Vezba 1-2013

8/16/2019 Vezba 1-2013

1/14

Vežbe iz medicinske biohemije

Biološki materijal

U biohemijskim laboratorijama izvode se brojne kvalitativne i kvantitativne analize različitihsastojaka biološkog materijala uzetog od pacijenata u cilju postavljanja dijagnoze (potvrđivanje ili

isključivanje bolesti na koju se sumnja) i praćenje toka bolesti (procena efikasnosti terapije i prognoza

bolesti). U tu svrhu najčešće se koristi krv (puna krvi i serum ili plazma koji se iz nje dobijaju) i urin.

eđutim! za dijagnozu i praćenje velikog broja bolesti neophodne su i analize drugih vrsta biološkog

materijala! pa se u laboratorijama ustanova u kojima se leče takve bolesti! vrše ispitivanja uzoraka

znatno većeg broja različitih vrsta biološkog materijala"

• #rv" venska! kapilarna! arterijska• $erum! plazma• Urin" prvi jutarnji! %&'časovni• okraćni kamenac• učni kamenac• erebrospinalna tečnost• *mnionska tečnost• $inovijalna tečnost

• $erozne tečnosti" pleuralna! peritonealna! perikardijalna

• eludačni sok

• +uodenalni sok

• ,noj

• $aliva

• $perma

• -vrsto tkivo

Uzimanje i obrada krvi

U laboratorijskim ispitivanjima obično se koriste uzorci venske i kapilarne krvi! dok se

arterijska krv koristi znatno ređe i to samo za određene analize.

Kapilarna krv#apilarna krv se najčešće uzima iz jagodice prsta! koja se najpre obriše gazom natopljenom

alkoholom i osuši. osle uboda sterilnom lancetom ili iglom za injekcije! dozvoljeno je da se primeni

samo blagi pritisak! što potpoma/e izlazak krvi. #apilarna krv se takođe mo/e uzeti i iz ušne školjke! a

kod beba se obično uzima iz pete. 0ajčešće se koristi za hematološka ispitivanja (npr. ispitivanje krvne

slike ručnim metodama! tj. brojanjem različitih krvnih ćelija pod mikroskopom) ili za određivanje

glukoze (posebno kod dijabetičara! kod kojih se vrlo često kontroliše nivo glukoze u krvi! pa je za

pacijenta nezgodno da se svaki put podvrgava venepunkciji).

Venska krv

1

8/16/2019 Vezba 1-2013

2/14


1enska krv je najčešće korišćen biološki materijal! a uzima se iz vena u lakatnom pregibu ili

na dorzalnoj strani ruke. re izvođenja venepunkcije postavlja se podveska nekoliko centimetara iznad

lakta. una venska krv! koja je uzeta uz dodavanje odgovarajućeg antikoagulansa! najčešće se koristi

kao uzorak za ispitivanje krvne slike pomoću automatskih analizatora. ,a ostala ispitivanja iz venske

krvi se izdvajaju serum (posle koagulacije krvi) ili plazma (iz krvi kojoj je dodat odgovarajući

antikoagulans). 2dvajanje seruma ili plazme treba izvršiti što pre! da bi se izbegle promene do kojihdolazi prilikom du/eg stajanja pune krvi (npr. sni/enje koncentracije glukoze zbog potrošnje u

eritrocitima).

Arterijska krv*rterijska krv se retko koristi kao uzorak! a potrebna je za određene analize! kao npr. za

određivanje parametara acido'baznog statusa i za analizu gasova u krvi (uz heparin kao

antikoagulans). +obija se uvođenjem igle u radijalnu! brahijalnu ili femoralnu arteriju! a vađenje

arterijske krvi mo/e da izvodi jedino lekar. #apilarna krv po svom sastavu sličnija arterijskoj nego

venskoj krvi.

,a uzimanje krvi koriste se špricevi! vakutejneri! serumski separatori (u separatorima se

nalaze gelovi! kuglice ili kristali). 3pricevi se sve ređe koriste! osim u slučaju uzimanja krvi za gasne

analize! kao i za uzimanje cerebrospinalne ili amnionske tečnosti. +anas se u laboratorijama koriste

specijalne epruvete za sakupljanje krvi (vakutejneri). 4pruvete mogu da budu oblo/ene silikonom!

čime se sprečava hemoliza i prilepljivanje krvi na zidove epruveta. U epruvetama mogu biti različiti

antikoagulansi! što je naznačeno zapušačima različitih boja! a koriste se igle odgovarajućeg promera

(npr. od %5'gejd/i! ili %6' i %%' za pedijatrijske pacijente ili one sa lošim i traumatizovanim venama).

*ko se koriste igle izvan ovog promera povećava se mogućnost hemolize.

