Vitaminok és karotinoidok meghatározása tojássárgájából mátrix ...
Transcript of Vitaminok és karotinoidok meghatározása tojássárgájából mátrix ...
⎯⎯⎯ Tudományos Diákköri Dolgozat ⎯⎯⎯
SOLYMOS EMESE
Vitaminok és karotinoidok meghatározása tojássárgájából mátrix szilárd fázisú
diszperziós technikával
Témavezetők: Dr. Eke Zsuzsanna Dr. Torkos Kornél
⎯⎯⎯ Eötvös Loránd Tudományegyetem ⎯⎯⎯ ⎯⎯ Természettudományi Kar ⎯⎯
⎯ Budapest, 2007 ⎯
Tartalomjegyzék
1. CÉLKITŰZÉS..................................................................................................................................................... 2
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............................................................................................................................... 3
2.1. VITAMINOK ÉS KAROTINOIDOK ÁLTALÁNOS BEMUTATÁSA............................................................................ 3 2.1.1. Vitaminok............................................................................................................................................... 3 2.1.2. Karotinoidok.......................................................................................................................................... 6 2.1.3. A karotinoidok szerepe az énekesmadarak fajfenntartásában ............................................................... 8
2.2. A TOJÁS ÖSSZETÉTELE.................................................................................................................................. 9 2.3. MINTA-ELŐKÉSZÍTÉSI MÓDSZEREK BEMUTATÁSA....................................................................................... 10
2.3.1.1. Lehetséges minta előkészítések szabad vitaminok és karotinoidok meghatározására ............... 11 2.4. MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSRA ALKALMAS ANALITIKAI MÓDSZEREK........................................................ 14
2.4.1. Kromatográfiás módszerek .................................................................................................................. 14 2.4.1.1. Vékonyrétegkromatográfia ....................................................................................................... 14 2.4.1.2. Gázkromatográfia...................................................................................................................... 14 2.4.1.3. Nagy hatékonyságú kromatográfia............................................................................................ 15
2.4.2. Detektálási módszerek ......................................................................................................................... 16 2.4.2.1. Fluoreszcens spektrofotometria................................................................................................. 16 2.4.2.2. Tömegspektrometria ................................................................................................................. 17 2.4.2.3. UV-VIS spektrofotometria........................................................................................................ 17 2.4.2.4. Diódasoros detektálás ............................................................................................................... 18
3. KÍSÉRLETI RÉSZ............................................................................................................................................ 19
3.1. STANDARD OLDATOK ÉS A BELSŐ STANDARD MEGVÁLASZTÁSA .................................................................. 19 3.2. KROMATOGRÁFIÁS KÖRÜLMÉNYEK ............................................................................................................ 20
3.2.1. Optimált paraméterek meghatározása................................................................................................. 20 3.2.1.1. Az eluens megválasztása........................................................................................................... 20 3.2.1.2. Oszloptermosztát hőmérsékletének optimálása......................................................................... 20 3.2.1.3. Detektálási paraméterek meghatározása.................................................................................... 21
3.3. MINTA-ELŐKÉSZÍTÉSI MÓDSZER KIVÁLASZTÁSA ÉS OPTIMÁLÁSA ................................................................ 23 3.3.1. Oldószeres extrakció............................................................................................................................ 23
3.3.1.1. Extrakciók számának meghatározása ........................................................................................ 23 3.3.2. Az MSPD minta-előkészítés ................................................................................................................. 24
3.3.2.1. A töltet mennyiségének optimálása........................................................................................... 25 3.3.2.2. Oldószer kiválasztása ................................................................................................................ 25 3.3.2.3. Elúciós térfogat optimálása ....................................................................................................... 26 3.3.2.4. Extrakciós idő optimálása ......................................................................................................... 27
3.4. A KIFEJLESZTETT MÓDSZER ........................................................................................................................ 28 3.5. A MÓDSZER ANALITIKAI TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐINEK VIZSGÁLATA........................................................... 29
3.5.1. Specifikusság ....................................................................................................................................... 29 3.5.2. Érzékenység ......................................................................................................................................... 31 3.5.3. Linearitás............................................................................................................................................. 32 3.5.4. Torzítatlanság...................................................................................................................................... 33 3.5.5. Precizitás ............................................................................................................................................. 34 3.5.6. Stabilitás.............................................................................................................................................. 35
3.5.6.1. Referencia oldat stabilitása........................................................................................................ 35 3.5.6.2. Mintaoldat stabilitása ................................................................................................................ 36
3.5.7. Kimutatási határ.................................................................................................................................. 36 3.5.8. Meghatározási határ............................................................................................................................ 37
4. MÓDSZER ALKALMAZÁSA VALÓS MINTÁKRA................................................................................... 39
5. ÖSSZEFOGLALÁS .......................................................................................................................................... 40
6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS........................................................................................................................... 41
7. FÜGGELÉK ...................................................................................................................................................... 42
7.1. VIZSGÁLT VEGYÜLETEK ............................................................................................................................. 42 7.2. SPECIFIKUSSÁG VIZSGÁLATA ...................................................................................................................... 45 7.3. LINEARITÁS ÉS ÉRZÉKENYSÉG VIZSGÁLATA ................................................................................................ 51 7.4. TORZÍTATLANSÁG VIZSGÁLATA.................................................................................................................. 52
8. IRODALOMJEGYZÉK ................................................................................................................................... 53
1
1. Célkitűzés
A biológiai hatóanyagok csoportjába tartozó vitaminok és karotinoidok
jelenlétének kimutatása, illetőleg mennyiségük meghatározása a korszerű táplálkozás
biztosításának érdekében mindenképpen szükséges minőségellenőrző feladat.
Előfordulásuk, metabolitjaik, valamint mennyiségi megoszlásuk ismerete az állati és
növényi sejtekben egyaránt jelentős az orvosi kutatás, a klinikai gyakorlat, a gyógyászat,
de a mezőgazdaság és az élelmiszeripar számára is. A vitaminok a természetes
anyagokban kis koncentrációban fordulnak elő, többnyire kötött formában, és olyan
kísérő anyagokkal együtt, amelyek a meghatározásuk biztonságát és pontosságát
csökkentik. A vitaminok analitikája éppen ezért bonyolult feladat. A használatban lévő
nagyszámú módszer azt mutatja, hogy tökéletesen egyik sem felel meg az előírt
követelményeknek, mint megbízhatóság, pontosság, gyorsaság és gazdaságosság.
Az ELTE Állatrendszertani és Ökológiai Tanszéke cinke tojássárgájában lévő
antioxidáns hatású karotinoidok és vitaminok koncentrációjának vizsgálatát tűzte ki
célul, annak kiderítése érdekében, hogy mennyire tudják befolyásolni a tojók a tojások
minőségén keresztül fiókáik életkilátásait. Ennek kapcsán egy tudományos
együttműködés keretében az Elválasztástechnikai Kutató-Oktató Laboratóriumot kérte
fel az analitikai feladat elvégzésére. Tekintettel a kis mintamennyiségre és a minták nagy
számára munkám során célul tűztem ki, hogy a lehető leggyorsabb és a
követelményeknek leginkább megfelelő minta-előkészítési és kromatográfiás eljárást
dolgozzam ki.
2
2. Irodalmi áttekintés
2.1. Vitaminok és karotinoidok általános bemutatása
2.1.1. Vitaminok
A vitaminok olyan biológiailag aktív szerves vegyületek, melyeket az emberi
szervezet általában nem tud előállítani, energiát nem szolgáltatnak, de fontos szerepet
töltenek be az anyag- és energiaforgalom lebonyolításában.
Egyes vitaminok szerkezetileg hasonló anyagokból, ún. provitaminokból
keletkeznek, például az A-vitamin esetén a karotinoidok (1. ábra) [1].
A-vitamin (retinol)
β-karotin
1. ábra: Az A-vitamin és a β-karotin szerkezeti képlete
Kémiailag egymástól jelentősen eltérnek, ezért csoportosításuk oldhatóságukon
alapszik, így jellegüket és funkcionális szerepüket nem veszik figyelembe (1. Táblázat).
Vízoldható vitaminok a B- és C-vitaminok. A C-vitamin változatlan formában hasznosul,
míg a B-vitaminok kémiai módosítást szenvednek, és koenzimként funkcionálnak [1]. Az
A-, D-, E-, K-vitaminok a zsíroldható vitaminok csoportjába tartoznak (2. Táblázat).
3
Vitamin Koenzim Tipikus reakció Avitaminózis
B1 (Timain) Tiamin-pirofoszfát Aldehid-transzfer
Beriberi (súlycsökkenés,
szívproblémák,
idegrendszeri zavarok)
B2 (Riboflavin) Flavin-adenin-
dinukleotid (FAD) Oxidáció-redukció Szájsebek, bőrgyulladás
B6 (Piridoxin) Piridoxal-foszfát
Aminocsoport-transzfer (az
aminosavak bioszintézise és
lebontása során)
Depresszió, zavartság,
rángatózás
Nikotinsav
(niacin)
Nikotinamid-adenin-
dinukleotid (NAD+) Oxidáció-redukció
Pellagra (bőrgyulladás,
depresszió, hasmenés)
Pantoténsav Koenzim A (CoA) Acil-csoport transzfer Magas vérnyomás
H (Biotin) Biotin-lizin komplexek
(biocitin)
ATP-függő karboxilezés és
karboxilcsoport transzfer
Vörös foltok a
szemöldök körül,
izomfájdalom, álmos
fáradtság (ritka)
Folsav Tetrahidrofolát Egy szénatom (C1)
transzfer, timin szintézis
Vérszegénység,
fejlődési (magzati)
idegtubulus károsodás
B12 5’-Dezoxiadenozil-
kobalamin
Metilcsoport szállítása,
intramolekuláris
átrendeződések
Vérszegénység, vészes
vérszegénység,
metilmalonsav acidózis
C (aszkorbinsav) - Antioxidáns
Skorbut (duzzadt és
vérző fogínyek, bőr
alatti bevérzések)
1. Táblázat: A vízoldható vitaminok csoportosítása
Vitamin Funkció Avitaminózis
A Antioxidáns Spermiumtermelés gátlása; sérülések az izmokban és
idegekben (ritkán)
D Kalcium- és foszfátanyagcsere
szabályozása
Angolkór (rachitis): csontdeformációk, hiányos
növekedés, csontlágyulás (felnőtteknél); puha
hajlékony csontok
E A látásban, növekedésben és
szaporodásban játszik szerepet
Szürkületi vakság, szaruhártya-károsodás, a légzési és
gyomor-bél traktus károsodása
K Véralvadás Bőralatti vérzés
2. Táblázat: A zsíroldható vitaminok (lipovitaminok) csoportosítása
4
Kühnau az élettani hatás alapján két nagy csoportot különböztet meg, a
prosztetikus vitaminokat és az induktív vitaminokat. Prosztetikus vitaminoknak tekinti
azokat a vitaminokat, amelyek a szervezetben fehérjéhez kapcsolódva enzimként
működnek, induktív vitaminoknak pedig azokat, amelyek nem minden élő szervezet
számára nélkülözhetetlenek, elsősorban a felsőbbrendű állati szervezetekben töltenek be
még teljesen fel nem derített szerepet [2]. A prosztetikus és az induktív vitaminok eltérő
tulajdonságait a 3. Táblázat mutatja be.
