VIVIEN SCHMELING PICCIN Efeitos da lesão pulmonar induzida ...

VIVIEN SCHMELING PICCIN

Efeitos da leso pulmonar induzida pela ventilao mecnica sobre o epitlio das vias

areas de conduo e sua influncia no aparelho mucociliar : modelo experimental em coelhos

Tese apresentada Faculdade de Medicina

da Universidade de So Paulo para obteno

do ttulo de Doutor em Cincias

rea de concentrao: Patologia

Orientadora: Profa. Dra. Elnara Mrcia Negri

So Paulo 2010

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Piccin, Vivien Schmeling Efeitos da leso pulmonar induzida pela ventilao mecnica sobre o epitlio das vias areas de conduo e sua influncia no aparelho mucociliar : modelo experimental em coelhos / Vivien Schmeling Piccin. -- So Paulo, 2010.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Departamento de Patologia.

rea de concentrao: Patologia. Orientadora: Elnara Mrcia Negri.

Descritores: 1.Depurao mucociliar 2.Muco 3.Clios 4.Ventilao mecnica 5.Traumatismo pulmonar induzido por respirador 6.Mecanotransduo celular

USP/FM/SBD-026/10

DE D I C A T R I A

Ao meu marido Roberto Buckhazi Piccin

Voc mais que especial. meu parceiro, meu grande amor, meu melhor

amigo. Sempre incentivou minhas idias, me deu apoio e conselhos sbios.

Minha admirao por voc enorme. O seu companheirismo fundamental

para minhas conquistas e estas somente tm significado porque tenho voc

ao meu lado. Eu te amo.

minha filha Priscila Schmeling Piccin

Voc minha companheira de uma jornada que no incio foi muito rdua e

difcil. Aprendi com voc, amadureci com voc. Minha filha, eu te admiro

muito, pela sua coragem, dedicao aos seus ideais, pelo seu corao

bondoso. Obrigada pela sua compreenso e pelo seu carinho. Eu te amo.

minha filha Andressa Schmeling Piccin

Meu chicletinho. Inteligente e amorosa. Sempre grudada na mame.

Sempre ligando para me contar as novidades da escola ou para saber onde

estou e a que horas vou chegar. Minha companheirinha de todos os

momentos. Eu te amo.

minha me Felicia Schmeling

Eu admiro sua coragem para sozinha criar trs filhos, sua fora em tantos

momentos difceis da vida, sua disciplina para voltar a estudar e se formar.

Me, eu tambm me orgulho muito de voc. Eu te amo.

AG R A D E C I M E N T O S

Profa. Dra. Elnara Mrcia Negri, pelo acolhimento e ensinamentos

valiosos. Muito obrigada por sua orientao e pacincia e, acima de tudo,

pela ajuda na concretizao do meu sonho de vida. Que Deus sempre

ilumine os seus caminhos.

querida Cludia Simeire Albertini Yagi que eu admiro tanto. A primeira que

acreditou em mim e, se estou aqui hoje, por culpa sua! Obrigada por tudo

Clau! Desejo-lhe sempre tudo de bom!

s amigas muito especiais Regiani Carvalho de Oliveira e Maringela

Macchione, minhas mestras do Laboratrio do Muco e Defesa Pulmonar.

Obrigada pelo carinho e pelo acolhimento. Vocs foram meus anjos da

guarda nessa jornada.

Susimeire Gomes pela sua luz, sua pacincia, seus ensinamentos

grandiosos. Voc o exemplo de profissionalismo, dedicao e respeito

pesquisa cientfica.

Ao Prof. Dr. Paulo Hilario Nascimento Saldiva pelo incentivo e disposio em

ajudar.

Aos Profs. Marcelo Amato e Carlos Carvalho pelo interesse, incentivo e

amplo apoio no desenvolvimento desse estudo na UTI Animal.

Profa. Elia Garcia Caldini meu muito obrigado pelos preciosos

ensinamentos. Hoje eu vejo o microscpio com outros olhos.

s Dras. Marisa Dolhnikoff e Maria Lcia Garcia pelos ensinamentos e

observaes construtivas.

Ao Prof. Dr. Raymundo Soares de Azevedo Neto pelo exemplo, pela

simpatia e pelas dicas sempre pertinentes.

s amigas Christiane Calciolari, Kelly Yoshizake, Luciana Rabello, Andrea

Cristina Pereira, Lcia Akinaga, Alessandra Choqueta, Naomi Nakagawa,

Danielle Goto, Gabriela Manfrim, Mary Anne Olm, Karina Andrighetti,

Dolores Rivero, Ana Julia Lichtenfels, Eliane Tigre, Heloisa Bueno, Janana

Proena, Aretha de Souza, Mrcia Sueli Bento, Maria Dalva Gomes

Santana, Eunilda Cavalcante, Tatiana Lanas, Raquel Annoni, Ana Laura

Carvalho, Mana Morales, Bianca de Arajo, Denise Carnieli, Miriam Lemos,

Cibele Berto, Adriana Lunardi, Fabiana Leoratti, Renata Leite e aos amigos

Ruy Neto, Digenes Ferreira e Rogrio Pazetti pelo apoio e ajuda

incondicional.

Agradeo igualmente aos companheiros do LIM 09, Marcelo do Amaral

Beraldo, Neide Ribeiro, Otlia Batista, Karina Timenetsky e Raquel Belmino

que me auxiliaram e me ensinaram tanto. Obrigada de corao!

A todos os amigos do Laboratrio de Biologia Celular FMUSP: Marcelo Alves

Ferreira, Nilsa Regina Damaceno Rodrigues, Maria res Amorim Mendes,

Ado Caetano Sobrinho, Felipe Garcia Alves, Valria Veiga Sales, Cristina

Viveiros Cordeiro da Fonseca, Mirian Regina Simone, Maria Ceclia

Marcondes, Maria Margarida Monteiro e Gildsio Vieira Rocha.

s dedicadas Liduvina de Barros, Vera Lcia Carvalho, Weluma de Souza,

Emlia de Araujo e Anna Mary Zenker Brando pela excelncia do trabalho e

disposio com os alunos e orientadores desse programa de ps-graduao.

Agora o mexidinho com vocs.

Profa. Cida Basile e estimadas Silvia Itzcovici Abensur, Gladis dos Santos,

Maria Snia Patrcio de Almeida e Gisela Aparecida Dantas de Macedo que

sempre me acolheram to bem e participaram dos meus momentos

maravilhosos no PAE Programa de Aperfeioamento de Ensino.

Profa. Raquel Casarotto, Prof. Celso Carvalho e Prof. Carlos Augusto

Pasqualucci pelos exemplos de docncia, pelos ensinamentos e pela

oportunidade de aprender.

FAPESP pelo apoio financeiro e pela liberao do estgio docente, de

extrema importncia para a formao do ps-graduando.

A realizao de uma pesquisa requer somatrio de recursos, tempo e

disposio. Agradeo tambm o apoio da Faculdade de Medicina da

Universidade de So Paulo FMUSP e dos Laboratrios de Investigao

Mdica: LIM 05 e LIM 59 Departamento de Patologia, LIM 09

Departamento de Crdio-Pneumologia e LIM 51 Departamento de

Emergncias Clnicas, sem os quais a disponibilidade de tempo e a

motivao no seriam suficientes para a colheita dos frutos desse estudo.

s amigas e amigos no citados aqui em nome, mas guardados com carinho

no corao. Agradeo ao sorriso, ao bom dia caloroso, ao aceno de cabea

afetuoso. Estes gestos, muitas vezes annimos, tornavam um dia difcil bem

mais leve e agradvel.

Aos amigos to queridos dessa jornada: Maria Aparecida Nogueira, Maria

Jlia Pinto Porto, Ester Almeida (In Memoriam), Dra. Ises Abrahamsohn, Dr.

Paulo Abrahamsohn, Dr. Granadeiro Guimares (In Memoriam), Maria

Helena Motta Rodrigues Alves, Eliana Marchi Azevedo, Luiza Dante Marchi,

Juliana Marchi de Castro e Azevedo. Agradeo a Deus a oportunidade de ter

conhecido estas pessoas especiais!

minha av Miriam Cuglovici (In Memoriam) e minha me Felicia

Schmeling, pela fora e pelo incentivo sempre.

minha irm Monica Schmeling Barbosa e pelo nosso reencontro. Monica,

eu te adoro!

s minhas tias Lori Schmeling, Regina e urea que achavam que o meu

marido um dia ia acordar com um livro ao lado.

minha sogra Helena Buckhazi Piccin e meu sogro Paschoalino Piccin pelo

carinho, compreenso e pela disposio em ajudar sempre.

s minhas filhas Priscila Schmeling Piccin e Andressa Schmeling Piccin,

estrelas da minha vida.

Ao meu marido Roberto Buckhazi Piccin, meu sol.

A Deus que permite o sentido de nossa vida.

Cada um como Deus o fez.

(Citado por Jos Granadeiro Guimares)

A acepo desse fato talvez seja o nosso maior desafio dirio.

Esta pesquisa recebeu subsdio financeiro da

FAPESP Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo

Bolsa de Doutorado Direto: Processo n 2006/50725-8

Esta tese est de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicao: Referncias: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver) Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina. Servio de Biblioteca e Documentao. Guia de apresentao de dissertaes, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Arago, Suely Campos Cardoso, Valria Vilhena. 2a ed. So Paulo: Servio de Biblioteca e Documentao; 2005. Abreviaturas dos ttulos dos peridicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.

