Virologia-Guia de Lectura

8/7/2019 Virologia-Guia de Lectura

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GUIA ELECTURA

Nov. 2006: corte de In Av. Sc m Martin en rechozo 010 ocrediloci6n de 10corroro de velerinorio 010 CoNEAU

FACU lTAD DE C IENC IAS VETERINAR IASUNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

2008


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,VIROLOGIAQUIA DE LECTURA

EDlcrON 2008

Autores: MV, MSc, PhD Gustavo DelhonMV, PhD Ana Cristina BratanichMV Marcelo Gonzalez

Vet. Luis JaureguiVet Danilo BucafuscoSrta. Susana Zacarias

Vet. Maria Amelia Gisbert


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PrologoIn curso de Virologia Animal tiene el caracter de curso h}lSico: El fundamento de

este enfoque es brindar al estudiante las herramientas biologicas con las cuales abordar Iaproblernatica de los virus en otros coutextos, sean medicos 0 productivos, Por su simplezarelativa, los virus se ofrecen como excelentes modelos para el analisis del parasitismo anivel molecular, tanto en el contexto de Ia celula como del huesped. Desafortunadarnente,ninguno de los textos clasicos sobre Virologia Fundamental ha sido traducido a1castellano.Este apunte ha sido confeccionado en base a esos textos y a publicaciones peri6dicas en laespecialidad, Lejos de reemplazar al mencionado material, tanto en nivel de cobertura comoen organizacion y extension, el apunte fue concebido como una guia para ayudar alestudiante a conceptualizar los fundamentos que subyacen a los virus como agentes quealteran la homeostasis.

Area'de VirologiaFeV

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IndicePagina

I . , Q u e es un virus? .Historia de la Virologfa .,............................ 2Taxonomla de los virus................ 8Estructura de los virus 32Genetica viral 49CicIo infeccioso 64Efectos de los virus sobre la funcion celular. 105Virus y Apoptosis 113Virulencia 117Respuesta inmune especifica e inespecffica a las infecciones virales 121Tipos de interaccion entre virus y celulas ., .,., 139Antivirales 154Evolucion de las enfennedades virales 163Esterilidad, Desinfeccion, Bioseguridad 167Cultivos Celulares ., 176Aislam iento .., 180Cuantif icacion 186Microscopia Electronica 189PCR 195


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i,Que es un_virus'?

Un virus es un parasite intracelular obligatorio, muy pequeiio e infeccioso, constituidopor proteinas, acidos nucleicos y, a veces, fosfolipidos.El ac ido nucleico , que puecIe SCI' RNA 0 DNA , constituye el genom a viral.Dentro de una celula huesped apropiada, el genom a viral es replicado hasta obtenermultiples copias del mismo. A su vez, el genoma viral dirige 11intesis de las proteinasvira le s u tilizan do L am aq uin aria b io sin te tic a d e 1 1c elula .La progenie viral se forma a partir del ensamblaje de las proteinas y acidos nucleicosvirales.La progenie viral es el vehiculo para la transmision del genoma viral a una nueva celulao animal, donde su desensamblaie inicia un nuevo ciclo infeccioso.Los virus son mucho mas simples que los microorganismos mas pequefios y carecen dede los sistemas generadores de energia y biosinteticos necesarios para una vidaindependiente. Pew no par ella los virus son los agentes mas sencillos. POl' ejernplo, losviroides son moleculas de RNA que infectan (y enferman) a una variedad de plantas deirnportancia economica. Los priones son simples moleculas de proteinas capaces deinducir enfermedades desvastadoras en los animales y elhombre.


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Historia de fa Yirologj~

La caracterizacion de los virus mencionada am ba necesrto decadas de investigacion,En rigor, hasta la Segunda Guerra Mundial solo sabiamos que los virus eran agentesinfecciosos muy pequefios: producian enferrnedad y atravesaban filtros que retenian a lasbacterias. Inicialmente, el termino virus se empleaba eon cierta ambiguedad para referirse adistintos agentes, pero hacia el final del primer cuarto del sigh) XX su uso se limite a losagentes filtrablesPara apreciar el contexte en que surge el concepto de virus debemos retrotraemos alos afios en que se define el concepto mismo de infecciosidad. Hacia el ultimo cuarto delsiglo XIX ocurrieron tres avances serninales en 1 2 1 historia de la Microbiologia: 1) LouisPasteur demuestra que la generacion espontanea de organismos no existe, 2) Robert Kochvalida fa teoria de los gerrnenes como agentes causales de enferrnedad, 3) Joseph Listerobtiene un cultivo puro de bacterias. Estos conceptos se volvieron el paradigma dominantede la microbiologia medica hacia fines de siglo y, al misrno tiernpo, establecieron unametodologia experimental a ernplear en todas las situaciones: el agente debla aislarse de laslesiones, cultivarse en estado puro y reproducir la enfermedad luego de Ia inoculacionexperimental.

En 1892, Dimitri Ivanowski publica la primera evidencia de un agente infecciosofiltrable. Can un extracto de hojas de tabaco enferrnas pasado por un filtro de porcelana(que retiene la mayoria de las bacterias y hongos), Ivanoswki pudo transmitir la enfermedada plantas sana.'>.Uno de los postulados de Koch (que el agente infeccioso debe ser aisladoen cultivo puro) no pudo ser satisfecho por el trabajo de Ivanowski y este opta por pensarque algo falla en sus metodos'. Siete afios mas tarde, Martinus Beijerinck repite losexperimentos de Ivanowski y los extiende observando que el agente puede rcproducirse entejido vivo pero no en medics artificiales como los utilizados can bacterias. Denomina alagente contagium vivum jluidum. Con ello cornienza un largo debate acerca de la naturalezadel agcnte: no era microscopicamente observable; era muy pequefio para ser una bacteria.El hecho que se reproduzca (en las hojas de tabaco) excluia 1aposibilidad de que se trate deuna toxina.

El desconocimiento de su naturaleza no irnpidio el hallazgo de nuevos agentesfiltrables en un breve periodo. Asi se descubre el agente de la fiebre aftosa que causaenferrnedad pustular en el ganado (Loeffler y Frosch) y, poco despues (1901), Walter Reedreporta el primer agente filtrable que causa enferrnedad en hurnanos, el virus de Ia fiebreamarilla. Diez afios despues Francis Peyton Rous demuestra que ciertos agentes filtrablescausan sarcomas en las gallinas y en 1915 Frederick Twort descubre accidental menteagentes filtrables capaces de matar bacterias (bacteriofagos). Asi, en el termino de 15 afiossabemos que los agentes filtrables infectan muchos organismos diferentes (eucariotas yprocariotas), que algunos son transmitidos par artropodos (fiebre amarilla), y que otrospueden causar tU1110res (virus del sarcoma de ROllS ). Para la decada del '30, el termino"virus" comenzaba a reernplazar al de agentes filtrables, pero su naturaleza seguia siendounmisterio.

1 C urio sam ente, c asi un siglo m as tarde, el m ism o apeg o a lo s paradig m as do min antes sem bro de dudas Jo strabajos que llevaron a! descubrimiento de los priones por Prusiner y su s colaboradores,

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Fue un virus de plantas, el virus del mosaico del tabaco CTMV) objeto de estudio deIvanowski, quien jugo un rol decisive en la determinacion de la naruraleza y propiedades delos virus. A principios del siglo se desarrollaron las tecnicas para purificar enzimas.Los virus purificados podian moverse en un campo elecrrico de manera similar que lasenzimas. Cuando el virus era inoculado en conejos, se producian anricuerpos queneutralizaban su infectividad en las plantas. Estos ballazgos apuntaban a que los virus erande naturaleza protcica. Trabajos C()l1 bacteriofagos dernuestran la presencia de acidosnucleicos. Esta hie la p rim e ra s ug ere nc ia de 1 2 1 naturaleza nucleoproteica de los virus'.

En 1935, Wendell Stanley cristaliza al TMV de la rnisma manera que los quimicoscristalizaban proteinas. Los cristales forman bastoncitos de diametro constante. En 194 I 1 2 1forma de baston del virus es confirmada mediante microscopta electronica. Al promediar elsiglo XX sabiamos que el 'fMY estaba representadopor particulas formadas porsubunidades que se ensamblan para original' los bastoncitos de las electromicrograflas.Quimicamente, esta compuesto por proteinas y RNA. Es mas, los bastoncitos podian serdesagregados en subunidades protei cas y RNA a partir de los cuales podia reconstituirsevirus infeccioso. Se debieron espcrar algunos afios mas para comprender con mayorexactitud como proteinas y RNA se ensarnblan para constituir una particula viral.

Para entonces se tenia en clam que el TMV, como todas las entidades vivas yreplicativas, podia mutar y que por 1 0 tanto tenia material genetico. Simultaneamente, losexperimentos de Avery con bacterias y de Hershey-Chase con fagos habian finalmentedernostrado que la informacion genetica reside en el DNA de los organismos. En 1953,Watson y Crick resuelven la estructura atomica del DNA Fue en la decada del '60 (Iamisma en que se descifra el codigo genetico, se reconoce al ribosorna como fabrica deproteinas y al RNA como el mensajero intermediadrio) cuando se demuestra que 1ainformacion genetica del TMV reside en el RNA viral: no s610 el DNA podia servir comodeposito de 1a informacion genetica. Quedaba claro que los virus podian alrnacenar lainformacion genetica en DNA (virus a DNA) 0 en RNA (virus a RNA).

En 1949, Enders, Weller y Robbins desarrollan un metodo para replicar virus invitro. Utilizan tejidos hurnanos para crecer virus de la poJiomelitis y con ella revolucionanla forma con que los virologos aislan y analizan las propiedades de los virus, EIrequerimiento de los virus de celulas vivas para replicarse los vuelve parasitesintracelulares obligatorios y asi los distingue de la mayoria de los agentes infecciosos.Desde 1950 hasta 1975 se producen avances extraordinarics en el estudio de losbacteriofagos. Entre otras cosas se analiza el efecto de 1a infeccion en 1a sintesismacromolecular de las celulas, observandose que el virus codifica nueva informacionexpresada como proteinas en Lacelula infectada, y que el virus puede existir en dos estados,litico y lisogenico,

La segunda mitad del siglo XX y con el impulso dado por los estudios en fagos, seproduce un avance expectacular en el campo de los virus, a tal punto que la Virologiaemerge como una disciplina por derecho propio. La cantidad de nuevos virus aislados(asociados 0 no a entidades previamente reconocidas) aumenta exponencialmente y seobserva gran variabilidad en su tamafio, resistencia a agentes ffsicos y quimicos y el tipo de2 Tengamos en cuenta que aun se desconocia que los acidos nucleicos constitulan el material hereditario delos organismos.

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enfermedades que producen. El empleo del microscopic electronico demuestra que, pese alas diferencias de tamaiio, los virus caen en unas pocas categorias rnorfologicas.

Los trabajos de Enders y col disparan el desarrollo de los cultivos celulares para Iapropagacion de virus animales. Para cuando tween su aparicion tecnicas de BiologiaMolecular, los virologos cuentan ya con sofisticados metodos de cultivo celular que lespermiten analizar d ciclo replicative de los virus en las celulas a nivel molecular,cuantificar precisamente las preparaciones virales, e incluso elaborar vacunas con mayoreficiencia.