Prosztetikus vitaminok Inuktív vitaminok
Csoporttagok B- és K-vitaminok A-, C-, D-, E-vitaminok
Természetes előfordulásuk Általános Csak bizonyos sejtekben és
magasabb rendű szervezetekben
Az átépítési (intermedier)
anyagcserében nélkülözhetetlenek
Csak sajátos feladatok teljesítésében
vesznek részt
Létfontosságúak Nem feltétlenül létfontosságúak Szerepük
Koenzimek részei Nem vesznek részt a koenzimek
felépítésében
Szöveti koncentrációjuk Állandó Erősen változó
Előfordulásuk a vérben Főképp az alakos elemekben Leginkább a plazmában
Szintézisük a szervezeten
belül
Egyeseket a bélbaktériumok állítják
elő A bélben nem szintetizálódnak
Működésük gátlásának
lehetősége
Minden vitamin antivitaminja
ismeretes Antivitaminjaik nem ismertek
Vitamin-túladagolás
(hipervitaminózis) Valódi hipervitaminózis nem ismert Túladagolás lehetősége fennáll
3. Táblázat: Vitaminok csoportosítása élettani hatás alapján
A tudományok fejlődésével egyre több induktívnak tartott vitamin prosztetikus
sajátságai váltak bizonyítottá (A-, C-, E-vitaminok). Az a tény is megállapításra került,
hogy az induktív vitaminok csoportjába tartozó hatóanyagok szerepét több, hasonló
szerkezetű vegyület is képes ellátni, melyeket „izotel” vagy „vitamer” anyagoknak
neveznek [2].
5
2.1.2. Karotinoidok
A karotinoidok zsírban oldódó természetes eredetű pigmentek. A karotinoid
elnevezés a sárgarépa latin nevéből ered (Daucus carota). A nyolc izoprén egységből
felépülő karotinoidok közös szerkezeti sajátossága a folytonos konjugációt alkotó polién
struktúra. Eddig kb. 600-féle karotinoidot azonosítottak, melyek közül a természetben
leggyakrabban és legnagyobb mennyiségben a β-karotin fordul elő. A karotin három
hasonló szerkezetű vegyület, az α-, β- γ- karotin keveréke (2. ábra).
α-karotin
β-karotin
2. ábra: Az α-karotin és β-karotin szerkezeti képlete
Hasonló szerkezetű a paradicsom piros színanyaga a likopin (3. ábra). Mindkét
láncvége nyitott, de gyűrűzáródással α- ill. β-ionon gyűrűt alkothat, hasonlóan a
karotinizomerek láncvégeihez.
Likopin
3. ábra: A likopin szerkezeti képlete
6
A karotinoidok a növény és állatvilágban nagyon elterjedtek, különösen nagy
mennyiségben fordul elő néhány oxigéntartalmú származékuk, például a lutein,
zeaxanthin és a β-kriptoxantin [2].
A karotinoidok szoros értelemben nem tekinthetők vitaminnak, de sokuk szolgál
az A-vitamin előanyagaként. Az emberi szervezet a β-karotinból tud legkönnyebben A-
vitamint előállítani. Az A-provitamin karotinoidok, amelyek legfontosabb képviselői az
α-, β-, γ-karotin és a kriptoxantin, feltételezhetően a bélfalban alakulnak át a következő
reakció értelmében:
C40H56 + 2 H2O 2 C20H29OH ⎯⎯⎯ →⎯dioxigenáz
β-karotin retinol
A keletkező vitamin védelmét a megfelelő mennyiségben szükséges természetes
antioxidánsok, a tokoferolok jelenléte biztosítja [2].
A karotinoidoknak eleinte csak provitamin szerepet tulajdonítottak, azonban ma
már bizonyított az oxigén- és elektron-szállítási, illetve peroxid-képző funkciójuk.
Daganatos betegségek széles körében végeztek tanulmányokat az egyes karotinoidok
preventív hatásának kimutatására. Feltételezhető, hogy hatással vannak a sejtek
differenciálódására és burjánzására. Mivel a daganatképződés alapvetően a sejtek
életműködésének osztódási zavara, ezért a sejtek retinoid és karotinoid tartalma
befolyásolhatja a daganatképződésre való hajlamot. Kutatások azt mutatják, hogy az
egyes daganattípusoknál más-más vegyület bizonyult hatásosnak [3].
Az egészséges emberi szem rendelkezik a szervezet saját „antioxidáns védelmi
rendszerével”. Ennek részei a sárgafoltban megtalálható lutein és a zeaxantin, az
antioxidáns hatású C és E vitamin, valamint az antioxidáns enzimek alkotóelemei, a cink
és a szelén. Bizonyos körülmények között a lutein és zeaxantin kiszűrik a káros
sugarakat. Az idő előrehaladtával azonban ezen karotinoidok koncentrációja csökken a
szemben, így helyes étrenddel pótolni kell őket. A karotinoidok azáltal, hogy
hatástalanítani tudják az UV-sugárzás hatására keletkezett szabadgyököket, bőrünk
védelmét is elősegítik a napsugárzással szemben [3].
Az egyes karotinoidok forrásai nagyrészt fedik egymást. β-karotin legnagyobb
mennyiségben a sárga, narancssárga, sötétzöld zöldségekben és gyümölcsökben fordul
elő. Ilyen például a kelkáposzta, sárgarépa, spenót, tök, sárgabarack, sárgadinnye és az
őszibarack. Lutein és zeaxanthin forrásai a kelkáposzta, tök, spenót, endívia és a zeller. A
narancs, mandarin, őszibarack és a papaya kriptoxantinban gazdag [4].
7
2.1.3. A karotinoidok szerepe az énekesmadarak fajfenntartásában
A kilencvenes évek kutatásai azt mutatták, hogy lehetőség van a tojó számára a
szülői ráfordítás változtatására a tojások minőségén keresztül is. Hubert Schwabl
kimutatta, hogy a kanári tojók tojásaikba eltérő mennyiségű tesztoszteront juttathatnak,
amivel bizonyos mértékig szabályozni tudják utódaik életkilátásait [5]. A magas
tesztoszteron koncentrációjú környezetben fejlődő fiókák erőteljesebbek voltak
társaiknál, élénkebben kérték a táplálékot, és végeredményben nagyobb kirepülési súlyt
értek el, mint társaik.
Általános jelenség a gerincesek körében, hogy az ikrák, a peték és a tojások sárga
színűek, ami a karotinoid tartalmuk következménye. Kutatások bizonyítják, hogy a
madártojások karotinoid tartalma erősen függ a táplálékban lévő karotinoidok
hasznosíthatóságától. Azt is kimutatták, hogy ezek a molekulák kiváló szabadgyökfogók,
és megakadályozzák a fejlődő embrió biológiailag aktív membránjainak károsodását az
agyban és a májban [6]. A tojássárgájában lévő karotinoidok mennyisége és minősége
tehát, hasonlóan a tesztoszteronhoz, befolyásolhatja az embrió további életkilátásait.
Korábbi vizsgálatokból már kiderült, hogy a karotinoid-felvétel energiaigényes folyamat,
illetve a tojónak a rendelkezésére álló karotinoid-mennyiséget meg kell osztania saját
élettani folyamatai és az embriók szükségletei között. A fészekalj tojásainak karotinoid
mintázata tehát egy komplex folyamat eredménye. Fontos szerepet tölt be a tojó
táplálékszerző képessége, egészségi állapota, tapasztalata és feltételezhetően a szociális
környezet is. Török János és munkatársainak vizsgálatai megerősítették, hogy a kis
szárnyfoltú hímek fészekaljaiban a tojássárgája szignifikánsan vörösebb színárnyalatú,
mint a nagy szárnyfoltúakéban. Eredményeik azt mutatták, hogy a tojók akkor fektetnek
többet a tojás minőségét javító biológiailag aktív molekulák bevitelébe, amikor párjuk
nem rendelkezik költési tapasztalattal, azaz „rossz” minőségű szülő [7,8]. Mind a
tesztoszteron, mind a karotinoidok többféle mechanizmus által életerős, egészséges
fiókák kelését eredményezhetik, amelyek táplálékkérő aktivitása az átlagosnál élénkebb.
8
2.2. A tojás összetétele
A tojás közel háromnegyede víz, a szárazanyag tartalom kb. 96%-a szerves
vegyület (fehérjék, zsírok, természetes festékek és elenyésző mennyiségű szénhidrát), a
fennmaradó részt pedig az ásványi anyagok teszik ki [5]. A fehérje és a sárgája
összetevőinek megoszlását mutatja a 4. ábra.
4. ábra: A fehérje és a sárgája összetevőinek megoszlása
A tojásfehérje gyakorlatilag zsírmentes, azaz a tojás zsírtartalmának egészét a sárgája
adja. A tojók tápláléka nem befolyásolja a tojásfehérje és a sárgája mennyiségét, viszont
ásványi anyag és vitamintartalmát meghatározza.
9
2.3. Minta-előkészítési módszerek bemutatása
A vitaminok a sejtekben, szövetekben általában kötött formában vannak jelen. A
zsíroldható vitaminok lipidekhez vagy fehérjékhez, a vízoldható vitaminok
enzimfehérjéhez kötve, mint észterek fordulnak elő.
A vitaminok vizsgálatánál a főbb lépések az alábbiak:
1. Mintavétel
2. Kötött formából történő felszabadítás
3. Extrakció
4. Elválasztás a zavaró szennyezőktől
5. Azonosítás
6. Mennyiségi meghatározás
A meghatározások gyakorlati és elméleti értékét a mintavétel jelentősen
befolyásolja, mivel a vitaminok az állati és növényi szövetek különböző részeiben igen
eltérő koncentrációban fordulnak elő. Így nem reprezentatív mintavétel esetén extrém
nagy vagy kis értékhez juthatunk.
