VO TRANSLATIONSKONTROLLE
Transcript of VO TRANSLATIONSKONTROLLE
VO TRANSLATIONSKONTROLLEVO TRANSLATIONSKONTROLLEHelmut Dolznig, Teil 2
1 Signaltransduktion zur Translation
2 Translationskontrolle und Krebs
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Helmut DolznigInst für Medizinische GenetikMedUniWien, Waehringer Srasse 10Tel 4277 67502 | email [email protected]
Translation and Cancer
Definitionen: Growth / Protein Synthesis Division / Cell Cycle
Erinnerung: Upstream Signalling to Translation
Transformation
PI3K, PKB/Akt
mTORmTOR
eIF4E
Andere Translationsfaktoren
Klinische Studien
Zusammenfassung
Literatur
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Growth versus Proliferation
Normaler ZellzyklusGrowth, Mass Increase
Proliferation Cell di ision
Maintain cell sizeGrowth and division
Proliferation, Cell division
Growth, Mass Increase
Growth:Massenzunahme / ZeitProtein / Makromolekülzunahme: en Makromolekülzunahme: =mehr Synthese als AbbauKonzentration von Proteinen/ M
ass
e/Vo
lum
e
o e e / Makromolekülzunahme pro Volumen ändert sich nichtVolumszunahme =
M
Zeit
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Massenzunahme = GrowthLangzeitproliferation braucht Massenzunahme
Growth = Prerequisite for Sustained Proliferation
ansonsten:
N M INo Mass Increase/
Volu
men
Mas
se
Zeit
St ti G öß d kti d Z ll b i j d T ilStetige Größenreduktion der Zellen bei jeder Teilung
->Proteinsynthese notwendig in Krebszellen
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Cell Cycle
G1S Replikation
Synthese PhaseGap 1
G2M
Gap 2
MitMitose
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Restriction Point
Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
G1/S Transition
Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Growth <-> Division
Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Transformation
Transformation: Zellen - immortal- anchorage independent proliferation (soft agar assays)
keine Kontaktinhibierung- keine Kontaktinhibierung- erzeugen Tumoren in Tieren
Expression von proto-Oncogenen und Tumor Suppressor Genen auf verschiedenen Ebenen reguliert
Teil: Translation
transformierte Zellen: mehr Proteinsynthese
Cause or Consequence?
????
Ist Veränderung von Translationskomponenten ausreichend für Transformation ?
Translationskontrolle stark verbunden mit
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Signaltransduktion, Expression von Oncogenen, Tumorsuppressorgenen
Upstream Signalling of Translation: Key Players
PKBAkt
PI3K
P
mTOR
S6K 4E-BPS6K 4E BP
T l ti
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Translation
PI3K-AktPI3K Akt
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
PI3K-Akt
PTEN
PI3K
PKBAkt
P
PI3KPP
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
PI3K-Akt
PKBAktPP
mTOR
P
PI3K
P
in Zellkultur und Tiermodellen:
S6KPPPP 4E-BPPP PI3K Onkogen
Akt/PKB OnkogenPTEN Tumorsuppressorgen
in humanen Tumoren:
PI3K aktivierende Mutationen, Amplifikationen
Akt aktivierende MutationenAmplifikationenmRNA Überexpressionp
PTEN LOHMutationenPromotor Methylierung
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Promotor Methylierung
PI3K-Akt
PKBAktPP
mTOR
P
PI3K
P
S6KPPPP 4E-BPPP
PI3K p110
Hotspot Mutationen: erhöhen Kinase Aktivität
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
PI3K-Akt
PKBAktPP
mTOR
P
PI3K
P
S6KPPPP 4E-BPPP
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
PI3K-Akt
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
PI3K-Akt
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Different Inhibitors of RTK-PI3K-Akt-mTOR axis
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
PI3K-Akt-mTOR axis inhibitors
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
mTORmTOR
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
mTOR signalling
PKBAktFKBP12 Akt
P
P
Rapamycin
S6KP
PPP
mTORC1 Tsc1Tsc2 P
RHEB
4E-BPPP
Rib biRibosomenbiogenese
verbesserte Translation vonmRNAs mit regulatorischen Elementen in 5’UTR
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
z. B. Cyclin D1, E ...
