Virginie Rougeron - Sexuality and clonality in Leishmania
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Transcript of Virginie Rougeron - Sexuality and clonality in Leishmania
"Everything you always wanted to know about sex (but were afraid to
ask)" in Leishmania after two decades of laboratory and field analyses.
Rougeron V., De Meeûs T., Kako Ouraga S., Hide M., Bañuls A-L.
Laboratoire d’accueilInstitut de Recherche pour le Développement
Génétique et Evolution des Maladies Infectieuses
(UMR CNRS/IRD 2724)
Contexte des maladies infectieuses et parasitaires
- 2ème cause de mortalité dans le monde
- OMS : ¼ des décès dus aux maladies infectieuses et parasitaires
Echelle globale - Dynamique
- Organisation
Un domaine de recherche COMPLEXE
Foyer de transmission
Pathogènes
circulants
Hôtes réservoir
s
Vecteurs
Agents infectieux
Processus biologiques
Structure des populations
Transmission de la maladie
Challenge : mieux comprendre et appréhender l’épidémiologie et les cycles
de transmission des pathogènes
Mode de reproduction de l’agent infectieuxMultiplication et transmission des gènes : propagation de la
maladie.Structure génétique des populations et des
stratégies de reproduction :
- compréhension des patterns et des cycles de transmission,- le diagnostic, les enquêtes épidémiologiques ou le développement de vaccins ou de médicaments.
BUT : Progrès faits dans la connaissance du système de reproduction du modèle
Leishmania
Observations expérimentales du mode de reproduction difficiles, voire
impossibles …
Un modèle d’étude captivant : les leishmaniesEn 2002, l’OMS a estimé:
- 350 millions le nombre de personnes à risque,
- 2.357.000 le nombre de nouveaux cas / an,
- Réactivation de nombreux foyers,
- Emergence de nouveaux foyers,
- Sous-estimation de la gravité et de la sévérité de ces parasitoses, et de leur impact socio-économique.
- Importance des co-infections VIH/leishmaniose,
Important problème de
santé publique
Chez le vertébréChez le phlébotome
Repas sanguin
Promastigote de multiplication
Amastigotes dans un
macrophage
Promastigote métacyclique :
forme indivisible
Un cycle biologique complexe
(Schéma du cycle biologique des Leishmania, modifié d’après http://dpd.cdc.gov/dpdx)
Chez le vertébréChez le phlébotome
Repas sanguin
Promastigote de multiplication
Amastigotes dans un
macrophage
Promastigote métacyclique :
forme indivisible
Formes cliniques majeures
Leishmaniose cutanée
Leishmaniose
mucocutanée
Leishmaniose viscérale
PKDLPost-Kala-Azar Dermal Leishmaniasis
Outils moléculaires peu adaptés
Soit pas assez résolutifs (MLEE,
RFLP), soit dominants (RAPD), soit
multifactoriels (PFGE).
Echantillons mal adaptés
Petite taille, répartitions
géographique et temporelle
larges
Déséquilibre de liaison
Estimation précise de la proportion de reproduction sexuée ou de clonalité mal
aisée(De Meeûs et Balloux 2004)
Mode de reproduction des leishmanies: un débat d’actualité
Deux hypothèses s’opposent :
- Majoritairement clonal, associé à des évènements de recombinaison occasionnels.
- Reproduction sexuée, de type automictique (fusion de gamètes descendants d’un même germe cellulaire).
(Tibayrenc et al., 1990)
(Bastien et al., 1992)
MAIS…
Théoriquement, dans un modèle
clonal strict
Accumulation indépendante de
mutations
Production d’excès en
hétérozygotes
Modèle clonal, associé à des évènements de recombinaison occasionnels.
Postulat : les descendants sont génétiquement identiques à leurs parents
Faibles taux de locus
hétérozygotes et une structure génétique non
strictement subdivisée en
lignées individualisées.
Résultats en
contradiction
Cependant…
(Balloux et al. 2003; De Meeûs et al. 2006)
Théorie clonale : (Tibayrenc et al., 2000)
(Judson and Normak, 1996; Welch et al. 2000)
(Bañuls A-L., 1998)
Mode de reproduction des leishmanies: un débat d’actualité
• 124 souches humaines de L. (V.) braziliensis
• Génotypage sur 12 locus microsatellites
• Caractéristiques des sites d’étude : départements, forêt
amazonienne, grande diversité en termes de
faune et de flore
-Bolivie, 1994
-Bolivie, 1998
-Pérou, 1993
-Pérou, 1994
• Leishmanioses cutanées et muco-cutanées• 4 sous-échantillons
Plus de sexe chez les Leishmanies?
(Rougeron et al., Molecular Ecology ressources, 2008)
Méthodes d’analyseGénétique des populations• Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT
v. 2.3.9.2.Hypothèse Nulle = le mode de reproduction est panmictique = zygotes
produits par l’association aléatoire des gamètes.
- FIS mesure du déficit en hétérozygotes à l’intérieur des sous-échantillons, reflétant l’écart à la panmixie (variant de -1 à +1),
FISFIS
FISFIS
Méthodes d’analyseGénétique des populations
• Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT v. 2.3.9.2.
Hypothèse Nulle = le mode de reproduction est panmictique = zygotes produits par l’association aléatoire des gamètes.
- FIS mesure du déficit en hétérozygotes à l’intérieur des sous-échantillons, reflétant l’écart à la panmixie (variant de -1 à +1),
-1
+1
0Panmixie
Clonalité
Autofécondation
Méthodes d’analyseGénétique des populations
• Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT v. 2.3.9.2.Hypothèse Nulle = le mode de reproduction est panmictique = zygotes
produits par l’association aléatoire des gamètes.