7abela 6. 1rste vakutejner epruveta

8oja zapušača Uzorak *ntikoagulans

uta $terilna unutrašnjost epruvete nema

rvena $erum nema

$iva lazma ili puna krv sa inhibitorom glikolize oksalat (0a ili #)! fluorid (0a)! jodacetat

,elena lazma ili puna krv heparin (0a! 9i ili 0:&)

lava lazma ili puna krv 0a'citrat

9jubičasta lazma ili puna krv 0a% ili # %'4+7*

2

8/16/2019 Vezba 1-2013

3/14


$lika 6. 1akutejneri

ošto kod jednog broja parametara postoje značajne dnevne varijacije koncentracija u krvi

(npr. gvo/đe! kateholamini! glukoza! trigliceridi! kortizol! estriol! kortikosteroidi)! u većini slučajeva je

najbolje uzimati krv nakon noćnog gladovanja i to obično između ; i < sati ujutru! a nakon 65'6= min

opuštanja u le/ećem polo/aju.

olo/aj tela prilikom uzimanja krvi utiče na preraspodelu vode između intravaskularnog i

ekstravaskularnog prostora" zapremina krvi odrasle osobe je za oko >55';55 m9 manja u stojećem!

nego u le/ećem stavu. ,bog toga je sadr/aj proteina plazme! kao i svih supstanci koje su vezane za proteine veći u stojećem nego u le/ećem stavu (ukupni proteini! albumin! lipidi! gvo/đe! kalcijum i

enzimi). 0a rezultate laboratorijskih analiza utiče i produ/eno korišćenje podveske! pa je stoga treba

izbegavati pri određivanju gasova u krvi ili laktata (kao posledica usporavanja protoka krvi smanjuje

se p2% a povećavaju p:! p2% i koncentracija laktata! usled anaerobnog metabolizma).

rilikom uzimanja krvi! pa sve dok se serum ne izdvoji! mora se voditi računa da ne dođe do

hemolize. :emoliza mo/e nastati usled upotrebe suviše velike ili male igle! sna/nog mešanja krvi

(antikoagulans se rastvara blagim mešanjem) ili pri procesima presipanja i razdvajanja. 2sim toga!

kako bi se sprečila hemoliza! centrifugiranje treba vršiti pri umerenim brzinama (%555'?555

obrtaja@min). Ukoliko je koncentracija hemoglobina u uzorku seruma (plazme) veća od 5!% g@9!

hemoliza je vidljiva golim okom. U hemolizovanim uzorcima mogu da se jave tri tipa grešaka"

' ovećanje koncentracije svih supstanci koje se u eritrocitima nalaze u većim

koncentracijama nego u serumu ili plazmi (npr. kalijum! magnezijum! enzimi laktat'dehidrogenaza!

kisela fosfatazaA). *ko je hemoliza veoma izra/ena! doći će i do blagog sni/enja nivoa onih supstanci

čija je koncentracija manja u eritrocitima nego u plazmi (dilucioni efekat)! na primer! ukupnih

proteina! albumina itd.

' #ako hemoglobin intenzivno apsorbuje svetlost talasne du/ine &5= nm (molarna

apsorbancija na ovoj talasnoj du/ini iznosi 6!? ⋅ 65=)! njegovo prisustvo u reakcionoj smeši ometa

spektrofotometrijska merenja u oblasti talasnih du/ina bliskih navedenoj vrednosti (npr. prilikom

određivanja bilirubina). Breške prouzrokovane ovim efektom mogu da se eliminišu primenom slepe probe.

' :emoglobin prisutan u hemolizovanom uzorku mo/e da ometa neke hemijske reakcije (npr.

inhibicija aktivnosti lipaze).

+o analiziranja! uzorke krvi treba dr/ati na ledu! ili ukoliko je moguće! odmah izdvojiti serum

ili plazmu. $tajanje krvi dovodi do povećanja njene alkalnosti! usled gubitka ugljen'dioksida (difuzija

iz plazme u atmosferu)! a ovaj fenomen posebno utiče na rezultate analize gasova u krvi. Usled

hidrolize organskih fosfata u eritrocitima! u plazmi mo/e da dođe do povećanja neorganskog fosfata.

#ako bi se ovo izbeglo serum ili plazmu treba odvojiti odmah nakon uzimanja krvi. Usled

kontaminacije bakterijama povećava se nivo amonijaka iz azotnih jedinjenja (uglavnom ureje)! a da bise ovo sprečilo! uzorak treba uzimati pod sterilnim uslovima! a krv ohladiti nakon uzimanja. roteaze

3

8/16/2019 Vezba 1-2013

4/14


iz krvi mogu da hidrolizuju peptide i peptidne hormone! te stoga uzorke krvi treba čuvati na & o i

odmah vršiti centrifugiranje.

Serum se dobija centrifugiranjem krvi uzete bez antikoagulansa! a centrifugiranje se izvodi pri brzini od %555 ' ?555 obrtaja@min posle završenog procesa koagulacije. 1reme potrebno za

koagulaciju je %5'?5 min ako se koagulacija vrši u vodenom kupatilu! br/e je ako se u krvi nalaziaktivator koagulacije! a sporije ako se uzorak nalazi na ledu. U toku centrifugiranja! fibrinska mre/a sa

krvnim ćelijama (koagulum) izdvaja se na dnu epruvete! a iznad nje ostaje serum! koji normalno ima

izgled bistre! /ućkaste tečnosti. $erum se u praksi koristi kao uzorak za određivanje većine

biohemijskih parametara! iako se u najvećem broju slučajeva umesto seruma mo/e koristiti i plazma.

