a la infección reciente de estos pre-dios, mediante la introducción de animales infectados que aumentaron levemente la reacción del estanque. También se pudo constatar que algunas lecherías positivas durante el primer muestreo (3) aparecieron negativas durante el segundo y tercer muestreo, coincidiendo en estos casos que estos predios se encontraban en saneamiento. La dis-tribución espacial de leucosis fue relativamente uniforme en las comunas analizadas (figura 2) y no se encontró una relación de esta enfermedad con el número de animales en los rebaños (cuadro 4). La mayor prevalencia de leucosis descrita en este estudio (61%) respecto a los antecedentes disponibles para la IX Región (38%) se puede explicar por el tamaño y distribución de la muestra analizada ya que en este estudio quedaron excluidas importantes comunas lecheras de la IX Región tales como Renaico, Loncoche y la mayoría de los predios de Pitrufquén, los cuales representan cerca del 45% de las lecherías de la Región (cuadro 2). Sin embargo, los recientes antecedentes sobre la mayor sensibilidad de la prueba de ELISA, respecto al método oficial empleado para el diagnóstico de leucosis (AGID), podrían también explicar la mayor prevalencia observada para esta enfermedad (Trono y col 2001, Felmer y col 2006).

La DVB se encuentra ampliamente distribuida en Chile, con estudios de seroprevalencia de 69,2 y 77,8% para la IX y X Región, respectivamente (Reinhardt y col 1990), y 59,7 y 86% en la Región Metropolitana para el ganado de leche y carne, respectivamente (Celedón y col 1996, Palacios 1996). En este estudio se determinó una alta prevalencia de esta enfermedad en la Región (96%), coincidiendo con los estudios anteriores. Aun cuando en la muestra hubo escasas lecherías libres de anticuerpos a VDVB, lo importante en esta enfermedad es conocer la fracción de predios en los que está ocurriendo infección activa. De acuerdo a esto, los países nórdicos dividen los predios en cuatro categorías o clases según la magnitud del valor ELISA registrado para los anticuerpos a VDVB y VHB-1 (clase 0, OD ≤ 0,05, Clase 1 OD 0,051 - 0,250, Clase 2 OD 0,251-0,550, clase 3 OD ≥ 0,551). En base a las características de la transmisión de estas enfermeda-des, se ha determinado que mientras más alto sea el valor ELISA (predios clase 3), mayor es la probabilidad que esté ocurriendo una infección activa o un cuadro agudo de la enfermedad, como asimismo mayor es la probabilidad de encontrar animales persistentemente infectados (PI) para el caso de DVB (Niskanen y col 1991, 1993). A pesar de que en promedio el 96% de las lecherías presentó anticuerpos

contra el virus DVB en los tres muestreos efectuados, sólo 73, 95 y 61 lecherías se clasificaron en clase 3 (39, 44 y 25% del total de cada muestreo) y son sospechosas por tanto de presentar infección activa. Las proporciones de lecherías en clase 3 en el grupo de seguimiento correspon-dieron a 37, 44 y 19%, respectivamente (cuadro 3). Estas observaciones sugieren un mayor dinamismo de este virus comparado con brucelosis y leucosis, consistente con la biología de este patógeno. Aun cuando no hay datos nacio-nales comparables, se estima que la proporción de lecherías en clase 3 es alta. Esta situación reflejaría la existencia de una presión de infección alta para esta enfermedad, favorecida por la inexistencia de medidas de control y deficiencias en la aplicación de medidas de bioseguridad por parte de los productores (Lindberg y Alenius 1999). No obstante, datos equivalentes obtenidos en un estudio realizado recientemente en Perú permitieron establecer que la proporción de lecherías en clase 3 era superior al reportado en nuestro caso (Stahl y col 2002). Las comunas con la mayor proporción de lecherías en clase 3 correspon-dieron a Curacautín (80%) y Ercilla (100%), mientras que la mayor cantidad de lecherías en clase 3 de esta muestra estuvieron concentradas en Vilcún, Freire y Pitrufquén, que corresponden a las comunas con mayor representación (figura 3). Sin embargo, no se pudo establecer una relación entre el número de animales en las lecherías y el riesgo de infección en los rebaños analizados (cuadro 4).

Los estudios disponibles acerca de la prevalencia de IBR en el país indican una alta prevalencia en el sur con valores prediales de 95% (Hochstein-Mintzel y col 1986) y de 86% en la zona central (Celedón y col 1996). En este estudio se pudo establecer un 76% de prevalencia de la infección por VHB-1 en las lecherías muestreadas de la IX Región, confirmando, al igual que DVB, que ambas enfermedades se encuentran altamente distribuidas. Sin embargo, en este caso una fracción mayor de lecherías fue clasificada en clase 3, las que tendieron a disminuir en los sucesivos muestreos de 62 a 41%, respectivamente (cuadro 3). Las comunas que concentraron la mayor cantidad de lecherías en esta clase fueron Vilcún, Freire y Pitrufquén, al igual que la situación observada para DVB (figura 3), siendo Freire la comuna que presentó la proporción más alta de lecherías en esta clase, lo que es consistente con el hecho de que en esta comuna predominan los rebaños grandes. Esta situación fue confirmada mediante el aná-lisis de Kruskall-Wallis que arrojó una relación altamente significativa entre el número de animales en ordeña y la presencia de esta enfermedad en la muestra. Esta prueba permitió confirmar que IBR se presenta con mayor proba-bilidad en los rebaños con un número más alto de animales por predio, donde existiría una mayor tendencia al stress debido a las condiciones de manejo y confinamiento, una de las principales causas que gatillan la aparición a esta enfermedad (Tikoo y col 1995).

La técnica de ELISA aplicada en este estudio permitió detectar de manera semicuantitativa la presencia de inmu-

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noglobulinas específicas presentes en la leche del estanque predial, producidas en respuesta a los patógenos causantes de las principales enfermedades analizadas en la Región. La aplicación de este sistema permitió la vigilancia y monitoreo predial de estas enfermedades a un costo relativamente bajo, contando con la ventaja de un diagnóstico precoz y de alerta temprana ante la introducción de algún patógeno en los predios. A diferencia de lo que ocurre con los mé-todos de diagnóstico actualmente en uso, esta plataforma ofrece la posibilidad de sistematizar y escalar el sistema de monitoreo de acuerdo a las necesidades, permitiendo además realizar el análisis de muestras individuales de animales para detectar y eventualmente eliminar a aque-llos que efectivamente se encuentren positivos para una determinada enfermedad. Además, junto a la integración a sistemas de información geográfica satelital, este sistema demostró la factibilidad de estudiar la epidemiología y distribución de una enfermedad en las distintas comunas de la Región, información que es de gran relevancia en el proceso de control y erradicación de una enfermedad en un área particular.

El sistema de monitoreo y vigilancia predial basado en el análisis de ELISA de muestras de leche del estanque predial permitió establecer por primera vez en la Región, que leucosis, IBR y DVB se encuentran ampliamente distribuidas en las lecherías, mientras que brucelosis se encuentra restringida a unas pocas lecherías. El acoplamiento de esta plataforma a un sistema de información geográfica satelital (SIG) permitió realizar un análisis espacial de la prevalencia de estas enfermedades en las diferentes co-munas de la Región, constituyéndose en una herramienta de apoyo para la vigilancia de estas enfermedades en las lecherías y para estudios epidemiológicos.

RESUMEN

Chile es reconocido internacionalmente por poseer una buena situación sanitaria pues el país ha podido alcanzar y mantener el estado de oficialmente libre de las principales enfermedades de la lista de la OIE. Sin embargo, aún coexisten en nuestros rebaños bovinos una serie de enfermedades, las cuales tienen un directo impacto en la producción, por cuanto disminuyen la fertilidad, producen pérdidas por aborto, alargan el lapso interparto y fundamentalmente constituyen barreras sanitarias para la exportación, ya que constituyen un riesgo de zoonosis para la población. En este trabajo se implementó un sistema de vigilancia predial basado en el análisis ELISA de muestras de leche del estanque, para estudiar la epidemiología y distribución espacial de cuatro de las principales enfermedades bovinas que afectan a la IX Región de Chile (brucelosis, leucosis bovina, DVB e IBR). Este sistema permitió monitorear el estado de estas enfermedades en 279 lecherías, cobertura que representó al 43% de las lecherías registradas en la IX Región, abarcando 19.635 vacas lecheras (14%). Con este sistema se pudo establecer por primera vez en la Región una alta prevalencia en la muestra para leucosis (59%), IBR (76%) y DVB (96%), mientras que se confirmó que brucelosis se encuentra restringida a unas pocas lecherías (5%). Este sistema de monitoreo predial acoplado al análisis espacial (SIG) permitió establecer la distribución de estas enfermedades en las distintas comunas de la Región, demostrando ser una valiosa herramienta de apoyo y de bajo costo para la vigilancia epidemiológica de enfermedades en el rebaño lechero, lo que avala la posibilidad de establecer dicha plataforma como sistema de vigilancia predial en la Región y su factibilidad de proyectarla a nivel nacional.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la asesoría brindada por el profesor Stefan Alenius de la Universidad de Ciencias Agrícolas (SLU) de Suecia y el apoyo técnico brindado en los muestreos por Horacio Floody de INIA-Carillanca. Además, agradecen la colaboración anónima y desinteresada de los productores de la IX Región que facilitaron el muestreo de sus rebaños.

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Arch Med Vet 41, 27-34 (2009)

ORIGINAL ARTICLE

Accepted: 03.07.2008.

* PO BOX 296, Coyhaique, Chile; [email protected]

The effect of degree of competition for feeding space on the silage dry matter intake and feeding behaviour of dairy cows

Efecto del grado de competencia por espacio de comedero en el consumo de materia seca y comportamiento del consumo de vacas lecheras

HF Elizaldea*, CS Mayneb

aCentro Regional de Investigación Tamel Aike, Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Chile.bAgri-Food and Bioscience Institute, Northern Ireland, Hillsborough, Co. Down BT26 6DR, UK.

RESUMEN

Veinticinco vacas lecheras fueron asignadas a cinco tratamientos con 1, 3, 5, 7 ó 9 vacas por espacio de comedero. Cada comedero consistió en un alimentador electrónico que permitía el acceso del animal a ensilaje dispuesto sobre una balanza. El comportamiento de consumo fue monitoreado con collares electrónicos que permitían la identificación individual de cada animal mientras consumía ensilaje. Los animales tuvieron acceso al ensilaje durante todo el día, el que fue ofrecido diariamente a las 9:30 h. No se utilizó concentrado. Las vacas fueron asignadas a un diseño de Cuadrado Greco-Latino con cinco períodos. Cada período consistió en 14 días, y para cada período se registró el comportamiento de consumo de una vaca por tratamiento con el resto de las vacas utilizadas para lograr el nivel de competencia asignado. Se observó un incremento lineal (P < 0,001) en el número de comidas por día y la tasa de ingestión, a medida que se incrementaba la competencia. Un aumento en la competencia resultó en una reducción lineal (P < 0,01) en el tiempo total de consumo, tiempo de consumo por cada comida y tamaño de cada comida. El consumo total disminuyó, tanto bajo la ausencia de competencia, como a altos niveles de competencia, observándose una tendencia cuadrática (P < 0,05) al incrementar los niveles de competencia. Se concluye que a niveles bajos de competencia las vacas consumen pocas comidas de mayor tamaño, pero en la medida que aumenta la competencia, éstas consumen el ensilaje en un gran número de pequeñas comidas. A niveles intermedios de competencia, las vacas mantienen su nivel de consumo como resultado de marcados cambios en su comportamiento ingestivo.

Key words: dairy cows, competition, intake, behaviour.Palabras clave: vacas lecheras, competencia, consumo, comportamiento.

cows was increased from 0.5 to 1.0 m of feeding space per animal, daily feeding activity increased by 14% and aggressive behaviour between animals decreased.

The aim of the present study was to evaluate the effect of competition between animals on dry matter intake and eating behaviour of late lactation dairy cows offered grass silage, using equipment which facilitates the automatic monitoring of food intake and feeding behaviour of indi-vidual animals kept in a group housed situation.

MATERIAL AND METHODS

TREATMENTS AND ANIMALS

Twenty five Friesian dairy cows in late lactation (aver-age milk yield 7.4 kg/day) were allocated to 5 treatments with 1, 3, 5, 7 or 9 cows per feeding space. Each feeding space consisted of a Calan gate with access to grass silage blocks placed on a load platform, as described by Forbes et al (1986). All animals were accustomed to the build-ing and the feeding during the preceding winter feeding period. Animals were offered medium-quality grass silage ad libitum for a seven day standardisation period prior to the start of the experiment.

INTRODUCTION

In group housing situations, the role of spacing during feeding is important since it has implications both for pro-duction, as related to food intake, and for housing design (Ferris et al 2006). Dairy system designers need to pay close attention to the needs of cows and all aspects of the animal area when developing designs and recommenda-tions (Mc Farland 2003). For example, Friend et al (1977) examined the effect of feed manger space per cow (0.1, 0.2, 0.3. 0.4 or 0.5 m/cow) on time spent eating and voluntary food intake. They found that when the length of manger was reduced below 0.2 m per cow, eating time and volun-tary food intake were reduced. It has been suggested that with trough feeding, competition for food will occur if all cows cannot eat at the same time (Albright 1993, Tolkamp et al 1998). However, there is little experimental data on the critical length of manger/cow for easy-feed systems, below which eating behaviour, intake and performance may be adversely affected. Work reported by DeVries et al (2004), indicated that when access to food for 24 Holstein

28

HF ELIZALDE, CS MAYNE

Cows were then allocated to a five period Graeco-Latin square design, in which the 5 treatments were grouped into replicates in three different ways with the consequence that the effects of three different sources of variation (i.e. gates, periods and competing animals) were equalized for all treatments (Cochran and Cox 1957). Each period consisted of 14 days, with the last five days of each period being the main recording period during which one cow per treatment was recorded for each period, with additional cows used to obtain the required level of competition. Recorded and non-recorded cows were rotated across treatments and gates over periods, as shown in table 1.

The silage offered in this experiment was harvested from a primary growth of a perennial ryegrass sward, using a double-chop harvester. An inoculant (Ecosyl ®), was applied at the rate of 2.50 litres per tonne of fresh grass. The grass was ensiled in walled silos, thoroughly compacted and covered with polythene sheeting weighted with rubber tyres. During feeding, the silage was removed from the silo using a block cutter, in blocks as required. Silage was offered to each treatment in sufficient quanti-ties to allow a refusal of 50 g/kg intake. Water was freely available at all times, from drinking troughs. No concen-trates were offered.

All animals were housed as a single group in cubicle accommodation with access to the silage controlled by 5 Calan gates. Treatment changeovers were made abruptly on the first day of each period. Cows were milked daily at 06:00 and 16:00 h with milk yields recorded at each milking.

DRY MATTER INTAKE AND FEEDING BEHAVIOUR

Each feeding space consisted of a Calan gate with access to grass silage blocks placed on a load platform. These load platforms consisted of four compressions type load cells, the output of which was input via a signal conditioner to a microcomputer. Cows had continuous access to the silage on the load platforms via a feed barrier with one access point (Calan gate) per platform. Each access point was fitted with an aerial loop which energized an active transponder and transmitted the identity of the cow to the microcomputer. Signals were stored on a microcomputer programmed to continu-ously record the weight on each weight platform to the nearest 100 g and the time. Information on timing and size of meals for individual cows for each day was then transferred to the mainframe computer for sorting and statistical analysis. Each day’s data file was sorted ac-cording to cow using the mainframe computer. In order to determine which consecutive meals should be merged according to a minimum intermeal interval criteria, an appropriate intermeal interval was then determined, using the method proposed by Forbes et al (1986). This involved plotting the frequency distribution of intervals between visits with the change in slope indicating the boundary between within-meal pauses and true between meal intervals. The sorted data was then scanned by means of a program in which the intermeal interval criteria were specified when activating the program. The data for dry matter content of the silage was also input onto the program at this stage.

Table 1. Allocation of cows to treatments. Asignación de las vacas a los tratamientos.

Gate Nº

1 2 3 4 5

Period I A1 A2 B C A3 D E FG

A4 H I J KL M

A5 N O PQ R S T U

Cows/gate 1 3 5 7 9

Period II A3 B C A4 D E FG

A5 H I J KL M

A1 N O PA R S T U A2

Cows/gate 3 5 7 9 1

Period III A5 D E FG

A1 H I J KLM

A2 N O PQ R S T U A3 A4 B C

Cows/gate 5 7 5 1 3

Period IV A4 N O PQ R S T U A5 A1 B C A2 D E F

GA3 H I J KL M

Cows/gate 9 1 3 5 7

Period V A2 H I J KL M

A3 N O PQ R S T U A4 A5 B C A1 D E F

G

Cows/gate 7 9 1 3 5

Treatment cows: A1 A2 A3 A4 A5.

Additional cows: B D E F G H I J K L M N O P Q R S T U.

29

DAIRY COWS, COMPETITION, INTAKE, BEHAVIOUR

This program then calculated information regarding : number of meals per day ; amount eaten per meal (kg DM); mean daily eating rate (g DM/min); eating rate for the first meal during the day (g DM/min ) and daily total silage intake (kg DM/day). The pattern of feed consumption throughout the day was also recorded using the mainframe computer, programmed to give the weight of feed consumed per cow continuously from 0 to 24 hours after feeding. Fresh silage was offered daily at 09:30 h. Daily samples of the silage were taken from each block of silage as loaded on the weigh platforms to give a bulked sample which was retained for determination of oven dry matter content. Once per week a sample of fresh silage (bulked across blocks) was analysed for toluene DM, ammonia - N, pH, volatile fatty acids, lactic acid, and ethanol, as described by MAFF (1981). Total N was determined by the macro – Kjeldahl method, using fresh samples of forage. Oven-dried samples were also analysed for MAD fibre (Clancy and Wilson 1966). Ash and GE con-centrations were analyzed as described by British Standard Institutions (1967). Daily silage dry matter intake and feeding behaviour were calculated on an oven dry matter basis. This was converted to a toluene dry matter basis, ethanol corrected.

LIVE WEIGHT AND MILK YIELDS

Live weights were recorded once per week during the experimental period. All animals were weighed to the nearest 0.5 kg on a 1500 kg capacity weighbridge, with weighing being carried out after pm milking. Individual milk yields were recorded at each milking to the nearest 0.1 kg.

STATISTICAL ANALYSIS

All data recorded during the last five days of each period i.e. milk yields, live weights, forage intake and feeding behaviour parameters were analyzed as 5 cows x 5 gates x 5 periods, Graeco-Latin square design with 5 treatments. Each of the 5 observations per treatment was used in deriving equations of response lines for increasing levels of competition, using the regression procedure of Genstat 5 Committee (1988).

RESULTS

SILAGE COMPOSITION

The chemical composition of the silage offered is given in table 2. Each value is the mean of ten observa-tions. The silage was well preserved, as indicated by its low pH value and low concentration of ammonia-N and butyric acid.

FEEDING BEHAVIOUR AND SILAGE DRY MATTER INTAKE

Sequences of visits alternating with short intervals were assumed to be part of the same meal. In order to

reduce the data to a more manageable form, a minimum intervisit - interval of 6 minutes was used.

Data on feeding behaviour and silage dry matter intake are presented in Table 3. There was a linear trend (P < 0.001) towards a higher number of meals per 24 h as the number of animals allocated per feed box increased. However, the amount eaten per meal decreased linearly (P < 0.01) with increasing number of animals per feed-ing space. Total feeding time per 24 h and feeding time per meal showed a similar trend, with linear reductions (P < 0.001) with increasing competition per feeding space. Mean daily eating rates increased markedly with increas-ing competition per feeding space (P < 0.001). A similar trend was found with eating rate during the first meal of the day, increasing linearly (P < 0.001) with increasing number of animals per feeding space.

Overall, total silage dry matter intake tended to be lower with the lowest and the highest levels of competition resulting in a quadratic trend (P < 0.05) with increasing competition per feeding space.

Data on the percentage occupancy of individual feeding spaces is also presented in table 3. There was a tendency towards increasing occupancy rate with increasing competition per feeding space, up to 7 cows per feeding space. Above 7 cows per gate, occupancy rate appeared to decrease.

PATTERN OF INTAKE DURING THE DAY

Treatment effects on silage dry matter intake at two hour intervals after offering fresh silage are presented in table 4 with the cumulative dry matter consumption over a 24 h period presented in figure 1. During the first two hours

Table 2. Chemical composition of silage as removed from the silo (g/kg toluene DM, ethanol corrected, unless otherwise stated). Composición química del ensilaje, tal como removido del silo (g/kg MS al tolueno, corregida por etanol, a menos que se señale de otra manera).

s.d.

Dry matter 222 ± 19.1

pH 3.68 ± 0.12

Composition of DM

Crude protein 137 ± 10.5

Ammonia N (g/kg TN) 72 ± 10.8

Acetic acid 22.8 ± 4.2

Propionic acid 0.72 ± 0.45

Butyric acid 1.02 ± 0.55

Lactic acid 136 ± 16.0

Ash 74 ± 9.9

MAD-fibre 353 ± 8.7

Ethanol 6.83 ± 2.5

30


Table 3. Effect of level of competition on feeding behaviour, dry matter intake, percentage occupancy of individual feed spaces and animal performance. Efecto del grado de competencia en el comportamiento del consumo, consumo de materia seca, porcentaje de utilización de los espacios individuales de comedero y la respuesta productiva animal.

Treatment Linear

trend Quadratic

trend

1 2 5 7 9 s.e.

Number of meals per day 11.0 13.2 15.0 15.4 16.9 0.80 ** *** NS

Amount eaten per meal (min) 0.90 0.80 0.69 0.74 0.57 0.06 * ** NS

Feeding time per meal (min) 30.9 19.1 11.3 11.3 5.9 2.60 *** *** *

Total feeding time (min/day) 339 253 170 174 100 12.5 *** *** *

Mean daily eating rate (g DM/min) 29.0 42.1 60.8 65.3 96.3 6.31 *** *** NS

Eating rate during the first main meal (g DM/min) 30.6 51.4 97.6 96.3 153.9 8.92 NS *** NS

Silage dry matter intake (kgDM/day) 9.8 10.6 10.4 9.6 9.6 0.37 NS NS *

Percentage occupancy of individual feed spaces (%) 24 53 59 85 63 NA NA NA NA

Animal data Mean live weight (kg)

561 567 554 549 541 3.5 *** *** NS

Milk yield (kg/ day) 8.0 7.5 6.9 7.4 7.3 0.33 NS NS NS

NA: Not applicable.

NS: Not significant.

0

2

4

6

8

10

12

2 4 6 8 10 12

Hours after feeding

Acc

umul

ated

dai

ly D

MI

(kg)

14 16 18 20 22 24

1 cow per gate 3 cows per gate 5 cows per gate

7 cows per gate 9 cows per gate

Figure 1. Effect of number of cows allocated per feeding space on the cumulative silage dry matter consumption over a 24 h period. Efecto del número de vacas asignadas por espacio de comedero en el consumo acumulado de materia seca de ensilaje en un período de 24 horas.

31


after feeding, silage dry matter intake was significantly higher (P < 0.001) with 1 and 7 cows per feeding space than when 5 or 9 cows were allocated per feeding space. Between 6-8 h after feeding, silage dry matter intake was significantly lower (P < 0.01) with 1 cow compared to 7 cows per feeding space, with the rest of the treatments being intermediate. By 10-12 h after feeding, animals on treatments with 5 or 7 cows per feeding space consumed significantly (P < 0.01) more silage dry matter, than when 1 cow was allocated per feeding space, with the remaining treatments being in an intermediate position. Between 16-18 h after feeding, silage dry matter intake was significantly higher (P < 0.05) with 5 cows than with 1 cow allocated per feeding space, with the rest of the treatments being intermediate and not differing significantly (P > 0.05) from each other. Increasing the number of cows allocated per feeding space had no significant effect (P > 0.05) on silage dry matter intake in the remaining time intervals.

LIVE WEIGHT AND MILK YIELD

Data on animal live weight and milk yield are presented in table 3. Animal live weight declined linearly (P < 0.001) with increasing number of animals per feeding space. At the same time, milk yields were not significantly (P > 0.05) affected by increasing level of competition.

DISCUSSION

Increasing the level of competition for silage between animals by increasing the number of cows allocated per

feeding space had a marked effect on feeding behaviour. In general, as the degree of competition increased, an increase in both number of meals per day and eating rate was observed, accompanied by reductions in total feeding time, feeding time per meal and average meal size. Hence, at low levels of competition, cows ate relatively few large meals, but as competition increased cows consumed silage in a larger number of small meals.

In the present study, overall silage dry matter intake was lower with no competition or with the highest level of competition, with a significant quadratic trend (P < 0.05). At intermediate levels of competition, cows tended to maintain their dry matter intake as a result of marked changes in eating behaviour. In the absence of competition, animals consumed large meals over a longer feeding time resulting in a lower total dry matter intake.

As intake per meal declined, there was a concomitant increase in eating rate. For example, the data presented in table 3 indicate a marked linear increase in rate of eating with increasing competition, reflecting the remarkable flexibility of the dairy cow to maintain dry matter intake (Grant 2006). However, the beneficial effect of a higher eating rate with increasing competition was insufficient to compensate for the large reduction in meal size at the highest level of competition, and a reduction in dry matter intake occurred.

These results are in general agreement with most of the available data reported in the literature. For example, early studies reported by Harb et al (1985) suggested that eating rates were increased when cows were group fed compared to when they were individually fed (57 vs.

Table 4. Effect of level of competition for feeding space on silage dry matter intake (kg) at two hour intervals after feeding initiation. Efecto del nivel de competencia por espacio de comedero en el consumo de materia seca de ensilaje (kg), cada dos horas luego de ofrecido.

Time intervals (hours after feeding) Level of competition (cows per gate)

1 3 5 7 9 Significance #

0-2 2.43b 1.71ab 1.44b 1.94b 1.38a ***

2-4 0.99 1.17 1.27 1.25 1.16 NS

4-6 0.93 0.86 0.68 0.73 0.60 NS

6-8 1.09a 1.30ab 1.42ab 1.77b 1.45ab **

8-10 1.45 1.47 1.26 1.50 1.18 NS

10-12 0.39a 0.86ab 1.13b 0.96b 0.76ab **

12-14 0.55 0.58 0.65 0.56 0.87 NS

14-16 0.54 0.86 0.54 0.79 0.82 NS

16-18 0.25a 0.39ab 0.83b 0.60ab 0.43ab *

18-20 0.36 0.45 0.27 0.33 0.48 NS

20-22 0.61 0.74 0.68 0.74 0.35 NS

22-24 0.16 0.19 0.13 0.23 0.22 NS

Means with the same superscripts, within rows, are not significantly different (P > 0.05).

# SED in all comparisons was 0.179.

32


43 g/min, respectively) and that feeding rate was further increased (71 g/min) if the number of trough spaces available to the group was reduced from 10 to 5. Later, Longenbach et al (1999), when restricting the manger space of dairy heifers from 47 to 31 and 15 cm, found that animals with restricted bunk space, ate faster in smaller meals to prevent a reduction in feed intake.

Work reported by Olofsson (1999) and Olofsson and Wiktorsson (2001), indicated that the average feed con-sumption tended to increase when the number of cows per feeding station was changed from 1 to 4. The most common explanation for this phenomenon is an increased maintenance activity factor in the group-fed animals, due to additional energy expenditure such as stress during competition for manger space (Coppock et al 1972). In the current trial, cows without competition (1 cow per feeding space) ate on average 6.6% less dry matter than those with increased levels of competition.

A number of studies reported in the literature suggest that group-fed animals eat more than isolated animals (Albright 1993, Nielsen 1999). Further, it has been noted that social stress increases food intake and body mass in hamsters (Foster et al 2006). However, there is little information regarding the effect of social factors on the dry matter intake of individual cows when offered feed in a group. It has been suggested that social facilitation (Ingrand et al 2000, Grant and Albright 2001), can result in enhanced intake in cows.

In the present study, all cows were fed as a group and higher feeding times were observed with one cow per feed-ing space. However, the low eating rates accompanied with fewer meals per day, i.e. larger intermeal intervals, suggest that a lack of competition may result in a reduction in dry matter intake due to a decrease in the rate of eating.

On the other hand, it is likely that the depression in intake observed at the higher level of competition (9 cows per Calan gate) might be due to stress of competition, i.e. more interaction between cows behind the feed barrier. As a result of this extremely high level of competition, the proportion of time during which feeding spaces were oc-cupied was reduced at the highest level of competition (table 3). It has been stated that restricting feed access may cause subclinical acidosis and an overall reduction in mean intake (Schwartzkopf-Genswein 2003). This may account for the reduction in dry matter intake observed at the highest level of competition. Furthermore, the mean daily eating rate at 9 cows per gate is high (96 g DM/min). It has been reported that a high eating rate may lead to a reduction in plasma volume and a rise in systolic blood pressure (Blair-West and Brook 1969). This may result in a temporary dehydration and consequently feeding inhibition (Cole 2000). The ten-dency for lower silage dry matter intakes with individually fed animals has major implications for animal production research studies. For example the results of the present work, taken in conjunction with those previously published in the literature (Phipps et al 1983, Phipps 1986) suggest

that intake of individually fed animals is between 6-9% lower than that of group fed animals subject to a degree of competition during feeding.

Consequently, the use of feed intake recording equip-ment such as that described by Forbes et al (1986), which enables automatic monitoring of food intake with group-fed animals under varying degrees of competition, may simulate more closely the on-farm situation, where there is normally a degree of competition during feeding.

PATTERNS OF CONSUMPTION

In general within a 24 h period, the majority of the dry matter intake and also most of the significant differences in intake tended to occur during daylight hours. For example, Tolkamp et al (2002) reported that loose-housed, lactating dairy cows offered grass silage ad libitum and concentrates, consumed most of the feed during daylight hours, with peaks and troughs in intake per hour of the feeding cycle just after noon and just after midnight, re-spectively. In the current trial, cows consumed on average 62% of their total daily silage dry matter intake between 9:30 am and 7:30 pm. For all treatments, a high propor-tion of the daily intake was consumed during the first 2 h after feeding. Studies have shown that the delivery of feed has great effect in terms of stimulating feeding activity in group-housed dairy cattle and is the primary influence in determining their daily feeding patterns (DeVries et al 2005, Mäntysaari et al 2006). This effect tended to be more pronounced at low levels of competition. Therefore, a more uniform pattern of consumption was observed with increasing competition, reflecting higher activity throughout the day. The relatively low levels of initial intake observed at high levels of competition, tended to be compensated later during the day between 6-8, 10-12 and 16-18 h after feeding, with cows consuming relatively more dry matter at this time.

It has been accepted that dairy cattle exhibit a diurnal feeding pattern where most of the feeding activity occurs during daylight hours. For example, Shabi et al (2005) observed that under dry lot, loose-housing, lactating dairy cows exhibit a distinct diurnal pattern in feeding activity; they were most active near sunrise and again near sunset. It is worth noting that in the present study, even at one cow per feeding space, some dry matter consumption was recorded 16-20 h after feeding, suggesting some circadian pattern of consumption (Takahashi and Zatz 1982).

LIVE WEIGHT AND MILK YIELD

Animal live weight tended to decrease linearly (P < 0.001) with increasing level of competition (table 3), probably as a result of an increase in the maintenance energy requirements with increased competition per feed-ing space, as suggested by Ellis et al (2006). It may be of interest to note, however, that animal live weight tended

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to be lower with one cow per feeding space compared to three cows per feeding space, although this may reflect gut fill effects resulting from reduced dry matter intake.

When Olofsson (1999) compared 1 or 4 mid lactation dairy cows per feeding station with a total mixed diet fed for ad libitum intake, he found no differences in milk pro-duction. In the current study, mean milk yields were not markedly affected (P > 0.05) by increasing competition. However, the lack of effect of increasing competition on milk yield in the present study may reflect the fact that animals in this study were in late lactation, with the result that treatment effects on dry matter intake tended to be reflected in live weight change.

It can be concluded that increasing the degree of com-petition per feed space had a marked effect on feeding behaviour. At low levels of competition, cows consumed relatively few, large meals but as the degree of competi-tion increased, cows consumed silage in a large number of small meals. Total silage dry matter intake was reduced by 6.6% in the absence of competition, with a further reduc-tion in intake at high levels of competition. Overall there was a significant quadratic relationship between degree of competition and total silage dry matter intake. The practical implication of these results is that provision of sufficient feeding space to enable all animals to consume forage simultaneously may reduce total forage intake in comparison to the situation where a moderate degree of competition is imposed at the feed barriers.

SUMMARY

Twenty five late lactation dairy cows were allocated to 5 treatments with either 1, 3, 5, 7 or 9 cows per feeding space. Each feeding space consisted of a Calan gate with access to silage blocks placed on a load platform. Eating behaviour was monitored by identifying cows using collar borne transponders. Animals had access to silage throughout the day, with fresh silage being offered daily at 09:30 h. No concentrates were offered during the experiment. Cows were allocated to a Graeco-Latin square design with 5 periods. Each period consisted of 14 days, and one cow per treatment was recorded for each period, with additional cows used to reach the required level of competition. All cows were rotated across treatments and gates over periods. As the degree of competition increased, animals modified their feeding behaviour, with a linear increase (P < 0.001) in both number of meals per day and eating rate. Increasing level of competition resulted in linear reductions (P < 0.01) in total feeding time, feeding time per meal and average meal size. Total dry matter intake was reduced both by the absence of competition and at high levels of competition, showing a quadratic trend (P < 0.05) with increasing competition. It is concluded that at low levels of competition, cows ate relatively few, large meals, but as competition increased cows consumed silage in a large number of small meals. At moderate levels of competition (3-7 cows/feeding space) cows maintained their intake as a result of marked changes in feeding behaviour.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank the staff of the dairy unit of Agri-Food and Bioscience Institute for co-operation and Dr. D. Kilpatrick of Queen’s University of Belfast, Biometrics Division, for advice and statistical analysis of the data.

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Arch Med Vet 41, 35-41 (2009)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 18.07.2008.

# FOMIX 2005-1, 16449.

* Km 1 carretera Huimanguillo-Cárdenas, Campo Experimental Hui-manguillo, INIFAP, Huimanguillo, Tabasco, México; [email protected]

Uso de suplementación mineral con monensina sódica en corderas Pelibuey durante el crecimiento postdestete#

Use of mineral supplementation with monensin sodium in Pelibuey female lambs during the postweaning growth

AT Piñeiro-Vázqueza, J Oliva-Hernándezb, c*, JA Hinojosa-Cuéllarb

aInstituto Tecnológico de Conkal, Yucatán, México.bUniversidad Popular de la Chontalpa, Tabasco, México.

cCampo Experimental Huimanguillo, Centro de Investigación Regional Golfo-Centro, INIFAP, Tabasco, México.