SU M R I O

S U M R I O

Lista de abreviaturas, smbolos e siglas Lista de figuras Lista de grficos Lista de tabelas Resumo Summary

1 INTRODUO............................................................................. 2

1.1 Ventilao mecnica e leso pulmonar induzida pela ventilao mecnica...................................................................................... 2

1.2 O sistema respiratrio e suas defesas......................................... 13

1.3 Aparelho mucociliar...................................................................... 17

1.4 Hiptese e justificativa.................................................................. 33

2 OBJETIVO................................................................................... 35

3 MTODOS.................................................................................... 37

3.1 Protocolos de ventilao mecnica.............................................. 39 3.1.1 Critrios para definio de LPIV................................................... 43 3.2 Avaliao da funo mucociliar.................................................... 43 3.2.1 Transporte mucociliar in situ......................................................... 44 3.2.2 Frequncia do batimento ciliar...................................................... 45 3.2.3 Transportabilidade pelo mtodo palato de r............................... 46 3.2.4 ngulo de contato......................................................................... 48 3.3 Morfometria e morfologia.............................................................. 50 3.3.1 Infiltrado inflamatrio.................................................................... 50 3.3.2 Muco cido e muco neutro........................................................... 51 3.3.3 Microscopia eletrnica.................................................................. 54 3.4 Anlise estatstica......................................................................... 55

4 RESULTADOS............................................................................. 57

4.1 Ventilao e sinais vitais............................................................... 57 4.2 Efeitos da ventilao mecnica sobre o pulmo.......................... 60 4.2.1 Avaliao macroscpica............................................................... 60 4.2.2 Infiltrado inflamatrio.................................................................... 62 4.2.3 Leso pulmonar induzida pela ventilao mecnica.................... 66 4.3 Funo mucociliar......................................................................... 66 4.3.1 Muco cido e muco neutro........................................................... 71 4.3.1.1 Traquia........................................................................................ 71 4.3.1.2 Bronquolos................................................................................... 75 4.3.2 Microscopia Eletrnica.................................................................. 78

5 DISCUSSO ............................................................................... 82

5.1 Funo mucociliar......................................................................... 83 5.1.1 Transportabilidade em traquia.................................................... 83 5.1.2 Transportabilidade em palato....................................................... 84 5.1.3 Frequncia de batimento ciliar...................................................... 86 5.1.4 ngulo de contato......................................................................... 88 5.2 Muco cido e muco neutro........................................................... 90 5.3 Morfologia celular do aparelho mucociliar.................................... 92 5.4 Ventilao mecnica e pulmo..................................................... 95 5.5 Limitaes..................................................................................... 102

6 CONCLUSO............................................................................... 107

7 ANEXOS ...................................................................................... 109

8 REFERNCIAS ........................................................................... 121

LI S T A S

ABREVIATURAS, SMBOLOS E SIGLAS

% por cento & e < menor que = igual a mais ou menos l microlitro m2 micrmetros quadrados 1:1 um para um Cdy complacncia dinmica cmH2O centmetros de gua cmH2O/L/seg

centmetros de gua por litro por segundo

Com comrcio et al. e outros EtCO2 dixido de carbono ao fim da expirao FC frequncia cardaca FiO2 frao inspirada de oxignio FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo Fr French FR frequncia respiratria HE Hematoxilina-Eosina HZ Hertz Ind indstria L/m litros por minuto Ltda limitada m2 metros quadrados ME microscopia eletrnica mg/Kg miligramas por kilogramas ml mililitros ml/cmH2O mililitro por centmetro de gua ml/Kg mililitros por quilograma

mm milmetros mm/min milmetros por minuto mm/s milmetros por segundo mmHg milmetros de mercrio mmol/L milimol por litro n nmero C graus Celsius graus p probabilidade (estatstica) PaCO2 presso parcial de gs carbnico no sangue arterial PaO2 presso parcial de oxignio no sangue arterial PAS/AB combinao de cido peridico de Shiff e azul alciano PEEP presso expiratria final positiva pH potencial de hidrognio Pmdia presso mdia Ppico presso de pico Pplat presso de plat rpm respiraes por minuto Rti resistncia tecidual SaO2 saturao arterial da oxihemoglobina VC volume corrente Vt volume corrente x vezes

FIGURAS

Figura 1 Foras de tenso e cisalhamento geradas pela ventilao mecnica e sua participao em diferentes setores do sistema respiratrio.................................... 6

Figura 2 Estrutura do epitlio respiratrio................................... 17

Figura 3 Esquema representando o mecanismo de transporte

mucociliar com a camada sol e camada gel do muco respiratrio.................................................................... 19

Figura 4 Esquema mostrando detalhes da estrutura em corte

transversal do clio envolto pela membrana plasmtica ................................................................... 20

Figura 5 Ciclo do batimento ciliar visto de perfil e do topo da superfcie...................................................................... 22

Figura 6 Diagrama esquemtico do polmero constituindo um

gel................................................................................. 24

Figura 7 Representao esquemtica do modelo jack-in-the-box para a secreo de mucina.................................. 25

Figura 8 Regulao da gene transcrio do MUC5AC............... 27

Figura 9 Mecanismo proposto de ativao autcrina de EGFR

em clulas epiteliais de brnquios aps estresse mecnico...................................................................... 28

Figura 10 Muco recobrindo o epitlio respiratrio........................ 31

Figura 11 Mecanismos de absoro e secreo de ons, gua e

eletrlitos do epitlio respiratrio.................................. 32

Figura 12 Esquema demonstrando as reas da traquia dos coelhos onde foram coletadas as amostras de muco e amostras de tecido traqueal para avaliao histopatolgica e da funo mucociliar......................... 42

Figura 13 Representao esquemtica do transporte mucociliar em palato de r............................................................. 47

Figura 14 Representao esquemtica do equipamento

utilizado para a medida do ngulo de contato.............. 48

Figura 15 Anlise macroscpica de pulmes de coelhos............. 61

Figura 16 Parnquima pulmonar dos grupos: Sham (A), Baixo Volume (B), Alto Volume (C) e Alta Presso (D) - (HE 400x)............................................................................. 65

Figura 17 Muco observado no epitlio traqueal dos grupos: Sham (A), Baixo Volume (B), Alto Volume (C) e Alta Presso (D) - (PAS/AB 400x)....................................... 73

Figura 18 Muco observado no epitlio de bronquolos dos

grupos: Sham (A), Baixo Volume (B), Alto Volume (C) e Alta Presso (D) - (PAS/AB 400x)............................. 77

Figura 19 Microscopia eletrnica dos grupos Sham (A), Baixo Volume (B), Alto Volume (C) e Alta Presso (D) 79

GRFICOS

Grfico 1 Nmero de clulas polimorfonucleares (infiltrado inflamatrio) observado em parnquima pulmonar dos animais do grupo Sham e grupos expostos aos protocolos de VM............................................................... 63

Grfico 2 Reproduo grfica da transportabilidade do muco in situ

(traquia de coelho) nos grupos ventilados (Baixo Volume/BV, Alto Volume/AV e Alta Presso/AP).............. 67

Grfico 3 Reproduo grfica da transportabilidade do muco in

vitro (palato de r) nos grupos ventilados (Baixo Volume/BV, Alto Volume/AV e Alta Presso/AP).............. 68

Grfico 4 Reproduo grfica da frequncia de batimento ciliar

observada na traquia de coelho nos grupos ventilados (Baixo Volume/BV, Alto Volume/AV e Alta Presso/AP)... 69

Grfico 5 Reproduo grfica da medida do ngulo de contato do

muco dos animais dos grupos ventilados (Baixo Volume/BV, Alto Volume/AV e Alta Presso/AP).............. 70

Grfico 6 Relao rea de muco/frao de parnquima observada

no epitlio traqueal dos grupos Sham, Baixo Volume (BV), Alto Volume (AV) e Alta Presso (AP)...................... 72

Grfico 7 Espessura do epitlio traqueal de coelhos nos grupos

Sham e grupos ventilados (Baixo Volume/BV, Alto Volume/AV e Alta Presso/AP).......................................... 74

Grfico 8 rea de muco observada no epitlio de bronquolos de

coelhos nos grupos Sham, Baixo Volume (BV), Alto Volume (AV) e Alta Presso (AP)...................................... 76

Grfico 9 Espessura do epitlio de bronquolos de coelhos nos

grupos Sham, BV, AV e AP (Mdia e Desvio Padro)...... 78

TABELAS

Tabela 1 Sinais vitais.................................................................... 57

Tabela 2 Parmetros ventilatrios................................................. 58

Tabela 3 Ventilao mecnica (VM)............................................. 59

Tabela 4 N de clulas polimorfonucleares por rea de parnquima pulmonar (m2).......................................... 62

Tabela 5 Transportabilidade em traquia de coelho (TMCT)....... 67

Tabela 6 Transportabilidade em palato de r (TMC).................... 68

Tabela 7 Frequncia de batimento ciliar (FBC)............................. 69

Tabela 8 ngulo de contato (AC).................................................. 70

Tabela 9 Muco em traquia de coelhos (em m2)........................ 71

Tabela 10 Muco em bronquolos de coelhos (em m2)................... 75

RE S U M O

Piccin VS. Efeitos da leso pulmonar induzida pela ventilao mecnica

sobre o epitlio das vias areas de conduo e sua influncia no aparelho

mucociliar: modelo experimental em coelhos [tese]. So Paulo: Faculdade de

Medicina, Universidade de So Paulo; 2010. 135p.

A ventilao mecnica (VM) pode ser causa de leso pulmonar sendo este

fato reconhecido na literatura como Leso Pulmonar Induzida pela

Ventilao Mecnica (LPIV), onde alteraes tanto fisiolgicas quanto

morfolgicas so evidenciadas no pulmo. O objetivo desse trabalho foi

avaliar a repercusso das foras envolvidas na ventilao mecnica atravs

de diferentes mecanismos de LPIV sobre o sistema mucociliar pela anlise

funcional e histopatolgica desse aparelho. Em um estudo controlado e

randomizado vinte e sete coelhos machos da raa Nova Zelndia foram

separados em quatro grupos. Nos primeiros trinta minutos foram submetidos

VM com volume corrente de 8 ml/kg peso, fluxo de 3 L/minuto, e presso

positiva expiratria final (PEEP) de 5 cm H2O e FIO2 de 0,4, sendo que o

grupo Sham (n=6) foi ventilado por apenas 10 minutos. Os grupos Baixo

Volume/BV (n=6; Vt 8, Ppico 17, Pmdia 9, PEEP 5, Fluxo 3), Alto

Volume/AV (n=7; Vt 16, Ppico 27, Pmdia 12, PEEP 5, Fluxo 5) e Alta

Presso/AP (n=8; Vt 8, Ppico 30, Pmdia 20, PEEP 12, Fluxo 9) foram

ventilados por mais 3 horas. A mecnica do sistema respiratrio foi

registrada pelo sistema Labview. Foram acompanhados os valores de

gasometria e sinais vitais. Amostras de tecido pulmonar foram coradas com

H&E para anlise de infiltrado inflamatrio. Analisou-se a frequncia de

batimento ciliar (FBC), transporte mucociliar na traqueia (TMCT),

transportabilidade em palato de r (MCT) e ngulo de contato (AC).