A vitaminok felszabadítására a sejteket elroncsolják és felaprítják. A feltárási és
további műveleteket a lehető leggyorsabban és alacsony hőmérsékleten végzik, annak
érdekében, hogy az enzimek káros hatást ne fejtsenek ki, így a meghatározás pontosságát
egyáltalán ne befolyásolják. Oxigénérzékeny vitaminoknál inert atmoszférában,
fényérzékenyeknél szűrt fénynél, vagy fénytől teljesen elzárt helyen kell a mintákat
feldolgozni. A feltárást és a homogenizálást kíméletesen kell végrehajtani, mert a
komponensek degradálódhatnak és fémionok jelenétében oxigén hatására autooxidációs
folyamat játszódhat le. Vízoldható vitaminoknál a felszabadítást hidrolízissel végzik. B-
vitaminoknál és biotinnál savas hidrolízist, folsav és pantoténsav esetén enzimes bontást
alkalmaznak. Zsíroldható vitaminok közül az A, D, E alkalikus közegben stabil. A K-
vitaminok mind savas, mind lúgos beavatkozásra érzékenyen reagálnak [9]. Feladatom a
szabad vitaminok és karotinoidok meghatározása volt, így elszappanosítási (feltárási)
lépés nem volt szükséges a minta-előkészítés során.
A zsíroldható vitaminok extrakciójánál peroxidmentes oldószerekkel dolgozunk.
Fontos az extrahálószer hőmérsékletének pontos megválasztása, mivel növekvő
hőmérsékleten a kalciferolok még inert atmoszférában is jelentős mennyiségben
10
alakulnak át [10]. A vízoldható vitaminok a vizsgálandó anyag vizes oldatából könnyen
kinyerhetők, ha már szabad állapotban vannak.
Sokáig az oszlopkromatográfiát alkalmazták tisztításra. Napjainkban azonban a
szilárd fázisú extrakciós töltetekkel lényegesen gyorsabban elvégezhető ez a lépés.
2.3.1.1. Lehetséges minta előkészítések szabad vitaminok és karotinoidok meghatározására
2.3.1.1.1.
2.3.1.1.2.
Protein kicsapás és oldószeres extrakció
A fehérjék kicsapása elvégezhető oldószeres, illetve savas vagy lúgos közegben
kicsapással. Az oldószeres kicsapásnál a leggyakrabban alkalmazott oldószerek az
aceton, acetonitril, metanol és az etanol. Hátránya ennek módszernek, hogy dúsítási lépés
alkalmazása nélkül csökken a kimutatási határ, mivel a minta jelentősen hígul. Gyakran
előfordulhat, hogy oldószerváltást kell alkalmazni, az apolárisabb oldószer miatt, hogy
folyadékkromatográfiásan injektálható legyen a minta. A savas/lúgos kicsapásnál
minimális a hígulás, tiszta a felülúszó valamint könnyen centrifugálható. Hátránya
azonban, hogy az extrém pH érték miatt nehéz semlegesíteni, magas az ionerősség, a
vegyület instabillá válhat, és az analitikai oszlop stabilitása is csökkenhet az alacsony
vagy magas pH értékeknél. A protein kicsapást követően az extrakció során a mintához
megfelelő szerves oldószert adva, és rázatva a szerves komponensek a vizes fázisból a
szerves fázisba kerülnek. A kicsapott fehérjék lecentrifugálásával a fázisok
elválaszthatók. Ezután a szerves fázist dúsítják, mely során az oldószer nagyobb részét
eltávolítják (pl.: bepárlással).
Mátrix szilárd fázisú diszperzió
A mátrix szilárd fázisú diszperzió (MSPD: Matrix Solid Phase Dispersion) a
szilárd fázisú extrakció (SPE: Solid Phase Extraction) egy speciális fajtája. A folyadék-
folyadék extrakció (LLE: Liquid-Liquid Extraction) lehetséges alternatívájaként alakult
ki. Rendszerint alumínium-oxid, magnézium-szilikát vagy módosított szilikagél (C8,
C18, amino, ciano) fázisokat alkalmaznak. Kifejezetten szilárd, félkemény és
meglehetősen viszkózus biológiai minták előkészítésére, extrakciójára és a komponensek
elválasztására (frakcionálására) alkalmas analitikai eljárás. Olyan alapvető fizikai és
11
kémiai elveken alapul, mint például a mechanikai keverés, ami a minta összezúzását, a
mátrix és a töltet érintkezését eredményezi. A kötött fázisú (pl.: oktadecil-szilillel
módosított szilika) szilárd hordozót és a biológiai mintát dörzsöléssel diszpergálják. A
homogenizált mintát pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM: Scanning Electron
Microscopy) vizsgálva azt tapasztalták, hogy a minta szerkezete teljesen szétroncsolódik,
és a mátrix komponensek szétoszlanak a hordozó felületén egy kb. 100 µm vastag fázist
alkotva. Népszerűségének oka, hogy sok komplikációt kiküszöböl, ami a szilárd vagy
félkemény minták folyadék-folyadék és szilárd fázisú extrakciójánál adódik. Kevesebb
oldószert igényel, és az extrakció során nem lép fel emulzióképződés. A minta-
előkészítés során a minta komponenseinek egy nem viszkózus, tiszta és homogén oldatba
kell kerülniük, hogy esetlegesen további tisztítási, vagy dúsítási lépést lehessen elvégezni
rajtuk. Sok biológiai minta, mint a vizelet, vér, plazma vagy szérum, egyből
rákerülhetnek a SPE töltetre, azonban sok minta nem vihető fel közvetlenül. Ilyen minták
például az állati vagy növényi szövetek. Ezeknek a mintáknak a hagyományos minta-
előkészítése egy aprítási lépéssel kezdődik, ezt követi az oldószer, sav, bázis, puffer, só,
detergens és/vagy kelátképző hozzáadása annak érdekében, hogy a minta szerkezetét és
sejtjeit minél inkább megbontsák, és lehetővé tegyék az extrakciót. A feltárási folyamat
során előfordulhat, hogy emulzió képződik. Ezt követően gyakran szűrni vagy
centrifugálni kell a mintát, sőt előfordulhat többszöri extrakció és centrifugálás is, míg a
minta alkalmassá válik a további tisztításra. Az MSPD kiküszöböli ezeket a
komplikációkat azáltal, hogy a minta előzetes kezelés nélkül összekeverhető a töltettel.
Így összességében egy lépésben elvégezhető a fehérjék denaturálása, a minta extrakciója,
a centrifugálás/szűrés és a tisztítás [10]. A MSPD minta-előkészítési lépéseit az alábbi
ábra szemlélteti (5. ábra).
12
5. ábra: Az MSPD módszer ábrázolása
Az irodalomban több helyen találkoztam a mátrix szilárd fázisú diszperzióval
tojásminták előkészítésére, azonban többnyire peszticidek [11] és szulfonamidok [12,13]
meghatározására használták. Karotinoidok és vitaminok mérése során is alkalmazták már
ezt a technikát, élelmiszerek [14] zöldségek [15,16,17,18], gyümölcsök [16],
tejtermékek [19], fogkrém [20], ínyszövet [21] és retina [21,22] minták előkészítésére.
13
2.4. Mennyiségi meghatározásra alkalmas analitikai módszerek
A kémiai- és fizikai-kémiai eljárások között a kémiai meghatározások olyan
reakciókon alapulnak, amelyek során jól mérhető elszíneződés vagy fluoreszcencia lép
fel. Az értékelés kolorimetriásan, fotometriásan vagy fluorimetriásan történik. A fizikai-
kémiai eljárások az egyes vitaminokra jellemző fizikai állandók meghatározásán
alapulnak. Ilyen módszerek: a fluorimetria, polarográfia, mágneses magrezonancia,
radioizotópok felhasználása, stb. A fizikai-kémiai eljárások óriási fejlődését jelentette a
kromatográfia, amely víz- és zsíroldható vitaminok, prosztetikus és induktív vitaminok
vizsgálatára egyaránt alkalmas.
2.4.1. Kromatográfiás módszerek
2.4.1.1. Vékonyrétegkromatográfia
A vitamin-analitikában a rétegkromatográfiához az adszorpciós, megoszlásos
eljárásokon kívül alkalmazható a komplexképzés ezüst-nitráttal impregnált lemezen, a
poliamid és az ioncserélő kromatográfia is. Az elválasztást a vitaminok és egyéb
hatóanyagok láthatóvá tétele, mennyiségi értékelés denzitométerrel vagy egyéb elúció
utáni meghatározással.
A legtöbb vékonyréteg-kromatográfiás módszer, amit a szakirodalomban közöltek
a zsíroldható vitaminok körében történt. Ennek valószínűleg az a magyarázata, hogy a B-
vitaminok meghatározására jól kidolgozott mikrobiológiai eljárások álltak rendelkezésre,
a zsíroldható vitaminok vizsgálatára azonban kevés módszer volt ismert [10,23]
2.4.1.2. Gázkromatográfia
A vitaminok közül az E-vitamin származékolást követően meghatározható
gázkromatográfiás technikával is. Az irodalomban találkoztam trimetil-szilillel
származékolt tokoferolok GC-FID analízisével [24] valamint GC-MS módszerrel,
melynek során N,O-bis(trimetil-szilil)trifluoracetamidot (BSTFA) és trimetilklórszilánt
alkalmaztak származékolószerként [25].
14
Mivel a karotinoidok meglehetősen oxigén, fény- és hőérzékeny anyagok, ezért
sok esetben fontos bomlástermékeik (norizoprenoidok) vizsgálata. Ilyen esetekben az
irodalomban pirolízis GC-MS technikát alkalmaztak [26]. A karotinoidok
hőérzékenységük miatt gázkromatográfiásan nem vizsgálhatók, ezért számomra ez a
technika nem volt alkalmas.
2.4.1.3. Nagy hatékonyságú kromatográfia
A folyadékkromatográfia olyan elválasztástechnikai módszer, mely a
komponenseknek két egymással nem elegyedő fázis közötti eltérő megoszlásán alapul,
ahol a mozgófázis folyadék. Az elválasztás a mozgófázisnak a kolonnában elhelyezkedő
állófázissal való érintkezése során valósul meg. Az érvényesülő mechanizmusok alapján
számos fajtája létezik: adszorpciós, ioncserés, méretkizárásos, affinitási, zárvány
komplex (királis), stb. [27].