SUMMARY

Pelibuey lambs have a postweaning weight gain of less than 80 g/d when they are feeding on grazing pastures. Taking this into consideration, it is important to study several additives that could optimize the lambs’ growth. The aim of this study was to evaluate the influence of the mineral supplementation with monensin on postweaning performance of the Pelibuey ewe lambs. Twelve Pelibuey ewe lambs (76 days old and 11.7 kg body weight) were assigned to one of two treatments (six female lambs per treatment). The treatments consisted of mineral salt with or without monensin sodium, offered ad libitum during 66 days (ten days for adaptation to growth trial and 56 days for growth trial). Each lamb was assigned to one individual pen; the experimental unit was the lamb. The average daily intake for mineral salts was 12.2 ± 0.9 g/lamb in the treatment without monensin and 2.3 ± 0.6 g/lamb in the treatment with monensin. Mineral supplementation with monensin sodium did not affect (P > 0.05) the body weight, total body weight gain, average daily body weight gain and the growth of the lambs over 15 body measures. During 56 days of this study, the lambs gained weight, 1.5 ± 0.3 kg of total body weight/lamb and 27 ± 5 g daily body weight gain/lamb. The monensin treatment did not affect (P > 0.05) the daily intake of dry matter and crude protein. In Pelibuey ewe lambs fed with African Star hay, the mineral supplement with monensin sodium did not affect the average daily body weight gain nor the daily intake of dry matter and crude protein with respect to mineral supplement without monensin sodium.

Palabras clave: ionóforo, suplementación mineral, ganancia de peso, trópico húmedo.Key words: ionophore, mineral supplement, body weight gain, humid tropic.

y col 1979); por ejemplo, en ovinos alimentados con heno el consumo de monensina sódica (20 mg/kg de materia seca) reduce la cantidad de acetato e incrementa el pro-pionato, lo que permite incrementar la cantidad de energía disponible para su utilización (García y col 2000, Baran y Žitñan 2002). Adicionalmente, se ha reportado (Joyner y col 1979) que los corderos que reciben monensina en el alimento (10 a 20 mg/kg de materia seca) muestran un incremento en la energía metabolizable de la dieta. No obstante, existe controversia (Joyner y col 1979, Baran y col 1986, Huston y col 1990, Plata y col 2004) sobre el efecto final de la monensina en la ganancia diaria de peso de los corderos. En algunos estudios (Joyner y col 1979, McCann y col 1990, Martini y col 1996) se indica que en los corderos que consumen dietas con monensina se reduce el consumo de alimento y se incrementa la eficiencia alimenticia. Sin embargo, no se informa de un incremento en la ganancia de peso.

El uso de la monensina se ha estudiado fundamen-talmente en ovinos de razas de lana (Joyner y col 1979, Ricke y col 1984, Baran y col 1986, Huston y col, 1990, McCann y col 1990, Martini y col 1996, Baran y Žitñan 2002, Mouro y col 2006), existiendo pocos trabajos en ovinos de razas de pelo (Mazza y col 2001, Plata y col 2004, Araújo y col 2006).

INTRODUCCIÓN

La ganadería ovina localizada en la región tropical de México utiliza como base de la alimentación el pastoreo sobre gramíneas naturales y/o introducidas (González y col 2002a, González y col 2002b). Sin embargo, el tipo de gramíneas utilizadas muestra ciertas limitaciones en la cantidad y calidad de los nutrientes, por ejemplo, los valores de energía y proteína cruda son menores a los de pastos localizados en zonas templadas (Ósuna y col 1996).

Específicamente en las corderas Pelibuey se ha re-portado (González y col 2002a) una ganancia diaria de peso que no supera los 82 g/cordera cuando éstas son alimentadas con base exclusiva en el pastoreo durante la etapa postdestete. Una forma de mejorar la eficiencia productiva de las corderas es a través del uso de aditivos, por ejemplo, los ionóforos.

Los ionóforos permiten un mejor uso de la energía generada por la dieta que consumen los corderos (Joyner

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AT PIñEIRO-VÁZQUEZ Y COL

Adicionalmente, este ionóforo se ha estudiado a través de su incorporación en un complemento alimenticio (en donde se controla la cantidad que consume un animal) y no se encontraron evidencias que sustenten su uso como parte del suplemento mineral, por lo que se requiere generar conocimiento que contribuya a aclarar si el consumo de la monensina (vía un suplemento mineral) tiene un efecto positivo en la ganancia de peso de los corderos durante su crecimiento postdestete.

Por otra parte, el crecimiento de las corderas ha sido evaluado a través de la ganancia diaria de peso (Plata y col 2004), en donde el uso de parámetros de tipo zoométrico ha sido poco estudiado como un indicador de crecimiento (Martínez y col 1987, Pulgarón y col 2000). Con base en lo planteado anteriormente, el objetivo del estudio consistió en determinar la influencia de la suplementación mineral con monensina sódica sobre la eficiencia de crecimiento postdestete de las corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de África.

MATERIAL Y MÉTODOS

LOCALIZACIÓN DEL ENSAYO

El ensayo se realizó en la estación experimental Huimanguillo del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias localizada en Huimanguillo, Tabasco, México (17°50’ LN, 93°23’ LO), a una altitud de 20 metros sobre el nivel del mar. El clima de la región es cálido con lluvias todo el año (Af) y la temperatura media anual de 27,8 ºC (Anónimo 2007).

PERÍODO EXPERIMENTAL

El ensayo tuvo una duración de 66 días, y fue dividido en una fase inicial o preexperimental de 10 días y una fase experimental de 56 días.

ANIMALES

Se utilizaron 12 corderas Pelibuey con una edad de 76 ± 3 días y 11,7 ± 0,5 kg de peso corporal.

TRATAMIENTOS

Las corderas se distribuyeron al azar a uno de dos trata-mientos (seis corderas por tratamiento). Se consideró el tipo de nacimiento (origen único y gemelar) en la asignación de las unidades experimentales a los tratamientos. Se utilizó un diseño completamente al azar de un solo factor (sales minerales con o sin monensina sódica) (Cody y Smith 1991). La unidad experimental fue la cordera.

Se ofrecieron diariamente sales minerales con o sin monensina sódica. La composición de la sal mineral (Foscamag Plus®) sin monensina sódica (en base a 100 g) fue la siguiente: fósforo elemental 18,0 g; calcio 18,0 g; sodio 5,0 g; magnesio 4,5 g; azufre 0,3 g; levadura 1,0 g;

metionina de zinc 2.000 ppm; zinc 3.000 ppm; cobre 900 ppm; manganeso 900 ppm; hierro 200 ppm; yodo 40 ppm; cobalto 30 ppm y selenio 20 ppm. La composición de la sal mineral con monensina sódica (Foscamag Plus con monensina sódica®) fue similar al tratamiento control, pero ésta contenía 1.000 ppm de monensina sódica.

Las corderas tuvieron acceso libre a la sal mineral durante el alojamiento nocturno. En forma diaria se supervisó el nivel de sales minerales procurando que siempre existieran en el saladero. El nivel de consumo de las sales minerales cordera/día se determinó a través de cuantificar durante tres días consecutivos lo ofrecido y lo rechazado a intervalos de 14 días durante todo el período de estudio.

SISTEMA DE ALIMENTACIÓN

Las corderas se alimentaron en base a heno de Estrella de África. El heno se ofreció diariamente (08:00 a 18:00 horas), procurando que siempre existiera un nivel de rechazo de al menos un 15% de lo ofrecido. El heno se obtuvo por corte (a intervalos de 25 días) y secado a campo.

CONSUMO DE HENO PROMEDIO POR CORDERA

Se estimó el consumo voluntario de heno de Estrella de África cordera/día durante tres días consecutivos a inter-valos de 14 días. Para ello, se cuantificó el heno ofrecido, rechazado y consumido. Para estimar el consumo de materia seca y proteína cruda cordera/día se tomaron muestras de heno ofrecido y rechazado y se les determinó el valor de materia seca y proteína cruda.

ALOJAMIENTO

Durante la evaluación del consumo de heno las corde-ras se alojaron en corrales individuales (2,4 m2) provistos de piso de concreto, comedero de canoa y bebedero. Una vez finalizado el período de alimentación, las corderas se alojaron en grupo durante la noche (18:00 a 08:00 horas). Se utilizaron dos corrales, uno para cada tratamiento. Cada corral (25 m2) dispuso de un bebedero y saladero.

MEDICINA PREVENTIVA

El control de parásitos gastrointestinales se efectuó con febendazole (un ml por cada 10 kg de peso, vía oral; Panacur®) al inicio del estudio y a los 35 días del primer tratamiento.

VARIABLES A EVALUAR

Peso corporal de las corderas. Se evaluó al iniciar el estudio y posteriormente a intervalos de 14 días hasta la finalización del estudio. En cada sesión de pesaje las corderas fueron sometidas a un ayuno previo de 14 horas. Se utilizó una báscula electrónica (Gallagher®) con una precisión de 0,100 kg.

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IONÓFORO, SUPLEMENTACIÓN MINERAL, GANANCIA DE PESO, TRÓPICO HÚMEDO

Cambio de peso total. Se calculó a través de la diferencia entre el peso corporal final y el inicial.

Ganancia diaria de peso. Correspondió a la diferencia entre dos pesajes sucesivos dividida por el intervalo en días entre pesajes.

Promedio en el consumo voluntario de heno. Se deter-minó en base húmeda y seca. En cada período de 14 días se realizaron tres mediciones del consumo individual de materia húmeda y seca/día aportado por el pasto. El pro-medio de tres mediciones de consumo voluntario dentro de un período de 14 días se consideró como el promedio en el consumo voluntario de heno.

Promedio en el consumo de proteína cruda. Se determinó en cada período de 14 días. Para ello se estimó primeramente el valor de proteína cruda/día aportado por el pasto.

Promedio en el consumo de minerales. Se efectuó en cada período de 14 días. Se calculó el promedio en el consumo individual de minerales/día para cada tratamiento y durante todo el estudio.

Medidas corporales. Se establecieron 15 mediciones en el cuerpo de la cordera de acuerdo a la metodología pro-puesta por Martínez y col (1987). Las medidas corporales seleccionadas fueron: longitud del cuerpo, altura a la cruz y a la grupa, perímetro toráxico y abdominal, perímetro, longitud, anchura y grosor de la caña, perímetro y anchura del maslo de la cola, anchura del lomo y anchura de la cadera medida a la altura del acetábulo y de la tuberosidad isquiática. Todas las mediciones se expresaron en cm y se efectuaron con apoyo de una cinta métrica y escuadra (alturas), vernier (anchura y grosor) y cinta métrica de sastre (mediciones de perímetro y longitud).

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos correspondientes al consumo de minerales se analizaron mediante estadística descriptiva (media ± EE). Las variables paramétricas se compararon mediante un análisis de varianza de manera transversal (Cody y Smith 1991) con apoyo del programa computacional SAS versión 8,0 para Windows (SAS Institute, Cary, NC, USA). Las variables que no mostraron una distribución normal se analizaron con la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon para datos no pareados (Milton y Tsokos, 1987). Se consideró un P < 0,05 como estadísticamente significativo. Los datos se presentan como promedio ± error estándar.

RESULTADOS

El promedio diario en el consumo de las sales minerales fue de 12,2 ± 0,9 g/cordera en el grupo control y de 2,3 ± 0,6 g/cordera en el tratamiento con monensina sódica.

En ambos tratamientos se detectó una tendencia a reducir el consumo de sales minerales conforme incrementó el período de estudio postdestete (figura 1). Sin embargo, en el grupo de corderas que recibieron sales minerales con monensina sódica, el promedio del consumo de la sal mineral fue menor al del grupo control (desde el inicio del estudio) e incluso la sal mineral no fue consumida en el período final del estudio.

Durante los 56 días de evaluación, el promedio gene-ral en el cambio de peso fue de 1,5 ± 0,29 kg/cordera, la ganancia diaria de peso de 27 ± 5 g/cordera, el promedio en el consumo diario de proteína cruda estuvo entre 43 y 69 g/cordera y el de materia seca entre 248 y 396 g/cordera.

Los promedios de proteína cruda y materia seca en el heno ofrecido fueron de 13,0 ± 1,7 y 91,3 ± 1,0%, respectivamente, y para el heno rechazado de 9,4 ± 1,0 y 91,6 ± 0,8% respectivamente. En el cuadro 1 se muestran los valores de materia seca y proteína cruda del heno de Estrella de África ofrecido y rechazado durante el período de estudio.

Las corderas mostraron consumos de materia seca y proteína cruda similares (P > 0,05) entre tratamientos (cuadro 2 y figura 2).

El peso corporal de las corderas (figura 3) y el cambio de peso total en los 56 días de evaluación resultó similar (P > 0,05) entre tratamientos. El cambio de peso observado en ambos tratamientos fue positivo, 1,6 ± 0,5 kg en el tratamiento sin monensina y 1,4 ± 0,3 kg en el tratamiento con monensina.

Durante el período dos a tres del estudio (figura 4), las corderas del tratamiento de sales minerales con monensina sódica mostraron una tendencia (P = 0,07) a obtener una mayor ganancia diaria de peso con respecto a lo detectado en las corderas del grupo control. Sin embargo, en el pe-ríodo cuatro a cinco las corderas del tratamiento de sales minerales sin monensina lograron una mayor ganancia diaria de peso (P < 0,05) con respecto a las corderas del grupo con monensina. En los otros períodos y en el pro-medio de la ganancia diaria de peso total, los tratamientos estudiados resultaron similares (P > 0,05).

El crecimiento de las corderas medido a través de 14 medidas corporales resultó similar (P > 0,05) entre tratamientos (cuadro 3).

Los promedios en las medidas corporales a los 90 días de edad fueron: longitud del cuerpo, 35,6 ± 0,6 cm, altura a la cruz 49,7 ± 0,9 cm, altura a la grupa 49,7 ± 0,9 cm, perímetro toráxico 59,5 ± 1 cm, perímetro abdominal 61,7 ± 1 cm, perímetro de la caña 5,5 ± 0,1 cm, anchura de la caña 1,8 ± 0,02 cm, grosor de la caña 1,3 ± 0,02 cm, longitud de la caña 11,1 ± 0,15 cm, perímetro del maslo de la cola 7,4 ± 0,3 cm, anchura del maslo 2,04 ± 0,10 cm, anchura del lomo 12,4 ± 0,24 cm, anchura de la cadera medido a la altura del acetábulo 15,1 ± 0,3 cm, anchura de la cadera medido a la altura de la tuberosidad isquiática 10,6 ± 0,3 cm y anchura del hombro 14,6 ± 0,4 cm.

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0

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2 a 31 a 2 3 a 4 4 a 5

Número de período de estudio(cada período: 14 días de duración)

Con

sum

o de

sal

esm

iner

ales

/cor

dera

/día

(g)

Sin monensina Con monensina

Figura 1. Consumo de sales minerales (X ± EE) con y sin monensina sódica en corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de África durante la fase postdestete. Intake of mineral salts (X ± SE) with and without monensin in Pelibuey ewe lambs fed with African Star hay during the postweaning growth.

0

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50

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Con

sum

o di

ario

de

prot

eína

crud

a po

r co

rder

a



Figura 2. Consumo de proteína cruda (X ± EE) en corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de África durante la fase postdestete. Valores indicados en el mismo período resultaron similares (P > 0,05). Crude protein intake (X ± SE) in Pelibuey ewe lambs fed with African Star hay during the postweaning growth.

Peso

cor

pora

l (kg

)

0

2

4

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Figura 3. Efecto de la suplementación mineral con y sin mo-nensina sódica sobre el peso corporal postdestete (X ± EE) de corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de África. Valores indicados en el mismo período (de manera transversal) resultaron similares (P > 0,05). Effect of the mineral supplementation with and without monensin sodium on the postweaning body weight (X ± SE) of the Pelibuey ewe lambs fed with African Star hay.

1 a 2 2 a 3

3 a 4 4 a 5



Gan

anci

a di

aria

de

peso

(g/

cord

era)

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0

–20

Figura 4. Efecto de la suplementación mineral con monensina sódica sobre la ganancia diaria de peso postdestete (X ± EE) de corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de África. Valores indicados entre los períodos de estudio cuatro a cinco resultan diferentes (P < 0,05); en el resto de los períodos (comparadas transversalmente) los valores resultaron similares (P > 0,05). Effect of the mineral supplementation with and without monensin sodium on the postweaning weight gain (X ± SE) of Pelibuey ewe lambs fed with African Star hay.

Mientras que a los 120 días fueron de: longitud del cuerpo 36,0 ± 0,5 cm, altura a la cruz 50,5 ± 0,8 cm, altura a la grupa 50,7 ± 0,8 cm, perímetro toráxico 61,7 ± 1,2 cm, perímetro abdominal 64,7 ± 1,4 cm, perímetro de la caña 5,6 ± 0,09 cm, anchura de la caña 1,8 ± 0,03 cm, grosor de la caña 1,4 ± 0,02 cm, longitud de la caña

11,4 ± 0,13 cm, perímetro del maslo de la cola 7,0 ± 0,17 cm, anchura del maslo 2,1 ± 0,07 cm, anchura del lomo 12,3 ± 0,2 cm, anchura de la cadera medido a la altura del acetábulo 15,4 ± 0,3 cm, anchura de la cadera medido a la altura de la tuberosidad isquiática 10,7 ± 0,2 cm y anchura del hombro 14,5 ± 0,3 cm.

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Cuadro 1. Proteína cruda del heno Estrella de África ofrecido (HO) y rechazado (HR) durante la prueba de crecimiento de corderas Pelibuey. Crude protein in the African Star hay offered (HO) and rejected (HR) during the growth trial in Pelibuey ewe lambs.

Número de período de estudioz

1 2 3 4

Componente del heno día 1 a 14 día 15 a 28 día 29 a 42 día 43 a 56

HO HR HO HR HO HR HO HR

Materia seca (%) 92,8 92,9 93,2 92,6 90,1 91,3 89,2 89,5

Proteína cruda (%) 15,3 11,3 12,4 10,2 8,3 6,6 16,0 9,6

z: Cada período de estudio tuvo una duración de 14 días.

Cuadro 2. Influencia de la suplementación mineral con monensina sódica sobre el consumo de materia seca en corderas Pelibuey. Influence of mineral supplementation with or without monensin sodium on dry matter intake in Pelibuey ewe lambs.

VariableTipo de suplemento mineral

Sin monensina sódica Con monensina sódica

Período de estudio Promedio en el consumo

1 a 2: día 1 a 14 Heno en base húmeda (g) 265 ± 81 269 ± 18

Heno en base seca (g) 246 ± 8 250 ± 17







Número de observaciones 6 6

1: Media ± EE.

Valores indicados en la misma fila resultaron similares (P > 0,05).

DISCUSIÓN

Existe limitada información que cuantifique el consu-mo de sales minerales en ovinos de razas de pelo (Oliva y Vidal 2001, Cadenas-Ramírez y col 2007). En corderas Pelibuey X Blackbelly en crecimiento (primeros 60 días postdestete) se ha informado (Cadenas-Ramírez y col 2007) un consumo diario de sales minerales (Magnophoscal®) de 7,1 ± 0,7 g/cordera cuando éstas son alimentadas en base a pastoreo y un complemento alimenticio. En corderos machos Pelibuey en finalización, el consumo de sales minerales corresponde a 10,9 g/cordero/día (Oliva y Vidal 2001). En el presente estudio, las corderas mostraron un consumo de sales minerales variable, el cual no resultó superior a los 15 g/cordera y tendió a reducirse conforme se incrementó la edad de la cordera (figura 1).

En la figura 1 se describe el consumo de sales minerales mostrado por las corderas de ambos tratamientos, en donde se aprecia que existen períodos en donde el consumo de

sales minerales mostrado por las corderas indica amplia variación. Por ejemplo, del período cuatro a cinco de estudio las corderas del tratamiento de sales minerales con monensina muestran un nivel de consumo de sales minerales que representó el 0% del consumo mostrado por las corderas del tratamiento de sales minerales sin monensina. Para contrastar los resultados de este estudio con otros trabajos, no se dispuso de información que do-cumente el consumo de sales minerales adicionadas con algún ionóforo en corderas.

Aunque las corderas del tratamiento de sales mine-rales con monensina mostraron menos variación en el consumo de sales minerales con respecto al tratamiento sin monensina sódica (figura 1), el bajo consumo de sales minerales detectado en las corderas del tratamiento sales minerales con monensina no permitió que éstas lograran un consumo de monensina sódica en un nivel (20 mg/kg de materia seca) en el cual se tiene evidencia que ésta ejerce efectos en los patrones de fermentación ruminal

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(Baran y Žitñan 2002) y digestibilidad de la proteína cruda (Mazza y col 2001).

Las corderas del tratamiento de sales minerales con monensina mostraron una tendencia a disminuir el con-sumo de monensina sódica conforme avanzó el estudio; esta situación impide atribuir de manera contundente los efectos encontrados en este estudio a la monensina. No obstante, en los casos en donde los tratamientos resultaron similares, se describirán y discutirán los cambios detectados en las variables estudiadas.

En ambos tratamientos se detectaron cambios de la tendencia en el nivel de consumo de materia seca y proteína cruda. Particularmente, entre los días 28 y 42 de estudio (períodos de estudio tres a cuatro) las cor-deras disminuyeron en un 17% el consumo de materia seca y en un 41% el de proteína cruda con respecto al nivel registrado en los días 14 a 28. Es posible que este cambio se asocie al menor valor proteínico del heno de Estrella ofrecido durante los días 28 a 42. Sin embargo, al incrementarse la calidad proteínica del heno ofrecido en el período subsiguiente (días 42 a 56) los consumos diarios de materia seca/cordera y proteína cruda/corde-ra se incrementaron nuevamente a un nivel superior al registrado en los dos períodos previos. En apoyo a estos resultados, se ha indicado (Rojas y col 1984) que el valor de la proteína cruda en el heno de Estrella de África muestra una relación directa con el nivel de consumo de materia seca de los ovinos.

En este estudio, el nivel de consumo de sales minerales con monensina sódica (2,3 g/cordera/día) no permitió in-crementar el peso corporal o la ganancia diaria de peso de las corderas Pelibuey alimentadas con el heno de Estrella de África con respecto a lo detectado en las corderas del tratamiento de sales minerales sin monensina. Es probable que el bajo nivel de consumo de monensina sódica registrado en este estudio (2,3 mg/cordera/día) explique la ausencia de un efecto positivo del ionóforo utilizado sobre los cam-bios de peso de las corderas. Adicionalmente, se tienen evidencias (Plata y col 2004, Manríquez y col 2005) que indican que en corderos machos Pelibuey finalizados con dietas integrales la monensina sódica no ejerce influencia sobre la ganancia diaria de peso a una dosis de 100 mg/kg de materia seca (Plata y col 2004) o a 25 mg/kg de materia seca (Manríquez y col 2005).

Aunque se detectaron diferencias en la ganancia diaria de peso de las corderas entre tratamientos en el último período de estudio (período cuatro), previamente se ha indicado que el bajo consumo de monensina no permite atribuir este efecto al ionóforo.

La reducción en la ganancia de peso en ambos tra-tamientos puede ser explicada en parte por la amplia variación en el consumo de materia seca y proteína cruda y por la tendencia a una disminución en el consumo de minerales que experimentaron estas corderas conforme avanzó el estudio. Al respecto, se ha encontrado (Morales y col 2007) que en los forrajes existen desequilibrios en

el contenido mineral que pueden afectar la concentración sérica de minerales e influir en la salud y nivel de produc-ción del rumiante.

Las medidas corporales evaluadas (a los 90 y 120 días de edad) en las corderas no resultaron afectadas (P > 0,05) por alguno de los tratamientos utilizados. Al parecer, el bajo consumo de materia seca y proteína cruda registrado por las corderas explica la baja eficiencia de crecimiento medido a través del peso corporal y de medidas corporales.

Se concluye que en corderas Pelibuey alimentadas con base en heno de Estrella de África en la fase postdestete, la incorporación de monensina sódica en el suplemento mineral durante 56 días no permitió que éstas lograran un consumo de monensina sódica en un nivel en el cual se tiene evidencia que ésta ejerce efectos sobre la eficiencia de crecimiento. El nivel de consumo de monensina que registraron las corderas no ejerció efectos sobre los niveles de consumo de materia seca y proteína cruda, ganancia diaria de peso durante los primeros 42 días y no influyó sobre las medidas corporales de las corderas.

RESUMEN

Las corderas Pelibuey tienen una ganancia de peso menor a 80 g/día cuando son alimentadas en base a pastoreo. Tomando esto en consideración, resulta importante estudiar diversos aditivos que muestren posibilidades de optimizar el crecimiento de los corderos. El objetivo de este estudio consistió en evaluar la influencia de la monensina sódica sobre el crecimiento postdestete de las corderas Pelibuey. Doce corderas Pelibuey (76 días de edad y 11,7 kg de peso corporal) fueron asignadas a 1 de 2 tratamientos (seis corderas por tratamiento). Los tratamientos consistieron de sales minerales con o sin monensina sódica, ofrecidas a libertad durante 66 días (10 días para adaptación al estudio de crecimiento y 56 días para el estudio de crecimiento). Cada cordera fue asignada a un corral individual; la unidad experimental fue la cordera. El promedio en el consumo diario de sales minerales fue de 12,2 ± 0,9 g/cordera en el tratamiento sin monensina y 2,3 ± 0,6 g/cordera en el tratamiento con monensina. La suplementación mineral con monensina sódica no afectó (P > 0,05) el peso corporal, ganancia de peso total, promedio de ganancia de peso diaria y el crecimiento de las corderas establecido en 15 medidas corporales. Durante los 56 días del estudio, las corderas ganaron peso, 1,5 ± 0,3 kg/cordera y 27 ± 5 g/cordera/día. El tratamiento con monensina no influyó (P > 0,05) en el consumo promedio de materia seca y proteína cruda. En corderas Pelibuey alimentadas con heno de Estrella de África la suplementación mineral con monensina sódica no afectó el promedio en la ganancia de peso diario, ni el consumo diario de materia seca y proteína cruda con respecto a la suplementación mineral sin monensina sódica.

AGRADECIMIENTOS

El presente material forma parte del proyecto “Productividad de primalas de razas de pelo en pastoreo y con complementación energética y proteínica” y ha sido financiado parcialmente por el Gobierno del estado de Tabasco y el CONACYT 16449 FOMIX Tabasco 2005-1. Parte de este material conforma la tesis de licenciatura del primer autor.

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Arch Med Vet 41, 43-51 (2009)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 19.11.2008.

# Financiado por Proyecto Fondecyt 1050915.

* Casilla 537, Chillán, Chile; [email protected]

Impacto de la exposición prenatal a testosterona sobre parámetros biométricos y endocrinos en ovinos recién nacidos#

Impact of prenatal exposure to testosterone in biometrics and endocrine parameters of newborn lambs

SE Recabarrena*, PP Rojas-Garcíaa, MP Recabarrena, K Norambuenaa, T Sir-Petermannb

aLaboratorio de Fisiología y Endocrinología Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Concepción, Chillán, Chile.bLaboratorio de Endocrinología y Metabolismo, Facultad de Medicina Occidente, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

SUMMARY

Biometric and endocrine parameters were studied in male and female Suffolk Down newborn lambs born to mothers exposed to an excess of testosterone (EPT) during 60 days (EPT-P1) and during 90 days (EPT-P2), beginning at day 30 of pregnancy. Control mothers received vegetable oil. At delivery time the following data were registered: time of delivery, number of newborns per mother and sex of the newborn. At 8 hours postpartum, the characteristics of the genitalia, the anus-urinary meatus distance and body weight were recorded. Blood samples were taken to measure cortisol, T3 and T4 on plasma. Data regarding time of birth, number of offspring and sex did not show any differences between the three groups of newborn lambs. Females born to EPT-P1 and EPT-P2 mothers exhibited masculinized genitalia, showing a penis and an empty scrotum. Females born to EPT-P1 mothers showed lower body weight and lower plasma T4 concentrations than females and males born to the other 2 groups of mothers (P < 0.05). Plasma cortisol concentrations were not different between offspring from the 3 groups of mothers, however, females born to EPT-P1 mothers showed an inverse correlation between cortisol concentration and body weight. Data showed that exposure to testosterone during a critical time during pregnancy had a profound impact on genitalia of females, and depending on the dose it produces lower body weight and lower plasma T4 concentrations in newborn females. The EPT had no effect on biometric and endocrine parameters in newborn male lambs.

Palabras clave: testosterona, masculinización, hormonas tiroideas, programación fetal.

Key words: testosterone, masculinization of external genitalia, thyroid hormones, fetal programming.

INTRODUCCIÓN

La oveja constituye un valioso modelo experimental para el estudio de la fisiología reproductiva ovina y la de otros rumiantes menores o mayores. Además, por varios años se la ha utilizado como modelo experimental para el estudio de la fisiología reproductiva humana ya que la hembra ovina comparte algunos aspectos endocrino-reproductivos con la mujer (Foster 1988).

La exposición prenatal a hormonas esteroidales como testosterona y cortisol ha permitido dilucidar aspectos claves de la fisiología ovina y su impacto en la hembra y macho adulto. Entre ellos, se han podido reconocer las consecuencias del estrés prenatal sobre la reproducción y el metabolismo del ovino adulto (De Blasio y col 2007) y últimamente se han podido establecer no sólo los aspec-tos organizacionales de los esteroides sobre la fisiología reproductiva de la hembra adulta sino que también sobre el macho (Recabarren y col 2006).

Estudios pioneros en hembras ovinas prepúberes con exposición prenatal a testosterona (EPT) han podido establecer que la EPT durante el período crítico del de-sarrollo cerebral modifica el patrón de secreción de LH, conduciendo a un adelanto de la pubertad, lo cual a su vez depende del momento, duración y grado de la EPT (Kosut y col 1997). Este fenómeno, además, se hace in-dependiente del fotoperíodo, lo cual es una característica de la activación del eje reproductivo del macho. Otros estudios han mostrado que la EPT ocasiona alteraciones en la morfología ovárica (Clarke y col 1977, Rojas-García y col 2006), en la conducta sexual y en la sensibilidad al retrocontrol de progesterona (Robinson y col 1999, Recabarren y col 2005a).

Un aspecto que no se ha definido aún es si alguna de las consecuencias de la exposición prenatal a testosterona se puede reconocer al nacimiento, o bien sólo en etapas posteriores como la puberal o la adultez. Los estudios del grupo de Foster y de Padmanabhan (Wood y Foster 1998, Savabieasfahani y col 2005) han podido establecer que la EPT en altas dosis, sobre los 100 mg de testosterona propionato, adelanta el inicio de la pubertad neuroendo-crina y modifica el patrón de secreción de gonadotropinas del ciclo estral en hembras adultas. Además, estudios de nuestro laboratorio han demostrado que la EPT modifica la

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SE RECABARREN Y COL

sensibilidad tisular a la insulina (Recabarren y col 2005a), la respuesta ovárica a la LH endógena en hembras ovinas inmaduras (Recabarren y col 2005b) y la secreción de LH y testosterona en respuesta al test de GnRH en machos maduros e inmaduros (Recabarren y col 2007). No obstante, aún no se han descrito parámetros biométricos y hormonales de machos y hembras recién nacidos con EPT. Es posible que la EPT modifique algunos parámetros biométricos y endocrinos que se pueden reconocer al nacimiento. En el presente trabajo se describen algunos de esos parámetros, entre los cuales se incluyen: hora del parto, número de crías, sexo de las crías, características morfológicas de los genitales, presencia de partos múltiples, peso al nacimiento, concentraciones plasmáticas de cortisol, como una medida del estrés del nacimiento y de las hormonas tiroideas como un indicador del estado metabólico.

MATERIAL Y MÉTODOS

ANIMALES

Para este estudio se utilizaron 60 hembras ovinas adultas de la raza Suffolk Down y sus respectivas crías (90 en total), nacidas durante tres períodos reproductivos. Las hembras se obtuvieron de un predio particular (Fundo Los Gultros, comuna de San Fabián de Alico, VIII Región).

A fines de marzo-principios de abril de cada año, las madres se sincronizaron y se aparearon con carneros de fertilidad probada. La sincronización de los estros, para monta dirigida, se logró con la aplicación de un implante vaginal de progesterona por 7 días (Eazy Breed®, CIDR-G). Al momento de la remoción del implante, se inyectó pros-taglandina F2-α (Genestren, Drug Pharma®) intramuscular. Con este esquema de tratamiento se aseguró una fecha de cruzamiento y partos relativamente uniformes para la totalidad de las hembras.

Las hembras preñadas se distribuyeron al azar en tres grupos, un grupo control y dos de exposición prenatal a testosterona. Los protocolos de EPT de las madres se basaron según lo descrito por Kosut y col (1997) y Recabarren y col (2005a). El primer protocolo utilizado consistió en la administración intramuscular de testosterona propionato (Steraloids Inc., USA) disuelta en aceite vegetal a un grupo de 16 hembras preñadas (EPT-P1) en concentraciones de 60 mg dos veces por semana, a partir de los 30 días y hasta los 90 días de gestación. En el segundo protocolo (EPT-P2), a un grupo de 12 hembras preñadas se le administró 30 mg de testosterona propionato intramuscular disuelta en aceite vegetal dos veces por semana, a partir de los 30 días y hasta los 90 días de gestación, dosis que posterior-mente se elevó a 40 mg de testosterona propionato desde los 90 hasta los 120 días de gestación. El grupo control, constituido por 32 hembras preñadas, se subdividió en dos grupos de 16 hembras cada uno, a las cuales sólo se les administró el vehículo consistente en aceite vegetal (30-90 días y 30-120 días).

Las ovejas preñadas se alimentaron con dieta estándar para hembras en gestación, en base a alimento pelletizado cuya composición consistía en materia seca (avena, maíz, trigo, harina de gluten, harina de soya, harina de pescado, harina de girasol y sales minerales) con 18% de proteína, 11% de fibra cruda, 2% de grasa y 2.450 Kcal/kg (Compañía Molinera El Globo, Chile), pradera natural y agua ad libitum. Además se mantuvieron bajo estricto control veterinario durante toda la gestación, con seguimiento ecográfico realizado por el Laboratorio de Reproducción Animal en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepción en Chillán.

Las hembras parieron en los establos de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepción, en un ambiente estabulado y constantemente controlado. Al momento del parto, los machos y hembras recién nacidos se dejaron sin intervención alguna durante ocho horas para permitir la vinculación madre-cría y asegurar la posterior ingesta de calostro durante las primeras horas de vida. Se registraron in situ la fecha y hora del parto, el tratamiento de la madre, el número de crías por madre, la condición general de la madre y su cría. Posteriormente, a las ocho horas postparto, se observó y registró el sexo de la cría y las características de los genitales externos y se midió la distancia ano-meato urinario o vagina con una huincha de medir. Además, se les registró el peso corporal mediante pesa digital y se les tomó la primera muestra de sangre por venopunción de la vena yugular. Además, como medida profiláctica, se limpió y desinfectó el cordón umbilical con una solución de polividona yodada al 10%.

Las muestras de sangre se recibieron en tubos hepari-nizados (10 UI de heparina/1 mL de sangre). Los tubos se centrifugaron a 1.000 x g por 10 minutos a 4 °C (IEC Centra 7-R•). Posteriormente el plasma se rescató usando pipetas Pasteur y se depositó en microtubos Eppendorf• de 1,5 mL, los que se conservaron a –20 °C hasta el momento de la determinación hormonal por radioinmunoanálisis (RIA).