#oncentracija pojedinih parametara je ista u serumu i plazmi (npr. bilirubin! holesterol i kreatinin)!

dok su vrednosti nekih parametara više u plazmi (kalcijum! ukupni proteini)! a drugih u serumu.

Plazma je krv bez krvnih ćelija! a dobija se centrifugiranjem pune krvi koje se mo/e izvršitineposredno posle vađenja krvi. 2snovna razlika u sastavu seruma i plazme je da plazma sadr/i

fibrinogen! koji se pri dobijanju seruma konvertuje u fibrin i na taj način uklanja iz uzorka. *ko je

potrebno da se iz krvi izdvoji plazma! ili ako se za analizu kao uzorak koristi puna krv! neophodno je

da se koagulacija krvi spreči dodatkom nekog antikoagulansa! koji se dodaje u epruvete u kojima se

sakuplja krv. #ao antikoagulansi se mogu koristiti"

' Heparin inhibira konverziju protrombina u trombin i time sprečava koagulaciju. 0e utiče na preraspodelu vode između krvnih ćelija i plazme i ne interferira u najvećem broju laboratorijskih

analiza. #oristi se oko % mg@65 m9 krvi natrijum'! kalijum'! amonijum' ili litijum'heparinata.

Upotreba heparina je ipak ograničena zbog znatno veće cene u poređenju sa drugim antikoagulansima.

' EDTA (dikalijumova ili dilitijumova soC dinatrijumova so ima nešto manju rastvorljivost)! u

koncentraciji od 65 do %5 mg@m9 krvi! sprečava koagulaciju na taj način što vezuje slobodne jonekalcijuma u helat. #ako ne utiče bitno na preraspodelu vode između eritrocita i plazme! a time ni na

zapreminu eritrocita! pogodan je za primenu prilikom uzimanja krvi za hematološka ispitivanja.

' ksalat (kalijumova so je najrastvorljivija) sprečava koagulaciju talo/enjem kalcijuma.rimenjuje se 65'%5 mg@65 m9 krvi ili %5'?5 mg praškaste soli. Dzaziva prelazak vode iz krvnih ćelija

u plazmu! pa dolazi do razbla/ivanja plazme za nekoliko procenata.

' !itrat (natrijumova so) stvara helat sa kalcijumovim jonom. #oristi se oko >5 mg natrijum'citrata@65 m9 krvi! mada već ?5 mg@65 m9 sprečava koagulaciju. D ovaj antikoagulans dovodi do

preraspodele vode između ćelija i plazme! slično oksalatu. itratna plazma se koristi kao uzorak za

određivanje fibrinogena i druga ispitivanja funkcije sistema koagulacije.

' +a bi se sprečila koagulacija pomoću natrijum"#luorida potrebno je koristiti oko 65 mg@m9krvi. 0atrijum'fluorid se obično koristi pre kao konzervans (inhibitor glikolize u eritrocitima! pa

povećava stabilnost glukoze u punoj krvi)! nego kao antikoagulantno sredstvo. eša se sa kalijum'

oksalatom (? dela oksalata E 6 deo fluorida) ili 6 deo dinatrijumove soli 4+7* sa % dela fluorida! a

zatim se koristi od ovakve smeše po ?5 mg@65 m9 krvi.

ored hemolize! na rezultat analize mogu da utiču i ikteričnost seruma i lipemija. Dkterični

uzorci se dobijaju iz krvi pacijenata sa /uticama! a karakteristična /uta boja je posledica povećane

koncentracije bilirubina! što uglavnom utiče na spektrofotometrijska merenja u oblasti talasnih du/ina

između &55 i =55 nm. Breške koje mogu nastati usled ikteričnog uzorka se koriguju primenom slepe

probe analize. 9ipemični uzorci seruma ili plazme su mutni i beličasti! a mogu se dobiti na dva načina"

4

8/16/2019 Vezba 1-2013

5/14


6. *ko se ne poštuje opisana procedura pripreme pacijenta za uzimanje krvi (tj. ako se krv ne

uzme natašte! već kraće vreme posle obroka)

%. *ko pacijent boluje od neke hiperlipoproteinemije koja se karakteriše povećanim nivoom

hilomikrona! 19+9'a! ili obe navedene klase lipoproteina.

9ipemija je vidljiva golim okom ako je koncentracija triglicerida u uzorku veća od &!=>mmol@9. risutni trigliceridi ometaju mnoga spektrofotometrijska merenja! naročito u oblasti talasnih

du/ina između &55 i =55 nm. Breške izazvane lipemijom koriguju se primenom slepe probe analize ili

uklanjanjem lipida iz uzorka ekstrakcijom ili ultracentrifugiranjam.

,a većinu biohemijskih analiza! serum ili plazma se mogu čuvati %& h na temperaturi od &o.

*ko se izvođenje analize odla/e na du/i period! uzorke treba zamrznuti na '%5 o ili 'F5o. 8ilirubin!

koji se često određuje u biohemijskim laboratorijama! vrlo je nestabilan metabolit (brzo se razla/e pod

dejstvom svetlosti)! pa određivanje bilirubina treba izvršiti u sve/em uzorku.