A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC: High Performance Liquid
Chromatography) az oszlopkromatográfiának egyik továbbfejlesztett változata. A
hatékonyabb elválasztás érdekében egyre kisebb szemcseátmérőjű töltetek jelentek meg,
azonban a részecskék átmérőjének csökkenésével az oszlop hidrodinamikai ellenállása is
megnőtt, így a folyadékfázis áramlása lelassult. Ennek kompenzálására olyan pumpákat
alkalmaztak, melyek a mozgófázist folyamatosan és pulzálásmentesen több száz bar
nyomáson képesek áramoltatni az oszlopon. Egy átlagos HPLC-s töltet szemcseátmérője
5 µm, és a pumpa általánosan 400 bar nyomásig üzemeltethető. Az utóbbi pár évben
megjelentek még magasabb nyomáson működő rendszerek, mint az RRLC (Rapid
Resolution Liquid Chromatograph, Agilent, 600 bar) és az UPLC (Ultra Performance
Liquid Chromatograph, Waters, 1000 bar).
A normál és fordított fázisú folyadékkromatográfia során kötött fázisú tölteteket
alkalmaznak. Ezen tölteteknél fontos, hogy lehetőség szerint inaktív, kémiailag stabil,
mechanikailag szilárd, homodiszperz méreteloszlású legyen. Az előállításuk során a
szferoid hordozó szemcsékre kovalens kötéssel különböző szerkezetű és polaritású
funkcionális csoportokat kötnek. A hordozó kezdetben szilikagél volt, mára azonban
egyre inkább elterjednek a polimer alapú szemcsék. A kötött állófázisok a szemcsék
felületén porózus réteget képeznek, ezzel növelve a fajlagos felületet és a kötési
kapacitást, valamint az anyagátadási folyamatot (diffúziót) is elősegítik.
15
A kémiailag kötött állófázisok a hordozó szemcsékre felvitt funkcionális csoportok
poláris v. apoláris tulajdonságainak megfelelően normál és fordított fázisú csoportokba
sorolhatók. Normál fázisok a nem módosított töltetek, a ciano (-CN), amino (–NH2, -
NH), dimetil-amino (-N(CH3)2), diol (-OH) és nitro (-NO2) csoporttal módosított
töltetek. A fordított fázisú töltetek szemcséin leggyakrabban C2-4, C8, C18 tagszámú
paraffinláncok, illetve fenil, etil, i-propil, stb. apoláris csoportok találhatók [28].
Azt azonban, hogy normál vagy fordított fázisú kromatográfiáról beszélünk,
önmagában nem a töltet minősége szabja meg, hanem az álló és a mozgó fázisok
egymáshoz viszonyított polaritása. Normál fázisú kromatográfia esetén a mozgófázis
minden esetben apolárisabb az alkalmazott állófázisnál, fordított fázisú kromatográfiánál
pedig az állófázis az apolárisabb [29].
Azok a karotinoidok, melyeken hidroxil-csoport is található mind normál [23,30]
mind fordított fázisú [23,31-38] folyadékkromatográfiával elválaszthatók. Normál fázis
esetén leggyakrabban szilika az állófázis és hexánt alkalmaznak eluensként. Az
irodalomban sok helyen találkoztam C18-as fordított fázisú elválasztással is
[23,31,32,33,34], de karotinoid és vitamin izomerek elválasztására több irodalom is C30-
as töltetű oszlopot javasolt [23,35,36,37,38].
2.4.2. Detektálási módszerek
2.4.2.1. Fluoreszcens spektrofotometria
A természetesen fluoreszkáló vegyületek többsége többgyűrűs aromás
szénhidrogén, melyek konjugált elektronrendszert tartalmaznak. Fluoreszcencia
jelensége akkor lép fel, mikor fény hatására a molekula gerjesztett állapotba kerül, majd
úgy jut vissza alapállapotba, hogy közben fényt emittál. A besugárzás és az emisszió
között rövid idő (10-15 s) telik el [29].
A mérendő vegyületek közül csak az A- és E-vitamin mérhető fluoreszcens
detektálással. Az A-vitamin 325 nm hullámhosszú fénnyel való gerjesztés esetén 470
nm-es emissziós maximumon, az E-vitamin pedig 295 nm-en gerjesztve 330 nm-en
fluoreszkál [39].
Mivel a célom az volt, hogy egy módszerrel határozzam meg az összes komponens
koncentrációját, így ez a detektálási mód számomra nem alkalmas.
16
2.4.2.2. Tömegspektrometria
Mind a karotinoidok, mind a vitaminok meghatározása lehetséges
tömegspektrometriás detektálással. A karotinoidok esetén az ionizációs módszerek közül
az atmoszférikus kémiai ionizáció jöhet csak szóba, mivel nagyon apoláris tulajdonságú
vegyületek. A vitaminok mérése azonban lehetséges elektrospray technikával.
Munkám során lehetőségem volt egy Agilent hármas kvardupól analizátorral
felszerelt tömegspektrométert alkalmazni, mely egy speciális ionforrással (Multimode
source) volt felszerelve (6. ábra). Ez az ionforrás képes szimultán atmoszérikus kémiai
ionizációra (APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization) és elektrosray ionizációra
(ESI: Electrospray Ionization).
6. ábra: A speciális ionforrás felépítése
2.4.2.3. UV-VIS spektrofotometria
Az UV-VIS spektrofotometria fényelnyelésen alapuló optikai módszer, melynek
során a mintát meghatározott hullámhosszú és intenzitású fénnyel megvilágítva mérjük
az abszorpció mértékét. Az elnyelési hullámhossz meghatározásával minőségi analízisre
van lehetőség, míg az abszorbancia mértékének (extinkció) mérésével számolható az
anyag koncentrációja. UV-VIS spektrofotometriás meghatározás esetén a karotinoidok
elnyelését 450 nm-nél, a retinolét 325 nm-nél, az α-tokoferolét pedig 295 nm körül
mérték [31-38].
17
2.4.2.4. Diódasoros detektálás
Többcsatornás detektorok azok az UV vagy UV-VIS tartományban működő
spektrofotometriai érzékelők, amelyek különböző hullámhosszakon egy időben több
kromatogramot képesek felvenni, valamint lehetőség van spektrum felvételére és
bizonyos spektrumfeldolgozásra is. Egy részük alkalmas korlátozott csúcstisztaság
vizsgálatra. A diódasoros detektoron (Diode Array Detector) azokat a többcsatornás
detektorokat értjük, amelyek adott beállítási paraméterek mellett idő, intenzitás,
hullámhossz adat-együttest gyűjtenek, az adatokat számítógépen tárolják, és mérés után
korlátozás nélküli adatfeldolgozást tesznek lehetővé. Az analitikai módszer fejlesztése
során ez a detektálási módszer bizonyult a legalkalmasabbnak [29].
18
3. Kísérleti rész
3.1. Standard oldatok és a belső standard megválasztása
Az alábbi vegyületeket vizsgáltam: α-karotin, β-karotin, β-kriptoxantin, likopin,
lutein, zeaxantin, retinol és α-tokoferol. Szerkezetüket és CAS számukat a
1. Függelék tartalmazza.
A karotinoid referencia anyagokat szilárd formában álltak rendelkezésemre.
Analitikai pontossággal 100 µg/cm3 koncentrációjú törzsoldatokat készítettem
diklórmetánnal komponensenként; az oldatokat mélyhűtőben tároltam. A vitaminokból
nagyobb mennyiség állt rendelkezésemre, ezért nagyobb koncentrációjú törzsoldatot
készítettem (1 mg/cm3) diklórmetánnal. Mivel a karotinoidok mennyisége kisebb a
tojásban, mint a vitaminoké, ezért két kalibráló oldatsorozatot készítettem különböző
koncentráció tartományban (karotinoidok: 0,1-10 µg/cm3 , vitaminok: 5-500 µg/cm3).
Az irodalom áttekintése alapján az echinenon és az asztaxantin jött szóba mint
alkalmas belső standard [31,33]. Tekintetve a mérendő minták magas számát (200 db) és
az echinenon igen magas árát, az astaxanthin mellet döntöttem. Az irodalmak alapján
feltételeztem, hogy a tojássárgájában nincs astaxanthin, és ezt később a méréseim is
bizonyították.
19
3.2. Kromatográfiás körülmények
A mérések elvégzésére egy Agilent 1200 SL típusú folyadékkromatográfot
használtam. A rendszer egy gázmentesítőből, bináris pumpából, termosztált mintaterű
automata injektorból, kolonnatermosztátból és egy diódasoros detektorból állt.
Fordított fázisú folyadékkromatográfiás módszert alkalmaztam, mivel a mért
karotinoidok között három vegyület nem tartalmaz hidroxil-csoportot. Az oszlop
választás során figyelmebe kellet venni, hogy a vegyületek között α- és β-izomer is van,
így egy C30-as fordított fázisú Develosil oszlop (150 mm × i.d. 4.6 mm, 3 µm) mellett
döntöttem. Továbbá egy C18-as fordított fázisú Zorbax előtétoszlopot (12.5 mm × i.d. 4.6
mm, 5 µm) is használtam az analitikai oszlop védelmének érdekében.
3.2.1. Optimált paraméterek meghatározása
3.2.1.1. Az eluens megválasztása
Az eluens szerves komponensének megválasztásához több fajta oldószert és ezek
keverékét is kipróbáltam (metanol, acetonitril, diklórmetán és etil-acetát). A legjobb
elválasztást az acetonitril és etil-acetát 2:1 arányú eleggyel értem el. Mivel az általam
használt analitikai oszlop nem utókezelt (non endcapped), így az acetonitril és etil-acetát
elegyhez 0,05 % trietil-amint adtam.
Oldószer gradienst és áramlási sebesség gradienst is alkalmaztam a minél gyorsabb
elválasztás érdekében.
3.2.1.2. Oszloptermosztát hőmérsékletének optimálása
A vizsgálat során a méréseket 5 µg/cm3 koncentrációjú standard oldattal végeztem
négy különböző hőmérsékleten (40 °C, 50 °C, 60 °C). 40 °C-nál alacsonyabb
hőmérséklet alkalmazása esetén, a szükséges áramlási sebesség mellett a megnövekedett
nyomás a töltet épségét veszélyezteti.