Rapamycin, CCI-779
i i idRapamycin: Fungizidisoliert aus Streptomyces hygroscopicus- antimicrobiell- immunosuppressivimmunosuppressiv- antiproliferativ, antitumor
wurde erst als Immunosuppressant bei Organtransplantationen verwendet um ll ft Ab t ß idallografte Abstoßung zu vermeiden
schlechte pharmakologische Eigenschaften: - bedingt wasserlöslich- schlechte chemische Stabilitätschlechte chemische Stabilität
Rapamycin-Esther: gut wasserlöslich, stabiler: CCI-779 (Wyeth, USA)
P äkli i h St di T lli i P t t B t SCL k i Präklinische Studien: Tumorzellinien: Prostata-, Brust-, SCLungenkarzinom, Gliobalastom, Melanom, T-Zell Leukämien
Humane Xenografts: erfolgreich, Tumorwachstum gestopptHumane Xenografts: erfolgreich, Tumorwachstum gestoppt
Phase I Studien beendet: Ziel: maximal tolerierbare DosisNebeneffekte: Haut
Hä t i Th b t i
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Hämatopoiese: Thrombocytopenie
Rapamycin (Sirolimus, Rapamune), CCI-779
Tumoren: Renal Cell Carcinoma (häufigster Nierenkrebs) FDA approvedN ll L C iNon small Lung Carcinoma Regression,
Brustkrebs, Weichteilsarcom, Squamous SkinCarcinoma, , , q ,NH-Lymphoma wenig Effekte
Phase II PTEN, Akt Phosphorylierungsstatus erhobenp y g
ProstatacarcinomaBrustkrebs wenig Effekte wenig Effekte
Phase III Brustkrebs: Kombinationstherapie(CCI779+aromatase inhibitor)
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
( )
Possible mechanism
nC
1 in
hibi
tion
cont
rol
mTO
RC
Rapamycin
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
eIF4EeIF4E
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Erinnerung: eIF4E Aktivierung
PKBAktPP
mTOR
P
PI3K
P
AS, Insulin, WF
S6KPPPPK
4E-BPPP
40SeIF3
eIF4APABP
4EBPP P
P
AS, Insulin, WF
4EBP
eIF4E eIF4E
eIF4GeIF4A
eIF4E
4EBP
Mnk-1P
Initiationskomplex
4EBP
P 2 Aufgaben: - Disssoziation von 4E
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
- Verhinderung der Wiederbindung
eIF4E
PKBAktPP
mTOR
P
PI3K
P
4E ist rate limiting -> Kompetition von verschiedenen mRNAs um Translationsinitiation
S6KPPPPK
4E-BPPP
a.) mRNAs mit unstrukturierten, kurzen UTRs (alle House Keeping genes), leichte Bindung und Scanning durch Präinitiationskomplex, präferentiell translatiert(strong RNAs)
b.) lange, strukturierte 5’UTRs, schlechte Cap dependent Translationenthalten oft IRESs (v.a. proto-Onkogene)(weak RNAs)
wenn mehr eIF4E vorhanden ist: überproportional bessere Translation von langen5’UTR messages verglichen mit kurzen: wenig Effekt
-> Anreicherung von Proteinen, die von komplizierten, sekundärstrukturreichen mRNAs codiert werden im Vergleich zur Masse an Transkripten
IF4E i
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
eIF4E overexpression-> Synthese von c-Myc, cyclin D1, RNR2, ODC, FGF-2, und VEGF angedreht
eIF4E
PKBAktPP
mTOR
P
PI3K
P
S6KPPPPK
4E-BPPP
Abhängigkeit der Translation vonAbhängigkeit der Translation von starken und schwachen mRNAs durch eIF4E levels
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies. Arrigo De Benedetti a, *, Adrian L. Harris b
Induzierbares eIF4E in CHO Zellen
Expression von 4E in COS Zellen -> uninduziert: 7x, induziert: 20x 30-50%mehr Proteinsynthese, bestimmte Proteine stärker synthetisiert (Pfeile)Vermutung: translational repressed genes (weak mRNAs, Repression aufgehoben durch mehr 4E)
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies. Arrigo De Benedetti, Adrian L. Harris
eIF4E
FGF-2: fibroblast growth factor, mitogen und angiogenWundheilung, Tumorvaskularisierung
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies. Arrigo De Benedetti, Adrian L. Harris
FGF-2 wird auch durch MMTV insertion angedreht
eIF4E
PKBAktPP
mTOR
P
PI3K
P
S6KPPPPK
4E-BPPP
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Translational control: the cancer connectionMichael J. Clemens , Ulrich-Axel BommerThe International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31 (1999)
eIF4E
PKBAktPP
mTOR
P
PI3K
P
S6KPPPPK