Los biologos celulares tomaron pronto nota de Ia relativa sirnplicidad de los virus yde su potencial para el analisis de las funciones celulares. Muchos avances en BiologiaCelular provinieron de estudios con virus animales: cl splicing del RNA, los oncogenes, losfactores de transcripcion, la transcripcion reversa, el trafico macromolecular endocelular, Infusion de membranas biologicas, la replicacion del DNA, los enhancers, etc, EI desarrollode Ia Virologia estuvo tempranarnente asociado al de la Inmunologia y ambas rarnas de laciencia nos han iluminado en la descripcion del complejo escenario que se menta durante lainfeccion de un animal asi como de las estrategias para prevenirla. Aunque los cultivoscelulares permitieron examinar las interacciones virus-celula, su relativa simplicidad nopudo reernplazar a los modelos animales para el analisis de las interacciones entre los virusy los tejidos y sistemas del huesped, especialmente el sistema inmune. Los virus han tenidomucho que ver con los grandes avances en el campo de la respuesta inmune mediada porcelulas T Fue un virologo, F. Burnet, quien forrnulo la teoria de la toleranciainmunologica. Jack Miller, trabajando con retrovirus descubrio que la ausencia del timo alnacimiento Ileva a ciertos tipos de inmunosupresion, En 1973, Rolf Zinkernagel y PeterDoherty, trabajando can el virus de la coriorneningitis linfocitaria murina (l.,CMV),postulan la restriccion en el reconocimiento antigenico por celulas T impuesta por lasmoleculas de histocompatibilidad.

La Virologia se encuentra en perpetuo movimiento, El cambio de milenio nosencuentra con resonantes exitos: e.g erradicacion deliberada del primer virus humane(viruela; ultimo caso reportado, Somalia, 1977). Y con desaflos enormes: en 1999 sereportaron 5,8 millones de nuevas personas infectadas con el virus del SIDA (HIV).

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I 17981885

p 5 Z ~ i ! 1 ~ I : o i l o ~ T ( ~ I ; ;acun , ~ - z ~ ; - ; ~ t ~ a - l a - ~l~;Zl;l--YCj enn(:;--'" ~-I Produccicn de la vacuna contra la rabia L. Pasteur.! Transmision de una enfermedad viral en D_IvanowskiPlantas.1892

]898 M.W. BeijerinckF. Loeffler and P. Frosch

V. Ellerman and O. Bang.

P. Rous

F.W. Twort, F. D'Herelle.R.E. Shope.

W, Smith, C.H. Andrews, and P. Laidlaw.

G.A. Kausche et al.

M.Delbruck

r.r. BittnerJ.F. Enders et al.

A. Lwoff et al.

A.D. Hershey et al.

F.L. Schaffer and C.E. Schwerdt.H. Fraenkel-Conrat and R.C. Williams.

1937 Reconocimiento de la naturaleza F.C. Bawden, N.W. Pirie.nucleoproteica de un virus de las plantas.

1938 Datos cornparativos de los tamanos de los W.l Elford, R. Doerr, C. Hollauer.virus.

Los virus se reconocen como agentesresponsables de enfermedades de [asplantas (TMV) y los animales (aftosa).

1 9 0 8 Identificacion de un virus causante de 1aleucemia aviar.1 9 1 I Identificacion de un virus causante del

sarcoma aviar.1 9 1 5 Descubrimiento de los bacteriofagos.1 9 3 3 Identificacion de un virus causante decancer en mamiferos. (papiloma del

conejo),Aislarniento del virus de Ia influenzahumana.

1 9 3 9 Visualizacion electrornicroscopica de unvirus. (TMV).1 9 4 0 E lu ci da ci on d el cicio replicative de un

fago.1942 Descubrirniento de un virus RNAtumorigenico para mamfferos (MMTV)1 9 4 9 Desarrollo del cultivo de celulas para elcrecimiento del virus polio.1 9 5 0 Demostracion de la induccion del fago

lisogenico.1952 Dernostracion de que el DNA de fago esinfeccioso.1 9 5 5 Cristalizacion de polivirus.1956 Demostracion de la infectividad de RNA

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LT.);:m;;Sira(:T6;;d~-T;~--"ii;dUCci6nuimica dernutaciones (TMV)19 9 Descubrimiento de los parvovirus.1963

A. Gierer and KW Mundry

L KiJham andLOlivier1960 Establecimiento de Ja secuencia de Tsugita et al,

arninoacidos de una proteina de capside(TMV)

1962 Establecimiento de la estructura icosaedrica D, Kasp ar a nd A_ Klugde m uc ho s viru s.

1970 Demostraci6n de [a presencia de un oncogen P,H. Duesberg and P.K. Vogten el virus del sarcoma de Rous.

1973 Demostracion de la transduccion estabJe de E.M. Scolnick et al.i nf orma c io n v ira l de la celula a un virus.

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Determinacion de Ja secuencia nucleotldica W. Fiers et al.de un virus (fago)

Se descubren los virus RNA de doblecadena (reovirus).

1967 Estab!ecimiento de Ia naturaleza de losviroides,1968 Demostraci6n de la segmentaci6n delgenoma del virus de la influenza.

Descubrimiento de la transcriptasa reversa

1976 Se demuestra que un oncogen viral (src)tiene su contrapartida en las celulas.

1977 Se descubre el splicing de RNA enadenovirus.1978 Secuenc ia de DNA de un virus animal

(SV40).1980 Descubrirniento de un retrovirus asociadocon leucem ia en humanos.

Erradicac ion de un virus epidemicovirulenro d e h um an os (v iru ela ),

1981 Fabricacion de una vacuna por medio detecnologia de DNA recombinante (aftosa).1982 E! v i rus vacc in i a utilizado pa ra e xpr es arantigenos de otros patogenos,1983 Aislamiento de un retrovirus humaneasociado con el SIDA

P.l Gomatos and L Tamm

'I.O. Diener W. Raymer

P.E. Duesberg

H. M. Temin, S. Mizutani, D.Baltimore

1M. Bishop.

L.T. Chow et al.

W.F iers, V . Reddy.

B J. Po iesz et a1 .

World Health Association

D .G . K le id et a!.

D. Panicali, G.L. Smith

F.Barre-Sinoussi et al


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11{-ci,~~)v;ru;~~;';m(;-vectore;ill-~ 1t1-~~rtar~ I - i ! Pdtten et -a igenes en la linea germinalEst ru c tu ra c ri st al in a de I inovirus con una M .G Rossm ann et al.resolucion de J A. I!

1986 Dernostracion de la estructura tipo viroide KWang et al, Chin et al,de! agente de la hepatitis delta del hum ane.

19831988 Evoluc i6n del concepto de prion. S .B . Prusiner

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Taxonomia de los virusEn los sistemas biologicos complejos formados por numerosos miembros, se

impone necesariamente la clasificacion En Virologia, imcialrnente los sistemas declasificacion se basaban en caracteristicas tales como [as propiedadespatogenicas de losvirus 0 el tropismo tisular. Por ejernplo, el grupo de los "virus de la hepatitis" comprendtavarios virus de propiedades bastante distintas que poseen In caracteristica comun deproducir enfermedad hepatica en humanos: virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B,virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus de 1a fiebre del Valle del RiftActuamente, todos ellos pertenecen a grupos distintos de virus y la propiedad de inducirhepatitis es una de las pocas caracteristicas que com patten. Para la decada del '60 y anteel descubrimiento exponencial de nuevos virus de animales, plantas y bacterias junto a 1anecesidad creciente de un sistema universal de clasificacion, surgen varios comites denomenclatura y clasificacion de virus. Los mismos proponen un sistema de agruparnientoen base a propiedades comunes que utiliza taxones clasicos como familias, subfamilias,generos y especies. En este afio (2005) el Comite Internacional de Taxonomia de Virus(ICTV) ha propuesto la existencia de, 3 ordenes, 73 farnilias, 9 subfamilias, 287 generosy 1938 especies de virus 1. De las 73 familias, cerca de 24 incluyen patogenos del hombrey los animales.

La Taxonornia, al igual que los virus, evolucionan, A medida que sabemos mas delos virus podemos refinar mas la posicion de un virus dentro de un grupo dado. Entoncesno es inusual que un virus que hace . 5 0 10 afios pertenecia a un genero dado, hoypertenezca a otro. A medida que se perfeccionen los metodos para el analisis de los virus,nuevas carnbios son de esperar. Por otro lado, existen numerosos virus que aun no se hanestudiado profundarnente y que por 1 0 tanto no han sido asignados a ningun grupo enparticular (virus huerfanos).

La forma en que los virus son caracterizados con fines taxonomicos cambiarapidamente. En el pasado, se utilizaban unas pocas caracteristicas tales como Iamorfologfa del virion, el tamafio, la estabilidad frente al pH 0 la temperatura, y laantigenicidad. Una tecnica que tuvo gran impato en Ia clasificacion de virus fue la tincionnegativa para el examen por microscopia electronica (Brenner and Horne, 1959), Latecnica perrnite determinar en una misma preparacion el tamafio, forma, estructura de lasuperficie, presencia de envoltura y simetria de los virus. La ultima adquisicion de lossistema taxonomicos fue la incorporacion de los datos provenientes de la secuenciacionde los acidos nucleicos virales. La sccuenciacion del genom a (total a parcial) se realizahoy a1principia del proceso de tipificacion de un virus, incluso con fines diagnosticos,Actua1mente se disponen de bases de datos accesibles via Internet donde se encuentranlas secuencias genomicas de los principales miernbros prototipos de todos los tax ones. Elimpacto de esta innovacion fue tal, que la secuenciacion de DNA 0 RNA viral hapromovido por sf sola la creacion de familias y/ o generos antes de que se dispongan deotros datos acerca del virus. La secuenciacion de los acidos nucleicos derive en elconocirniento de la organizacion de los genomas y estrategias replicativas, ambascaracteristicas que hoy en dia tambien se utilizan con fines taxonomicos. Las secuenciasgenomicas son cruciales para el avance de 1a taxonornia filogenetica tal cual veremosI Ver la Iista completa de virus con nombre en: www.viro!ogy.net/Big_Virology/BVViruslist.html

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http://www.viro%21ogy.net/Big_Virology/BVViruslist.htmlhttp://www.viro%21ogy.net/Big_Virology/BVViruslist.html


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despues. En la fig. 1 se resumen las propiedades de los virus utilizadas con finestaxonomicosE i . g ! r r E t 1: Propiedades de los virus utilizadas en taxonomiaPropiedades dt;I_yiriQ!1

MorfologiaT am ano del v irio nForm a del virionP re se nc ia d e p ep lo rn er osPresencia 0 ausencia de envolturaSimerrla y estructura de la caps ide

P ro p ie da de s f ls ic o qu tr ru c asMasa del virionDensidad de f lo t ac i onCoeficiente de sedimentacionE stab ilid ad ill p HE sta bilid ad te rm i caE sta bilid ad a nte canones, s olv en te s, d ete rg en te s, i rr ad ia ci cn , etc