20
7. ábra: Az oszloptermosztát hőmérsékletének optimálása
Megállapítható, hogy a legrövidebb analízisidő és a legszimmetrikusabb csúcsok
60 °C-on adódtak (7. ábra). Ezen a hőmérsékleten azonban az oszlop élettartama
jelentősen csökken, így 50 °C-ot választottam a kolonna termosztálásához.
3.2.1.3. Detektálási paraméterek meghatározása
A tömegspektrometriás detektálás során használt ionforrással nem tudtam a kellő
érzékenységet elérni, ennek oka lehet, hogy ezt a speciális ionforrást nem lehet kellően
magas hőmérsékleten üzemeltetni (az ionforrás maximum hőmérséklete: 350 °C).
További terveim között szerepel a probléma újbóli kivizsgálása, valamint az multimód
ionforrás és az APCI ionforrás összehasonlítása.
A diódasoros detektor detektálási hullámhosszának kiválasztásához külön-külön
felvettem a komponensek spektrumait 200-600 nm-es tartományban. A gyűjtött
spektrumok alapján a maximális elnyelés az összes karotinoid esetén 450 nm körülinek
adódott, az α-tokoferolnál 295 nm, a retinolnál pedig 325 nm volt. Így a továbbiakban
ezen a három hullámhosszon végeztem méréseket (8. ábra). Az optimált paramétereket a
4. Táblázatban foglaltam össze.
21
Injektálási térfogat 10 µl
Injektor Termosztát
hőmérséklete 4°C
A H2O Eluens
B ACN:EtAc = 2:1 + 0,05 % TEA
Idő / perc B / % Áramlási sebesség / (cm3 /
perc)
0 90 0,5
3 90 0,5
7 100 1
9 100 1
12 100 1,5
20 100 1,5
Gradiens
26 90 0,5
Kolonnatermosztát
hőmérséklete 50 °C
A 450 nm
B 295 nm Detektor csatorna
C 325 nm
4. Táblázat: Az optimált paraméterek táblázatos összefoglalása
8. ábra: 5 µg/cm3 koncetrációjú standard oldat kromatogramja
22
3.3. Minta-előkészítési módszer kiválasztása és optimálása
3.3.1. Oldószeres extrakció
A módszerfejlesztés során tyúktojással dolgoztam, mert könnyebben beszerezhető,
valamint a nagyobb tömege miatt standard addíciós vizsgálatra is alkalmas, mivel a
cinketojás túl kicsi mérete miatt nem alkalmas ilyen jellegű vizsgálatok elvégzésére. Az
irodalomban tojásminták esetén a legtöbbször oldószeres extrakciót alkalmaztak a
minták előkészítésére [8,9,34,36].
100 µl belső standard (10µg/cm3 koncentrációjú oldat) hozzáadását követően a
fehérjék kicsapását végeztem el 1,5 cm3 5% NaCl-oldat és etanol 1:1 arányú elegyével.
Következő lépésként 2 cm3 hexánnal extraháltam a mintát, majd 20 perc centrifugálás
(5500 RPM) után a szerves fázist elválasztottam és 40 °C-on nitrogén atmoszféra alatt
szárazra pároltam. Azért használtam nitrogént a bepárlás során, mert a célkomponensek
oxigénre érzékeny vegyületek. A bepárolt mintát 200 µl diklórmetán és metanol 1:4
arányú elegyével oldottam vissza.
3.3.1.1. Extrakciók számának meghatározása
Az extrakció során a lehető legjobb visszanyerésre törekedtem, a kimutatási határ
csökkentése érdekében. Ezért a vizsgált mintát másodszor és harmadszor is extraháltam 2
cm3 hexánnal, majd a szerves fázisokat összegyűjtöttem, és ezzel az oldattal folytattam a
minta-előkészítést. A kapott eredményeket a 9. ábran szemléltettem.
9. ábra: A többszöri extrakció hatása
23
A kapott eredményekből az alábbi képlettel visszanyerést számoltam:
Visszanyerés% = 100elméleti
mért ⋅AA
Egyszeri extrakció után a számított visszanyerés 50%-nak adódott. A tapasztalat
azt mutatja, hogy a második extrakció növeli a visszanyerést. A háromszori extrakció
csökkenő visszanyerés-értéke a statisztikai ingadozással magyarázható.
Tapasztalataim szerint ezzel a módszerrel feldolgozott minták extraktumai eléggé
zavarosak voltak a hosszú centrifugálási idő ellenére is. Ez azonban problémát okozott a
HPLC analízis során, mivel az injektor eltömődött, meglehetősen gyakori tisztítást
igényelt. Az oldat zavarosságát okozhatta a centrifuga alacsony fordulatszáma. Mivel
nem állt rendelkezésemre nagyobb fordulatszámú centrifuga, így egyéb tisztítási lépéssel
kellett megoldanom a problémát. Két lehetőség adódott, vagy szűrés, vagy az
extraktumok újbóli extrahálása. Mivel 200 µl oldat szűréséhez speciális pipettahegyekre
vagy centrifugára lenne szükség, így a szűrést a bepárlási lépés előtt próbáltam elvégezni
0,45 µm-es fecskendőszűrő segítségével. Azonban ekkora pórusméretű szűrőn nem
lehetett átszűrni az oldatot a szűrő tömődése miatt, így mindenképpen újbóli exrakciót
kellett elvégeznem. Ez a plusz lépés annyira meghosszabbította a minta-előkészítés
idejét, hogy egy nap alatt mindössze 10 minta előkészítését tudtam elvégezni. A kapott
visszanyerés átlagosan 70 % volt.
3.3.2. Az MSPD minta-előkészítés
Mivel az oldószeres extrakció meglehetősen idő- és oldószerigényes, valamint a
visszanyerés hatásfoka is alacsony volt, így az MSPD minta-előkészítést próbáltam ki.
Első lépésként a 100-200 mg tojássárgájához (melyet manuálisan választottam el a
fehérjétől) a belső standard hozzáadását vagy az ismert koncentrációjú oldattal történő
adalékolást végeztem el. Ezt követően a mintát egy dörzsmozsárba helyeztem melybe
előzőleg bemértem a megfelelő mennyiségű hordozót (Isolute® C18e). A töltetet és a
mintát kézi „keveréssel” homogenizáltam. A homogén mintát egy
6 cm3-es fecskendőbe töltöttem, amibe előzőleg üvegszálas papírszűrőt helyeztem és 200
mg hordozót mértem. Az „előtétoszlop” lehet a hordozóval azonos vagy attól eltérő fázis,
ami szolgálhat a komponensek izolációjának elősegítésére vagy további tisztításra.
24
Ezután megfelelő oldószerrel vagy oldószerekkel eluáltam a zavaró mátrixot, majd
leoldottam a kívánt komponenseket.
Az MSPD módszer kidolgozása során számos paramétert optimáltam. Ezek közül
csak néhányra térek ki, melyek jelentősebben befolyásolták a minta-előkészítést.
3.3.2.1. A töltet mennyiségének optimálása
Mivel változó mennyiségű tojásmintákat kell vizsgálnom, így az optimálás során a
megfelelő minta-hordozó arány megválasztására törekedtem. A legjobb minta-hordozó
aránynak az 1:4 adódott. Ennél kevesebb minta esetén a keverék pépszerű maradt, így
nehezen volt átvihető a fecskendőbe. Négyszeresnél nagyobb mennyiség használata nem
szükséges, valamint túl sok töltet alkalmazása esetén a keverék porszerű lesz (száll), így
szintén nehézkes a kezelése.
3.3.2.2. Oldószer kiválasztása
A mátrixkomponensek eltávolítása érdekében a mosáshoz nagy tisztaságú vizet
használtam. Puffer alkalmazására nem volt szükség, mivel a vízzel történő mosás után
felvett kromatogramok zavaró komponensektől mentesek voltak. A következő feladat az
eluáló oldószer kiválasztása volt. Négy oldószert próbáltam ki: hexánt, acetonitrilt,
metanolt és diklórmetánt. Az elúciót minden esetben 10 ml oldószerrel végeztem. Az 10.
ábra az egyes oldószerekkel való elúció során kapott csúcsterületeket ábrázoltam.
10. ábra: A különböző oldószerek esetén kapott csúcsterületek
25
Először a hexánt próbáltam ki, mivel az oldószeres extrakció során az összes
komponensre használható volt. Ennél a módszernél azonban csak a legapolárisabb
vegyületekre, valamint a vitaminokra volt megfelelő a visszanyerés hexánt használva.
Ezért következőnek egy polárisabb oldószert választottam, az acetonitrilt. Ekkor azt
tapasztaltam, hogy a legtöbb komponenst akkor sem sikerült leoldani, ha nagy
mennyiségű oldószert használtam. Hasonlóak voltak a tapasztalataim a metanollal is.
Viszont a metanol esetében valamivel jobb visszanyeréseket kaptam az összes hidroxil-
csoportot tartalmazó vegyületre, de azon vegyületek, amelyek nem képesek hidrogén-
kötés kialakítására teljes mértékben a tölteten maradtak még 10 cm3–es elúciós térfogat
esetén is. Végül a diklórmetán alkalmazásával sikerült megfelelő visszanyeréseket
elérnem az összes komponensre. Ezt az eredményt a diklórmetán jó polarizáló
készségének tulajdonítottam. A továbbiakban a diklórmetánt használtam az elúcióhoz.
3.3.2.3. Elúciós térfogat optimálása
Arra törekedtem, hogy minél kevesebb oldószert használjak, hogy ezáltal a
bepárlási lépés a lehető legrövidebb legyen. Fontos továbbá, hogy így csökkenthető a
környezeti terhelés és felmerülő költségek. Az elúcióhoz szükséges oldószertérfogat
optimálását az adalékolt minták 1cm3-es frakcióinak gyűjtésével végeztem. A kapott
eredményeket a 11. ábra szemlélteti.
11. ábra: Az elúcióhoz szükséges oldószertérfogat optimálása
A kapott eredmények alapján a 4 cm3-t választottam elúciós térfogatnak, mivel közel
100%-os visszanyerést tapasztaltam.
26
3.3.2.4. Extrakciós idő optimálása
Az extrakciós idő optimálása során vizsgáltam, hogy a minta és a hordozó
érintkezésének ideje mennyire befolyásolja a visszanyerés értékét. A mintákat a mérések
között fénytől elzárt helyen 10 °C-on tároltam. Az 12. ábra szemléltetem a kapott
eredményeket. Bár magasabb hőmérsékleten a komponensek migrációja nagyobb, így az
extrakciós idő csökkenthető, azonban a vizsgálandó vegyületek hő- és fényérzékenysége
miatt nem célszerű magasabb hőmérsékleten kivitelezni az extrakciót. Ezt a tényt
alátámasztja, hogy szobahőmérsékleten végzett extrakció során a minták visszanyerései
kisebbnek adódtak.