Urin 0ačin na koji će se izvršiti sakupljanje urina zavisi od vrste ispitivanja. ostoji veći broj

mogućih načina sakupljanja! ali se kao uzorci najčešće koriste prvi jutarnji urin i %&'časovni urin.

Prvi jutarnji urin se uzima rano ujutru! natašte! uz korišćenje potpuno čistog suda. #ako jeovaj uzorak urina najkoncentrovaniji! pogodan je za kvalitativno ispitivanje tj. za fizičko'hemijski

pregled urina i sedimenta. 0e treba ga koristiti za kvantitativna određivanja! zbog toga što u toku dana

postoje izrazite varijacije u ekskreciji pojedinih supstanci urinom. ,ato se na osnovu koncentracije u

prvom jutarnjem urinu ne mo/e pouzdano proceniti dnevna ekskrecija ispitivane supstance! koja ima

veći klinički značaj od koncentracije te supstance u urinu.

$%"&asovni urin! odnosno ukupna količina urina koja se izluči u toku %& h! sakuplja se počevod jutra! zaključno do jutra sledećeg dana. Ujutru u određeno vreme! npr. u ;.55 sati! pacijent treba

potpuno da isprazni bešiku i ovu porciju urina odbaci. $ve ostale porcije urina koje se izluče u toku

celog tog dana i noći treba sakupljati! pazeći da ne dođe do gubitaka. $ledećeg jutra u isto vreme (u

datom primeru u ;.55 h)! sakupi se poslednja porcija urina! ponovo uz potpuno pra/njenje bešike.

elokupna količina urina nosi se u laboratoriju! gde će biti izvršeno merenje zapremine urina. #od

zdravih osoba koje unose prosečne količine hrane i tečnosti! zapremina %&'časovnog urina se obično

kreće između 6%55 i 6=55 m9. %&'časovni urin se koristi za kvantitativno određivanje raznih

sastojaka. U laboratoriji se izmeri zapremina urina (diureza)! uz pomoć menzura odgovarajućeveličine. #ompletan urin mora dobro da se izmeša! pa se zatim odvoji određena količina za dalju

analizu. o određivanju koncentracije ispitivane supstance! izračunava se dnevna ekskrecija te

supstance (količina supstance prisutne u celokupnoj količini urina) mno/enjem dobijene koncentracije

sa zapreminom %&'časovnog urina.

ri sakupljanju urina pacijentu treba davati odgovarajuće uputstvo o načinu sakupljanja! kao i

o načinu ishrane i uzimanja lekova! pošto različiti sastojci u urinu mogu da interferiraju sa analitičkim

postupcima. +a bi se sprečile promene u sastavu urina (najčešće %&'časovnog)! u mnogim slučajevima

se koriste različiti konzervansi. 2ni se dodaju direktno u bocu u kojoj će se sakupljati urin! a deluju

tako što sprečavaju rast bakterija! razlaganje nestabilnih supstanci ili sprečavaju talo/enje nekih

sastojaka. Dzbor konzervansa se vrši zavisno od vrste analize"

5

8/16/2019 Vezba 1-2013

6/14


" Hlorovodoni&na kiselina (65 m9 koncentrovane :l ili =5 m9 rastvora :l koncentracije% mol@9) koristi se kod određivanja amonijum'jona! kalcijuma! oksalata i nekih hormona!

" Borna kiselina (= mg@?5 m9) kod određivanja većeg broja hormona!

" 'atrijum"bikarbonat (= g) kod određivanja urobilinogena i porfirina!

" Toluen kod određivanja aminokiselina!" Petroletar kod određivanja urobilinogena.

,a izvođenje nekih analiza nije dozvoljena upotreba konzervanasa! pa se urin mo/e zaštititi od

rasta bakterija i promene sastava zamrzavanjem (npr. kod određivanja osmolalnosti urina! cistina ili

aldosterona).

ri stajanju urina dolazi do promena njegovog sastava! pre svega zbog delovanja bakterija.

ošto se urin obično ne sakuplja pod aseptičnim uslovima! često dolazi do kontaminacije. 8akterije

obično dovode do razlaganja glukoze! ali i ureje na amonijak i ugljen'dioksid! što povećava alkalnost

urina! te ovakav uzorak nije pogodan za određivanje glukoze! ureje! amonijaka! p: i ukupnog azota.

2sim toga! u alkalnom urinu dolazi do talo/enja fosfata. $tajanjem urina dolazi do talo/enja mokraćnekiseline i urata (gube rastvorljivost u hladnom urinu)! te stoga uzorke urina pre analiziranja treba

dobro izmešati. Dstalo/eni urati se rastvaraju umerenim zagrevanjem urina! a fosfati dodavanjem male

količine kiseline.

