Vanessa Regina Maciel Uzan A EXPRESSÃO GÊNICA DOS … · A Deus, pelo dom da vida, de amar e me...

Vanessa Regina Maciel Uzan

A EXPRESSÃO GÊNICA DOS RNAs NÃO CODIFICADORES HOTAIR, MALAT1, HULC E BCYRN1

EM OSTEOSSARCOMA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós Graduação da Fundação PIO XII –

Hospital de Câncer de Barretos para

obtenção do Título de Mestre em Ciências

da Saúde.

Área de concentração: Oncologia

Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando Lopes

Co-orientador: Dr. Daniel Onofre Vidal

Barretos, SP

2015

FICHA CATALOGRÁFICA Preparada por Rafael de Paula Araújo CRB 8/9130

Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos

U99e Uzan, Vanessa Regina Maciel A expressão gênica dos RNAs não codificadores HOTAIR, MALAT1, HULC e

BCYRN1 em osteossarcoma / Vanessa Regina Maciel Uzan. - Barretos, SP 2015. 84 f. : il. Orientador: Luiz Fernando Lopes. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII – Hospital

de Câncer de Barretos, 2015. 1. Osteossarcoma. 2. RNAs não codificadores longos. 3. Metástase.

4. Expressão Gênica. 5. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo

Real. 6. Biomarcadores. I. Autor. II. Lopes, Luiz Fernando CDD 572.86

FOLHA DE APROVAÇÃO

Vanessa Regina Maciel Uzan

A expressão gênica dos RNAs não codificadores HOTAIR, MALAT1, HULC E BCYRN1 em

osteossarcoma

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Fundação Pio XII – Hospital de

Câncer de Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde - Área de

Concentração: Oncologia

Data da aprovação: 26/02/2015

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Antônio Sergio Petrilli

Instituição: Instituto de Oncologia Pediátrica - Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP

Prof. Dr. Rui Manuel Vieira Reis

Instituição: Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos

Prof. Dr. Luiz Fernando Lopes

Orientador – Presidente da Banca

“Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da Pós-

Graduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento

do Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de Apresentação de Dissertações

e Teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este

trabalho foi realizado em concordância com o Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP),

não havendo nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou

falsificação de dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas

neste material são de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão

da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos.”

“Embora o Núcleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Câncer de Barretos tenha

realizado as análises estatísticas e orientado sua interpretação, a descrição da metodologia

estatística, a apresentação dos resultados e suas conclusões são de inteira responsabilidade

dos pesquisadores envolvidos. Os pesquisadores declaram não ter qualquer conflito de

interesse relacionado a este estudo.

DEDICATÓRIA

A Deus, pelo dom da vida, de amar e me fortalecer a cada dia.

Aos meus pais, Sandra M. Maciel Uzan e José Roberto Uzan por serem a minha referência

como ser humano e como profissional e pelo incentivo insaciável para a minha formação.

Aos meus irmãos Valéria e Márcio e aos meus sobrinhos Giovanna e Arthur pelo amor e

apoio na realização dos meus sonhos.

Ao meu namorado Alberto, pela força nas horas mais difíceis, pelo amor sincero,

companheirismo e por participar ativamente da concretização deste trabalho com seu

conhecimento e acreditando em mim.

Dedico à vocês este trabalho.

AGRADECIMENTOS

Agradeço em primeiro lugar a Deus, pela saúde, força, e por estar comigo todos os

dias, em todos os momentos incondicionalmente.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Luiz Fernando Lopes, por acreditar em mim como pessoa

e como profissional, pelas palavras de incentivo durante as “tempestades” que encontramos

neste caminho chamado mestrado e por contribuir para o meu crescimento profissional e

intelectual.

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Daniel Onofre Vidal, por acrescentar palavras de

sabedoria nas linhas deste trabalho, pela exigência no meu aprendizado e na qualidade

deste trabalho.

Aos assessores das Bancas de Acompanhamento, Dr. Rui Reis e Dra. Ana Lucia

Ambujamra que a cada encontro acrescentavam seus conhecimentos e sugestões para o

aprimoramento deste trabalho.

Ao Dr. Carlos Alberto Scrideli, pela pronta colaboração com este projeto.

A Dra. Érica Boldrini, por me acompanhar na revisão dos prontuários e dividir seus

conhecimentos comigo.

A toda equipe do Núcleo de Apoio ao Pesquisador pelo suporte prestado,

especialmente aos estatísticos Cleyton, Marco e Anderson por todo o aprendizado, e pela

realização das análises metodológicas e estatísticas.

Aos professores, colegas e equipe de suporte da Pós Graduação do Hospital de Câncer

de Barretos que contribuíram para o meu aprendizado.

Ao Dr. Valter Penna, pela coleta de todas as amostras de osteossarcoma que

utilizamos neste projeto.

Aos funcionários do Biobanco, em especial ao Dr. Cristovam Scapulatempo por revisar

criteriosamente e pacientemente todas as lâminas do nosso estudo, e à minha amiga e

excelente profissional Jacqueline, por me auxiliar em todas as etapas no laboratório.

Ao Dr. Carlos Eduardo Bezerra, por avaliar os exames de imagem e redimensionar

pacientemente os tumores avaliados.

Ao André Van Helvoort Lengert, além do profissionalismo, agradeço imensamente

pela amizade, pelas palavras de força e por contribuir ativamente da conclusão deste

trabalho. Exemplo de humildade, simplicidade e inteligência.

A Direção da Fundação Pio XII, em especial ao Sr. Henrique Duarte Prata, pelo

incentivo aos estudos e permitindo que possamos nos ausentar em alguns (ou vários)

momentos para a realização desse sonho.

A minha Equipe de Farmacêuticos (34) e Auxiliares (63) da Farmácia da Fundação Pio

XII – Hospital de Câncer de Barretos, pela compreensão nos momentos em que precisei me

ausentar e pelas palavras de força nos momentos em que tudo parecia difícil.

A minha família por ter lutado e muitas vezes se sacrificado para me dar esse privilégio

de poder estar formada e realizar o sonho da Pós Graduação. Em especial, agradeço aos

meus pais José Roberto Uzan e Sandra M. Maciel Uzan, por me ensinarem o amor ao

próximo, a buscar os sonhos, a não desistir diante das dificuldades e pelo amor

incondicional. Com muito amor e gratidão dedico esse trabalho a vocês.

Ao meu médico particular, noivo e eterno namorado, Alberto Paiva de Moraes Filho,

que durante esse período tornou-se mestre no assunto junto comigo e por acrescentar seus

conhecimentos técnicos e científicos nesse trabalho. Meu companheiro de leituras de

prontuários, interpretação de laudos de tomografias, raio-x e ressonâncias. Agradeço

também por ser tão compreensivo, paciente, presente e incentivador. Obrigada pelas

palavras de força e de ânimo nas horas certas!

E por fim, aos pacientes, por nos conceder o uso de suas amostras para a realização

deste trabalho. O sorriso que vemos no rosto de vocês diariamente, apesar das lutas que

vocês enfrentam, é o que nos dá forças para continuar e não desistir.

“ Seja lá o que for que você faça, empregue toda tua energia e todo teu espírito nesta tarefa.