4E-BPPP
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Translational control: the cancer connectionMichael J. Clemens , Ulrich-Axel BommerThe International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31 (1999)
eIF4E ist ein Onkogen
Transformationsassays
- anchorage
- keine Kontaktinhibierung
eIF4E
NIH3T3
gindependentproliferation(soft agar assays)
fibroblastsCHOREF
- erzeugenTumoren in Mäusen
4E verstärkt Transformation mitv-mycE1AE1AMax
Knock down von 4E durch antisense hemmt oncogene/metastatische
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
eIF4E ist ein Onkogen
Knock down von 4E durch antisense hemmt oncogene/metastatische Eigenschaften von ras transformierten REFs
eIF4E in Tumoren
Überexpression in Blasen-, Head/Neck-, Colon- und Brustkarzinomen
Hypothese:
bessere Translation von mRNAs mit langen 5’UTR, komplexen Sekundärstruktureng , p
Brustkrebs:
4E expression könnte als Tumormarker, Prognostischer Indikator genutzt werdenÜberexpression meist transkriptionell, oder durch Genamplifikation
4E antisense in human breast cancer cell line: angiogene und tumorigene Eigenschaften vermindert
Head and neck squamous carcinomas (HNSC):Head and neck squamous carcinomas (HNSC):
Grenze Tumor / Normalgewebe schwer zu erkennen, 4E expression hilft
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
eIF4E
Apoptose:
4E Expression reduziert Apoptose in serum arretierten Zellen bzw in Myc-überexprimierenden Zellen
4E antisense: mehr Apoptose bei Starvation oder Bleomycin Behandlung
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Summary Initiation Factors + Cancer
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, Watkins and Norbury, BJCancer 86 (2002), 1023-27
Zusammenfassung
Wachstum (growth) ist nicht gleich Zellteilung (Proliferation, cell division)
Voraussetzung für Zellteilung ist Wachstum, Voraussetzung für Wachstum ist Translation
d.h. ohne Translation keine Zellteilung daher ohne Translation kein Tumordaher Inhibition der Translation sehr interessant für Tumortherapie!!!
PI3K-Akt-mTOR pathway sehr häufig dereguliert in humanen Tumoren PI3K Akt mTOR pathway sehr häufig dereguliert in humanen Tumoren neben Rb und p53 am häufigsten
Aktivierung von Proto-Onkogenen: PI3K Untereinheiten, PKB/Akt Familie durch aktivierende Mutationen, Amplifikationen, Überexpression
Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen: PTEN, TSC1/2 durch LOH, Mutationen, Silencing (Methylierung)
Komponenten der Translationsinitiationsmaschinerie impliziert in Krebs im MenscheneIF2, eIF3, eIF4A, eIF4E, eIF4E (überexprimiert)
eIF4E = Onkogen, transformiert Zellen und Überexpression resultiert in Tumoren im Tiermodell
Transformierende Wirkung wahrscheinlich durch selektiv bessere Translation von „schwachen“ mRNAs(langer stark strukturierter 5‘ UTR, z.B. myc, Cyclin D1, VEGF..)
Sehr viele therapeutische Ansätze um PI3K - PKB/Akt – mTOR pathway bei Krebserkrankungen zu
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Sehr viele therapeutische Ansätze um PI3K PKB/Akt mTOR pathway bei Krebserkrankungen zu blocken (präklinische Tests – Phase II Studien)
Literatur
Hildago et al. The rapamycin sensitive signal transduction pathway as a target for cancer therapy. Oncogene 19 (2000), 6680-86
Wyeth Homepage, www.wyeth.com
Watkins and Norbury Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis Watkins and Norbury, Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, BJCancer 86 (2002), 1023-27
Arrigo De Benedetti and Adrian L. Harris. eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31 (1999)
Malumbres and Barbacid, To cycle or not to cycle: a critical decision in cancer.Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31
Garber, Rapamycin’s resurrection: a new way to target the cancer cell cycle.JNCI, 93 (2001), 1517-19
Averous J, Proud. When translation meets transformation: the mTOR story.Oncogene. 2006 Oct 16;25(48):6423-35.