(e)es

,a ispitivanje fecesa koriste se različiti uzorci" pojedinačni (za kvalitativne analize! najčešće

za dokazivanje okultnog krvarenja)! celodnevni (sakupljen u toku %&'sata! za kvantitativne analize) i

uzorak koji se sakuplja u toku ;% sata (za metabolička ispitivanja).

rilikom sakupljanja uzoraka treba izbegavati kontaminaciju urinom (dokaz za prisustvo urina

su povećane količine hlorida! kojih ima neznatno u normalnom fecesu). ,a kvantitativna ispitivanja

celodnevni uzorak treba dostaviti laboratoriji u što je moguće kraćem periodu. 7reba koristiti sve/e

uzorke kako bi se izbegla potreba za konzervisanjem (najbolje je da se uzorci čuvaju u fri/ideru). *ko

je neophodno da se u fecesu određuje azot! feces treba izmešati sa oko %55 m9 vode i nakon toga

homogenizovati. Gednom alikvotu se uz pa/ljivo mešanje dodaje ista zapremina koncentrovane

sumporne kiseline i ovako pripremljen uzorak se čuva do analiziranja.

,a metabolička ispitivanja uzorci fecesa se! slično uzorcima urina! sakupljaju u tačno

definisanom periodu. U ovom slučaju se koristi nekoliko supstanci (npr. ugalj! karmin i gencijana

violet)! pomoću kojih se označava početak i kraj eksperimentalnog perioda. 2bično se dodaje 5!= do 6g u kapsulama pre doručka prvog jutra kad otpočinje ispitivanje! odnosno sakupljanje fecesa i ponovo

pre doručka zadnjeg dana sakupljanja! kad se završi sakupljanje fecesa. $a sakupljanjem fecesa se

otpočinje kad se prvi put pojavi boja u stolici. $akupljanje obuhvata sve uzorke stolice do onog uzorka

koji ponovo sadr/i boju (ovaj uzorak se odbacuje). o završetku sakupljanja izmeri se posuda sa

fecesom. asa fecesa se dobija oduzimanjem te/ine posude koja je izmerena pre početka sakupljanja.

$akupljeni feces se homogenizuje i odgovarajući alikvoti se koriste za dalja ispitivanja.

Dru*e telesne te&nosti

6

8/16/2019 Vezba 1-2013

7/14


+ikvor (cerebrospinalna tečnost) ispunjava šupljine u mozgu i prostor između mozga ikičmene mo/dine i njihovih opni (subarahinoidalni prostor). 2dvojen je od krvi krvno'mo/danom

barijerom. Uloga likvora je da štiti tkivo centralnog nervnog sistema! u njemu se sakupljaju

razmenjene materije i cirkulišu hranljive materije. 9ikvor se uzima lumbalnom punkcijom u polo/aju

9&'9=! pod aseptičnim uslovima i pomoću sterilne kanile. unkcijom treba uzimati otprilike uvek isti

volumen! oko 6= do %5 m9! s obzirom da se sastav likvora menja. rilikom uzimanja likvora prvihnekoliko kapi se odbaci! a preostala količina raspodeli u tri epruvete. Uzorak iz prve epruvete se

koristi za hemijska i imunološka ispitivanja! iz druge za mikrobiološka ispitivanja! a iz treće epruvete

za utvrđivanje ukupnog i diferencijalnog broja ćelija.

Amnionska te&nost okru/uje fetus i štiti ga od spoljašnjih trauma! osigurava stalnutemperaturu ploda! delimično ga hrani! učestvuje u razmeni gasova i slu/i za izlivanje sekreta i

ekskreta (ima zaštitnu! prenosnu i metaboličku funkciju). Uzorci amnionske tečnosti se uzimaju

transabdominalnom amniocentezom nakon 6>'te nedelje od poslednjeg menstrualnog perioda ili 6&'te

nedelje od početka trudnoće. 0e treba uzimati više od 65 ' %5 m9 uzorka. Uzorak se zatim centrifugira

u toku = min na =55'6555g! pošto se za ispitivanja koristi supernatant. #ao i u slučaju likvora! prvo se

ispituje izgled uzorka amnionske tečnosti! a zatim se primenjuju i sva druga neophodna ispitivanja"

mikroskopska! hemijska! genetska i mikrobiološka.

Serozne te&nosti se nalaze unutar telesnih šupljina (pleuralna! peritonealna! perikardijalna)!između parijetalne i visceralne membrane! u količini od nekoliko mililitara. embrana obično ne

sprečava razmenu tečnosti i elektrolita između telesnih šupljina i intersticijalne tečnosti koja ga

okru/uje. *kumulirana tečnost unutar pleuralne! perikardijalne ili peritonealne šupljine se naziva izliv.

*spiracija pleuralne tečnosti se naziva toracenteza! perikardijalne je perikardiocenteza! a aspiracija

peritonealne tečnosti je peritoneocenteza. 2ve tehnike se primenjuju u dijagnostičke ili terapeutske

svrhe u cilju oslobađanja od pritiska. Dzlivi mogu biti transudati ili eksudati. 7ransudati nastaju kao

posledice sistemskih oboljenja (kongestivno oštećenje srca)! a eksudati usled oštećenja površinamembrana (inflamacija! maligna stanja! infekcije). 7ransudati i eksudati se razlikuju po boji! izgledu i

broju ćelija.