MEDICIÓN DE HORMONAS

La medición de la concentración plasmática de cortisol, triyodotironina (T3) y de tiroxina (T4) plasmática se realizó en el Laboratorio de Fisiología y Endocrinología Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias (Universidad de Concepción) mediante RIA, utilizando kits comerciales (Coat-A-Count, DPC, USA). El RIA de cortisol presentó un coeficiente de variación intraensayo de 3% e interensayo de 7%, y un nivel de detectabilidad de 5 µg/dL definido como el 90% del buffer control (Recabarren y col 2000, Recabarren y col 2004). Para el RIA de T3, el coeficiente de variación intraensayo fue 2% e interensayo 5%, y un nivel de detectabilidad de 13 ng/dL definido como el 90% del buffer control. Para el RIA de T4 los coeficientes in-traensayo e intersayo fueron 2% y 5%, respectivamente, y un nivel de detectabilidad de 0,97 µg/dL definido como el 90% del buffer control.

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TESTOSTERONA, MASCULINIZACIÓN, HORMONAS TIROIDEAS, PROGRAMACIÓN FETAL

Todos los procedimientos experimentales realizados fueron aprobados previamente por el comité ético local para la investigación animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepción.


Se utilizó análisis de varianza (ANDEVA) de dos vías (dos sexos y tres tratamientos) con comparación de los promedios con el test de Newman Keuls para las variables hormonales y parámetros biométricos (distancia ano-meato urinario, pesos al nacimiento de las crías), utilizando el programa computacional GB-Stat v.5. Para cuantificar la relación entre las variables peso y concentración plasmá-tica hormonal se utilizó la Correlación de Pearson a través del programa Prisma GraphPad 4,0. La hora del parto se distribuyó en cuatro períodos de seis horas cada uno, correspondiente a las 24 horas del día (24:00 a 05:59 h; 06:00 a 11:59 h; 12:00 a 17:59 h y 18:00 a 23:59 h). El tipo de parto y sexo de las crías se expresaron en forma porcentual. Se consideró para todos los análisis un P < 0,05 como estadísticamente significativo. Los datos se expresan como promedio ± error estándar.

RESULTADOS

PARÁMETROS BIOMÉTRICOS

Horario de los partos. El cuadro 1 muestra la distribución porcentual de los partos en los cuatro períodos horarios

descritos. Se registró un total de 86 crías (cuatro crías no fueron incluidas en este análisis porcentual por no tener el registro horario de su nacimiento).

En las madres control la mayor cantidad de nacimientos se concentró durante la noche en el período comprendido entre las 24:00 h y las 05:59 h (36%), mientras que en las madres EPT-P1 la mayor cantidad de nacimientos se concentró en el período comprendido entre las 06:00 h hasta las 11:59 h (43,8%). Finalmente, en las madres EPT-P2 la mayor cantidad de nacimientos se produjo durante el día y en dos períodos consecutivos, desde las 24:00 h hasta las 05:59 h (40%) y desde las 06:00 h hasta las 11:59 hs (40%).

Número de crías. El cuadro 2 muestra el porcentaje de partos que tuvieron como resultado una cría (parto único) o dos crías (partos melliceros). Considerando todos los partos, un 48,3% fueron partos únicos y un 51,7% fueron melliceros. Si se separa por grupo, las madres controles tuvieron mayormente partos únicos (parto único: 59,4%; parto mellicero: 40,6%), mientras que las madres EPT-P1 y EPT-P2 mayormente tuvieron parto mellicero (EPT-P1: parto único: 31,3%; parto mellicero: 68,7% y EPT-P2 parto único: 41,7%; parto mellicero: 58,3%).

El cuadro 2 muestra además para cada grupo de hem-bras el porcentaje de mellizos del mismo sexo y de sexos diferentes. En los partos en donde ambas crías fueron machos, el grupo EPT-P1 presentó la mayor cantidad con un 44,4%; seguido por el grupo EPT-P2 con un 33,3% y el grupo control con un 22,2%. El grupo de hembras control

Cuadro 1. Porcentaje de ovejas madres que paren en cuatro intervalos horarios durante las 24 horas del día. Las madres EPT recibieron testosterona propionato por 60 (P1) o 90 días (P2) a partir del día 30 de preñez mientras que las madres control recibieron aceite vegetal. Percentage of ewes delivering during four intervals of time during a 24-hours day. EPT mothers received testosterone propionate for 60 or 90 days beginning at day 30 of pregnancy while control mothers received vegetable oil.

Hora del día

24:00-05:59 06:00-11:59 12:00-17:59 18:00-23:59

Madres control 36% 32% 19% 13%

Madres EPT-P1 25% 43,8% 2,5% 18,8%

Madres EPT-P2 40% 40% 10% 10%

Cuadro 2. Tipo de parto y sexo de crías melliceras nacidas de ovejas tratadas con testosterona durante la preñez y ovejas control. Las madres EPT recibieron testosterona propionato por 60 (P1) o 90 (P2) días a partir del día 30 de preñez mientras que las madres control recibieron aceite vegetal. Delivery type and sex of the offspring born to ewes exposed to testosterone during pregnancy and to control sheep. EPT mothers received testosterone propionate for 60 or 90 days beginning at day 30 of pregnancy while control mothers received vegetable oil.

Tipo de parto Sexo de los mellizos

Unico Múltiple Macho-macho Macho-hembra Hembra-hembra

Madres control 59,4% 40,62% 22,2% 42,8% 62,5%

Madres EPT-P1 31,3% 68,7% 44,4% 28,6% 37,5%

Madres EPT-P2 41,7% 58,3% 33,3% 28,6% 0%

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SE RECABARREN Y COL

presentó la mayor cantidad de partos con ambas crías hembras con un 62,5%, el grupo EPT-P1 con un 37,5% y el grupo EPT-P2 no tuvo este tipo de parto. Por último, en los partos en los que se obtuvo una cría de cada sexo el grupo de hembras control registró un 42,8% y los grupos de hembras EPT-P1 y-P2 obtuvieron, ambos, un 28,6%.

Sexo de las crías. En el cuadro 3 se entregan los porcentajes de machos y hembras nacidos en cada grupo de madres. Las hembras masculinizadas que poseían escroto vacío y pene fueron incluidas en el grupo de las hembras. En el grupo de las madres control, el mayor porcentaje de crías nacidas fue de sexo femenino con un 57%; en el grupo de madres EPT-P1 el mayor porcentaje de crías nacidas fue de sexo masculino con un 59%; y en el grupo de madres EPT-P2 el mayor porcentaje de crías nacidas fue de sexo masculino con un 63%.

Peso de las crías. La figura 1 muestra la comparación entre los pesos al nacimiento de las crías nacidas de madres control, madres EPT-P1 y madres EPT-P2 en ambos sexos. Las hembras recién nacidas de madres EPT-P1 presentaron estadísticamente un menor peso al nacimiento en compara-ción a las hembras nacidas de madres control y nacidas de madres EPT-P2. Además pesaron menos que los machos de su mismo grupo y de los otros grupos (P < 0,05).

Características de los genitales externos y distancia ano-meato urinario. Las hembras nacidas de madres EPT exhibieron una marcada masculinización de los genitales externos (figura 2), con la presencia de pene y un escroto vacío. Como complemento de la observación cualitativa se midió la distancia ano-meato urinario, la cual es un bioindicador de masculinización de la genitalia externa. En el cuadro 4 se muestra el promedio de las distancias ano-meato urinario separado por sexo y tratamiento. Las hembras EPT-P1 y EPT-P2 mostraron mayor distancia ano-meato urinario que las hembras control (P < 0,01) y similar a la que presentaron los machos. La distancia ano-meato urinario de las hembras EPT-P2 fue menor a la de hembras EPT-P1, pero mayor que el de las hembras control (P < 0,01).

Cuadro 3. Porcentaje de machos y hembras nacidos de ovejas expuestas a testosterona durante la preñez y de madres control. Las madres EPT recibieron testosterona propionato por 60 (P1) ó 90 (P2) días a partir del día 30 de preñez mientras que las madres control recibieron aceite vegetal. Percentage of male and female lambs born to ewes exposed to testosterone during pregnancy and to control mothers. EPT mothers received testosterone propionate for 60 or 90 days beginning at day 30 of pregnancy while control mothers received vegetable oil.

Grupos Machos Hembras

Madres control 43% 57%

Madres EPT-P1 59% 41%

Madres EPT-P2 63% 37%

Peso

cor

pora

l (kg

)

Hembras Machos6

5

4

3

2

1

0n = 23 n = 11 n = 7 n = 19 n = 16 n = 12

*

Figura 1. Peso corporal (promedio ± EE) en ovinos recién na-cidos de madres control y de madres con exposición prenatal a testosterona. El color de la columna es indicativo del tratamiento (blanca = control, negro = EPT-P1, gris = EPT-P2). Se muestran en forma separada hembras y machos. Dentro de cada columna se señala el número de recién nacidos de cada grupo. * indica diferencia significativa respecto a los otros grupo (P ≤ 0,05, ANDEVA). Body weight (mean ± SEM) in newborn lambs born to control mothers and to mothers with EPT. Colour of column indicates the treatment (white = control, black = EPT-P1, gray = EPT-P2). Males and females are presented separately. Within each column, the number of newborn is given for each group. * indicates significant differences with respect to the other groups (P ≤ 0,05, ANOVA).

Hembras Machos

T4 (u

g/dL

)

12,5

10,0

7,5

5,0

2,5

0,0

n = 23 n = 11 n = 7 n = 19 n = 16 n = 12

T3 (n

g/dL

)

350300250200150100

500

n = 23 n = 11 n = 7 n = 19 n = 16 n = 12

Cor

tisol

(µg/

dL)

141210

86420

n = 23 n = 11 n = 7 n = 19 n = 16 n = 12

a

b

c

Figura 2. Concentraciones plasmáticas (promedio ± EE) de a) cortisol, b) triyodotironina (T3) y c) tiroxina (T4) en ovinos recién nacidos de madres control y madres con EPT. El color de la columna es indicativo del tratamiento (blanca = control, negro = EPT-P1, gris = EPT-P2). Se muestran en forma separada hembras y machos. Dentro de cada columna se señala el número de recién nacidos de cada grupo. Plasma concentrations of a) cortisol, b) triiodothyronine (T3) and c) thyroxine (T4) in newborn lambs born to control mothers and to mothers with EPT. Colour of column indicates the treatment (white = control, black = EPT-P1, gray = EPT-P2). Males and females are presented separately. In each column, the number of newborns is given for each group.

47


Cuadro 4. Distancia (cm) ano-meato urinario en machos y hembras recién nacidos de ovejas expuestas a testosterona du-rante la preñez y de ovejas control. Las madres EPT recibieron testosterona propionato por 60 (P1) o 90 (P2) días a partir del día 30 de preñez mientras que las madres control recibieron aceite vegetal. Distance from anus to urinary meatus in newborn male and female lambs born to ewes exposed to testosterone during pregnancy and to control mothers. EPT mothers received testosterone propionate for 60 or 90 days beginning at day 30 of pregnancy while control mothers received vegetable oil.

Distancia (cm)

Machos control 16,1 ± 0,4a

Hembras control 1,63 ± 0,1b

Machos EPT-P1 15,4 ± 0,45

Hembras EPT-P1 14,5 ± 0,3

Machos EPT-P2 15,3 ± 0,58

Hembras EPT-P2 11,5 ± 2,0

A es distinto de b (P ≤ 0,05, paired t test).

PARÁMETROS ENDOCRINOS

Concentraciones plasmáticas de cortisol, T3 y T4. La figura 2 muestra las concentraciones plasmáticas de cortisol, T3 y T4, en las crías macho y hembra nacidas de madres control y de madres EPT a las 8 horas postparto. No hubo diferencias estadísticas al comparar los tres grupos de crías. Las hembras nacidas EPT-P1 presentaron un promedio de cortisol plasmático de 8,99 µg/dL, un valor levemente superior al de los otros grupos de hembras y machos (figura 2 a). Además, este grupo presentó un peso promedio significativamente más bajo. Es por ello que se evaluó la correlación entre ambos parámetros. Se encontró que en todas aquellas hembras nacidas EPT-P1 cuya concentración plasmática de cortisol fue mayor a 8,99 µg/dL, el peso se correlacionaba inversamente con esta concentración de cortisol, es decir, aquellas hembras que tuvieron cortisol alto, su peso fue más bajo (figura 3). Esta correlación no se observó en los otros grupos de animales control o EPT-P2.

En relación a la T3, no hubo diferencias estadísticas al comparar los tres grupos de crías, mientras que en la T4 las hembras del grupo EPT-P1 mostraron una menor concentración de T4 que las hembras del grupo control. La correlación peso corporal-niveles de tiroxina es un importante bioindicador de estado metabólico en recién nacidos animales y humanos (De Blasio y col 2006, Fisher 2007). Al evaluar esa correlación en nuestros animales encontramos que en las hembras del grupo control existe una correlación directa entre peso corpo-ral y T4 plasmática (figura 4). Esta correlación no está presente en machos y se pierde en las hembras nacidas EPT-P1 y EPT-P2.

Peso corporal (kg)3 4 5 6 7

Cor

tisol

(µg

/dL

)

30

20

10

0

Figura 3. Correlación entre el peso corporal y el cortisol plasmático en corderos recién nacidos de madres EPT-P1. Cada punto en el gráfico indica un recién nacido. La correlación utilizada fue de Pearson, con un valor de R2 de 0,374 y un valor de P ≤ 0,05. La línea recta da cuenta del ajuste de los valores a la correlación. La pendiente de la línea recta es significativamente distinta de 0. Correlation between body weight and plasma cortisol con-centrations in newborn lambs of mothers with EPT-P1. Each point in the figure indicates one newborn. Pearson correlation was used with a R2 of 0,374 and P ≤ 0,05. The slope of the straight line is significantly different from 0.

Peso corporal (kg)

2 3 4 5 6 7

T3

ng/d

L

20

15

10

5

0

450

350

250

150

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T4 ug/dL

Figura 4. Correlación entre peso corporal y hormonas tiroideas en corderos hembras recién nacidos de madres control. Cada punto en el gráfico indica un recién nacido. La T3 está representada por los círculos negros y la T4 por los círculos blancos. La co-rrelación utilizada fue de Pearson, con un valor de R2 de 0,302 y un valor de P ≤ 0,05. La línea recta da cuenta del ajuste de los valores a la correlación (línea punteada = T3, línea continua = T4). La pendiente de la línea recta es significativamente distinta de 0 sólo para T4. Correlation between body weight and T4 in newborn female lambs of control mothers. Each point in the figure represents one newborn lamb. Pearson correlation was used with a R2 of 0,302 and P ≤ 0,05. The slope is significantly different from 0 only for T4.

DISCUSIÓN

El presente estudio describe una serie de variables relacionadas con el parto de hembras ovinas Suffolk-Down y sus crías bajo condiciones de estabulación y medio-ambientales controladas y cómo puede una exposición

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prenatal a testosterona alterar estas variables. Las hembras con exposición prenatal fueron tratadas con testosterona propionato durante una etapa crítica del desarrollo del feto, lo que equivale a un cambio en el ambiente intrauterino que deja importantes efectos en el recién nacido. El mayor impacto en los parámetros analizados se observó en las hembras nacidas de madres EPT-P1 (60 mg de testostero-na, dos veces por semana, del día 30 al 90 de gestación), las cuales, además de la masculinización de los genitales externos, exhibieron menor peso al nacimiento y menor concentración de tiroxina a las ocho horas postparto que las hembras control y machos. Las hembras nacidas de madres EPT-P2 también presentaron masculinización de los genitales externos, pero sin exhibir menor peso al nacimiento ni menor concentración de tiroxina que las control. Los machos nacidos de madres control y madres EPT no se diferenciaron entre sí en ninguno de los parámetros estudiados. Indudablemente, la aparición de aspectos fenotípicos masculinos en una hembra denota un fuerte efecto del tratamiento con testosterona sobre el desarrollo genital.

Los resultados en relación al parto muestran que los nacimientos en las hembras control se concentraron en dos intervalos horarios que abarcaron entre la medianoche y las seis de la mañana y entre las seis de la mañana y el mediodía. Cerca del 70% de los partos ocurrieron entre esos horarios. El horario de inicio del parto podría estar en relación al ritmo circadiano de cortisol. El cortisol plasmático empieza a aumentar en las primeras horas de la madrugada en varias especies para alcanzar un máximo alrededor de las 07:00-08:00 h (Cagnacci y col 1998, Hernandes y col 2000). El ritmo circadiano de cortisol en los fetos previo al parto es desconocido, pero se ha evidenciado que los fetos de ovejas exhiben un ritmo de cortisol (Parraguez y col 1989). Lo observado en cuanto al horario de los partos es similar a lo encontrado en humanos. Estudios realizados en mujeres a punto de parir indican que existe una mayor incidencia de partos en la madrugada y al anochecer (Cagnacci y col 1998, Anderka y col 2000). Sin embargo, la distribución horaria de los partos en las madres EPT-P2 fue más tardía en comparación con las hembras control. La razón de ese retraso y desplazamiento desde las primeras horas de la mañana hasta el horario de la tarde es desconocida, pero podría estar relacionada con el ritmo circadiano de cortisol del feto. Cabe hacer notar que no se encontró una relación entre el sexo de la cría y la hora del parto.

En las hembras control, el 59,4% de los partos fue parto único, mientras las hembras EPT fue mayormente de mellizos. La frecuencia de la obtención de mellizos es un carácter racial y, por tanto, de base genotípica, si bien se ha establecido que influyen en diversos grados factores ambientales, sobre todo la alimentación. No obstante, en los ovinos la heredabilidad (h2) de nacimientos gemela-res es, en general, baja (10-15%). Las madres de nuestro estudio eran todas multíparas. Si se toman en cuenta todas

las madres, el porcentaje de madres melliceras sobrepasa levemente el 50%. El tratamiento con testosterona a las madres no debería influir en el número de crías gestadas ya que la exposición a un exceso de testosterona se inicia a los 30 días postencaste, aunque Wolf y col (2002) obser-varon que en ratas la EPT puede llevar a efectos tóxicos con reducción en el tamaño de la camada y la viabilidad de los embriones. Además, el sexo de las crías nacidas de las hembras control es 57% hembras y 43% machos. Si se toma en consideración el total de crías, independiente del tipo de madre, el porcentaje de machos fue mayor que el de hembras (55% versus 45%), producto de que las madres con los protocolos de exposición a testostero-na parieron más machos que hembras. En este caso, se debe considerar que el tratamiento tampoco influiría en el sexo de la cría ya que éste se establece en el momento de la fecundación, a menos que la exposición prenatal a testosterona determinara una mayor mortalidad embrio-naria de hembras a partir de los 30 días postgestación. Sin embargo, el seguimiento ecográfico no mostró signos de muerte embrionaria, por lo que los resultados en relación al sexo serían determinados por el azar.

Las hembras nacidas de madres EPT-P1 y -P2 presentaron masculinización de los genitales externos con la presencia de pene y un escroto vacío de menor tamaño que el de los machos y con una distancia ano-meato urinario semejante a los machos. Estos resultados, con dos protocolos dife-rentes de exposición prenatal a testosterona, confirman lo observado por otros autores. Se ha descrito que hembras nacidas de ovejas tratadas con 200 mg de testosterona entre los 30 y 90 días de gestación nacen con genitales completamente virilizados, con un pseudopene y una bolsa escrotal vacía en lugar de una apertura vaginal (Herbosa y col 1995, Robinson y col 1999). Las hembras masculini-zadas presentan ovarios y un útero con terminación ciega pero sin vagina (Unsworth y col 2005). Se ha establecido además, que el efecto virilizante observado en los genita-les externos se acompaña de conductas masculinas en la hembra adulta (Orgeur 1995), de múltiples alteraciones neuroendocrinas y ováricas como el hipergonadotropismo (aumento en la secreción de hormona luteinizante, LH), la sensibilidad reducida al retrocontrol positivo y negativo de estradiol (Sharma y col 2002, Savabieasfahani y col 2005, Vergara 2007), el desarrollo de ovarios multifoliculares (Padmanabhan y col 2006, Rojas-García y col 2006), así como alteraciones en el perfil de LH y estradiol en la fase folicular del ciclo estral (Vergara 2007). En contraste, otros estudios han mostrado que las hembras nacidas de madres tratadas con testosterona entre los 60-90 días de gestación (segunda mitad del período crítico) nacen con genitales externos normales, pero tienen la postura urinaria masculinizada (Clarke y col 1976, Herbosa y col 1995), lo que permite concluir que el período crítico para la masculinización de los genitales externos ocurre entre los 30 y 60 días de gestación al igual que la masculinización del sistema nervioso central (SNC).

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Los efectos de la EPT en los genitales externos fe-meninos se han descrito en otras especies. En ratas, Wolf y col (2002) encontraron que la administración prenatal de propionato de testosterona condujo a la formación de genitales externos masculinos, con la distancia ano-genital aumentada. En humanos, las niñas expuestas prenatalmen-te a altos niveles de andrógenos, como en el caso de la hiperplasia suprarrenal congénita, presentan virilización de los genitales externos al nacimiento, incluyendo clito-romegalia y fusión de los labios (Nimkarn y New 2007, New 2004). El efecto de los andrógenos prenatales sobre el tracto reproductivo en la hembra se debería a que la testosterona y dihidrotestosterona mantienen el sistema de conductos de Wolff y promueven el crecimiento y desa-rrollo de glándulas accesorias y genitales externos de sexo masculino, mientras que la regresión del tracto reproductor femenino es principalmente dependiente de la hormona antimülleriana (AMH) que se secreta desde la célula de Sertoli fetal (Josso y col 2006, Wolf y col 2002).

La exposición prenatal a testosterona influyó en el peso de nacimiento de las crías hembras de las madres EPT-P1. Las hembras recién nacidas EPT-P1 pesaron menos que las hembras control, que las hembras EPT-P2 y que los machos. Este fenómeno estaría asociado a la dosis y duración de la exposición a testosterona, dado que sólo se observa con el tratamiento EPT-P1. Estos resultados concuerdan con el estudio de Manikkam y col (2004) quienes observaron que el tratamiento con dosis de 100 mg de testosterona propionato dos veces por semana entre los 30 y 90 días de gestación redujo el peso corporal y talla de los recién nacidos de ambos sexos y la circunferencia torácica de las hembras. En humanos, se ha propuesto que el peso al nacimiento es un indicador de la aparición de diferentes patologías en la edad adulta por los efectos “programado-res” de esta condición (Eriksson y col 2001, Barker 2005, Barker y col 2006, Carlsen y col 2006). Resultados en recién nacidos humanos sugieren que la exposición prenatal a testosterona como aquella que se observa en madres con el síndrome de ovario poliquístico tiene como resultado recién nacidos con menor peso, lo que se conoce como niños pequeños para la edad gestacional (PEG) (Sir-Petermann y col 2002). Se ha atribuido también que el menor peso sería consecuencia de una alteración en la concentración de IGF-1 en el feto como resultado de la exposición a la testosterona (Padmanabhan y col 2006). Por otro lado, en el estudio de Dwyer y col (2006) se observó que el peso al nacimiento de los corderos estaba relacionado con el tamaño de la camada. Las gestaciones triples eran más cortas que las gestaciones únicas o gemelares. El peso al nacimiento de los corderos disminuía con cada aumento en el número de corderos en la camada. Sin embargo, en el presente estudio sólo las hembras EPT-P1 tuvieron un peso corporal menor al de los machos y hembras de otros grupos, pero este fenómeno no estaría relacionado con el tamaño de la camada. Los efectos de un bajo peso al naci-miento en ovinos se pueden evidenciar en sus desempeños

productivos en la vida adulta, como, por ejemplo, reducción en el número de fibras musculares, lo que podría afectar el contenido y calidad de la carne (Fahey y col 2005). Sin embargo, otros estudios le atribuyen un efecto reductor en el contenido de grasa subcutánea o perirrenal o pélvica al tratamiento con testosterona prenatal, lo que podría contribuir a una mejor calidad de la carcasa en el animal al momento de su faena (DeHaan y col 1987).

En relación al cortisol plasmático, los resultados muestran que no hubo diferencia en los niveles plasmáti-cos al nacimiento entre los tres grupos. Estos resultados concuerdan con los de Manikkam y col (2004) quienes no encontraron diferencias significativas en los niveles del cortisol circulantes entre las borregas controles y las tratadas prenatalmente con testosterona. En el presente estudio no se observó una correlación entre peso al nacimiento y las concentraciones de cortisol, tomando en cuenta el total de recién nacidos o separados según el tratamiento de la madre. No obstante lo anterior, si se usa el valor de cortisol promedio de cada grupo como un límite de corte, se encontró una relación inversa entre peso al nacimiento y peso corporal en los recién nacidos EPT-P1. Esto ocurre sólo si se separa por cortisol y esta correlación no se repite en los recién nacidos de hembras control o nacidos de madres EPT-P2. En recién nacidos humanos se ha determinado que aquellos niños pequeños para la edad gestacional tienen mayor concentración de cortisol en la sangre del cordón umbilical que los niños adecuados para la edad gestacional (Economides y col 1988), lo cual sugiere que habría una relación entre el peso al nacimiento y las concentraciones de cortisol. Si se considera que el menor peso al nacimiento es el resultado final del crecimiento fetal en el útero, el cual depende prin-cipalmente de la disponibilidad de nutrientes, es posible suponer que hembras nacidas de madres EPT-P1 tuvieron menor disponibilidad de nutrientes que las hembras naci-das de hembras EPT-P2. Las razones de este fenómeno se desconocen, pero se ha demostrado en la oveja preñada que un aumento del cortisol induce una reducción en el número de células binucleadas de la placenta productoras del lactógeno placentario (Ward y col 2002), lo cual puede comprometer la disponibilidad del lactógeno placentario necesario para el crecimiento fetal por sus efectos en la partición de nutrientes y en las concentraciones de IGF-1 fetal (Braun y col 2007).

El cortisol es un factor relevante para la maduración fetal (Fowden y col 1998, Dwyer y col 2006) y para el aumento de la producción de triyodotironina (T3) en el feto. Esto último prepara al feto para el aumento en la demanda metabólica y la termogénesis que ocurren al nacimiento (Dwyer y col 2006). A su vez, las hormonas tiroideas promueven el desarrollo fetal y actúan como signos de disponibilidad de energía (Fowden y Forhead 2004). En la oveja, las hormonas tiroideas presentes en el plasma fetal derivan principalmente de fuentes fetales (Fowden y Forhead 2004). La triyodotironina se produce

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a partir de la tiroxina (T4) en el tejido adiposo pardo por la enzima 5’-monodeyodinasa, cuya actividad aumenta durante los últimos meses de preñez. Las concentraciones de T3 no se diferenciaron entre los grupos, mientras que la concentración plasmática de T4 fue menor en las hembras nacidas de madres EPT-P1. Mellor y Pearson (1977) des-cribieron una menor concentración de T4 en recién nacidos durante las primeras 24 horas postparto con restricción del crecimiento fetal por disminución del tamaño de la placenta de las ovejas madres. En un estudio de Dwyer y col (2006), la T3 plasmática se relacionó significativamente con el peso al nacimiento durante las primeras 24 horas de vida, pero no después de esto. Los corderos de mayor peso tenían concentraciones plasmáticas mayores de T3 y T4 (Dwyer y col 2006). Esta asociación entre peso al nacimiento y T4 concuerda con nuestros datos. En primer lugar porque, a lo menos en las hembras, un alto valor de T4 coincidió con un peso mayor. Y en segundo lugar porque las hembras recién nacidas EPT-P1 presentaron una concentración promedio de T4 más baja que el resto de los grupos, y esas hembras tuvieron el menor peso promedio al nacimiento, aun cuando no encontramos una correlación directa entre ambas variables como en las hembras control. Las concentraciones de T3 y T4 fueron iguales entre los otros grupos ya que no diferían en el peso al nacer, lo que significaría que metabólicamente no habría diferencia entre los grupos.

Este estudio confirma la hipótesis planteada en relación a que las crías hembras expuestas prenatalmente a un exceso de testosterona durante su gestación exhiben diferencias en parámetros biométricos y endocrinos, tales como: distancia entre ano-meato urinario, peso al nacimiento y concentraciones de tiroxina (T4) en relación a las hembras nacidas de madres controles. En consecuencia, se puede inferir que el mayor impacto de la exposición prenatal a testosterona se produce en la hembra recién nacida. Las hembras presentan virilización de los genitales externos y dependiendo de la dosis y la duración de la EPT presentan menor peso al nacimiento y una menor concentración plasmática de T4. Sin embargo, en los otros parámetros biométricos y hormonales estudiados no se encontraron diferencias estadísticas entre crías de madres control y crías nacidas de madres expuestas a un exceso de testosterona, lo cual descarta efectos de la testosterona en la madre. Esto sugiere que el mayor impacto del exceso de testosterona en el feto y recién nacido se relaciona con la masculinización de las hembras. Aparentemente, la EPT no influiría en los parámetros estudiados en machos EPT, sin embargo, efectos de largo plazo no se pueden descartar.

RESUMEN

Se estudiaron parámetros biométricos y endocrinos de crías recién nacidas de ovejas Suffolk Down expuestas prenatalmente a un exceso de testosterona (EPT) durante 60 días (EPT-P1, n = 16) y 90 días (EPT-P2, n = 12), a partir del día 30 de preñez. Las madres control (n =32) recibieron aceite vegetal. Al momento del parto se registraron: hora del

parto, número de crías por madre y sexo de las crías. Ocho horas postparto se registraron: las características de los genitales externos, distancia ano-meato urinario (DAM) y peso corporal. Se determinó concentración plasmática de cortisol, T3 y T4, por radioinmunoensayo. Hora del parto, número y sexo de las crías fue similar entre los grupos. Las hembras nacidas de madres con EPT-P1 y EPT-P2 exhibieron genitales masculinizados con presencia de un pene y un escroto vacío. Las hembras nacidas de madres EPT-P1 presentaron menor peso al nacimiento que las hembras y machos control y hembras nacidas de madres EPT-P2 (P < 0,05), DAM semejante a los machos (P<0,01) y menor concentración de T4 que los otros grupos (P<0,05). Además presentaron una relación inversa entre cortisol plasmático y peso corporal. Las hembras nacidas de madres EPT-P2, con excepción de la masculinización de los genitales, no se diferenciaron de las hembras nacidas de madres control. Los parámetros biométricos y endocrinos de los machos no mostraron diferencias entre los tres grupos. Concluimos que la EPT produce masculinización de los genitales de hembras y, dependiendo de la concentración de testosterona, la EPT puede disminuir las concentraciones plasmáticas de T4 en las hembras. La EPT no influye en parámetros biométricos y endocrinos de machos recién nacidos.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos a los alumnos de pregrado de la carrera de Medicina Veterinaria de la Universidad de Concepción, Chillán, quienes colaboraron en la colección de los datos de los partos. Al Dr. José F. Cox y colaboradores del Laboratorio de Biotecnología de la Reproducción por el seguimiento ecográfico. Este trabajo fue financiado por Proyecto Fondecyt 1050915.

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Arch Med Vet 41, 53-59 (2009)

ORIGINAL ARTICLE

Accepted: 27.08.2008.

* [email protected], [email protected]

Evaluation of clinical and pathological characteristics of 155 canines with mammary tumours: a retrospective study

Evaluación de características clínicas y patológicas de 155 caninos con tumores mamarios: un estudio retrospectivo

BH Sontasa*, H Ozyogurtcub, A Gurelb, H EkiciaaDepartment of Obstetrics and Gynaecology, Faculty of Veterinary Medicine, Istanbul University, Avcilar, Istanbul, Turkey.

bDepartment of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Istanbul University, Avcilar, Istanbul, Turkey.

RESUMEN

En este estudio se evaluaron en forma retrospectiva las características clínicas y patológicas de 155 perras con tumores mamarios. 55% de los animales con tumores mamarios eran Poodle (83 pacientes). La edad promedio al momento de la excisión del tumor fue de 10,3 ± 0,2 años, mientras que el tiempo transcurrido entre la detección del tumor y tratamiento del paciente fue de 308 ± 38,5 días. 46 de las 119 perras habían parido al menos una vez y 22 de 59 habían presentado un historial con falsa preñez. Además, 2% de los animales habían presentado tumores de origen vulvar o vaginal. 212 tumores fueron removidos quirúrgicamente y de ellos, 78,3% eran malignos, 12,3% resultaron benignos, 8% eran cambios hiperplásicos y 1,4% eran tumores no clasificados. No hubo asociación significativa entre el tipo histopatológico de los tumores mamarios y edad, raza, ubicación y duración del tumor, estado reproductivo, historial de preñez o pseudopreñez.

Key words: canine, mammary neoplasia, age, breed, histopathology.

Palabras clave: caninos, neoplasia mamaria, edad, raza, histopatología.

INTRODUCTION

Mammary gland is a modified sweat gland which is the second most common site for tumour development after the skin in dogs (Dorn et al 1968, Schneider et al 1969, Schummer et al 1981, Moulton 1990). At 9 to 11 years of age, dogs have maximum risk of developing mammary tumours (MTs) although the risk rises at the age of 6 to 7 years which is defined as the “cancer age” (Schneider 1970, Moulton 1990). Hormonal influences, obesity at a young age and intake of red-meat or home-made diet were determined to increase the risk of tumour development (Schneider et al 1969, Briggs 1980, Sonnenschein et al 1991, Bruun 1997, Alenza et al 1998, Alenza et al 2000). Factors like number of pregnancies, history of false preg-nancies, regularity of oestrous cycles, number of litters or puppies and their size were found to be unrelated to the development of MTs (Brodey et al 1966, Schneider et al 1969, Schneider 1970).

Retrospective studies investigating epidemiologic, clinical and pathologic features of MTs in dogs have been previously published (Brodey et al 1966, Dorn et al 1968, Schneider 1970, Mulligan 1975, Priester 1979, Boldizsar et al 1992, Hellmen et al 1993, Itoh et al 2005, Zatloukal et al 2005). However, according to the place

where the study was conducted or due to the different classification systems used, features like breeds of dogs at high or low risk and the ratio of benign or malignant tumours varies among the reports. Therefore, the objective of the retrospective study presented here was to identify clinical and pathological characteristics of 155 reviewed canine mammary tumour cases.

MATERIAL AND METHODS

A total of 328 bitches with MTs were clinically exami-ned and surgically treated at the Department of Obstetrics and Gynaecology, between January 1, 2000 and January 1, 2005. Only the animals with histopathologic diagnosis were included in this study (n = 155). Breed, age, location of affected mammary glands, tumour size (maximal dia-meter of the tumour), number of days between the time the tumour was first determined and the time the patient was presented, reproductive history (spaying status, age at spaying, whelping and history of false pregnancy), application of any kind of exogenous hormones and type of surgery (simple mastectomy or radical mastectomy) were obtained from review of medical records or phone calls to the owners. Histopathological examination of the tumours was performed at the Department of Pathology. Histological classification of the samples were performed according to World Health Organization (WHO) classifica-tion for mammary tumours of the dog (Misdorp et al 1999). However, in addition to WHO classification, malignant mix

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BH SONTAS ET AL

tumour was used for the tumours containing both epithe-lial elements and cartilagenous or osseous components. (Moulton 1990, Helmen et al 1993, Funakoshi et al 2000, Restucci et al 2000). In 2006, the owners were contacted for additional follow-up information.