Amostras de pulmo e traquia foram coradas pela tcnica PAS/AB para

avaliao do muco. Observamos diminuio da complacncia do sistema

respiratrio (p

comparao com o grupo Sham. No foram observadas diferenas quanto

ao TMCT e AC nos grupos ventilados. A transportabilidade em palato

diminuiu no grupo BV (p=0,007) ao final do protocolo de ventilao (1,42

com variaes de 2,11-0,99 para 0,95 com variaes de 1,15-0,92). A FBC

diminuiu (p=0,047) no grupo AP quando comparamos os valores iniciais

(13,51 variao de 14,49-11,62) e finais ao protocolo de VM (11,69 variao

de 14,18-10,12). Respostas fisiolgicas e microscopia eletrnica (ME) da

traquia corroboram a disfuno da FBC no grupo AP. Na traquia os

grupos ventilados apresentaram uma diminuio da quantidade de muco

total (BV 2.018, AV 3.219 e AP 2.883) e de muco cido (BV 672, AV 240 e

AP 480) por m2 de tecido pulmonar por campo estudado (p

SU M M A R Y

Piccin VS. Effects of ventilator-induced lung injury on airway-ciliated epithelia

and the influence on mucociliary transport system [thesis]. So Paulo:

Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2010. 135p.

Mechanical ventilation (MV) can result in a medical complication named

Ventilator-Induced Lung Injury (VILI), where physiologic and morphologic

alterations in the lungs have been reported. In this study, we have

hypothesized that MV-induced injury can have a major impact on the

mucociliary system. In a randomized controlled trial twenty-seven male New

Zealand rabbits were separated into four groups. During the first thirty

minutes all rabbits were subjected to MV with tidal volume of 8 ml/kg of body

weight, 3 L/minute of flow, positive end expiratory pressure (PEEP) of 5 cm

H2O and FIO2 of 0.4. After that the study animals were divided into 4 groups:

Sham (n=6) was ventilated for ten minutes, Lower Volume/LV (n=6; Vt 8, P

peak 17, P mean 9, PEEP 5, Flow 3), High Volume/HV (n=7; Vt 16, P peak

27, P mean 12, PEEP 5, Flow 5) and High Pressure/HP (n=8; Vt 8, P peak

30, P mean 20, PEEP 12, Flow 9) and ventilated for 3 hours more.

Respiratory system mechanics was recorded using Labview. Blood

gasometry and vital signals were monitored. Lung tissue sections were

stained by H&E to analyze inflammation. We also studied the ciliary beating

frequency (CBF), tracheal mucociliary transport (TMCT) in situ and in vitro,

mucus contact angle (CA) and respiratory mucus viscosity. To quantify

mucosubstances, tracheal samples were stained with PAS/AB. As a result

we have that the respiratory system compliance decreased (p

range of 14.49-11.62) and final (11.69 range of 14.18-10.12) measurements

were compared. Physiological data and tracheal electronic microscopy

confirm the CBF dysfunction observed in the AP group. In the trachea all

ventilated groups showed a significant decrease in total mucus (LV 2,018,

HV 3,219 and HP 2,883) and acid mucus (LV 672, HV 240 and HP 480) per

um2 of lung tissue (p

1 INTRODUO

I N T R O D U O

Vivien Schmeling Piccin

2

1.1 Ventilao mecnica e leso pulmonar induzida pela ventilao

mecnica

Desde a utilizao do fole manual por Paracelso (1530) para insuflar

pulmes de pessoas recentemente falecidas at os dias atuais, quando

intensivistas dispem de modernos equipamentos de suporte ventilatrio, o

tema Ventilao Mecnica (VM) tem sido objeto de muitos estudos. No

obstante, ainda apresenta lacunas quanto a sua atuao e impacto em

mltiplos rgos e sistemas do organismo humano (Terzi e Carvalho, 2003).

De forma conceitual a ventilao mecnica pode ser entendida como

a manuteno da oxigenao e da ventilao em pacientes portadores de

insuficincia respiratria aguda, de maneira artificial, at que estejam

capacitados a reassumi-las (Barbas et al., 2002). Indiscutivelmente trata-se

do mais importante aspecto de suporte de vida para pacientes com falncia

respiratria.

Como qualquer outra terapia, a ventilao mecnica apresenta efeitos

colaterais (Villar, 2005). Um desses efeitos, denominado Leso Pulmonar

Induzida pela Ventilao Mecnica (LPIV), tem sido grande item de

investigao, uma vez que representa um potencial fator de risco em

pacientes ventilados mecanicamente (Lionetti et al., 2005). O conceito de

I N T R O D U O


3

LPIV foi estabelecido a partir de evidncias visveis, como a disperso

area, e evidncias mais sutis, como o desenvolvimento de edema

intersticial, edema alveolar e ruptura epitelial. Alm disso, recentes

pesquisas apontam para o papel das clulas inflamatrias e mediadores na

leso pulmonar, bem como a prpria resposta intracelular ao estresse

mecnico (Sibilla et al., 2002) como fatores relacionados LPIV.

Geralmente, a assistncia ventilatria ao paciente crtico realizada

atravs de um modo ventilatrio determinado por um conjunto de ajustes no

ventilador que faz com que o equipamento de ventilao mecnica obedea

a regras especficas. O modo volume controlado permite o ajuste do fluxo e

do volume corrente, sendo a presso da via area consequncia da

mecnica pulmonar do paciente. Se a complacncia for baixa ou a

resistncia elevada, ter valores de presso elstica ou resistiva elevados e

o ventilador dever desenvolver presses mais altas para suplant-la e fazer

com que o volume de ar previamente determinado entre nos pulmes. Por

outro lado, se o aparelho for ajustado para controlar a presso na via area,

o fluxo e o volume corrente decorrero da mecnica pulmonar do paciente.

Se o paciente tiver uma complacncia baixa, seu componente de presso

elstica se elevar. Como o ventilador no permite que a presso ultrapasse

o limite previamente determinado pelo operador, o volume corrente

automaticamente cair (Pomplio e Carvalho, 2003). Como pode ser

observado, no so pequenos os desafios de uma adequada estratgia

ventilatria, mas de forma geral preconiza-se a utilizao de baixos volumes

correntes (7 8 ml/Kg), associado a uma presso expiratria final positiva

I N T R O D U O


4

(PEEP) previamente determinada. Para diminuio da presso inspiratria a

estratgia recomendada a mudana do padro do fluxo inspiratrio (fluxo

decrescente). Evidentemente trata-se de uma maneira simplificada de

demonstrar o gerenciamento do paciente com suporte ventilatrio, que

envolve vrios outros estratagemas. De qualquer forma a questo

fundamental j demonstrada em situao experimental que altos volumes

correntes e altas presses inspiratrias podem ser responsveis por leses

pulmonares graves durante a ventilao mecnica, caracterizadas por

membrana hialina, infiltrao de granulcitos, e extravasamento das

hemcias, associadas a uma permeabilidade vascular pulmonar bastante

aumentada, entre outros. Volumes correntes de 12 ml/Kg em humanos

assim como presses inspiratrias habitualmente utilizadas na ventilao

mecnica (25 - 40 cmH2O) parecem ser capazes de produzir leses

pulmonares mais graves do que aquelas decorrentes do uso de altas fraes

inspiradas de oxignio. Perodos to curtos como 30 minutos so suficientes

para desencadear essas leses em pulmes normais. Associado a estas

leses observa-se tambm o aparecimento de hipotenso arterial sistmica

e disfuno de mltiplos rgos (Barbas et al., 2002).

Entretanto, antes de considerarmos mais aprofundadamente a

influncia do volume corrente e da presso inspiratria no sistema

respiratrio, pertinente ponderar que, na fisiologia normal, as clulas no

pulmo esto normalmente sujeitas a uma variedade de foras mecnicas

como resultado da natureza dinmica da funo pulmonar (Schumacker,

2002). Uma dessas foras de tenso denominada fora de cisalhamento

I N T R O D U O


5

(shear stress) e ocorre nas vias areas de conduo devido ao fluxo areo.

Sendo produzida quando o ar move-se pela superfcie celular, gera uma

tenso paralela membrana plasmtica acarretando em uma deformao

dessa membrana. Uma segunda forma de deformao sofrida pelo pulmo

refere-se tenso mecnica. A tenso ocorre quando determinada fora

aplicada a uma clula que, sendo elstica, causa um estiramento ou uma

deformao mecnica. Em estados patolgicos como leso pulmonar aguda,

onde a diminuio da elasticidade pulmonar relevante, a magnitude da

fora de tenso mecnica est aumentada, com consequente ampliao do

nvel de esforo (Schumacker, 2002).

importante observar que as clulas sujeitas fora de tenso

mecnica ou cisalhamento apresentam diversos e extensos nveis de

resposta.

A Figura 1 apresenta de forma ilustrativa como estas foras esto

distribudas no sistema respiratrio.

I N T R O D U O


6

FONTE: Modificado de Fishman AP, pulmonary diseases and disorders em Welsh MJ, 1988.

Figura 1 Foras de tenso (setas vermelhas) e cisalhamento (setas

azuis) geradas pela ventilao mecnica e sua participao em diferentes setores do sistema respiratrio.

NOTA: EP: Epitlio; BM: Membrana basal; SM: Glndula submucosa; FC: Fibrocartilagem.

Durante a ventilao mecnica as foras de tenso e cisalhamento

no representam mais aquelas observadas na atividade normal da funo

respiratria. Estas foras, devido a um princpio de gerao mecnica de

fluxo, esto diminudas ou aumentadas de acordo com o padro ventilatrio

adotado e seus ajustes especficos, seja este modo volume controlado ou

presso controlada. Schulz (1959) foi o primeiro autor a descrever as

consequncias patolgicas nos pulmes mecanicamente ventilados,

sugerindo que o estresse mecnico da camada interna dos alvolos

(causado pela hiperdistenso) pode mudar as caractersticas surfactantes

(citado por Duarte et al., 2003). A partir de ento vrias pesquisas se

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7

seguiram com o objetivo de entender melhor a transformao do sinal

mecnico gerado pelo ventilador em sinal biolgico (mecanotransduo), e

suas possveis consequncias ao organismo.