GenornaT ipo de ac ido nuc leicoT am afio d el g eno rnaPresencia de un a 0 do s cadenasLinear 0 circularSentidoNumero y r a rnano d e f ra gmen to sS ec ue nc ia d e n uc le otid osP re se nc ia d e sec ue nc ia s re pe tid asPresencia de isomerizacionContenido en GCPresencia 0 ausencia y tipo de cap 5'Presencia 0ausenc ia de pro teina covalentem ente unida a extreme 5 'Presencia 0ausenc ia de po lyA en 3 '

ProteinasN urn ero , ta m afio , y f un c io ne s d e p ro re in as estructuralesN um ero , tam ano , y fu nc io ne s d e p ro te in as n o e stru ctu ra le sSecuencia de aminoacidosGlicos i lacion, fosforilacion, miristi lacion,Mapeo de epi topes

LipidosC on te nid os, tip o

Car bo h i dra to sC on te nid o, tip o

O rganizac ion del genom a y replicacionOrganizacion de ! genomaEs tr at eg ia r ep li c at iv eNumero y po sic ion de marcos d e l ec tu raCa ra ct er is ti ca s d e l a t ra ns cr ip c io nCa ra c te rt st ic a s d e l a t ra du c ci onS itio de acum ulac ion de pro teinas viralesS itio d e ensarn blaje del virio nSitio y naturaleza de la m adurac io n y lib era cio n d e v irio ne s

pro]iedacl9s antigGni[J!sRelaciones serologicas,

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Propiedades bioh}giJl;:iRange de huesped natural, tropismoModo de transmision en la naturalezaRclaciones con el vectorDistribucion geograficaPatogenicidad

Cuando se aisla un nuevo virus se siguen una serie de procedirnientos generalestendientes a ubicar la nueva entidad en alzuno de los taxones conocidos. Uno de los,.'procedimientos es Ia tincion negative para microscopia electronica la cual brindarapidarnente informacion acerca de la estructura del virion. En rnuchos cases, esto essuficiente para asignar virus en algunas de las farnilias. De no serlo, puede recurrirse aladeterminacion del acido nucleico viral, Ia caracterizacion antigenica y/o a lasecuenciacion parcial del genoma seguida de la comparacion con secuencias existentes enlos bancos de datos. Estas cornparaciones son 'Miles ya que permiten rapidarnente asociar1anueva entidad con grupos pre-establecidos de virus.La clasificacion de BaltimoreEn 1971, David Baltimore sugirio un esquema de clasificacion viral basado en la formaen la cual un virus produce su mRNA durante 1a infeccion. Todos los virus deberanproducir un mRNA para Ia sintesis de protein as pero 1aforma en que 10 hacen dependeradel tipo de genorna viral ( tipo de acido nucleico y polaridad). Asi surgen:Clase I: DNA doble cadenaClasell: DNA simple cadena po Iaridad positivaClase III: RNA doble cadenaClase IV: RNA simple cadena polaridad positivaClase V: RNA simple cadena, polaridad negativa,Clase VI: RNA simple cadena, polaridad positiva, con retrotranscripcion a DNA.En realidacl, el numero para cada clase no se aplica usualmente pero la division segunacido nucleico y polaridad es uno de los criterios mas importantes utilizados hoy en dia,junto con las caracteristicas morfologicas de la capside y la presencia 0no de envoltura.

EI sistema se basa en la existencia de niveles jerarquicos. Las familias de virusocupan Ia jerarquia superior' y las mismas se denotan empleando el sufijo viridae. Unafamilia comprende un grupo de virus que comparten caracteristicas comunes que losdiferencian de los miembros de otra familias (tabla 1), La mayo ria de las familias de virustienen una morfologia, organizacion gen6mica y estrategia replicativa caracteristicas,indicando una asociacion filogenetica'. En cuatro familias de virus se han incorporado2 En rigor, los ordenes ocupan ese sitio. Sin embargo, hasta el presente s610 un orden de virus ha sidoasignado y par ello no nos extenderemos mas al respecto. El orden Mononegavirales cornprende lasfamilias Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, y Filoviridae. Notar el sujijo virales utilizado para designarordenes,3 Ello no quiere decir que dentro de una familia, dos virus muestren una gran distancia filogenetica, Aun enese caso, la distancia que los separa sera menor que la existente con un tercer virus perteneciente a otrafamilia.

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subfamilias para permitir una jerarquia mas cornpleja de taxones entre virus que muestranrelaciones mas complejas entre sus rniembros. Las subfamilias se dcnotan con el sufijovtrtnae. Los generos de virus representan agrupamientos de virus que POSCCilcaracteristicas cornunes pem distintas de los miembros de otros generos. Los generos sedesignan con el sufijo virus. Los criterios para defin ir un genera varian entre familia yfamilia.E! taxon "especie' ha sido el mas diflcil de caracterizar en Virologia. Despues dealios de controversia, 11ICrV acepto 1a siguiente definicion de especie: "una especie devirus se define como una clase politetica (esto es. definida por mas de una propiedad) devirus que constituye un linaje replicative y ocupa un nicho ecologio: particular". Estadefinicion acomoda la variabilidad inherente de los virus y no depende de ningunacaracteristica (mica del virus. Queda clare que el termino especie es definido de manerasimilar al terrnino virus, pera en varias ocasiones el termino virus se corresponde mejorcon subespecies, cepas 0variantes. Muchas veces, 11aislar un virus y caracterizarlo, es

_ . - , -- ,Familia Caracteristicas-- - _-------_._------

RNA sim p le c ad en aPo la ri da d po si t i v aC an envo ltu raTranscr ipc ion d i scon tinua HerpesviridaePoxviridae

Virus RNAPicornaviridaeCaliciviridaeAstroviridae

RNA sim p le c ad en apo la ridad posi ti vas in e nvo l tu ra

TogaviridaeFlaviviridae

RNA s imp le c aden apolaridad positivaCon e nv ol tum

Coronaviridae

ParamyxoviridaeRhabdoviridaeFiloviridae

RNA sim p le c ad en apo la ridad nega tiva

con envo l tu ra

~ c"Familia ." -------,~~-CaracteristicasVirus DNAHepadnaviridae DNA do ble y s imp le c a denaCon envo ltu raC on ve rsio n d e RNA g en orn ic oa DNACircoviridaeParvoviridae

DNA sim p le c ad en as in envo l tu ra

PapovaviridaeAdenoviridae DNA do ble cadenasin envoltura

DNA d ob le c ad en ac on envo ltu raIridoviridae

Sin nombre: ASFV

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Agentes subvirales: satelites, viroides yRNA sim ple cadena Prionespolaridad negativa 0

OrthomyxoviridaeBunyaviridae

en. ambos sentidos Genero huerfano: DeltavirusGenoma sc grn en ta doC on e nv ol tu ra

RN/\ simple cadenaPolaridad negativeDefectuoso. sate lite

RNA doble cadenapolaridad positiva

Genorna segmentadoS in envo lt ur a

Taxon sin definir: agentes de las encefalitisespongiformes (nombres a asignar)

Sin acido nucleicoPr iones C 'pro te ina sautoreplicativas")

ReaviridaeBirnaviridae

Retroviridae RNA sim ple cadenaP ola rid ad p os itiv eConversion a DNA ........._----------...... ... _

diflcil determinar si eJ mismo debe ser design ado como una especie 0 como una cepa deuna especie. Para ilustrar los problemas asociados a la definicion de especie,mencionaremos eI caso de dos retrovirus que afectan a los ovinos, el virus del tumornasal enzootico (ENTV) y el virus del Jaagsiekte (JSRV), EI ENTV causa tumorcs en lacavidad nasal mientras que el JSRV causa tumores pulmonaresv El genoma de ambosvirus po see una longitud prornedio de 7000 bases y la comparacion de las secuenciasrevela una similaridad del 9YYO.Cube preguntarse si un 5% de diferenc ias es suficientecomo para cataloger a dos virus como entidades diferentes. Sin embargo, al inocular elENTV en una oveja se desarrollan tumores nasales y no pulmonares, y al inocular elJSRV se desarrollan adenomas pulmonares pero no tumores nasales. Segun nuestradefinicion de especie, se trata de virus distintos, muy similares, pero distintos, Cada unose relaciona can dos patologias caracteristicas. Es interesante considerar que parte de ese5% de diferencias se concentran en los genes que codifican para la proteina que usan losretrovirus para ingresar a las celulas.

Los virus RNA son un verdadero problema para la nocion de especie. Durante lainfeccion natural del hue sped por un virus RNA se producen muchas variantes genomicas(por razones que tratarernos oportunamente). Cada una de estas variantes tiene elpotencial de adaptarse rapidamente a distintos ambientes. Actualmente se refiere a estasvariantes naturales can la denorninacion de "cuasiespecies".

El siguiente cs un ejemplo de la terminologia taxonornica aplicada al virus de larabia: Orden Mono negavirales, familia Rhabdoviridae, genero Lyssavirus, virus de larabia, Muchas veces se emplean terrninos vernaculos como, por ejemplo, "losparamixovirus", pero aqui no sabemos a ciencia cierta si se esta haciendo referencia a lafamilia Paramyxoviridae, al genera Paramyxovirus, 0 a alguna de las especies delgenero.Taxonomia filogenetica

Como los virus no dejan fosiles, se pens6 que nunca se encontraria evidencia parapro bar que dos taxones tenian raices evolutivas comunes. Cuando surgio la secuenciaciondel genoma como herramienta para la clasificacion, fue evidente que existian muchos

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dominies funcionales conservados en sus proteinas. A pesar de que los genomaspertenecientes a especies de distintas farnilias son muy diferentes, tambien es obvio quevirus distintos (incluso fami 1ias distintas) poseen ciertas sernejanzas a nivel genetico (yasea la organizacion de sus genes, 0 Ia existencia de secuencias para dominies proteicosque posecn funciones similares). Estas relaciones filogeneticas empezaron a reflejarse enel esquema taxonornico. POl' ejemplo, la razon por la cual sc creo el ordenMononegavirales surgio al reconocer que los genes para las protein as del nucleocapsidede las familias constituyentes se organizaban de manera similar y sus productos eranparecidos. A medida que mas y m as similitudes se rcconozcan, mayor sera Ia tendencia aconstruir ordenes de virus, Nosotros volverernos sobre estos ternas mas adelante en elcurso a proposito de tratar la evolucion de los virus,

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'Y{1!Jil1il{ ) f1ke;yJJ j I11Ql.. M e }Q IolltbiL!1!I,[()j(Wfjy!.f_flWm !2])J)XV ass.dt1iSpcta I I IQQ_[1 , iJ!lllol]WJ!OXY[Cl!S' ( j[rQf1Ql?1!!S Iw"jd1!,I

Chloriridovirus------------ - ---- ------------- B Q ! . 1 < D ! . i ! J 1 'y

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Larue Satellite RNAs_._:__~~~,~b,~.'~m~,.m~..~"""" ..,..'.".~._._.'___

