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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

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Vias de Biossíntese de Antibióticos

Vias de Biossíntese de Antibióticos

Fernanda Luiza de Souza SebastianesProfa. Dra. Aline Aparecida Pizzirani-Kleiner

Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos

SumárioSumário

• Histórico

• Mecanismo de ação dos antibióticos

• Vias de biossíntese de antibióticos

• Resistência Microbiana

• Obtenção de novos antibióticos


História dos antibióticos

Cientistas da segunda metade do século XIX (Tyndal, Lister, Huxley,Duchesne e Vuillemin) já observavam o fenômeno denominado por“antibiose”, o qual era resultado dos agentes antimicrobianos.

Em 1860 Joseph Lister estudou o efeito inibitório de substâncias químicas sobre as bactérias.

Fenol Esteriliza instrumentoscirúrgicos

taxas de mortalidade associadas à cirurgias

Pasteur e Joubert em 1877 reconheceram o potencial clínicos dosprodutos microbianos como agentes terapêuticos

Bacillus antracisCrescia em urina estéril

Morte com a adição de bactérias junto com ele na mesma urina

(Greenwood, 1997)Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos

Alexander Fleming1881 1955

Nobel Medicina 1945

1928 Alexander Fleming descobriu a penicilina

Saint Mary´s Hospital de Londres

(Bentley, 2005 )Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos


Colônias de Staphylococcus vizinhas do fungoPenicillium apresentavam-se translúcidas (lise celular).

Cresceu Penicillium em meio líquido e verificou que uma substância antimicrobiana era secretada no meio.

Contaminante inibia o crescimento de Staphylococcusmesmo diluído 800 vezes.

Agente antibacteriano penicilina

Penicillium chrysogenum


1941 início do uso clínico da penicilina (estreptococos e pneumococo).

Penicilina Primeiro antibiótico usado para o tratamento de infecções em humanos

13 anos da descoberta ao uso

prático. (Gomez & Lopez, 2006)

Chain & Florey em 1940 analisaram o efeito antibacteriano da penicilina.

No final da década de 1930, no auge da segunda guerra mundial, o elevado número de pacientes infectados exigia a descoberta de substâncias efetivas para o tratamento de infecções bacterianas.



1944 – Selman Abraham Waksman e colaboradores isolaram a estreptomicina de uma cepa Streptomyces, a primeira droga efetiva contra o bacilo da tuberculose.

Em 1889 o nome antibiótico foi criado por Vuillemim e, posteriormente, em 1942 foi redefinido por Waksman.

Prêmio Nobel de Medicina (1952)

Antibiótico: é um composto químico derivado de microrganismos (bactérias, fungos) que têm a capacidade de inibir o crescimento, inclusive chegando a destruir outros microrganismos em soluções diluídas – antibacteriano, antifúngico e antitumoral.

(Greenwood, 1997)


Microrganismos apresentam dois tipos de metabolismo:

Produção de Antibiótico

Microrganismos

Biossíntese de antibióticos em microrganismosSeminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos

Os produtos naturais isolados de actinomicetos e fungos têm sidoa principal fonte da maioria dos antibióticos comercializados.

• Secundário: rotas biossintéticas longas e complexas derivadas do metabolismo primário

• Primário: ativo durante todo o ciclo de vida


• Mais de 8000 antibióticos foram identificados

• 200 novos antibióticos a cada ano

• Atualmente existem 90 antibióticos utilizados na prática clínica.

• Antibióticos são produzidos principalmente por bactérias

ou fungos:

Antibióticos produzidos por fungos (principalmente pelosgêneros Penicillium e Cephalosporium) Ex.: penicilina, cefalosporina, griseofulvina.

