VI SINH ỨNG D ỤNGNNGGNG - · PDF filetr Ư ng i h c k thu t cÔng ngh tp. hcm khoa...

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

------

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH

VI SINH VI SINH VI SINH VI SINH ỨNG DNG DNG DNG DỤNGNGNGNG

TS. Nguyễn Hòai Hương

Dùng cho sinh viên ngành Công nghệ Sinh học Năm xuất bản: 2009

2

MỤC LỤC

Trang

Giới thiệu môn học 4

Bài 1 Vi khu�n amôn hóa 5

I Lý thuyết 5

II Thực hành 5

1. Môi trường - hóa chất 5

2. Tiến hành thí nghiệm 6

3. Quan sát và ghi nhận kết quả 7

III Bài nộp 8

Bài 2 Vi khu�n nitrate hóa 9

I Lý thuyết 9

II Thực hành 9




III Bài nộp 11

Bài 3 Vi khu�n phản nitrate hóa 12

I Lý thuyết 12

II Thực hành 12




III Bài nộp 14

Bài 4 Vi khu�n cố định nitơ 15

I Lý thuyết 15

II Thực hành 16




III Bài nộp 18

Bài 5 Vi khu�n phân hủy cellulose 19

3

I Lý thuyết 19

II Thực hành 20




III Bài nộp

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

21

22

23

4

GIỚI THIỆU MÔN HỌC Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương

pháp phân lập, khảo sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môi trường, công

nghệ lên men. Các vi sinh ứng dụng thường được phân lập từ môi trường tự nhiên,

chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau, chuyển hóa vật chất trong tự nhiên.

Nguồn phân lập chúng có thể từ đất, nước, động vật, thực vật hay thực phNm. Phân

lập, xác định chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng dụng.

Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh viên phân lập vi

sinh vật chủ yếu từ môi trường đất. Đất là một trong những cơ chất thuận lợi nhất đối

với sự phát triển của các loại vi sinh vật khác nhau. Số lượng vi sinh trong 1 g đất có

tới hàng trăm triệu, thậm chí hàng tỉ tế bào. Hoạt động sống của vi sinh vật đất có liên

quan đến nhiều quá trình xảy ra trong đất, trước hết là các vòng tuần hoàn của vật chất

trong tự nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu huỳnh.

Các bước chung của bài thực hành là

1. Phát hiện các nhóm vi sinh vật trong mẫu đất bao gồm đại diện của một số

nhóm phân loại

2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và hình thái tế bào học tế bào của các

đại diện thuộc vi sinh vật phân lập được.

NỘI DUNG THỰC HÀNH

BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA

BÀI 2: VI KHUẨN NITRATE HÓA

BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRATE HÓA

BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐNNH NITƠ

BÀI 5: VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE

5

BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA

I. Lý thuyết

Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có

chứa nitơ tạo thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều

loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất

khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuNn và nấm khuNn ty. Tuy vậy, những vi sinh

vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều.

Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy

phân thành các amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình

dị hóa và đổng hóa. Các sản phNm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH3 và

H2S.

Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí.

Trong điều kiện hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các

loài trong giống Bacillus và Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae,

các xạ khuNn và nấm khuNn ty. Trong đó, vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống

Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống Clostridium tham gia quá

trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình amôn hóa

được thực hiện bới các loài vi khuNn và trực khuNn kỵ khí tùy nghi.

II. Thực hành

Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng

cách cấy các mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone.

Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng

Pasteur nhằm tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện

thuộc giống Bacillus – giống đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa.

Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính

khác nhau của khuNn lạc các vi khuNn khác nhau này.

1. Môi trường - hóa chất

- Môi trường canh thịt- peptone:

Cao thịt 5g

Peptone 10g

Nước 1000ml

6

- Môi trường thạch: Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch.

- Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng.

Giấy lọc loại thấm acetate chì

- Giấy quỳ đỏ

- Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm

bào tử

- Thuốc thử Nessler:

Hòa tan 50 g KI trong 35 ml nước cất không đạm. Thêm dung dịch

HgCl2 bão hòa cho đến khi xuất hiện kết tủa. Thêm 400 ml KOH 50%

pha lõang đến 1 l, để lắng, sử dụng dịch trong.