Rel~renc~_Fauquet, CM., Mayo, M.A., Maniloff, J,Desselberger, U., and Ball, LA. (eds) (2004). Virus Taxonomy,Vlllth Report of the fCTV. Elsevier/Academic Press, London, pp. 1258.Copyright 2002 ICTV. All rights reserved:Last Updated January-2005Assembled for ICTVdB by Dr. Cornelia Bttchen-Osmond, ICTV Database Management, Earth Instituteand Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, New York, N

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C 'm __ __~~~~ . ~ __ ~_ ~ . ~~~~ . m~"""_ ."" """ ~

Papilornavirus H 9 . Y l m ! Fibropapilorna!J~?yino 'i~l_ _.~_._.__._ cutaneoidem caballo Sarcoide_----- ..~..~-..._ _ . . . . . . ._----bovine Fibropapilo rna

cutaneoTipo 2

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......-....-..- .__ ._------PiQfQPJll . iJQma c L e lRQIQH-- .._---- ----.------.r ~ ~ w J . hm l ! l y : Lm : _ ; pVlfjg FibropapilornaR Y ! [ 1 Q _ " _ _ _ _ _ _ _ _ . _

p_ ajli\Q ID fly irus Q flP l!l_Q . 9 1 1 ! n Q--.".~ ._ _-- ~.---- ..~ ~".~_- -.-- ..- .._------.jP C J R i lQ T l Ji lv 1 1 '\ .1 5 . mJrCil!Cl E . < m L k j j E a cut( iJ!COgllital .m.lrcltW

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cutaneo........-- ~ -- .__-_ .._ . _ - - - - . . . . . . . . . . ,E~lpilomacutang~~.....-._-.....-.-..- -.------.--t ...---.-.......- ....- .--- ...--------jI~?p_Ugmav i r. .!;; p~~Jro E ; : m i !OJI1iLQIa IwilL G1I1in Q.......-- -..--I--- -------!~ -._---_-.-._-----------1~2ilQ m a\jin~onG :l!! !:l!pjhm )a qt1


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H e r p ; ; s ' , ; i ~ - l ~ - S ~:;~[;~~j[o-~-----"x a n t ~ ; ; ~ . ; t.,oital. _ . ~ r ~ t l t J f a ~ I T ~ . ; ' U l l i g~qllil~~). . . . ._ . _ .__ _ , _ _Herpesvirus perro Enferrnedad S l ll : l_ f a m 0 m < ! U i !Cimino 1 hem orragica de los

cachorros---~-------R ino traqu eitis v i ric a . 5 .W 2 fm n i 1 i,U1IH!felina

t! erpesvi rus equ m oequirl_o 2~__ ~~_~-----l- __.__.. .._~ . _Herpesvirus cerdo Rinitis futQfamiUfl_ be!,!p~~?im~?_~_ _

bovino

~)oxvirus bovine - ..- ...-- . - .. .--.-----~P seud ov iru ela b ov ina p arap ox virus

......... _ - - - - _ ..._-----__ .------Herpesvirus gatofeline 1......... _ _ .._ -._.._---~----- ................... _ _ .._ .._._._---Herpesvirus pollo Laringotraqueitis

infecciosaviar 1.._ ___-1--.._------_ --.--.-.-.-Herpesvirus bovinebovine J

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--- ------F ie br e c a ta rr almalizna___ ~ __ ,_o_ __ . Paralisis,linfomatosis

--__- ____._._____-----jS~ll;ttlHJlUi'Lg~ma

.. _ . . . ._-_ ..._------V i ru el a o vi ll a capnpoxvirusV irus de M arek pollos

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f-------+-----::-------f~~__~~.-.~-~___+~~.~--. ~----lcerdo V iruela pore ina suipoxvirus........-._-_ ----~~-----1ortopoxviruso vi no , g ato ,1----------+ eleK'~I}te, conej .Q___pollos ....-.-------------------+---- --------------1Viruela avipoxvirus. . ~ - - _ . . . ~ _ . w o _ _ _ m - ~-------------___lParvovirus cerdo Aborto, muerte

_ _ g _ ( ~ H 'C } I _ ~ ( ) ~ P ~ E i_ ~ _ ~ ! _ ~ _ 1 .. . . _Panleucopenia gato Enteritis, hipo,felina Cereb ..............-- ..~ - -.-.---.-----+-~--- -.Parvovirus perro En te ri ti s, m i o c ardi ti scanine-~.~--.----;-.-.--.--.----t- - -- -.~.+::--;----Enterovirus bovina Infecciones Picornabovine tipos 1 subclinicas enteroa7Enterovirusporcinos I a 11

, ~_~ __ ~ ~L '~LIdem pero el !produce__ ._ ... ---:-_+- __ , .~ _+'p~~?~ ..I--c.e.falomielitis

Enferrnedad porcino Enfermedadvesicular vesicular po rc inalES)fcinaEnterovirusaviares

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Encefalornielitisaviar

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[\'1 1 ~ ~ d ;- i~~- T M-an;l-feros en - -- - I~l~0 t'!~~dll-i(;~m(}carI j ;i c; ;Knd -encefalomiocar I contacto con dins cardiod!!_ is_ . _ _ _ _ro~~(~e~- -_ __ _ _ t ~ -I Rinovrrus bovine Rinitis I! bovinos 1-3

-...------.~-- -- -_ -- -.- ---- 1--------_ .._ ------ - ...V irus G etah Equine FiebreVirus de la Bovino,ovinn Signos respiratoriosdiarrea viral y entericosbovinaVin; -~-de la--cerdo-----~ 111f~~cc~'~(}-n----~----

Rinovirus"3u.f:'.~~?_L}_Virus delafiebre aftosa: 7tip~):o.Virus de!exanternavesicular

.a~ CalicivirusfelineV irus de laencefali tiseq uin a del este,oeste yVenezuela

equm o RinitisRurniantes y cerdo Fiebre aftosa

. - ---c--~~--- _ . _ ..__.Jcerdo V esiculas I

I Enfermedadrespiratoria alta,11eUlY!0n ~-, -_!~l~erasEncefalit is

gato

Equino (hombre)

peste porcine generalizada.----._ - _---_._--1-------- - ------cquino Aborto, inf

arteritis equina G eneralizada._ ..._- -- . . . .- . . . .~- - .--.- . . . . .~-- ...-- . . . .---~- .. ------Virus de Oveja (hom bre) Encefalitislouping illV irus de laenfermedad deWesselsbron

-._ -_._-1--- ....._-----Oveja (hombre) Inf. Generalizada,aborto

. . _ _ ~ . . _ c . _ , c _ . _ , ~ _ _ ~ ~ ,_cc_ __Cerdo (hombre)irus de lae nc ef al i ti stlp_~llles!l:.. _Influenzasporcina,

.--""-"""--""-"-"~~~"Enc ef a l iti s, a bo rt o

Cerdo, caballo,polio, resp,

Respiratorio~~__il, ..a~~. .__ . ___ .__V. Conejo, roedores Respiratorio_ p a ra i l 1 ! l u c . r . : s _ _ ( l 1 ~ - - - .- - . - . . - -: para inf luenza perro Respiratorio_l_(Y 5) .. ._. 1-------_ .-..-.--._ ...--.V _ rumiantes Respiratoriop arainfluen za 3-------.-- ..---__-- --1-- ..__---__-------.--..Virus de aves Signos nerviosos

-------1-.----......---.-.Generalizado

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gastroenteri (ist ra nsm is ib le p or ci na--.-~--------.-~r--c:---~------.-~--~--~------~.-- -~--------- . -~-.-.".--.V irus de la p eritonitis G ato Peritonitis, neum onia, Coronavirus, grupo 1~1f~c.t:_i!:'~~fl'![!~_~.(_f'!.~l~

General, nerviosoanidos y otros

. . . f - - - . - - . - ~ - acaovejao c " ~ . __ , C_~~T_ ~_~ .


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Virusbovina

oncovirinae

~ .~ "~ """"""cnW"" __ --+~Virus de mardi-visna_.........................-..~~+....--.-----~- ..-!---..~-.~-.-- .......- ...~-_.. .._-_._. __.._._----_--de la artritis Cabra Artritis, encefalomielitis Retrovirus, lentivirinaeencefalomicl itiS(;.~pr_ iT~ __ _. f__ - :__-- _Virus de la anemia Caballoinfecciosa cquina(~:l~).__ ___ __.~.~ ... ..__~ _

_ _ . . . . . . . . . . . . . - _ _ - -~ - -_ .- _ _ _ _ - - . - . _... . . _ ~ -- - .. - _ - .-._ _ ._ _.-.._.- _ .Virus d~l leucemia Gato leucemiat : ~ ~ J l < l _ (Y ! t :Y 2. ._ . .Virus del sarcomafeline

(Jato sarcoma+ - - _ _ - - - - _ _ _ - - - - - _ ._ ._ I- _- ..- ----~Oveja NCUl110nia progesiva

anemia .-___._____.._-------IRetrovirus, lentivirinae

Retrovirus, spumavirinae

Retrovi rus , spumavi rinaeArtritis, nefrosis, enteritis,et cOrtoreovirus aviares Pollo

Virus vacuolizante Vaca ningunobovine- - - - - - _ . - - _ _ _ 1 - - - - - - - . - - - - - . - - - - - - - , - - - - . - - - . . . - . . . - - - -Virus vacuolizante Gato ningunafeline

V irus de la lenguaazulV iru s l ba ra ki

Rumiantcs Lengua azulVaca Parecido a lengua azul

...-.--~.~-- - - - ---.- ~ - ..--~ - -- --.~. -..-.--- --- ~-- -~ - - ..-.".-~-Virus de la peste Caballo, asno, cebra, pesteequina africana mula---_.._-_--_ ...__ .. . -.-.--"-~-----~Virus de la Caballoence fa lo s is equ in a1- 5Rotavirus

pancreatica de lospeees

. r ~_"~~~""~__ '_"~_"~ C


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Cada partlcula individual de virus rec ibe el nornbre de VIrion Las p artic ula svirales estan disefiadas para la transmision efectiva del genorna viral de una celula a laotra 0 de un animal a otro. Una funcion del virion es proteger al genorna viral de Iaruptura 0 de la m utac ion durante su Else extracelular. En particular, la c apside del virio ncumple un rol fundamental en la proteccion del genoma. Las proteinas de la capsideposeen sofisticados plegamientos y se hallan empaquetadas de forma muy compacta, detal forma que resisten la digestion por las enzimas proteoliticas.

Al referirnos a la estructura de un virion es conveniente distinguir entre los siguientesterminos:

Protomero (0 unidad estructural): conjunto de proteinas (iguales 0 distintas) queforman el bloque unitario de un ensamblaje mayor. Por ejemplo, VP 1, VP2, VP3 yVP4 son cuatro proteinas distintas que constituyen los pro tom eros del virus de lapolio 0poliovirus,Unidad de ensamblaje. conjunto de proteinas o de protorneros que operan comointermediaries en Ia formacion de una estructura mayor (ej, el pentamero de VPI enel virus SV40).Unidad morfologico (capsomere): se refiere a las regiones 0 "clusters" observablessobre la superficie del virion con cl microscopic electronico. Generalmente se trata delas partes de las proteinas que se proyectan desde la superficie viral alrededor de losejes de simetria.Capside: la cubierta proteica que rodea al genoma viral. Los terminos ingleses coat 0shell se refieren a Ia capside.Nucl eo copsid er s e refiere al complejo completo de proteinas y acido nucleico quesuele utilizarse especial mente en cases donde la nucleocapside es una subestructurade particulas virales mas complejas.Envoltura: bicapa Iipidica y proteinas asociadas que rodean muchos tipos departiculas virales.Virion: la particula viral cornpleta.

