Verifiche qualitative dell’RNA e cDNA in

ambito dei trials “BCR/ABL e AML

translocation programme”

Massimo Degan, CRO Aviano (PN)

Verifiche qualitative dell’RNA

…perch è è importante verificare l’RNA …• La verifica della qualità dell’RNA nei saggi

diagnostico-molecolari viene fatta allo scopo di evidenziare un’eventuale degradazione del campione che può compromettere le successive reazioni di retro-trascrizione e amplificazione del target.

• Le procedure di verifica dell’RNA e cDNA permettono di evitare il problema dei falsi negativi.

• Verifica della presenza di DNA contaminante.

• Non è sufficiente considerare il parametro relativo al rapporto 260/280 nella lettura spettrofotometric a dell’RNA per stabilirne la qualità.

Verifiche qualitative dell’RNA

…perch è è importante verificare l’RNA …Il successo delle applicazioni successive all’estrazione dell’RNA (RT -PCR, microarrays, etc) dipende da 3 fattori:

INTEGRITA’

PUREZZA

QUANTITA’

QUALITA’

RNases

Verifiche qualitative dell’RNA

…perch è è importante verificare l’RNA …

QUANTITA’

• Lettura Spettrofotometrica

• Lettura Fluorimetrica

Verifiche qualitative dell’RNA

…perch è è importante verificare l’RNA …

QUANTITA’

• Lettura Spettrofotometrica

• Lettura Fluorimetrica

Verifiche qualitative dell’RNA

QUANTITA’

Lettura Spettrofotometrica (tradizionale)• 260 nm DNA, RNA• 280 nm contaminanti proteici

260/280 range 1.8-2.2

• 230 nm altri contaminanti (es. guanidine thiocyanate) 260/230 >1.7

Limitazioni

• Diluizione del campione (la lettura avviene in cuve tte)

Lettura tramite Nanodrop (Thermo Scientific)

• Nessuna diluizione del campione• 0.5-2 ul di campione, range di conc: 2 ng-12 ug

NanoDrop ® spectrophotometer data of RNA with various contaminants.

A. Pure RNA sample.B. RNA sample with 0.01% (v/v)

guanidine thiocyanateC. RNA with 5% ethanol (EtOH)

contaminationD. RNA with 5% isopropanol (IPA)

contamination

Verifiche qualitative dell’RNA

Lettura SpettrofotometricaLimitazioni•Mancanza di specificità nella lettura dell’RNA.

•Non è in grado di stabilire la purezza del campione. Il metodo non è in grado di distinguere la presenza di DNA genomico contaminante.

•La presenza di DNA genomico contaminante contribuis ce alla sovrastima della concentrazione del campione.

•Non è in grado di verificare l’integrità del campione in quanto i singoli nucleotidi sono in grado di contribuire all a lettura a 260 nm.

Verifiche qualitative dell’RNA

…perch è è importante verificare l’RNA …

QUANTITA’

• Lettura Spettrofotometrica

• Lettura Fluorimetrica

Verifiche qualitative dell’RNA

QUANTITA’

Lettura Fluorimetrica•Utilizzo di dye fluorescenti che legano gli ac. nuc leici, il cambiamento dello stato conformazionale conseguente , risulta in un aumento della fluorescenza alla specifica lun ghezza d’onda del fluoroforo.

•L’utilizzo di una curva di calibrazione o di un ref erence a concentrazione nota rende possibile la quantizzazio ne del campione.

• Sensibilità molto elevata (1 pg/ul – 2.5 ng)

Limitazioni• Stesse limitazioni della lettura spettrofotometrica .

QuantiFluor ™ RNA Dye standard curves .

A. high-concentration RNA standard curve using the QuantiFluor™ RNA Dye .

B. low-concentration RNA standard curve using the QuantiFluor™ RNA Dye. Linear range is 0.1–10ng of RNA in a 200µl assay.

Verifiche qualitative dell’RNA

INTEGRITA’PUREZZA

QUALITA’

Metodi

•Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni denaturanti

• 2100 Bioanalyzer (Agilent)

Verifiche qualitative dell’RNA

INTEGRITA’PUREZZA

QUALITA’

Metodi

•Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni denaturanti

• 2100 Bioanalyzer (Agilent)

Verifiche qualitative dell’RNA

Elettroforesi con gel di agarosio

•Metodo economico che permette la verifica dell’inte gritàdell’RNA tramite corsa elettroforetica in condizion i denaturanti (formaldeide / formamide) in presenza d i bromuro di etidio.