2. Tiến hành thí nghiệm

Chu�n bị môi trường:

- Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm,

khử trùng ở 1 atm, 15 phút.

- Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử

trùng ở 0,5 atm.

- Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các

đĩa petri, giữ ở 30OC

Chu�n bị mẫu:

- Mẫu đất được pha với nước để thu dịch huyền phù

Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng:

- Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 102, 103, 104, 105, 106

- Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịt-

peptone đã khử trùng ở trên

- Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetate chì gài vào giữa nút bông

và ống nghiệm

- Ủ ở nhiệt độ 30OC trong 3 ngày đêm.

- Mẫu đối chứng là môi trường không cấy dịch huyền phù.

Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch:

- Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 102, 103, 104, 105, 106

- Lấy 0,1 ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử

trùng ở trên

- Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch

7

- Ủ ở nhiệt độ 30oC trong 3 ngày đêm.

- Mẫu đối chứng là môi trường không cấy dịch huyền phù.

3. Quan sát và ghi nhận kết quả

Môi trường lỏng:

Quan sát:

- Sự đục môi trường

- Sự tạo bông, kết cạn

- Nổi váng trên bề mặt.

Phản ứng sinh hóa:

- Thử với thúôc thử Nessler: nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng,

thêm một que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa:

Màu vàng nhạt – ít ammoniac

Vàng sậm – nhiều ammoniac

Nâu – rất nhiều ammoniac

- Dùng giấy quỳ thử sự sinh NH3 (làm giấy quỳ hóa xanh).

- Quan sát màu giấy lọc thấm acetate chì: sự sinh H2S làm giấy lọc thấm acetate

chì hóa đen.

- So sánh đối chứng và thí nghiệm và ghi kết quả vào bảng sau:

Độ pha

loãng

Đục môi

trường

Tạo bông Tạo cặn Sinh NH3 Sinh H2S

- Chọn một độ pha loãng có tỷ lệ vi sinh vật cao nhất làm tiêu bản và soi kính

hiển vi.

Môi trường thạch:

Ghi nhận:

- Số lượng khuNn lạc trên 1 đĩa ở mỗi độ pha loãng

- Quan sát hình thái khuNn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng sau:

Độ pha loãng Số khu�n lạc Hình thái

khu�n lạc

Xuất hiện bào tử

8

- Làm tiêu bản và soi kính hiển vi

- So sánh hình thái quan sát được giữa tiêu bản từ môi trường lỏng và môi

trường thạch

- Chụp hình khuNn lạc, tế bào.

III. Bài nộp

- Nộp kết quả ghi chép trong thí nghiệm và hình chụp khuNn lạc, tế bào.

- Nêu ứng dụng vi khuNn amôn hóa.

9

BÀI 2: VI KHUẨN NITRATE HÓA

I. Lý thuyết

Nitrate hóa là quá trình oxi hóa NH3 thành HNO3, cung cấp năng lượng cho vi

sinh vật hoạt động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO2.

Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có

khả năng thực hiện quá trình này.

Nitrate hóa qua 2 giai đoạn:

Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa NH3 thành nitrite bởi một số đại diện thuộc nhóm vi

khuNn nitrite hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, ...Tất cả

chúng đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và

cấu trúc tế bào.

Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình

bầu dục. Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc

một số điều kiện. Hai pha chủ yếu là pha di động- tế bào có 1 hay chùm tiên mao và

pha tập đoàn khuNn keo-các tế bào không di động.

Giai đoạn 2 của quá trình nitrate hóa oxi hóa nitrite thành nitrate bởi một số vi

khuNn: Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis.

Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que

tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện

không thuận lợi chúng có thể hình thành những tập đoàn khuNn keo. Nitrospina

gracilis là những trực khuNn thẳng, mảnh dẻ, thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di

động, và có đặc trưng là hình thành những tập đoàn khuNn keo. Nitrococcus mobilis

thì có dạng hình tròn, có tiên mao.

Vi khuNn nitrate hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt

chẽ đối với việc oxi hóa cơ chất-NH3 và nitrite.