12. ábra: Az adszorpciós idő hatása a visszanyerésre
Az eredmények alapján a 60 perces állási idő választottam, mivel 90 percnél már
nem nőtt számottevően a visszanyerés, viszont a 30 perces időtartam-növekedés
jelentősen megnövelné a minta-előkészítés időigényét.
27
3.4. A kifejlesztett módszer
Ebben a fejezetben csak a kifejlesztett minta-előkészítést összegzem, mivel a
kromatográfiás körülményeket a 3.2. fejezetben foglaltam össze.
A kapott eredmények alapján a mátrix szilárd fázisú diszperziós minta-előkészítést
választottam. A tojássárgáját a fehérjétől elválasztva -20°C-on tároltam. Első lépésként a
belső standard 10µg/cm3-es oldatából 100µl-t pipettázok a mintára, majd a lemért minta
tömegéhez képest négyszeres mennyiségű ISOLUTE® C18(e) típusú töltetet mérek a
mintát tartalmazó fiolába. Spatula segítségével elkeverem és átviszem a keveréket egy
dörzsmozsárba. Körülbelül 30 másodpercig homogenizálom dörzsöléssel. Egy
fecskendőbe 2 darab üvegszálas szűrőt helyezek, amire 200mg C18-as töltetet mérek be.
Erre kerül a homogenizált mintakeverék, amit ütögetéssel, majd üvegbot segítségével
tömörítek. Az így elkészített patront 1 óráig hűtőben tárolom. A fecskendőt ezután a
vákuumkádra helyezem, és 3 cm3 ioncserélt (Millipore) vízzel lemosom az esetleges
szennyezőket. A töltetet vákuum segítségével szárítom, valamint az elúció előtt 4g
Na2SO4-al töltött fecskendőt helyezek alá. A Na2SO4 használatával biztosítom, hogy a
tölteten maradt kis mennyiségű víz se kerüljön a bepárlandó oldatba. Ezt követően
kétszer 2cm3 diklórmetánnal eluálom a mérendő komponenseket a C18-as fázisról.
Ügyelve arra, hogy közben ne száradjon ki a patron. Az így kapott oldatokat 40°C-on 10
perc alatt szárazra párolom, majd 200µl diklórmetán:metanol=1:4 arányú eleggyel
visszaoldom. Az oldatokból 10µl-t injektálok.
28
3.5. A módszer analitikai teljesítményjellemzőinek vizsgálata
Az analitikai módszer kidolgozásánál a módszer alkalmazhatóságát az ún.
teljesítmény jellemzők meghatározásával lehet megállapítani. Az általam vizsgált
teljesítményjellemzők a következők:
- Szelektivitás (specifikusság)
- Érzékenység
- Torzítatlanság
- Precizitás
- Stabilitás
- Kimutatási határ
- Meghatározási határ
3.5.1. Specifikusság
A módszer szelektivitása arra vonatkozik, hogy a módszer mennyire képes a
mérendő komponensek meghatározására egyéb zavaró alkotók jelenlétében. Mértékének
megállapítása céljából az elemzéseket a tiszta standard oldattal és adalékolt mintával
végeztem el.
min2 4 6 8 10 12 14 16 18
Norm.
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\1CC-1401.D)
6.6
04 -
Ast
axan
thin
7.6
38 -
Lut
ein
12.
433
- be
ta-C
rypt
oxan
thin
14.
347
- Ly
cope
ne
16.
241
- al
pha-
Car
oten
e 1
6.59
9 -
beta
-Car
oten
e
13. ábra: 5µg/cm3 koncentrációjú standard oldat 450 nm detektált kromatogramja
29
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
20
40
60
80
100
DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AB-0201.D)
6.5
16 -
Ast
axan
thin
7.5
28 -
Lut
ein
12.
366
- be
ta-C
rypt
oxan
thin
14.
483
- Ly
cope
ne
16.
326
- al
pha-
Car
oten
e 1
6.69
0 -
beta
-Car
oten
e
14. ábra: Tyúktojás minta 450 nm detektált kromatogramja
min2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
100
200
300
400
500
DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AF-0601.D)
6.5
29 -
Ast
axan
thin
7.5
52 -
Lut
ein
12.
391
- be
ta-C
rypt
oxan
thin
12.
728
14.
301
- Ly
cope
ne
16.
198
- al
pha-
Car
oten
e 1
6.55
1 -
beta
-Car
oten
e
15. ábra: Adalékolt tyúktojás minta 450 nm detektált kromatogramja
A kapott kromatogramokon látható, hogy az adalékolt tyúktojás kromatogramja zavaró hatásoktól mentes, így a vizsgálandó komponenseket szelektíven lehet meghatározni.
30
3.5.2. Érzékenység
A mérés érzékenysége az analitikai mérőgörbe meredeksége (a) a mért analitikai
jelnek (J) a koncentráció (c) szerinti deriváltja, azaz az egységnyi koncentrációváltozásra
eső jelváltozás.
cJa ΔΔ= /
A relatív érzékenység a mérés érzékenységének egy vonatkoztatási anyagra (belső
standard) kapott érzékenységnek a hányadosa, azaz a relatív jelek és a hozzájuk tartozó
koncentrációk hányadosaiból szerkesztett analitikai mérőgörbe meredeksége.
)/(/ ISTDISTD ccfJJ =
A minták analízise során belső standard módszert használtam, ezért az
érzékenység vizsgálata esetén relatív érzékenységekkel számoltam. A kalibrációt a
karotinoidok esetén 0,1-50 µg/cm3, vitaminoknál 5-500 µg/cm3 tartományban végeztem.
Az eredményeket az 5. Táblázatban foglaltam össze.
Komponens Relatív érzékenység R2
Alfa-karotin 0,215 0,997
Béta-karotin 0,092 0,998
Béta-kriptoxantin 0,086 0,999
Likopin 0,035 0,994
Lutein 0,208 0,996
Retinol 0,002 0,999
Alfa-tokoferol 0,003 0,994
Zeaxantin 0,208 0,998
5. Táblázat: Az érzékenység adatok táblázatosan összefoglalva
A mérendő komponensek között a zeaxantin is szerepelt, ami a lutein izomere. A
két komponenst csak jelentős analízisidő növekedés esetén tudtam volna elválasztani,
erre azonban nem volt szükség. Az érzékenység vizsgálata során kiderült, hogy a lutein
31
és a zeaxantin kalibrációs görbéinek meredeksége azonos, tehát az extinkciós
koefficiensük megegyezik. A továbbiakban a luteinnel végeztem a vizsgálatokat, a
minták mérése során pedig lutein-zeaxantin összkoncentrációt adtam meg, ami teljes
mértékben kielégítette az elvárásokat.
3.5.3. Linearitás
Linearitás vizsgálat a módszer azon jellemzője, amely alkalmassá teszi egy adott
koncentráció-tartományon belül a koncentráció és a detektor válaszjel közötti
összefüggés megállapítását.
A linearitást különböző koncentrációjú standard oldatokkal határoztam meg.
Karotinoidok esetén 0,1-50 μg/cm3, vitaminok esetén 5-500 μg/cm3 közötti tartományt
vizsgáltam. Az értékelést követően a legkisebb négyzetek módszerével meghatároztam a
regressziós egyenes egyenletét és a regressziós koefficiens értékét.
A kapott Linearitás görbéket a 2. Függelék szemlélteti. A lineáris regresszióval
kapott kalibrációs egyenesek paramétereit pedig a 6. Táblázat tartalmazza.
Komponens Alsó határ Felső határ Tengelymetszet Meredekség R2
Alfa-karotin 0,1 50 0,057 0,215 0,997
Béta-karotin 0,1 50 0,003 0,092 0,998
Béta-kriptoxantin 0,1 50 0,018 0,086 0,999
Likopin 0,1 50 0,015 0,035 0,994
Lutein 0,1 50 0,015 0,208 0,996
Retinol 5,0 500 0,001 0,002 0,999
Alfa-tokoferol 5,0 500 0,020 0,003 0,994
6. Táblázat: A linearitási paraméterek összefoglalása
A kapott eredmények azt mutatják, hogy a vizsgált tartományban a kalibrációs
görbe az összes komponensre lineáris, a kapott regressziós koefficiens minden esetben
nagyobb mint 0,990.
32
3.5.4. Torzítatlanság
A torzítatlanság (pontosság) rendszeres hiba kimutatására szolgál. A hiba azon
eleme, ami ugyanazon alkotók ismételt mérése során állandó marad, vagy kiszámítható
módon változik.
A standard addíciót négy ponton végeztem: 2,5; 5; 7,5 és 10 µg/cm3 koncentráció
értékeken adalékolva a mintát. A kapott csúcsterületekből belső standard módszerrel
meghatároztam a koncentrációkat, majd ábrázoltam a hozzáadott koncentráció
függvényében. A grafikonokat a 3. Függelékben tüntettem fel.
Az eredmények értékelését regresszió-analízissel végeztem. A kapott egyenesek
regressziós koefficiense, az egyenesek tengelymetszete, meredeksége, és a meredekség
konfidencia intervalluma a 7. Táblázatban láthatók.
Komponens Meredekség Tengelymetszet R2
Alfa-karotin 1,045 ± 0,087 0,122 0,997
Béta-karotin 1,034 ± 0,108 0,582 0,996
Béta-kriptoxantin 1,117 ± 0,152 0,426 0,994
Likopin 1,093 ± 0,079 0,014 0,998
Lutein 0,974 ± 0,171 5,770 0,991
Retinol 1,044 ± 0,104 15,56 0,997
Alfa-tokoferol 1,057 ± 0,067 324,9 0,998
7. Táblázat: A regressziós egyenesek paraméterei
A módszer torzítatlan, ha 95 %-os megbízhatósági szinten a meredekség
konfidencia intervalluma tartalmazza az 1-et, valamint a regressziós koefficiens értéke
nagyobb, mint 0,98. A vizsgált komponensek vonatkozásában a likopin kivételével a
fenti követelmények teljesültek. A tengelymetszet konfidencia intervallumát nem
vizsgáltam, mivel nem áll rendelkezésemre vitamin- és karotinoidmentes tojásminta.