STATISTICAL METHODS

Statistical analysis were performed using statistical packages for social sciences for Windows 11.5 package program (SPSS 2004). The effects of breed, age, location of the tumour and reproductive status on tumour type were analyzed using Kruskal-Wallis test. The effect of type of surgery on survival time was analyzed with x² test. The correlation between the size of the tumour and survival time was analyzed using the Mann-Whitney U test. Survival time was defined as the time from surgery to death, was analyzed using Kaplan-Meier method and were compared using the log-rank test between dogs grouped according to factors as follows; age (< 10 vs ≥ 10 years), breed (Poodle vs other breeds), reproductive status (spayed vs intact), number of tumours (single vs multiple), maxi-mal diameter of tumours (< 5 vs ≥ 5 cm), type of surgery (simple mastectomy vs radical mastectomy), histological diagnosis (benign vs malignant), (< 6 vs ≥ 6 months), the use of exogenous hormones (yes vs no), whelping (yes vs no) and history of pseudopregnancy (yes vs no).

RESULTS

In the present study, it was determined that some of the information was not recorded or could not be followed-up by telephone.

As seen in table 1, 22 different breeds (excluding mixed breed dogs) were represented in 155 dogs and Poodle was the most commonly affected breed with 83 cases determined in this study.

The mean age of 150 dogs at the time of examination was 10.3 ± 0.2 years, with a range of 4 to 17 years (figure 1). However, age at detection of the tumour was 9.37 ± 0.27 years with a range of 3 to 15 years in 93 dogs. Duration of tumour growth was recorded in 91 dogs which was between 2 and 1,460 days with an average of 308 ± 38.5 days. The mean age of dogs with benign tumours at the time of examination was 9.38 ± 0.48 years while for those with malignant tumours it was 10.15 ± 0.23 years. Dysplasia or hyperplasia was diagnosed at the mean age of 9.6 ± 0.81 years. However, no significant difference (P < 0.05) was found between the ages of animals diagnosed with dysplasia/hyperplasia or benign or malignant tumours.

Location of the tumour was recorded in 88 cases. The mammary glands involved by 133 tumours were as follows: thoracical (22.5%), abdominal (30.1%) and inguinal (47.4%). The ratio of malignant tumours in thoracal, abdominal and inguinal mammary glands were 89%, 70% and 79%, respectively. The size of 82 tumours varied from 0.5 cm

to 18.0 cm with an average of 3.58 ± 0.34 cm. Malignant tumours (n = 74, size = 5.5 ± 0.47 cm) were larger than benign tumours (n = 8, size = 3.07 ± 1.03 cm) without statistical significance (P < 0.05).

All the dogs with MTs were female and 92 of 121 dogs (76%) were sexually intact at the time of examination. Regarding the spayed bitches (24%), spaying was per-formed in 1 animal at 9 months old; in 3 at 2 years; in 1 each at 4, 5, 7, 12 and 13 years; in 4 at 6; in 2 at 8; 3 each at 9 and 10 years and in 8 animals at unknown time. The owners of two animals, indicated that one of the ovaries was not removed at the time of spaying. Fourty-six out of the 119 (38%) dogs had whelped at least once in their life-time. Out of the 82 dogs, six had a history of hormonal treatment in which steroid hormones were used in two dogs for the treatment of skin diseases and oestrogen was used in one bitch to terminate pregnancy. In three dogs the reason of the use was not identified. Pseudopregnancy was recorded in 22 of 59 bitches. Three out of 155 animals (1.9%) with mammary tumours also had vulvar (1 dog) and vaginal (2 dogs) tumours of myoma, fibropapilloma and leiomyoma.

Two hundred and twelve tumours were surgically re-moved since 57 out of the 155 dogs were presented with more than one tumour. Of the 212 tumours, 78.3% were malignant tumours, 12.3% were benign, 8.0% were hyper-plastic changes and 1.4% were unclassified tumours.

Follow-up information was obtained from the owners of 65 dogs in which 32 died because of related, unrelated or unknown causes. Of the 32 dogs, death was unrelated with mammary tumours (pyometra, hypothyroidism, ingestion of foreign body, paresis, nasal tumour, fall and lethargy) in seven animals, recurrence in two and respiratory disease in seven. Euthanasia was reported in four animals due to recurrence and in two dogs due to undetermined reasons. The cause of death of the remaining 10 animals was not reported. No necropsy was performed or reported in any animal. The average postmastectomy survival time was 331 ± 64 days for 32 dogs. Median survivals for 32 dogs with malignant and benign tumours were 304 and 575 days, respectively. The survival rates of animals that had radical mastectomy (n = 20) were higher than those in dogs that had simple mastectomy (n = 38) although there were no significant differences (P < 0.05).

No significant relationship (P < 0.05) was found bet-ween the histologic diagnosis of the mammary tumours and breed, age, duration, location or size of the tumour, reproductive history including spaying status, pregnan-cy or pseudopregnancy and application of exogenous hormones.

DISCUSSION

In the present study, a total of 155 bitches with MTs that were surgically treated at the Department of Obstetrics and Gynaecology were evaluated retrospectively to explore

55

CANINE, MAMMARY NEOPLASIA, HISTOPATHOLOGY

Table 1. Breed distribution of 155 dogs with mammary tumours. Distribución de razas de 155 perras con tumores mamarios.

Breed Numberof dogs

Numberof tumours

Number of dogs with benign

tumours

Number of dogs with malignant

tumours

Number of dogs with

hyperplasias/dysplasias

Number of dogs with unclassified

tumours

Poodle 83 112 11 93 8 0

Cocker Spaniel 11 17 1 14 2 0

Mixed breed 10 12 2 8 1 1

Boxer 6 8 1 7 0 0

Miniature Pinscher 5 9 1 8 0 0

German Shepherd 5 7 0 7 0 0

Rough Collie 5 5 0 4 0 1

Anatolian Shepherd dog 4 6 1 4 1 0

Pekingese 4 9 2 4 3 0

Great Dane 1 1 0 1 0 0

Miniature Spitz 1 1 1 0 0 0

Golden Retriever 1 1 1 0 0 0

Beagle 1 2 0 2 0 0

Samoyed 1 1 0 1 0 0

Caucasian Sheep dog 1 1 0 1 0 0

Dachshund 1 1 0 1 0 0

Irish Setter 3 3 1 2 0 0

Pointer 2 2 0 2 0 0

Doberman Pinscher 1 1 0 1 0 0

English Setter 1 1 0 1 0 0

Dalmatian 1 4 2 1 1 0

Chihuahua 1 1 0 1 0 0

Tibetian Terrier 1 1 0 1 0 0

Unknown 5 6 2 2 1 1

Total 155 212 26 166 17 3

clinicopathologic characteristics of MTs in female dogs. Despite the fact that 328 female dogs with MTs were treated between 2000 and 2005, histopathologic identifi-cation could not be made in all cases due to the owners’ financial constraints.

Mammary tumours were determined in 22 different purebred dogs. Poodle was the most commonly affected breed although sporting dogs including Pointers, Retrievers, English Setters and Spaniels were reported to have a higher frequency (Priester 1979, Moulton 1990). This may be related to the fact that small or miniature dogs, especially poodles, are the dominant house-hold pets in this region compared to medium or large sized dogs. Therefore, we agree with the belief that breed predisposition varies due to the pet population (Alenza et al 2000).

Mean age at detection of the tumour was 9.37 years with a range of 3-to-15 years. However, duration of the tumour before presentation was between 2 and 1460 days with an average of 308 days which means that the dogs were brought approximately a year after the detection of

the mass by the owner. Because of this reason the mean age at the time of examination was 10.3 years (range 4-to-17) which is in accordance with the ages reported in several studies (Schneider 1969, Boldizsar et al 1992, Zatloukal et al 2005).

Both in our study and in the study by Chang et al (2005), dogs were examined and treated more or less a year after the detection of the mass. It is our opinion that some private practitioners prefer to wait until the tumour becomes big in size before referring the patient or establishing a treatment plan. In addition, we also believe that the owners disregard the disease or postpone the examination if no signs of pain or suffering are observed in their animal. This hypothesis was supported by a study (Alenza et al 2001) in which dogs with inflammatory carcinoma suffering from generalized weakness, signs of pain and inflammatory changes, were examined and treated approximately 55 days after the perception of the clinical signs by the owner.

Benign tumours occured one to two years earlier than malignant tumours which coincides with the findings of

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BH SONTAS ET AL

Figure 1. Age distribution of dogs with mammary tumours at surgery and at first occurence. Distribución de la edad de perras con tumores mamarios, en cirugía y en primera ocurrencia.

Table 2. Histologic types and number of tumours presented between 2000 and 2005. Tipos histológicos y número de tumores presentados entre los años 2000 y 2005.

Numberof tumours Histologic diagnosis %

166 Malignant Tumours 78.30

60 Simple carcinoma 28.30

32 Complex carcinoma 15.09

25 Malignant mixed tumour 15.06

23 Carcinosarcoma 13.85

12 Osteosarcoma 5.66

5 Noninfiltrating (in situ) carcinoma 2.36

4 Other sarcomas 1.89

3 Fibrosarcoma 1.42

1 Spindle cell carcinoma 0.47

1 Squamous cell carcinoma 0.47

26 Benign Tumours 12.27

10 Benign mixed tumour 4.72

7 Adenoma 3.30

6 Fibroadenoma 2.83

3 Duct papilloma 1.42

3 Unclassified Tumours 1.41

1 Mast cell tumour 0.47

1 Lipoma 0.47

1 Osteochondrom 0.47

17 Hyperplasias/Dysplasias 8.02

9 Duct ectasia 4.25

6 Adenosis 2.83

1 Endrinopathy 0.47

1 Osteoma 0.47

0

10

20

30

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Age at examination (Years)

Num

ber

of d

ogs

0

10

20

30

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Age at �rst occurence (Years)

Num

ber

of d

ogs

Total number of dogs Malignant BenignUnclassi�ed Hyperplasia/dysplasia

previous studies (Moulton 1990, Zatloukal et al 2005). In two reports (Miller et al 2001, Zatloukal et al 2005) the mean age of dogs with dysplastic or hyperplastic changes were determined to be 6.1 and 8.3 years, respectively, which contrasts with the mean age found in the present study (9.6 years). In our opinion, this could be related to the delayed presentation of the patients because of the previously mentioned reasons. The mean age of the dogs with malignant tumours was 10 years which is in correspondance with the mean age of dogs with malignant mammary tumours in the other studies (Moulton 1990, Zatloukal et al 2005). Growing age is highly related with malignancy due to accumulation of tumourogenous factors leading to malignant tumours by advancing age (Zatloukal et al 2005).

Tumour development was most commonly determined in inguinal mammary glands which is in accordance with previous studies (Mulligan 1975, Moulton et al 1986, Moulton 1990, Miller et al 2001, Vural and Aydın 2001). The reason of the increased frequency in the last two glands is unknown, however, several explanations such as presence of larger mass of tissue, or greater prolifera-tive change in response to oestrogen in the most caudal glands have been suggested (Moulton et al 1986, Moulton 1990). Furthermore, hyperplastic nodules which occur most commonly in the last two glands, are considered the beginning stages of tumourogenesis (Moulton et al 1986, Hellmen 1996).

Reproductive history of the bitches reported here was similar to those documented elsewhere (Brodey et al 1966, Schneider et al 1969, Priester 1979). Most bitches were sexually intact which may suggest that the risk of tumour

development may be higher in intact bitches than in spayed bitches (Frye et al 1967). One of the most interesting fin-dings in the present study was, two animals with ovarian remnant syndrome that had mammary tumours, which is not indicated previously. No significant correlation was found between the development of MTs and pregnancy or pseudopregnancy that corresponds well with the studies by Brodey et al (1966) and Schneider et al (1969). Although, the incidence of mammary gland tumours may increase when progestagens and oestrogens are used at high dosa-ges or at the wrong time or at prolonged administration, in this study, the use of progestagens was not recorded in any animals (Briggs 1980, Van Os et al 1981, Bruun 1997). This is probably related with less attraction of the private practitioners to the use of hormonal contraception in small animal practice in this region.

57


Figure 5. Simple carcinoma (tubulopapillary carcinoma) in a 9 year-old, sexually intact, mixed-breed dog. Various sized tubular structures and branching tubules are demonstrated. (Haematoxylin and eosin X 400). Carcinoma simple (carcinoma tubulopapilar) en una perra de raza mixta de 9 años de edad, sexualmente intacta. Se observan estruc-turas tubulares de varios tamaños y túbulos ramificados (Hematoxilina y eosina X 400).

Figure 2. A 7 year-old, sexually intact, Chihuahua bitch pre-sented with a small mass in the inguinal mammary gland. The mass was histopathologically diagnosed as simple carcinoma. Perra Chihuahua de 7 años de edad, sexualmente intacta, presentando una pequeña masa en la glándula mamaria inguinal. La masa fue histopatológicamente diagnosticada como carcinoma simple.

Figure 3. An 8 year-old, sexually intact, Terrier bitch was pre-sented with a 4 months history of a large mass as big as a baby head in the inguinal mammary gland. The dog was euthanized due to the inoperable size of the mass. Histopathological diagnosis of the mass was not determined because neither a necropsy nor a biopsy has been permitted. Perra Terrier de 8 años de edad, sexualmente intacta, presen-tando un historial de 4 meses con una masa tan grande como la cabeza de un bebé en la glándula mamaria inguinal. Se le aplicó eutanasia debido al tamaño inoperable de esta masa. El diagnóstico histopatológico de la masa no fue determinado, ya que ni la necropsia ni la biopsia fueron permitidas.

Figure 4. Malignant mix tumour in the left inguinal mammary gland of a 4.5 year-old, sexually intact, German shepherd bitch. Atypical gland epithelial cells located adjacent to cartilagenous component is shown. (Haematoxylin and eosin X 400). Tumor mixto maligno en la glándula mamaria izquierda de una perra pastor alemán de 4,5 años de edad, sexualmente intacta. Se observan células epiteliales glandulares atípicas ubicadas en forma adyacente al componente cartilaginoso.

The aims of determining the survival time following the surgery and the effects of investigated variables such as tumour size or type of surgery on survival failed because of several reasons. First of all, follow-up information was obtained from 65 of 155 owners which was evaluated as a small sample number to make a clear statement. In addition to this, in 7 of 31 dogs, the cause of death was unrelated to MTs like pyometra, hypothyroidism or ingestion of foreign body. Moreover, it was clearly observed that after the surgical removal of the tumours, the animals were

examined in private clinics for subsequent diseases which prevented us to follow-up the patients and to perform necropsies on them. The data of survival time found in the present study should be considered only descriptive because of the low sample number and of the low power of the statistical analyses.

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BH SONTAS ET AL

Histopathological diagnosis of MTs is crucial in prediction of tumour behaviour after surgical excision. Moreover, histopathologic typing of the tumour is also important in establishing a post-operative chemotherapy plan to increase the survival time following the surgery since several protocols have been used with success in dogs (Karayannopoulou et al 2001). Various classification systems (Hampe and Misdorp 1974, Gilbertson et al 1983, Misdorp et al 1999) have been developed to estimate the prognosis of the disease. However, because of the lack of a standart criteria to differentiate benign from malignant tumours, the incidence of malignant tumours varies widely from 39 to 91 per cent according to different reports (Priester 1979, Nerurkar et al 1989, Hellmen et al 1993, Vural and Aydın 2001, Martins et al 2002, Itoh et al 2005, Zatloukal et al 2005). In the current study, the histologic ratio of malignant to benign tumours was approximately 7:3 which is in accordance with those determined in most studies (Priester 1979, Nerurkar et al 1989, Hellmen et al 1993, Vural and Aydın 2001, Martins et al 2002, Itoh et al 2005) whereas, in contrast to Misdorp et al (1999). This interesting regional difference may be due to a) the duration of the growth before the diagnosis; b) the age of the dogs; and c) high prevelance of unspayed animals. In five dogs presented with more than one tumour, the histological diagnosis of each mammary mass was de-termined to be different. This means that a dog presented with multiple mammary tumours may have benign and malignant tumours at the same time, which also confirms the importance of histological examination.

The average time from the detection of the tumour to presentation was approximately 308 days which is a sufficient time for transitions between dysplasias, benign tumours and carcinomas. According to Hellmen (1996), hyperplastic and preneoplastic nodules exist in the ma-mmary gland which may become tumourous lesions by time. And also, dysplastic or hyperplastic changes in the mammary glands are considered preneoplastic that are the initial stages in the multi-step process of tumouro-genesis (Schneider et al 1969, Hellmen 1996). The low incidence of dysplastic or hyperplastic changes compared to benign and malignant tumours is in accordance with previous studies which may also be associated with the time of consultation that seems to occur late in progress of the disease (Vural and Aydın 2001, Martins et al 2002, Zatloukal et al 2005).

Finally, this study demonstrated that in the bitch, mammary tumours occur most commonly in the last two glands of small breed dogs at the age of 10 to 11 years and the nature of the tumours is histologically malignant.

SUMMARY

In the present study, clinical and pathologic features of 155 bitches with mammary tumours were evaluated retrospectively. Fifty-five per cent of the animals with mammary tumours were Poodles (83 patients).

Mean age at the time of tumour excision was 10.3 ± 0.2 years and days between the time the tumour was first determined and the time the dog was presented were 308 ± 38.5 days. Fourty-six of the 119 dogs whelped at least once and 22 of 59 dogs had a history of false pregnancy. Two per cent of the animals also had tumours of vulvar and vaginal origine. Two-hundred and twelve tumours were surgically removed and out of the 212 tumours, 78.3% were malignant, 12.3% were benign, 8.0% were hyperplastic changes and 1.4% were unclassified tumours. No significant association was found between the histopathological type of mammary tumours and age, breed, location and duration of the tumour, reproductive status, history of pregnancy or pseudopregnancy.

ACKNOWLEDGEMENT

The authors are grateful to Assoc. Prof. Dr. Bülent Ekiz (Department of Animal Breeding and Husbandry, Faculty of Veterinary Medicine, Istanbul University) for the statistical analysis.

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ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 17.09.2008.

* Casilla 567, Vadivia, Chile; [email protected]

Estudio comparativo de la próstata en perros mediante ecografía transrectal y transabdominal

Comparative study of the canine prostate using transrectal and transabdominal ultrasonographic techniques

J Thibaut*, J Santander, M MieresInstituto de Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias,

Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

SUMMARY

The purpose of this study was to compare the use of transrectal and transabdominal ultrasonographic techniques for the examination of the canine prostate gland. Twenty healthy male dogs, from 1.5 to 10 years old, weighing between 15 and 35 kg were used. They were anesthetised intravenously with Xylazine and Ketamine. The transrectal ultrasound was performed using a 7.5 MHz linear transducer and the transabdominal ultrasound with a 7.5 MHz sector transducer. The parameters compared with both techniques were: detection of the prostate gland, its length, width echogenicity and echotexture. The transrectal technique allowed the detection of the prostate gland in all cases. The transabdominal technique achieved 4 complete images, 11 incomplete images and in 5 cases the prostatic gland was not detected at all. Significant differences in prostatic length and width were found comparing both techniques. The gland was longer with the transrectal technique and wider with the transabdominal method. There were no differences between both techniques when comparing the echogenicity and echotexture. However the obtained image detail was better with the transrectal technique. It can be concluded that the transrectal technique gives better information regarding prostatic size than the transabdominal technique. The transrectal technique is rarely used, because a rectal probe and general anesthesia are required. In dogs, both techniques are important and complementary in order to determine prostatic image.

Palabras clave: ecografía, transrectal, transabdominal, próstata, caninos.

Key words: ultrasonography, transrectal, transabdominal, prostate, canines.

INTRODUCCIÓN

La próstata es la glándula accesoria más importante del perro macho (Kirk 1995, Johnston y col 2001). Es una glándula bilobulada que envuelve a la uretra caudal al cuello de la vejiga urinaria (Swinney 1998). Su ubicación es retroperitoneal. Está dorsalmente rodeada por el recto y ventralmente se encuentra en contacto con la sínfisis púbica (Root-Kustitz y Klausner 2000). El tamaño y peso de la próstata varían dependiendo de la edad, raza y peso corporal del perro (Selcer 1995). Su posición se relaciona con el grado de distensión de la vejiga, la presencia de alguna patología y la edad del animal (Sánchez y Cortese 1994). En el animal joven se ubica en la pelvis mientras en el perro adulto su posición es más craneal (Loriot y col 1997).

Durante la vida del perro el desarrollo de la próstata se puede dividir en tres etapas. La primera corresponde al período de embriogénesis y del desarrollo postnatal inmediato y finaliza cuando el animal tiene 2-3 años. La segunda consiste en una fase de desarrollo hipertrófico exponencial que es dependiente de los andrógenos y termina

cuando el animal tiene 12 a 15 años. En la última etapa se observa una involución senil, que comienza cuando la producción de andrógenos disminuye (Berry e Isaacs 1984, Verstegen 1999). El crecimiento de la próstata es andrógeno dependiente (Purswell y col 2000), la castra-ción lleva a disminuir el volumen prostático, con atrofia de la glándula y elementos estromáticos, y disminuye la habilidad para aceptar y metabolizar andrógenos (Root-Kustitz y Klausner 2000).

La principal regulación andrógena del crecimiento prostático está dada por la 5 alpha-dihidrotestosterona (5 alpha-DHT), que es formada desde la testosterona por la enzima 5 alpha reductasa. Tanto 5 alpha-DHT como la testosterona comparten el mismo receptor intracelular. La 5 alpha-DHT produce un efecto mayor porque ésta se une al receptor con una afinidad dos veces mayor que la testosterona y posee una tasa de disociación cinco veces menor que testosterona (Cohen y col 1995, Susuki y col 1998a, Root-Kustitz y Klausner 2000).

Las patologías de la próstata son comunes y suelen tratarse de procesos de origen infeccioso, hormonal, ana-tómico o embriológico. Se ha observado un incremento de incidencia conforme aumenta la edad del animal y podría estar relacionado con el hiperdesarrollo fisioló-gico del órgano, bajo la influencia de los andrógenos (Verstegen 1999).

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Tanto andrógenos como estrógenos deben estar presen-tes para producir una hiperplasia/hipertrofia significativa. Perros viejos con hiperplasia prostática benigna (HPB) han demostrado que secretan 40% menos testosterona, 15% menos de 5 alpha-DHT y 60% más estradiol que los perros normales. Esta alterada relación estrógeno:andrógeno sensibiliza la próstata de manera que los estrógenos priman. Los estrógenos pueden aumentar el número de los receptores de andrógenos en el tejido prostático y pueden formar metabolitos con actividad de radicales libres que dañan el tejido prostático alterando su respuesta a la 5 alpha-DHT (Root-Kustitz y Klausner 2000).

El examen de la próstata debería ser de rutina en perros mayores de cinco años. La observación clínica, palpación rectal y abdominal ayudan a diagnosticar posibles pato-logías prostáticas, además de un examen radiográfico y ecográfico que pueden mostrar aumento de tamaño con o sin alteración de la estructura (Antelo 2002). El estudio ultrasonográfico del tracto reproductivo del perro es un procedimiento útil, seguro y no invasivo que permite ac-ceder a la próstata canina (Johnston y col 1991, Nyland y Matoon 1995).

El examen ecográfico de la próstata se facilita por la presencia de líquido en la vejiga urinaria. Esto puede conseguirse evitando la micción o rellenándola de solu-ción salina isotónica mediante una sonda uretral (England 1995). El rol del ultrasonido en enfermedades reproduc-tivas radica en su capacidad para detectar anormalidades anatómicas y la capacidad de realizar procedimientos para tomar muestras de tejido que nos entreguen un diagnóstico definitivo (Nyland y Matoon 1995).

Para la ecografía de la próstata vía transabdominal son indispensables sondas sectoriales, ya que su posición intra-pélvica reduce la vía de abordaje. La próstata es bastante superficial y es preferible una frecuencia de 7,5 MHz, para obtener una buena imagen. Sin embargo, una sonda de 5 MHz permite también obtener imágenes de calidad, pero no posee suficiente resolución para la ecografía de la próstata en perros pequeños (Loriot y col 1997). La mejor resolución de imágenes de la glándula prostática es obtenida vía transrectal (Miles 1989).

La prostatomegalia canina usualmente resulta en un desplazamiento de ésta hacia el abdomen caudal, lo que provee un fácil acceso por la vía transabdominal (Selcer 1995). Puede ser difícil tomar imágenes cuando la glándula se encuentra alojada dentro de la pelvis; en ese caso, el transductor puede ser colocado en el recto del animal y dirigido ventralmente para obtener imágenes de la próstata caudal. Esta técnica, aun requiriendo de sedación o anestesia, es útil, pues permite el examen de la porción diseminada de la glándula prostática, que no puede ecografiarse trans-abdominalmente, y que clínicamente es descuidada con frecuencia (England 1995). La ecografía transrectal no requiere de una vejiga llena (Miles 1989).

La imagen de la próstata presenta un aspecto ecográfico homogéneo, con una ecogenicidad superior a la de los riñones,

pero inferior a la del bazo. Numerosas manchas pequeñas anecogénicas aparecen homogéneamente diseminadas en el parénquima, las que representan las zonas colectoras de las secreciones prostáticas. La parte prostática de la uretra no es visible en el perro; sin embargo, está a veces algo dilatada en perros viejos (Loriot y col 1997). La forma bilobulada de la glándula prostática puede ser reconocida generalmente en el plano de imagen transversal (Nyland y Matoon 1995). En un corte longitudinal, la próstata tiene forma alargada (Loriot y col 1997). La forma cambia con la edad, en los cachorros es alargada, con el paso de los meses adquiere una forma redondeada, a los 1,5 a 2 años de edad la glándula es ovalada y claramente bilobulada. Con los años los surcos dorsal y ventral se hacen más evidentes, con lo que en la vista transversal la próstata adquiere forma de mariposa (Fritsch y Gerwing 1996).

Dado que generalmente se utiliza la técnica transab-dominal, en el presente estudio se desea comparar con la técnica transrectal para determinar las ventajas y desven-tajas de cada una y así poder evaluar la conveniencia del uso de una o ambas técnicas.

MATERIAL Y MÉTODOS

El estudio se realizó en el Hospital Clínico Veterinario de la Universidad Austral de Chile. Se utilizó un total de 20 perros machos mestizos clínicamente sanos, de 1,5 a 10 años de edad y de 15 a 35 kg, los que fueron aneste-siados previo ayuno de 12 horas con Xilacina1 (1mg/kg) y Ketamina2 (3 mg/kg) vía endovenosa. Luego se depiló la cubierta de pelo abdominal rasurando a ambos lados del prepucio hasta el escroto; seguidamente el paciente fue ubicado en decúbito lateral.

Para la ecografía transrectal se utilizó un Ecógrafo Pie Medical 480 provisto de un transductor lineal electrónico bifrecuencia de 5,0 / 7,5 MHz. Se colocó el transductor lineal dentro de un protector de látex que contenía gel ecográfico en su interior, luego se lubricó e introdujo por el recto del paciente hasta lograr visualizar la glán-dula prostática obteniendo un corte longitudinal único. Posteriormente se realizó la ecografía transabdominal con un Ecógrafo Pie Medical 300 S PANDION Vet, provisto de un transductor mecánico sectorial Sonda APAS de 5,0 / 7,5 MHz. Se aplicó gel ecográfico, luego se ubicó el transductor perpendicularmente en la región paraprepu-cial, se identificó la vejiga, el cuello vesical y, siguiendo caudalmente el corte longitudinal, se localizó la próstata, que fue observada longitudinalmente. Luego de realizar ambas técnicas ecográficas en todos los perros con una frecuencia de 7,5 MHz se procedió a su evaluación regis-trándose la visualización total, parcial o nula de la próstata mediante ambas técnicas. Luego se registró el largo y alto máximo de la próstata en centímetros realizando tres

1 Xilacina 2% Laboratorio Agroland, Chile.2 Ketamina 10% Laboratorio Drag Pharma, Chile.

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ECOGRAFÍA, TRANSRECTAL, TRANSABDOMINAL, PRÓSTATA, CANINOS

ecografías individuales por cada técnica, obteniendo un promedio de las mediciones. La ecogenicidad obtenida fue evaluada y registrada, clasificándose en hipoecoi-ca, isoecoica o hiperecoica en relación al parénquima esplénico y la ecotextura se evaluó como homogénea o heterogénea. Las mediciones obtenidas para el largo y alto prostático fueron ingresadas a una planilla MS Excel® y se analizaron mediante el uso de estadística descriptiva en base a media aritmética y desviación estándar (DE). Se realizó una prueba de normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk y para determinar si existieron diferen-cias significativas entre las mediciones de largo y ancho prostático se utilizó una prueba de “t” de student pareada con un nivel de significancia de P < 0,05. El programa computacional utilizado fue el Statistix versión 8.0 para Windows (Statistix 8, Copyright© 1985-2003, Analytical Software, USA).

RESULTADOS

VISUALIZACIÓN DE LA PRÓSTATA VÍA TRANSRECTAL

De las 20 próstatas ecografiadas vía transrectal se logró una buena visualización de la glándula en la totalidad de los casos estudiados, observándose completa, como una estructura alargada en su corte longitudinal, con una buena definición de todos sus bordes, con una ecogenicidad y ecotextura variables, dependiendo del caso observado.

VISUALIZACIÓN DE LA PRÓSTATA VÍA TRANSABDOMINAL

De las 20 próstatas ecografiadas vía transabdominal, cuatro pudieron ser visualizadas en su totalidad, esto por dificultad para definir el borde caudal de la próstata debido

a la sombra ecográfica originada por la pelvis. En los perros en que la glándula fue visible se observó alargada en su corte longitudinal, de una ecogenicidad y ecotextura dependientes del caso observado.

En cinco de los 20 perros ecografiados vía transabdo-minal no fue posible observar la glándula prostática.

Figura 2. Imagen de un corte longitudinal de próstata en perro. Ecografia vía transabdominal. Prostatic image in a dog using transabdominal ultrasound.P, Próstata; V, vejiga; CV, cuello vesical.

En la figura 3 se observa con la técnica transrectal la glándula prostática completa en la totalidad de los animales, y sólo en cuatro perros al utilizar la técnica transabdominal.

TAMAñO PROSTÁTICO

El número de casos utilizados para la comparación eco-gráfica fue de 15, debido a que la glándula prostática no fue observada en cinco perros con la técnica transabdominal.

Cuadro 1. Media aritmética (X) ± DE (cm) y valor de P para las mediciones del largo y altura de la próstata en perros utilizando las técnicas transrectal y transabdominal (n = 15). Prostatic length and width measures in dogs using transrectal and transabdominal ultrasound.

Medición ecográfica(cm)

TransrectalX ± DE

Transabdominal X ± DE P

Largoprostático 4,17 ± 1,50 3,67 ± 1,14 0,014

Alturaprostática 2,13 ± 0,52 2,32 ± 0,69 0,029

ECOGENICIDAD

La ecogenicidad de la próstata con la ecografía vía transrectal se observó isoecoica en 19 casos e hiperecoica en uno. Con la ecografía transabdominal, en 15 casos se observó isoecoica y en cinco no pudo ser evaluada por no observarse la próstata.

Figura 1. Imagen de un corte longitudinal de próstata en perro. Ecografia vía transrectal. Prostatic image in a dog using transrectal ultrasound.V, Vejiga; P, Próstata.

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J THIBAUT Y COL

ECOTEXTURA

La ecotextura de la próstata con la ecografía vía transrectal fue homogénea en 13 casos y heterogénea en siete. La técnica transabdominal demostró una ecotextura homogénea en 10 casos y heterogénea en cinco. En cinco perros la próstata no pudo ser evaluada al no observarse por esta vía.

DISCUSIÓN

VISUALIZACIÓN DE LA PRÓSTATA VÍA TRANSRECTAL

En los 20 perros estudiados la próstata pudo ser apre-ciada completa, debido a que la ubicación preferencial de la glándula es pélvica como ha sido descrito por Selcer (1995) y Gobello y Corrada (2001), similar a lo descrito en humanos por Peeling y Griffiths (1984). Esta visualiza-ción de la glándula concuerda con lo descrito por Mosca Zohil y Castellano (1995), Kamolpatana y col (2000) y Sasaki y col (2006) quienes mencionan que la ecografía transrectal sigue siendo el método más preciso y exacto para visualizar la próstata.

Según Gallardo de Medrano (2006), la posición pél-vica de la glándula puede variar con la edad del animal, así como con el grado de distensión de la vejiga urinaria. Sin embargo, una posición más abdominal no dificultó la observación de la próstata en este estudio. Además, la ecografía transrectal no necesitó de una vejiga urinaria llena para visualizar con mayor facilidad la próstata, tal como lo describe Selcer (1995), a diferencia de la ecografía transabdominal.

Susuki y col (1998b) señalan que la observación completa de la próstata utilizando este método se debe principal-mente a que sólo la pared del recto se encuentra entre el transductor y la glándula, la que no presenta inconveniente para permitir el paso de las ondas de ultrasonido, a dife-rencia de la técnica ecográfica transabdominal donde se interponen grupos musculares y la estructura ósea pélvica, que dificulta la visualización del margen caudal o incluso de la glándula completa.

La observación de la glándula prostática con este método permite apreciar lesiones tanto en el borde caudal como en el craneal, así como realizar mediciones de la glándula y estimar si existe o no algún grado de hiperplasia. Como han descrito Paclikova y col (2006), las alteraciones pros-táticas son más frecuentes en perros mayores de seis años; sin embargo, han sido observadas en perros de diferentes edades y su detección oportuna puede lograr mantener la fertilidad del paciente y en casos extremos realizar algún tratamiento para salvarle la vida.

Mosca Zohil y Castellano (1995) establecen que al encontrarse sólo la pared del recto entre el transductor y la próstata la imagen obtenida permite observar alteraciones a nivel de la cápsula, que sólo son visibles con este método, además de visualizar el cuello de la vejiga cuando éste no es visible con la técnica transabdominal, permitiendo determinar neoplasias a ese nivel.

Kamolpatana y col (2000) indican que las dificultades de utilizar esta técnica están dadas principalmente por la incomodidad que produce en los pacientes, por lo que es necesario utilizar sedación o anestesia para su ejecu-ción, así como la necesidad de contar con un transductor lineal, que no es de uso habitual en la clínica de pequeños animales.

VISUALIZACIÓN DE LA PRÓSTATA VÍA TRANSABDOMINAL

El no visualizar la próstata en cinco casos ecografiados y obtener una observación incompleta en 11 de ellos puede deberse a la edad de los perros. Como describe Gallardo de Medrano (2006), la próstata se encuentra en la cavidad pélvica hasta aproximadamente los cinco años, y luego por efecto hormonal pasa a ubicarse en gran parte en la cavidad abdominal. Esto se correlaciona con lo reportado por Atalan y col (1999) quienes reportan no haber obser-vado la próstata en dos casos por esta vía.