II. Thực hành

Việc phát hiện vi khuNn nitrate hóa được thực hiện bằng cách cấy dịch huyền phù

cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski. Nguồn C duy nhất trong

môi trường này là CO2 có trong không khí và trong thành phần của CaCO3. Nguyên

liệu năng lượng và nguồn N cho các vi khuNn gây ra giai đoạn đầu của quá trình

nitrate hóa là NH3 và muối amôn, còn đối với vi khuNn gây ra giai đoạn hai là nitrite.

10

Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuNn nitrate hóa là việc thông khí

đầy đủ vào môi trường nuôi cấy.

1. Môi trường - hóa chất

- Môi trường Winogradski phân lập Nitrosomonas spp.

(NH4)2SO4 2 g/l

K2HPO4 1 g/l

MgSO4.7 H2O 0,5 g/l

FeSO4 . 7H2O 0,4 g/l

NaCl 2 g/l

Chia vào các bình thủy tinh 50ml, cho vào mỗi bình một ít CaCO3. Hấp khử

trùng ở 1 atm

- Môi trường phân lập Nitrobacter spp.

NaNO2 1,0 g

MgSO4. 7H2O 0,5 g

FeSO4. 7H2O 0,03 g

NaCl 0,3 g

Na2CO3 1,0 g

K2HPO4 1,0

Nước 1 L

Chỉnh pH về 7,3.

- Dung dịch pha loãng mẫu

- Tinh thể diphenylamin

- H2SO4 đậm đặc


- ChuNn bị môi trường: Môi trường đã hấp khử trùng được phân vào các ống nghiệm

- Xác định vi sinh vật trên môi trường lỏng:

Pha loãng mẫu 102 - 105

Mỗi độ pha loãng lấy 1ml mẫu cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường đả khử

trùng ở trên

Ủ ở 30OC trong 2-3 tuần

- Làm 1 ống nghiệm đối chứng

3. Quan sát và ghi nhận kết quả:

11

- Ở mỗi độ pha loãng, ghi nhận sự thay đổi môi trường trong ống nghiệm

- Những ống nghiệm nào ghi nhận có vi khuNn phát triển, cần tiến hành thử nghiệm

định tính.

Phản ứng định tính nitrate: Lấy vài tinh thể diphenylamin hòa tan trong 1 giọt

H2SO4 đậm đặc. Sau đó thêm 1 giọt dịch cần kiểm tra. Tiến hành trên bản sứ trắng sẽ

thấy xuất hiện màu xanh thNm. Ghi nhận kết quả vào bảng:

Ống

nghiệm

số

Độ pha loãng

102 103 104 105 106

NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3-

Chọn ống nghiệm có kết quả dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển

vi. Cần lưu ý chọn được cả những hạt CaCO3, vì xung quanh hạt này, tỷ lệ vi khuNn là

cao nhất. Miêu tả, so sánh hình thái các tế bào vi khuNn quan sát được.

III. Bài nộp


- Nêu ứng dụng vi khuNn nitrate hóa.

12

BÀI 3. VI KHUẨN PHẢN NITRATE HÓA I. Lý thuyết

Phản nitrate hóa là quá trình vi sinh vật thực hiện việc khử nitrate thành nitơ phân

tử, đồng thời oxi hóa các chất hữu cơ như đường, rượu, axit hữu cơ thành CO2 và H2O

với chất nhận điện tử cuối cùng là NO3-. Năng lượng sinh ra khi oxi hóa cơ chất được

vi sinh vật sử dụng trong quá trình hoạt động sống của mình.

Quá trình phản nitrate hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng

đặc biệt mạnh trong điều kiện kỵ khí.

Các vi sinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Phần

lớn chúng thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm một số giống

Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus …

II. Thực hành

Việc phát hiện vi khuNn phản nitrate hóa được thực hiện bằng phương pháp cấy

mẫu lên môi trường chứa hợp chất C ở dạng oxi hóa, có nitrate và các hợp chất khác

cần cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Các vi khuNn này sử dụng nitrate làm chất

nhận electron nhưng không dùng làm nguồn N trong quá trình đồng óa, vì không thể

khử NO3- thành NH4

+. Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy vi khuNn phản nitrate hóa,

người ta cho thêm peptone, asparagine hoặc muối amôn và hạn chế lưu khí trong quá

trình nuôi cấy.