33
3.5.5. Precizitás
A precizitás a véletlen hiba mérőszáma. A módszer precizitása a kölcsönösen
független megismételt vizsgálatok eredményei közötti egyezés mértéke a becsült
tapasztalati szórással (standard deviáció, SD), vagy a százalékos szórással (relatív
standard deviáció, RSD) kifejezve.
1
)(1
−
−=∑=
n
xxSD
i
n
ii
100%ix
SDRSD =
A precizitás meghatározását 5 µg/cm3-en adalékolt 5 párhuzamos minta
analízisével végeztem. A kapott eredményekből visszanyeréseket számoltam, valamint
meghatároztam a párhuzamos mérések relatív standard deviációját, ezt foglalja össze a 8.
Táblázat.
Visszanyerés / %
Komponens 1 2 3 4 5
Átlag
visszanyerés
/ %
RSD /
%
Asztaxantin 98,53 100,82 90,00 96,85 98,00 96,84 4,22
Alfa-karotin 98,62 99,78 90,28 96,77 101,76 97,44 4,51
Béta-karotin 95,47 99,32 91,35 98,18 98,99 96,66 3,45
Béta-kriptoxantin 96,17 98,99 88,38 97,11 99,92 96,11 4,75
Likopin 95,08 104,54 91,93 96,83 99,73 97,62 4,91
Lutein+Zeaxantin 97,96 99,69 89,99 95,89 99,16 96,53 4,08
Retinol 96,33 102,26 88,86 94,47 103,42 97,07 6,14
Alfa-tokoferol 95,56 108,15 91,84 92,64 99,79 97,60 6,84
8. Táblázat: A precizitás során kapott eredmények összefoglalása
A módszer teljesítmény jellemzői a táblázatban megadott adatok alapján a
következők: A visszanyerések átlagértékei a 96,11–97,62 % közötti tartományban voltak,
az RSD értékek kisebbnek adódtak, mint 7 %, ami biológiai minták esetén igen jó
34
eredmény. Továbbá látható, hogy a belső standard esetén kapott visszanyerések
hasonlóak a többi komponensnél kapott értékekhez. Ez alapján megállapítható, hogy a
belső standard kiválasztása megfelelő volt, azaz alkalmas a komponensek minta-
előkészítés során való viselkedésének modellezésére.
3.5.6. Stabilitás
A stabilitás vizsgálat során a kalibráló standard oldatok és az előkészített minták
eltarthatósági határait vizsgáltam.
3.5.6.1. Referencia oldat stabilitása
A referencia oldat vizsgálatához a középső kalibrációs pontnak megfelelő
koncentrációjú (5 µg/cm3) standard oldatokat választottam, melyeket különböző
hőmérsékleteken tároltam (-20°C, 10°C és 25°C). Az oldatokat adott időközönként
vizsgáltam. A mért koncentrációk időbeli változását a 16. ábra szemlélteti. A mérések
előtt rendszeralkalmasság vizsgálatot végeztem frissen készített oldatokkal. Az
elemzéseket az 1., 2., 3., 7., 14., és a 28. napon végeztem el.
16. ábra: Standard oldatok stabilitásvizsgálata
35
A kapott eredmények azt mutatják, hogy az alacsonyabb koncentrációjú standard
oldatok szobahőmérsékleten 3 napig, hűtőben 7 napig, mélyhűtőben pedig 4 hétnél
hosszabb ideig tarthatók el.
3.5.6.2. Mintaoldat stabilitása
A minta stabilitásának vizsgálatát a mérésre előkészített adalékolt minta hetenkénti
elemzésével végeztem. A mintákat a mérések között fénytől elzárt helyen és -20°C-on
tároltam. A kapott eredményeket a 17. ábra mutatja be.
17. ábra: Az extrahált minta stabilitásvizsgálata
A minta stabilitás vizsgálatának eredménye alapján megállapítható, hogy az
extrakció után két hétig tarthatók el a mintaoldatok.
3.5.7. Kimutatási határ
Egy alkotó kimutatási határa (LOD: Limit of Detection) az a koncentráció (ck),
amelyhez tartózó jel megegyezik a vakminta válaszjelének (Jk) és a vakminta
válaszjeléhez (Jvak) (ami az én esetemben az alapvonal válaszjelével egyezik meg)
tartozó tapasztalati szórás (SDvak) háromszorosának összegével (9. Táblázat).
36
vakvakk SDJJ 3+=
A módszer kimutatási határát több különböző koncentrációjú standard oldat
elemzésével határoztam meg, mivel nem állt rendelkezésemre karotinoidokat és
vitaminokat nem tartalmazó mátrix.
LOD
Komponens Koncentráció /
µg/cm3 Jel/Zaj
Asztaxantin 0,05 33,4
Alfa-karotin 0,05 9,9
Béta-karotin 0,05 5,3
Béta-kriptoxantin 0,05 6,5
Likopin 0,07 3,7
Lutein 0,05 24,3
Retinol 1,00 3,6
Alfa-tokoferol 1,00 3,2
9. Táblázat: A kapott kimutatási határok
3.5.8. Meghatározási határ
Egy alkotó meghatározási határ (LOQ: Limit of Quantification) az a legkisebb
koncentráció, amely még elfogadható pontossággal és precizitással határozható meg.
Értékét a vak válaszjeléhez (alapvonal válaszjele) tartozó tapasztalati szórás tízszeresével
számoljuk (10. Táblázat).
vakvakk SDJJ 10+=
A vizsgálatot az LOD vizsgálathoz hasonlóan standard oldatokkal végeztem
ugyanazon okból kifolyólag.
37
LOQ
Komponens Koncentráció /
µg/cm3 Jel/Zaj
Asztaxantin 0,1 56,5
Alfa-karotin 0,1 13,3
Béta-karotin 0,1 10,1
Béta-kriptoxantin 0,1 10,5
Likopin 0,1 5,0
Lutein 0,1 26,8
Retinol 5,0 11,6
Alfa-tokoferol 5,0 10,4
10. Táblázat: A kapott meghatározási határok
38
4. Módszer alkalmazása valós mintákra
A fejlesztett módszert sikeresen tudtam alkalmazni cinketojások sárgájának
vizsgálatra. A vizsgált mintákat tojásfehérjétől elválasztva, lefagyasztva kaptam meg.
A minta-előkészítés során a tojássárgáját négyszeres mennyiségű Isolute® C18e
töltettel homogenizáltam, majd szűrővel ellátott fecskendőbe töltve egy órán át hűtőben
tároltam. A töltet vízzel történő mosását követően a célkomponenseket diklórmetánnal
eluáltam, majd a kapott oldatot nitrogén atmoszféra alatt szárazra pároltam, végül
diklórmetán és metanol 1:4 arányú elegyével oldottam vissza. A visszaoldás során kapott
oldatból 10 µl-t injektáltam kromatográfiás rendszerbe.
Az 18. ábra egy cinketojás karotinoid és vitamin tartalmának meghatározása található.
m in0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
50
100
150
200
D AD 1 A, S ig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAR OTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD-1301.D)
6.5
56
- A
stax
anth
in
7.5
93 -
Lut
ein
+ Z
eaxa
n
12.
402
- b
eta-
Cry
ptox
anth
in
15.
323
- L
ycop
ene
16.
253
- a
lpha
-Car
oten
e 1
6.56
8 -
bet
a-C
arot
ene
D AD 1 B, S ig=295,4 Ref=off (071011\071011_KAR OTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD-1301.D)
12.
277
- a
lpha
-Toc
ophe
rol
D AD 1 C, Sig=325,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD -1301.D )
6.7
83 -
Ret
inol
18. ábra: Cinketojás minta 295, 325 és 450 nm hullámhosszon felvett kromatogramja
39
5. Összefoglalás
A munkám során sikerült egy olyan módszert kidolgoznom, mellyel a szabad
vitaminok és karotinoidok meghatározása elvégezhető tojássárgájából. A módszer
lehetővé teszi a vegyületek pontos minőségi és mennyiségi meghatározását, még olyan
kisméretű tojások esetében is, mint pl. a cinketojás.
A módszer három fő lépésből áll: (1) MSPD; (2) extraktum bepárlása majd
visszaoldása; (3) vitaminok és karotinoidok elválasztása és meghatározása HPLC-DAD
rendszeren. A három lépés kombinálásával a célvegyületek egyszerűen, megbízhatóan és
gyorsan vizsgálhatók tojássárgájából.
Vizsgáltam a módszer teljesítmény jellemzőit, mint specifikusság, érzékenység,
linearitás, torzítatlanság, precizitás, stabilitás, kimutatási és meghatározási határ.
Sikerrel alkalmaztam a kidolgozott módszert cinketojás vitamin és karotinoid
tartalmának meghatározására.
További terveim között szerepel egy HPLC-APCI-MS/MS módszer kifejlesztése a
vegyületek még gyorsabb meghatározása és a kimutatási határ csökkentésének
érdekében.
40
6. Köszönetnyilvánítás
Köszönettel tartozom témavezetőnek Dr. Eke Zsuzsannának, aki mély szakmai
ismeretével kiemelkedő támogatást nyújtott munkámhoz.
Köszönöm Dr. Torkos Kornélnak egyetemi konzulensemnek a tudományos
diákköri dolgozatom elkészítéséhez adott segítségét.
Köszönetemet fejezem ki Tölgyesi Lászlónak, Benesóczki Dórának és Angyal
Vilmosnak a munkám során nyújtott szakmai támogatásért és Juhászné Kovács Évának a
minta-előkészítés során nyújtott segítségért.
Köszönettel tartozom még az EKOL-ban tevékenykedő kollégáimnak, valamint a
munkám során használt anyagok és eszközök biztosításáért a Kromat Kft.-nek és a
Wessling Kht.-nek.
41
7. Függelék
7.1. Vizsgált vegyületek
asztaxantin α-karotin
127-40-2 432-70-2
Sigma Aldrich Sigma Aldrich
β-karotin β-kriptoxantin
7235-40-7 472-70-8
Sigma Aldrich Carotenature
42
likopin lutein
502-65-8 127-40-2
Carotenature Carotenature
reitnol α-tokoferol
68-26-8 59-02-9
Sigma Aldrich Sigma Aldrich
43
zeaxanthin
Nem elérhető
Carotenature
1. Függelék: A vizsgált komponensek szerkezeti képlete és CAS száma
44
7.2. Specifikusság vizsgálata
min2 4 6 8 10 12 14 16 18
Norm.