•Può essere determinata anche la concentrazione dell ’RNA se si dispone di software di analisi dell’immagine e di uno STD a quantità note (densitometria).

•Nei mammiferi si osservano 2 bande predominanti di rRNA: 28S e 18S. Il rapporto 2:1 è indicatore di buona qua litàdell’RNA.

Intact High Quality RNA Characterized by:

�Two prominent rRNA Bands (28S e 18S)

�Slight smear of various sized mRNA molecules in background

Verifiche qualitative dell’RNA

Verifiche qualitative dell’RNA

Elettroforesi con gel di agarosio

Limitazioni

•L’analisi elettroforetica richiede quantità signific ative di RNA (~ 1 ug).

•Il metodo non permette di determinare se il campion e contiene degli inibitori che potrebbero inficiare l e reazioni successive di reverse transcriptase e PCR.

•Esposizione di agenti tossici da parte dell’operato re nell’allestimento dell’elettroforesi in condizioni denaturanti.

Verifiche qualitative dell’RNA

INTEGRITA’PUREZZA

QUALITA’

Metodi

•Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni denaturanti

• 2100 Bioanalyzer (Agilent)

Verifiche qualitative dell’RNA

2100 AGILENT Bioanalyzer

•Miglior metodo esistente nel mercato, sfrutta il pr incipio dell’elettroforesi capillare permettendo la verific a dell’integritàdell’RNA tramite chips. In pratica il campione comb inato con un fluorescente, viene iniettato nel pozzetto del chip e attraverso una matrice di poliacrilammide presente nei microchannels viene separato elettroforeticamente in base al peso molec olare.

•1 ul di campione di RNA (~ 25 ng; 12 samples / chip ), rilevato tramite fluorescenza

•RNA 6000 Nano kit: 25 a 500 ng/µL di RNA

•RNA 6000 Pico Kit: 50 pg/µL a 5000 pg/µL di RNA

Verifiche qualitative dell’RNA 2100 Bioanalyzer

•L’algoritmo RIN (RNA Integrity number) è un’indice qualitativo dell’RNA che il software di analisi att ribuisce al campione biologico in esame.

•RIN: range 0-10. RIN = 0 RNA completamente

degradato;

RIN = 10 RNA eccellente.

Analisi qualitativa tramite 2100 Bioanalyzer

High integrity RNA

Low integrity RNA

Very low integrity RNA

• Verifica del cDNA tramite PCR competitiva con B2M

Verifica cDNA con B2M

B2M =800 bp

Comp =600 bp

Routine Diagnostica in OECS (CRO)

Verifica qualitativa dell’RNA e cDNA• Estrazione di RNA con TriZol e lettura con Nanodrop

• Verifica dell’integrità dell’RNA tramite 2100 Bioana lyzer

Competitive RT - PCR

Principio

Un competitore interno di dimensione differente rispetto all’amplicone specifico di B2M preparato da un frammento di DNA eterologo e ingegnerizzato in modo da contenere la stessa sequenza dei primers della B2M, viene amplificato in presenza del campione che deve essere quantizzato. Dal momento che è nota la quantità di competitore aggiunto nel mix di reazione, è possibile determinare la quantità in termini di cDNA del campione ignoto.

• Verifica del cDNA tramite PCR competitiva con B2M

• Multiplex PCR con primers di B -actin e primers BCR/ABL

Verifica cDNA con B2M

B2M =800 bp

Comp =600 bp

I°R p210

B-ACT

B3A2

Routine Diagnostica in OECS (CRO)

Verifica qualitativa dell’RNA e cDNA• Estrazione di RNA con TriZol e lettura con Nanodrop

• Verifica dell’integrità dell’RNA tramite 2100 Bioana lyzer

UK NEQASBCR/ABL and AML

Translocation Programme

Foglio di accompagnamento campioni (attuale)

Il campione liofilizzato viene risospeso con 1 ml di H2O RNAse free.

Verifiche qualitativa del cDNA

UK NEQASBCR/ABL and AML Translocation Programme

Campione 122 Analisi Elettroforetica

I°R p210 I°R p190 I°R p230

UK NEQASBCR/ABL and AML Translocation Programme

CONCLUSIONI

• Negli esercizi UK NEQAS che prevedono RNA come materiale di partenza, è preferibile addizionare direttamente TRIzol al campione liofilizzato, al po sto dell’H2O.

• RNA è facilmente degradabile ed è preferibile mantene rlo nelle condizioni di maggior stabilità (TRIzol).

• L’utilizzo di H2O nella risospensione del campione liofilizzato deve essere di assoluta qualità in term ini di RNAse free.