En principio, cualquier tecnica destinada al estudio de 1a estructura de los virusrequiere la obtencion de una suspension pura de virus. En la figura 1 se muestra unprotocolo clasico para producir virus libre de restos celulares.

La microscopia electronica es la mejor manera de determinar la estructura generalde los virus. Aunque pueden examinarse cortes ultradelgados de tejidos infectados, seobtiene mayor detalle cuando se emplean suspensiones virales purificadas que han sidotefiidas negativamente con, por ejemplo, fosfotungstato de potasio. Mientras que en uncorte podernos observar partfculas virales en diversos grades de maduracion, cuando seexaminan suspensiones de virus purificado predorninan las forrnas maduras 0completas,

La microscopia crioelectronica es una variante en fa cual la muestra se congela amuy bajas temperaturas (-160C) Yse mantiene as! durante la observacion. No se

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~~~- ~ sobrenadan te, ", ,(virus + restos'; 'f;, celulares]

restoscekt~ares

centrifug-aci6nr~~-Jellet(virus purificado)

Figura 1: Esquema de un protocolo de propagaci6n y purificaci6n de virus

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Ia secuencia de aminoacidos en el CHSO de las proteinas puras. Virus mas complejos nohan podido cristalizarse atm. En esos cases, las particulas son disociadas en unidades deensamblaje menores las cuales sf pueden purificarse y cristalizarse. Estes datos suelencornbinarse con los obtenidos por analisis de crioelectro-micrografias de particulascornpletas para obtener una imagen cornpleta y detallada de la estructura del virion.

o

E i g _ 2 _ : A ) V irus S indbis (RNA , envuelto , Togaviridaei. V ista de la superfic ie del virion. D erecha: cortetr an sv er sa l m o stra nd o l as g li co pr ote in as d e l a e nv ol tu ra ( pe ri fe ri a mas clara) y l a n uc le oc ap sid e p or d en tr o.D ebajo se m uesrra la superfic ie de la nucleocapside, B ) L a capdide de un calic ivirus (R NA . no envuelto,Caliciviridaey. C) Rota viru s ( RNA , n o e nv ue lto , Reoviridaes. L a p artfc ula tie ne tre s c apa s c on ce ntric as d eproteinas. Las espiculas que ernanan de In superficie estan forrnadas por la proteina VP4 la cual estaim p lic ad a e n e l re co no cim ie nto d el re ce pto r c elu la r, D ) H erp esv iru s (DNA, envuelto, Herpesviridaei. Laenvoltura no se incluye a los fines de rnostrar la nuc le oc apside euy a superfic ie c ontie ne una proteinae stru ctu ra l prin cip al, V P 5. (d e F un dam en ta l V iro lo gy , F ie ld s, B et a l, a = edicion).

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Existe una gran variedad de tipos morfologicos entre los virus. En la figura J scmuestra un esquema sencillo de una parricula viral con sus componentes. El clementemils externo corresponde a Ia envoltura, cuya estructura general es identica a la decualquier membrana biologica. Como no todos presentan membrana, los virus seclasifican enyjrus enyueltos y yirus 1 1 9 envueltos. Rodeada por Ia envoltura se encuentra1a capside, de naturaleza proreica y presente en todos los virus. La capside sirve a su vezde cubierta protectora para el genorna viral, RNA 0 DNA, d cual esta asociado a otrasproteinas, Como la capside y el genoma viral de ciertos virus estan intimarnenterelacionados, suele utilizarse el terrnino nucleocapside para referirse al complejocomplete de proteinas-acidos nucleicos. En algunos virus, la envoltura se hallafuertemente asociada a la nucleocapside. En otros, por el contrario, se describe un espacio(tegumenta) que es ocupado por otro set de proteinas, Las variaciones sobre estaarquitectura basica, que pueden ser significativas, se veran oportunamente al tratarindividualmente las distintas familias de virus.

tegumentofuura 3: Componentes de la particula viral.

La envolturaLa e nvo lt ur a esta constituida po r una bicapa de lipidos y proteinas asociadas. La

presencia de la envoltura no s610 es un rasgo morfologico, sino que imprime al virus eonun estilo de penetracion en la celula target 0 blanco y con una manera de interactuar conla rama efectora del sistema inrnune.

Las proteinas de la envoltura pueden ser transmembrana 0 asociarse con la bicapapor otras rnodalidades. La cadena polipeptldica de las proteinas transrnernbranaatraviesan una 0 mas veces la bicapa. Tlpicamente presentan tres dominies: uno interne,uno transmembrana y otro externo. Si se trata de una glicoproteina (gp), las cadenas deoligosacaridos se unen ai dominic externo. Los dominios extern os son particularmenteimportantes pues contienen los sitios de union a los receptores celulares, evento quemarca el inicio de la penetraci6n de los virus en las celulas. Por 1 0 tanto, Ia integridad dela envoltura es esencial para la infectividad de los virus envueltos. Los dominies extemos

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son importantes en otro sentido: son los blancos predilectos de la rama efectora de Iarespuesta inmune.FJ rol de las protein as de [a envoltura en la penetracion, no se limita 1 1 la union alos receptores. Para que el genoma viral pueda expresarse en la celula, debe desprendersede las estructuras que 1 0 rodean. Los virus envueltos se deshacen de su membrana, ya seaen la superficie celular 0 en los endosornas, al fusionarse con Lamembrana de la celula.La fusion entre las membranas dependen de las aptitudes fusogenicas de algunasproteinas de Ia envoltura.;,CuAntos tipos diferentes de proteinas de membrana tienen los virus? Elladepende del virus en cuestion. Por ejemplo, el virus de Ia rabia (Rabdovirus, RNA), posees610 dos tipos, la glicoproteina G y la proteina M. Existen unas 1200 copias de gp G pmvirion. La gp G es una protcina transrnembrana con un peso molecular de 63 Kd3, y esresponsable de la union a los receptores y de la fusion de Ia envoltura con la membranaplasmatica. La proteina M (26 Kd, 1800 copias pm virion) se encuentra del lado internede la envoltura y realiza contactos con la nucleocapside. En los paramixovirus (RNA), laglicoproteina fIN se encarga de la union a los receptores mientras que la gp F es el factorfusogenico. Otros virus mas cornplejos, como ciertos virus DNA, contienen mas de 10tipos de proteinas distintas en su envoltura. Observese, que el reconocimiento de losreceptores celulares y la fusion de membranas son funciones que pueden recaer sobre untipo de proteina 0bien repartirse entre dos 0mas proteinas distintas.

Otras funciones irnportantes de las proteinas de la envoltura son la destruccion dereceptores e intervenir en el denudamiento de 1 a nucleocapside, aunque las mismas estanrestringidas a un numero menor de virus.

La envoltura es adquirida en las etapas finales de In infeccion, antes de laliberacion de la progenie viral. El proceso por el cual la nucleocapside adquiere laenvoltura se conoce como gemacion ("budding" en ingles) y puede ocurrir en Iamembrana plasmatic a, en el aparato de Golgi en el reticule endoplasmico, segun elvirus. Las proteinas de envoltura se congregan en la membrana relevante y lasnucleocapsides luego "arrastran" la membrana resultando envueltas en el proceso, (,C


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La capside es esencialrnente una cubierta formada por repeticion de unas pocasproteinas (de un solo tipo de proteina en algunos virus). estructura de Ia c


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dobles, triples y quintuples de rotacion, un patron que parecc ser la forma mas eficientepam la disposicion de subunidades estructurales en una conforrnacion cerrada (figura 4),Existen exactamente 60 elementos identicos en fa superficie de cualquier estructura consimetria icosaedrica que ,)'C relacionen entre sf por ejes de rotacion dobles, triples yquintuples. Esto significa que 5 1 una capside esta formada par 240 unidades, las mismasdeben estar agrupadas en 60 sets identicos.

En la figura 5, las unidades, representadas por comas, se disponen obedeciendo alas leyes del icosaedro. Las comas relacionadas por ejes dobles de sirnetria contactan porsus cabezas, las relacionadas pm ejes triples, por sus cuellos, y las relacionadas por susejes quintuples, por sus colas. La siruetria del icosaedro establece que 3610 60 (como en lafigura) 0 un multiple de 60 unidades iQ~l1t.ica~pueden acornodarse en la estructura. En famayorla de los virus, cada unidad (coma) esta formada por !lUIS de una cadenapolipeptidica. En algunos, se trata de cadenas de la misma proteina mientras que en otroslas cadenas son quimicarnente distintas.

af J . r u r a 5. E stru ctu ra s c on s im e tria ic osa ed ric a c on te nie nd o 6 0 (a ) 0 180 (b) s ubun id ad es ,

(de Fundamental Virology, Fields, Bet al, 3ea edicion).

El multiple de 60 unidades que utiliza un virus para conforrnar su capside vieneindicado por el valor T. Asi, un virus con un valor T= 4 indica que posee 240 unidadestotales agrupadas en 60 sets identicos. El valor T tarnbien se conoce como valor detriangulacion por que da idea del modo en que la superficie del icosaedro puede sersubtriangulada para acomodar un gran numero de unidades.

Los virus con capsides mas grandes general mente ernplean diferentes tipos desubunidades para formar los vertices con ejes quintuples de rotacion (hay 12 de talesvertices en un icosaedro) y presentan adernas otros tipos de cornplejidad.

En algunos virus envueltos, los dominies internos de las proteinas de membranapresentan contactos con la capside. En estos casos se piensa que la movilidad lateral delas proteinas en la bicapa esta restringida, y que las proteinas se ordenan siguiendo losprincipios de la simetria del icosaedro.

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Pi\=g_mjly!nJ:;> (FtNA, no envueltos)Debido a su pequeiio tamafio y a la falta de envoltura, varies virus RNA de

polaridad positive.' han podido cristalizarse y su estructura tridimensional determinarsecon precision. En la figura 6 se muestra la organizacion estructural de la capside enPicornaviridae. Contiene 60 unidades estructurales 0 protomeros. Cada protornerocontiene cuatro subunidades, las proteinas VPI, VP2, VP3 y VP4 (del Ingles Yirion!')olypeptide). Como hay 180 de tales subunidades en el virion, organizadas en 60protorneros identicos, 'reel.

EiglJra6~ Organizacion de la capside de picornavirus. (de Fundamen ta l V i ro lo gy , Fields, B et 'II,3'" edicion).