Gênero Streptomyces – produz 70% dos antibióticos do mercado

(Peláez, 2006)

Microrganismos produtores

Streptomyces tenebraeus1968TobramicinaMicromonospora purpurea1963GentamicinaStreptomyces lincolnensis1962LincomicinaStreptomyces kanamyceticus1957KanamicinaStreptomyces orientalis1956VancomicinaStreptomyces ambofaciens1954EspiramicinaStreptomyces erithreus1952EritromicinaStreptomyces noursei1950NistatinaStreptomyces rimosus1950OxitetraciclinaStreptomyces fradiae1949NeomicinaCephalosporium sp1948Cefalosporina C, N e PStreptomyces aureofaciens1948ClortetraciclinaStreptomyces lavendulae1947 – 53FramicetinaBacillus polymyxa1947PolimixinaStreptomyces venezuelae1947CloranfenicolBacillus lincheniformis1945BacitracinaStreptomyces griseus1944EstreptomicinaPenicilium griseofulvum1939 / 1945GriseofulvinaBacillus brevis1939TirotricinaPenicillium notatum1929 – 40Penicilina

MicrorganismoData da descobertaNome

Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos(Greenwood, 1997)



Produção de antibióticos

1. Preparação do inóculo;

2. Inoculação em meio de fermentação;

3. Incubação em condições de fermentação controladas e aeração forçada com ar esterilizado;

4. Remoção do micélio por centrifugação e/ou filtração;

5. Extração e purificação do antibiótico.

Esquema básico de um processo fermentativo para produção comercial de um antibiótico:

Porcentagem de empresas envolvidas com a pesquisa de metabólitos de interesse industrial no Brasil

Pesquisa


Produção de antibióticos

A cada ano são produzidos 100000 toneladas de antibióticos, o que corresponde a US$ 5 bilhões em vendas destinadas à:

• medicina

• agricultura

• terapêutica animal

Biossíntese de antibióticos em microrganismosSeminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos

Mecanismo de ação dos antibióticos

Ex.: Penicilina,Cefalosporina, Vancomicina

• Inibição da síntese de proteínas

Ex.: EritromicinaRifampicinaEstreptomicina

• Inibidores da síntese da parede celular microbiana

• Interferem na síntese de nucleotídeos

•Interferem com a membrana celular bacteriana

Ex.: SulfonamidasTrimetropina

Ex.: Polimixina BColistina


Vias de biossíntese de antibióticos

Peptídeos não ribossomais e policetídeos são as principais classes de antibióticos que apresentam ampla diversidade estrutural e funcional.

Eles são sintetizados respectivamente por enzimas multifuncionais chamadas de peptídeo sintetase não ribossomal (NRPS) e policetídeosintetase (PKS).

Estas enzimas apresentam similaridade na estrutura modular dosdomínios catalíticos e no mecanismo de montagem linear.

Peptídeos não ribossomais e policetídeos não são sintetizados com a participação direta dos ribossomos.


(Walsh, 2004)



Enzima peptídeo sintetase não ribossomal (NRPS)

As NRPSs são constituídas por módulos que são responsáveis pela incorporação de um resíduo na cadeia de peptídeo nascente.

Cada módulo é responsável por: ativação, adenilação, tioesterificação, condensação e modificação de um substrato (aminoácido) específico.

Ex.: Penicilina, vancomicina,ciclosporina.

(Challis & Naismith, 2004)



• Os domínios apresentam sítios catalíticos distintos com motivosestruturais conservados importantes para a atividade catalítica.

• Três domínios são necessários na estrutura de um módulo como:

1. Domínio A (adenilação) - selecionae ativa os aminoácidos (seqüência primária);

3. Domínio C (condensação) - catalisa a formação das ligações peptídicas

(Challis & Naismith, 2004)

2. Domínio PCP (proteína carreadorpeptidil) - liga o resíduo de serinado grupo tiol do cofator com o aminoácido ativado


Enzima PKS (policetídeo sintase)

Policetídeos são cadeias de ácidos graxos que apresentamatividade farmacológica. Ex.: antibióticos, antitumorais, fitoalexinas;

Enzimas PKS atuam sobre o substrato acil CoA (ácidos graxos) para sintetizar os policetídeos;

São organizados também em unidades funcionais (módulos);

Cada módulo de PKS catalisa as diferentes etapas das reações químicas para a formação da estrutura do antibiótico.