1. Môi trường- hóa chất

- Môi trường Giltay:

Dung dịch A:

Asparagine (C4HgN2O3. H2O) 1g

KNO3 1g

Nước máy: 0,25 l

Dung dịch B:

Citric acid hoặc 5g

Citrate kali 8,5 g

KH2PO4 1g

MgSO4.7H2O 1g

13

CaCl2.6H2O: 0,2g

FeCl2. 4H2O vết

Nước máy: 0,25l

Nếu sử dụng acid citric cần bổ sung KOH 10% với phenolphthalein làm

chất chỉ thị. Hòa 0,25l dung dịch A và 0,25l dung dịch B, sau đó thêm nước

máy đến 1L dung dịch môi trường Giltay hoàn tất.


- ChuNn bị môi trường: môi trường Giltay với thành phần như trên được phân vào

6 ống nghiệm, hấp khử trùng 0,5 atm.

- Pha loãng mẫu 103- 107

- Lấy 1ml mẫu cấy sâu vào đáy ống nghiệm có chứa môi trường đã khử trùng ở

trên. Ống đối chứng không cấy mẫu.

- Ủ ở 30OC trong 7 ngày đêm.


Dấu hiệu chủ yếu nhất cho sự phát triển của vi khuNn nitrate hóa là sự sinh khí, làm

đục và giảm pH của môi trường.

- Quan sát các ống nghiệm ở các độ pha loãng khác nhau và ghi nhận vào bảng.

- Kiểm tra việc khử nitrate trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với

diphenylamine

Độ pha loãng Đục môi

trường

Sinh khí pH môi

trường

NO3-

103

104

105

106

107

- Chọn 1 ống nghiệm cho kết quả tốt nhất làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi và

ghi nhận hình thái học của các vi khuNn phản nitrate hóa phân lập được.

- Kiểm tra việc khử nitrate trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với

diphenylamine: Lấy vài tinh thể diphenylamine hòa tan vào một giọt H2SO4 đặc,

sau đó thêm vào một giọt dịch nghiên cứu. Nếu có mặt nitrate sẽ xuất hiện màu

xanh thẫm.

14

III. Bài nộp


- Nêu ứng dụng vi khuNn phản nitrate hóa.

15

BÀI 4. VI SINH VẬT CỐ ĐNNH NITƠ

I. Lý thuyết

Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vi sinh vật và dùng làm

nguồn kiến tạo tế bào. Các vi sinh vật cố định N sống tự do, có nhiều trong đất, hay

sống cộng sinh trong nốt sần cây họ đậu, hai họ quan trọng nhất là Azotobacteraceae

và Rhizobiaceae. Trong bài thí nghiệm này chúng ta sẽ phân lập các vi khuNn cố định

đạm tự do thuộc họ Azotobacteraceae.

Trong họ Azotobacteraceae có hai giống vi khuNn cố định đạm tự do trong điều

kiện hiếu khí là Azotobacter và Azomonas. Tất cả các loài thuộc giống Azotobacter và

Azomonas đều sống dị dưỡng, dùng nhiều nguồn carbon khác nhau, monosacharide,

disacharide, polysacharide (dextrin, tinh bột), nhiều rượu và acid hữu cơ, các hợp chất

có vòng thơm…Nguồn nitơ có thể là nitơ phân tử, cũng có thể là muối amôn, nitrate,

nitrite, amino acid. Tùy thuộc nồng độ các hợp chất có nitơ này trong môi trường mà

quá trình cố định nitơ phân tử sẽ bị ức chế nhiều hay ít. Đồng thời chúng có nhu cầu

lớn đối với P và Ca, cũng như để cố định nitơ mạnh mẽ chúng cần Mo và B.

Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển được ở pH lớn hơn 6, vì vậy hầu như

không gặp chúng ở đất chua. Azotobacter cần độ Nm cao hơn so với nhiều vi khuNn

khác nên cũng ít gặp chúng ở các vùng đất khô hạn.