Aunque VP4 se sefiala en la figura, esta proteina se encuentra enterrada en Ia capside yno contribuye a fa superficie del virion. C uando sc tratan viriones purificados con unas olu cio n d e Bel 0.1 M , pll 6 , el v irion se disoc ia liberando el genom a de RNA , V P4 Y 12pentameros compuestos por 5 protorneros cada una. Los pentameros pueden disociarse enpresencia de urea 2 M en sus protorneros constituyentes (figura 7).

4 Esto es, cuyo RN A aetna com o un m RN A dentro de la celu la,

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ac. clorhldr. 0.1MpH 6.37 C

....fI>-urea 2 M

- - - - - - - - - - - -pentamero prot6mero

virion[igUI1!I Disociacion del virion en picornavirus.

Este esquema de disociacion sugiere el mecanisme de ensamblado.Tanto VPl, VP2 como VP3 poseen un dominio cornun de unos 200 aminoacidos,

organizado como hoja plegada B y denominado "barril B" de la capside, La forma en quese pliega la cadena polipeptldica se muestra en Ia fig 8. Las cadenas B forman dos hojas(B, I, D, G y C, II, E, F)_ Las doble mayusculas (Be, HI, etc) indican los "loops" (partesdel polipeptido que unen las regiones 13y que pueden adoptar varias configuraciones)donde sc encuentran las mayores diferencias entre las VPs. Los cilindros indican regionesde c{,helices. Aunque los barriles B son comunes a rnuchas proteinas, el tamafio ydisposicion de los loops son exclusives de las proteinas virales. La forma de estosdominies les permite empaquetarse firmernente alrededor de los ejes de rotacion. Dehecho, dominios sirnilares se encuentran en las capsides de muchos tipos de virus,

superficie externa del virus

DE OH

BeH I

F GCD

FigUrjL~;_ modele de barril f3 de las proteinas de Ia capside.Los loops asf como los extremes carboxi-terminales protruyen hacia la superficie

externa del virion contribuyendo aS I a la antigenicidad del virion y al reconocimiento delos receptores celulares, Alrededor de los ejes quintuples de rotacion, cinco molecules deVPI interactuan (fig, 6, centro de la figura), se forma una depresion denorninada cation;En los rinovirus, el canon es el sitio de interaccion con el receptor celular ICAM- I, unaproteina de adhesion de la superfamilia de las inrnunoglobulinas. Los extremos N-terrninales de los barriles se encuentran en el lado interno de let capside interdigitandose yformando una red que dirige y estabiliza el ensarnblado.

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En algunos picornavirus, el virion sufre un carnbio conformacional a! interactuarcon la superficie celular. EI cambio es de tipo expansive, va acompafiado de 1 f : 1 perdida deVP4 del interior, y serfa disparado por la union a uno 0 unos pocos receptores. POl' ]0tanto, la union con el receptor no s610 prornueve Ia adhesion especifica del VJnIS a lacelula, sino que inicia el desensamblaje.Adenovirus (DNA, no envucltos)_~ '_~ __ _ _ ,___"c ~ ,____ ~~ . m~ ,__ ,_mT

Los adenovirus (Adenoviridaes poseen una estructura mas cornpleja que ladescripta anterior mente (fig.v). La estructura tridimensional de la particula fuedeterminada con una resolucion de 35 A mediante reconstruccion tridimensional a partirde micrografias crioelectronicas. Las particulas de adenovirus son icosaedricas y midenentre 70 y 100 nm (unas tres veces mas que los picornavirus).

, ftbra Hexer.protema asociada al hex6n

protema asociada al penlonbase

DAP (protelna asociada al DNA)

f jgU ta ._ 2 ._D i ag rama de l a pa rt ic u la d e adenovi ru sAnalisis electroforeticos indican la presencia de unos 11 polipeptidos diferentes en elvirion, 7 de los cuales estan en Ia capside formando 252 subunidades 0 capsorneros (240hexones y 12 pentones).

Cada hexon es un trirnero de un mismo polipeptido de 110 Kd (polipeptido II), elcual posee dos dominies con una configuracion global sernejante a Ia del barril {3 , Losloops del barril se proyectan hacia fuera interactuando firmernente con los loops de losotros barriles del hexon. Los loops contienen los principales determinantes antigenicosespecfficos de cada tipo de virus.

EI penton esta formado por una base pentarnerica (polipeptido Ill) y una fibratrimerica (polipeptido IV) y se Iocaliza en los ejes quintuples de rotacion (12 parparncula)". Cada base esta rodeada par 6 hex ones . La proteina de Ia fibra posee 225 L os n orn bre s d e h ex on y penton derivan del h ech o de que cada uno esta rodeado por 6 y 5 e lement osidenticos, respect ivamente,

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repeticiones que conforman el largo tallo y un extreme Cvterminal de 181 aminoacidosque forman la dilatacion en el extrerno. Se piensa que tanto la fibra como la base sonimportantes para ingresar a In celula. La dilatacion de la fibra media la union inicial y labase refuerza la union al interactuar con integrinas de In celula.

En los virus con simetria helicoidal, las unidades de la capside forman una helicealrededor del genoma con un eje de rotacion coincidente con el eje de la helice. POI"ejernplo, el TMV es un bastoncito rigido de 300 nm de largo POf 18 de ancho. Las 2130unidades de la capside se disponen en una helice hacia In derecha con 16 1/3 unidades porvuelta, El RNA se Iocaliza entre las vueltas sucesivas de la helice (fig. 10).

&ur~lQ. Estructuta helicoidal del virus del mosaico del rabaco (TMV) (de Fundamental Virology, Fields,B et al, 3r9 edicion).

Los virus codifican en su genoma las proteinas que necesitan para replicarse,ensamblarse, formar el virion, etc. Cuando hablamos de proteinas del virion nos estarnosrefiriendo a aquellas proteinas virales que forman parte de Ia particula viral,diferenciandolas de otros productos virales que, aunque esenciales para la replicacion delvirus, no integran las mismas. La mayoria de las proteinas del virion, como hemos visto,cumplen roles estructurales y, a veces, proteinas del virion y proteinas estructurales delvirus se utilizan como terminos equivalentes. Algunos virus poseen enzimas incorporadasen el virion. Por ejemplo, los retrovirus poseen en la capside varias copias de la enzima

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transcriptasa reversa la cual cum ple un papel decisive en el cilo de vida de este grupo devtrus. La forma mas directa de identificar las proteinas del virion es purificandolo.disociando sus proteinas y separandolas luego mediante electroforesis. Una forma delograr esto es infectar cultivos celulares en un rnedio en el cual Ia metionina normalpresente en 51 J cornposicion es reemplazada por 35S-metionina. En estas condiciones,todas las proteinas que incorporan metionina (y Ia gran rnayoria 1 0 haec) van a serradioactivas, y por extension, las particulas virales que se forman. Luego se cosecha elvirus y se 1 0 purifica siguiendo algun protocolo de purificacion, La purificacion esirnportante ya que tam bien las proteinas celulares seran radioactivas y si no se las separael gel contendra tanto bandas correspondientes a proteinas celulares como virales. Lasuspension viral luego se trata con un detergente como e1 SDS (dodecil sulfate de sodio)el cual disocia las proteinas del virus y anula sus cargas. Las proteinas disociadas Iuegose separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. En estas condiciones, laseparacion de las protein as en el gel es una funcion de su tamafio relative, y el misrnopuede estimarse si se corren simultaneamente proteinas con pesos moleculares conocidos(marcadores de peso molecular). Transcurrida Ia electroforesis, el gel de seca y se poneen contacto con un film. La radioactividad emitida por las bandas proteicas impresiona laemulsi6n del film y tras el revel ado se detecta como una mancha negra. Este ultimoprocedimiento se denomina radioautografia (fig" 1I),

Vp1 ~ -VP2_ ..VP3-VP4 :

mum l.l. Polipeptidos de rotavirus en particulas purificadas.Otro metodo muy utilizado que tarnbien emplea marcacion metabolica con un

aminoacido radioactive, requiere la produccion previa de anticuerpos especificos paraproteinas virales. En esta tecnica, denominada inmunoprecipitacien, las celulasinfectadas y marcadas son lisadas con un detergente, A este lisado (que contiene tantoproteinas celulares como virales) se le agrega un anticuerpo especlfico acoplado aparticulas inertes, En el l isado, los anticuerpos sc uniran a una p ro te in a v ira l de ta l formaque se formaran cornplejos proteina-anticuerpo-particula, los cuales pueden separarse delresto de los componentes del lisado mediante centrifugacion. Las proteinas viralespueden luego fraccionarse en un gel de poliacrilamida y visualizarse medianteradioautografla,

La tecnica de inmunoblotting (0 Wester blott) tambien se basa en reaccionesentre anticuerpos y proteinas virales pero en fonnato distinto y sin Ia necesidad de

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70000, 1 0 cual j lustra Ia relative sirnpleza de los virus" En este contexte, sorprende lamanera en que los genes virales dorninan la escena de Ia expresion genica una vez dentrode las celulas. En Ia figura 12 se com para Ja cantidad de DNA entre diversos orgam sm os.

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r; 100tog~ 50 I}~o.~_._~.~ ~~ __ . ._o~.~ ......

virus bacterias levaduras mosca mosca mamffero

rlg!lf.1 ! 12. Cantidad de DNA en diversos organismos (en millones de pares de bases)

Las restricciones espaciales de los virus obligan a una alta densidad genica, estoes, disponer de muchos genes en un corto tramo de acido nucleico, mientras que en lacelula eucariota los genes estan separados por largas secuencias no codificantes. En losvirus mas sencillos, los genornas contienen genes para las protein as estructurales y pocomas. En los mas complcjos, como los grandes virus DNA, el genorna se expande paraaceptar genes para enzimas del metabolisrno nucleotidico, la replicacion del DNA, eincluso para proteinas destinadas a modular al gran enernigo: el sistema inmune. Noexiste correlacion entre el nurnero de genes de un virus y Ia severidad de la enfcrmedadque ocasionan. Virus con un bajo mimero relativo de genes pueden ser desvastadores paraeI huesped, e.g. el HIV, mientras que virus con un numero relative alto de genes (e.g.poxvirus) pueden ocasionar enferrnedades benignas, No debemos perder de vista Iapremisa de que los virus solo "buscan" perpetuarse en la naturaleza adaptandose al nichoque mas le convenga. Ello puede requerir de una cantidad variable de productos viralesde acuerdo a Ia estrategia utilizada.

EI pequeiio tarnafio de los genornas virales ha perm itido let secuenciac ioncornpleta de incontables virus de plantas, bacterias y animales. La organizacion de losgenornas suele representarse con diagrarnas de distinto tipo, siguiendo ciertasconvenciones. En la figura 13 se esquematizan dos versiones de 1a organizaciongenomica del virus de la papilomatosis bovina 1 0 B PV - 1 (DNA , Pap i lomaviridaei . Elgeno rna del BPV-l es una rnolecula de DNA circular de doble cadena con 7946 pares debases, Su organizacion puede esquernatizarse en su version circular nativa (A) 0 en suversion linearizada (B} El BPV -1 poscc 10 genes. Algunos se expresan temprano duranteIa infeccion y reciben el nombre de genes E (Early= temprano), los otros se expresantarde durante la infeccion y reciben el nombre de genes L (Late= tardios). Unacaracteristica de todos los papilornavirus es que todos sus genes estdn codificados en unasola de las dos cadenas de DNA.