Lo observado en este estudio se contradice con Mosca Zohil y Castellano (1995) quienes observaron la próstata en todos los casos mediante ecografía transabdominal, lo que puede deberse a que los perros eran mayores de seis años y presentaban patologías prostáticas.

Selcer (1995) y Ruel y col (1998) coinciden en que, a diferencia de la ecografía transrectal, la visualización de la próstata vía transabdominal tiene ciertos requerimientos, entre los cuales destacan una vejiga llena y que la glán-dula se encuentre en posición abdominal. Sin embargo, resulta ser un método, aunque menos preciso, seguro y conveniente ya que se puede utilizar el transductor sectorial habitualmente utilizado en la clínica de pequeños animales no siendo necesaria la sedación del paciente.

TAMAñO PROSTÁTICO

Si bien no se encontraron estudios que comparen la medición de la próstata utilizando las técnicas ecográficas

Figura 3. Observación de la glándula prostática en perros mediante las técnicas ecográficas transrectal y transabdominal (n = 20). Prostatic gland observation in dogs using transrectal and transabdominal ultrasound.

20

4

11

5

0

5

10

15

20

25

TransabdominalTransrectalTécnica ecográfica

Nº

caso

s

Completa Incompleta Nula

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ECOGRAFÍA, TRANSRECTAL, TRANSABDOMINAL, PRÓSTATA, CANINOS

transrectal y transabdominal en caninos, Huang Foen Chung y col (2004) realizaron esta medición en humanos comparando el volumen prostático, estudio que no arrojó diferencias significativas; sin embargo, no se observó la glándula vía transabdominal en dos pacientes, y hubo diferencias de volumen hasta de un 30% en mediciones seriadas vía transabdominal.

El largo prostático significativamente mayor obtenido con la ecografía transrectal (4,17 ± 1,5 cm), en comparación con la vía transabdominal (43,67 ± 1,14 cm), se debe a la ubicación de la glándula, ya que la sombra ecográfica originada por la cavidad pélvica puede dificultar o im-pedir la correcta visualización de la próstata al realizar una ecografía vía transabdominal como fue descrito por Loriot y col (1997). La menor altura de esta imagen transrectal (2,13 ± 0,52 cm), en comparación con la vía transabdominal (2,32 ± 0,69 cm), se podría explicar por la compresión realizada en la próstata al introducir el ecógrafo en el recto.

Juniewicz y col (1989) determinaron que la ecografía transrectal puede ser usada para estimar correctamente el peso prostático, basándose en las mediciones obtenidas. En un trabajo realizado por Susuki y col (1998b) se utilizó un normograma para determinar el volumen prostático utilizando ecografía transrectal, ya que es el método más exacto para tomar mediciones prostáticas in vivo.

ECOGENICIDAD

Aunque la calidad de la imagen obtenida fue mejor al realizar la ecografía vía transrectal, la ecogenicidad obser-vada con ambos métodos no mostró grandes variaciones. Se observó un caso en que la ecogenicidad vía transrec-tal fue diferente a la transabdominal, a diferencia de lo descrito por Mosca Zohil y Castellano (1995), quienes al comparar lo observado con ambas técnicas encontraron múltiples variaciones de ecogenicidad en el parénquima prostático, debido principalmente a que todos los anima-les utilizados presentaban patologías prostáticas y que utilizaron un transductor de 3,5 / 5 MHz para realizar la ecografía transabdominal y uno de 7,5 MHz para realizar la ecografía transrectal.

Ruel y col (1998) establecen que las variaciones ecogénicas de la próstata están dadas principalmente por patologías, si bien la ecogenicidad de la glándula tiende a variar con la edad del paciente, siendo menor en perros jóvenes y mayor en perros de mayor edad. De acuerdo a Selcer (1995), entre las patologías que cambian la eco-genicidad, la más frecuente es la HPB, en que se puede observar una glándula hipoecoica o hiperecoica; para el resto de patologías como las neoplasias, quistes prostáticos o prostatitis, lo más característico es la presentación de patrones ecogénicos mixtos, observando zonas anecoicas, hipoecoicas e hiperecoicas combinadas.

ECOTEXTURA

Sólo dos variaciones de ecotextura fueron encontradas al comparar los mismos casos con las técnicas transrectal y transabdominal. Sin embargo, cinco casos que presentaron una ecotextura heterogénea mostraron distintas características ecográficas con una y otra técnica, pudiendo observarse un mayor detalle y precisión con la técnica transrectal al igual que lo descrito por Mosca Zohil y Castellano (1995), los cuales establecen que el mayor detalle observado se debe a la distancia entre el transductor y la próstata ya que solo la delgada pared del recto se interpone entre la sonda transrectal y la glándula.

Las modificaciones de ecotextura de acuerdo a Ruel y col (1998) se deben en su mayoría a patologías prostáticas; las lesiones cavitarias no son patognomónicas y pueden verse tanto en quistes, abscesos, quistes paraprostáticos, prostatitis, neoplasia o lesiones combinadas, por lo tanto el diagnóstico definitivo se realiza con punciones guiadas ecográficamente.

Narayan y col (2005) describen que la ecografía trans-rectal junto con la resonancia magnética son técnicas usadas para el estudio médico de la patofisiología prostática. Sin embargo, la resonancia magnética es de alto costo y de escasa utilización en medicina veterinaria, siendo la ecografía transrectal el método más exacto.

La técnica ecográfica transrectal permitió visualizar completamente la próstata a diferencia de la técnica trans-abdominal. El largo prostático es mayor al ser medido con la técnica transrectal, mientras que la altura es mayor al ser medida con la técnica transabdominal. La ecotextura y ecogenicidad son similares al comparar ambas técnicas.

RESUMEN

Con el objetivo de evaluar las técnicas ecográficas transrectal y transabdominal para el examen de la glándula prostática en perros, se realizó un estudio en 20 perros machos enteros, clínicamente sanos, de 1,5 a 10 años de edad y un peso de 15 a 35 kg, los que fueron anestesiados con xilacina y ketamina EV. Se realizó la ecografía transrectal en un corte longitudinal con un transductor lineal de 7,5 MHz y la ecografía transabdominal con un transductor sectorial de 7,5 MHz. Los parámetros para comparar ambas técnicas fueron: a) posibilidad de observación de la glándula prostática, b) largo y alto máximo de la próstata, ecogenicidad y ecotextura prostática. La próstata se observó en todos los casos ecografiados con la técnica transrectal, a diferencia de la técnica transabdominal, en que se logró obtener cuatro imágenes completas, 11 incompletas, no observándose la glándula en cinco perros. Se encontraron diferencias significativas (P < 0,05) en las mediciones de largo y alto prostático al comparar ambas técnicas, siendo mayor el largo de la glándula prostática con la técnica transrectal y la altura con la técnica transabdominal. No se encontraron diferencias al comparar la ecogenicidad y ecotextura, sin embargo, el detalle de la imagen obtenida fue mejor con la técnica transrectal. Se concluye que la técnica ecográfica transrectal permitió visualizar completamente la próstata en todos los perros, a diferencia de la técnica transabdominal, en que no siempre se observó la glándula por encontrarse total o parcialmente dentro del canal pélvico. Se estima que ambos métodos de examen son complementarios e importantes de realizar en determinados casos.

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J THIBAUT Y COL

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Arch Med Vet 41, 67-71 (2009)

ARTÍCULO ORIGINAL

Aceptado: 10.09.2008.

# Proyecto DID UACH 200717.

* Casilla 567, Valdivia, Chile; [email protected]

Salmo salar: morfología ultraestructural de la pared del corion en ovas normales y con problemas de eclosión#

Salmo salar: ultrastructural morphology of chorion, from normal and with hatching problems ova

R Jaramillo*, O Goicoechea, O Garrido, E MolinariInstituto de Embriología, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

SUMMARY

Either eyed alevins unable to digest the chorion or those digesting it partially, are both suffering the “hard chorion” phenomenon; in both cases alevins can not survive producing high mortality rates. During recent years, the salmon farming industry in Southern Chile has been facing massive mortality events caused by “hard chorion”. Since “hard chorion” is a recently observed phenomenon there are no literature reporting its origin. The aim of this study was to find differences in the ultrastructure of chorion fibers from Salmo salar ova at different stages of development by using Scanning Electron Microscopy and image analysis technique. Early results here reported indicated no differences in thickness of chorion fibers for Salmo salar ova at different stages of development, however differences in spatial arrangement of fibers forming the inner layer of chorion seem to explain the “hard chorion” occurrence. No pores were observed in the inner layer of chorion of ova exhibiting “hard chorion” as opposed to normally developed ova which have pores and allow hatching of alevins. Since choriogenin is a protein formed by a number of sub-units, it is possible that failure in synthesis of one of these sub-units might be responsable for an anomalous arrangement of fibers of chorion causing the “hard chorion” phenomenon.

Palabras clave: Salmo salar, reproducción, ultraestructura, corion.

Key words: Salmo salar, reproduction, ultrastructure, chorion.

INTRODUCCIÓN

El desarrollo ontogenético en peces ocurre a través de una sucesión de estados que conducen al nacimiento del alevín durante el proceso denominado eclosión. El perío-do de eclosión es la etapa en la cual el embrión emerge desde la envoltura que rodea al huevo (corion) durante el desarrollo, para constituirse en alevín con saco, el cual iniciará su fase de vida libre, primero utilizando el vitelo remanente en el saco vitelino como nutriente, para más tarde iniciar su alimentación externa.

Durante la ovogénesis, el hígado de la hembra de peces teleósteos sintetiza, entre otras, una proteína compleja llamada coriogenina (Darie y col 2005). Esta proteína está formada por tres subunidades, las cuales son trans-portadas a través del torrente sanguíneo hasta llegar al ovario en donde se ensamblan para constituir una cubierta protectora denominada envoltura vitelina o corion (Celius y Walther 1998).

Una vez ocurrida la fecundación, con la finalidad de evitar la poliespermia y de proteger al embrión durante su desarrollo, se produce el endurecimiento del corion,

el cual permanecerá envolviendo al huevo fecundado hasta el momento en que ocurra la eclosión del alevín. Este endurecimiento parece producirse por la participa-ción de Ca2+ en medio ácido, junto a mucopolisacáridos sometidos a reacciones de oxidorreducción, sumados a la formación de puentes disulfuros entre las proteínas del corion (Masuda y col 1992).

Bajo condiciones normales, el desarrollo de los embriones ocurre al amparo de la acción protectora del corion, pero alcanzado el estado de ova con ojo comienza la producción de enzimas de eclosión, las cuales inician el proceso de digestión de las paredes internas del corion. El adelgazamiento progresivo y considerable de esta envoltura permite que ocurra la ruptura del corion y la subsecuente salida de los alevines con saco desde su interior.

Los estudios relacionados con el corion, hasta ahora conocidos, hacen referencia al proceso de endurecimiento del corion postfecundación, a la caracterización de las enzimas participantes y los mecanismos involucrados en dicho proceso (Iuchi y col 1991, Masuda y col 1992, Iconomidou y col 2000, Darie y col 2005). Sin embargo, y a pesar de las evidencias químicas y espectroscópicas que muestran cambios estructurales en la conformación de las proteínas del corion luego del proceso de fecunda-ción, no existen estudios que muestren las características ultraestructurales del corion previo a la fecundación y luego de ocurrido el endurecimiento.

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Por otra parte, y directamente relacionado con el pro-ceso de eclosión, se ha podido observar que en algunas pisciculturas dedicadas a la producción de alevines de salmónidos en el sur de Chile han ocurrido fracasos re-productivos importantes debido a que un gran porcentaje de ovas con ojo de algunas cohortes no logran romper el corion. Un porcentaje menor de ovas logra romper el corion de manera parcial, por lo que una parte del cuerpo del embrión o parte de su saco vitelino eclosiona, quedan-do el resto del embrión o del saco atrapado al interior de la cavidad coriónica, lo que lleva a la muerte del alevín. Debido a que en apariencia el corion se transforma en una barrera difícil de romper o degradar este fenómeno ha sido denominado comúnmente como “corion duro”.

Este problema ha sido reportado principalmente en ovas de Salmo salar y Oncorhynchus kisutch, pero parece ser un fenómeno generalizado entre los salmonídeos, ya que también se ha observado en otras especies cultivadas en el sur de Chile, tales como Salmo trutta y Oncorhynchus mykiss, desconociéndose hasta ahora la razón por la cual el corion es digerido de manera parcial por las enzimas de eclosión.

Como este fenómeno parece ser de reciente ocurrencia, hasta el momento no existen antecedentes que expliquen el origen del “corion duro”. Sin embargo, y como resultado de la observación macroscópica de los cambios que ocurren con las ovas entre el momento de su obtención y la pos-terior fecundación, es posible pensar que la organización estructural de las fibras proteicas que componen el corion o su distribución se encuentren alteradas en aquellas ovas que no eclosionan o que eclosionan parcialmente.

Un primer paso para entender este fenómeno sería el conocer las características de la organización estructural del corion normal en ovas sin fecundar y del corion de ovas postfecundación, y luego conocer las características del corion en ovas parcialmente eclosionadas o definiti-vamente sin eclosionar.

MATERIAL Y MÉTODOS

RECOLECCIÓN DE OVAS

Para el estudio de la ultraestructura normal del corion de ovas sin fecundar y ovas recién fecundadas se obtu-vieron ovas de Salmo salar desde una piscicultura de la Décima Región.

El corion de ovas eclosionadas y sin eclosionar se obtuvo a partir de cohortes de Salmo salar provenientes de la misma empresa y colectadas en el momento en que se presentó el fenómeno de “corion duro”.

FIJACIÓN DEL CORION PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

DE BARRIDO

El corion de ovas sin fecundar así como de ovas post-fecundadas fueron fijados en terreno mediante la utilización de una solución de glutaraldehído al 2,5% en buffer fos-

fato, para luego ser dispuestas en una caja refrigerada y más tarde trasladadas al laboratorio de microscopía del Instituto de Embriología de la Universidad Austral de Chile en Valdivia.

A partir del grupo de ovas que continuó el desarrollo, durante la eclosión de los alevines, se procedió a recolectar el corion de aquellas ovas eclosionadas, las cuales fueron fijadas en las mismas condiciones que las anteriores.

En el caso de ovas que evidenciaron la ocurrencia del fenómeno “corion duro”, se procedió primero a disecar el corion de los alevines no eclosionados o parcialmente eclosionados para luego proceder a su fijación utilizando el mismo fijador. El transporte de ambos tipos de corion hasta el laboratorio de Embriología en Valdivia se realizó según el procedimiento más arriba descrito.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

Las muestras de corion fueron preparadas para su ob-servación a la Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) según el siguiente protocolo. Primero fueron lavadas en buffer fosfato, postfijadas en tetróxido de osmio al 1% en el mismo buffer, deshidratadas en una batería de alcohol y acetona, seguida de un proceso de secado al punto crítico del CO2 y montadas sobre un portaespecímenes. Finalmente fueron metalizadas por ionización con una capa de oro de 20 nm de espesor. La observación de las muestras se realizó en un microscopio electrónico de barrido modelo LEO 420.

ANÁLISIS DE IMÁGENES

Las fotografías de los diferentes tipos de corion obte-nidas a la MEB fueron utilizadas para realizar un análisis de imágenes que permitió evaluar cuantitativamente las características del corion de los diferentes tipos de ovas en estudio. En este caso se procedió a realizar mediciones del grosor del corion así como también de las fibras que forman la cara interna del corion. El programa utilizado para este estudio fue SigmaScan pro5 (SPSS Inc.).

RESULTADOS

El estudio de ovas sin fecundar, de ovas fecundadas, de ovas parcialmente eclosionadas y ovas sin eclosionar de S. salar a la MEB reveló que el corion de todas ellas posee similares características estructurales; es decir, que en todos los casos el corion aparece como una envoltura compuesta por dos capas o estratos íntimamente asociados, seguidos de un tercer estrato que presenta una serie de porosidades formando una especie de red y que se dispone próximo a la membrana citoplasmática del ovocito (figura 1).

El estrato externo, que corresponde a la fracción de corion que está en contacto con el medio ambiente, es de apariencia granular y corresponde a una capa fina de aproximadamente 0,2 μm de espesor, que se continúa con un segundo estrato (estrato esponjoso), situado inmedia-

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SALMO SALAR, REPRODUCCIÓN, ULTRAESTRUCTURA, CORION

tamente por debajo y que está compuesto por numerosos haces de fibras proteicas ordenadamente entrelazadas. Esta disposición permite la formación de numerosos espacios o poros (aproximadamente 1,15 µm de diámetro) que le otorgan a este segundo estrato la apariencia de una esponja derivando de allí su nombre.

Figura 1. MEB del corion de ovas de Salmo salar recién fertilizadas. (EE = estrato externo; EEs = estrato esponjoso; EI = estrato interno; PO = poros que se continúan hacia el estrato esponjoso). SEM chorion’s view of fertilized Salmo salar ova. (EE = ex-ternal stratum; EEs = spongy stratum; EI = inner stratum; PO = pores connected to the spongy stratum).

El tercer estrato o estrato interno corresponde a la cara del corion que está en contacto directo con la mem-brana plasmática del ovocito. Este estrato está formado por un entramado muy similar a la estructura de una red que permite la aparición de poros. Los poros tienen su origen en el estrato esponjoso y su prolongación hacia el estrato interno permite el establecimiento de una relación de continuidad entre ambos estratos (figura 2), la que es característica para cada especie de salmónido.

A pesar de estas similitudes en la estructura del corion, se observaron algunas variaciones entre los diferentes tipos de ovas estudiadas. Estas diferencias se producen fundamentalmente al realizar mediciones del grosor del corion y del grosor de las fibras proteicas que constituyen el corion. En el caso del espesor del corion de las ovas no fecundadas este promedio llegó a los 30,5 μm, mientras que en el caso de las ovas fecundadas el grosor del corion alcanzó un promedio de 25,5 μm (cuadro 1).

En el caso del grosor de las fibras, las ovas no fecun-dadas mostraron un grosor 0,16 μm, mientras que en las ovas fecundadas el grosor fue de 0,29 μm (cuadro 1), no observándose diferencias en la disposición espacial (entramado) de las fibras (figuras 2 y 3).

Figura 2. MEB de la cara interna del corion de ovas eclosio-nadas de Salmo salar (FP = fibras proteicas; PO = poros que se continúan hacia el estrato esponjoso). SEM view of chorion’s outer stratum from hatched ova of Salmo salar (FP = protein fibers; PO = pores connected to the spongy stratum).

Figura 3. MEB de la cara interna del corion de ovas no eclosio-nadas de Salmo salar (FP = fibras proteicas). Nótese la ausencia de poros. SEM inner stratum chorion´s view from not hatched ova of Salmo salar (FP = protein fibers). See homogeneous distribution of fibers and absence of pores.

El estudio del corion de ovas eclosionadas, también llamado “corion normal,” mostró un grosor del corion promedio de 25,6 μm (cuadro 1), mientras que el grosor del corion de ovas que no permitieron la eclosión de alevines llamadas “corion duro” fue de 25,4 μm.

Si bien es cierto que la diferencia en el grosor del corion entre ambos tipos de ovas es mínima, la principal diferencia

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entre ambos tipos de corion viene dada por el grosor de las fibras y por la disposición de éstas en el estrato interno (figuras 2 y 3). En el caso del corion normal, el grosor promedio de las fibras es de 0,18 μm, mientras que en el caso de “corion duro” las fibras alcanzan un promedio de 0,25 μm (cuadro 1).

En el caso de las “ovas normales” las fibras que confor-man el corion siguen el patrón de ordenamiento observado en las ovas fecundadas y no fecundadas, es decir, mantienen la estructura de una red con poros dispuestos de manera equidistante y que permiten una comunicación entre el estrato interno y el esponjoso.

El estrato interno del corion de ovas que presentan el fenómeno “corion duro” exhibe una disposición regular de las fibras proteicas; sin embargo, esta disposición está completamente alterada ya que no hay formación de la estructura en forma de red característica del corion normal, por lo cual no se aprecia la formación de poros. En este caso las fibras se disponen densamente no permitiendo formación de poros, lo que no hace posible el paso de sustancias hacia el estrato esponjoso (figura 3).

DISCUSIÓN

En general, las ovas de los peces teleósteos presentan una envoltura primaria externa, que le confiere una identidad morfológica y bioquímica a cada especie, y que recibe el nombre de corion (Brivio y col 1991). Este corion es una estructura formada por capas que pueden variar en número y grosor dependiendo de la especie (Cotelli 1998). Las ovas de Salmo salar siguen estos patrones ya descritos exhibiendo tres capas: un estrato externo, un estrato medio o esponjoso y un estrato interno. Del mismo modo, los resultados aquí presentados muestran que el corion de los diferentes estados de desarrollo de las ovas de S. salar exhibe de manera regular el mismo número de capas.

Respecto del grosor del corion, los datos nos permiten establecer una variación entre el corion de ovas no fecun-dadas y ovas fecundadas. La diferencia puede ser explicada debido a que el corion presenta un cierto grado de elastici-dad. En el caso de ovas no fertilizadas y no hidratadas, se aprecia más grueso debido a que las primeras no han sido

hidratadas y por lo tanto se mantienen como al momento de la ovulación. En el caso de las ovas fecundadas, éstas han permanecido por algunas horas en el agua, por lo que se ha producido ingreso de agua por osmosis al interior de la ova, lo que produce aumento de la presión de turgencia al interior de la ova, la que ejerce presión sobre el corion. Este aumento de la presión interna de la ova conlleva un estiramiento del corion por la resistencia que este último realiza para evitar la ruptura de la ova.

Los valores reportados para el grosor del corion de ovas fecundadas con desarrollo normal y de ovas con corion duro varían en 0,1 µm. Esto podría estar relacionado con la disposición y grosor de las fibras, lo que podría estar asociado a una menor elasticidad.

Respecto del grosor de las fibras del corion normal, podemos decir que las fibras que forman tanto el corion de ovas no fecundadas y fecundadas no presentan cambios en su grosor, mientras que en el caso del corion duro éstas son definitivamente más gruesas ya que alcanzan los 0,25 µm. El origen de esta anomalía es de etiología desconocida. Aun cuando se ha encontrado en ovas de reproductores con daño hepático, en reproductores alimentados con dieta de alta energía y reemplazo proteico no existe certeza que pudiesen ser éstas las causas de la anomalía.

La diferencia más notoria entre las ovas con desarrollo normal y aquellas que muestran “corion duro” es que en este último caso el estrato interno no exhibe la característica disposición de red que conecta al ovocito con los poros del estrato esponjoso, por lo tanto no hay continuidad entre el ovocito y el corion.

Estudios publicados acerca del corion han reportado que las principales funciones de éste son permitir la difusión de gases y productos metabólicos de desechos, proporcionar protección mecánica, además de un aislamiento térmico a la ova (Iconomidou y col 2000), facilitando de este modo el desarrollo normal y la posterior eclosión de los alevines. Todas estas funciones se ven facilitadas por la presencia de los poros, situados en el estrato esponjoso, que se encuentran invadidos por microvellosidades que se proyectan desde la membrana plasmática del ovocito y que atraviesan la red de espacios (poros) observados en el estrato interno del corion (Shabanipour y Heidari 2004).

Cuadro 1. Valores promedios en µm obtenidos para parámetros como grosor del corion y fibras del corion para los diferentes tipos de ovas de Salmo salar estudiadas mediante el análisis de imágenes. Thickness average values (µm) obtained for both chorion and chorion fibers from different types of studied ova in Salmo salar.

Tipo de ovasGrosor del corion Grosor de las fibras

Promedio µm Desv. Std. Promedio µm Desv. Std.

Corion ovas sin fecundar 30,5 7,37 0,16 0,052

Corion ovas fecundadas 25,5 1,45 0,29 0,099

Corion normal 25,6 1,08 0,18 0,058

Corion duro 25,4 2,95 0,25 0,083

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SALMO SALAR, REPRODUCCIÓN, ULTRAESTRUCTURA, CORION

La ausencia de poros en el estrato interno del corion, por tanto, debiera reducir las funciones normales de éste y con ello afectar la viabilidad del alevín en formación. Por otra parte, las enzimas de eclosión que de manera normal disuelven el estrato interno del corion degradan-do específicamente ciertas glicoproteínas estructurales que forman parte de la red del estrato interno del corion (Yamagami 1981), facilitando con ello la ruptura del corion (coriólisis), también parecen ser afectadas. La ausencia de poros en el estrato interno no permite o permite sólo de manera parcial la actividad degradativa de las enzimas de eclosión, lo que redunda en la persistencia parcial o total del corion.

Puesto que la síntesis de la coriogenina ocurre en el hígado, es posible pensar que peces con algún tipo de daño hepático podrían producir una forma alterada de alguna de las tres subunidades que constituyen la coriogenina. Esta alteración podría significar que alguna de las subunidades de la coriogenina no se dispone de manera entrelazada, generando con ello un estrato interno del corion carente de poros. De este modo, entonces, el fenómeno denomi-nado “corion duro” podría ser explicado por la ausencia de poros en el estrato interno del corion, con lo que se produciría una restricción de los procesos fisiológicos de las ovas en desarrollo.

RESUMEN

El “corion duro” es un fenómeno de reciente ocurrencia y se caracteriza porque algunos alevines con ojo no son capaces de degradar el corion que les rodea o lo hacen sólo de manera parcial, produciéndose en ambos casos la muerte del alevín. Este fenómeno ha causado fracasos reproductivos importantes en algunas pisciculturas del sur de Chile, desconociéndose hasta ahora la razón de su ocurrencia. En este estudio se realizaron mediciones del grosor del corion de Salmo salar así como de las fibras que forman parte de éste en ovas fertilizadas, no fertilizadas, con desarrollo normal y ovas que no lograron eclosionar. Los resultados

obtenidos indican que las leves variaciones observadas en el grosor del corion entre los diferentes estados de desarrollo de las ovas estudiadas no explican la ocurrencia del “corion duro”. Sin embargo, la disposición de las fibras proteicas que forman el estrato interno del corion parece ser la respuesta a este fenómeno. Las ovas que no eclosionan presentan “corion duro” y exhiben un estrato interno carente de poros a diferencia de lo que se observa en las ovas que desarrollan normalmente y que logran la eclosión. Se propone que problemas en la síntesis de alguna de las sub-unidades que forman la coriogenina serían los responsables de la formación de un estrato interno carente de poros, siendo ésta la razón del “corion duro”.

REFERENCIAS

Brivio MF, R Bassi, F Cotelli. 1991. Identification and characterization of the major components of the Oncorhynchus mykiss egg chorion. Mol Reprod Develop 28, 85-93.

Celius T, BT Walther. 1988. Oogenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) occurs by zonagenesis preceding vitellogenesis in vivo and in vitro. J Endocr 158, 259-266.

Cotelli F. 1998. The fish egg chorion: Cellular and molecular biology. Proceedings of the EMBO-Workshop on reproduction and early development.

Darie CC, ML Biniossek, MA Gawinowics, Y Milgrom, JO Thumfart, L Jovine, ES Litscher, PM Wassaman. 2005. Mass spectrometric evidence that proteolitic processing of Rainbow trout egg vitelline envelope proteins takes place on the egg. J Biol Chem 280, 37585-37598.

Iconomidou VA, DG Chryssikos, V Gionis, MA Pavlidis, SJ Hamodrakas. 2000. Secondary structure of chorion proteins of the teleostean fish Dentex dentex by ATR FT-IR andFT-Raman spectroscopy. J Struct Biol 132, 112-122.

Iuchi I, K Masuda, K Yamagami. 1991. Change in component proteins of the egg envelope (chorion) of rainbow trout during hardening. Develop Growth Differ 33, 86-92.

Masuda K, I Iuchi, K Yamagami. 1992. Some properties of the hardening process in chorions isolated from unfertilized eggs of medaka Oryzias latipes. Develop Growth Differ 34, 545-551.

Shabanipour N, B Heidari. 2004. A histological study of the zona radiate during late oocyte developmental stages in the Caspian sea mugilid, Liza aurata (Risso 1810). Braz J Morph Sci 21, 191-195.

Yamagami K. 1981. Mechanism of hatching in fish: secretion of hatching enzyme and enzymatic choriolysis. Am Zool 21, 459-471.

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Arch Med Vet 41, 73-76 (2009)

COMUNICACIÓN

Aceptado: 10.06.2008.

* Casilla 160-C correo 3, Concepción, Chile; [email protected]

Frecuencia de comportamientos anormales estereotipados en caballos Chilenos estabulados

Frequency of stereotyped abnormal behaviour in stabled Chilean horses

L Muñoz*, J Torres, O Sepúlveda, C Rehhof, R OrtizDepartamento de Ciencias Clínicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Concepción, Concepción, Chile.

SUMMARY

The frequency of stereotyped abnormal behaviour i.e. windsucking/crib-biting, weaving and stall-walking were studied in 100 Chilean horses of both sex, stabled in individual boxes either all day long or during a certain period of time. All horses were tamed and older than 2 years old, and belonging to 16 studs of the Comuna de Chillán (Chile). The horses were observed between 7:00 and 19:00 hours during one day, and its owner or carer was asked whether the horse presented some stereotyped abnormal behaviour or not. Horses were separated according to age into 2 groups: 2 to 5 years old and older than 5 years, and also according to sex: stallions, geldings or mares. Data was analysed using the Microsoft® Excel Worksheet to establish frequencies. Differences between groups were analysed by Exact Fisher’s Test. Significance level was P < 0.05. The results showed that 50% of the studs had one or more horses with some stereotyped abnormal behaviour. Ten porcent of the horses presented stereotyped abnormal behaviour. Stall-walking was the most frequent stereotyped abnormal behaviour (8%), then windsucking/crib-biting (2%), and finally weaving (1%). According to sex, statistic differences were observed only for stall-walking between stallions and mares (P = 0.012). According to age no statistic differences were observed.

Palabras claves: comportamiento anormal, estereotipias, equinos, caballo Chileno.

Key words: abnormal behaviour, stereotypies, equine, Chilean horse.

INTRODUCCIÓN

En la vida silvestre, los caballos son gregarios y si tienen opción pasan más de la mitad de su tiempo en contacto con otros caballos (Houpt y Ogilvie-Graham 2002), por lo que el aislamiento social es una experien-cia perturbadora (Mal y col 1991). Esto junto a algunas prácticas de manejo asociadas a la estabulación como la alimentación fraccionada pueden favorecer el desarrollo de algunos comportamientos anormales, los cuales son comunes en caballos domésticos (Simpson 1998). Los comportamientos anormales no son deseados por los propietarios tanto desde el punto de vista estético como de salud, debido a que algunos de ellos pueden causar o predisponer a algunas patologías (Houpt 1995, McBride y Long 2001). Sin embargo, estos comportamientos anormales reflejan condiciones de vida inapropiadas asociadas a la domesticación (Mason 1991, Simpson 1998, Harewood y McGowan 2005), aun cuando se ha demostrado que para algunas de ellas existe una predisposición genética (Marsden 2002).

Los comportamientos anormales se pueden dividir en dos grupos, los propiamente anormales y los anormales estereotipados; los primeros son un acto aberrante con un

fin determinado, en tanto que los estereotipados aparte de ser aberrantes son repetitivos, y se caracterizan por mani-festarse con una secuencia de movimientos recurrentes e invariables, que se mantienen de un modo extraordinario y el animal parece tener dificultades para detenerlos, además no poseen un propósito o función definida (Dodman y col 1994).

El presente estudio tuvo como objetivos conocer la frecuencia de los comportamientos anormales estereoti-pados en el caballo Chileno estabulado y posteriormente comparar estos resultados con estudios realizados en otros países en diferentes razas o tipos de caballos y condiciones de manejo.

MATERIAL Y MÉTODOS

En septiembre del 2007, de 16 criaderos de la comuna de Chillán, Región del Biobío, Chile, se utilizaron 100 caballos Chilenos inscritos en los Registros Genealógicos de la Sociedad Nacional de Agricultura, de ambos sexos, y que cumplieran con los siguientes requisitos: permane-cer estabulados en pesebreras individuales durante todo el día o parte de éste, amansados y de dos años o más. Los caballos fueron observados en sus pesebreras, por un solo observador, un día, desde las 7:00 horas a las 19:00 horas con la finalidad de detectar algún comportamiento anormal estereotipado, además, complementariamente, se consultó al propietario o cuidador si el caballo presentaba

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uno o más de los siguientes comportamientos anormales estereotipados: aerofagia (tragador de aire) con o sin apoyo, bamboleo (mal del oso), o bien paseo circular en la pesebrera. Los equinos de acuerdo a su edad se dividieron en dos grupos: grupo A (de 2 a 5 años; n = 33) y grupo B (mayores a 5 años; n = 67). De acuerdo al sexo los equi-nos se dividieron en tres grupos: machos enteros (n = 37), machos castrados (n = 26) y hembras (n = 37).


Para el análisis de los datos se usó la planilla electrónica Microsoft® Excel para el cálculo de frecuencias, luego para comparar las diferencias existentes dentro de las variables sexo y edad se utilizó la Prueba Exacta de Fisher, con un nivel de significancia de P < 0,05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El 50% de los criaderos tenía uno o más caballos con algún comportamiento anormal estereotipado. Este por-centaje está dentro del rango observado en otros estudios realizados en el Reino Unido, siendo muy similar al 46% reportado por Waters y col (2002) en criaderos de caballos en donde sólo se consideraron caballos menores a cinco años, mantenidos la mayor parte del día en pradera. También es similar a lo señalado por McBride y Long (2001) quienes encontraron que el 55% de los centros de competencias ecuestres y el 58% de las escuelas de equitación tenían caballos con este tipo de comportamientos. Sin embargo, los resultados son mucho menores al 80% reportado por estos mismos autores en corrales de caballos de carrera. Esto confirma que los comportamientos anormales es-tereotipados son muy comunes en los lugares donde se crían o mantienen caballos, principalmente si éstos se mantienen estabulados, lo que coincide con lo señalado por otros autores (Houpt 1986, Simpson 1998).