O significado e impacto da mecanotransduo no sistema pulmonar

bem como os mecanismos moleculares dos mecanossensores celulares

ainda no esto totalmente estabelecidos. Desde que o mecanossensor

definido como um sistema que detecta tenso mecnica na clula e converte

esta deformao em um sinal biolgico, os mecanismos apontados como

responsveis por esta interpretao de sinais de distoro incluem os canais

inicos sensveis ao estiramento, interaes citoesquelticas e outros

sistemas. Parte da dificuldade em identificar a chave do processo

mecanossensor est em identificar qual exatamente o estgio em que este

mecanossensor ativado (Schumacker, 2002).

O papel da falncia por estresse e reparo da membrana plasmtica

epitelial tem sido discutido como importante mecanismo de base mediador

da leso pulmonar por estresse mecnico. As clulas experienciam a

falncia por estresse da membrana plasmtica quando a matriz qual esto

aderidas sofre uma grande deformao (Matthay et al., 2002). No pulmo,

semelhante mecanismo pode ajudar a explicar a leso celular decorrente de

ventilao mecnica. Vlahakis e Hubmayr (2002) demonstraram que a

deformao mecnica dos pulmes induz o trfego de lipdios para a

membrana plasmtica de clulas epiteliais dos alvolos, acarretando

aumento da superfcie celular. Esse mecanismo um processo dependente

de temperatura e, consequentemente, de energia e envolve o movimento de

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8

vesculas atravs da membrana. Condies associadas que inibem este

processo de defesa envolvem baixa temperatura, baixo colesterol e

enfraquecimento citoesqueltico. Esses pesquisadores, ainda considerando

o papel de proteo do trfego de lipdios, recentemente demonstraram que

a leso celular por estresse significativamente aumentada quando esse

trfego inibido (Vlahakis e Hubmayr, 2002). Devido observao das

propriedades mecnicas das clulas, onde se constatou a associao entre

a inibio da resposta de remodelao e a leso, foi levantada a hiptese de

que a remodelao celular um mecanismo mais importante para a

citoproteo contra a deformidade ou ruptura por tenso do que os

elementos de conectividade e resistncia representados pelos componentes

celulares de suporte de tenso (Vlahakis e Hubmayr, 2002). Os autores

sugerem que o movimento dos lipdios deve ser considerado em pesquisas

de agentes de proteo contra a leso pulmonar induzida pela ventilao

mecnica. Em outro estudo, Atabai et al. (2002) sugerem que o fator de

crescimento de clulas epiteliais (Keratinocyte Growth Factor KGF) pode

intensificar o reparo do epitlio alveolar por mecanismos que no incluiriam o

de multiplicao celular. Foi administrado KGF (5 mg/Kg), via intratraqueal,

em ratos 48 h antes do isolamento de pneumcitos do tipo II. As clulas

previamente tratadas com KGF apresentaram um expressivo nvel de reparo

epitelial quando comparadas com as do grupo controle, sugerindo que

experimentalmente esta protena auxilia na recuperao da leso pulmonar

aguda. Lim et al. (2002) apresentaram evidncias, em estudo in vivo, de que

a tenso excessiva em vias areas pode induzir o movimento de clulas

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inflamatrias para a microcirculao local de ratos. Neste estudo, os autores

desenvolveram uma nova aplicao da microscopia intravital em ratos

anestesiados, mecanicamente ventilados, possibilitando a direta observao

do influxo leucocitrio na circulao traqueobronqueal. Neste estudo a

ventilao normal foi mantida com 80 respiraes por minuto, com 6 ml/Kg

de volume e 0 cmH2O de presso positiva expiratria final (PEEP). O

aumento da tenso pulmonar foi induzido pelo aumento da PEEP para 8

cmH2O em diferentes intervalos de tempo. A ventilao normal no alterou a

velocidade de recrutamento leucocitrio e tampouco o nmero de ligaes

celulares. Em contraste, o aumento do PEEP por uma hora induziu um

considervel decrscimo na presso sangunea, com recuperao dos

valores de base em trinta minutos. O evento de reduo tempo-dependente

da velocidade de recrutamento leucocitrio permanece assim mesmo aps a

reduo da PEEP excessiva. No entanto, o nmero de receptores

endoteliais atinge seu patamar em uma hora de observao, retornando aos

valores de base em duas horas, o que sugere que o endotlio no

irreversivelmente ativado com a sustentao da tenso pulmonar devido

utilizao da PEEP. Os autores especularam que o recrutamento leucocitrio

o resultado direto do aumento da tenso no pulmo resultando no

desencadeamento local de mediadores inflamatrios e na ativao do

endotlio das vias areas. Para confirmar esta hiptese, foram apresentados

dados demonstrando que o aumento da tenso no pulmo no modifica o

trfego leucocitrio no mesentrio de ratos, no obstante a similar reduo

da presso sangunea. Esses dados confirmam a hiptese de que a

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excessiva tenso no pulmo durante a ventilao mecnica pode

desencadear eventos deletrios em pacientes com patologias em vias

areas. Frank et al. (2002) induziram dano pulmonar em ratos ventilados

com diferentes protocolos de ventilao mecnica. Os ratos foram

randomizados em trs grupos, com 12, 6 ou 3 ml/Kg de volume corrente na

ventilao e PEEP de 10 cmH2O. Como esperado, o grupo de 12 ml/kg de

volume corrente apresentou um visvel extravazamento de gua no pulmo

aps 4 horas. O grupo com volume corrente de 6 ml/Kg de peso corpreo,

similar ao grupo com estratgia protetora de ventilao mecnica utilizada

pelo National Institutes of Health, notadamente apresentou reduo do

edema pulmonar. O grupo de 3 ml/kg de volume corrente igualmente

apresentou reduo do edema pulmonar. Existem evidncias de que o

adicional efeito de proteo do uso de 3 ml/Kg de volume corrente pode ser

explicado pelo favorecimento da proteo contra leses epiteliais alveolares,

baseadas em estudos biomecnicos sobre antgenos de clula epitelial do

tipo I bem como pela expresso melhorada do surfactante protena C e a

normalizao da capacidade de transporte do fludo alveolar.

Histologicamente pode ser observada a diminuio do edema e da

inflamao com estratgias de baixo volume corrente. Dessa maneira, existe

um efeito de proteo relacionado s estratgias ventilatrias que

possibilitam a reduo de leso no endotlio pulmonar, mas o adicional

efeito de proteo do uso de baixo volume corrente parece ser explicado

pela limitao de leso no epitlio alveolar. Sabe-se atualmente que

estratgias protetoras de ventilao mecnica conduzem a um declnio na

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mortalidade de pacientes com sintomas clnicos de leso pulmonar aguda

(Matthay et al., 2002).

Na literatura cientfica percebe-se que o estiramento somente afetar

o pulmo se esta fora for suficiente para acarretar falncia mecnica dos

elementos estruturais. De modo significante, no existe dvidas da

importncia da distoro mecnica na fisiologia ou fisiopatologia do pulmo

(Schumacker, 2002), porm a questo continua a requerer a colaborao de

vrios profissionais para sua resposta.

Adicionalmente ao estudo do impacto das foras mecnicas da VM

sobre o pulmo distal, surgiram pesquisas in vitro com foco no estudo do

efeito da estimulao mecnica sobre clulas do aparelho mucociliar e sobre

as propriedades do muco. Sanderson e Dirksen (1986) observaram que a

estimulao mecnica da superfcie de cultura de clulas ciliadas derivadas

da traquia de coelhos resultava em um aumento transitrio do batimento

ciliar de vinte por cento ou mais no apenas na clula estimulada, mas at

mesmo nas clulas vizinhas quela. Sanderson et al. (1990) tambm

mostraram que a estimulao mecnica em culturas de clulas ciliadas do

epitlio respiratrio de coelhos desencadeia uma onda de propagao de

clcio (Ca2+) atravs de mecanismos de comunicao intercelular. Esta

comunicao capacita as clulas na coordenao de suas atividades

fisiolgicas estabelecendo um padro de colaborao mtua. A abertura dos

canais de clcio atravs do estresse mecnico e sua participao na

regulao do batimento ciliar foi tambm explorada por Winters et al. (2006)

em tecido mucociliar extrado da traquia de ratos. Estes pesquisadores

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concluram que complexas interaes de componentes fsicos e bioqumicos

regulam a viscosidade do muco e a mobilidade ciliar. Moores et al. (1992)

pesquisaram a ao da ventilao de alta frequncia sobre muco

expectorado de pacientes com bronquite crnica observando que o aumento

da viscosidade e da elasticidade observados no muco aps a aplicao

desse estmulo especfico poderia acarretar na reduo do clearance

pulmonar in vivo. Even-Tzur et al. (2008) verificaram que culturas de clulas

humanas do epitlio nasal expostas a uma cmara simulando o estresse

causado por diferentes fluxos de ar apresentavam um aumento na secreo

de muco em relao as clulas no submetidas a tal estresse mecnico,

sugerindo que o estmulo mecnico representativo na funo do epitlio

nasal.

Porm, apesar de muito ter sido estudado sobre o impacto das foras

de tenso e cisalhamento geradas pela ventilao mecnica sobre o

parnquima pulmonar distal, e tambm alguns estudos in vitro terem sido

desenvolvidos para pesquisar sobre o tema, existem poucos estudos in vivo

que abordam as consequncias das diferentes foras tensionais geradas

pela ventilao mecnica sobre o aparelho mucociliar. Estes estudos

envolvem ou pacientes com diferentes histrias clnicas geralmente

abordando um padro ventilatrio em particular (Konrad et al., 1995;

Nakagawa et al. 2000, Nakagawa et al. 2005; de Oliveira et al., 2006); ou

pesquisas experimentais focando a ao no aparelho mucociliar de drogas

especficas ou do posicionamento do corpo durante a ventilao mecnica

(Nakagawa et al, 2004; Bassi et al., 2007).

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Sabe-se, no entanto, na comunidade cientfica, que os achados de

edema por aumento de permeabilidade, processo inflamatrio com liberao

de mediadores, congesto, inundao alveolar e atelectasias observados na

LPIV (Duarte et al., 2003) acarretam acrscimo da quantidade de secrees

no pulmo, dificuldade de depurao dessa secreo e proporcional

aumento na ocorrncia de infeco pulmonar. Assim, um melhor

entendimento sobre leso pulmonar induzida pela ventilao mecnica e sua

influncia sobre o aparelho mucociliar pode auxiliar no desenvolvimento de

medidas para a defesa e clearance pulmonar.

Neste contexto, faremos uma breve reviso sobre o sistema

respiratrio e o aparelho mucociliar, bem como sobre os fatores

determinantes para um adequado clearance pulmonar, como o epitlio

respiratrio, constituio do muco respiratrio e transporte inico.