Sinovijalna te&nost je ultrafiltrat plazme koji sadr/i mukopolisaharide (hijaluronat)! asintetišu je ćelije sinovijalne membrane. 2va tečnost podmazuje zglobove i prenosi hranljive sastojke!

omogućavajući tako ishranu zglobnog tkiva. *naliza sinovijalne tečnosti se koristi za postavljanje

dijagnoze oboljenja zglobova. 7ehnika uzorkovanja sinovijalne tečnosti se naziva artrocenteza! vrši se

pomoću šprica! uz upotrebu 0a'heparina kao antikoagulansa.

,vrsta tkiva koja se najčešće ispituju u biohemijskim laboratorijama su maligna tkiva dojke!u kojima se određuju receptori za estrogen i progesteron. Uzorak se uzima biopsijom i odmah

zamrzava u tečnom azotu. aralelno sa biohemijskim ispitivanjima neophodno je da se tkivo ihistološki ispita kako bi se potvrdilo da se radi o malignom tkivu.

-zvori preanaliti&ke varija)ije

*ko se u jednom uzorku određena analiza ponavlja više puta! dobijeni rezultati neće biti

potpuno identični! zbog izvesne nepreciznosti analitičke metode koja se koristi za određivanje date

supstance. Ukoliko je preciznost metode manja! utoliko će se rezultati ponovljenih određivanja više

razlikovati! iako je stvarna koncentracija supstance koja se određuje u uzorku uvek ista. 2vaj tip

varijacije rezultata naziva se analiti&ka varija)ija.

7

8/16/2019 Vezba 1-2013

8/14


Hazličite bolesti dovode do karakterističnih promena koncentracija pojedinih sastojaka

biološkog materijala (npr. povećanje koncentracije glukoze u krvi kod dijabetes melitusa)! što

omogućava primenu rezultata laboratorijskih ispitivanja za procenu zdravstvenog stanja pacijenata.

eđutim! i kod zdravih osoba! brojni faktori utiču na koncentracije pojedinih sastojaka telesnih

tečnosti in vivo. 2vi faktori! zajedno sa faktorima koji deluju u samom postupku uzimanja biološkog

materijala utiču na stvarnu koncentraciju ispitivane supstance u dobijenom uzorku i predstavljajuizvore preanaliti&ke varija)ije.

Iiziološki faktori koji utiču na sastav telesnih tečnosti mogu da se podele u dve grupe"

6. Iaktori koji ispoljavaju dugoročne efekte (ovi efekti se najčešće ne mogu kontrolisati)

%. Iaktori koji ispoljavaju kratkoročne efekte (efekti koji se mogu kontrolisati).

(aktori koji ispoljavaju du*oro&ne e#ekteU većini slučajeva nije moguće eliminisati uticaj ovih faktora na koncentraciju sastojaka

telesnih tečnosti. 0a neke se ne mo/e delovati uopšte (npr. starost! genetski faktori)! dok na druge

mo/e! ali ne trenutno! u trenutku kad se uka/e potreba da se osoba podvrgne laboratorijskom

ispitivanju (npr. uobičajeni način ishrane). ,bog toga je neophodno poznavati efekte ovakvih faktora i

uzeti ih u obzir prilikom interpretacije dobijenih rezultata. U ovu grupu spadaju"

• Starost (koncentracije mnogih sastojaka telesnih tečnosti različite su kod novorođenčadi!

dece! odraslih i starih osoba)!

• .enetski #aktori (pol! rasa i dr.)!

• (aktori sredine (npr. klima i nadmorska visina)!

• Du*oro&ne )ikli&ne promene (uticaj godišnjih doba ili menstrualnog ciklusa kod /ena)!

• Telesna te/ina (npr. prosečne koncentracije triglicerida u plazmi rastu sa povećanjem telesne

te/ine)

• 'a&in is0rane (npr. kalorična ishrana sa velikim sadr/ajem masti utiče na parametre lipidnog

statusaC vegetarijanska ishrana pokazuje vrlo povoljne efekte na lipidni status! ali mo/e da

dovede do deficijencije nekih vitaminaC du/e gladovanje takođe dovodi do karakterističnih

promena! npr. do porasta koncentracije ketonskih tela u krvi i urinu).

• Stepen uobi&ajene #izi&ke aktivnosti1

(aktori koji ispoljavaju kratkoro&ne e#ekte+ejstvo ove grupe faktora se mo/e kontrolisati! pa se njihov uticaj na rezultate laboratorijskih

ispitivanja eliminiše adekvatnom pripremom pacijenta pre i u toku uzimanja biološkog materijala.

#ratkoročne uticaje na sastav telesnih tečnosti ispoljavaju sledeći faktori"• Polo/aj tela prilikom uzimanja krvi" polo/aj tela utiče na preraspodelu vode između

intravaskularnog i ekstravaskularnog prostora" zapremina krvi odrasle osobe je za oko >55'

;55 m9 manja u stojećem! nego u le/ećem stavu. ,bog toga je sadr/aj proteina plazme! kao i

svih supstanci koje su vezane za proteine veći u stojećem nego u le/ećem stavu.

• Vreme poslednje* obroka" uzimanje hrane utiče na koncentraciju brojnih sastojaka krvi. #ao

što je ranije rečeno! krv se zbog toga u pravilu uzima natašte! najmanje 65 h posle obroka.