(Lal et al., 2000)



A biossíntese de policetídeo:

Ex.: Eritromicina, tetraciclina.

(Lal et al., 2000)

PKS I

Modificações Pós-PKS

Eritromicina A 6-Deoxieritronolide B


A biossíntese de policetídeo:

• Um módulo de PKS também pode ser subdividido em domínios

c) Domínio KS (cetosintase) - catalisa a reação de elongação;

d) Domínio Te (tioesterase) - liberação do produto (policetídeo).


• Os quatros domínios essenciais são:

a) Domínio AT (acetiltransferase): ativação de ácidos graxos;

b) Domínio ACP (proteína carreadoraacil) - transporta os substratos participando da elongação;

Domínio AT

Domínio KS

Domínio Te

Reconhecimento do substrato e transferência para domínio ACP

Formação da ligação cetide (ligação C-C)

Liberação do produto



As PKSs são classificadas em tipo I, II, III

PKS I - uma única cadeia polipeptídica multifuncional apresenta todas as atividades enzimáticas necessárias para um ciclo de elongação e processamento;

PKS II - a atividade enzimática para a elongação e processamento da cadeia de policetídeos estão presentes em polipeptídeos separados;

PKS III – cadeia é elongada e processada em um único sítio ativo multifuncional.

(Castoe et al., 2007)



Fitoalexinas são compostos antimicrobianos que são sintetizados durante a infecção no tecido lesado – via econômica;

Estes compostos são sintetizados pela via PKS III;

A síntese de fitoalexina é induzida por microrganismos, radiação ultravioleta, compostos químicos - sais de metais pesados, componentes da parede celular de fungos – quitina;

Os agentes que podem induzir a síntese de fitalexinas são chamados de elicitores.

(Jeandet et al., 2002)



Os policetídeos são sintetizados por bactérias, fungos, animais e plantas;

Em plantas os policetídeos apresentam diversas funções: pigmentação de flores, resposta a exposição de luz UV, defesa contra patógeno (fitoalexinas);

PKS específicos de plantas são chalcona sintase (CHS) e 2-pirona sintase (2-PS);

Estas enzimas apresentam 74% de seqüência idêntica de aminoácidos. Entretanto, elas diferem no substrato selecionado e no número de reações de condensação.

(Jez et al., 2000)



Análise da estrutura tridimensional das PKSs de plantas mostraram que a cavidade de iniciação e elongação da enzima 2-pirona sintase é menor do que a da chalcona sintase

A variação de aminoácidos que compõem a cavidade do sítio ativo altera a preferência ao substrato e o comprimento da cadeia de policetídeo

(Jez et al., 2000)



(Jez et al., 2000)

A manipulação do volume do sítio ativo éuma estratégia para aumentar a diversidade molecular de policetídeos.

Para demonstrar este princípio o sítio ativo da CHS foi modificada para parecer-se com a 2-PS por mutagênese sítio dirigida;

Identificação dos produtos da reação confirmaram que a modificação na CHS alterou a preferência do substrato de p-coumaroyl-CoA por acetyl-CoA e o produto formado foi um tricetídeo em vez de tetracetídeo;



Enzimas pós PKSs

Enzimas pós PKSs alteram a estrutura de policetídeos sendoimportantes para a atividade biológica dos mesmos;

Oxidação, metilação, alquilação e glicosilação;

A função das enzimas pós PKSs é testada por meio da inativação de genes, seguido por caracterização dos metabólitos resultantes;

É possível avaliar a seqüência de modificações até chegar ao composto bioativo final.

(Weissman & Leadlay, 2005)



Enzimas pós PKSs

Outra técnica alternativa é expressar um gene pós-PKS em hospedeiro heterólogo na presença de uma cadeia de policetídeo;

Glicosiltransferases (GTs) têm sido estudadas para avaliar a tolerância delas a outros açúcares alternativos;

Estes experimentos são realizados em hospedeiros heterólogos usando a combinação de GTs nativas e exógenas,genes da via PKSs e de acúcares.