Ninguém conquista um sonho sem persegui-lo, ninguém anda uma milha sem dar o primeiro

passo. Se ao fim da estrada alguma sombra de arrependimento te atacar, ainda assim,

levante a cabeça, orgulhe-se por ter tentado, por ter buscado, por ter empregado todas as

tuas forças até o último instante. Tanto pior e sempre pior é arrepender-se daquilo que você

não fez” (Augusto Branco)

“Eu tudo posso, naquele que me fortalece”

Filipenses 4:13

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO

1.1 Osteossarcoma 1

1.2 Alterações genéticas associadas ao osteossarcoma 3

1.3 Os RNAs não codificadores longos (lncRNAs) 5

1.4 Os lncRNAs associados aos processos de invasão e metástase em

tumores humanos 8

1.4.1 MALAT1 (Metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1) 8

1.4.2 HOTAIR (HOX transcript antisense RNA) 9

1.4.3 HULC (Hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA) 10

1.4.4 BCYRN1 (Brain cytoplasmic RNA1) 11

2 JUSTIFICATIVA 13

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral 14

3.2 Objetivos Específicos 14

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Amostras e seleção dos pacientes 15

4.2 Critérios de inclusão 15

4.3 Critérios de exclusão 15

4.4 Aspectos éticos 16

4.5 Coleta de dados 16

4.6 Avaliação da representatividade tumoral 16

4.7 Extração de RNA 17

4.8 Avaliação da quantidade e da qualidade do RNA total 18

4.9 Análise de contaminação do RNA com DNA genômico 19

4.10 Tratamento com DNase 19

4.11 Síntese de cDNA 20

4.12 Análise de expressão dos RNAs não codificadores longos por

RT-qPCR

20

4.13 Análise estatística 21

5 RESULTADOS

5.1 Tamanho da amostra 23

5.2 Avaliação da representatividade tumoral 25

5.3 Extração, quantificação e avaliação da qualidade do RNA total 25

5.4 Avaliação de contaminação com DNA genômico e tratamento das

amostras de RNA com DNAse

27

5.5 Análise da expressão dos normalizadores e requantificação das

amostras utilizando o Qubit 28

5.6 Características clínicas, patológicas e demográficas dos pacientes

com osteossarcoma

30

5.7 Análise da expressão dos lncRNAs 31

5.8 Associação da expressão dos lncRNAs com os fatores clínico-

patológicos dos pacientes

33

5.9 Associação do perfil de expressão dos lncRNAs com as

características clínico-patológicas dos pacientes

40

5.10 Análise de sobrevida global e sobrevida livre de eventos 47

6 DISCUSSÃO 53

6.1 Otimização do protocolo de extração e análise da qualidade do RNA 53

6.2 Caracterização das amostras 55

6.3 Expressão dos lncRNAs em osteossarcoma 58

6.3.1 Correlação da expressão do BCYRN1 com as características clínico-

patológicas e sobrevida

59

6.3.2 Correlação da expressão do HOTAIR com as características clínico-

patológicas e sobrevida

60

6.3.3 Correlação da expressão do HULC com as características clínico-

patológicas e sobrevida 62

6.3.4 Correlação da expressão do MALAT1 com as características clínico-

patológicas e sobrevida 63

6.4 Limitações do estudo 65

7 CONCLUSÕES 66

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 66

ANEXOS

Anexo A – Ficha de coleta de dados 78

Anexo B – Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de

Câncer de Barretos e do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto/Universidade de São Paulo

81

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Funções celulares atribuídas aos diversos lncRNAs conhecidos 6

Figura 2 - Organização genômica dos lncRNAs 7

Figura 3 - Representação esquemática da estratégia desenvolvida neste

trabalho para a avaliação da expressão de lncRNAs em osteossarcoma 24

Figura 4 - Representatividade tumoral nas amostras selecionadas para a

avaliação da expressão dos lncRNAs 25

Figura 5 - Comparação da integridade do RNA de amostras de osteossarcoma

após extração com dois protocolos diferentes 26

Figura 6 - Gel de agarose para a avaliação da amplificação do gene KRAS nas

amostras de RNA 27

Figura 7 - Gel de agarose para a avaliação da amplificação do gene KRAS nas

amostras de RNA após tratamento com DNase 27

Figura 8 - Expressão normalizada dos lncRNAs em osteossarcoma avaliada por

RT-qPCR 32

Figura 9 - Análise de sobrevida global e sobrevida livre de eventos para os

pacientes metastáticos e não metastáticos ao diagnóstico tratados

pelo protocolo GLATO 2006 no Departamento de Pediatria do

Hospital de Câncer de Barretos no período de 2006 a 2013. 47

Figura 10 - Análise de sobrevida global de acordo com o perfil de expressão dos

lncRNAs 51

Figura 11 - Análise de sobrevida livre de eventos de acordo com o perfil de

expressão dos lncRNAs

52

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Condições de ciclagem para a PCR do gene KRAS 19

Tabela 2 - Média e desvio-padrão dos Cts dos normalizadores ACTB e GAPDH,

obtidos após análise de expressão gênica a partir de RNA

quantificado por meio do Nanovue 28

Tabela 3 - Comparação da quantificação de RNA realizado pelos dois métodos

utilizados neste trabalho 29

Tabela 4 - Média e desvio padrão dos Cts dos normalizadores ACTB e GAPDH,

obtidos após análise de expressão gênica a partir de RNA

quantificado por meio do Qubit 29

Tabela 5 - Características clínicas, patológicas e demográficas dos pacientes

com ostessarcoma para a análise de expressão dos lncRNAs 31

Tabela 6 - Comparação da média de expressão do BCYRN1 com as

características clínico-patológicas dos pacientes avaliados 36

Tabela 7 - Comparação da média de expressão do HOTAIR com as


Tabela 8 - Comparação da média de expressão do HULC com as características

clínico-patológicas dos pacientes avaliados 38

Tabela 9 - Comparação da média de expressão do MALAT1 com as


Tabela 10 - Área sob a curva, desvio padrão, p-valor e intervalo de confiança

determinados pela curva ROC. 40

Tabela 11 - Ponto de corte, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo

(VPP), valor preditivo negativo (VPN) e acurácia, de acordo com a

curva ROC. 41

Tabela 12 - Associação do perfil de expressão do BCYRN1 com as caracterísiticas

epidemiológicas e clínico-patológicas 43

Tabela 13 - Associação do perfil de expressão do HOTAIR com as caracterísiticas


Tabela 14 - Associação do perfil de expressão do HULC com as caracterísiticas


Tabela 15 - Associação do perfil de expressão do MALAT1 com as caracterísiticas


Tabela 16 - Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação às

características epidemiológicas 47

Tabela 17 - Sobrevida livre de eventos (SLE) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em

relação às características epidemiológicas 48

Tabela 18 - Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação às

características clínico-patológicas 48

Tabela 19 - Sobrevida livre de eventos (SLE) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em

relação às características clínico-patológicas 49

Tabela 20 Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação à

expressão dos lncRNAs 49

Tabela 21 Sobrevida livre de eventos (SLE) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em

relação à expressão dos lncRNAs 50

LISTA DE ABREVIATURAS

ACTB Actin beta

ARF ADP-ribosylation factor

ASXL1 Additional sex combs like 1

ASXL2 Additional sex combs like 2

ATRX Alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked

AUC Área sob a curva

BAX BCL2-associated X protein

BCYRN1 Brain cytoplasmic RNA 1

CASKI Linhagem celular de carcinoma epidermóide de cervix, HPV 16

CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

CDKN2B Cyclin-dependent kinase inhibitor 2B

cDNA DNA complementar

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

CREB cAMP-response element-binding protein

CREBBP cAMP responsive element binding protein

Ct Cycle threshold

CXCR4 C-X-C chemokine receptor type 4

DNA Ácido desoxiribonucléico

DNase Desoxirribonuclease

dNTP Desoxirribonucleotídeos fosfatados

EUA Estados Unidos da América

EZH2 Enhancer of zeste homolog 2

FGFR2 Fibroblast growth factor receptor 2

FMRP/USP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Universidade de São

Paulo

GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

GBTO Grupo Brasileiro de Osteossarcoma

H3F3A H3 histone, family 3ª

HCB Hospital de Câncer Infantojuvenil de Barretos

HIC1 Hypermethylated in cancer 1

http://en.wikipedia.org/wiki/Glyceraldehyde_3-phosphate_dehydrogenase

HOTAIR HOX transcript antisense RNA

HOXD Homeobox D

HULC Hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA

IC Intervalo de confiança

Kb Quilo bases

KDM6A Lysine (K)-specific demethylase 6A

KRAS Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog

lncRNAs RNAs não codificadores longos

MALAT1 Metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1

MAP2K4 Mitogen-activated protein kinase 4

MAPK7 Mitogen-activated protein kinase 7

MDM2 MDM2 proto-oncogene, E3 ubiquitin protein ligase

MgCl2 Cloreto de magnésio

miRNA Micro ácido ribonucleico

MLL2 Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 2

MMP9 Matrix metallopeptidase 9

mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

MYC Myelocytomatosis oncogene

ncRNAs RNAs não codificadores

NSD2 Nuclear SET domain-containing protein 2

OMS Organização Mundial de Saúde

OS Osteossarcoma

OSX Osterix

PB Pares de bases

PHF6 PHD finger protein 6

PI3K/AKT/MTOR

Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase/thymoma viral

proto-oncogene/mechanism target of rapamycin

(serine/threonine kinase)

PRC2 Complexo repressivo polycomb 2

PRKACB cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit beta

RANKL Receptor activator of NF-kappa-B ligand

RB1 Retinoblastoma

RIN RNA Integrity number

RNA Ácido ribonucléico

RNA POL II RNA polimerase II

RNase Ribonuclease

ROC Receiver Operating Characteristics

RT-qPCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa

SAME Serviço de Arquivo Médico Especializado

SAOS2 Linhagem celular de osteossarcoma

SETD2 SET domain containing 2

SG Sobrevida Global

SisOnco Sistema Hospitalar Interno do Hospital de Câncer de Barretos

SLE Sobrevida Livre de Eventos

SMARCA4 SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator

of chromatin, subfamily a, member 4

SMC1A Structural maintenance of chromosomes 1A

SPSS 21 Statistical Package for Social Science

TC Tomografia computadorizada

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TP53 Tumor protein p53

TWIST Twist transcriptor factor

USP7 Ubiquitin specific peptidase 7

ZMYM3 zinc finger, myocyte maintenance-type 3

LISTA DE SÍMBOLOS

% Porcentagem

~ Aproximadamente

< Menor ou igual a

> Maior que

< Menor que

µm Micrômetro

mg Miligrama

mL Mililitro

rpm Rotações por minuto

µL Microlitro

G Gravidade (unidade de rotação em centrífuga)

°C Graus Celsius

nm Nanômetro

ng Nanograma

mM Milimolar

µM Micromolar

U Unidades

µg Micrograma

cm Centímetros

> Maior ou igual a

P Valor de p

vs versus

RESUMO

Uzan VRM. A Expressão gênica dos RNAs não codificadores HOTAIR, MALAT1, HULC E

BCYRN1 em osteossarcoma. Dissertação (Mestrado). Barretos: Hospital de Câncer de

Barretos; 2015.

JUSTIFICATIVA: Os tumores ósseos primários representam 5-6% de todos os tumores da

infância e adolescência (0-19 anos), sendo o osteossarcoma o câncer ósseo primário mais

comum nesta faixa etária. Cerca de 20% dos pacientes apresentam metástases ao

diagnóstico e, em torno de 40% evoluirão com metástase, resultando em uma baixa taxa de

sobrevida de 20% em cinco anos. Geneticamente, o osteossarcoma é um tumor

extremamente complexo e por isso, torna-se necessária a busca de marcadores moleculares

que possam indicar o prognóstico, ou mesmo a presença de metástases ao diagnóstico

visando o auxílio do tratamento desses pacientes. OBJETIVO: Os objetivos deste estudo

foram otimizar um protocolo de extração e avaliação da qualidade do RNA em

osteossarcoma, avaliar a expressão gênica de quatro RNAs não codificadores longos

(HOTAIR, MALAT1, HULC E BCYRN1) em amostras de osteossarcoma primário e avaliar o

potencial dessas moléculas como marcadores de prognóstico de pacientes com

osteossarcoma. MATERIAIS E MÉTODOS: Inicialmente, 175 pacientes portadores de

osteossarcoma foram identificados no banco de dados da nossa instituição. Após rigorosos

critérios de inclusão e exclusão, 36 amostras pré-quimioterapia, provenientes de pacientes

diagnosticados entre 2006 e 2013, foram incluídas no nosso estudo. Todas as amostras de

osteossarcoma foram revisadas por um patologista e àquelas que apresentaram pelo menos

50% de tecido tumoral foram submetidas a extração do RNA. Após a extração, as amostras

foram analisadas quanto a integridade do RNA, quantificadas e a expressão dos genes foi

avaliada por meio da RT-PCR em tempo real. RESULTADOS: No nosso trabalho a média de

idade dos pacientes foi de 15 anos, sendo a maioria (55,6%) do sexo feminino. A localização

mais frequente do tumor foi o fêmur (44,4%) e o subtipo histológico osteoblástico foi

predominante (77,8%). A maioria dos pacientes no estudo apresentou resposta parcial à

quimioterapia (72,2%) e 44,9% dos pacientes apresentaram metástases ao diagnóstico ou

durante o tratamento. Em relação a expressão dos lncRNAs, nossos resultados mostraram

que existe uma ampla variação na expressão dos quatro genes propostos entre as amostras

e que a média de expressão maior dos genes BCYRN1 e MALAT1 foi associada

significativamente a idade superior a 10 anos. Após categorização da expressão, observamos

que a maioria dos pacientes que apresentaram baixa expressão do gene BCYRN1 pertenciam

ao grupo do tipo histológico osteoblástico. Para o gene HOTAIR, a alta expressão foi

associada à pacientes com tumor menor que 12 cm ao diagnóstico, e para o MALAT1, a alta

expressão foi observada em pacientes com idade ao diagnóstico igual ou superior a 10 anos.