• !irkadijalni ritam" koncentracija nekih sastojaka telesnih tečnosti podle/e promenama u

toku dana (hormoniC gvo/đe ' koncentracija gvo/đa u serumu je najviša ujutru! dok je uveče

čak ?5J ni/a). 4fekti se eliminišu uzimanjem biološkog materijala u određeno vreme u toku

dana (krv se po pravilu uzima ujutru).

8

8/16/2019 Vezba 1-2013

9/14


• -mobiliza)ija i 0ospitaliza)ija. osle nekoliko dana neaktivnosti dolazi do određenih

promena (npr. smanjenje zapremine plazme! povećanje hematokrita itd).

• Ve/banje (kraće vreme pre uzimanja biološkog materijala)" efekti zavise od trajanja i

intenziteta fizičke aktivnosti.

• Pušenje2 unošenje alko0ola ili lekova.

9

8/16/2019 Vezba 1-2013

10/14

Primena spektro#otometrije u medi)inskoj bio0emiji

U biohemijskim laboratorijama se vrše kvalitativna ispitivanja (dokazivanje prisustva

određenih supstanci u biološkom materijalu) i kvantitativna određivanja pojedinih biohemijskih parametara. 2d analitičkih metoda primenu u medicinskoj biohemiji imaju"

6. etode separacije" hromatografija i elektroforeza

%. #vantitativna određivanja"

' gravimetrija

' titrimetrija

' spektrofotometrija

' elektrohemija

' imunohemija

' hromatografija

2d pomenutih metoda najčešće se primenjuje spektrofotometrija! koja se zasniva na 9ambert

8eer'ovom zakonu"

3 4 5 K b K ) ili 3 4 6 K b K )

3 " apsorbancija (Lkstinkcija) 5 (67 8 molarni apsorpcioni koeficijent (6 zavisi od prirode supstance! M i 7 )

b " du/ina optičkog puta N širina kivete (cm) ) " koncentracija rastvora

:emijskom reakcijom između parametra koji se određuje u uzorku i reagensa stvara se

proizvod reakcije! čija se apsorbancija meri spektrofotometrijski (U1 ili 1D$). erenja u U1 oblasti

vrše se u kvarcnim ili plastičnim kivetama (ukoliko se u reakcionoj smeši ne nalaze korozivne

supstance)! a u 1D$ oblasti u staklenim ili plastičnim kivetama. erenje apsorbancije se vrši na M maO.

Dzračunavanje nepoznate koncentracije je moguće ostvariti na ? načina"

6. primenom standarda

%. primenom standardne krive

?. primenom molarnog apsorpcionog koeficijenta

-zra&unavanje kon)entra)ije primenom jedno* standarda podrazumeva da se paralelno saanalizom uradi i standard! a zatim se na osnovu izmerenih apsorbancija analize i standarda računa

nepoznata koncentracija analize iz sledeće izraza"

$t

$t

*

* )*

*) ×=

* P koncentracija analize

$t P koncentracija standarda** P izmerena apsorbancija analize*$t P izmerena apsorbancija standarda

8/16/2019 Vezba 1-2013

11/14

$tandard je rastvor poznate! tačno određene koncentracije ispitivanog parametra u

odgovarajućem rastvaraču. #oncentracija standarda se bira tako da bude u opsegu referentnih

vrednosti parametra čije se koncentracija određuje. $tandardi mogu biti primarni ili sekundarni.

rimarni standardi se dobijaju rastvaranjem određene! tačno izmerene količine ispitivane supstance! u

odgovarajućem rastvaraču! a sekundarni standardi se dobijaju razbla/ivanjem primarnih standarda! pri

čemu njihova koncentracija mora biti određena referentnom metodom za dati parametar.

-zra&unavanje kon)entra)ije primenom standardne krive podrazumeva konstruisanjestandardne (kalibracione) krive zavisnosti apsorbancija od koncentracija standardnih rastvora. U tu

svrhu koristi se serija standardnih rastvora rastućih koncentracija ispitivanog parametra. $a svakim od

standardnih rastvora se izvodi reakcija! a zatim izmeri apsorbancija. 0a osnovu dobijenih parova

vrednosti za koncentracije i apsorbancije izračuna se jednačina prave i nacrta standardna kriva"

Ddealna standardna kriva je linearna i prolazi kroz koordinatni početak! a metoda ima dobar analitički opseg ako oko

8/16/2019 Vezba 1-2013

12/14

Slepe probe se koriste za eliminisanje ne/eljenih apsorbancija koje mogu da utiču na rezultat.U tu svrhu se mogu koristiti slepa proba reagensa i slepa proba analize (uzorka).

$lepa proba reagensa slu/i za eliminisanje apsorbancije koja potiče od reagensa i priprema se

istim postupkom kao analiza i standard! ali se umesto uzorka dodaje voda ili rastvarač! u istoj

zapremini. $lepom probom reagensa se vrši podešavanje nule spektrofotometra. Ukoliko je

apsorbancija slepe probe reagensa suviše visoka! nula aparata se podesi destilovanom vodom! aapsorbancija slepe probe reagensa izmeri! a zatim se oduzme od apsorbancije analize i apsorbancije

standarda. U slučaju da reagensi ne apsorbuju na talasnoj du/ini merenja! nula aparata se podešava

destilovanom vodom.