Ex.: Genes que codificam GTs e o açúcar desosamina foram coexpressos em uma biblioteca gênica codificando diferentes macrolactonas.


Narbomicina

Algumas pós PKSs são específicas a um determinado substrato, enquanto que outras são mais flexíveis permitindo a produção de novos compostos bioativos;



A flexibilidade destas enzimas pode ser conseguida com mutagênese sítio dirigida ou evolução dirigida.



Evolução

A via de biossíntese de ácidos graxos (FAS) está presente em todos os organismos;

A via de FAS e PKS usam o mesmo núcleo de atividade enzimática, portanto, acredita-se que exista uma conexão evolutiva entre estas vias.

(Kodama et al., 2005)

FAS

PKS


Evolução

Para provar essa hipótese, foram estudadas as seqüências do domínio KS presentes em classes de FASs e PKSs encontrados em bactérias, fungos, animais e vegetais;

A árvore filogenética derivada destas seqüências reflete um processo evolutivo longo e compartilhado destas vias (PKS e FAS).



Evolução

Proteínas KS de plastídios e mitocôndrias estão localizados próximo das bactérias, consistente com a origem procariótica destas organelas.



Evolução


FAS I micobacteriana agrupou com FAS I de fungos -arquitetura muito similar destas duas enzimas;

Eventos evolucionários independentes podem ter levado ao desenvolvimento do sistema de FAS em fungos e animais.

PKSI bacteriano divide um ancestral comum com FAS I animal e PKS I de fungos


Evolução


Reconstruções da árvore indicaram que o PKSI bacteriano apresenta um papel central, sendo que ele pode ser derivado de FAS bacterianas.


Evolução


Seqüências dos domínios KSsrevelaram que duplicações múltiplas de genes, perda de genes, e transferência horizontal de genes tem contribuído para a evolução de PKS em bactérias


A biossíntese de PKS-NRPS:

• Existem também antibióticos que são sintetizados por um sistema híbrido NRPS-PKS.

• A Leinamicina é um antibiótico híbrido peptídeo-policetídeo.

• Caracterização bioquímica dos genes da biossíntese da leinamicina em Streptomyces atroolivaceus S-140 revelou que este antibiótico (antitumoral) é sintetizado por um sistema híbrido NRPS-PKS (2-NRPS e 6-PKS).

(Tang et al., 2006) Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos

Módulos

Enzimas NRPS-PKS


• Peptídeos antimicrobianos são sintetizados com a participação direta de ribossomos em animais, plantas e microrganismos;

• A maioria destes peptídeos são catiônicos e lipofílicos provocando a morte de bactérias através do rompimento na membrana celular;

• A carga positiva destes peptídeos facilita a interação com a carga negativa da membrana bacteriana que contém fosfolipídios. O caráter lipofílico permite a permeabilização na membrana bacteriana;

• Nos animais, os peptídeos antimicrobianos são a primeira linha de defesa do sistema imunológico.

(Peláez, 2006)Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos


(Peláez, 2006)

• Uma ampla variedade de peptídeos antimicrobianos éproduzida por bactérias como bacteriocinas;

• Os peptídeos antimicrobianos sintetizados nos ribossomos das bactérias são conhecidos como bacteriocinas;

• Entretanto, os antibióticos não estão incluídos nesse grupo, pois são sintetizados por meio do metabolismo secundário, ou seja, sem o envolvimento direto dos ribossomos.


Genes da biossíntese de antibióticos em procariotos

Os genes responsáveis pela biossíntese de antibióticos encontram-se agrupados em “clusters” contíguos.

Cluster do ácido clavulâmico em Streptomyces clavuligerus

Nestes agrupamentos gênicos encontram-se também genes reguladores e de resistência ao antibiótico.

Os genes podem estar organizados em operon (gramicidina S, surfactina e tirocidina).