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3BPV-1 2

Eig_lJr~J}_. M apa genom ico del BPV - L Arriba) V ersion circular. EI c lrculo interne representa el genornacomplete de DNA de doble cadena. 79461! indica la posicion de la union del primer y ultimo par de basesque, por convencion, se coloca a las 12 hs de un hipotetico reloj. Las bases van aumentando hacia Iaderecha en el sentido de las agujas del reloj. Las lineas curvas externas representan las posiciones de losdistintos genes dentro del circulo. Por ejemplo, el genE6 esta codificado entre las bases 1 y 500,aproximadamente, el gen E4 entre las bases 3000 y 3500, etc. Las flechas que se apoyan sabre el circuloindican dos casas: J ) la posicion del sitio donde se inicia la transcripcion del gen, 2) el sentido (bacia laderecha 0 hacia la izquierda) en que se transcriben. POI' ejem plo, PS9rJ indica el sitio donde co rnienza atr an sc rib irs e e l gen E I; P indica que ha y un promotor y 89 0 es Ia primer base transcripta para E]_ N oteseque todas las flechas seftalan hacia la derecha indicando que, en este virus, todos los genes estancodificados en la misma cadena del DNA. f\ es el promotor para los genes tardios y LCR (Long ControlRegion, region de control larga) es una region del genoma viral que no conriene genes pero si senales parael control d e l a t ra ns cr ip ci on y la replicac ion de! DN A. AL Y AE (posiciones 7175 y 4203) indican seftalesde poliadenilac ion para genes LyE, respectivam ente. Adviertase que en m uchos cases existesuperposic io n de genes E. Los genes E6 y E 7 so n partic ularm ente interesantes ya que se asocian con latr an sfo rrn ac io n c elu la r. A bajo ) V ersio n lin ea l. En la parte inferior se m uestra la escala de bases del. DNA.Arriba 5C rnuestran los genes como bloques con sus llmites en numero de bases. Como en A, la eleccion dellugar donde ernpieza eJ genom a es arbitraria, L a direc cio n de la transcripc io n es de izquierda a derecha por1 0 que se deduce que el extrem e 5'de la cadena codificante esta a la izquierda y el extrem e 3' a la derecha,(Fundamental Virology, 3'" ed., Fields et al., 1995).

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Los genomas de los virus vienen en varios forrnatos. En la figura 14 se muestranlos mas comunes entre los virus de animales.

circulardobl e c a cena papilomavirllSpolyomavin.!s

l ineald o b le c adena ======~herpesviruspOXVJfUSl ineals imp le C 'c : ld ena oorvovuus

ciroular, parcialmente 0doble cadena ,~ hvpadnavims_ , , _ w _ . . _ , _~0_ , .1~. . ~m __ '~ ~ . ~_"~__ _ __ "~_ __ ._ ~~ .

linealsimple cadena

Picornavirus. TogavirvsCorona virus. RabdovirusParamyxovirus

Imeal, seqmentado,s imple cacena - .........---- Or th omyxo v ir u s , B u n ys v in i s,Arenavirus

hneal, segmentado, =: : ;: : : :: : .= ; ~ Reovirusdoble cadena

EiguraU. Diversos formatos de los genomas virales.EI cuadro corresponde a los genomas tal cual seencueruran dentro de las parttculas virales, ignorando el heche de que algunos pueden carnbiar deconfiguracion durante el ciclo infective dentro de la celula, NQlW los esquemas no tienen en cuenta lasdiferencias de tarnafio entre los genomas de los distintos grupos de virus.

i ,CCmlO se determina si el acido nucleico de un virus cs DNA 0 RNA? La formamas sencilla es purificando virus como, por ejemplo, se ilustra en la figura 1, y Iuegoseparando el acido nucleico de las proteinas virales mediante cualquier procedimiento deextraccion de acidos nucleicos (aunque estes procedimientos no son exactamente igualespara el RNA 0DNA). Estos son luego incubados con DNasa 0Rnasa las cuales digeriranselectivamente el DNA 0 el RNA, respectivamente, El efecto de 1a digestion puedeseguirse electroforeticamente 0espectrofotometricamente.

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La razon ultima por la cual nos interesa In genetica de los virus en CienciasVeterinarias es comprender como funcionan los genes virales cn el contexte del huespedy como manipuleamos para nuestro provecho. El conocimiento de la funcion genica esindispensable para comprender los mecanismos Intimos por los cuales los virus producenenfermedad. De hecho, los virus, por su relativa simplicidad, constituyen una oportunidadunica para descifrar las bases geneticas del parasitismo. Este conocimiento, a su vez,puede sugerir nuevas estrategias para combatir 0prevenir las infecciones virales,

La genetica de los virus ha pasado rapidamente de la genetica clasica a la basadaen las modernas tecnicas de Biologia Molecular. Una de las formas mas poderosas paraconocer la funcion de un gen viral es producir un virus que no pueda expresar esc gen ypar 1 0 tanto producir su proteina. Este mutante puede ser usado para infectar cultivos detejidos y/o animales y luego cornparar el fenotipo de la infeccion con el del virus normal.

Supongarnos que se construye un virus mutante al cual se Ie deleciona (se lequita) un gen, el gen W, Cuando infectamos celulas cultivadas con el virus mutanteobservamos que no se produce progenie viral. Esto puede deberse a una de rnuchasrazones: 1) el gen W codifica para la proteina encargada de reconocer al receptor celular,2) el gen W codifica para una proteina esencial para el desmantelamiento de la capside,3) el gen W codifica para un factor de transcripcion viral, 4) etc. Cualquiera de estasrazones podria justificar el fenotipo observado, esto CS, Ia falta de produccion deprogenie. En el primer caso, el virus no puede entrar ala celula; en el segundo, no puedeliberar su genoma; en el tercero, no puede expresar sus genes y POf 10 tanto producir lasproteinas del virus. Supongamos ahora que se toman micrografias electronicas de lascelulas infectadas y, sorprendentemente, se observan particulas completas en el lugaradecuado en tiernpos tardios de 1a infeccion. Una linea de razonamiento nos llevaria apensar que las posibilidades I, 2 Y3 son falsas, y que el gcn W debe cumplir algun ro1 enla Iiberacion de las particulas ya rnaduras. Refinarnientos posteriores nos llevaran aconocer en que fase del ciclo infective el gen W resulta crucial. Por 10 tanto, no nossorprenderia constatar que cuando infectamos un animal con el virus rnutante, este no seenferma pues el virus no puede replicarse. Provisoriamente podemos concluir que el genW (0 si se quiere, la proteina par 61 codificada) es esencial para el virus, pues sin 61 elvirus fracasa en su objetivo: replicarse.

Supongamos ahara que se construye otro mutante del misrno virus, pero esta vezse deleciona el gen Z, Cuando infectamos celulas con el mutante no encontramosdiferencias al cornpararlo con el virus normal, Produce progenie en la cantidad esperada yen los tiempos esperados. Decimos que Z es un gen no esencial para Ia replicacion viral.Sin embargo, cuando inoculamos animales con el virus rnutante, los sintomas tardan enaparecer y la enfermedad es mucho mas benigna que la causada tras Ia inoculacion con elvirus normal 0 salvaje. La conclusion es que el gen Z no es esencial para la replicacionviral in vitro pew sf es irnportante para producir la enferrnedad. La conclusion se vedareforzada si comprobasernos que el rnutante Z se replica a niveles norrnales en los tejidosdel animal, reforzando la idea de que las diferencias en el fenotipo no se deben a uninconveniente en la replicacion, Entonces deberiamos pensar que el gcn Z cumple algunrol mcdulando la interaccion del virus con su huesped, quizas a traves del sistema

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inmune, Por ejemplo, la proteina Z podria interferir con alguna citokina interfiriendo conla respuesta inmune, Al estar ausente el gen Z el sistema inmune puede eliminar masrapidamente al virus impidiendo que induzca patologia severa. In concepto a retener esque muchos genes virales que 110 parecen esenciales In vitro pueden ser cruciales para fainduccion de enfermedad en el animal.

En el pasado, los virus mutantes se obtenian accidentalmente en el Iaboratorio, 0se inducian especificamente con algun tratarniento. En la actualidad, con cl conocimientode las secuencias de los genornas virales y la capacidad de alterarlos de manerapredecible mediante tecnicas de DNA recombinante, los mutantes virales puedenobtenerse sobre una base racional, ya fuera para conocer las funciones de 10 genes 0paraproducir cepas vacunales.

Los terminos cepa, tipo, variante, y mutante se suelen emplear en Virologia sindernasiada discriminacion para indicar un virus que difiere de manera heredable de unaforma parental 0 salvaje ("wild type" en ingles). En la mayoria de los cases, un virussalvaje es una cepa adaptada en el laboratorio a partir de la cual se obtienen versionesmutantes y con la cual se compara el cornportamiento de dichos mutantes, Por 1 0 tanto, eltermino salvaje es un termino arbitrario que se asocia a una poblacion especifica de virus.Sabemos que en rnuchos casos 1 0 que consideramos salvaje puede que no refleje conexactitud al virus predominante en Ia naturaleza. Para subsanar esta arbitrariedad sediferencia claramente entre cepa::;salvajes de laboratorio y nuevos aislamientos de campoa partir del huesped natural los cuales se designan como aislamientos de campo 0sirnplemente aislamientos.

El terrnino cepa ("strain" en ingles) se usa para designar diferentes versionessalvajes del mismo virus. Por ejemplo, las cepas Orsay y New Jersey del virus de Inestomatitis vesicular, VSV (RNA, Rhabdoviridaey. EI termino tipo se ha transfonnadocon el tiempo en sinonimo de serotipo, tal cual se determina con ensayos deneutralizacion de In infectividad, por ejemplo los serotipos A, C, 0, etc del virus de Iafiebre aftosa (RNA, Picornaviridaei. E 1 termino variante se usa generalmente paraindicar un virus que es fenotlpicamente distinto del salvaje pero del cual se desconoce iab ase g enetic a d e Ia diferencia.I) Mutaciones

Algunos virus producen una alta proporcion de mutantes durante la propagacionen ausencia de mutagenos. Cuando estas rnutaciones espontaneas se acumulan en elgenorna terrninan reflejandose en el fenotipo. La tasa de mutacion en los virus DNA esdel orden de 10-8, esto es, se produce una mutacion cada 100.000.000 de nucleotidosincorporados en el genorna durante la replicacion. En los virus RNA, la rasa es de 10-4, unerror cada 10.000 nucleotidos incorporados. Existe consenso en atribuir la gran tasa dernutacion de los virus RNA a la baja fidelidad de Ia replicacion de los genom as RNA. Labaja fidelidad depende de la falta de actividad "editora" (proofreading) de las enzimas

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que replican el RNA J . Par 1 0 tanto, los genom as de los virus DNA son estables mientrasque los genornas de los virus RNA son inestables, a tal punto que se vuelve dificil aplicarel concepto de "especie" cuando tratamos de un virus RNA. Para ilustrar cste importanteconcerto tengamos en cuenta que cuando infectamos un animal can ciertos virus I~NA, esfrecuente aislar del mismo animal una poblacion heterogenea de virus con diferenciassustanciales a nivel genomico.