CONCLUSÕES: Nossos achados demostraram que a maior expressão de BCYRN1 e MALAT1

foi associada significativamente a pacientes com idade acima de 10 anos. Não encontramos

associação significativa entre a expressão dos genes e a sobrevida dos pacientes. Nossos

dados em conjunto sugerem que a expressão de BCYRN1 e HOTAIR merecem uma

investigação mais abrangente em OS.

PALAVRAS-CHAVE: Osteossarcoma; RNAs não codificadores longos; Metástase; Expressão

Gênica; PCR em Tempo Real; Biomarcadores.

ABSTRACT

Uzan VRM. The gene expression of non-coding RNAs HOTAIR, MALAT1, HULC and BCYRN1 in

osteosarcoma. Dissertation (Master’s degree). Barretos: Barretos Cancer Hospital, 2015.

BACKGROUND: The primary bone tumors represent 5-6% of all tumors of childhood and

adolescence (0-19 years), and osteosarcoma is the most common primary bone cancer in

this age group. About 20% of patients present metastases at diagnosis, and approximately

40% will develop metastatic disease, resulting in low survival rate of 20% in five years.

Genetically, the osteosarcoma is an extremely complex tumor, therefore it becomes

necessary to identify new molecular markers that may predict the prognosis or the presence

of metastasis at diagnosis in osteosarcoma patients. OBJECTIVES: Standardize a protocol for

RNA extraction and quality assessment, evaluate the expression of non-coding RNAs

(MALAT1, HOTAIR, HULC and BCYRNA1) in primary osteosarcoma samples and also to

evaluate the potential role of these molecules as prognostic markers in osteosarcoma.

MATERIAL AND METHODS: Initially, 175 patients with osteosarcoma were identified in the

database of our institution. After stringent criteria for inclusion and exclusion, 36 pre-

chemotherapy samples, from patients diagnosed between 2006 and 2013 were included in

our study. The RNA extraction was performed using the TRIZOL method and, in some specific

cases, using commercial kit. After extraction, the samples were analyzed for their integrity,

quantified, and the gene expression was assessed by real time RT-PCR. RESULTS: The

average age of the patients was 15 years, being the majority (55,6%) female. The most

frequent tumor site was femur (44,4%) and the osteoblastic histologic subtype was

predominant (77,8%). The majority of the patients presented partial response to treatment

(72,2%) and almost half (44.9%) presented metastasis at diagnosis or during treatment.

Regarding the expression of lncRNAs, our results showed that there is a wide variation in the

expression of the proposed four genes between samples and the average higher expression

of BCYRN1 and MALAT1 genes was significantly associated with the age of 10 years. After

categorization of expression in high and low, we observed that most patients with low

expression of the gene BCYRN1 belonged to the osteoblastic histological type group. For

HOTAIR gene overexpression has been associated with patients with lower than 12 cm

tumor diagnosis, and for MALAT1, high expression was observed in patients with age at

diagnosis less than 10 years.

CONCLUSIONS: Our findings showed that the highest expression of BCYRN1 and MALAT1

was significantly associated with patients over the age of 10 years. We found no significant

association between gene expression and patient survival. Our data together suggested that

the expression of BCYRN1 and HOTAIR deserves a comprehensive analysis in OS.

KEYWORDS: Osteosarcoma; long non-coding RNAs; Metastasis; Gene Expression; Real-Time

Polymerase Chain Reaction; Biomarker.

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 Osteossarcoma

Os tumores ósseos primários representam 5-6% de todos os tumores da infância e

adolescência (0-19 anos), sendo o osteossarcoma (OS) o câncer ósseo primário mais comum

nesta faixa etária. O OS apresenta uma distribuição bimodal de idade, sendo o primeiro pico

observado na segunda década de vida (14-19 anos) e o segundo pico a partir da sexta

década de vida (60 anos)1.

Em geral, a incidência na população é de 2-4 casos/milhão ao ano, entretanto na

adolescência (15-19 anos) a incidência pode chegar a 8-10 casos/milhão ao ano. O OS

representa de 10 a 15% dos tumores sólidos extracraniais nesta faixa etária1, 2. Nos Estados

Unidos (EUA) são esperados aproximadamente 400 novos casos de OS por ano, em

indivíduos até 20 anos3. No Brasil, a maior incidência deste tipo de tumor está registrada no

estado de São Paulo4, no qual são descritos 648 casos (~ 54 casos/ano) de OS entre 2000 e

junho de 2012, em pacientes de 0 a 18 anos5. No Hospital de Câncer Infantojuvenil de

Barretos (HCB) há registro de 225 casos de OS entre os anos 2000 e 2013.

O OS é um tumor maligno definido pela presença de células mesenquimais alteradas

que produzem osteóide e/ou tecido ósseo imaturo6. Se origina mais frequentemente na

região metafisária dos ossos longos, no interior da cavidade medular e penetra no córtex

ósseo, envolvendo e invadindo os tecidos moles adjacentes7. Na classificação atual da

Organização Mundial de Saúde (OMS), o OS pode ser dividido em: convencional,

telangectásico, de pequenas células, central de baixo grau, secundário, parosteal, periosteal

e, por último, de superfície de alto grau. O diagnóstico histológico do tipo convencional

compreende a grande maioria deste tipo de tumor e é dividido em três subtipos:

osteoblástico, condroblástico e fibroblástico, dependendo do tipo predominante de matriz

presente no tumor6. O subtipo histológico não tem impacto sobre a resposta à

quimioterapia e os pacientes recebem o mesmo tratamento, independentemente do

subtipo histológico, sugerindo que estes vários padrões de diferenciação são reflexo de uma

única entidade clínica8.

Historicamente, o prognóstico de pacientes com OS tratados apenas com cirurgia e/ou

radioterapia era ruim, com sobrevida em torno de 20% em dois anos9. A maioria desses

pacientes iria ao óbito devido à evolução da doença e estabelecimento de metástases

2

pulmonares6. A introdução da quimioterapia sistêmica no tratamento do OS resultou em

uma melhora significativa no prognóstico dos pacientes, elevando a sobrevida livre de

eventos a 60 – 70%, em três anos, nos casos de OS localizados de extremidades10-12.

Aproximadamente, 15-20% dos pacientes com OS apresentam metástases ao

diagnóstico, detectadas por exames radiológicos, como a tomografia computadorizada (TC)

e, adicionalmente em torno de 40% evoluirão com metástase em fases posteriores durante

o tratamento12, 13. As metástases são muito frequentes nos pulmões (~80%), mas também

podem ocorrer em outros sítios ósseos, medula óssea e, raramente, em linfonodos. Os sítios

metastáticos da doença comumente apresentam resistência ao tratamento, resultando em

uma baixa taxa de sobrevida do paciente, em torno de 20% em cinco anos12, 14, 15.