Genes da biossíntese de antibióticos em fungos filamentosos

Genes de fungos filamentosos que atuam na biossíntese de antibióticos estão organizados em “clusters”

Genes da biossíntese de antibióticos organizados em “clusters”em Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans e Acremoniumchrysogenum.

(Gutiérrez et al., 1999)



Genes agrupados em um único cromossomo ou em cromossomos diferentes

Genes da biossíntese de Cefalosporina em clusters diferentes no fungo Acremonium chrysogenum

Genes da biossíntese de penicilina agrupados em um único cromossomo “cluster” em Penicillium chrysogenum e Aspergillus nidulans

(Gutiérrez et al., 1999)


Organização dos genes em “cluster”

Facilita a expressão coordenada de genes da biossíntese de antibióticos, a identificação e o sequenciamento de novos “clusters” de PKSs

Biossíntese de antibióticos em microrganismosSeminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos(Weissman & Leadlay, 2005)

Estratégias gerais de resistência às drogas:

Os patógenos podem:

Produzir uma enzima que destrói a droga;

Alterar o alvo molecular da droga;

Diminuição do acúmulo do antibiótico nabactéria.

Genes de resistência são transportados em plasmídeos e são encontrados em transposons

Mutação cromossômica

Genes de resistência em plasmídeos

Por meio do uso abusivo e indiscriminado dos antibióticos ocorreu a seleção de microrganismos resistentes as drogas.

Resistência microbiana

Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos(Rang et al., 1997)


A resistência a antibióticos nos microrganismosdissemina-se em três níveis:

• Transferência de bactérias entre pessoas;

• Transferência de genes de resistência entre bactérias (geralmente em plasmídios);

• Transferência de genes de resistência entre elementos genéticos no interior das bactérias, por meio de transposons.

Resistência microbiana

(Rang et al., 1997)


Novos antibióticos

e) Necessidade de estudo e identificação de novos antibióticos na área de agricultura, que poderão substituir os produtos agroquímicos, os quais apresentam alta toxicidade, custo e agressividade ao meio ambiente.

(Strobel et al., 2004)

As pesquisas que visam ao desenvolvimento de novos antibióticos são prioritárias devido a vários fatores:

a) Aparecimento de novos patógenos e a seleção de resistentes;

b) Aquisição de múltiplos níveis de resistência pelas bactérias;

c) Variados efeitos colaterais indesejáveis dos antibióticos existentes, que devem ser eliminados;

d) Escassez de tratamento efetivo para múltiplas doenças tropicais como malária, doença de Chagas, leishmaniose e diversos tipos de diarréias;

Microrganismos endofíticos e alguns de seus produtos

Endófito Composto químico Referência

Acremonium sp. Leucinostatina A Strobel & Hess(1999)

Conoplea elegantula Isocumarinas Findlay et al. (1995)

C. cf. quercina Criptocina Li et al. (2000)

Cryptoriopsis cf. quercina

Criptocandina Strobel (2003)

Streptomyces sp. Kakadumicina Castillo et al. (2003)

Streptomyces sp. Munumbicina A, B, C e D

Strobel (2003)

Streptomyces sp. Metilalbonoursina Strobel (2003)


Novas Aplicações

• Aspergillus fumigatus• Endófito → Cynodon dactyron• Produção de novos compostos bioativos

• Asperfumóide, asperfumina• Separados por CLAE e identificados por EM

• Atividade contra 3 patógenos• C. albicans, Tricophyton rubrum e A. niger

(Liu et al., 2004)Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos

Biossíntese de antibióticos em microrganismos

Novos antibióticos

• Entretanto, os novos antibióticos podem apresentar alta toxicidade e propriedades farmacocinéticas indesejáveis como baixa absorção por via oral e instabilidade da droga.

• Portanto, alguns pesquisadores se dirigem a tecnologias como a biossíntese combinatória e produção de antibióticos híbridos para conseguir novos compostos bioativos.