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\1CC-1401.D)
6.6
04 -
Ast
axan
thin
7.6
38 -
Lut
ein
12.
433
- be
ta-C
rypt
oxan
thin
14.
347
- Ly
cope
ne
16.
241
- al
pha-
Car
oten
e 1
6.59
9 -
beta
-Car
oten
e
19. ábra: 5 μg/cm3 koncentrációjú standard oldat 450 nm detektált kromatogramja
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
20
40
60
80
100
DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AB-0201.D)
6.5
16 -
Ast
axan
thin
7.5
28 -
Lut
ein
12.
366
- be
ta-C
rypt
oxan
thin
14.
483
- Ly
cope
ne
16.
326
- al
pha-
Car
oten
e 1
6.69
0 -
beta
-Car
oten
e
20. ábra: Tyúktojás minta 450 nm detektált kromatogramja
45
min2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
100
200
300
400
500
DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AF-0601.D)
6.5
29 -
Ast
axan
thin
7.5
52 -
Lut
ein
12.
391
- be
ta-C
rypt
oxan
thin
12.
728
14.
301
- Ly
cope
ne
16.
198
- al
pha-
Car
oten
e 1
6.55
1 -
beta
-Car
oten
e
21. ábra: Adalékolt tyúktojás minta 450 nm detektált kromatogramja
min2 4 6 8 10 12 14 16 18
Norm.
0
25
50
75
100
125
150
175
200
DAD1 A, Sig=450,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD-1301.D)
6.5
56 -
Ast
axan
thin
7.5
93 -
Lut
ein
12.
402
- be
ta-C
rypt
oxan
thin
14.
010
- Ly
cope
ne
16.
252
- al
pha-
Car
oten
e 1
6.56
8 -
beta
-Car
oten
e
22. ábra: Cinketojás minta 450 nm detektált kromatogramja
46
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Norm.
-5
-2.5
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
DAD1 B, Sig=295,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2CC-1701.D)
6.8
13 -
Ret
inol
12.
284
- al
pha-
Toco
pher
ol
23. ábra: 50 μg/cm3 koncentrációjú standard oldat 295 nm detektált kromatogramja
min2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
20
40
60
80
100
120
DAD1 B, Sig=295,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AB-0201.D)
6.5
34 -
Ast
axan
thin
6.7
44 -
Ret
inol
7.4
78 -
Lut
ein
12.
239
- al
pha-
Toco
pher
ol
24. ábra: Tyúktojás minta 295nm detektált kromatogramja
47
min2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
20
40
60
80
100
120
DAD1 B, Sig=295,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AF-0601.D)
6.5
44 -
Ast
axan
thin
6.7
61 -
Ret
inol
7.4
99 -
Lut
ein
12.
259
- al
pha-
Toco
pher
ol
14.
301
- Ly
cope
ne
16.
190
- al
pha-
Car
oten
e 1
6.39
5 -
beta
-Car
oten
e
17.
128
25. ábra: Adalékot tyúktojás minta 295nm detektált kromatogramja
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Norm.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
DAD1 B, Sig=295,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD-1301.D)
6.5
57 -
Ast
axan
thin
6.7
74 -
Ret
inol
7.5
86 -
Lut
ein
12.
276
- al
pha-
Toco
pher
ol 1
2.48
2 -
beta
-Cry
ptox
anth
in
14.
225
- Ly
cope
ne
26. ábra: Cinketojás minta 295 nm detektált kromatogramja
48
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Norm.
-5
-2.5
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
DAD1 C, Sig=325,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2CC-1701.D)
6.8
13 -
Ret
inol
27. ábra: 50 μg/cm3 koncentrációjú standard oldat 325 nm detektált kromatogramja
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Norm.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
DAD1 C, Sig=325,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AB-0201.D)
6.7
44 -
Ret
inol
7.4
82 -
Lut
ein
11.
986
- al
pha-
Toco
pher
ol
28. ábra: Tyúktojás minta 325 nm detektált kromatogramja
49
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
10
20
30
40
50
DAD1 C, Sig=325,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2AF-0601.D)
6.5
28 -
Ast
axan
thin
6.7
61 -
Ret
inol
7.5
01 -
Lut
ein
16.
179
- al
pha-
Car
oten
e 1
6.41
5 -
beta
-Car
oten
e
29. ábra: Adalékolt tyúktojás minta 325 nm detektált kromatogramja
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Norm.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
DAD1 C, Sig=325,4 Ref=off (071011\071011_KAROTIN 2007-10-11 11-50-02\2BD-1301.D)
6.5
57 6
.783
- R
etin
ol
7.5
86 -
Lut
ein
30. ábra: Cinketojás minta 325 nm detektált kromatogramja
50
7.3. Linearitás és érzékenység vizsgálata
2. Függelék: Kalibrációs görbék ábrázolása
51
7.4. Torzítatlanság vizsgálata
3. Függelék: Torzítatlanság vizsgálatakor kapott eredmények ábrázolása
52
53
8. Irodalomjegyzék
[1] Hollósi M., Lackó I., Asbóth B.: Biomolekuláris kémia I., Nemzeti Tankönyvkiadó,
Budapest, 2005.
[2] Dr.Tegledy Kováts L.: Válogatott fejezetek az élelmiszerkémiából, Vitaminok és
egyéb hatóanyagok, Tankönyvkiadó,Budapest 1966.
[3] Lipidperoxidáció és biológiai antioxidáns védelem, Előadás, www.mkk.szie.hu
[4] Dr. Bíró Gy., Dr. Lindner K.: Tápanyagtáblázatok, Medicina Kiadó, Budapest, 1999.
[5] H. Schwabl Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 90 (1993)
11466-11470
[6] M. Andersson: Sexual Selection. Princeton University Press, Princeton, 1994.
[7] J. Török, R. Hargitai, G. Hegyi, Z. Matus, G. Michl, P. Péczely, B. Rosivall, Gy.
Tóth Behav. Ecol. Sociobiol 61(4) (2006) 541-550
[8] R. Hargitai, Z. Matus, G. Hegyi, G. Michl, Gy. Tóth, J. Török Comp. Biochem. and
Phys. Part B 143 (2006) 145-152
[9] Vitamin-meghatározási eljárások természetes anyagokban, Magyar Élelmezésipari
Tudományos Egyesület, Budapest, 1977.
[10] S.A. Barker J. Biochem. Biophys. Methods 70 (2007) 151-162
[11] S. J. Lehotay, K. Mastovska, S. J. Yun J. AOAC Int. 88 (2005) 630-8
[12] S. Bogialli, R. Curini, A. DiCorcia, M. Nazzari, M. L. Polci J. Agric. Food Chem.
51 (2003) 4225-32
[13] V. J. Agrawal J. Chromatogr. 624 (1992) 411-23
[14] S. Bogialli, A. DiCorcia J. Biochem. Biophys. Methods 70 (2007) 163-179
[15] N. R. Fernandez-Alba, M. D. Lopez Martinez, M. Contreras Special publication-
Royal Society of Chemistry 269 Biologically-Active Phytochemicals in Food (2001)
280-2
[16] K. Putzbach, M. Krucker, K. Albert, M. A. Grusak, G. Tang, G. G. Dolnikowski J.
Agric. Food Chem. 53 (2005) 671-7
[17] K. Putzbach, M. Krucker, M. D. Grynbaum, P. Hentschel, A. G. Webb, K. Albert J.
Pharma. and Biomed. Anal. 1088 (2005) 224-33
[18] T. Glaser, A. Lienau, D. Zeeb, M. Krucker, M. Dachtler, K. Albert
Chromatographia 17 (2003) 1146-56
54
[19] Jr. G. W. Chase, Y. Lin, V. C. Stoakes, R. R. Eitenmiller, A. R. Long J. AOAC Int.
87 (2004) 1173-8
[20] A. Lienau, T. Glaser, M. Krucker, D. Zeeb, F. Ley, F. Curro et al. Anal. Chem. 74
(2002) 5192-8
[21] T. Glaser, M. Dechtler, K. Albert GIT Labor-Franz 82 (1999) 663-8
[22] M. Dechtler, T. Glaser, K. Kohler, K. Albert Anal. Chem. 73 (2001) 667-74
[23] A. J. Meléndez-Martínez, I. M. Vicario, F. J. Heredia Review: Analysis of
carotenoids in orange juice 20 (2007) 638-649
[24] A. Pyka, J. Sliwiok J. Chromatogr. A 935 (2001) 71-76
[25] R. A. Jacques, J. G. Santos, C. Dariva, V. J. Oliveira, R. B. Caramão J. Supercritical
Fluids 40 (2007) 345-359
[26] M. F. Nonier, N. Vivas De Gaulejac, N. Vivas, C. Vitry C. R. Chimie 7 (2004) 689-
698
[27] European Pharmacopoeia 6.0 01/2008:20229
[28] Kremmer T., Torkos K., Szókán Gy.: Elválasztás technikai módszerek elmélete és
gyakorlata, Eötvös Loránd Egyetem Természettudományi Kar Egyetemi jegyzet,
2005.
[29] Dr. Fekete J.: A folyadékkromatográfia alapjai, Jáva-98 Kft. Bp. 2003.
[30] J. M. Humpheries, F. Khachik J. Agric. Food Chem. 51 (2003) 1322-1327
[31] D. Talwar, T. K. K. Ha, J. Cooney, C. Brownlee, D. St JO’Reilly Clinica Chimica
Acta 270 (1998) 85-100
[32] B. S. Inbaraj, J. T. Chien, B. H. Chen J. Chromatogr. A 1102 (2006) 193-199
[33] J-P. Steghens, A. L. van Kappel, E. Riboli, C. Collombel J. Chromatogr. B 694
(1997) 71-81
[34] R. W. S. Weber, H. Anke, P. Davoli J. Chromatogr. A xxx (2007) xxx-xxx
[35] T. Lacker, S. Strohschen, K. Albert J. Chromatogr. A 854 (1999) 37-44
[36] L. C. Sander, K. E. Sharpless, M. Pursch J Chroamtogr. A 880 (2000) 189-202
[37] J. Sclatterer, D. E. Breithaupt J. Agric. Food Chem. 54 (2006) 2267-2273
[38] . P. Chen, C. Y. Tai, B. H. Chen J Chromatogr. A 1054 (2004) 261-268
[39] D. Siluk, R. V. Oliveira, M. Esther-Rodriguez-Rosas, S. Ling, A. Bos, L. Ferrucci, I.
W. Wainer J. Pharm. and Biomed. Anal. 44 (2007) 1001-1007