O tratamento para o osteossarcoma preconiza a utilização combinada de

quimioterapia em altas doses, ressecção da lesão primária e de todos os sítios metastáticos

da doença, geralmente por toracotomia exploratória com apalpação de todo pulmão16. Na

busca de novas alternativas para o sucesso no tratamento do osteossarcoma, o Grupo

Brasileiro para Tratamento de Osteossarcoma (GBTO)17, posteriormente Grupo Latino

americano de Oncologia Pediátrica (GALOP), vem publicando estudos propondo

modificações nos esquemas de tratamento quimioterápico a fim de melhorar a sobrevida

desses pacientes. Entretanto, os resultados encontrados mostraram que mesmo

intensificando o tratamento não houve melhora no grau de necrose ou na taxa de

sobrevivência17. Aproximadamente, 30% de todos os pacientes com metástase pulmonar ao

diagnóstico e, mais do que 40% daqueles que alcançarem uma remissão cirúrgica completa

podem apresentar bom prognóstico a longo prazo15. O tratamento para recidiva local ou nos

pulmões é inicialmente cirúrgico. A recorrência de metástase pulmonar é frequente e,

embora o prognóstico destes pacientes seja ruim, com uma sobrevida pós-recaída de 20%

em cinco anos, a retirada da lesão deve ser realizada quando viável18. Em contraste, quando

isso é possível em torno de 33% dos pacientes com múltiplas recorrências ressecáveis

sobrevivem cincos anos ou mais19.

Assim, a detecção da metástase ao diagnóstico ou mesmo o acompanhamento da

lesão metastática é essencial no tratamento do OS. Atualmente, a técnica padrão utilizada

na detecção e seguimento da metástase pulmonar é TC de tórax. Entretanto, tal técnica

tende a subestimar o número de metástases pulmonares e também pode falhar na

3

identificação de metástases ao diagnóstico, o que pode levar a um tratamento inadequado

destes pacientes19.

1.2 Alterações genéticas associadas ao osteossarcoma

Geneticamente, o OS é um tumor extremamente complexo, não havendo uma

alteração específica identificada neste tipo de sarcoma. Apesar dessa complexidade genética,

existem numerosos achados quanto às alterações genéticas que podem estar associadas à

patogênese do OS20. A descoberta de tais alterações foi originada de estudos que avaliaram

modelos animais (rato) de OS, síndromes de predisposição genética, fatores etiológico-

ambientais e a abordagem direta destes tipos de tumores21.

Diversos modelos animais que apresentam diferentes alterações genéticas

desenvolvem OS. Como exemplo, podemos citar os animais com alterações em Tp53, dos

quais cerca de 40-50% desenvolvem OS22, 23; em Bax e Arf, dos quais 44%24; em Hic1, dos

quais 40%25; entre outros. Entre as síndromes familiais que predispõe os indivíduos ao

desenvolvimento de OS pode-se destacar a síndrome de Li-Fraumeni e do Retinoblastoma,

apresentando alterações nos genes Tp53 e Rb1, respectivamente26, 27. Em relação aos

fatores ambientais, agentes físicos, químicos e biológicos têm sido sugeridos como

carcinógenos para o OS. Entre eles, a ação da radiação ionizante já tem sido associada ao

maior risco de desenvolvimento de OS28. Uma variedade de genes também é descrita com

alterações nos OS que ocorrem de forma esporádica. Entre eles podemos citar: TWIST, MYC,

CDKN2A, CDKN2B, FGFR2, MDM2, MAPK7, MAP2K4, MMP9, entre muitos outros29. Tesser-

Gamba et al.30 estudaram a expressão de 10 genes localizados em regiões de rearranjo

cromossômico em OS. Dentre eles, encontravam-se os genes MAPK7 e MAP2K4 que

estavam altamente expressos na maioria das amostras analisadas e a expressão desses

genes foi significativamente associada com a presença de metástase ao diagnóstico, baixa

resposta à quimioterapia e pior sobrevida global.

Com o intuito de encontrar alvos moleculares para as terapias existentes ou em

desenvolvimento, um estudo realizado com pacientes após recaída de OS avançado,

encontrou comumente alterações na via PI3K/Akt/mTOR e sugeriu que existe uma elevada

diversidade molecular nesta doença e a necessidade de mais estudos para definir subgrupos

distintos de alterações genéticas31.

4

Um estudo que avaliou alterações em 633 genes reguladores epigenéticos em

amostras de 1000 tumores pediátricos diversos revelou que 72 genes estavam

recorrentemente mutados em todo o grupo de pacientes estudados. Os pacientes

portadores de OS apresentaram altas taxas de mutação nos genes reguladores epigenéticos,

tais como, H3F3A, PHF6, ATRX, KDM6A, SMARCA4, ASXL2, CREBBP, EZH2, MLL2, USP7, ASXL1,

NSD2, SETD2, SMC1A e ZMYM332.

Outro estudo teve como objetivo mostrar o comportamento metastático do OS

através da expressão dos genes e da análise citogenética e encontrou que os genes MDM2,

CXCR4, RANKL, RB1 e OSX possuem expressões modificadas de acordo com o momento do

surgimento da metástase (ao diagnóstico ou durante o tratamento), podendo haver perda

do RANKL ou ganho do CXCR4 em tumores de pacientes metastáticos ao diagnóstico.

Eventos como esses, facilitam a progressão da metástase concomitante com o

estabelecimento do tumor primário e apoiam o papel do receptor CXCR4 em direcionar a

metástase para o pulmão. Por outro lado, acontecimentos tardios, como a perda do RB1 e

ganho de MDM2, que são genes reguladores fundamentais do ciclo celular, parece estar

relacionada com os mecanismos finais que contribuem para o estabelecimento da metástase

no OS33.

Alterações cromossômicas também são frequentes no OS. A utilização de técnicas

convencionais de citogenética tem demonstrado como as mais comuns o ganho do

cromossomo 1 e as perdas dos cromossomos 2, 6, 8, 9, 10, 13 e 1734, 35. Ainda, rearranjos

cromossômicos foram descritos envolvendo os cromossomos 1, 4, 6, 7, 11, 12, 14, 15, 17, 19

e 2236, 37. Esses dados sugerem que a instabilidade genômica é frequente e importante para

o desenvolvimento do OS e envolve vias que normalmente mantém a integridade genômica.

Apesar de todo esse conhecimento sobre as alterações moleculares envolvidas na

patogênese do OS, a doença metastática ainda é um desafio, sendo o processo metastático

pouco compreendido na evolução do OS. Dessa forma, há uma necessidade crítica de

identificar marcadores que possam indicar com precisão ou predizer a existência de doença

metastática em pacientes com OS, uma vez que a maioria desses pacientes apresenta

doença micrometastática não detectável pelos exames de imagem ao diagnóstico. Além

disso, estratificar os pacientes de maneira correta pode auxiliar no correto manejo do

tratamento, principalmente nos pacientes não metastáticos, que podem ser beneficiados

com tratamentos menos tóxicos sem piora na resposta ou prognóstico.

5

1.3 Os RNAs não codificadores longos (lncRNAs)

Nos últimos anos, principalmente com o desenvolvimento de novas técnicas como o

sequenciamento em larga escala e os DNA tiling arrays, houve uma revolução na nossa visão

em relação à organização e conteúdo do genoma humano. Previamente ao que era

assumido, tais técnicas revelaram o achado inesperado de que a maior parte do genoma

humano é transcrito em RNA. Atualmente, estima-se que mais de 70% do genoma humano

seja transcrito, entretanto apenas 2% servem de modelo para a produção de proteínas38, 39.