Mamane Y, Petroulakis E, LeBacquer O, Sonenberg. mTOR, translation initiation and cancer.Oncogene. 2006 Oct 16;25(48):6416-22.
Corradetti MN, Guan KL. Upstream of the mammalian target of rapamycin: do all roads pass through mTOR?Oncogene. 2006 Oct 16;25(48):6347-60.
Crino PB, Nathanson KL, Henske EP. The tuberous sclerosis complex.N Engl J Med. 2006 Sep 28;355(13):1345-56.g p ( )
Hennessy BT, Smith DL, Ram PT, Lu Y, Mills GB. Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drug discovery.Nat Rev Drug Discov. 2005 Dec;4(12):988-1004.
Samuels Y, Ericson K. Oncogenic PI3K and its role in cancer.Curr Opin Oncol 2006 Jan;18(1):77-82
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Curr Opin Oncol. 2006 Jan;18(1):77-82.
Cully M, You H, Levine AJ, Mak TW. Beyond PTEN mutations: the PI3K pathway as an integrator of multiple inputs during tumorigenesis.Nat Rev Cancer. 2006 Mar;6(3):184-92
eIF4A
2 Isoformen I und II40S
PABP eIF3RNA Helicase
Überexpression in Hepatocarcinomas, Melanoma ZellinieneIF4E
PABP eIF3eIF4G
eIF4A
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
eIF2
eIF2 PGSK3P
inactive
eIF2 Kinases
HRI, PKR, PERK
eIF2BeIF2eIF2GDPGTP
GTPGDP GTPGDP
eIF2GTP
M t RNA
Translation Initiation
Met-tRNA
Erhöhte Expression von eIF2 in transformierten Zelllinien, NH-Lymphoma,Magen-, Colon- und RektaltumorenMagen , Colon und Rektaltumoren
Überexpression von eIF2bzw. eIF2Mutante (keine P Stelle mehr)-> Transformation
Verlust von eIF2 Kinases: HRI niedrig in epithelialen Ovarialtumoren
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Verlust von eIF2 Kinases: HRI niedrig in epithelialen OvarialtumorenPKR fraglich
eIF3
11 Untereinheiten40S
PABP eIF35 UE überexprimiert in manchen Tumoren (Brust, Cervix, Ösophagus, Lunge, Testis, Prostata)
Hypothese: Überexpression einer eIF3 UE-> mehr eIF3 eIF4E
eIF4GeIF4A
PABP eIF3
eIF3 bindet direkt an manche IRESs (Growth advantage?)
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
eIF4G
2 Isoformen I und II
Ü40S
PABP eIF3Überexpression von I Transformation in NIH3T3 Fibroblasten
Cap dependent und independent Translation erhöht in FM3A ZelleneIF4E
eIF4APABP eIF3
eIF4G
Überexpression gefunden in 30% Non Small cell lung cancers
Hypothese:
Kompetition mit 4EBP um 4E Bindung -> Inhibitorischer Effekt von 4EBP aufgehoben bzw geschwächt
Direkte IRES Bindung
eIF4G mRNA hat selbst IRES, positiver Feedbackloop?