1.2 O sistema respiratrio e suas defesas

O sistema respiratrio possui uma arquitetura voltada para a

otimizao de sua funo primordial que o de efetuar as trocas gasosas

(Saldiva et al., 1990). As estruturas componentes desse sistema podem ser

divididas entre aquelas que promovem a entrada e sada do ar do organismo

e que fazem parte da zona condutora (o nariz, a nasofaringe, a laringe, a

traquia, os brnquios e os bronquolos); e aquelas que facilitam o trnsito

gasoso para o sangue e do sangue para o ambiente e esto situadas na

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zona respiratria (os bronquolos respiratrios ou terminais, os ductos

alveolares e os sacos alveolares).

As vias areas representam a maior rea de superfcie epitelial do

corpo humano em contato direto com o meio externo e, como consequncia,

so as que mais sofrem com as agresses advindas desse contato

(Nakagawa, 2006). Em 24 horas um indivduo adulto inala aproximadamente

12.000 litros de ar ambiente. Ao final de uma inspirao profunda 80% do

volume pulmonar ser composto de ar, 10% de sangue e 10% de tecido

pulmonar propriamente dito, porm disposto de forma a otimizar a interface

de troca (com extenso equivalente de 70 a 100m2). O ar inalado contm

uma srie de elementos potencialmente nocivos, tais como partculas

orgnicas e inorgnicas, organismos vivos e mortos, vapores e fumaas, que

so frequentemente depositados na superfcie do trato respiratrio (Saldiva

et al., 1990; Nakagawa, 2006).

Entretanto, apesar da inalao contnua de agentes nocivos, os

pulmes so limpos e estreis. Isso ocorre porque as vias de conduo so

estruturadas anatmica e fisiologicamente para proteger a regio alveolar

(Lorenzi et al., 1991), seja atravs de respostas imunolgicas inatas (no-

especficas) ou adquiridas (especficas) (Nakagawa, 2006). O sistema de

defesa inato responsvel pelo transporte de partculas e microorganismos

depositados na superfcie das vias areas e pela eliminao de patgenos

nos alvolos atravs do condicionamento do ar inspirado (umidificao,

aquecimento e filtrao), transporte mucociliar (ou transporte pela tosse) ou

fagocitose pelos macrfagos na regio alveolar. O sistema de defesa

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adquirido antgeno-especfico, incluindo respostas imunolgicas mediadas

pela clula e pelo anticorpo (Nakagawa, 2006).

Concentramos nosso estudo na zona condutora, basicamente

traquia e bronquolos, para efeito de anlise e comparao dos efeitos da

LPIV em partes distintas do sistema de defesa inato com funo de

transporte mucociliar.

A traquia o principal segmento condutor de ar nas vias areas,

sendo formada por anis cartilaginosos em formato de meia-lua que se

subdividem at chegar aos sacos areos. Sua convexidade frontal, sendo

apenas cilndrica em sua parte anterior. Posteriormente a traquia plana e

coberta por uma membrana. Na traquia existe um revestimento interno

mucoso e outro ciliar, onde os clios se movem em direo faringe, levando

as impurezas e o excesso de muco. As paredes externas da traquia so

revestidas por musculatura lisa e recebem fibras dos ramos simpticos e

parassimpticos do sistema neurovegetativo para regulao da resistncia

das vias areas e da intensidade do fluxo de ar. Existem receptores beta-

adrenrgicos (2) no tecido desta musculatura lisa que quando estimulados

pela noradrenalina da fibra simptica produzem relaxamento e consequente

aumento do calibre da traquia. Os receptores muscarnicos por suas vezes

ligam-se a acetilcolina da fibra parassimptica e promovem a contrao da

musculatura com consequente diminuio da rea livre de entrada do ar

(Savarese e Rosinha, 2006).

A traquia subdivide-se em dois ramos denominados respectivamente

brnquio principal direito e brnquio principal esquerdo. Ocorrem, ento,

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sucessivas divises dicotmicas e aproximadamente entre a 9 e 19

geraes encontram-se os bronquolos (Leff e Schumacker, 1996).

importante observar que, medida que as subdivises avanam, os

brnquios perdem cartilagem e ganham musculatura lisa comandada pelo

sistema neurovegetativo. O nmero de clulas mucosas do revestimento

interno permanece, mas o nmero de clulas ciliadas vai diminuindo at que

estas desaparecem no bronquolo terminal (Savarese e Rosinha, 2006).

Os bronquolos so segmentos com 1 mm ou menos, com epitlio que

varia desde cilndrico simples ciliado at cbico simples na sua poro final.

As clulas caliciformes diminuem progressivamente, estando mesmo

ausentes da medida em que os bronquolos adquirem menor dimetro. O

epitlio dos bronquolos apresenta regies especializadas denominadas

corpos neuroepiteliais que recebem inervao colinrgica. Estes corpos

possuem clulas com grnulos de secreo que provavelmente esto

envolvidas na resposta do bronquolo frente a alteraes na composio dos

gases na luz bronquiolar. A lmina prpria dos bronquolos delgada e rica

em fibras elsticas. Abaixo da mucosa encontra-se a camada muscular que

relativamente mais desenvolvida do que nos brnquios e est sob controle

do sistema nervoso autnomo. A estimulao parassimptica aumenta o seu

grau de contrao diminuindo o dimetro destes tbulos, ocorrendo o oposto

com a estimulao simptica. Os menores bronquolos com carter condutor

so revestidos por um epitlio cbico simples contendo clulas de clara.

Estas clulas secretam lipoprotenas com funo de prevenir adeses no

lmen (Moriscot et al., 2004).

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1.3 Aparelho mucociliar

O epitlio das vias de conduo pseudoestratificado ciliado e as

clulas comprometidas com o transporte mucociliar podem ser divididas

didaticamente em secretoras e ciliadas. As clulas ciliadas possuem cerca

de 200 clios, com cerca de cinco a sete micrmetros na regio da traquia,

tornando-se progressivamente menores ao caminhar para a periferia do

pulmo. Locais onde as principais fontes de secreo pulmonar esto

presentes: 1. glndulas da submucosa, onde so encontradas as clulas

mucosas e serosas (presentes somente nas vias areas cartilaginosas); 2.

epitlio das vias areas: clulas mucosas (ou globet cells), serosas e

clulas de clara. Existem atualmente dez tipos celulares descritos no epitlio

respiratrio, incluindo-se clulas com papel ainda pouco conhecido (special

type e brush) (Jeffery et al., 1983; Lorenzi et al., 1991) (Figura 2).

FONTE: Modificado de Morgenroth, 1988.

Figura 2 Estrutura do epitlio respiratrio. 1: clula ciliada; 2: clula secretora; 3: camada gel do muco respiratrio; 4: capilares da submucosa; 5: fibras musculares da submucosa.

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O muco respiratrio reveste o epitlio pulmonar desde a traquia at

as unidades de troca gasosa, formando um filme lquido impermevel a gua

e medindo cerca de dois a cinco micrmetros de espessura (Figura 2).

composto por duas camadas; uma camada inferior denominada camada sol

(fluido periciliar), que consiste de um fluido seroso, e a camada superior,

denominada fase gel, que constituda por um material visco-elstico.

O transporte mucociliar o principal mecanismo de defesa pulmonar

(Silberberg, 1990). As partculas inaladas, potencialmente nocivas ao

organismo, se impactam ao longo das vias areas de conduo e so

adsorvidas pela camada de muco que recobre o epitlio (King et al., 1989;

Lorenzi et al., 1991). Desta forma, uma questo muito relevante diz respeito

aos mecanismos de retirada do muco das vias areas. Estes devem ser

eficientes, pois a sua falncia pode ter mltiplas implicaes, tais como:

1. Facilitar a colonizao de bactrias, aumentando-se o risco de

infeces respiratrias (Braga, 1990);

2. Aumentar o tempo de contato de agentes agressores com o

epitlio respiratrio. Existem hipteses que associam a falncia do

transporte mucociliar carcinognese pulmonar, por potencializar a

ao de substncias inaladas (Zayas et al., 1990).

3. A estase de muco pode acarretar graves distrbios na

ventilao, com aumento da resistncia ao fluxo areo (Braga, 1990).

O mecanismo de transporte mucociliar pode ser comparado

grosseiramente ao de uma esteira rolante. O motor do sistema dado pelos

clios que batem continuamente, propiciando energia para o deslocamento

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da camada de muco (Figura 3). Este transporte feito nas vias areas

respiratrias; o batimento ciliar impulsiona o muco no sentido cranial, em

direo orofaringe, onde deglutido ou expectorado (Lorenzi et al., 1991;

Saldiva et al., 1992).

FONTE: Modificado de Macchione, 1998.

Figura 3 Esquema representando o mecanismo de transporte mucociliar

com a camada sol e camada gel do muco respiratrio. O batimento ciliar segue uma orientao rgida em direo a orofaringe.

O perfeito funcionamento do transporte mucociliar depende de fatores

ligados ao clio, ao muco e interao adequada entre clio e o muco

(Houtmeyers et al., 1999). Portanto, para um transporte mucociliar eficiente

necessria a ao coordenada de trs funes celulares: gerao de fora,

funo secretora, e transporte de gua e ons. Uma falha em qualquer

destes elementos pode ser suficiente para o colapso do transporte como um

todo (Saldiva et al., 1992). medida que ocorre falncia do transporte

mucociliar, o indivduo passa a depender de uma forma progressivamente

maior do transporte do muco realizado pela tosse (Puchelle et al., 1981). A

tosse, portanto, constitui um mecanismo alternativo de eliminao das

secrees.

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Os clios so prolongamentos citoplasmticos com estrutura bem

definida. Em corte transversal apresentam nove pares de microtbulos

perifricos e um par central (Figura 4). O mecanismo de batimento ciliar

bastante complexo, dependendo basicamente de um deslizamento dos

pares de microtbulos, e ocorre com um grande gasto energtico (Satir e

Sleigh, 1990). Esta estrutura ideal dos clios pode estar alterada tanto em

condies de doenas congnitas (ex: sndrome da hipomotilidade ciliar),

assim como resultado de agresses crnicas do epitlio respiratrio

(Houtmeyers et al., 1999).