Assim, as moléculas de RNA que não possuem a capacidade de codificar proteínas são

denominadas como RNAs não codificadores (ncRNAs).

De acordo com o seu tamanho, os ncRNAs são divididos em duas classes principais: os

ncRNAs pequenos (< 200 nucleotídeos) e os ncRNAs longos (lncRNAs > 200 nucleotídeos).

Recentemente, os ncRNAs pequenos têm recebido mais atenção, especialmente os

microRNAs (miRNAs) que têm sido descritos com um papel crucial no desenvolvimento de

diversas doenças, incluindo o câncer40. Entretanto, torna-se cada vez mais claro o fato de

que o genoma de mamíferos também codifica vários lncRNAs, definidos como RNAs

endógenos com tamanho superior a 200 nucleotídeos que não apresentam uma significativa

fase aberta de leitura (menos de 100 aminoácidos), dessa forma não resultando em

proteína41. A maioria dos lncRNAs descritos até o momento é transcrito pela RNA polimerase

II (RNA pol II) e são poliadenilados42, entretanto em alguns casos, como o BCYRN1, apesar de

funcionais os lncRNAs não são poliadenilados43.

Assim, os lncRNAs constituem um grupo heterogêneo de moléculas de RNA e podem

atuar de diversas maneiras diferentes em funções biológicas e moleculares nas células.

Dentre suas diversas funções, em geral os lncRNAs podem regular a expressão gênica44,

influenciar a localização das proteínas45 e, ainda, são importantes para a formação de

subestruturas celulares ou complexos proteicos essenciais para as células46. A figura 1

demonstra as funções celulares de alguns dos lncRNAs já descritos.

6

Fonte: Gutschner & Diederichs47

Figura 1. Funções celulares atribuídas aos diversos lncRNAs conhecidos. A) lncRNAs podem ser processados

em ncRNAs pequenos que podem alvejar outros RNAs, o que subsequentemente leva a degradação do RNA

alvo; B) lncRNAs podem atuar como “esponjas” de miRNAs, assim inibindo sua função e influenciando na

expressão dos RNAs alvos do miRNA; C e H) lncRNAs são importantes na formação de estruturas subcelulares e

complexos de proteínas, nos quais desempenham uma função de arcabouço; D) lncRNAs podem interagir com

proteínas alterando sua função e localização celular; E) lncRNAs regulam a expressão gênica pelo recrutamento

de fatores de transcrição a região promotora dos seus genes alvos; F) lncRNAs podem regular o mecanismo de

splicing alternativo de pré-mRNAs; G) lncRNAs podem interagir com complexos de remodelamento de

cromatina e induzir alterações locais ou globais no “empacotamento” da cromatina.

Os lcnRNAs frequentemente se sobrepõem com ou estão intercalados a transcritos

codificantes e não codificantes42. Em termos de posição genômica, os lncRNAs podem ser

agrupados em cinco diferentes categorias: (1) senso ou (2) antisenso, quando sobrepõe um

ou mais exons de outro transcrito na mesma fita ou na fita oposta de DNA, respectivamente;

(3) bidirecional, quando sua expressão e a de um transcrito adjacente na fita oposta é

iniciada em regiões genômicas próximas; (4) intrônico, quando se origina de um intron de

um segundo transcrito e; (5) intergênico, quando ocorre como uma unidade independente

dentro do intervalo genômico entre dois genes (Figura 2).

7

Fonte: criado por Vidal DO, 2013.

Figura 2. Organização genômica dos lncRNAs. A linha preta representa a fita de DNA; As caixas pretas

representam os exons, a linha preta pontilhada representa a posição dos introns e as setas indicam a direção

de transcrição dos genes.

Muitos estudos vêm sendo desenvolvidos no intuito de identificar novos lncRNAs. Um

dos relatos mais recentes identificou 5.440 lncRNAs no genoma humano que quando

combinados com o resultado de outros quatro estudos resultou em aproximadamente 7.000

lncRNAs48. Estimativas recentes levam a crer que existam mais de 20.000 lncRNAs transcritos

no genoma humano, implicando que esta classe de lncRNAs representará um enorme, ainda

desconhecido, componente de redes celulares normais que pode estar alterado na biologia

da célula tumoral49.

8

De fato, os lncRNAs são frequentemente expressos de forma específica seja em uma

doença, tecido ou estágio de desenvolvimento, o que torna tais moléculas alvos atrativos a

novas terapias voltadas às funções específicas dos lncRNAs tanto no desenvolvimento

quanto em doenças50, 51. No entanto, nossos conhecimentos de como os lncRNAs podem

agir nas células e quais funções eles podem ter nas doenças, como o câncer, ainda é muito

limitado.

1.4 Os lncRNAs associados aos processos de invasão e metástase em tumores humanos

Uma das principais características do câncer é a sua habilidade de invadir tecidos

adjacentes e promover a formação de metástases à distância, é também um dos maiores

desafios no tratamento oncológico e implica na interação e regulação de complexos

mecanismos biológicos. Frequentemente, as células tumorais passam por alterações

morfológicas, hoje conhecidas como transição epitélio-mesênquima, modificando sua

interação célula-célula ou célula-matriz. Portanto, toda essa cascata de invasão e metástase

compreende múltiplas alterações biológicas que permitem as células invadirem tecidos

sadios, seguido da intravasão nos vasos sanguíneos e linfáticos. Durante este trânsito na

corrente sanguínea, as células escapam da vigilância do sistema imune e adquirem a

capacidade de crescimento independente de ancoragem, além de extravasarem nos tecidos

alvos e promover a instalação de micrometástases e posteriormente o crescimento de um

tumor52. Neste contexto, alguns lncRNAs têm sido descritos como tendo um papel

fundamental no processo metastático. Dentre eles podemos destacar o MALAT1, HOTAIR,

HULC e BCYRN1.

1.4.1 MALAT1 (Metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1)

Um dos primeiros lncRNAs a ser descrito com tal papel foi o MALAT1, um transcrito de

8kb, localizado no cromossomo 11q13.1 que é um ponto de quebra frequente de

translocações cromossômicas associadas ao câncer53-55. MALAT1 fica retido no núcleo e está

localizado nos speckles nucleares, que são estruturas envolvidas no processamento do pré-

mRNA56. Recentemente, MALAT1 foi demonstrado atuando na regulação do splicing

alternativo de pré-mRNAs pela modulação dos níveis de fatores de splicing. A supressão de

MALAT1 altera o processamento de um conjunto de pré-mRNAs, os quais desempenham um

9

papel importante na biologia do câncer. Esse gene também é altamente conservado entre

diversas espécies ressaltando sua importância funcional53.