Giống Azotobacter theo Khóa phân lạoi Bergey gồm 6 lòai chính: A. chroococcum,

A. vilelandii, A. beijerinckii, A. nigricans, A. armenicanus và A. paspali; trong khi đó

giống Azomonas gồm 3 lòai chính: A. agilis, A. insignis và A. macrocytpgenes. Có thể

phân biệt các lòai này qua khả năng sinh kén, khả năng di động, khả năng tổng hợp

sắc tố, khả năng phát hùynh quang (Bảng 1).

Bảng 1. Phân biệt các lòai thuộc giống Azotobacter và Azomonas dựa vào đặc

điểm hình thái

Giống Lòai Kén Di

động

Sắc tố tan trong nước

Nâu

đen

Nâu

đen –

đỏ tím

Đỏ

tím

Lục Vàng

– lục

hùynh

quang

Lam-

trắng

hùynh

quang

A z A. + + - - - - - -

16

chroococcum

A. vilelandii + + - - +/- +/- + -

A. beijerinckii + - - - - - - -

A. nigricans + - +/- + +/- - - -

A. armenicanus + + - + + - - -

A. paspali + + - - + - + -

Azo

mo

na

s

A. agilis - + - - - - + +

A. insignis - + +/- - +/- - +/- -

A.

macrocytpgene

s

- + - - - - +/- +/-

Qua bảng 1 ta nhận thấy tất cả các Azotobacter đều sinh kén, ngược lại với các

Azomonas. Cả ba lòai thuộc giống Azomonas đều có hình thái khuNn lạc và tế bào rất

giống A. chroococcum. Hầu hết chúng tổng hợp sắc tố phát hùynh quang (phát hiện

khi chiếu tia cực tím λ = 364 nm trong buồng tối).

II. Thực hành

Việc phát hiện Azotobacter và Azomonas được thực hiện trên môi trường chọn lọc

Thompson-Skerman không chứa nitơ hợp chất, trong điều kiện hiếu khí và độ Nm cao.

1. Môi trường- hóa chất

- Môi trường Thompson-Skerman (N2-free glucose) tăng sinh

K2HPO4: 1g

MgSO4: 0,2g

FeSO4: 0,2g

CaCl2: 0,1g

Na2MoO4: 0,001g

Glucose: 10g

Nước máy: 1000ml

- Môi trường Thompson-Skerman (N2-free glucose) phân lập

K2HPO4: 1g

MgSO4: 0,2g

17

CaCl2: 0,1g

Na2MoO4: 0,001g

Glucose: 10g

Nước máy: 1000ml

Agar: 3% thể tích môi trường

- ChuNn bị môi trường Thompson-Skerman với thành phần như trên, hấp khử

trùng ở 121oC trong 15 phút 1 atm.

- Buồng tối có đèn cực tím.


- Giai đoạn tăng sinh: Cân 1g đất cho vào erlen có 50 ml môi trường Thompson-

Skerman tăng sinh đã hấp khử trùng với thành phần như trên. Ủ 4-7 ngày 30OC.

- Giai đọan sau tăng sinh: kiểm tra xem có vi khuNn mong múôn không: soi kính

X 100 hay soi dầu quan sát tìm tế bào hình oval hay que đứng riêng lẻ hay cặp đôi.

- Giai đoạn phân lập: Cấy truyền từ môi trường tăng sinh vào môi trường

Thompson-Skerman phân lập đã phân vào đĩa petri và hấp khử trùng. Ủ 3-5 ngày,

30oC.


- Quan sát và ghi nhận hình thái vi khuNn đặc trưng sau giai đoạn tăng sinh.

Hình dạng tế

bào Bào tử

Kích

thước

Sự sắp xếp

tế bào

Hình vẽ tế

bào

Lọai 1

Lọai 2

…

- Ghi nhận các loại khuNn lạc khác nhau xuất hiện sau giai đoạn phân lập. Mô tả

các khuNn lạc đó:

Khu�n

lạc

Hình

dạng Bề mặt

Độ

trong

Màu

sắc

Huỳnh

quang

Khuếch

tán màu

vào môi

trường

Số lượng

khu�n lạc

loại này

18

- Chọn các khuNn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản giọt ép đề quan sát bao nhầy. Soi

kính hiển vi vật kính 40X đề kiểm tra hình thái vi khuNn: kích thước lớn, thường

đứng thành đôi và có bao nhầy.