Figura 4 A: esquema mostrando detalhes da estrutura em corte transversal

do clio envolto pela membrana plasmtica contnua clula. Neste corte so observados nove pares de microtbulos conectados entre si por pontes de nexina e dispostos ao redor de um par central. Ao lado podemos ver uma microscopia eletrnica mostrando um corte transversal de clio de r, conforme representado no esquema A (aumento de 84000 X).

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A frequncia de batimento ciliar normal de 10 a 20 Hz. A eficincia

da propulso do fluido brnquico pelos clios conseguida pelo fato do

batimento ciliar ser assimtrico. O seu batimento pode ser decomposto em

duas fases, na primeira o clio se estende totalmente e a extremidade do

clio penetra parcialmente na camada gel (fase do batimento efetivo). Em

uma segunda fase, de recuperao, o clio se dobra e coloca o seu eixo

principal paralelamente superfcie epitelial. Desta forma, retorna

posio original lentamente, com uma velocidade cerca de duas vezes

menor que a do batimento efetivo, por uma fase de menor impedncia, sem

qualquer contato com a camada gel (Figura 5). O batimento ciliar respeita

uma coordenao, onde os clios se movem em ondas metacrnicas

(Lorenzi et al., 1991; Satir e Sleigh, 1990).

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FONTE: Modificado de Lorenzi Filho, 1993.

Figura 5 Ciclo do batimento ciliar visto de perfil e do topo

da superfcie. a: batimento efetivo; b e c: fase de recuperao o clio se movimenta lentamente e em direo contrria ao transporte do muco.

A secreo de muco uma importante atividade biolgica, confirmada

pelo fato de que ao longo da escala evolucionria serem encontradas clulas

especializadas na sua produo. Em qualquer situao em que seja

produzido o muco sua principal funo isolar e proteger a superfcie

tecidual do ambiente que o cerca.

O muco respiratrio exerce as funes de lubrificar e umidificar a

superfcie das vias areas; isolar e proteger o epitlio de agressores

exgenos; promover um ambiente adequado ao batimento ciliar e diminuir a

tenso superficial nas pequenas vias areas de maneira semelhante ao

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surfactante nos alvolos, pois as mesmas tendem a colapsar ao final da

expirao (Sad et al., 1970; Saldiva, 1990; Welsh, 1987). O muco uma

mistura heterognea de diferentes secrees que formam um polmero

hidroflico com propriedades viscoelsticas. Sua composio de

aproximadamente 95% do seu peso de gua; eletrlitos, incluindo Na , o

principal componente, K , Mg +2, Ca +2 e Cl-, e ainda componentes orgnicos,

como protenas, carboidratos, lipdeos e aminocidos (Lorenzi-Filho, 1993;

Verdugo, 1990).

Como qualquer gel, o muco respiratrio consiste em uma matriz e um

solvente. Neste caso, o solvente a gua, e a matriz composta de vrios

polmeros que se agrupam aleatoriamente. O principal componente desta

matriz uma famlia de macromolculas chamadas mucinas e secretadas

pelas clulas mucosas das glndulas da submucosa, clulas caliciformes e

clulas secretoras. Alm das mucinas outras substncias tambm se agregam

a essa matriz, como os proteoglicanos, lipdeos, substncias antioxidantes,

proteases e antiproteases, tampes, imunoglobulinas (IgA secretora, IgG,

IgM), lisozima, peroxidase, lactoferrina, antileucoprotease, protenas ricas em

prolina, albumina, DNA, actina e, possivelmente, outras substncias como o

surfactante (Houtmeyers et al., 1999; Lorenzi-Filho e Saldiva 1991; Verdugo,

1990).

Mucinas so glicoprotenas altamente heterogneas, consistindo de

um filamento protico e nas quais pequenas cadeias laterais de

polissacardeos esto ligadas. A estrutura central do peptdeo representa

aproximadamente 20% do peso, enquanto os 80% restantes so

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24

carboidratos. A estrutura central (core) inclui regies densamente

glicosiladas e tambm regies desnudas, isto , no glicosiladas. As

regies glicosiladas representam 70 a 80%, enquanto as no glicosiladas

representam 20 a 30%, estas contm resduos de cistena e so suscetveis

clivagem. As cadeias laterais de oligossacardeos esto ligadas ao corpo

protico central atravs de ligaes O-glicosdicas pela N-

acetilgalactosamina nas cadeias laterais de acar (Figura 6). As cadeias

laterais contm de 2 a 20 monossacardios que podem ser lineares ou

ramificadas, e variam imensamente na composio. So, em geral,

sulfatados e/ou contm terminais silicos, determinando as caractersticas

polinicas das mucinas (Silberberg, 1990, Verdugo, 1990) (Figura 6).

FONTE: Modificado de Lorenzi Filho, 1993.

Figura 6 Diagrama esquemtico do polmero constituindo um gel. Podemos observar a natureza das ligaes entre as cadeias que se encontram entrelaadas, enquanto as ligaes S:S se encontram na estrutura do polmero.

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25

As propriedades fsicas dos polmeros no estado gel so

primariamente determinadas pela configurao macromolecular na qual as

cadeias de polmeros esto interligadas matriz de gel, assim como pela

conformao (tamanho e formato), carga, flexibilidade e concentrao dos

polmeros constituintes (Houtmeyers et al., 1999; Lopez-Vidriero, 1987).

As mucinas so mantidas nos grnulos das clulas secretoras graas

a um mecanismo de anteparo, onde as cargas negativas so

contrabalanadas por uma grande quantidade de cargas positivas (no caso,

o Ca++). Uma pequena abertura seria suficiente para a entrada de gua,

difuso do clcio e exocitose promovida por perda do anteparo, por um

mecanismo conhecido como jack-in-the-box (Figura 7) (Verdugo, 1990).


Figura 7 Representao esquemtica do modelo jack-in-the-box para a secreo de mucina. O granulo secretor primeiro instala-se junto membrana plasmtica (a). A exocitose iniciada pela abertura de um poro na membrana (b). A gua no espao extracelular entra atravs deste orifcio, permitindo a difuso do escudo (anteparo) de

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26

ctions. A perda do escudo de carga leva a uma catastrfica reao atravs da malha dos polmeros sobre a fase de transio, quando ento uma carga de repulso promove uma rpida hidratao da malha polinica, liberando o produto secretrio (c).

Recentes estudos tm tambm relacionado a secreo de mucinas

como resultante de uma resposta mecanotransduo. Um exemplo seria a

observao de que em eventos de compresso mecnica como o que ocorre

durante a bronquioconstrio na asma, gradualmente aumentam a

expresso da protena de MUC5AC (expresso gnica de mucina 5AC) nas

clulas (Voynow et al., 2009; Park e Tschumperlin, 2009) (Figura 8).

A compresso mecnica igualmente resultaria no colapso do espao

intercelular, aumentando a concentrao de ligantes de EGFR (receptores

de fator de crescimento epidrmico). Esta estimulao sinalizada via MAPK

(proteno-quinases ativadas por mitgenos) levaria a uma expresso de

ligantes especficos de EGFR que retornam a ativao de seus prprios

receptores de modo autcrino ou parcrino, perpetuando os sinais, em um

ciclo que se mantm mesmo aps o trmino do estmulo de compresso

(Chu et al., 2005) (Figura 9).

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Receptor_de_fator_de_crescimento_epid%C3%A9rmico&action=edit&redlink=1http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Receptor_de_fator_de_crescimento_epid%C3%A9rmico&action=edit&redlink=1

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FONTE: Imagem cedida pela Dra. Maringela Macchione, modificado de Voynow e Rubin, 2009.

Figura 8 Regulao da transcrio do MUC5AC. Seguido a um estmulo mecnico, ligantes de EGFR (receptores de fator de crescimento epidrmico) desencadeariam uma cascata de eventos culminando no aumento da expresso da MUC5AC (mucina gene expresso 5AC).

Mas essa regulao da transcrio de sinais no seria a nica forma

de mecanismo da expresso de mucinas. Vrios mediadores inflamatrios,

incluindo a elastase neutroflica, TNF (fator de necrose tumoral alfa) e IL-8

(interleucina 8) aumentam igualmente a expresso de MUC5AC (mucina

gene expresso 5AC) pelo aumento do RNA (cido ribonuclico) mensageiro

no epitlio das vias areas. Alguns estudos tambm apontam para

mecanismos genticos na regulao da expresso de mucinas (Voynow e

Rubin, 2009).


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FONTE: Modificado de Chu et al., 2005.

Figura 9 Mecanismo proposto de ativao autcrina de EGFR (receptores

de fator de crescimento epidrmico) em clulas epiteliais de brnquios aps estresse mecnico. Veja texto para maiores detalhes.

A matriz de gel provavelmente secretada como um polmero

condensado, e se torna um hidrogel somente aps hidratao. Este

mecanismo ocorre por causa da presena de cross-linking e do

emaranhado existente entre as cadeias de macromolculas; a matriz do

polmero funciona como sua prpria membrana semipermevel, impedindo

que as cadeias polinicas migrem para fora do gel. esta caracterstica

polinica das mucinas que fornecer a energia necessria para sua

hidratao; essa fora contrabalanada pelos ons livres e polictions que


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podem penetrar na rede de polmeros e neutralizar as cargas polinicas das

mucinas (Lorenzi-Filho e Saldiva, 1991; Verdugo, 1990).

Alm das glicoprotenas, os proteoglicanos, polmeros secretados pelas

clulas serosas, tambm participam da caracterstica viscoelstica do muco. De

maneira anloga s mucinas, as lisozimas provavelmente tambm atuam para a

condensao do muco (Verdugo, 1990).

As vrias possibilidades de ligaes entre os polmeros que compem o

muco respiratrio fazem com que possam assumir configuraes bastante

peculiares quando livres nas vias areas. A presena de ligaes estveis,

como as pontes dissulfeto e as ligaes O-glicosdicas, ao lado de interaes

inicas de menor estabilidade, preenchem os requisitos moleculares para a

existncia de um componente elstico (ligaes estveis) e um deformvel,

viscoso, representado pelas ligaes menos estveis (King et al., 1974). Esses

mesmos autores demonstraram que outras macromolculas que apresentam

cross-linking so perfeitamente transportveis pelo epitlio ciliado. Outros

fatores como o grau de hidratao do muco, teor de imunoglobulinas, o pH e a

composio inica tambm interferem na conformao espacial das molculas

de glicoprotenas e, consequentemente em seu comportamento mecnico

(King, 1980; Saldiva, 1990).