Primeiramente, o MALAT1 foi descrito com um aumento de expressão no tumor

primário, como um marcador prognóstico de metástase e pior sobrevida de pacientes

acometidos pelo carcinoma de pulmão de células não pequenas. Essa associação com a

metástase se mostrou estágio e histologia específica, dessa forma servindo como fator

prognóstico independente na sobrevida do paciente em estágios iniciais do adenocarcinoma

de pulmão57. A expressão de MALAT1 foi observada em diversos tecidos normais, com os

maiores níveis de expressão em pâncreas e pulmão57, entretanto sua expressão está

aumentada em uma gama de outros tumores quando comparados aos tecidos normais

correspondentes como, por exemplo, no carcinoma hepatocelular58. MALAT1 pode estar

associado com parâmetros clínicos e pode controlar a proliferação celular, a apoptose, a

migração, invasão, ou a disseminação metastática nas células tumorais59.

Um estudo demonstrou que o MALAT1 promove a mobilidade celular em células

tumorais de pulmão, por meio da regulação transcricional ou pós-transcricional de genes

importantes para este mecanismo celular60. Adicionalmente, MALAT1 suporta a proliferação

e invasão de células de câncer cervical (CaSki), e sua inibição leva ao aumento de expressão

de proteínas pró-apoptóticas como caspase 3, 8 e Bax61.

A expressão de MALAT1 também foi avaliada em pacientes com mieloma e mostrou

estar superexpresso em pacientes recém diagnosticados em comparação com pacientes pós

tratamento. A expressão desse gene foi relacionada com o status da doença e a mudança da

expressão pós tratamento teve relevância prognóstica. Pacientes que sofreram progressão

precoce tiveram uma alteração significativamente menor na expressão de MALAT1 após

tratamento. Sendo assim, MALAT1 mostrou ter um papel fundamental na patogênese do

mieloma62.

Recentemente, MALAT1 foi associado com o processo de proliferação e metástase em

osteossarcoma, através da ativação da via PI3K/Akt. Esses resultados indicaram que MALAT1

pode ser considerado como alvo terapêutico no osteossarcoma humano63.

1.4.2 HOTAIR (HOX transcript antisense RNA)

O HOTAIR é um gene de 2.2 kb localizado no cromossomo 12q13.13. HOTAIR atua na

interação e recrutamento do complexo repressivo polycomb 2 (PRC2) no locus do gene

10

HOXD o que leva ao silenciamento transcricional de 40 kb a montante44. Devido a sua

importância na regulação epigenética da expressão gênica, não é surpreendente que a

expressão de HOTAIR esteja alterada em uma série de tumores.

Em um dos primeiros relatos, a expressão aumentada de HOTAIR foi associada a

tumores primários de mama em relação ao tecido normal. Ainda, o seu nível de expressão

nos tumores primários correlacionou-se positivamente com a ocorrência de metástases e

pior prognóstico nestes pacientes. A superexpressão de HOTAIR em células epiteliais

cancerosas levou ao aumento do potencial de invasão e formação de metástases destas

células. Em contrapartida, a supressão de HOTAIR levou a inibição de tais processos

biológicos64. Resultados semelhantes foram descritos em carcinoma hepatocelular, no qual a

expressão de HOTAIR também está aumentada em tumores primários e parece ser um

biomarcador potencial para ocorrência de metástases em linfonodos. Ainda, a expressão de

HOTAIR mostrou-se um fator independente de prognóstico associado à recorrência da

doença e sobrevida menor dos pacientes. A depleção de HOTAIR em células tumorais do

fígado reduz a capacidade de invasão e viabilidade dessas células65. Somado a isso, a

supressão de HOTAIR torna as células cancerígenas mais sensíveis à ação de quimioterápicos

como a cisplatina e doxorrubicina66.

A alta expressão do HOTAIR ainda está relacionada ao potencial invasivo e metastático

do adenocarcinoma gástrico67, do melanoma68, do carcinoma endometrial69 e do câncer de

colo de útero70, entre outros. Xue et al.71 identificaram variantes genéticas do HOTAIR que

se associam a um risco aumentado de câncer colorretal. Meta-análises recentes confirmam

a associação entre a expressão elevada de HOTAIR com prognóstico desfavorável e

sobrevida reduzida em um grande número de malignidades72, 73.

1.4.3 HULC (Hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA)

O HULC é um gene de 500kb localizado no cromossomo 6p24.3. HULC foi inicialmente

descrito como um ncRNA específico do fígado que é altamente expresso em tumores

primários do fígado74. Também apresenta expressão elevada em metástases hepáticas de

pacientes com carcinoma colorretal, entretanto não é expresso nestes tumores primários75.

Recente relato demonstrou que HULC funciona como uma “esponja” de miRNAs, se ligando

e provocando a diminuição da expressão de uma série de miRNAs, incluindo o miR-372. A

redução na expressão deste miRNA leva ao aumento da expressão do seu alvo PRKACB, que

11

por sua vez induz a fosforilação de CREB. Isso resulta na alteração dos processos de

deacetilação e metilação de histonas, gerando um impacto no remodelamento da cromatina

alterando assim a expressão de uma série de genes76.

Um estudo comparou a expressão tecidual e plasmática do HULC entre pacientes com

hepatocarcinoma e um grupo controle. Além de serem constatados níveis significativamente

maiores de HULC no tecido/plasma de pacientes com hepatocarcinoma, houve relação

direta entre os valores de expressão do HULC e outras variáveis, como o grau de

diferenciação histológica. Estes resultados sugerem um potencial uso deste RNA como

biomarcador diagnóstico e/ou prognóstico77.

Um trabalho mostrou superexpressão do HULC em tecidos de câncer gástrico,

notando-se associação direta com estádios mais avançados e presença de metástases. O

mesmo trabalho estudou os efeitos da superexpressão e do “knockdown” da expressão do

HULC em células, determinando que o HULC desempenha papel importante na proliferação,

migração e invasão celular, bem como na inibição da apoptose78.

Outro estudo investigou a expressão do HULC em tecidos de câncer de pâncreas,

observando-se correlação significativa entre maior expressão do gene com tamanho

tumoral, invasão vascular e o estádio da doença79.

1.4.4 BCYRN1 (Brain cytoplasmic RNA 1)

O BCYRN1, também conhecido como BC200, é um gene de 200pb localizado no

cromossomo 2p21, que é especificamente expresso em tecidos do sistema nervoso. Sua

expressão já foi descrita em células germinativas, entretanto normalmente não é expresso

em tecidos somáticos de origem não neural. Uma análise em 19 tipos diferentes de tumor

revelou sua expressão nos carcinomas de mama, colo do útero, esôfago, pulmão e ovário,

mas não nos tecidos normais correspondentes80. Em outro trabalho, os autores

identificaram a expressão elevada de BCYRN1 em carcinoma invasivo de mama, mas não em

tecido normal. Uma análise de sensibilidade e especificidade confirmou o poder prognóstico

da expressão do BCYRN1 como um marcador molecular deste tipo de tumor. Além disso, em

carcinoma ductal in situ, a expressão de BCYRN1 foi relacionada com alto grau nuclear,

apontando que possa ser utilizado como marcador prognóstico de progressão tumoral43.

Tais exemplos deixam evidente o importante papel funcional dos lncRNAs para a

ativação do mecanismo de invasão celular e formação de metástases. De fato, os lncRNAs

12

descritos podem regular uma gama de genes envolvidos nestes processos. Por fim, lncRNAs

especificamente expressos ou silenciados em tumores humanos podem desenvolver um

papel importante no estabelecimento do fenótipo tumoral e, portanto, representar um

grupo de potenciais novos alvos terapêuticos no combate ao câncer.