$lepa proba analize se koristi za eliminisanje apsorbancije koja potiče od uzorka i priprema se

na isti način kao analiza! uz određene modifikacije kojima se sprečava reakcija ispitivanog parametra

sa reagensom. Apsorbancija slepe probe analize se uvek mora izmeriti, a njena vrednost se oduzima

samo od apsorbancije analize.

9e#erentni materijali koji se koriste u bio0emijskoj laboratorijiU biohemijskim laboratorijama se kao referentni materijali koriste kalibratori i kontrolni

materijali. #alibratori se koriste za kalibraciju analitičkih instrumenata i imaju tačno određenu

vrednost parametara čije se koncentracije određuju. #ontrolni serumi se koriste za procenu preciznosti

i tačnosti rezultata. *naliziraju se na potpuno isti način kao i uzorci pacijenta! a koncentracija

parametara u kontrolnim serumima mora biti poznata. #ontrolni serum se ne koristi za kalibraciju

instrumenata.

Eksperimentalni rad

- Provera ta&nosti pipeta

:1 .ravimetrijska metodaDzmeriti te/inu destilovane vode na elektronskoj vagi sa tačnošću 5!556g koju ste u merni sud

dodali pipetom koja odmerava odgovarajuću deklarisanu zapreminu. Dzračunati odstupanje u

procentima od deklarisane zapremine (greška ne bi smela da bude veća od 6J)

$1 Spektro#otometrijska metodaHeagensi koji se koriste za sprektrofotometrijsku kalibraciju automatskih pipeta su"

0a2:! 5!56 mol@9

p'nitro'fenol (p0)! 5!65= g@9

Heferentno razbla/enje D ' 0apuniti normalni sud od %=5 m9 do crte sa 5!56 mol@9 0a2:.

+odati 6 m9 rastvora p0 5!65=g@9. U = epruveta dodati po %!= ml 0a2:. U svaku epruvetu pipetom

koju proveravamo dodajemo po 65 S9 p0 referentnog rastvora D. ročitati apsorbanciju svakog

rastvora iz = epruveta na &56 nm. 2čekivana vrednost * je 5!==5.

Dz = očitanih vrednosti izračunati srednju vrednost i računati odstupanje prema formuli"

*sr@5!==5T+T1N zapremina u S9 koju odmerava pipeta

8/16/2019 Vezba 1-2013

13/14

+ P razbla/enje test rastvora (6"%=6 u ovom primeru) a 1 je ukupna zapremina u S9 P %=65 u

ovom primeru.

2dstupanje ne bi smelo da pređe 6J.

-- Ta&nost spektro#otometra

,a ispitivanje tačnosti spektrofotometra koristi se rastvor kalijum'dihromata. # %r %2; se suši

na 665° tokom 6h. ripremaju se dva rastvora različitih koncentracija u 5!55= mol@9 sumporne

kiseline.

Hastvor *" 5!5= g@9 # %r %2;

Hastvor 8" 5!6 g@9 # %r %2;

5!55= mol@9 sumporne kiseline se koristi kao slepa proba

erenja apsorbancije rastvora * i 8 prema sumpornoj kiselini kao slepoj probi se izvode na7° od 6='%=°.

U tabeli su date očekivane vrednosti apsorbancija rastvora * i 8 na talasnim du/inama MN %?=!

%=;! ?6?! ?=5 nm.

; 9astvor A 9astvor B$min7 5!>%> 5!55< 6!%=6 5!56<$=? >ma@7 5!;%; 5!55; 6!&=& 5!56=min7 5!%&& 5!55& 5!&FF 5!55;ma@7 5!=?> 5!55= 6!5;6 5!566

--- 'a&ini izra&unavanja kon)entra)ije u bio0emiji

,a pravljenje rastvora standarda p0 koristiti stock rastvor 6 mmol@9 p'nitrofenola u 65

mmol@9 0a2:.

p'nitrofenil fosfat E :%2 p-nitrofenol E fosfat

p-nitrofenol E 2:' p"nitro#enoksidni anjon zuto obojen

ε(p0) N 6F =55 9@mol O cm.

:1 Apsorp)ioni spektar 0acrtati apsorpcioni spektar jedinjenja p0 na spektrofotometru 8eckman u laboratoriji %5&.

regledati spektar! uočiti apsorpcione maksimume i minimume. 2čitati karakterističan *maO na oko &55

nm i tako određenu talasnu du/inu koristiti za određivanje koncentracije u uzorku preko standarda!

preko standardne krive i pomoću molarnog apsorpcionog koeficijenta.

$1 dreivanje kon)entra)ije p'P u uzorku upotrebom STA'DA9DA

8/16/2019 Vezba 1-2013

14/14

Dzmeriti apsorbancije u nepoznatom uzorku i standardu! pa izračunati koncentraciju nepoznate

analize. #oristiti standard p0 koncentracije =5 Smol@9.

Vezba 1-2013

Documents

Transcript of Vezba 1-2013