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  • Verhalten von gentechnisch veränderten

    Mikroorganismen in Trink- und Flußwasserbiofilmen

    Frauke Rena Hangen

  • Verhalten von gentechnisch veränderten Mikroorganismen

    in Trink- und Flußwasserbiofilmen

    vorgelegt von

    Diplom-Ingenieurin

    Frauke R. Hangen

    Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften

    der Technischen Universität Berlin

    zur Erlangung des akademischen Grades

    Doktor der Ingenieurwissenschaften

    - Dr. – Ing. -

    genehmigte Dissertation

    Promotionsausschuss:

    Vorsitzender: Prof. Dr. rer. nat. Helmut Görisch

    Berichter: Prof. Dr. rer. nat. Ulrich Szewzyk

    Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. Ulf Stahl

    Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 08. 03. 2001

    Berlin 2001

    D 83

  • Danksagung 1

    Danksagung

    Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von November 1996 bis Herbst 2000 im

    Fachgebiet Ökologie der Mikroorganismen der Technischen Universität Berlin

    durchgeführt. Verschiedene Menschen hatten Anteil an ihrer Entstehung, ihnen

    möchte ich an dieser Stelle danken.

    Mein erster und herzlicher Dank gilt Herrn Prof. Dr. U. Szewzyk für die

    Bereitstellung des Themas und die Arbeitsmöglichkeit in seinem Institut. Sein großes

    Interesse an den aktuellen Ergebnissen und die stete Diskussionsbereitschaft waren

    für die Arbeit sehr förderlich.

    Herr Prof. Dr. U. Stahl, Fachgebiet Mikrobiologie und Genetik der TU Berlin, hat

    sich gerne als Zweitgutachter bereit erklärt und in den gelegentlichen Treffen immer

    Interesse für die Thematik der Arbeit gezeigt. Dafür danke ich ihm sehr.

    Herrn Dr. W. Manz gilt mein Dank für die produktive Betreuung, die konstruktiven

    Diskussionen und die entscheidenden Hinweise zur thematischen Gestaltung der

    Arbeit. Vielen Dank auch für die Korrektur dieser Arbeit.

    Frau Dr. E. Grohmann hat mir mit engagierter Betreuung bei den Experimenten im

    genetischen Teil der Arbeit sehr geholfen und mich bei der Arbeit im Labor

    enthusiastisch unterstützt. Ganz herzlichen Dank auch für die Korrektur dieser Arbeit.

    Ein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Søren Molin und seinen Mitarbeitern für

    die freundliche Aufnahme in Kopenhagen, die Möglichkeit im Department of

    microbiology, Technical University of Denmark, Lyngby zu arbeiten, die Betreuung

    und stete Diskussionsbereitschaft, die Bereitstellung von Material und Stämmen und

    nicht zuletzt die Finanzierung des Aufenthaltes in Kopenhagen.

    Herr Dr. M. Strätz, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Braunschweig,

    ermöglichte durch die Bereitstellung des als Wildtyp verwendeten P. putida KT2442

    die Parallelexperimente in der vorliegenden Arbeit.

    Vielen Dank auch an Hans von Döhren für die Möglichkeit, das S1-Labor des

    Fachgebietes Biochemie der TU Berlin für einen Teil der Experimente zu nutzen.

    Robert Witzig und Joanna Olszewska unterstützten dieses Projekt als studentische

    Hilfskräfte, Robert hatte entscheidenden Anteil an den Kreuzungsexperimente,

    Joanna an der Durchführung und Auswertung der Biofilmexperimente in

    Landwehrkanal-Wasser. Meine Kolleginnen und Büronachbarn Dr.-Ing. Karen Bade

    und Dipl.-Biol. Uta Böckelmann haben durch ihre Diskussionsbereitschaft diese

    Arbeit vorwärtsgebracht. Allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe danke ich sehr für die

    freundliche Atmosphäre und Unterstützung.

  • 2

    Mein herzlicher Dank gilt schließlich auch meinen Eltern Christine und Prof.