(Rodriguez & McDaniel, 2001)Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos

Antibióticos híbridos

• O princípio da produção de antibióticos híbridos é baseado na clonagem de genes heterólogos da biossíntese de antibióticos, em uma cepa que produz um composto similar.

• São clonados genes que codificam enzimas utilizadas em reações estruturais de modificação como metiltransferases, hidroxilases, redutases, glicosiltransferases e oxidases.

(Hutchinson, 1997)Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos

Novos antibióticos

Produção de 11-hidroxiaclacinomicina A pela expressão do gene dnrF de Streptomyces peucetius (produtor de aclacinomicina). As setas indicam o sítio de ação de DnrF; o asterisco indica o novo grupo hidroxila.

(Salas & Mendez, 1998)Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos

Biossíntese combinatória

• O princípio da produção de biossíntese combinatória é baseado na clonagem ou mistura de núcleos de enzimas biossintéticas produzindo novos núcleos moleculares.

• Os experimentos com esta PKSs e NRPS geralmente envolvem a deleção, a substituição ou a adição de módulos, ou a criação de módulos híbridos de diferentes PKS-NRPS.

• Assim, novos metabólitos podem ser gerados a partir da formação de proteínas com novas propriedades enzimáticas.

Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos(Hutchinson, 1997)



Biossíntese combinatória com sintases aromáticas policetônicas.

A) Combinando o PKS da actinorodina (act min) e aaromatase/ciclase(ARO/CYC) da tetracenomicina (tcm).

B) Combinando o PKS da tetracenomicina, act KR e griseusin (gris) ARO/CYC.

Estas combinações resultaram em novas moléculas.



Rifampicina B: não é ativa via oral Rifampicina: ativa via oral

Geldanamicina: antitumoral tóxico 17-DMAG: menos tóxico



A biossíntese combinatória compreende a manipulação biossintética que tenta acelerar o processo de evolução;

A evolução é dirigida por mutação, recombinação e seleção. A biossíntese combinatória acelera o processo de mutação e recombinação entre os genes presentes em diferentes espécies;

A seleção ocorre primeiro com a escolha de módulos e por fim são escolhidas as moléculas ativas farmacologicamente.

Os requerimentos para a obtenção de antibióticos híbridos têm sido analisados por Hutchinson (1997) e Salas & Mendes (1998):

• Escolha do organismo produtor do antibiótico;

• Conhecimento químico e bioquímico da via biossintética;

• Conhecimento genético de síntese do antibiótico;

• Determinação do novo antibiótico produzido por um microrganismo híbrido.

Novos antibióticos


Novos antibióticos


Descoberta de novos genes da via de biossíntesede antibióticos

Sequenciamento do genoma microbiano permite a identificação de todos os clusters de PKSs e a rede regulatória. Ex.: Streptomyces coelicolor e Streptomyces avermitilis;

Rastreamento de uma biblioteca de cosmídeo de uma determinada bactéria para os genes de PKSsmodulares;

Metagenômica: biblioteca de DNA obtida de amostras do ambiente.


Indústria Farmacêutica

• Fases de P & D

• aquisição das amostras• extração• testes iniciais• isolamento e caracterização• testes in vitro• estrutura • testes pré-clínicos *• testes clínicos*

* alto investimento

Ten Kate & Laird,1999Seminário Pós Graduação – Vias de Biossíntese de Antibióticos

Conclusão

• Os produtos naturais apresentam uma grande fatia dos produtos que são utilizados na medicina e agricultura.

• Atualmente têm sido foco de atenção os trabalhos com microrganismos produtores de compostos bioativos, os quais apresentam um grande potencial para a descoberta de novos metabólitos secundários - antibióticos.

• O desenvolvimento de técnicas para a descoberta de novas biomoléculas, através de biossíntese combinatória e antibióticos híbridos, contribuiu para melhorar efeitos farmacocinéticos como absorção e ação da droga, e ainda diminuiu possíveis efeitos colaterais.



Referências

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Fim

Obrigada!

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