De los 100 equinos estudiados, el 10% manifestó comportamientos anormales estereotipados, resultado que se encuentra dentro del rango observado en otros estudios similares, en que las prevalencias reportadas varían entre 3,9 y 34,7% (Luescher y col 1991, Houpt 1995, McGreevy y col 1995a, Redbo y col 1998, Pell y McGreevy 1999, McBride y Long 2001, Marsden 2002, Waters y col 2002, Christie y col 2006). El cuadro 1 muestra la frecuencia de comportamientos anormales estereotipados total y por edad en caballos Chilenos estabulados de la comuna de Chillán. De acuerdo a estos resultados se pudo estable-cer que sólo el 1% de los caballos presentaba más de un comportamiento anormal estereotipado, además, no se observaron diferencias estadísticamente significativas asociadas a la edad. El cuadro 2 muestra la frecuencia de comportamientos anormales estereotipados según el sexo, observándose sólo diferencias estadísticamente significativas entre machos enteros y hembras para paseo circular en la pesebrera (P = 0,012), siendo más frecuente en machos

enteros. Tanto la aerofagia como el bamboleo tuvieron una frecuencia de presentación muy baja, cercana al límite inferior del rango reportado por otros autores, que para la aerofagia es de un 0,4 a 10,5% y para el bamboleo de 0,1 a 9,5% (McGreevy y col 1995a, McGreevy y col 1995b, Redbo y col 1998, Pell y McGreevy 1999, McBride y Long 2001, Waters y col 2002), lo cual era esperable ya que en el caballo Chileno muchos de los factores de riesgo están atenuados como el ser un pony (Christie y col 2006), que su alimentación se basa principalmente en forraje y no concentrado (McGreevy y col 1995a, Johnson y col 1998, Redbo y col 1998, Waters y col 2002, Bachmann y col 2003, Mills y col 2000), que el sistema de manejo permite el contacto visual entre caballos (McGreevy y col 1995a) y que se usa preferentemente cama de paja (McGreevy y col 1995a, Goodwin y col 2002, Christie y col 2006). Es importante señalar que diversos estudios han demostrado que en la aerofagia con y sin apoyo, a diferencia de lo que se creía hasta hace algunos años, el aire deglutido llega sólo hasta la parte craneal del esófago y luego vuelve a la faringe (McGreevy y col 1995c, Marsden 2002), que los cólicos recurrentes observados con frecuencia en estos caballos son la causa y no consecuencia de este comportamiento y que son los factores genéticos y de manejo los que hacen pensar erróneamente que este comportamiento puede ser copiado por otros caballos (Houpt 1986, McGreevy y col 1995a, Marsden 2002, Nicol y col 2002). Eso sí, está demostrado que en los caballos con aerofagia hay un au-mento del tiempo de tránsito intestinal (McGreevy y col 2001). Respecto a nuestros resultados, llaman la atención dos situaciones: el alto porcentaje de caballos que realizan paseo circular en la pesebrera, ya que estudios anteriores realizados en caballos de carrera, enduro, adiestramiento y salto señalaban un rango para este comportamiento de entre 0,2 y 5,5% (McGreevy y col 1995a, McGreevy y col 1995b, Redbo y col 1998, Pell y McGreevy 1999, Waters y col 2002) y que el paseo circular en la pesebrera sea más frecuente que la aerofagia y bamboleo, situación observada sólo por McGreevy y col (1995b) en caballos de enduro en el Reino Unido y por Christie y col (2006) en caballos en Canadá. Este comportamiento fue explicado por McGreevy y col (1995b) como una manifestación de aversión a la pesebrera, ya que el sistema de manejo del caballo de enduro implica gran cantidad de horas fuera de la pesebrera, recibiendo incluso su forraje fuera de ésta, por lo que la pesebrera no es el refugio que pudiera representar para caballos que tienen un manejo en que pasan pocas horas al día fuera de la pesebrera, situación que podría coincidir con el manejo del caballo Chileno, el cual pasa la mayor parte del día amarrado al aire libre fuera de la pesebrera o, menos frecuentemente, en un corral o potrerillo, lugar donde recibe alimento; además, el entrenamiento del caballo Chileno considera el trabajar en pareja junto a otro caballo. Sin considerar el sexo, podemos decir que el caballo Chileno tiene una mayor predisposi-ción a desarrollar este comportamiento. Sin embargo, a la

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COMPORTAMIENTO ANORMAL, ESTEREOTIPIAS, EQUINOS, CABALLO CHILENO

luz de los resultados, el que este comportamiento se haya presentado sólo en machos y principalmente en machos enteros indica que existe un factor de riesgo asociado al sexo y más probablemente al manejo de los machos, por lo que adquiere validez lo sugerido por Houpt (1986) al señalar que el paseo circular en pesebrera es causado por el confinamiento y la frustración. Esto es altamente pro-bable si tomamos en cuenta que los criadores de caballos Chilenos habitualmente mantienen los machos enteros la mayor parte del día en pesebrera, sin contacto táctil con otros caballos y muchas veces aún sin contacto visual. Con los resultados obtenidos, se puede concluir que el 50% de los criaderos de caballo Chileno tienen caballos con comportamientos anormales estereotipados, que la frecuencia de éstos en la raza es muy baja, con excepción del paseo circular en la pesebrera, probablemente debido a factores de riesgo asociados al manejo, los cuales sería interesante analizar en futuros estudios.

RESUMEN

La frecuencia de comportamientos anormales estereotipados como aerofagia, bamboleo y paseo circular en la pesebrera, fue estudiada en 100 caballos Chilenos, de ambos sexos, estabulados en pesebreras individuales durante todo el día o parte de éste, amansados y de dos años o más pertenecientes a 16 criaderos de la comuna de Chillán. Los caballos fueron observados desde las 7:00 a las 19:00 horas durante un día y su propietario o cuidador consultado si presentaba algún comportamiento anormal estereotipado. Los equinos de acuerdo a su edad se dividieron en dos grupos: de 2 a 5 años y mayores a 5 años, y de acuerdo al sexo

en tres grupos: machos enteros, machos castrados y hembras. Los datos fueron analizados por medio de la planilla electrónica Microsoft® Excel, para establecer las frecuencias, y para comparar diferencias existentes entre los comportamientos anormales y las variables sexo y edad se utilizó la Prueba Exacta de Fisher, con un nivel de significancia de P < 0,05. El 50% de los criaderos tenía uno o más caballos con algún comportamiento anormal estereotipado. De los 100 equinos estudiados, el 10% manifestaba algún comportamiento anormal estereotipado, siendo el paseo circular en la pesebrera el más frecuente (8%), luego aerofagia (2%) y bamboleo (1%). Respecto al sexo, sólo se observaron diferencias estadísticamente significativas para paseo circular en la pesebrera entre machos enteros y hembras (P = 0,012), siendo este comportamiento más frecuente en machos enteros. Para la variable edad no se encontraron diferencias estadísticamente significativas.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Mario Briones, del Departamento de Ciencias Pecuarias de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepción, por su apoyo en el análisis estadístico de los datos.

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Cuadro 1. Frecuencia total y por edad de comportamientos anormales estereotipados en caballos Chilenos estabulados de la comuna de Chillán. Total and according to age frequency of the stereotypic abnormal behaviour in stabled Chilean horses of Chillán.

Comportamiento anormal estereotipado

Frecuencia (%)

TotalGrupo A2-5 añosn = 33

Grupo B6-19 añosn = 67

Paseo circular en la pesebrera 8 3 5

Aerofagia 2 0 2

Bamboleo 1 0 1

Cuadro 2. Frecuencias de comportamientos anormales estereotipados en caballos Chilenos estabulados de la comuna de Chillán, según sexo. Frequency of stereotypic abnormal behaviour according to sex in stabled Chilean horses of Chillán.

Comportamiento anormal estereotipado

Frecuencia (%)

Machos enterosn = 37

Machos castradosn = 26

Hembrasn = 37

Paseo circular en la pesebrera 6a 2 0a

Aerofagia 1 0 1

Bamboleo 1 0 0

a = P < 0,05 entre machos enteros y hembras.

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L MUñOZ Y COL

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77

Arch Med Vet 41, 77-82 (2009)

COMUNICACIÓN

Aceptado: 20.06.2008.

* Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Calle 65 Nº 26-10, Manizales, Caldas, Colombia; [email protected]

Concentrados autólogos de plaquetas como tratamiento de lesiones de tejidos blandos del aparato locomotor en caballos

Autologous platelet concentrates as a treatment for soft tissue musculoskeletal lesions in horses

JU Carmonaa*, M Pradesb, D Argüellesc

aGrupo Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Calle 65 Nº 26-10, Manizales, Caldas, Colombia.

bDepartamento de Medicina y Cirugía Animal, Universidad Autónoma de Barcelona, Edificio V. 08193. Bellaterra, Barcelona, España.

cCentro de Referencia Clínica Equina, La Equina. Manilva, Málaga, España.

SUMMARY

The efficacy of an autologous platelet concentrate (APC) in 5 horses with soft tissue musculoskeletal injuries namely: superficial digital flexor tendon (SDFT) tendinopathy and suspensory ligament desmopathy (DSL), was evaluated. Initial degree of lameness, flexion test response, ultrasonographic images and long term (1 year) clinical follow-up were documented. Three injections of APC were performed at two week intervals. Horses were evaluated before each injection, two months after the last treatment and one year after. Platelet counts, white blood cell counts and determination of TGF-β1 levels per ml of APC were performed. Two horses had acute SDFT tendinopathy, 1 had chronic forelimb proximal desmitis (PD) of the suspensory ligament (PDSL), 2 had chronic hindlimb PDSL, and 1 of them also had desmitis of the medial branch of the suspensory ligament of the right hindlimb. All the horses in this study presented a clinical decrease of degree of lameness and response to flexion test, two months after last APC treatment. Ultrasound appearance improved in the horses with SDFT lesions, but remained the same in the horses with DSL. All the horses returned successfully to competition without reinjury. Means of 250 ± 71.8 x 106 platelets, 8.68 ± 3.78 leucocytes x 106, and 12.5 ± 2.4 ng of TGF-β1 per 1 ml of the PC were obtained.

Palabras clave: caballo, tendinopatía, desmopatía, concentrado autólogo de plaquetas, TGF-β1.

Key words: horse, tendinopathy, desmopathy, autologous platelet concentrate, TGF-β1.

INTRODUCCIÓN

Las lesiones de los tendones y ligamentos sanan lenta e ineficientemente. Una vez se produce la lesión, estas estructuras nunca vuelven a recuperar sus propiedades biomecánicas originales (Goodship y col 1994, Smith y Schramme 2003). Se ha descrito la presencia de citocinas catabólicas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la interleucina 1 (IL-1) en biopsias de tendones de caballos afectados por tendinopatía crónica (Hosaka y col 2002, Hosaka y col 2004). Estas citocinas promueven la producción exagerada de metaloproteinasas de matriz (MMPs) y ciclooxigenasa 2 (COX-2), entre otras moléculas proinflamatorias, las cuales tienen efectos nocivos sobre la matriz extracelular (ECM) y las células residentes de tejidos tales como los tendones y ligamentos (Tsuzaki y col 2003, Hosaka y col 2004, Hosaka y col 2005).

Los efectos negativos de las citocinas catabólicas po-drían ser disminuidos por algunos factores de crecimiento (GFs) (van Miert 2002). Estudios in vitro han demostrado

las propiedades benéficas del factor de crecimiento trans-formante beta (TGF-β) (Murray y col 2003, Anitua y col 2004), factor de crecimiento similar a la insulina tipo I (IGF-I) (Dahlgren y col 2001), y otros GFs (Zhang y col 2003, Murray y col 2003, Wong y col 2003). Además, Dahlgren y col (2002) documentaron la acción positiva del IGF-I en un modelo equino de tendinitis del flexor digital superficial (SDFT) inducida con colagenasa. Los resultados de esos estudios sugieren los posibles beneficios de usar GFs como un tratamiento complementario de las lesiones de tejidos blandos del aparato locomotor, ya sea mediante el uso de proteínas puras recombinantes o me-diante terapia génica (Dahlgren y col 2001, Beredjiklian 2002, Dai y col 2003).

Los concentrados de plaquetas son una fuente autóloga de algunos GFs, especialmente TGF-β1 y otras moléculas que modulan la inflamación y el proceso de reparación tisular (Anitua y col 2004, 2005, Sutter y col 2004). Los concentrados autólogos de plaquetas (APCs) han sido usados exitosamente en medicina humana en situaciones como reconstrucción alveolomaxilar (Anitua y col 2004, Carlson y col 2002), cirugía plástica (Bhanot y Alex 2002) y ortopédica (Anitua y col 2004). También existen reportes anecdóticos sobre el uso de APCs como tratamiento de la tendinopatía de Aquiles en dos atletas y para tratar una

78

JU CARMONA Y COL

avulsión traumática de cartílago articular en un jugador de fútbol (Sánchez y col 2003). Anitua y col (2005) do-cumentaron los efectos positivos de los concentrados de plaquetas sobre tenocitos humanos. En ese estudio los concentrados plaquetarios indujeron proliferación celular y aumento en la expresión de dos péptidos angiogénicos como el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y factor de crecimiento derivado del hepatocito (HGF). Adicionalmente, Schnabel y col (2007) y Smith y col (2006) describieron importantes efectos anabólicos del plasma rico en plaquetas sobre explantes de tendones equinos. En esos trabajos se pudo observar que los concentrados de plaquetas promovían la síntesis de colágeno tipo I y de la proteína olimérica de la matriz de cartílago (COMP).

En este trabajo se presenta un estudio clínico des-criptivo sobre el uso de APCs como tratamiento de lesiones de tendones y ligamentos en cinco caballos. Los objetivos de este trabajo fueron describir los posibles efectos benéficos y la seguridad clínica de la inyección de APCs en caballos con lesiones de tejidos blandos del aparato locomotor.

MATERIAL Y MÉTODOS

Este estudio clínico fue aprobado por las directivas del Hospital Clínico Veterinario de la Universidad Autónoma de Barcelona, España. Los propietarios fueron informados sobre la naturaleza experimental del trata-miento con APCs y sus posibles complicaciones. Todas las observaciones y determinaciones fueron realizadas por el mismo clínico.

CABALLOS

Cinco caballos de diferente sexo, edad, raza y aptitud fueron incluidos en el estudio. La edad promedio de los pacientes fue de 8,6 años (rango 5-14 años). Un total de ocho extremidades fueron tratadas, ya que algunos pacientes presentaban lesión bilateral (cuadro 1). Dos pacientes tenían lesión aguda relacionada con tendinopatía del SDFT, uno con desmitis proximal crónica bilateral del ligamento suspensorio de los miembros anteriores, dos caballos con desmitis crónica bilateral del origen del ligamento suspensorio de los miembros posteriores; uno de esos pacientes también presentaba desmitis de la rama medial del ligamento suspensorio del miembro posterior izquierdo.

CRITERIOS DE INCLUSIÓN

Los criterios de inclusión empleados en este trabajo fueron que los caballos presentaran lesiones de tendones o ligamentos, pero que no hubieran sido tratados al menos durante los últimos seis meses. Los caballos enrolados no debían recibir ningún tratamiento adicional durante el tiempo del estudio (más de un año).

ESQUEMA DEL TRATAMIENTO

Cada paciente fue tratado con una inyección intra y perilesional de un APC cada 15 días, por tres veces consecutivas.

DISEñO DEL ESTUDIO

Se realizó un examen completo de cojera a cada paciente. En éste se incluyeron los bloqueos anestésicos necesarios para determinar el sitio exacto de la lesión en la extremidad. Cada examen fue complementado mediante evaluación ecográfica. Los exámenes de cojera y ecográfico fueron realizados antes de cada tratamiento, dos meses después de la última inyección del APC y un año después. El grado de cojera fue calificado subjetivamente de 0-5 de acuerdo con el criterio de la AAEP (1991). El examen de cojera siempre fue realizado sobre la misma superficie, los pacientes fueron manipulados por el mismo operario y recorrieron siempre la misma distancia.

Para la evaluación ecográfica de las lesiones de ten-dones y ligamentos se empleó la clasificación ecográfica modificada de Rantanen y col (2003), que incluye la combinación de los signos clínicos (calor, inflamación, cojera, sensibilidad al tacto y grosor de las estructuras anatómicas comprometidas) y las lesiones ecográficas de cada paciente. Los parámetros ecográficos usados en este estudio incluyeron: perímetro de área seccional (CSA), región de mayor lesión (MIZ), porcentaje de la región de mayor lesión en comparación con la región contralateral sana del ligamento o tendón, patrón ecogénico de la lesión y orientación transversa y longitudinal de las fibras. El examen clínico y el ecográfico de cada caballo fueron combinados para crear una escala cualitativa de lesión en seis categorías de 0-V, donde 0 = tendón o ligamento de apariencia ecográfica normal en un paciente clínicamente normal, V = presencia de lesiones anecoicas muy graves, con un gran incremento en los parámetros CSA-MIZ, desorganización horizontal y/o transversal de las fibras con evidentes signos clínicos acompañados de grados moderado o severo de cojera.

El tratamiento con los APCs fue considerado como exitoso cuando el caballo regresaba al mismo nivel físico-atlético de entrenamiento o competición que tenía antes de haber presentado la lesión y sin observarse recidiva a lo largo del período de evaluación clínica (un año).

PREPARACIÓN E INYECCIÓN DEL CONCENTRADO

AUTÓLOGO DE PLAQUETAS

Previa preparación aséptica, se obtuvo sangre entera de la vena yugular de cada paciente mediante un catéter mariposa 23G (Terumo, Bélgica). La sangre fue depositada en tubos de citrato de sodio 3,2% v/v con capacidad para 5 ml. Los tubos con sangre fueron centrifugados a 120 g durante cinco minutos. La primera fracción supernadante

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CABALLO, TENDINOPATÍA, DESMOPATÍA, CONCENTRADO AUTÓLOGO DE PLAQUETAS, TGF-β1

(50%) del plasma, adyacente a la capa leucoplaquetaria (buffy coat), fue obtenida bajo estricta asepsia en una cámara de flujo laminar horizontal. Esta fracción fue depositada en tubos sin aditivo y centrifugada a 240 g durante cinco minutos. Luego se extrajo el 25% del plasma del fondo de cada tubo. Esta última fracción fue depositada dentro de jeringas estériles y activada con cloruro de calcio (4,5 mEq/5 ml), a razón de 50 μl por ml de APC (Argüelles y col 2006). Dos ml de APC de cada paciente fueron em-pleados para realizar recuento de plaquetas y leucocitos (ADVIA 120, Bayer, USA) y determinar los niveles de TGF-β1 mediante una prueba comercial humana de ELISA (R&D System, USA).

El área afectada de la extremidad de cada paciente fue preparada asépticamente para realizar la inyección del APC. Los pacientes fueron sedados con un bolo intravenoso de detomidina (40 μg/kg) (Domosedan, Pfizer, España) y tartrato de butorfanol (0,02 mg/kg) (Torbugesic, Fort Dodge Laboratories Inc, España). Cada APC fue aplicado peri e intralesionalmente mediante inyección (aguja 21G) ecoguiada. La cantidad de APC usada en cada paciente fue determinada subjetivamente en función del tipo, tamaño (cm2 de área en corte transversal ecográfico) y extensión de la lesión (cm de longitud) (cuadro 1). Durante el tra-tamiento los caballos fueron confinados y dos semanas después de la última inyección se permitió un aumento gradual del ejercicio en función de la sintomatología clínica de cada paciente.


Este estudio clínico piloto fue realizado en equinos, en atención a que existe suficiente información científica y anecdótica sobre los efectos positivos de los APCs en lesiones de tejidos blandos de seres humanos (Bhanot y col 2002, Carlson y col 2002, Anitua y col 2004), tales como tendinopatías y desmopatías (Sánchez y col 2003, Anitua y col 2005).

Un promedio de 5 ml de APC fue obtenido a partir de cada 75 ml de sangre entera. El análisis de APC reveló un promedio de 250 ± 71,8 x 106 plaquetas, 8,68 ± 3,78 leucocitos x 106 y 12,5 ± 2,4 ng de TGF-β1 por mililitro. La técnica empleada para preparar los APCs de este estudio produjo una baja concentración de plaquetas (250 ± 71,8 x 106 plaquetas/ml) en comparación con los valores obte-nidos mediante el método de aféresis descrito por Carter y col (2003) (490 x 106 plaquetas/ml) y por Sutter y col (2004) (855 x 106 plaquetas/ml) o mediante un método semiautomatizado de buffy coat (1.472 x 106 plaquetas/ml). Sin embargo, con la técnica empleada en este estudio se obtuvieron concentraciones elevadas de TGF-β1 (12,5 ± 2,4 ng/ml) en comparación con las concentraciones obteni-das mediante el método de aféresis descrito por Carter y col (2003) (7,4 ± 1,3 ng/ml), y concentraciones bajas de TGF-β1 en comparación con los resultados descritos por Sutter y col (2003) (23,6 ng/ml). Es importante aclarar que concentraciones tan bajas como 5 ng/ml de TGF-β1 inducen síntesis de ECM y proliferación celular in vitro (Fortier y col 1997).

Los animales con lesiones del SDFT presentaban un registro ecográfico inicial grado V (cuadro 2). Los caba-llos con desmitis del origen del ligamento suspensorio presentaron registros ecográficos entre los grados I-IV (mediana II) (cuadros 2 y 3). Durante el inicio del estudio todos los pacientes presentaron un grado leve de cojera y una respuesta moderada a la prueba de flexión. El mejo-ramiento en ambos parámetros (clínico y ecográfico) fue más evidente al final del estudio. La apariencia cosmética del área lesionada (tendinopatías) fue excelente, incluso después de la primera inyección.

La evaluación ecográfica seriada mostró un mejo-ramiento en el registro de las lesiones, especialmente en los pacientes con tendinopatía del SDFT (cuadro 2). Los pacientes con desmitis del origen del ligamento suspensorio no cambiaron la apariencia del registro de calificación ecográfica. Sin embargo, estos pacientes

Cuadro 1. Historia clínica, reseña y aptitud de los pacientes del estudio. Clinical history sex, breed, age and aptitude of the studied patients.

CaballoNº Raza Sexo Edad

(años) Disciplina Extremidadafectada Diagnóstico APC

(ml/lesión)

1 Cruce Hembra 10 Salto AI Tendinopatía aguda del SDFT 5

2 Cruce Macho 11 Salto AD Tendinopatía aguda del SDFT 5

3 Warmblood Macho 11 Doma clásica D&IA PDSL Crónica 8

4 Angloárabe Macho castrado

6 Salto D&IP PDSL Crónica 8

5 Trotón Macho 5 Trote D&IP PDSL crónica. Desmitis de la rama medial del SL de la EPI

8-4

AI: Anterior izquierda. AD: Anterior derecha. PD: posterior derecha. PI: Posterior izquierda. SDFT: tendón flexor digital superficial. PDSL: Desmitis proximal del origen del ligamento suspensorio. SL: Ligamento suspensorio.

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JU CARMONA Y COL

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CABALLO, TENDINOPATÍA, DESMOPATÍA, CONCENTRADO AUTÓLOGO DE PLAQUETAS, TGF-β1

presentaron disminución del grado de cojera y respuesta a la prueba de flexión. Los caballos con desmitis del origen del ligamento suspensorio finalizaron el estudio con una calificación ecográfica mediana similar a la inicial (II), pero con una disminución en el rango de la clasificación (I-II) (cuadros 2 y 3).

Los caballos con tendinopatía del SDFT regresaron a su nivel de ejercicio o competencia normal 4,5 meses después del último tratamiento, sin recidiva durante el período de seguimiento (1 año). El caballo con desmitis crónica bilateral del origen del ligamento suspensorio de los miembros anteriores regresó a su nivel de competencia previo a la lesión dos meses después del último tratamiento y no presentó recidiva durante el año de seguimiento. Los pacientes con desmitis bilateral del origen del ligamento suspensorio de los miembros posteriores regresaron a su nivel de competición a los seis meses después de la última inyección del APC y no mostraron recaídas durante el año de seguimiento.

Aunque los caballos 1 y 2 de este estudio presentaron lesiones agudas del SDFT, en realidad esas afecciones podrían ser potencialmente consideradas como un cuadro de naturaleza degenerativa (Molloy y col 2003). Es nece-sario considerar que, aunque muchas lesiones tendinosas o ligamentosas pueden cursar como afecciones agudas (traumáticas), muchas de éstas, en realidad, son episodios relacionados con recidiva de lesiones crónicamente activas o con el fallo biomecánico de tejido cicatricial ubicado dentro de los tendones o ligamentos previamente lesio-nados (Goodship y col 1994, Dowing y col 2000, Smith y Schramme 2003).

Se sabe que caballos con clasificación de lesión tendinosa del SDFT (grados IV-V) similar a la de los dos caballos de este estudio están muy predispuestos a sufrir recidiva de la lesión; esto a pesar de haber seguido un programa adecuado de ejercicio controlado y recibir tratamiento convencional. Normalmente se recomienda un período de reposo de 9-12 meses como parte del tratamiento de esa clase de pacientes (Jorgensen y Genovese 2003, Dyson 2004). Aunque no es una muestra representativa, en este estudio se pudo apreciar que los dos pacientes con tendinopatía del SDFT, tratados con APCs, regresaron a su nivel de competición normal en la mitad del tiempo esperado y no presentaron recidiva de la lesión en comparación con casos reportados en la literatura, los cuales habían sido manejados con tratamientos convencionales como la inyección intra o perilesional de glicosaminoglicanos polsulfatados, ácido hialurónico o beta-aminopropiontrilo (BAPN), entre otros (Jorgensen y Genovese 2003, Dyson 2004).

Es necesario comentar que en un estudio reciente (Abellanet 2007) se evaluó el efecto de los APCs en 39 caballos con tendinopatía del SDFT con resultados esperanzadores. De manera general, se observó que los caballos tratados con APCs presentaron un mayor éxito terapéutico (medido como regreso a la competición) 69-76% (Abellanet 2007) en comparación con otros estudios en los que caballos con afecciones parecidas fueron tratados

de manera convencional (40-50%) (Dyson 2004). Por otra parte, también se observó que los caballos tratados con plaquetas presentaron un menor nivel de recaídas después de iniciar la competición (20-22%) (Abellanet 2007) en comparación con caballos tratados de manera clásica (50-80%) (Smith 2003, Dyson 2004).

Los casos de desmitis crónica proximal bilateral de los miembros posteriores no mostraron mejoramiento en su apariencia ecográfica después del tratamiento con APCs. Aunque estos pacientes no presentaban lesiones anecoicas y únicamente mostraban desorganización de las fibras y engrosamiento del origen del ligamento suspensorio, ellos mejoraron clínicamente y regresaron a su nivel de trabajo sin recidiva durante el año de seguimiento. El pronóstico de las lesiones del ligamento suspensorio depende de la extensión de la afección, del área afectada y de la extremidad (Dyson y col 1995). La desmitis proximal del ligamento suspensorio tiene un buen pronóstico cuando ocurre en los miembros anteriores en comparación con los posteriores (Dyson y col 1995). El caballo número 3 con desmitis proximal de los miembros anteriores regresó al nivel de entrenamiento previo a la lesión dos meses después de la última inyección de APC. Se ha observado que equinos con esta misma clase de afección regresan al nivel de entrenamiento previo a la lesión después de un programa de reposo seguido por ejercicio controlado durante tres meses (Dyson y Genovese 2003).

La principal limitación del estudio presentado aquí es el pequeño número de casos documentados y la variedad de las patologías. Sin embargo, a partir de los resultados obtenidos en este trabajo y a partir de los datos documentados por Abellanet (2007), se podría pensar que la inyección de APCs podría ser una nueva terapéutica promisoria para el tratamiento de las desmopatías y tendinopatías en el caba-llo. Sin embargo, esta terapia no puede ser recomendada hasta que se haya evaluado un mayor número de casos clínicos e idealmente bajo un esquema de estudio doble ciego con un largo período de seguimiento. Esto serviría para validar las impresiones clínicas observadas en este estudio y para reafirmar el uso empírico de esta sustancia por muchos veterinarios de equinos. Finalmente, la segu-ridad del tratamiento con APCs es un aspecto positivo que se puede asumir de esta investigación.

RESUMEN

Se evaluó la eficacia de un concentrado autólogo de plaquetas (APC) en cinco caballos con lesiones de tejidos blandos del aparato locomotor, tales como tendinopatía del tendón flexor digital superficial (SDFT) y desmopatía del ligamento suspensorio (DSL). Se documentaron el grado inicial de cojera, la repuesta a la prueba de flexión, las imágenes ecográficas y un seguimiento clínico a largo término. Se aplicaron tres inyecciones con un intervalo entre inyección de dos semanas. Los caballos fueron evaluados antes de cada inyección, dos meses después del último tratamiento y un año después. El número de plaquetas, leucocitos y los niveles de TGF-β1 fueron determinados en cada APC. Dos pacientes presentaron tendinopatía aguda del SDFT, un caballo tenía desmitis crónica proximal del ligamento suspensorio (PDSL) de ambos miembros anteriores, dos caballos tenían PDSL de ambos miembros posteriores; de estos pacientes uno tenía desmitis de la rama medial

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JU CARMONA Y COL

de ligamento suspensorio del miembro posterior izquierdo. Todos los caballos de este reporte presentaron una disminución clínica del grado de cojera y respuesta a la prueba de flexión dos meses después del último tratamiento. La apariencia ecográfica mejoró en los caballos con tendinopatía del SDFT, pero permaneció similar en los caballos con PDSL Los caballos con tendinopatía aguda del SDFT regresaron exitosamente a su nivel de competición sin recidiva. Los caballos con PDSL tanto de las extremidades anteriores como posteriores regresaron exitosamente a su nivel de competición sin recidiva. Por cada ml de APC se obtuvo un promedio de 250 ± 71,8 x 106 plaquetas, 8,68 ± 3,78 leucocitos x 106 y 12,5 ± 2,4 ng de TGF-β1.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer al Instituto de Terapia Regenerativa Tisular, Barcelona, España, y a Catalina López, MVZ, por la preparación de los APCs.

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83

Arch Med Vet 41, 83-88 (2009)

COMUNICACIÓN

Aceptado: 09.07.2008.

# Financiado por proyecto DID-UACH 2006-04.

* Casilla 567, Valdivia, Chile; [email protected]

Características citológicas del lavado bronqueoalveolar y respuesta inmune humoral frente a Aspergillus fumigatus en caballos Chilotes con

obstrucción recurrente de las vías aéreas#

Cytologic broncheoalveolar lavage findings and humoral immune response against Aspergillus fumigatus in Chilote horses with recurrent airway obstructions “heaves”

G Morána,b*, O Arayac, A Ortloffd, H Folcha

aInstituto de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.bBecario CONICYT, Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

c Instituto de Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.dEscuela de Medicina Veterinaria, Universidad Católica de Temuco, Temuco, Chile; Programa de Doctorado en

Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

SUMMARY

In this study, the presence and characteristics of the recurrent airway obstruction (RAO), in Chilote horses were investigated. The Chilote horse is a breed of small and very rustic horses, descendent from the horses that were brought by the spaniards during the colony and remained isolated in the Chiloe island, south of Chile, for a long time. Twenty two animals, all from the same farm and living under similar conditions, were physically examined. In all cases broncheoalveolar lavage (BALF) was performed and the recovered resident cells from the respiratory tract were studied in smears stained with May Grewald – Giemsa; the level of antibodies against Aspergillus fumigatus was determined by ELISA. The results indicate that out of the total population of animals under investigation, 13 showed clinical signs compatible with RAO and 9 were normal. In all cases, the animals that were considered RAO positive showed a higher percentage of polymorphonuclear neutrophils in the BALF: furthermore, a clear positive correlation between the relative amount of neutrophilic cells present in the airways and the severity of the signs observed during the physical examination exists. All of the animals, healthy and RAO positive horses, showed high titres of antibodies against A. fumigatus, a well known allergen, commonly distributed in the region and present in the hay/straw. Our results show that Chilote horses, even though they are a rustic bread, are very susceptible to become RAO positive with similar characteristics to those described in other breeds, moreover, all animals were sensitized to A. fumigatus antigens showing the immunogenicity and the important distribution of this fungal allergen.

Palabras clave: caballos Chilote, ORVA, LBA, alergia.

Key words: Chilote horses, RAO, BALF, allergy.

INTRODUCCIÓN

El caballo Chilote, mantenido en la Isla Grande de Chiloé desde la llegada de los españoles, es un recurso único en el mundo; antecedentes históricos, características morfológicas y su análisis genético confirman que tiene su origen en aquellos ejemplares equinos provenientes de la península ibérica durante el periodo de la conquista. En 1999 se aprobó formalmente la existencia de la raza del caballar Chilote y se abrieron los registros genealógicos, permitiendo la inscripción de los ejemplares que cumplen con los estándares establecidos. Una de las características de esta raza es su rusticidad y su capacidad de adecuarse al medio, lo que hace de estos animales una excelente herramienta para labores de tipo agrícola (Escobar y Tadich 2006). Estos equinos, a pesar de su rusticidad, al

igual que las otras razas de caballos conocidas, desarrollan obstrucción recurrente de las vías aéreas (ORVA) si son expuestos a determinados alérgenos. El ORVA, conocido en inglés como RAO (recurrent airways obstruction), es consecuencia de un proceso inflamatorio originado por una hipersensibilidad gatillada por la inhalación de agentes alergénicos. Esta condición, debido a los mecanismos inmunológicos que intervienen en la patogénesis, tiene alguna similitud con el asma humana (Herszberg y col 2006, Morán y col 2006). Esta patología pulmonar equina se caracteriza por una inflamación de las vías aéreas, acumulación de mucus y obstrucción reversible, debido a la hipersensibilidad bronquial (Jackson y col 2000), lo que hace que el animal presente una gran disnea, carac-terizada por doble espiración abdominal y tos seca. Si la patología lleva varios meses se puede apreciar la llamada línea del esfuerzo, la cual se debe a la hipertrofia de los músculos rectoabdominales. En los casos menos severos, sólo es posible observar una disminución en el rendimiento deportivo del caballo.

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G MORÁN Y COL

La hipersensibilidad broncopulmonar de tipo I y la hipersensibilidad tipo III son los factores etiopatogénicos que se señalan como principales del ORVA (Robinson y col 2001, Horohov y col 2005); estos cuadros se desa-rrollan como consecuencia de una exagerada respuesta inmune humoral, que a su vez depende de la actividad de las células T CD4+ del tipo Th2 e IL-4 (Lavoie 2001). Adicionalmente, juegan un rol importante las citoquinas proinflamatorias que se producen como consecuencia de la entrada de los alérgenos en las vías respiratorias (Barnes y col 1998).

Entre los alérgenos más importantes como inductores de este cuadro alérgico están las esporas de Aspergillus fumigatus, hongo oportunista causante de varias pato-logías respiratorias tanto en hombre como en animales (Rementeria y col 2005). Las esporas de este hongo se encuentran principalmente en heno y paja almacenados con 20-30% de humedad (Araya y Zaror 1995). También se han encontrado bacterias inductoras de hipersensibilidad pulmonar como Faenia rectivirgula y Thermoactinomices vulgaris, las que crecen en las mismas condiciones que el Aspergillus fumigatus (MacGorum y col 1998). Por otra parte, los ácaros del polvo son potencialmente alergénicos para humanos y caballos (Hockenjos y col 1981), y cons-tituyen un factor de complicación, debido a que éstos se alimentan de esporas de hongos, las que son eliminadas como pellets fecales, los cuales también serían un factor para iniciar este cuadro alérgico en los equinos (Clarke y Madelin 1987).

El objetivo de este estudio es analizar las caracte-rísticas citológicas del lavado bronqueoalveolar (LBA) de caballos Chilote con ORVA y compararlos con los resultados obtenidos de los animales sanos, determinar el grado de respuesta inmune humoral de estos animales contra Aspergillus fumigatus y determinar la importancia de este microorganismo en la inducción de este cuadro alérgico pulmonar en esta raza de caballos mantenidos en la Región de los Ríos de Chile.