    Ludwig Hangen für das stete Interesse an meinem Werdegang und an dieser

    Arbeit. Mein Vater hat leider ihre Fertigstellung nicht mehr miterleben können. Herrn

    Prof. Dr. Volkert Hansen, Universität Wuppertal, und Jürgen Ortlam danke ich sehr

    für die energische Unterstützung in der Zeit der Fertigstellung der Promotion.

    Die Arbeit entstand im Rahmen des Projektes „Biofilme als Modellsysteme für das

    Verhalten von in der Gentechnologie relevanten Organismen in komplexen

    Biozönosen“. Ich danke dem BMBF für die finanzielle Förderung (Förderkennzeichen

    des BMBF: 0311228).

    Essen, im Juli 2001.

  • Inhalt 3

    Inhalt

    Danksagung........................................................................................................ 1

    Inhalt................................................................................................................... 3

    Abkürzungsverzeichnis......................................................................................... 6

    1 Einleitung...................................................................................................... 9

    Zielsetzung dieser Arbeit..................................................................................12

    2 Material und Methoden .................................................................................13

    2.1 Chemikalien..............................................................................................13

    2.1.1 Puffer und Lösungen ..........................................................................13

    2.2 Organismen..............................................................................................13

    2.2.1 P. putida FH1.....................................................................................14

    2.2.2 P. putida KT2442................................................................................14

    2.2.3 Helfer und Donorstämme in der Triparentalen Kreuzung .......................14

    2.2.4 Rifampicin-resistente Trinkwasserisolate..............................................15

    2.2.5 GFP-markierte Trinkwasserisolate.......................................................15

    2.2.6 Transkonjuganten...............................................................................15

    2.3 Stammhaltung und Kultivierung..................................................................16

    2.3.1 Kulturmedien......................................................................................16

    2.3.2 Stammhaltung und Herstellen des Inokulums.......................................18

    2.3.3 Selektive Kultivierung und Kultivierung.................................................19

    2.4 Bestimmung der Gesamtzellzahl................................................................20

    2.5 In Situ Hybridisierung................................................................................21

    2.5.1 Fixieren der Zellen..............................................................................21

    2.5.2 In situ Hybridisierung..........................................................................21

    2.5.3 Sonden..............................................................................................22

    2.6 Biofilmreaktoren und Versuchsdurchführung...............................................24

    2.6.1 Biofilmreaktoren .................................................................................24

    2.6.2 Trägermaterial....................................................................................27

    2.6.3 Zugabe des Inokulums........................................................................27

    2.6.4 Probenahme und Auswertung .............................................................27

    2.7 Flüssigkulturen..........................................................................................29

  • 4

    2.7.1 Probenahme und Auswertung .............................................................29

    2.8 Substratverwertung ...................................................................................29

    2.9 Trinkwasser als Substrat und Inokulum.......................................................30

    2.9.1 Das Berliner Trinkwasser: physikalisch, chemisch, mikrobiologisch........30

    2.9.2 Flüssigkulturen in Trinkwasser ............................................................30

    2.9.3 Trinkwasserbiofilme ............................................................................30

    2.10 LW-Wasser als Substrat und Inokulum....................................................31

    2.10.1 Flüssigkulturen in LW-Wasser.............................................................32

    2.10.2 Adhäsion von P. putida FH1 an Flocken...............................................33

    2.10.3 Landwehrkanal-Biofilme......................................................................33

    2.11 Transfer des Plasmids pJB20 in Trinkwasserisolate.................................34

    2.11.1 Selektion Rifampicin-resistenter Mutanten: ...........................................34

    2.11.2 Triparentale Kreuzung, Konjugation und Filter-Kreuzung: ......................34

    2.12 Detektion authochthoner Rezipienten......................................................35

    2.13 Nachweis des Gentransfers....................................................................36

    2.13.1 Überprüfung der Antibiotikaresistenzen................................................36

    2.13.2 Immunologischer Nachweis des GFP...................................................36

    2.13.3 Spezifische Amplifikation pJB20-Plasmid kodierter Gene ......................38

    2.13.4 Sequenzieren der 16 S rDNS ..............................................................39

    2.13.5 Einordnen d