O comportamento mecnico ideal do muco respiratrio o que

prescreve a existncia de um componente elstico, capaz de transferir a

energia cedida pelo clio camada de muco, ao lado de um componente

deformvel, que pode se alterar e propiciar o deslocamento do filme de

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muco diante da energia a ele transmitida e com consequente perda dessa

energia (Sleigh et al., 1988).

Portanto, o muco respiratrio no pode ser caracterizado somente

como um lquido ou um slido, mas uma combinao de ambos. O slido

responde a uma fora com deformao totalmente recupervel aps a

remoo do stress. O lquido se deforma continuamente enquanto durar a

fora, porm, aps sua remoo, o fluxo cessa e no h recuperao desse

deslocamento. Por ser um material viscoelstico, a deformao do muco

sofre um retardo em relao forca aplicada. A magnitude dessa defasagem

indica a proporo do comportamento viscoso e elstico (King,1980).

O controle da secreo da hipofase sol de importncia fundamental

para o correto funcionamento do transporte ciliar, de forma a manter os clios

em contato ideal com a epifase gel. Um aumento da espessura da hipofase

sol promoveria o desacoplamento entre o muco e o clio. Por outro lado, uma

hipofase sol de espessura reduzida tambm levaria a prejuzos do transporte

ciliar, por interferncia mecnica do clio no seu retorno configurao inicial

aps o batimento efetivo (Satir e Sleigh, 1990; Welsh, 1988) (Figura 10).

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FONTE: Modificado de Morgenroth, 1988.

Figura 10 Muco recobrindo o epitlio respiratrio.Os clios esto

envoltos pela camada sol (no visualizada) e no topo da figura pode-se ver a camada gel recobrindo a camada sol. Eletromicrografia de varredura: 12.000x.

A regulao da quantidade de fluido da hipofase sol depende das

clulas epiteliais (em especial das clulas ciliadas), que possuem a

capacidade tanto de secretar como de absorver lquido, utilizando a energia

celular para movimentaes inicas contra um gradiente eletroqumico. As

clulas epiteliais so polarizadas anatmica e funcionalmente, o que

fundamental para que exeram suas funes (Boucher, 1994a; Boucher,

1994b). Essas clulas possuem uma membrana apical que se mantm em

contato com a luz e uma membrana baso-lateral, que mantm contato com o

espao intersticial e vasos sanguneos. As clulas so alinhadas lado a lado

e so separadas por um espao intercelular. Prximo ao pice o espao

intercelular estreitado por junes firmes, as tight junctions, que

determinam uma difuso seletiva do espao intercelular (Boucher, 1994a;

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Boucher, 1994b). O transporte de solutos atravs de epitlios gera

gradientes osmticos que movimentam a gua, o que ocorre aparentemente

atravs dos espaos intercelulares (Welsh, 1988).

Existem dois mecanismos bsicos de transporte inico atravs do

epitlio respiratrio: um que determina a capacidade de absoro de lquido

e outro oposto, que determina a secreo de lquidos (Boucher, 1994a;

Boucher, 1994b; Welsh, 1987).

A absoro de lquidos efetuada atravs de um canal especfico na

membrana apical que facilita a entrada de sdio, a favor do gradiente

eletroqumico. Uma vez dentro da clula, o sdio sair pela membrana

basolateral, atravs da bomba Na-K-ATPase. A passagem do Na provoca

um desequilbrio de cargas, gerando energia para a passagem passiva de

Cl (Barroso et al., 1992). (Figura 11)

FONTE: Modificado de Wine, 1999.

Figura 11 Mecanismos de absoro e secreo de ons, gua e eletrlitos do epitlio respiratrio (TJ: tight-junction).

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A secreo de lquidos ocorre a partir de um mecanismo de co-

transporte que, ao colocar na membrana basolateral Na a favor de um

gradiente eletroqumico, acopla a entrada de K e Cl . O Na e o K saem

novamente pelo mesmo plo, atravs da Na-K-ATPase e por um canal

especfico para o K , respectivamente. Por outro lado, o Cl sai pela

membrana apical atravs de um canal especfico de Cl (Barroso et al.,

1992; Boucher, 1994a; Boucher, 1994b) (Figura 11).

Os canais inicos, alm de regularem a quantidade de lquido na

camada sol, provavelmente regulam o grau de hidratao do muco,

modulando suas propriedades reolgicas (Gastaldi et al., 2000; Verdugo,

1990).

1.4 Hiptese e justificativa

A hiptese do presente estudo baseia-se no fato de que as foras

fsicas geradas pela ventilao mecnica possam afetar diretamente o

desempenho do aparelho mucociliar. Justificamos o desenvolvimento deste

estudo baseados no fato de que o impacto da VM sobre esse sistema no

est ainda completamente esclarecido na literatura cientifica. Sendo o

aparelho mucociliar um dos mais importantes mecanismos de defesa

pulmonar, o conhecimento desse impacto pode trazer repercusses no

manejo de pacientes sob ventilao mecnica.

2 OBJETIVO

O B J E T I V O


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O objetivo do trabalho foi avaliar a repercusso das foras envolvidas

na ventilao mecnica atravs de diferentes mecanismos de LPIV sobre o

sistema mucociliar pela anlise funcional e histopatolgica desse aparelho.

3 MTODOS

M T O D O S


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Esse projeto foi aprovado pela Comisso de tica em Pesquisa do

Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So

Paulo.

Foram utilizados vinte e sete coelhos da linhagem Nova Zelndia

(albinos, machos, adultos), provenientes do Biotrio Central da Faculdade de

Medicina da Universidade de So Paulo. Os animais foram alimentados e

mantidos de acordo com normas j padronizadas, havendo controle de

temperatura, umidade e ciclo de luz adequada para essa espcie

(Weisbroth, Flatt e Kraus, 1974). Todos os animais foram pesados no incio

do experimento, a fim de preparar a anestesia e avaliar os valores de

ventilao mecnica de acordo com os objetivos do experimento.

Os animais foram randomicamente divididos em quatro grupos,

sendo: seis animais no grupo de baixo volume (BV), onde foi realizada

ventilao mecnica com menor volume corrente; oito animais no grupo de

leso pulmonar induzida por ventilao mecnica por mecanismo de alta

presso (AP); sete animais no grupo de leso pulmonar induzida por

ventilao mecnica por mecanismo de alto volume corrente (AV) e seis

animais para o grupo no-ventilado (Sham).

No incio de cada experimento os coelhos receberam medicao pr-

anestsica intramuscular composta por Acepromazina (0,1 mg/Kg) e

M T O D O S


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Cloridrato de Cetamina (2,5 mg/Kg). Aps sedao inicial foram obtidos os

acessos auriculares (venoso e arterial). Os sinais vitais (oximetria,

frequncia cardaca e presso arterial mdia) foram monitorados atravs de

monitor Portal DX 2020 (Dixtal Biomdica Indstria e Comrcio Ltda

Brasil).

Aps anestesia os animais foram posicionados em decbito dorsal em

mesa cirrgica com foco de luz adequado e ento submetidos

traqueotomia, com colocao de cnula de polietileno com dimetro interno

mdio de 3,5 mm, ajustada perfeitamente luz traqueal de maneira que no

houvesse vazamentos. A seguir, verificou-se, atravs da ausculta, se os

pulmes estavam ventilando bilateralmente e simetricamente e ento a

cnula foi fixada parede da traquia com o auxlio de fios de algodo 2-0.

Em seguida foi iniciada a manuteno anestsica administrada em

bomba de infuso e infundida pelo acesso venoso auricular, sendo composta

por Midazolam (0,1 mg/Kg), Cloridrato de Cetamina (1,8 mg/Kg/h),

Acepromazina (0,1 mg/Kg/h) e Brometo de Pancurnio (0,2 mg/Kg/h),

diludos em 20 ml de soluo fisiolgica. O Anexo A exemplifica a planilha

utilizada para clculo do protocolo de anestesia de acordo com o peso de

cada animal. Trata-se de protocolo padro desenvolvido anteriormente pela

equipe do LIM 09 - Departamento de Crdio-Pneumologia. Paralelamente

um pequeno fragmento da traquia anterior cnula de traqueotomia foi

retirado para avaliao imediata do transporte mucociliar e da frequncia de

batimento ciliar naquele tecido biolgico.

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Para controle de diurese os coelhos foram submetidos sondagem

vesical com utilizao de sonda Foley (8 Fr), previamente lubrificada com

Cloridrato de Lidocana a 2%.

3.1 Protocolos de ventilao mecnica

Os animais dos grupos BV, AP e AV foram ventilados inicialmente no

modo volume controlado com o ventilador mecnico Newport Modelo e500

Wave Ventilator (Newport Medical Instruments Costa Mesa, CA 92627

USA), pelo perodo de trs horas e meia, sendo os trinta minutos iniciais

despendidos para a acomodao no ventilador mecnico e estabilizao dos

sinais vitais (frequncia cardaca de 240 a 300 batimentos por minuto,

presso arterial mdia ao redor de 70 mmHg, oximetria de pulso acima de

95% e capnometria entre 45% e 35%) (Kozma et al., 1974). Durante os

primeiros trinta minutos de ventilao os animais foram ventilados com

volume corrente (VC) de 8 ml/kg de peso corpreo, fluxo de 2 L/min, presso

expiratria final positiva (PEEP) de 5 cmH2O, frequncia respiratria (FR) de

30 rpm e com frao inspirada de oxignio (FiO2) de 40% (Kozma et al.,

1974; Broccard et al., 1999; Sinclair et al., 2002; Kotani et al., 2004a; Kotani

et al., 2004b; Lpez-Aguilar et al., 2005; Meinhardt et al., 2005). Aps esses

primeiros trinta minutos para estabilizao o protocolo de ventilao

especfico de cada grupo foi instaurado.