MATERIAL Y MÉTODOS

ANIMALES

En el presente estudio se utilizaron 22 caballos Chilote. Los animales correspondieron a individuos de ambos sexos mantenidos estabulados durante la noche y alimentados con heno que, según pudo determinarse, contenía esporas de Aspergillus fumigatus. La contaminación por este hongo fue determinada usando el muestreador manual de Burkard como ha sido descrito anteriormente (Araya y Zaror 1995). El diagnóstico de ORVA se realizó mediante el examen clínico, lo cual permitió clasificar los animales según la intensidad de la signología clínica como ha sido propuesto por Robinson (2000). Además, los animales fueron sometidos a un lavado bronqueoalveolar (LBA) y a una inspección endoscópica del tracto respiratorio. Adicionalmente a los

caballos incluidos en el experimento se les extrajo sangre por venopunción yugular para la realización de un hemo-grama y la obtención de suero, el que posteriormente fue congelado a -20ºC hasta su análisis.

LAVADO BRONQUEOALVEOLAR

Para la realización del LBA se ocupó una sonda Fogarty flexible de 180 cm, la cual se introdujo vía nasotraqueal hasta un bronquio de tercera o cuarta generación. Para efectuar el examen, los caballos fueron sedados con Romifidina en dosis de 60 µg/kg vía endovenosa (Laboratorio Boehringer Ingelheim). El fin de este procedimiento fue facilitar la maniobra y evitar la tos paroxística al momento que la sonda traspasa la carina traqueal. Una solución fisioló-gica estéril a 37 ºC fue instilada en el árbol respiratorio mediante jeringas de 60 ml en un volumen total de 180 ml. Posteriormente se recuperó tanto líquido como fue posible. Luego las muestras fueron centrifugadas por 10 minutos a 2.500 g y seguidamente su componente celular fue sometido a conteo diferencial en frotis utilizando la tinción May-Grünwald Giemsa.

PRUEBA DE ELISA PARA LA DETECCIÓN DE

INMUNOGLOBULINAS ESPECÍFICAS PARA LOS ANTÍGENOS

DE ASPERGILLUS FUMIGATUS

Para detectar y cuantificar en los sueros problema la presencia de inmunoglobulinas específicas contra Aspergillus fumigatus se montó un ELISA indirecto. Para ello se uti-lizaron placas de microtitulación de 96 pocillos. A cada pocillo se le agregaron 100 µl de antígeno de Aspergillus fumigatus en buffer carbonato 0,1 M a pH 9,5, el cual se dejó incubando por 12 horas a 4 ºC. Posteriormente los pocillos de las placas se lavaron tres veces con 300 µl de buffer PBS a pH 7,0 con 0,05% de Tween 20. Luego los pocillos de la placa se bloquearon con 200 µl de PBS con un 5% de leche descremada por una hora a Tº ambiente; la placa fue lavada tres veces con la solución de lavado. Terminado este proceso, se agregaron a cada pocillo 100 µl de suero de caballo diluido 1:100 en PBS, se incubó por una hora a Tº ambiente, a continuación la placa fue lavada tres veces con la solución de lavado. Luego se agregaron a cada pocillo 100 µl de suero antiinmunoglobulina de caballo preparado en conejo en una dilución 1:1000 e incubados por 1 hora a 37 ºC; luego las placas fueron lavadas tres veces y cada pocillo fue cargado con 100 µl de Ac anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa diluido 1:1000. Posteriormente la placa fue lavada tres veces con solución de lavado para agregarle 100 µl de solución de sustrato (buffer fosfato citrato a pH 5,0). La placa se incubó por 10 minutos a Tº ambiente en oscuridad, luego la reacción colorimétrica se detuvo agregando 50 µl de solución 2,5 M de ácido sulfúrico para colocarlo en el lector de ELISA con un filtro de 490 nm.

85

CABALLOS CHILOTE, ORVA, LBA, ALERGIA

OBTENCIÓN DE ANTÍGENOS DE ASPERGILLUS FUMIGATUS

Para la obtención de las proteínas solubles de Aspergillus fumigatus usadas en el test de ELISA, el crecimiento del Aspergillus se dividió en dos partes: cultivo en agar peptona por 7 días a 23 ºC y luego cultivo en suspensión en caldo Malta por otros 7 días a 23 ºC. La extracción de proteína se basó en el método descrito por Céspedes y col (1999). Para esto, los microorganismos se cosecharon por centrifugación y se fijaron con etanol (Merck, USA) al 60% por 24 horas. Luego, los microorganismos se centrifugaron por 10 minutos a 12.500 g, se eliminó el sobrenadante y se incubó en una solución salina hiper-tónica 1 M NaCl, 0,1 M de citrato de sodio y 0,5 mM de EDTA (Sigma Chemical Co. USA) por 24 horas a 4 ºC. Posteriormente, los microorganismos fueron sonicados (Ultrasonic Homogenizer, serie 4710 Cole Parme USA) durante 20 minutos a 90 Watts, las células desintegradas se centrifugaron a 25.000 g por 30 minutos y el sobrena-dante, que contenía las proteínas solubles, se dializó contra buffer fosfato salino (PBS). Posteriormente, las proteínas obtenidas se concentraron mediante el uso de Speed Vac SC 110 (Savant, USA) y fueron cuantificadas por el método Bradford, conservándose a –20 ºC hasta su uso.


Los valores obtenidos tanto en los conteos celulares del LBA como en las distintas pruebas a que fueron so-metidos los animales fueron evaluados para determinar su normalidad mediante el test de Kolmogorov-Smirnov. Además, fueron comparados por el método Wilcoxon rank test, donde P < 0,05 fue considerado significativo.


De los veintidós caballos Chilote del predio en que se realizó el estudio, trece mostraron síntomas compatibles con ORVA y nueve resultaron normales al examen clíni-co. Los animales positivos fueron a su vez agrupados en cuatro grupos de acuerdo a la severidad de su signología (cuadro 1); sólo un animal fue clasificado con ORVA de 8 puntos (signología clínica severa), que presentaba gran disnea, tos seca, secreción nasal abundante, ollares dilatados y miembros extendidos, producto de la difi-cultad respiratoria. El análisis de las células recobradas del LBA mostró en este ejemplar un 82% de neutrófilos. Los tres animales ORVA positivos que por sus signos clínicos fueron clasificados con 5-6 puntos (signología clínica moderada) mostraban una disnea importante, tos y secreción nasal evidente, y el examen citológico del LBA demostró un porcentaje de neutrófilos que variaron entre un 66% a 75%. En el grupo con signología clínica leve (3-4 puntos), fueron incluidos cinco caballos ORVA positivos que mostraron disnea moderada con espiración abdominal y tos seca ocasional; el porcentaje de neutró-

Cuadro 1. Clasificación de los animales positivos y negativos a ORVA según su signología clínica (Robinson y col 2000), la edad de cada animal y el porcentaje relativo de neutrófilos presente en el LBA. Clinical signology score according to Robinson et al (2000) in the horse population under study, showing the age of each animal and the relative percentage of neutrophils in the cells recovered from BALF (LBA).

Signos clínicos de ORVA Edad(años)

Neutrófilosen LBA (%)

Signos clínicos severos 12 82

Signos clínicos moderados 2155

756670

Signología leve 13245

11

5852464440

Signología clínica positivasólo después de ejercicios

3233

33312020

Ausencia de signos clínicos 105

1144

12736

865422100

filos en el LBA en este grupo varió en un rango de 40% a 58%. Por último, en la clasificación 1-2, se incluyeron los cuatro animales positivos restantes que mostraban escasa signología clínica cuando estaban en reposo, en los cuales, hecho el examen citológico del LBA, se pudo observar un porcentaje de neutrófilos que varió entre un 20% y un 31%. Los animales normales al examen clínico mostraron en las células recobradas del LBA un porcentaje igual o inferior al 8% de neutrófilos, lo que está en perfecta coincidencia con lo reportado anteriormente (Hare y col 1994, Robinson y col 2001). De estos resultados parece evidente, en equinos con ORVA, la perfecta correlación que existe entre la presencia de neutrófilos en el árbol bronquial y los signos clínicos.

En la figura 1A puede verse el aspecto de un frotis de LBA normal en que abundan macrófagos, linfocitos y algunas células epiteliales, no observándose la presencia de neutrófilos. En la figura 1B se muestra un frotis del LBA que corresponde a un caballo con ORVA con signología clínica moderada en que se ve una gran cantidad de neu-trófilos y una escasa presencia de macrófagos y linfocitos.

86

G MORÁN Y COL

Adicionalmente, como hallazgo curioso puede verse en la figura 1C el aspecto de un frotis de células obtenidas de un caballo positivo a esta enfermedad, mostrando un 57% de polimorfonucleares eosinófilos; observaciones como esta última han sido descritas anteriormente como conse-cuencia de parasitismo pulmonar, por lo general causado por Dictyocaulus arnfieldi o producto de la migración de áscaris, que preferentemente en el equino es Parascaris equorum (Morán y col 2006). También hallazgos similares han sido atribuidos a un cuadro poco frecuente en equinos denominado eosinofilia pulmonar idiopática (McGorum y Dixon 1994) o al efecto aditivo de las numerosas citoquinas producidas en los primeros estadios de una reacción de hipersensibilidad tipo I en el pulmón (Hare y col 1998). En este caso, esta última parece ser la causa del hallazgo descrito, ya que en lavados posteriores la eosinofilia fue reemplazada por una neutrofilia evidente; sin embargo, un efecto concomitante de una parasitosis para que se produzca esta eosinofilia exagerada no puede ser descartado ya que sabemos que los antígenos parasitarios son particularmente buenos inductores de células T helper de tipo 2 (TH-2) cuya activación es necesaria para que se produzca la inflamación alérgica en el pulmón (Robinson 2001).

Otro hallazgo único en el grupo de animales estudia-dos lo constituye un caballo que presentó en el LBA un 86% de células epiteliales (figura 1D) cuando en general éstas no deben sobrepasar el 5%, aumento que puede ser atribuido a causas iatrogénicas durante el lavado o a procesos infecciosos generalmente de carácter viral, siendo esto último la aparente causa de este hallazgo, ya que al examen endoscópico se pudo observar un gran daño de la vía aérea superior, con una exfoliación masiva del epitelio respiratorio. Además, una infección respira-toria viral previa de los equinos actuaría como un factor predisponente para desencadenar el cuadro de ORVA; lo más probable es que un animal afectado por un cuadro viral presente una respuesta mucho más severa a la inha-lación de esporas de hongo, debido principalmente a la grave alteración producida por los virus sobre el sistema mucociliar, facilitando de esta manera la penetración de las esporas en el sistema respiratorio (Morán y col 2006); sin embargo, en este caso el equino no hizo ORVA ya que al evaluar posteriormente los fluidos bronquiales volvió a la normalidad en sus valores.

Al examinar el forraje de la población animal en estudio pudo determinarse la presencia de esporas de Aspergillus fumigatus en gran cantidad, hecho que no debe llamar la atención ya que Araya y Zaror (1995) demostraron la presencia de este hongo en un 80% de muestras de forrajes en 17 criaderos de caballos chilenos de las provincias de Valdivia y Osorno. Establecida la presencia de este hongo en el ambiente se quiso determinar el nivel de anticuerpos específicos presentes en el suero de estos animales contra antígenos de Aspergillus fumigatus. Los resultados de-mostraron, como puede verse en la figura 2, que tanto los animales ORVA positivos como los animales sanos mostra-

ban niveles similares de inmunoglobulinas antiproteínas de Aspergillus fumigatus. Estos resultados concuerdan con lo descrito por Schmallenbach y col (1998) quienes sugieren que las proteínas de Aspergillus fumigatus son altamente inmunogénicas y además concuerdan con los reportes obtenidos por los mismos autores y Eder y col (2001), quienes encontraron que los niveles de IgG específica en el suero no tenían diferencia entre los caballos con ORVA y los individuos sanos. Sin embargo, estos mismos autores demostraron que los niveles de IgG e IgE específicas en el LBA eran significativamente más altos en individuos con ORVA que en caballos sanos. Estos resultados demuestran además la amplia distribución del antígeno, ya que todos los animales se encuentran inmunizados, dependiendo por tanto la presentación de la enfermedad a causas adicio-nales, probablemente localizadas en el árbol bronquial. Una de estas causas probables podría pertenecer al ámbito de la inmunidad innata, ya que está demostrado que los polisacáridos, glucanos, galactomananos y componentes proteicos de Aspergillus fumigatus en su primer encuentro con los fagocitos y el epitelio del árbol bronquial estimulan de inmediato a los TLR-2 y TLR-4, induciendo a estas células a producir citoquinas proinflamatorias IL-1 y TNF-alfa (Meier y col 2003), lo cual induciría la secreción de IL-6 e IL-8, para seguir con la producción de IL-17 por

Figura 1. Citología de lavado bronquioalveolar de caballo Chilote: (A) citología caballo sano; (B) cuyo conteo diferen-cial indicó 80% de polimorfonucleares neutrófilos; (C) conteo diferencial de polimorfonucleares eosinófilos indicó 57% y (D) conteo diferencial indicó un 86% de células epiteliales. Tinción May Grünwald-Giemsa. Smears of cells obtained from bronchioalveolar lavage cyto-logy of Chilote horse stained with May Grünwald-Giemsa. (A) Cytology obtained from a normal horse showing epithelial and mononuclear cells. (B) Aspect of a smear of an RAO positive horse showing great percentage of polimorphonuclear neutrophils. (C) Smear obtained in a special case were 57% of cells present in BALF were polimorphonuclear esosinophils and (D) a unique sample of BALF that shows 86% of cylindrical and ciliated epithelial cells.

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CABALLOS CHILOTE, ORVA, LBA, ALERGIA

parte de células NKT residentes. IL-8 e IL-17 podrían explicar por sí solas la presencia de los neutrófilos en el árbol bronquial de los caballos positivos a ORVA, tal como parece estar demostrado en ratones y en asma humana (Afzali y col 2007); adicionalmente, este efecto podría verse reforzado con la formación de complejos inmunes que tienden a prolongar la inflamación pulmonar y a per-petuar la infiltración neutrofílica mediante la generación de factores quimiotácticos derivados de la activación del complemento. Esta mirada renovada de la patogénesis del ORVA viene, en cierta forma, a complicar la visión anterior más simplista que proponía una explicación basada en la superposición de una hipersensibilidad tipo I, mediada por anticuerpos reargínicos, con una hipersensibilidad tipo III mediada por complejos antígeno-anticuerpo.

Se puede concluir que los caballos Chilote, al igual que las otras razas equinas, tienen la predisposición de presentar ORVA al estar sensibilizados con los alérgenos inductores de este cuadro pulmonar, sugiriendo que la presentación de este cuadro alérgico pulmonar en equinos se debe a la interacción de factores genéticos y ambientales, al igual que los cuadros alérgicos humanos; además, los antígenos de Aspergillus fumigatus tienen un rol importante en la inducción de ORVA en esta raza de caballos.

RESUMEN

El objetivo de este estudio fue analizar las características citológicas del lavado bronquealveolar (LBA) y la respuesta inmune humoral en caballos Chilote con obstrucción recurrente de las vías aéreas (ORVA) contra Aspergillus fumigatus y su rol en la inducción de este cuadro alérgico. Para esto, se utilizaron 22 caballos Chilote, de los cuales 13 presentaban ORVA y 9 estaban clínicamente sanos, los cuales fueron utilizados como controles. A todos los animales se les realizó un

examen físico, se les evaluó la citología pulmonar mediante un lavado bronqueoalveolar (LBA) y se les extrajo suero sanguíneo, con el propósito de determinar anticuerpos específicos contra Aspergillus fumigatus a través de un ELISA indirecto. Los resultados obtenidos de los extendidos celulares hechos a partir del LBA muestran que el porcentaje relativo de neutrófilos encontrados en los caballos con ORVA era concordante con los hallazgos obtenidos en el examen clínico. Con respecto a la prueba de ELISA se determinó que todos los animales, incluidos los controles, tenían niveles similares de anticuerpos específicos contra Aspergillus fumigatus no existiendo diferencias entre los individuos con ORVA y el grupo de animales sanos (P > 0,05). Se puede concluir que los caballos Chilote, al igual que las otras razas de caballo, tienen la predisposición de hacer ORVA al estar sensibilizados con los alérgenos inductores de este cuadro alérgico pulmonar y que existe concordancia entre el porcentaje de neutrófilos encontrados en el LBA y la gravedad de los síntomas clínicos de estos animales. Además, los antígenos de Aspergillus fumigatus tienen un rol importante en la inducción de ORVA en esta específica raza de caballo.

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ORVA

*

Control0,0

0,5

1,0

1,5

*O

Da

490

nm

Figura 2. Niveles de inmunoglobulinas específicas para Asper-gillus fumigatus en suero de caballos Chilote con ORVA y grupo control sano (*P > 0,05). Levels of specific antibodies against Aspergillus fumigatus in serum of RAO positive (ORVA) and control Chilote horses.

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G MORÁN Y COL

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Arch Med Vet 41, 89-95 (2009)

COMUNICACIÓN

Aceptado: 20.06.2008.

* Casilla 2 correo 15, Santiago, Chile; [email protected]

Caracterización demográfica de la población de perros de Viña del Mar, Chile

Demographic characterization of the dog population in Viña del Mar, Chile

MA Morales*, C Varas, L IbarraFacultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

SUMMARY

The high population of dogs living in the streets, specially in tourist destinations such as Viña del Mar represents a problem that requires to study some of the characteristics of this population, starting with the dogs that have an owner. A random survey sample of 861 households proportionally stratified according to the number of households in twelve locations of the city was carried out. The information was gathered by handing a questionnaire survey to house owners. Total population was estimated in 100,717 dogs with 95% confidence limits of 92,961 and 108,463; there was an average of 0.95 dogs per household, sex ratio was 1.6 males per 1 female, mean age was 4 years and 7 months, and human-dog ratio was 4.1 people per dog. The crude rate of fertility was 39.1%, and general fertility rate was 115.1%; the total fertility rate shows that every female rears 10 puppies during her reproductive life. The mortality rate was 23%. The growth rate was 8.2% and the turnover rate was 25%.

Palabras claves: demografía, perros, Chile.

Key words: demography, dogs, Chile.

INTRODUCCIÓN

El hombre ha permitido que el perro se reproduzca en forma desordenada, lo ha echado de la casa para que busque su alimento y lo ha abandonado una vez que se ha aburrido de él, propiciando que se convierta en un serio problema social en muchas ciudades y comunidades (Álvarez y Domínguez 2001). A través del tiempo, esta tenencia irresponsable ha creado problemas de exceso de animales, amenazas a la salud, contaminación, molestias, crueldad y abandono (Collins 1976). Se han publicado datos aislados sobre el tamaño de la población canina en algunas poblaciones o países, generalmente obtenidas de encuestas específicas realizadas en localidades que desean conocer la dinámica poblacional del perro con objeto de estar en mejores condiciones de implementar medidas de control (Álvarez y Domínguez 2001). En Chile existen estudios de demografía canina desde el año 1966 (Montes 1966), cambios que se han observado (Morales y col 1993), y otros estudios que a la fecha han abarcado ciudades del norte, centro y sur del país. No cabe duda que la presencia de perros en ciudades con atractivos turísticos, mercados, playas, sitios arqueológicos o cualquier otro lugar de inte-rés para visitantes nacionales y extranjeros constituye un aspecto negativo para la promoción de la llamada industria sin chimeneas y los ingresos por este concepto (Álvarez y Domínguez 2001).

En los últimos años, la sociedad de Viña del Mar ha experimentado diversos cambios con relación a la tenencia responsable de mascotas y control de la población canina a través de la aprobación de una ordenanza municipal en el año 2001, un programa de esterilización de hembras caninas, campañas de desparasitación, estudios de cap-tura y recaptura de perros callejeros en el centro de la ciudad y diversas campañas de educación por parte de la Sección de Medio Ambiente de la Ilustre Municipalidad de Viña del Mar.

Pero esta iniciativa no se ha visto sustentada en un conocimiento de la población existente que abarque todos los sectores de la ciudad, para un futuro programa global y sectorial de control de población canina. Por este motivo se realizó un estudio de características demográficas de la población canina con dueño de la ciudad de Viña del Mar.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se estudió la población canina con dueño existente en la ciudad de Viña del Mar. Se utilizaron los planos de los sectores y unidades vecinales de dicha ciudad (Servicio Comunal de Planificación de la Ilustre Municipalidad de Viña del Mar), los planos zonales censales de la misma y el Censo de Población 2002 (Instituto Nacional de Estadísticas V Región y Oficina Censal Comunal del Servicio Comunal de Planificación de la Ilustre Municipalidad de Viña del Mar). Se confeccionaron un formulario de encuesta, un manual de instrucciones para los encuestadores, cartas de presentación y credenciales de identificación y planos de recorrido. Se trabajó con personal y vehículos de la

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MA MORALES Y COL

I. Municipalidad de Viña del Mar y encuestadores capa-citados previamente.

La unidad de muestreo fue la vivienda. El tamaño de la muestra se determinó bajo el supuesto de un promedio de 0,733 perros por vivienda y una desviación estándar de 0,977 (Acuña 1998). Para estimar la población con un error de ± 0,09 y un 99% de confianza, se obtuvo un tamaño de muestra de 784 viviendas, usando la fórmula para tamaño de muestra de Cochran (1963). Teniendo en cuenta una probabilidad de no respuesta del 20%, el total de viviendas encuestadas sería de 940, distribuidas proporcionalmente según número de viviendas por sector de la ciudad de Viña del Mar. Se logró encuestar un total de 861 viviendas seleccionadas al azar, que respondieron satisfactoriamente (8,4% de no respuesta).

El marco fue constituido por los planos que muestran los doce sectores de la ciudad de Viña del Mar con sus respectivas Unidades Vecinales y los Planos Zonales Censales correspondientes al Precenso de Vivienda 2001, que posteriormente se utilizó para el Censo de Población 2002. Los planos están identificados según el Distrito, Zona Censal y Unidad Vecinal que correspondan.

Se hizo un listado de los doce sectores y sus unidades vecinales correspondientes y se obtuvo el número de man-zanas de cada unidad vecinal y por ende de cada sector. Se enumeró en forma ascendente cada manzana hasta llegar a completar el total de manzanas por sector. La forma de identificación de las viviendas seleccionadas dentro de la manzana tuvo un orden, empezando a contar las viviendas a partir de la esquina noroeste, caminando alrededor de la manzana en el sentido contrario a las manecillas del reloj, y a medida que se avanzaba alrededor de la misma, se contaron solamente las unidades de vivienda que que-

daban a la izquierda hasta completar el total de viviendas por manzana (Kish 1972). Se visitó previamente las áreas seleccionadas, con el objeto de sensibilizar a los habitantes sobre el motivo de la encuesta y se realizó una encuesta piloto en una vivienda por sector.

La encuesta se llevó a cabo en noviembre de 2002, durante dos semanas, en un horario de 9:00 a 18:30 horas y de 19:00 a 22:00 horas. Las dos semanas siguientes se utilizaron para validar las respuestas de la encuesta e insistir con las viviendas que no habían contestado previamente.

Los datos fueron procesados utilizando el programa Epi Info 2002 (Dean y col 2002).

Para el análisis se construyeron distribuciones de frecuencias con las variables, se calcularon tasas de fe-cundidad, mortalidad y migración utilizando las fórmulas de Haupt y Kane (1991).


La población canina de la ciudad de Viña del Mar fue estimada en 100.717 individuos, con límites de confianza (95%) de 92.961 y 108.463 perros, Chorrillos es el sector con menor población canina con un número estimado de 3.264 perros y Achupallas el sector con mayor población con 12.879 (cuadro 1).

La estructura de la población canina por sexo para la ciudad de Viña del Mar es 62% para los machos y 38% para las hembras, lo que determina una razón de masculinidad de 1,63:1, semejante a muchas ciudades de Chile y de los países en vías de desarrollo, en que se observa una mayor existencia de machos respecto de hembras (Margawani y Robertson 1995, Nunes y col 1997, Güttler 2005). En comparación con otras ciudades del país esta razón es

Cuadro 1. Población estimada de perros, límites de confianza, razón de masculinidad, edad media y porcentaje de mestizos, Viña del Mar, Chile. Estimated dog population, confidence limits, sex ratio, mean age and percentage of crossed breed per area, Viña del Mar, Chile.

Sector Poblaciónestimada

Límites de confianza

Razón demasculinidad Edad media % mestizos

Nueva Aurora 7.121 5.006 – 9.236 2,73:1 4 años 3 meses 82,1

Recreo 10.424 8.430 – 12.418 1,18:1 4 años 9 meses 42,4

Forestal 12.215 9.411 – 15.019 2,50:1 4 años 9 meses 76,9

Chorrillos 3.264 2.381 – 4.147 3,14:1 4 años 2 meses 72,4

Oriente 10.777 8.673 – 12.881 1,10:1 5 años 7 meses 70,5

Miraflores 10.040 7.157 – 12.923 1,55:1 4 años 2 meses 79,8

Santa Inés 3.950 2.226 – 5.674 1,50:1 5 años 5 meses 84,0

Plan 8.712 6.517 – 10.907 1,17:1 5 años 8 meses 31,6

Achupallas 12.879 2.917 – 11.907 1,37:1 3 años 0 meses 75,5

Gómez Carreño 5.483 2.917 – 8.049 1,59:1 6 años 2 meses 50,0

Reñaca Alto 9.951 7.995 – 11.907 3,04:1 3 años 9 meses 80,6

Reñaca Bajo 5.901 5.054 – 7.748 1,19:1 4 años 8 meses 19,6

Total Viña del Mar 100.717 92.961 – 108.463 1,63:1 4 años 7 meses 64,7

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DEMOGRAFÍA, PERROS, CHILE

más estrecha, lo que indica una menor discriminación hacia las hembras como se observa en la mayoría de las ciudades de Chile, a excepción de Iquique, con un índice de masculinidad de 1,6:1 (Luza 1996). El resto de las ciudades muestran a Chillán con un índice de masculini-dad de 2,1:1 (Véliz 1993), Santiago 1,9:1 (Acuña 1998), Osorno 1,9:1 (Ruiz 1999) y Valdivia 2,4:1 (Güttler 2005). Si se compara con ciudades de Sudamérica, el índice de masculinidad es mayor en Viña del Mar, es así como en Araçatuba, São Paulo (Nunes y col 1997), y en Bogotá el valor es de 1,3:1 (Urrego y Lanzziano 1999). En Bali, el índice de masculinidad es más alto ya que el valor se eleva a 5,7:1 (Margawani y Robertson 1995). En algunas comunas de Zimbabwe también el valor es 1,3:1 (Butler y Bingham 2000). En Estados Unidos y Reino Unido los valores de índice de masculinidad son menores que en Viña del Mar, acercándose al valor de 1:1, lo que representa una menor discriminación hacia la tenencia de hembras. En St Joseph, Indiana, es 0,9:1 (Patronek y col 1997). En el Reino Unido, el índice de masculinidad es 1:1 (Thrusfield 1989, Michel 1999).

La edad promedio de la población canina de Viña del Mar fue estimada en 4,58 años (4 años 7 meses), con una desviación estándar de 3,9 años (cuadro 1). El promedio es mayor que en otras ciudades y localidades de Chile, pero semejante a los promedios de ciudades de países desarro-llados. En Chillán, 4,2 años (Véliz 1993), en Valdivia es de 3,5 años (García 1995) al igual que en Iquique (Luza 1996), en Santiago, 3,8 años (Acuña 1998), en Osorno, 4,1 años (Ruiz 1999). En comparación con Bogotá, el promedio de edad en esta ciudad es más bajo que en Viña del Mar con un valor de 3,5 años (Urrego y Lanzziano 1999). En algunas comunas de Zimbabwe, la población es más joven, con un promedio de edad de 2 años (Butler y Bingham 2000). En cambio, en Estados Unidos y el Reino Unido los promedios se asemejan a Viña del Mar. Patronek y col (1997) en St Joseph, Indiana, encontraron una mediana de 5 años. En el Reino Unido el promedio de edad de la población canina es de 4,8 años (Thrusfield 1989). En Bahamas el promedio de edad alcanzó los 3 años (Fielding y Mather 2001).

Con respecto a la pirámide poblacional canina de Viña del Mar, figura 1, su forma muestra una población donde abundan los perros menores de un año, especialmente los machos. Se observa el control ejercido sobre el tamaño de la población de este grupo de edad, probablemente por efecto de sacrificio, lo que afecta al grupo de 1 año. Por otra parte, la menor amplitud de las barras a los 4 y 9 años de edad refleja el hábito de las personas a redondear o recordar edades en cifras terminadas en 5 o 10. Observando otras pirámides poblacionales, su forma difiere de la pirámide poblacional de Reino Unido de 1986 (Thrusfield 1989), especialmente por la proporción de perros menores de 1 año de edad.

La existencia estimada de perros mestizos en la ciudad de Viña del Mar se eleva a un 64,7%, semejante al de Santiago, con un 67,1% (Acuña 1998), pero menor al resto de las ciudades del país, lo que indica una mayor tenencia de perros de raza en ambas ciudades. En Iquique los perros mestizos representan el 75% de la población canina (Luza 1996) y en Osorno el 74,4% (Ruiz 1999). Si se compara con St Joseph, Indiana, Estados Unidos (Patronek y col 1997), el porcentaje de perros mestizos en Viña del Mar es mayor. Con respecto a los perros no mestizos, se estima que la raza más frecuente en Viña del Mar es Cocker Spaniel con un 6,6% de la población canina total. Esto difiere de la mayoría de las ciudades de Chile donde el Ovejero Alemán ocupa el primer lugar; es el caso de Chillán (Véliz 1993), Valdivia (García 1995); la excepción es Iquique, donde la raza Pekinés fue proporcionalmente mayor (Luza 1996). Con relación a trabajos de países desarrollados, en Suecia, Sallander y col (2001) observaron que la raza más frecuente era la Dachshund y en el Reino Unido, el Labrador Retriever (Thrusfield 1989).

En el cuadro 2 se presentan resultados que relacionan la población de perros con la vivienda y con sus habitantes. El Plan es el sector con menor número de perros por vivienda y Forestal el sector con el promedio más alto de perros por vivienda. En la ciudad de Viña del Mar se obtuvo un prome-dio de 0,95 perros por vivienda, es decir, casi un perro por vivienda, lo que es bastante alto comparado con estudios en otras ciudades de Chile como, por ejemplo, Chillán, con un promedio de 0,77 perros por vivienda (Véliz 1993), Valdivia, 0,54 (García 1995), Iquique, con un promedio de 0,45 perros por vivienda (Luza 1996), Santiago 0,76 (Acuña 1998), Osorno 0,63 (Ruiz 1999). En Zimbabwe, el promedio de perros por vivienda es aún más alto, llegando a 1,5 en algunas de sus comunas (Butler y Bingham 2000). En cambio, en países desarrollados, este promedio es más bajo; 0,48 en St Joseph, Indiana (Patronek y col 1997), y 0,32 en el Reino Unido (Thrusfield 1989).

Eda

d (a

ños)

20 15 10 5 0 5 10 15 20

< 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

% Machos % Hembras

Figura 1. Pirámide poblacional de perros, Viña del Mar, Chile. Dog population pyramid, Viña del Mar, Chile.

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MA MORALES Y COL

En Viña del Mar, el 57% de las viviendas posee al menos un perro, valor superior al de otras ciudades como Iquique donde el 35,5% de las viviendas posee al menos un perro (Luza 1996), Osorno, el 47% (Ruiz 1999), Valdivia con un 44,9% (Güttler 2005). Chillán (Véliz 1993) y Santiago (Acuña 1998) son las ciudades que más se asemejan a los valores de Viña del Mar con 52,8% y 51,7% respectivamente. Comparado con otros países del mundo, el resultado de porcentaje de viviendas con perro es más alto en Viña del Mar, con excepción de algunas comunas de Zimbabwe donde alcanza a 62% (Butler y Bingham 2000). En St Joseph, Indiana (Patronek y col 1997), se encontró un 21,7%. En otras ciudades como Bali, Indonesia, es de 39% (Margawani y Robertson 1995) y en Araçatuba, São Paulo, Brasil, es de 50,4% (Nunes y col 1997).

La relación persona: perro (cuadro 2) en Viña del Mar arrojó un valor de 4,1:1, razón que se encuentra dentro de los valores de distintas ciudades. En Santiago y Bogotá, esta razón es más amplia con valores de 6,4:1 (Acuña 1998) y 10,86:1 (Urrego y Lanzziano 1999) respectivamente. El valor observado en Viña se asemeja a los mostrados en Araçatuba, São Paulo con una razón de 4,2:1 (Nunes y col 1997) y en algunas comunas de Zimbabwe, con una razón de 4,7:1 (Butler y Bingham 2000).

La razón de tenencia estimada para la población canina en la ciudad de Viña del Mar se resume en un 42,4% por razón afectiva, 13,3% por razón de guardián, 41,4% por ambas razones y el 3,2% por otras razones. Comparando con Santiago, las razones de afectividad en Viña del Mar son mayores, ya que el problema de seguridad es menos relevante que en la capital de Chile, y es así que en Santiago

la opción afectiva es de 22,4% y la de guardián el 41,4% (Acuña 1998). En el resto de las ciudades de Chile las opciones afectiva y guardián son mayoritarias, pero en todas las ciudades la opción afectiva prevalece al igual que Viña del Mar, mostrando un 62,8% en Chillán (Véliz 1993), un 73,17% en Valdivia (García 1995), un 81,5% en Iquique (Luza 1996), un 64,5% en Osorno (Ruiz 1999). En algunas comunas de Zimbabwe, las razones de tenencia afectivas en este país no superan el 1,2%, mientras que la opción de guardián alcanza a 60% (Butler y Bingham 2000); en Suecia (Sallander y col 2001) un 64 % se usa como animal de cría y 16% para caza. De los 12 sectores de la ciudad de Viña del Mar en 10 de ellos predomina la razón afectiva-guardián (cuadro 2).

En cuanto al confinamiento (cuadro 2) se estima que en la población canina de la ciudad de Viña del Mar el 77,5% es permanente, el 10,5% temporal y el 12% sin confinamiento. El sector donde se manifiesta principal-mente el confinamiento permanente es Reñaca Bajo. En comparación con otras ciudades de Chile, la población canina de Viña del Mar, en el grado de confinamiento permanente, sólo es superada por Santiago con un 85,4% (Acuña 1998); en el resto de las ciudades el porcentaje es menor, lo que indica un menor control y mayor tenencia irresponsable de mascotas: Chillán con un 63,6% (Véliz 1993), Valdivia con un 61,93% (García 1995), Iquique con un 59,6% (Luza 1996), Osorno, con un 61% (Ruiz 1999). En St Joseph, Indiana, Estados Unidos, el grado de confinamiento permanente alcanza al 89,5% (Patronek y col 1997), lo que indica mayor control por parte de la población y mayor conciencia de tenencia responsable de mascotas.