- Ghi nhận các đặc điểm này vào bảng:

Hình dạng tế

bào Bào tử

Kích

thước

Sự sắp xếp

tế bào

Hình vẽ tế

bào

Lọai 1

Lọai 2

…

III. Bài nộp


- Nêu ứng dụng vi khuNn cố định nitơ.

19

BÀI 5:VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE I. Lý thuyết

Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Việc tổng hợp

cellulose có quy mô phức tạp hơn hẳn việc tổng hợp những hợp chất khác. Do đó, vi

sinh vật phân giải cellulose có vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình tuần hoàn

Carbon.

Sự phân giải tiến hành trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, môi trường kiểm hoặc

acid, độ Nm thấp hoặc cao và ở các nhiệt độ khác nhau. Tất cả vi sinh vật tham gia vô

cơ hóa cellulose đều thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, có enzyme cellulase xúc

tác việc phân giải cellulose thành cellobiose và glucose. Vi sinh vật dùng các hợp chất

sinh ra này làm nguồn carbon và nguồn năng lượng.

Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình này gồm niêm

khuNn, một số đại diện của các vi khuNn không sinh bào tử và sinh bào tử, xạ khuNn,

nấm...Trong đó, quan trọng nhất là niêm khuNn (Myxobacteria).

Niêm khuNn có tế bào hình que nhỏ bé (03-0,4 x 0,7-10µm) hơi uốn cong, thường

có đầu nhọn, thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các vi khuNn khác.

Trên cơ chất đặc niêm khuNn có chuyển động trượt, do sự tiết chất nhầy không đồng

đều trên bề mặt tế bào. Vài loài niêm khuNn có tiên mao, có chu kỳ phát triển phức

tạp. Đầu tiên, các tế bào hình que từ từ dầy lên, biến thành những tế bào dạng nghỉ,

hình cầu hoặc bầu dục, kích thước khác nhau.

Niêm khuNn phân giải cellulose chủ yếu gồm các giống Cytophaga,

Sporocytophaga, Sorangium sống trong đất ít acid, trung tính và ít kiềm. Các loài

thuộc giống Cytophaga có tế bào đầu nhọn, không sinh vi kén. Các loài trong giống

Sporocytophaga có hình thái tương tự như Cytophaga nhưng khác ở chỗ có khả năng

sinh vi kén. Các loài thuộc giống Sorangium là những trực khuNn đầu nhọn, có khả

năng hình thành kén.

Trên bề mặt vật liệu có cellulose, niêm khuNn phát triển trong dạng thể nhầy,

không có hình dạng xác định, lan rộng, không màu hoặc có màu vàng, da cam, đỏ

tương ứng với chỗ cellulose bị phân giải nhiều hay ít.

Ngoài niêm khuNn, trong đất còn có các loài phân giải cellulose thuộc giống

Cellvibrio, tế bào uống cong, di động nhờ 1 tiên mao, không sinh nội bào tử, khuNn

20

lạc không màu hoặc có màu vàng lục. Chúng chỉ dùng cellulose khi cạn kiệt các

nguồn cacbon khác và khả năng phân giải không mạnh mẽ bằng niêm khuNn.

Trong đất chua, vai trò phân giải do các nấm thuộc giống Chaelomium,

Trichoderma, Fusarium, Aspergillus...

II. Thực hành

Hầu hết tất cả những loài phân giải cellulose thuộc nhóm hiếu khí và ưa Nm.

Việc phát hiện và xác định sô lượng các vi sinh vật phân giải cellulose trong điều

kiện hiếu khí được tiến hành bằng cách cấy dịch huyền phù nghiên cứu lên các đĩa

chứa môi trường chọn lọc Hutchinson có nguồn carbon duy nhất là cellulose. Nuôi

cấy trong điều kiện hiếu khí.

1. Môi trường và hóa chất

- Môi trường Hutchinson (g)

KNO3 2,5

K2HPO4 1,0

MgSO4 0,3

CaCl2 0,1

NaCl 0,1

FeCl3 0,01

Agar 3%

Nước máy 1000ml


- ChuNn bị các đĩa petri có môi trường Hutchinson với thành phần như trên, hấp

khử trùng ở 1 atm.