Os coelhos sorteados para o grupo BV foram mantidos no modo

volume controlado com volume corrente (VC) de 8 ml/kg de peso corpreo,

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fluxo de 2 L/min, PEEP de 5 cmH2O, frequncia respiratria (FR) de 30 rpm

e com frao inspirada de oxignio (FiO2) de 40%. Aqueles sorteados para o

grupo AV foram ventilados com VC de 16 ml/kg de peso corpreo, com fluxo

de 2 L/min, PEEP de 5 cmH2O, FR de 30 rpm e com FiO2 de 40% ou o

necessrio para manter SaO2 mnima de 90%. Os animais sorteados para o

grupo AP tiveram o modo ventilatrio modificado para presso controlada e

foram ventilados com presso inspiratria controlada de 30 cmH2O, PEEP

de 12 cmH2O (ou o suficiente para manter o VC de 8 ml/Kg), FR de 30 rpm e

com FiO2 de 40% ou o necessrio para manter uma saturao arterial da

oxihemoglobina (SaO2) mnima de 90%. (Meinhardt et al., 2005; Lpez-

Aguillar et al., 2005; Suzuki et al., 2004; Maeda et al., 2004; Simonson et al.,

2004; Kotani et al., 2004a; Kotani et al., 2004b; Sinclair et al., 2002; Suh et

al., 2002).

Durante o perodo de ventilao mecnica, em caso de quadro de

hipotenso do animal, com presso arterial mdia inferior a 50 mmHg, era

feita reposio volmica controlada pelo peso do animal com soro fisiolgico

a 0,9 %. Os gases inspirados tambm foram aquecidos e umidificados em

sistema de aquecimento de gua temperatura de 33 C e umidade relativa

de 100% (termo higrmetro digital MTH-1380 Minipa Ind. e Com. Ltda

Brasil) durante todo o perodo de ventilao mecnica (Nakagawa et al.,

2000; Nakagawa et al., 2004; Eckerbom et al., 1991).

Foram acompanhados tambm os valores de gasometria, com coleta

de sangue arterial em trs tempos, a saber: aps os trinta minutos de

estabilizao no ventilador mecnico, uma hora e meia aps instalao do

M T O D O S


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protocolo de ventilao mecnica e ao final do protocolo de ventilao. Para

a realizao da gasometria foi coletado 0,5 ml de sangue arterial em seringa

preparada (PicoTM 50 - Radiometer Copenhagen) e a anlise dos gases

sanguneos foi realizada imediatamente aps coleta no aparelho de

Gasometria ABL 835 Flex Radiometer Copenhagen, Dinamarca.

As medidas de mecnica respiratria foram coletadas atravs do

sensor para neonato (CO2/Flow Sensor Neonatal Novametrix Medical

Systems Inc. USA) ligado ao equipamento NICO2TM Dixtal. Os sinais

analgicos foram gravados imediatamente antes da instalao do protocolo

de ventilao mecnica e ao final do experimento, em um microcomputador

(Pentium III-600) atravs de um programa para captao e anlise dos

dados feito em linguagem LabView 6.0 (National Instruments), desenvolvido

especificamente para a monitorizao respiratria.

Os animais selecionados para o grupo Sham foram, aps

procedimento inicial semelhante aos demais grupos relativos preparao

anestsica e traqueotomia, foram ventilados em volume controlado pelo

perodo de 10 minutos com volume corrente (VC) de 8 ml/kg de peso

corpreo, fluxo de 2 L/min, presso expiratria final positiva (PEEP) de 5

cmH2O, frequncia respiratria (FR) de 30 rpm (Kozma et al., 1974) e com

frao inspirada de oxignio (FiO2) de 40%, tempo esse necessrio para a

coleta de dados vitais e amostra de muco, sendo em seguida sacrificados

pelo mtodo de exsanguinao. Os animais dos demais grupos igualmente

foram sacrificados pelo mtodo de exsanguinao ao trmino do perodo de

exposio ao protocolo de ventilao mecnica.

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Em seguida ao sacrifcio, em todos os grupos os pulmes ainda

conectados cnula de traqueotomia foram mantidos em presso positiva

contnua (CPAP) de 20 cmH20 e, aps remoo em bloco da caixa torcica

por esternotomia, o pulmo direito foi clampeado com pina Kelly

imediatamente abaixo da interseco do brnquio fonte direito com a

traquia, separado do pulmo esquerdo e mergulhado em um Becker com

paraformaldedo 4% em tampo fosfato para posterior estudo em

microscopia de luz. Um fragmento da traquia distal foi igualmente

mergulhado em paraformaldedo 4% em tampo fosfato para estudo em

microscopia de luz. Pequenas pores da traquia distal foram fixadas com

glutaraldedo a 2% para posterior anlise em microscopia eletrnica de

transmisso e uma pequena amostra tambm separada para avaliao

imediata da funo mucociliar (Figura 12).

Figura 12 Esquema demonstrando as reas da traquia dos coelhos onde foram coletadas as amostras de muco e amostras de tecido traqueal para avaliao histopatolgica e da funo mucociliar.

M T O D O S


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3.1.1 Critrios para definio de LPIV

Sabe-se que existem basicamente trs mecanismos de leso

pulmonar induzida pela ventilao mecnica: volutrauma (pela expanso

alveolar secundria ao uso de alto volume corrente, com ou sem alta

presso), atelectrauma (pelo repetitivo recrutamento e no-recrutamento

alveolar) e biotrauma (secundrio ao aumento de citocinas pela leso

mecnica no tecido pulmonar). No entanto, a contribuio relativa de cada

um desses mecanismos ainda no conhecida e os critrios para definio

da LPIV ainda so inespecficos (Carney et al., 2005; Dreyfuss e Saumon,

1998). Alteraes no balano hdrico, aumento da permeabilidade endotelial

e epitelial, alm de severos danos teciduais entre outros so descritos na

LPIV. Assim, para efeito deste estudo, consideramos como indicativos da

ocorrncia da leso induzida pela ventilao mecnica a presena de

aumento do nmero de clulas polimorfonucleares no parnquima pulmonar,

alteraes macroscpicas do pulmo, alteraes hemodinmicas e alterao

da mecnica respiratria (Dreyfuss e Saumon, 1998; Carney et al., 2005;

Wolthuis et al., 2009).

3.2 Avaliao da funo mucociliar

As amostras de muco respiratrio foram coletadas na traquia, na

poro imediata ao final da cnula de ventilao mecnica, atravs de um

pequeno tubo cilndrico flexvel conectado a uma seringa (Figura 12). Esta

M T O D O S


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coleta foi efetuada em dois momentos: ao incio do protocolo de ventilao

mecnica (ou seja, imediatamente aps os trinta minutos de estabilizao

inicial) e ao trmino da exposio dos animais (ou seja, aps mais trs horas

de ventilao mecnica). Gentilmente, o muco foi aspirado e colocado em

um tubo plstico tipo Eppendorf, submerso em vaselina lquida para evitar a

desidratao, identificado e armazenado em congelador -70 C, para anlise

posterior.

3.2.1 Transporte mucociliar in situ

O transporte mucociliar in situ foi verificado em dois momentos:

imediatamente aps a traqueotomia um pequeno fragmento da traquia foi

retirado da poro anterior cnula; ao final do protocolo, a traquia foi

dissecada e uma poro cartilaginosa prxima a Carina foi extrada. Em

ambas as situaes a velocidade do transporte mucociliar no tecido traqueal

foi prontamente avaliada, sendo aquele tecido biolgico mantido

temperatura ambiente dentro de uma cmara de acrlico com 100% de

umidade, garantida por uma nebulizao ultra-snica de soluo salina (NaCl)

(Macchione et al., 1995). A velocidade de transporte ciliar foi aferida pela

observao direta de carbono coloidal (tinta nanquim filtrada em papel de

filtro comum) colocado sobre o epitlio ciliado da traquia (aproximadamente

1 l). O deslocamento do fio de carbono coloidal pelo percurso de 1,2 mm

foi visualizado atravs de uma lupa estereoscpica (Zeiss) equipada com

uma objetiva com aumento de 0,8 vezes, com ocular reticulada e com

M T O D O S


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aumento de dez vezes. O tempo de progresso tambm foi cronometrado,

sendo o valor final relatado como distncia percorrida versus tempo (mm/s)

(Rivero et al., 2001).

3.2.2 Frequncia do batimento ciliar

Para a mensurao da frequncia de batimento ciliar no epitlio da

traquia utilizamos um aparelho composto pr uma cmera filmadora (Sony-

3CCD - color vdeo cmara), acoplada a um microscpio tico (Olympus BX

50), sob o qual foi colocada uma pequena poro cartilaginosa da traquia.

Igualmente ao mencionado no item 3.2.1 a frequncia do batimento ciliar in

situ foi verificada em dois momentos. Em ambas as situaes a frequncia

do batimento ciliar no tecido traqueal foi prontamente avaliada pela tcnica

descrita a seguir. Um estroboscpio emitindo flashes de luz a uma

frequncia inicial de 30.30 Hertz foi direcionado para a superfcie do epitlio.

A imagem do epitlio, iluminada pela luz estroboscpica e capturada pela

cmera filmadora, foi transmitida para um monitor que permitiu, ento, uma

perfeita observao do epitlio e do batimento ciliar. Observando o epitlio,

diminuamos a frequncia da luz estroboscpica at no conseguirmos ver o

movimento dos clios (o equipamento possui um programa de computador

que permite controlar a frequncia da luz emitida), significando que o

batimento ciliar estava em concordncia com a frequncia da luz emitida

pelo estroboscpio. A frequncia foi ento anotada e o processo repetido por

trs vezes em reas diferentes do epitlio.

M T O D O S


46

3.2.3 Transportabilidade pelo mtodo palato de r

O mtodo de anlise de transporte do muco em palato de r

classicamente aceito como mtodo in vitro para determinar a velocidade de

transporte do muco em epitlio ciliado (King e Festa, 1998; Rubin et al.,

1990b). Utilizando-se hipotermia como anestesia, a Rana catesbiana adulta

foi rapidamente decapitada, a sua mandbula foi desarticulada e o palato

removido atravs do corte completo da juno da faringe posterior e esfago

at a pele das costas. O palato removido foi ento colocado sobre uma gaze

saturada com uma mistura de ringer e gua destilada na proporo de 1:1

(Ringer) em um recipiente de vidro, vedado com um filme plstico e ento

armazenado em refrigerador a 4 C por dois dias. No terceiro dia uma

amostra de muco foi coletada atravs da extremidade posterior do palato

com estilete e imediatamente imerso em leo mineral para evitar a

desidratao. Todos os experimentos foram realizados a partir do terceiro

dia para a mxima remoo do muco da r, mantendo-se a integridade da

atividade ciliar (Macchione et al., 1995; Rubin, 1998). Este muco foi ento

coletado para servir como controle, em relao ao muco a ser testado. Durante

os procedimentos o palato de r foi mantido temperatura ambiente, dentro

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