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
mRNAs with IRES
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, Watkins and Norbury, BJCancer 86 (2002), 1023-27
Translation Initiation
The rate of synthesis of any given protein is determined primarily by the level of translation initiation. In brief, a ternary complex is formed between eIF2, GTP and the initiator methionyl-tRNA (met-tRNAi) hil f 40S ib l b it b d t IF3 l lti b it i iti ti f t tRNAi), while free 40S ribosomal subunits are bound to eIF3, a large, multi-subunit, initiation factor. Free 60S ribosomal units are similarly bound to the monomeric eIF6. Together, eIF3 and eIF6prevent premature association of the 60S and 40S ribosomal subunits. The ternary complex is transferred to eIF3/40S along with eIF1 and eIF1A, to form a 43S pre-initiation complex. eIF3 can
bi d t th IF4F l hi h i i t d ith th RNA th li ki th 40S ib now bind to the eIF4F complex, which is associated with the mRNA, thus linking the 40S ribosome to the mRNA and generating the 48S pre-initiation complex.eIF4F itself consists of three components: eIF4G, eIF4E, and eIF4A. eIF4G binds eIF3 and acts as a scaffold for eIF4E and eIF4A. eIF4E recognises and binds the 5' mRNA cap structure while the RNA d d t ATP IF4A i th ht t i d d t t i th 5' t l t d i dependent ATPase eIF4A is thought to unwind secondary structure in the 5' untranslated region (UTR). eIF4B is an additional factor that may stimulate the eIF4A helicase activity and promote RNA binding. The poly(A) tail of the mRNA interacts with poly(A) binding protein (PABP), which in turn has a binding site on eIF4G allowing the mRNA to circularise. The 48S pre-initiation complex
d t f th RNA 5' d til it t AUG i iti ti d Thi now scans downstream from the mRNA 5' end until it encounters an AUG initiation codon. This process can only occur if the 43S complex has formed in the presence of eIF1 and eIF1A.With the Met-tRNAi positioned at the AUG codon, eIF5 interacts with the pre-initiation complex via EIF2 and eIF3. eIF2-bound GTP is hydrolysed and eIF2-GDP is released. The hydrolysis of a second GTP bo nd to the initiation factor eIF5B is acti ated b the 60S ribosomal s b nit These second GTP bound to the initiation factor eIF5B is activated by the 60S ribosomal subunit. These two successive GTP hydrolysis events, and the simultaneous release of eIF3, are essential for the joining of the 60S subunit. A functional 80S ribosome is consequently formed and peptidyl transfer can now occur.
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, Watkins and Norbury, BJCancer 86 (2002), 1023-27
Regulation of ternary complex formation
Translation InitiationRegulation of ternary complex formationThe protein kinases PKR, HRI and PERK can phosphorylate the alpha subunit of eIF2 and this results in an increased affinity for eIF2B, a guanine nucleotide exchange factor. Normally, eIF2B catalyses the exchange of eIF2-bound GDP with GTP so that a new interaction with met-tRNAi can take place and the ternary complex can re-form Phosphorylated eIF2a sequesters eIF2B can take place and the ternary complex can re-form. Phosphorylated eIF2a sequesters eIF2B, preventing the formation of additional ternary complexes and inhibiting translation initiation. eIF2a has also been shown to be cleaved during apoptotic cell death, rendering eIF2 inactive and consequently disabling the ternary complex.
Regulation of mRNA-bindingmRNA binding to ribosomes is generally the rate limiting step in translation initiation and consequently is a major focus for regulatory pathways. Disruption of the eIF4F complex abolishes the link between the capped mRNA and the ribosomes and drastically inhibits translation the link between the capped mRNA and the ribosomes and drastically inhibits translation. Formation of eIF4F complexes also depends upon the presence of active eIF4E which, while it is the least abundant of the translation initiation factors, is essential for binding the pre-initiation complex to the cap structure. Availability of eIF4E is regulated through the activities of 4E-BP/2/3. These exist in a hypophosphorylated state in quiescent cells and have the capacity to sequester These exist in a hypophosphorylated state in quiescent cells and have the capacity to sequester eIF4E by competing with eIF4G for a common 4E-binding site. This in turn prevents assembly of the eIF4F complex and inhibits translation initiation. 4E-BP1 hyperphosphorylation at multiple amino acid residues occurs in response to growth factors such as insulin, IGF-1 and angiotensin-II and involves protein kinases including mTOR MAP kinases PKC ATM and casein kinase II involves protein kinases including mTOR, MAP kinases, PKC, ATM and casein kinase II. Hyperphosphorylated 4E-BP1 dissociates from eIF4E, leaving it free to participate in eIF4F formation. The activity of eIF4E may be regulated by phosphorylation (e.g. by the MAP kinase-stimulated protein kinase, Mnk1). Low levels of eIF4E phosphorylation are correlated with reduced translation rates in quiescent and mitotic cells
Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008
translation rates in quiescent and mitotic cells.
Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, Watkins and Norbury, BJCancer 86 (2002), 1023-27