- FIS mesure du déficit en hétérozygotes à l’intérieur des sous-échantillons, reflétant l’écart à la panmixie (variant de -1 à +1),
- s : taux d’autofécondation extrapolé,
FIS = s / (2-s) s = (2*FIS) / (1+FIS)
FISFIS
FISFIS
- DL : association non aléatoire des allèles à différents locus.
• Tester l’existence d’un effet Wahlund :
Se produit lorsque l’échantillon considéré est en réalité
composé de plusieurs sous-populations.
BAPS v. 4.1 = Bayesian Analysis of Population Structure- Inférer la structure génétique d’une
population- Déterminer l’existence de clusters intra-population sur la base des génotypes multilocus
• Vérification de la cohérence des hypothèses proposées : EASYPOP v. 2.0.1.
FSTAT v. 2.3.9.2 = déficit en hétérozygotes, FIS, calculé à nouveau.
Forts déficits en hétérozygotes
- Valeur moyenne FIS = 0,504
- Taux d’autofécondation estimé correspondant : s = 0,67
Graphe n°1 :
Déficit en hétérozygotes dans chacune des populations
Graphe n°2 :
Déficit en hétérozygotes pour chacun des 12 locus étudiés
Résultats :
(Rougeron et al., PNAS, 2009)
Effet WahlundGraphe n°3 :
Déficit en hétérozygotes pour chaque population et et après clusterisation des
populations (BAPS)
- Nombre de clusters : 13 à 15 / population
- Forte diminution des FIS au sein des 4 populations
étudiées
MAIS, les valeurs de FIS restent importantes : FIS =
0,307
Taux d’autofécondation s = 0,47.
Déséquilibres de liaison significatifsDL significatifs pour 13 des 66 paires de locus étudiées
Résultats :
(Rougeron et al., PNAS, 2009)
Forts FIS = faible hétérozygotie, DL significatifs
Effet Wahlund
Diminution des valeurs de FIS
Sous-structuration géographique
Barrières géographiques
Biologie des réservoirs
mammifères et des vecteurs
Présence d’un effet Wahlund, MAIS…
Clonal = faible FIS = forte hétérozygotie, DL significatifs
(Rougeron et al., PNAS, 2009)
Les valeurs de FIS restent importantes…Mode de reproduction mixte
Alternance de différents modes de reproduction :
Hypothèse testée sous Hypothèse testée sous EASYPOPEASYPOP
• Clonalité,
• Recombinaison sexuée entre individus apparentés, • Evènements de recombinaison sexuée entre individus non apparentés
s ~ 47%
c ~ 50%
r ~ 3%
L. (V.) braziliensis : (Rougeron et al., PNAS, 2009)
• Echantillon structuré en petites sous-populations• Echantillon caractérisé par un mode de reproduction mixte
Encore plus de sexe chez certaines espèces de leishmanies.Régime de reproduction mixte
Alternance de différents modes de reproduction :
Clonalité Evènements de recombinaison entre individus
non apparentés
Reproduction sexuée, de
type allogamique
Evènements de recombinaison entre individus
apparentés
Reproduction sexuée, de
type endogamique (Rougeron et al., PNAS, 2009)
Clonalité
Clonalité
Alternance de différents modes de reproduction : cycle de vie
EndogamieAllogamie
Exemples :
- P. falciparum
- Trypanosoma brucei brucei
Chez le vertébréChez le phlébotome
Repas sanguin
Promastigote de multiplication
Amastigotes dans un
macrophage
Promastigote métacyclique :
forme indivisible
(Rougeron et al., PNAS, 2009)
Rougeron et al., PLoS Pathogens, 2010
Confirmation de l’hypothèse d’endogamie
Mise en évidence de phénomènes de recombinaison génétique entre individus issus de deux souches différentes de L.
major.
Résistante à la
drogue A
Résistante à la
drogue B
Hybrides résistants aux deux drogues
Première étude à mettre en évidence expérimentalement l’existence de
reproduction sexuée chez les leishmanies.
2/ Valider expérimentalement l’existence d’endogamie
1/ Mener le même type d’étude de génétique des populations sur d’autres espèces de leishmanies
Quelles sont les prochaines étapes?
Résultats en désaccord avec la théorie clonale pour certaines espèces du genre Leishmania
Mode de reproduction mixteAlternance de différents modes de
reproduction
BUTS : Etudier la composition génotypique d’une souche hétérozygote.
Suivre au cours du temps l’évolution des génotypes. HYPOTHESE : L’attendu d’un mode de reproduction endogamique est une diminution de l’hétérozygotie au cours du temps.
Une souche = une population de génotypes ≠ un seul génotype
Jusqu’à présent les études de génétique des populations considéraient une souche
comme un seul individu.
Etude préliminaire :
Kako et al. (Session Poster)
Quelles sont les prochaines étapes?
Quelles sont les prochaines étapes?
3/ Le vecteur = unité de reproduction ?
Isoler les parasites Etudes de
génétique des populations
Développer une technique de biologie
moléculaire
Exemple : P. falciparum
REMERCIEMENTS
Projets :
- European Community SD3 project (n8TS3*-CT92-0129)
- French National Project ANR 06-SEST-20 IAEL
Laboratoires :
- Unit of Molecular Parasitology from the Institut voor Tropische Geneeskunde, Belgium
- Institudo de Medicina Tropical ‘Alexander von Humboldt’, Peru
- Laboratoire de Parasitologie et de Mycology de Montpellier