- Giấy lọc cắt thành những khoanh tròn kích thước tương ứng đĩa petri. Hấp khử

trùng ở 1 atm.

- Mẫu đất pha với nước máy để lấy dịch huyền phù

- Cấy 0,1 ml dịch huyền phù từ độ pha loãng 102 đến 106, trang đều lên bề mặt

bằng que cấy trang.

- Dùng kẹp sắt đã khử trùng trên ngọn lửa gắp 1 khoanh giấy lọc vô trùng đặt áp

sát lên bề mặt. Mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần, đậy nắp đĩa petri.

- Nuôi cấy 30OC trong 12-14 ngày đêm.


21

- Quan sát và đếm số lượng khuNn lạc vi sinh vật mọc được trên khoanh giấy lọc

trong mỗi đĩa petri.

- Xác định xem khuNn lạc là của nhóm vi sinh vật nào (niêm khuNn, xạ khuNn hay

nấm khuNn ty) chiếm ưu thế trên giấy lọc. Để phân biệt các khuNn lạc nhỏ của xạ

khuNn và nấm, có thể quan sát trên kính hiển vi với vật kính 10X. Nhận xét sự

khác nhau giữa các loại vi sinh vật phát hiện được.

Khu�n

lạc

Hình

dạng

Kích

thước

Màu

sắc

Số khu�n lạc cùng loại

ghi nhận được (khu�n

lạc/đĩa)

Loại 1

Loại 2

- Mô tả khác khuNn lạc khác nhau của niêm khuNn, ghi nhận các dấu hiệu. Chọn

khuNn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản cùng với các sợi cellulose từ những chỗ giấy

lọc bị phân giải nhiều nhất. Lưu ý hình dạng tế bào sinh dưỡng và vi kén hoặc bào

tử nấm mốc.

III. Bài nộp


- Vi sinh vật nuôi cấy được thuộc nhóm vi isnh vật nào?

- Qua quan sát hình thái, màu sắc bào tử và cuống sinh bào tử nấm mốc, hãy thử

phân lọai nấm mốc.

22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ebgorov. Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại học quốc gia Moscow.

2. Benson: Microbiological Applications Lab Manual, Eighth Edition. The McGraw−Hill Companies, 2001.

23

PHỤ LỤC

Bài 1. Vi khu�n phân giải amôn

Mẫu đất thanh trùng 80oC, 10 phút pha lõang

rồi trải đĩa

KhuNn lạc Bacillus megaterium

KhuNn lạc Bacillus substilis Bacillus substilis nhuộm bào tử

Bacillus cereus var. Mycoides

A) KhuNn lạc B) Tế bào kết chuỗi có bào tử

24

2. Bài 2. Vi khu�n nitrate hóa

Nitrosomonas europea (Kính hiển vi quang

học, tương phản pha X2500)

Nitrosomonas europea (Kính hiển vi điện tử

X39,600.

Nitrobacter winogradskyi (Kính hiển vi

quang học, tương phản pha X2500)

Nitrobacter winogradskyi (Kính hiển vi điện

tử X 213000)

Bài 3. Vi khu�n phản nitrate hóa

KhuNn lạc Paracoccus denitrificans Tế bào Paracoccus denitrificans

25

KhuNn lạc Pseudomonas aeruginosa Tế bào Pseudomonas aeruginosa

Bài 4. Vi khu�n cố định đạm

KhuNn lạc Azotobacter spp. Tề bào Azotobacter spp. hình que và kén hình cầu, oval

Bài 5. Vi sinh vât phân hủy cellulose

Vi khu�n thủy phân cellulose (niêm khu�n)

Cytophaga hutchinsonii,

26

KhuNn lạc Sorangium cellulosum Tế bào Sorangium cellulosum

Nấm phân hủy cellulose

Trichoderma harzianum

Trichoderma viride

Trichoderma flavofuscum

VI SINH ỨNG D ỤNGNNGGNG - · PDF filetr Ư ng i h c k thu t cÔng ngh tp. hcm khoa...

Documents

Transcript of VI SINH ỨNG D ỤNGNNGGNG - · PDF filetr Ư ng i h c k thu t cÔng ngh tp. hcm khoa...