Los virologos constantemente propagan virus en cultivos de tejidos 0en animales.Con el tiempo, las mutaciones espontaneas se van acumulando y, como resultado, laspreparaciones de virus se vuelven hcterogeneas, con la subpoblacion de virus salvagerepresentando solo una fraccion del total. Para paliar este inconveniente y mantencr unapoblacion hornogenea de virus, los virologos recurren a la clonacion periodica de suspreparaciones. Aun 3s1, probablernente se trate de una utopia mantener poblaciones devirus geneticamente homogeneas.

La forma mas sencilla de inducir mutaciones es agregar un mutageno al rnedio decultivo durante la propagacion de virus. Entre los rnutagenos mas usados se encuentranlos agentes alkilantes, el acido nitroso, y los agentes intercaladores, cada uno con sumecanisme particular de accion. EI problema de esta estrategia reside en i quegeneralrnente se obtienen multiples mutaciones y no es posible atribuir un determinadofenotipo a una lesion puntual del gcnorna. Una propiedad de las mutaciones es Iacapacidad de revertir a1 estado salvaje, y cada mutacion tiene una frecuenciacaractertstica de reversion.

Como habiamos mencionado anteriormente, las tecnicas de Biologia Molecularpermiten hoy introducir cualquier tipo de mutacion en rnuchos virus. EI primer paso enesa direccion es clonar la secuencia de interes (la que queremos mutar) en un vector. Elsegundo paso es sorneter a nuestra secuencia a algun metodo de mutagenesis in vitro.Luego debernos introducir 1a secuencia mutada en el genoma del virus, Finalmente,debemos asegurarnos de que cualquiera sea el fenotipo observado, el mismo se debe a lamutacion discnada. Las tecnicas para generar virus mutantes por disefio varian entre losgrupos de virus ya que el tipo de genorna y las caracteristicas del virus determinan 1aestrategia a seguir. Examinemos brevcmente las estrategias mas frecuentes,

1) Para clonar la secuencia de interes, de alguna manera debe aislarse unfragmento del genorna que la contenga. La manera usual de hacerlo es cortando elgenoma con enzimas de restriccion y separando el fragmento deseado medianteelectroforesis en agarosa, El fragrnento es luego ligado en un vector, par ejemplo unplasmido, y las moleculas recombinantcs son introducidas en bacterias para suamplificacion (ver fig, 15)" Mientras que este procedimiento es apropiado para virus

IPor eI contrario, las polimerasas de DNA poseen actividad editora, esto es, la capacidad de detectar unnucleotide inccrporado por error e intercambiarlo par el correcto. EI hecho de que el 80% de los virusanimates sean virus RNA indica que la faits.de edicion no es un impedirnento para tener exito en lanaturaleza. Sin embargo, la falta de edicion parece ser una limitante para el tamafio de los genornas: losgenomas de los virus RNA no sobrepasan las 32 Kb,

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DNA de doble cadena, los Ie simple cadena as! como los virus RNA requieren pasosadicionales ya que las enzimas de restriccion no operan sobre ellos. Por ejemplo, losgenomas de virus RNA pueden transformarse en eDNA (copia de DNA) medianteincubacion con la enzirna transcriptasa reversa.

2) Una vez clonada Ia secuencia de interes, es po sible introducir Ia mutacion, Trestipos basicos de mutacion pueden introducirse. La m L 1 S sencilla es 1 8 delecion, en Ia cualse remueve un fragmento de DNA de nuestra secuencia mediante incubacion con enzimasde restriccion. La delecion es Ia mejor mantra de obtener mutaciones nulas, que

s ttlo s d e coste/pm3 eflzims Xgenoma vilal b:dd~,. J : c :2L ' . .C".. "~" ~cL .',"

O " ~ , . X

t:~ @:=)0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000

purificaci6ndo plasrnido

E igp@ _ U. E jem plo de c lonac io n de un gen viral

completarnente inactivan la funcion de un gen (ver m as abajo), Tambien resultan deinteres cuando queremos averiguar la funcion de una parte de una proteina (en estoscasos en vez de remover el gen entero se remueve una segmento del mismo). Sinembargo, no siempre los genornas contienen sitios de restriccion adecuados para elinvestigador. Para estos casos existen metodos alternatives como la mutagenesis dirigidapor oligonucleotides 0 el peR (reaccion en cadena de Ia polimerasa), requiriendo ambosun conocimiento previo de las secuencias involucradas. Un segundo tipo de mutaciones

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son las llarnadas rnutaciones por insercion, en las cuales no se rernueven secuencias del') C"~_.~'''''~ ~', viral sin ~ c"-o~~.r::. . .. .. .. ~. . inse rtan n0~-';:~f_c..~",.. .,~t);D foraneas (.~n ~l'j'l lugar determinado rl~ge!lUJU.d vua :--:UIU Y_UCI ~C Ul2;< tl-QH .:)l",..o\....


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sistema bajo estudio. En virus DNA medianos 0 pequefins el metodo mas cornun es Iigarel fragmento conteniendo la secuencia mutada directamenre con el genoma viral. Paragrandes virus DNA el metodo de la transferencia del marcador es uno de los mas us adosy se basa en el proceso de recornbinacion homologa. La idea central es introducir DNAgen6mico viral dentro de celulas junto con el fragmento de DNA que contiene lasecuencia mutada. La forma mas corriente de hacerlo es mediante transfeccion. Con bajafrecuencia, el fragmento con la secuencia mutada sera insertado en el gcnoma viralreernplazando al fragmento con la secuencia normal (recornbinacion hornologa). Para queclio ocurra, es critico que la secuencia mutada en el fragmento este flanqueada pmsecuencias normales. EI problema aquf es como detectar el virus mutante producido porlas celulas. Como la recornbinacion hornologa es un fenomeno raro, dentro de la progenieel virus mutante estara menos representado que cl salvaje. Por 1 0 tanto se debe recurrir aalgun metodo de busqueda de esas raras especies. Unos pecos genes, debido a suparticular funcion, penni ten directamente seleccionar en favor 0 en contra de suexpresion, Para In mayoria de los casos, pueden introducirse ciertos genes foraneos (e.g.el gen bacteriano J 3 galactosidasa) junto con la secuencia mutada, La expresion de Hgalactosidase en el virus permitira su seleccion ya que las placas originadas por el virusmutante se tefiiran de azul en presencia de un sustrato cromogenico como el Xvgal.

La introduccion de secuencias en ciertos virus RNA se ha visto facilitada con Iaproduccion de clones infecciosos. Basicamenre, se obtiene eDNA a partir del RNAgenornico y el mismo se dona entero en un vector apropiado. De csta forma se manipulael genoma como un vector y pueden introducirse secuencias mutadas mediante enzimasde restriccion. Luego se transfecta el vector en celulas las cuales produciran virus mutado(si Ia mutacion es viable). Otros rnetodos fueron desarrollados para In introduccion demutaciones en virus RNA de polaridad negativa.

4) La necesidad de asegurarse de que los fenotipos observados son resultado de lamutaci6n disefiada se debe a que durante los metodos mencionados arriba puedenintroducirse cambios en otras partes del genorna. Para reducir estos problemas puedenseguirse di versas caminosLlno de ellos es rnanejarse con secuencias cortas, con el fin decomprobar pm medio de secuenciacon que no se han producido otras mutaciones. Esconveniente obtener aislamientos virales independientes del mismo plasmido mutante. Silos aislarnientos independientes exhiben el mismo fenotipo, es probablemente debido alamutaci6n diseriada. La forma mas convincente, sin embargo, es mapear Ia mutacion parademostrar que la mutaci6n que confiere el fenotipo se encuentra en una secuenciadefinida.I-C) Tipos de mutaciones

Se pueden obstener distintos tipos de virus mutantes. Los mejores son aquellosfaciles de evaluar, razonablemente estables y portadores de una (mica mutacion.Mutaciones nulas: inactivan la funcion del gen. En principio, distintos carnbios en losacidos nucleicos (deleciones, inserciones, mutaciones por cambio de marco de Iectura)pueden generar el fenotipo nulo, aunque tambien es posile que esos carnbios dejenintactos segmentos de la proteina que retienen la funcion 0 parte de la rnisma. Ineluso esposible que los cambios introducidos sean eludidos por mecanismos de traduccion, Porello, cuando se disefian mutaciones, conviene delecionar el gen entero, cuando esto es

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posible. Las mutaciones nulas son especialmente convenientes para determinar si un genes esencial 0no para un proceso en particular.Mutaciones sensibles a fa temperatura ( ( 5 1 ) : historicarnente, las mutaciones Is han sidoamy utiles en Virologia debido a su fenotipo condicional/letal. Las rnutaciones is puedenproducirse mediante tratamiento con mutagenos seguido de seleccion por temperatura. Enestas condiciones el virus crece a Ia ~~!ill?QIaturaQyrmisiya (37 C) pero no a la nopermisiva (por ejernplo, a 42 C). A Ia t~mJ2s~raturano PSD.!:!isivase presuponc que laprotema del gen mutado se ve impedida de alcanzar una configuracion funcional,mientras que a la temperatura permisiva adquiere dicha configuracion y el mutante puedeser propagado. En algunos virus como los reovirus y ciertos orthomyxovirus, lasmutaciones ts han servido para idcntificar todos los genes virales,Mutaciones de morfologia de placa: estos mutantes producen placas en cultivo can unamorfologia alterada debido a alguna diferencia rnetabolica entre el virus mutante y elvirus salvaje. Se han obtenido mutantes sincitiales en algunos virus que causan que lascelulas vecinas se fusionen en vez de sufrir los cambios citoliticos usuales. Estesfenotipos pueden proveer marcadores geneticos utiles y los mutantes pueden emplearsepara estudiar procesos tales como la fusion de membrana y el egreso del virus,Mutaciones de escape a 10 , ' 1 anticuerpos: pueden seleccionarse mutantes con alteracionesen las proteinas de superficie por la resistencia del virus a Ia neutralizacion por unantisuero contra esas proteinas. Estos mutantes de escape a la neutralizacion puedenluego analizarse por media de la secuenciacion del DNA para deterrninar las posicionesde las mutaciones. Por medic de sa reactividad frente a un panel de anti cuerposmonoclonales se pueden determinar los efectos sobre epitopes especificos. Los mutantesde escape han sido rnuy utiles para analizar las proteinas de la superficie de muchos virus.

La reversion de un virus rnutante al fenotipo salvaje puede ocurrir por 3 viasdistintas: 1) reversion por una mutacion que restituye el nucleotide correcto en el sitiooriginal (reversion verdadera), 2) la mutacion puede ocurrir en un segundo sitio delmismo gen restaurando el fenotipo salvaje (supresion intragenica), 3) la reversion esmediada por una segunda mutacion en un gen distinto (supresion extragenica),

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