Cuadro 2. Número promedio de perros por vivienda, razón persona: perro, principal razón de la tenencia y porcentaje de confinamiento permanente en la vivienda según sector, Viña del Mar, Chile. Mean number of dogs per household, human: dog ratio, main reasons for keeping dogs and percentage of permanent confinement per area, Viña del Mar, Chile.

Sector Promedio perrospor vivienda

RazónPersona: perro

Principal razónde la tenencia

Porcentaje deconfinamiento permanente

Nueva Aurora 1,27 3,4:1 Afectivo-guardián 67,9

Recreo 1,05 3,8:1 Afectivo-guardián 84,7

Forestal 1,28 3,2:1 Afectivo-guardián 65,9

Chorrillos 1,21 3,2:1 Afectivo-guardián 79,3

Oriente 1,14 3,4:1 Afectivo-guardián 76,1

Miraflores 1,04 3,2:1 Afectivo 60,7

Santa Inés 1,04 4,4:1 Afectivo-guardián 96,0

Plan 0,43 8,0:1 Afectivo 79,4

Achupallas 1,17 3,6:1 Afectivo 79,4

Gómez Carreño 0,85 4,7:1 Afectivo-guardián 81,8

Reñaca Alto 1,22 3,6:1 Afectivo-guardián 76,3

Reñaca Bajo 0,71 5,6:1 Afectivo-guardián 95,7

Viña del Mar 0,95 4,1:1 77,5

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Según cómo la población canina sale a la calle, el 42% (37% para los machos y 49,8% para las hembras) lo hace acompañada con sus dueños y con correa, lo que obedece a la ordenanza municipal vigente. El 22% (23% para los machos y 19,6% para las hembras), aunque salen acompañados de sus dueños, no salen con correa a la calle. El 36% (40% para los machos y 30,6% para las hembras) de la población canina sale a la calle sin ningún control. Esto señala que los dueños mantienen un mayor control sobre las hembras que sobre los machos, ya que se observa una mayor proporción de machos que permanece libre en la calle.

La tasa general de natalidad (TGN) estimada para la población canina de la ciudad de Viña del Mar es de un 39,1%, de modo que de 100 individuos de la población 39 nacen durante el año; esto es levemente mayor que la TGN registrada para la ciudad de Santiago, con un 36,2% (Betzhold 1998) y mayor que la registrada en Bogotá que fue de un 21,1% (Urrego y Lanzziano 1999), lo que indica que en Viña del Mar nacen más crías vivas por año con relación a la población de perros que en las ciudades mencionadas.

La tasa de fecundidad general (TFG) es de 115,1%, resultado mayor que el registrado para la ciudad de Santiago con un 103% (Betzhold 1998), lo que significa que nacen más crías vivas por año por cada 100 hembras caninas en edad fértil en la ciudad de Viña del Mar con respecto a Santiago.

La tasa de fecundidad específica por edad estimada muestra que la edad más fértil de las hembras caninas de Viña del Mar es la de 1 año de edad, con un valor de 166,7%; a continuación las hembras de 2 a 4 años y también las de 6 y 7 años. De los 11 años en adelante la fecundidad es cero, aunque excepcionalmente hubo hembras que parieron después de esa edad (cuadro 3). En Santiago, la mayor fecundidad se obtuvo en hem-bras entre 6 y 10 años de edad, con un valor de 136,1% (Betzhold 1998). La Tasa Global de Fecundidad (TGF) es de 10 crías, resultado menor que el registrado para la ciudad de Santiago con un valor de 16,1 (Betzhold 1998), lo que implica que en Viña del Mar una hembra tiene menos descendencia en toda su vida reproductiva que en la ciudad de Santiago.

El tamaño de camada promedio al nacimiento es de 4,95 crías; las hembras jóvenes tienen un promedio de 6 crías, de las cuales todas nacieron vivas, en cambio, en las hembras mayores de 10 años de 4 crías totales 3,5 nacen muertas (cuadro 4). La cifra de 4,95 crías promedio de Viña es similar a la de Iquique con 5,2 crías (Luza 1996), a la de Santiago con 4,58 crías (Betzhold 1998), a la de Osorno con 4,6 crías (Ruiz 1999) y sólo es mayor en la ciudad de Valdivia con 7,3 crías (García 1995). En algunas comunas de Zimbabwe el valor es de 4,6 crías (Butler y Bingham 2000).

La tasa general de mortalidad, que es de un 23%, indica que de 100 individuos totales de la población 23 mueren durante el año, y es mayor en hembras (25,1%) que en machos (21,7%). El promedio es más alto que en Santiago con un 10,3% (Brizuela 1998) y Bogotá con un 8,14% (Urrego y Lanzziano 1999). Esta tasa de 23% se explica por la alta mortalidad de la población menor de un año de

Cuadro 3. Tasas de fecundidad específica por edad en hembras caninas, Viña del Mar, Chile. Specific fertility rates of bitches per age, Viña del Mar, Chile.

Edad (años) Tasa de fecundidad específica (por 100)

Menor de 1 11,8

1 166,7

2 143,8

3 132,4

4 132,0

5 71,4

6 126,3

7 104,5

8 33,3

9 0,0

10 60,0

11 0,0

12 0,0

13 0,0

14 0,0

Mayor o igual a 15 20,0

Cuadro 4. Razones de reproducción en hembras caninas según edad de la madre, Viña del Mar, Chile. Reproduction rates of female dogs according to the mother’s age, Viña del Mar, Chile.

Edad de la madre (años)

Razón Menor de 1 1 a 1,9 2 a 4,9 5 a 10 Mayor de 10 Total

Tamaño camada al nacimiento 6,00 5,71 4,83 4,67 4,00 4,95

Promedio de crías nacidas vivas 6,00 5,36 4,20 4,33 0,50 4,38

Promedio de crías nacidas muertas 0,00 0,36 0,13 0,33 3,50 0,56

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MA MORALES Y COL

RESUMEN

El número excesivo de perros callejeros, especialmente en una ciudad con las características turísticas de Viña del Mar, representa un problema que hace necesario conocer algunas de las características de esta población, en primer lugar de aquellos perros con dueños. Se obtuvo una muestra al azar de 861 viviendas que fueron proporcionalmente distribuidas según el número de viviendas de los 12 sectores de la ciudad. La información fue recolectada mediante un cuestionario que se aplicó a los dueños de la vivienda. Se estimó una población total de 100.717 perros con límites de confianza al 95% de 92.961 y 108.463; había un promedio de 0,95 perros por vivienda, la razón de masculinidad fue de 1,6:1, la edad media de los perros fue de 4 años y 7 meses, la razón número de personas por perro fue de 4,1. La tasa general de natalidad fue de 39,1%, la tasa de fecundidad general fue de 115,1% y la tasa de fecundidad total señala que cada hembra durante su vida reproductiva tiene 10 crías nacidas vivas. La tasa de mortalidad fue de 23%, la tasa de crecimiento alcanzó la cifra de 8,2% y la tasa de renovación de la población fue de 25%.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a la Ilustre Municipalidad de Viña del Mar por el apoyo prestado a la realización de este trabajo.

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edad que constituye la población con mayor número de perros de la ciudad de Viña del Mar, mortalidad que se ve reflejada claramente en su efecto sobre el tamaño del grupo de 1 año en la pirámide poblacional. En Ontario, Canadá, se observó una mortalidad mucho menor (260 muertes en 10.000 perros asegurados) (Bonnett y col 1997). La tasa de mortalidad específica por edad, tal como se acaba de señalar, muestra un valor alto en los perros menores a 1 año de edad y también en los perros sobre 15 años, semejándose a la observada en Santiago (Brizuela 1998), pero con valores bastante superiores.

La causa más frecuente de mortalidad fue el aplas-tamiento de perros por la madre, con un 4,6%, lo que explica la alta mortalidad en perros menores de 1 año de edad. También se declararon como causas importantes las intoxicaciones y los atropellos; en cambio, en Santiago la causa más frecuente fueron las enfermedades con un 2,9% (Brizuela 1998).

El otro factor que influye en el tamaño de la población son los movimientos migratorios.

La tasa de inmigración estimada para la población canina de la ciudad de Viña del Mar fue de un 21,5%, valor similar al de la ciudad de Santiago con un 22,34% (Gigoux 2002). El valor para los machos fue de 22,8%, parecido al de Santiago, con 21,89%, y en las hembras, el valor fue de 19,3%, valor menor al observado en Santiago, con 23,22% (Gigoux 2002).

La tasa de emigración estimada fue de un 29,4%, valor notoriamente mayor al registrado para la ciudad de Santiago que fue de un 5,25% (Gigoux 2002). El valor para los machos fue de 25,6%, cifra mayor a la observada en Santiago, con 5,09%, y el de las hembras fue de 35,7%, cifra igualmente mayor a la observada en Santiago, con 5,58% (Gigoux 2002).

Como consecuencia de las dos tasas anteriores, la tasa neta de migración estimada alcanzó un valor negativo, –7,94%, lo que indica que hay más población que emigra que la que inmigra. Por otra parte, en Santiago el valor es positivo, con un 17,09% (Gigoux 2002).

Si se consideran en conjunto las tasas de fecundidad general, de mortalidad general y neta de migración la tasa de crecimiento anual estimada para la población canina de la ciudad de Viña del Mar es de un 8,2%, valor menor que el registrado para la ciudad de Bogotá con un 13,12% (Urrego y Lanzziano 1999) pero mayor a los registrados en California, con un 1,4% (Kass y Hansen 2000) y algunas comunas de Zimbabwe, con un 6,52% (Butler y Bingham 2000); esto significa que en un período cercano a los 12 años la población canina de Viña del Mar podría crecer al doble si no se realiza un efectivo control.

La tasa de renovación anual estimada para la pobla-ción canina de la ciudad de Viña del Mar es de un 25%, mayor a la registrada en St Joseph, Indiana, con un 14,1% (Patronek y col 1997), y Bogotá, con un 16,3% (Urrego y Lanzziano 1999).

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Presentación general: la revista publica artículos en español o inglés.

Los artículos deberán ser escritos con letras Times New Roman 12, por un solo lado de las hojas, a interlineado y medio, en tamaño carta (21,5 x 27,9 cm), dejando un margen de 2 cm en los cuatro bordes.

Todas las páginas deben ser numeradas de manera conse-cutiva en el ángulo superior derecho, y las líneas deberán ser numeradas en cada página, iniciándose con el número 1, junto al margen izquierdo, en todo el trabajo.

Los títulos de capítulos deben ser escritos en mayúscula, justificados al lado izquierdo, en líneas separadas y sin punto final. Ejemplo: MATERIAL Y MÉTODOS. En los subtítulos sólo la primera letra es mayúscula. (Ejemplo: Diseño experi-mental) y deberá ser justificado al lado izquierdo. Subtítulo secundario debe ser justificado al lado izquierdo y en letra cursiva. No deberán usarse subrayado ni numeración de sub-títulos o lista de ítems.

Las cifras deben ser escritas en números. Cuando están al inicio de una frase, o cuando la claridad del texto lo requiera, deben ser expresadas en palabras. Un decimal deberá ser pre-cedido de un numeral usando punto cuando el artículo es en inglés o coma cuando el artículo es en español (Ejemplo: 0,5 no ,5). Múltiplos de mil deben escribirse separados por punto (Ejemplo: 1.000). Las medidas de cantidad deberán ajustarse al Sistema Internacional de Unidades, a menos que la práctica en una disciplina use derivados de ellos (Ejemplo: la unidad internacional de Curie). Las fechas deben ser expresadas como “07 de septiembre de 1954” en el texto, pero pueden presentarse abreviadas en los cuadros y figuras. El tiempo diario se debe expresar según las 24 horas cronológicas (Ejemplo: 13:00 h).

Para la nomenclatura química se deben utilizar las normas de la Sociedad de Bioquímica (Biochem J 209, 1-27, 1983), los fármacos o drogas deben ser mencionados por sus nombres genéricos (en minúsculas), si es necesario colocar marcas y sus fuentes deberán ir a pie de página. Las enzimas deben ser identi-ficadas, cuando se mencionan por primera vez, según la Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry.

Los términos en latín y sus abreviaciones que son de uso común en la literatura científica, tales como: in vitro, in vivo, ad libitum deberán ir en cursiva. Los valores de probabilidad deben ser dados en la forma de P < 0,05 o P < 0,01. Des-viación estándar, error estándar de la media e intervalos de confianza, se abreviarán en la forma siguiente: DE, EE y IC, respectivamente.

Título

El título del trabajo debe ser conciso, específico e informa-tivo. Sólo la primera letra será mayúscula, en negritas, centrado, iniciándose en la línea 10, sin usar marcas comerciales o abre-viaciones. Se deberá señalar, con superíndice (#) la fuente de financiamiento, si lo hubiese, que se detallará a pie de página. Separado por el espacio de una línea se deberá escribir el título en inglés.

Autores y direcciones

Los nombres de los autores se escribirán bajo el título separados por un espacio. Use iniciales (sin puntos) y apellido separando por comas entre los autores, ajustándose al siguiente ejemplo: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Al término de cada nombre de autor debe identificarse con una letra en superíndice, el nombre de la sección, departamento, servicio o institución a la que pertenece o perteneció dicho autor, durante la ejecución del trabajo. La letra con un asterisco indica el autor responsable de la correspondencia, debiéndose señalar a pie de página el número de fax, correo electrónico y casilla de correo.

Pie de página

Serán usados para elaborar abreviaciones citadas en el título de cuadros, marcas comerciales, nombre y dirección de empresas. Deben ser indicados con números.

Summary

La segunda página debe contener un summary, de no más de 250 palabras y que describa los propósitos del estudio o investigación, el material y métodos empleados, los resultados principales y las conclusiones más importantes. No se deben emplear abreviaturas no estandarizadas. En línea aparte, separado por un espacio y justificadas a la izquierda se deben incluir key words (palabras clave) en minúsculas, las que no deben ser más de 4.

Introducción

En la tercera página en la línea 1 se escribirá el título del capítulo. En la línea siguiente, con sangría, predeterminada de un tabulador en 5 espacios, se plantearán los antecedentes que sustentan el propósito del artículo, sin un despliegue extensivo del tema y utilizando sólo las referencias más pertinentes. Se deben indicar, cuando corresponda, la hipótesis que se postula y los objetivos de la investigación.

Entre párrafos debe conservar el interlineado y medio.

Material y Métodos

Separado por un espacio de la sección anterior, se deberá describir el capítulo con suficientes detalles para permitir a otros repetir el estudio. Después de la primera referencia en el texto a drogas o reactivos, se deben señalar el nombre genérico, dosis y vía de administración. Para el caso de equipo especializado se indicarán la marca, el modelo y el nombre del fabricante.

Los métodos estadísticos utilizados deben ser señalados como subtítulos: “Análisis estadístico” y deben incluir un adecuado detalle, que permita a los lectores establecer con precisión cómo han sido analizados y presentados los datos y las unidades de medidas en que están expresadas (medias aritméticas, desvia-ciones estándares, errores estándares de la media, medianas, rangos o límites de confianza, etc.). Si las pruebas usadas fueron paramétricas (Chi cuadrado, prueba “t“ de Student, Anova, etc.) o no paramétricas (Wilcoxon, Kruskal-Wallis, etc.). Se deberán identificar el nombre, la versión y el proveedor del programa computacional utilizado, ejemplo: SPSS versión 9.0 para Win-dows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).

Resultados

Separado por el espacio de una línea de la sección anterior, se deberá describir el capítulo de resultados, presentado en forma concisa y lógica, sin discusión o referencia a otro trabajo. Los cuadros y figuras deben ser los mínimos necesarios y los datos no deben ser repetidos en el texto y tampoco deberán ser mostrados simultáneamente o reiterados.

Discusión

Esta sección, separada por una línea de la anterior, debe evaluar e interpretar los resultados, relacionándolos a los de otros estudios relevantes. No debe repetir resultados o presentar nuevos. Debe ser diligentemente tratada en su desarrollo, haciéndola de manera lógica y concisa, estableciendo conclusiones, relevancias y proyecciones del trabajo. Debe evitarse formular conclusiones

que no estén respaldadas con sus hallazgos ni sustentadas en trabajos aún no publicados.

Resumen

El resumen en español deberá ser escrito en hoja aparte, y deberá ajustarse a las mismas normas señaladas para el summary. Separadas por el espacio de una línea se deberán escribir las palabras clave en letras minúsculas, no debiendo ser más de cuatro y justificadas en el lado izquierdo.

Agradecimientos

Deben ser breves y sólo incluir personas o instituciones que han hecho una contribución directa, han provisto material necesario o dado las facilidades para la realización del estudio.

Referencias

La precisión con la que son señaladas las referencias es de responsabilidad de los autores y deben corresponder al artículo original; asegúrese que todos los artículos citados en el texto estén incluidos en el listado de referencias y viceversa. En el texto, las citas se deben indicar entre paréntesis y en orden cronológico, citando el apellido del autor y la expresión “y col” después del apellido del primer autor, cuando son más de dos, Ej.: (Pérez 1994, Castro y Martínez 1996, Cifuentes y col 2002).

El listado de referencias debe ir en orden alfabético de acuerdo al apellido del primer autor y debe incluir el apellido e iniciales de todos los autores. Cuando no se dispone del nombre del autor, use el término anónimo entre comillas, tanto en el texto como en el listado de referencias. Las referencias, cuando son del mismo autor, solo o con más autores, deben ser escritas en orden cronoló gico. Las letras a, b, c, etc., deberían ser agregadas como superíndice cuando un autor escribe más de un trabajo en el mismo año. Los nombres de los autores deben escribirse en minúsculas, sin punto entre las iniciales. Los nombres de las revistas y de los libros deben ser en letra cursiva, usando la abreviatura estandarizada. Use los siguientes ejemplos como guía.

Para artículos en revista: Matamoros R, C Gómez, M Andaur. 2002. Hormonas de utili-

dad diagnóstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34, 167-182.

Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373.

Para capítulos en libros o publicaciones ocasionales:Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total

nitrogen in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington DC, USA, Pp 75-83.

Flórez J. 1992. Fármacos analgésicos opiáceos. En: Flórez J (ed). Farmacología Humana. 2ª ed. Masson-Salvat, Barcelona, España, Pp 25-28.

WHO, World Health Organization. 1972. International Drug Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser WHO Nº 48.

SAG, Servicio Agrícola y Ganadero, Chile. 1996. Resolución Exenta Nº 3599 del 29 de noviembre de 2006.

Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of inva-ding microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA (eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472.

Para artículos y resúmenes publicados en series regulares:Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Böhmwald. 1998.

Valores sanguíneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) en vacas lecheras del sur de Chile. Resúmenes del X Con-greso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136.

Para memoria de título:Matthei SM. 2002. Determinación de la presencia del receptor del

factor activante plaquetario en membranas de neutrófilos de bovino. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Chile.

Para tesis:Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor

GM-CSF en espermatozoides bovinos y su relación con la motilidad espermática. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Chile.Minimice el uso de resúmenes como referencias. Evite usar

“datos no publicados” o “comunicación personal” al menos que de ello exista una forma escrita. Si esto ocurriera, debe hacerse referencia en el texto, pero no debe aparecer en el listado de referencias. Las referencias a trabajos que han sido aceptados para publicación deben ser citados como “en prensa”; sin em-bargo, trabajos que han sido sometidos a publicación, pero no han sido aceptados todavía, deben ser referidos como “datos no publicados”.

Direcciones de páginas Web no deben ser incluidas en las referencias; si su uso es imprescindible, la dirección debe ser señalada en el texto como pie de página, incluyendo fecha de consulta.

INSTRUCCIONES COMPLEMENTARIAS

Cuadros

Las leyendas de los cuadros y figuras deben presentarse en español e inglés.

Los cuadros deben ser el menor número posible, presentados en hoja aparte, con sus respectivos títulos en español e inglés en la parte superior. La información de los cuadros no debe repetir lo del texto. Los cuadros deben ser numerados consecutivamente con números arábigos, en el orden en que aparecen en el texto, asignándoseles un título breve y autoexplicativo que indique su contenido. Sobre cada columna del cuadro debe colocarse un encabezamiento corto o abreviado. Sólo los encabezamientos de las columnas y los títulos generales se separan con líneas hori-zontales. Las columnas de datos deben separarse por espacios y no por líneas verticales. Cuando se requieran notas aclaratorias, deben agregarse al pie del cuadro. Las notas aclaratorias para todas las abreviaturas no estándar y las unidades de medidas deben ser agregadas entre paréntesis. Si se usan superíndices para señalar diferencias entre valores use a, b, c, minimice el número

DIRECCIÓNComité Editor Archivos de Medicina Veterinaria

Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chilee-mail: [email protected] - Fono-Fax: (56-63) 221459

www.medicinaveterinaria.clwww.scielo.cl

Casilla 567, Valdivia, CHILE

Representante Legal:Víctor Cubillos Godoy

Rector de la Universidad Austral de Chile

de dígitos en cada columna. Informe el valor de cero como 0. El ancho máximo de los cuadros no debe exceder los 80 mm para una columna, o los 170 mm para dos columnas.

Figuras

Las figuras deben ser presentadas en hojas separadas con sus respectivos títulos en español e inglés en la parte inferior y numeradas consecutivamente usando números arábigos, según el orden en que aparecen en el texto. Ej.: Figura 1, no Fig. 1. Denomine figura a cualquier ilustración que no sea cuadro, Ej.: gráficos, radiografías, ecografías, electrocardiogramas, fotografías, etc. Las figuras deben ser orientadas verticalmente y acompañadas de una corta descripción que contenga la expli-cación de todos los marcadores, líneas y símbolos usados. Si la figura tiene secciones, éstas deben ser identificadas como a, b, c, etc., en la esquina superior derecha y deberán ser descritas en la leyenda.

Para el caso de fotografías, en el reverso y con lápiz a carbón, deben señalarse con flecha la orientación espacial, el número de la figura y el nombre del autor principal. Los símbolos, flechas o letras, empleados en las fotografías, deben tener un tamaño y contraste suficientes para distinguirlos de su entorno. Envíe las

figuras protegidas en un sobre grueso y de tamaño apropiado. Las figuras pueden diseñarse a una o dos columnas de ancho (80 y 170 mm, respectivamente). Las reproducciones en colores de las figuras deben ser financiadas por los autores.

Cuando las figuras no son originales debe señalarse la autoría, y cuando corresponda, se debe adjuntar la autorización del autor para ser reproducidas.

Pruebas de imprenta

Una prueba de imprenta será enviada al autor encargado de la correspondencia, para su lectura y corrección puntual, y debe ser devuelta al editor dentro del plazo que se especifique. Por otra parte, el editor se reserva el derecho a corregir la prueba de imprenta cuidadosamente, pero sin asumir responsabilidad de tal, y de esta manera agilizar el proceso de publicación.

La decisión final para la publicación del trabajo será en el momento en que el Comité Editor acepte las correcciones, que a sugerencia de los árbitros han realizado los autores. Modifica-ciones a las pruebas de imprenta que no sean de errores menores no serán aceptadas. Ni los editores ni la imprenta aceptarán responsabilidad por la impresión de errores de los ar tículos que los autores no hayan corregido en la prueba de imprenta.

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS

JOURNAL ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Archivos de Medicina Veterinaria publishes, in Spanish or English, original scientific contributions such as scientific articles, reviews and short communications which can include clinical observations, descriptions of methods or techniques and advances in all aspects of veterinary science and animal welfare.

SUBMISSION OF MANUSCRIPTS

Manuscripts should be submitted to the Editor and must include:• Threepapercopiesof themanuscript, includingall tables

and figures.• Anelectronicversionofthetext,tables(preferablyinMS

Word format) and figures (in Excel format, JPG or TIFF, with 300 dpi), on a CD, labeled with the first author’s surname and the beginning of the article’s title.

• Themanuscriptsmustbeoriginal,andmaynotbeconsideredfor publication in another journal.

• Manuscriptsthatdonotconformtoeditorialrequirementswill be returned without review.

• TheeditormayrequireacopyoftheappropriateBioethicalCommittee Certification for manuscripts describing studies involving animals or humans.

• Authorsmustincludealetterdeclaringauthorship,signedby all authors.

• AcoveringlettertotheEditormustbeincludedrequestingpublication of the work, and naming the corresponding author who will also revise the proof of the article, should it be accepted for publication.

• Theintellectualpropertyoftheworkwillberetainedbytheauthors.

• RefereesofArchivos de Medicina Veterinaria will aid the Editorial Committee to determine whether the manuscript fulfills publication requirements. The authors may suggest possible referees. All articles submitted for publication will be assessed by two referees. The referees will be selected by the Editorial Committee, and may or may not include those nominated by the authors. In the case of a disagreement between the referee’s reports, a third referee will aid the Editorial Committee to reach a decision. Referees are obliged to keep all information from the articles confidential, including unpublished information.

• Previoustothepublicationofacceptedarticles,thepublicationcharge must be paid, the amount of which can be found at www.medicinaveterinaria.cl.

PREPARATION AND FORM OF MANUSCRIPTS

Types of articles

Review articles: provide expert summaries of current knowledge in a particular field of veterinary science, and do not necessarily have a set format. Authors should consult with the Editor before initiating a review. The Editorial Committee may solicit an expert to prepare a review, which will also be refereed and edited. Reviews must not exceed 30 pages in length, including tables, figures and references.

Scientific articles: report new advances in veterinary science based on original research. The format must include summary, introduction, material and methods, results, discussion, resumen, acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum length of the manuscript is 20 pages, including tables, figures and references.

Short communications: briefly inform of an advance, experimental result, clinical observations or new methodology, with the following format: summary, introduction, material and methods, results and discussion (combined), resumen, acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum length of the manuscript is 12 pages, including tables, figures and references.

JOURNAL STYLE AND LAYOUT

General presentation: The journal publishes articles in English or Spanish. Manuscripts must be written using 12 point Times New Roman font with one and a half-line spacing, on one side only of letter paper (21.5 x 27.9 cm) using 2 cm margins on all sides. Pages must be numbered consecutively in the top right corner, and lines must be numbered on the left, starting with number one, on all pages.

Headings must be in upper case, left-justified on a separate line with no full stop following, eg. MATERIAL AND METHODS. Only the first letter of sub-headings is capitalized. Primary sub-headings (eg. Experimental design) should be left-justified; secondary sub-headings are left-justified and italicized. Do not use underlining and do not number sub-headings or itemized lists.

In the text, numbers must be written in numerals. When a sentence begins with a number or when necessary for clarity, this should be written in words. A decimal point must be preceded by a number (eg. 0.5 not .5) and a point is used to denote the decimal in English and a comma in Spanish. All measurements should be reported in IS units unless it is normal practice in a discipline to use derivatives (eg. the Curie international unit). Dates must be formatted as 07 September, 1954 in the text, but

Founded in 1969 ISSN 0301-732x

Journal indexed by the following international scientific repertoires: Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

they may be abbreviated in tables and figures. Use the 24-hour clock for times of day (e. g. 13:00 h).

Chemical nomenclature must be expressed using the Biochemical Society Standards (Biochem J 209, 1-27, 1983), generic names (in lower caps) must be used for medications. If brands and sources of medications need to be included, this should be included as a foot-note. Enzymes must be identified at first mention, in accordance with the Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry.

Latin terminology and abbreviations commonly used in scientific literature, such as in vitro, in vivo, ad libitum must be italicized. Probability values must be presented as P<0.05 or P<0.01. Standard deviation, standard error of the mean and confidence intervals are abbreviated as follows: SD, SEM and CI, respectively.

Title

Titles should be short, specific and informative. The title is centred in bold, starting at line 10 without using trade names or abbreviations. Only the first letter is capitalised. The superscript symbol # should be used to indicate the source of funding, with details given as a footnote, if appropriate.

Author’s names and addresses

Author’s names are written underneath the title, separated by a space. Use initials (without stops) and surnames only, separated by comas, as in the example: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Superscript letters should be used after each author’s name to identify the section, department, service or institute of the author where the work was conducted. The corresponding author is indicated using the superscript letter followed by an asterisk, with the full contact details, including fax number and email address indicated in the footnote.

Footnotes

These are used to define abbreviations used in table titles, commercial brands, the name and address of companies. They must be indicated with numbers.

Resumen

The second page must contain a summary in Spanish (Resumen), of no more than 250 words, that describes the objectives of the study or research, the material and methods used, the principal results and the most important conclusions. Non-standard abbreviations must not be used. On a separate line, left-justified and separated by a space, up to four palabras clave (key words) should be identified.

Introduction

The subheading “Introduction” is written on the third page on line 1. In the following line, indented by 5 spaces, the context of the study is briefly presented without an extensive revision of the theme, and only citing the most relevant references. When appropriate, the hypothesis and objectives of the study must be clearly and concisely presented. The one and a half-line spacing between paragraphs must be kept.

Material and methods

Separated by one space from the previous section, this section should contain sufficient detail to allow others to repeat the study. When the first reference in the text is made to medications or chemicals, the generic name, dose and route of administration

should be indicated. For specialized equipment, the brand, model and manufacturer’s name must be indicated.

Details of all statistical methods used must be given at the end of this section under the sub-heading “Statistical analysis” and should include adequate detail to allow readers to determine precisely how data have been analysed and the units that are used to express the results (mathematical mean, standard deviation, standard error of the mean, mediums, ranges or confidence limits, etc.). The use of parametric (Chi-square, student’s T-test, ANOVA, etc.) or non-parametric (Wilcoxon, Kruskal-Wallis etc.) analyses must be indicated. The name, version and sources of computational statistical analysis programs must be identified, eg. SPSS version 9.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).

Results

Separated by one space from the previous section, this section should contain a concise and logical description of the results obtained without discussion or reference to other work. The minimum number of tables and figures should be included to present the pertinent data without repetition, and data presented in tables and figures should not be repeated in the text.

Discussion

This section, separated by one space from the previous section, should evaluate and interpret the results and relate these to other relevant results. The results should not be repeated and new results must not be presented in this section. Care should be taken to ensure that the discussion is developed in a logical and concise manner, and conclusions are reached, as well as a discussion of their relevance. Conclusions that are not directly supported by the data of the study or other unpublished studies should not be presented.

Summary

The summary is written in English, and must be presented on a separate page. The summary should contain the same elements as the “Resumen”. On a separate line, following the summary, left-justified in small caps and separated by a space, up to four key words should be identified.

Acknowledgements

This section should be brief, and should only include people or institutions that have made a direct contribution, provided necessary material or have provided the facilities for the study’s development.

References

The accuracy of the reference section is the responsibility of the authors and references must be verified against the original article. Please ensure that all articles cited in the text are included in the reference list and vice versa. In the text, citations should be listed in parentheses in chronological order, citing authors’ names, and using et al after the first author’s name where there are more than two (e.g. Pérez 1994, Castro and Martínez 1996, Cifuentes et al 2002).

The reference list must be ordered alphabetically according to the first author’s name, and all authors’ names and initials must be included. When no author is given, use the term “Anonymous” in both text and reference list. References with the same author, single or with coauthors, should be listed in chronological order. The letters a, b, c, etc. should be appended as a superscript when more than one work is cited from the

same author within the same year. Authors names should appear with the initials and first letter of the surname in upper caps and the remainder of the surname in lower caps, with no dots between initials. Journal titles and names of books should be in italics using standard abbreviations. Use the following examples as a guide:

For journal articles:Matamoros R, C Gómez, M Andaur. 2002. Hormonas de utili-

dad diagnóstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34, 167-182.

Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373.

For chapters in books or occasional publications:Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total

nitrogen in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington DC, USA, Pp 75-83.

Flórez J. 1992. Fármacos analgésicos opiáceos. En: Flórez J (ed). Farmacología Humana. 2ª ed. Masson-Salvat, Barcelona, España, Pp 25-28.

WHO, World Health Organization. 1972. International Drug Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser WHO Nº 48.

SAG, Servicio Agrícola y Ganadero, Chile. 1996. Resolución Exenta Nº 3599 del 29 de noviembre de 2006..

Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of inva-ding microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA (eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472.

For articles and proceedings published in regular series:Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Böhmwald. 1998. Valores

sanguíneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) en vacas lecheras del sur de Chile. Resúmenes del X Congreso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136.

For dissertations:Matthei SM. 2002. Determinación de la presencia del receptor del

factor activante plaquetario en membranas de neutrófilos de bovino. Memoria de título, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Chile.

For Theses:Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor

GM-CSF en espermatozoides bovinos y su relación con la motilidad espermática. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Chile.

Minimise the citation of abstracts as references. Authors are specifically discouraged from citing “unpublished data” or “personal communication”, unless this information exists in written form, in which case the text should be referred to, but this should not appear in the list of references. References to papers which have been accepted but not published should be cited as “in press”, whereas manuscripts which have been submitted for publication but not accepted should be referred to as “unpublished data”.

Web pages should not be included as references. If so required, web page addresses should be written as footnotes, including date of consultation.

COMPLEMENTARY INSTRUCTIONS

Tables

The titles to tables and figures must be presented in both Spanish and English.

The number of tables should be kept to a minimum and presented on separate pages with their respective titles in English and Spanish at the top. Information in tables must not be repeated in the text. Tables must be numbered consecutively with Arabic numbers in the order in which they are referred to in the text. The brief title to the table should indicate the contents of the table and should be understandable without reference to the text. Each column of each table must have a short or abbreviated heading. Only column headings and general titles should be separated with horizontal lines. Data columns should be separated by spaces and not vertical lines. When additional explanatory information is required, this should appear at the foot of the table. Explanatory information for non-standard abbreviations and units should appear within parentheses. If superscripts are used to indicate significant differences between values, use a, b, c. Minimise the number of digits in each column. Indicate a zero value as 0. Table widths should not exceed 80 mm for one column or 170 mm for two columns.

Figures

Figures should be submitted on separate pages, with their respective titles in English and Spanish at the bottom and numbered consecutively using Arabic numerals in the order they are referred to in the text. Eg. Figure 1, not Fig. 1. Figures include all illustrations that are not Tables, eg. graphs, radiographies, ecographies, electrocardiograms, photographs, etc. Figures must be vertically oriented and be accompanied by a short descriptive caption that contains an explanation for all markers, lines and symbols used but no abbreviations. If the figure contains sections, these should be labelled as a, b, c, etc. in the top right corner and must be described in the caption.

The reverse of photographs must be marked using graphite pencil with the number of the figure, the first author and an arrow showing the orientation of the photograph. Symbols, arrows or letters used should be of an adequate size and contrast to be easily visible. Photographs should be submitted in a protective, adequately sized envelope. Figures may be one or two column-widths (80 or 170 mm, respectively). The cost of printing coloured figures must be met by the authors.

The authorship of non-original figures must be acknowledged, and when appropriate, authorization to reproduce these figures must be provided.

Proofs

A proof will be sent to the corresponding author for proof-reading, and must be returned within the specified time. Otherwise the Editor reserves the right to carefully proof-read the article but without assuming responsibility for errors, to continue with the publication process.

The final decision regarding acceptance of the manuscript will be taken when the Editorial Committee accepts the manuscript following correction according to the referees’ comments. Alterations to the proof that do not correspond to minor errors will not be accepted. Neither the Editor nor the Publisher accept any responsibility for printed errors which were not noted by the authors at the time of proof-reading the proof.

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