Visto isso, nós avaliamos a expressão dos lncRNAs MALAT1, HOTAIR, HULC e BCYRN1

em amostras primárias de osteossarcoma ao diagnóstico e o potencial papel destas

moléculas como marcadores prognósticos nesta doença.

13

2 JUSTIFICATIVA

Os lncRNAs estão associados a regulação da expressão gênica e podem atuar por

diferentes mecanismos. Os lncRNAs MALAT1, HOTAIR, HULC e BCYRN1 já foram associados a

diversos fatores prognóstico como presença de metástase, baixa resposta à quimioterapia e

o processo metastático em tumores humanos. Nossa hipótese é de que esses genes também

possam estar envolvidos com a progressão do tumor, resistência ao tratamento e o processo

metastático em osteossarcoma. Como estes tumores são muito agressivos e metade dos

pacientes apresenta metástase ao diagnóstico ou durante o tratamento, com um

prognóstico muito pobre, a avaliação dessas moléculas pode indicar novos marcadores

biológicos com potencial prognóstico para este tumor, bem como novos alvos para terapias

alternativas no osteossarcoma.

14

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar a expressão gênica de MALAT1, HOTAIR, HULC e BCYRN1 em amostras de

osteossarcoma e avaliar o potencial papel destes genes como marcadores prognósticos

nesses pacientes.

3.2 Objetivos específicos

Otimizar um protocolo de extração e análise de qualidade de RNA em osteossarcoma;

Correlacionar a expressão dos genes com os dados clínico-patológicos dos pacientes;

Analisar a sobrevida global e sobrevida livre de eventos dos pacientes de acordo com a

expressão dos genes avaliados.

15

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Amostras e seleção dos pacientes

O levantamento dos pacientes diagnosticados com OS entre os anos de 2006 e 2013

foi realizado por meio do SisOnco, um sistema informatizado, o qual contém a base de

dados da patologia do Hospital de Câncer de Barretos (HCB). Nesse período, foram

identificados 175 pacientes com OS. Ainda, por meio de uma colaboração estabelecida com

o Dr. Carlos Alberto Scrideli, 32 amostras de RNAs de OS provenientes do Banco de Tumores

do Laboratório de Pediatria da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de

São Paulo (FMRP/USP) foram incluídas em nossas análises.

Além das amostras de osteossarcoma, também avaliamos expressão dos genes de

interesse em uma linhagem celular não tumorigênica de osteossarcoma (SAOS).

Para a avaliação dos critérios de elegibilidade, foi utilizada uma ficha de coleta de

dados (Anexo A), contendo 62 parâmetros. Através dos dados obtidos em prontuário, a ficha

foi preenchida e criou-se um banco de dados no programa SPSS 21.

4.2 Critérios de inclusão

Os participantes deste estudo atenderam aos seguintes critérios de inclusão:

Qualquer idade ao diagnóstico;

Diagnóstico definido de osteossarcoma (ósseo), de qualquer localização anatômica e

histologia;

Tratamento realizado pela equipe de Pediatria;

Com metástase ou não ao diagnóstico;

Amostras criopreservadas disponíveis para a extração de RNA.

4.3 Critérios de exclusão

Os critérios de exclusão deste estudo foram:

Pacientes cujo início do tratamento quimioterápico ocorreu anteriormente a coleta do

material biológico;

Amostras que não possuíam representatividade de tumor maior que 50%;

Amostras cuja integridade do RNA estava comprometida (RIN < 4.0);

Diagnóstico de osteossarcoma como 2º tumor primário.

16

4.4 Aspectos éticos

O projeto foi encaminhado ao Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) da Fundação Pio XII –

HCB (aprovado em abril de 2013 – número de referência 251.134) e do Hospital das Clínicas

da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP)

(aprovado em setembro de 2014), de modo a atender as exigências da Resolução nº

466/2012 do Conselho Nacional de Saúde/Ministério da Saúde (Anexo B).

A dispensa do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) foi concedida pelo

CEP por se tratar de um estudo com uso de amostras retrospectivas e de risco mínimo para

os participantes da pesquisa, sendo este risco inerente a quebra acidental do sigilo de

informações. Os pesquisadores envolvidos se comprometeram a garantir o sigilo de todos os

pacientes, não divulgando publicamente o nome ou qualquer outra informação que possa

identificar os pacientes envolvidos neste estudo.

4.5 Coleta dos dados

A coleta dos dados clínicos-patológicos foi realizada no SAME (Serviço de Arquivo

Médico Especializado) na Fundação Pio XII – HCB e no mesmo departamento da Fundação

Pio XII - Hospital de Câncer Infantojuvenil de Barretos. Os dados clínico-patológicos das

amostras provenientes de Ribeirão Preto foram encaminhados pelo Dr. Carlos Alberto

Scrideli.

4.6 Avaliação da representatividade tumoral

Para as amostras do HCB, um fragmento de tecido congelado de cada amostra

selecionada para o estudo foi descalcificado, incluído em parafina e corado com

hematoxilina/eosina, seguindo os protocolos padronizados no departamento de patologia

do HCB. Em seguida, confeccionou-se lâminas de cada amostra e estas foram avaliadas pelo

patologista Dr. Cristovam Scapulatempo Neto, para determinar a porcentagem de tumor

presente no fragmento estocado e disponível no biobanco da instituição.

As amostras provenientes da FMRP/USP foram submetidas a macrodissecção manual

no laboratório de patologia da instituição, com o intuito de proporcionar o enriquecimento

das amostras para células tumorais. A microdissecção das amostras foi realizada em

criostato refrigerado e utilizando o composto Tissue Tek O.C.T (Sakura). Dois cortes de 8-

10µm foram utilizados na macrodissecção, após a marcação da área tumoral pelo

17

patologista. A macrodissecção das amostras permite o enriquecimento maior do que 80%

para células tumorais.

4.7 Extração de RNA

A extração do RNA total de todas as amostras foi realizada a partir de um fragmento

do tumor congelado, utilizando-se inicialmente o TRIZOL (Life Technologies), de acordo com

as recomendações do fabricante. Brevemente, aproximadamente 30mg de tecido tumoral

foram separadas em um tubo contendo 1mL de TRIZOL e esferas de cerâmica (CK28) para

maceração. Os tecidos foram macerados utilizando o equipamento precellys 24 (Bertin

Technologies) sendo submetidos a pelo menos 2 ciclos de maceração de 6500 rpm durante

10 segundos. Durante o intervalo de 5 minutos entre os ciclos, as amostras eram

armazenadas no gelo.

Após esse passo, todo o conteúdo foi transferido para um tubo de 1,5mL e

acrescentou-se 200L de solução salina 0,9%. As amostras foram incubadas à temperatura

ambiente por 5 minutos e adicionou-se 200L de clorofórmio. Em seguida, as amostras

foram homogeneizadas com auxílio de vórtex por 15 segundos e centrifugadas a 12.000G

por 15 minutos a 4°C. Após centrifugação, foi recolhido o sobrenadante (fase aquosa)

contendo o RNA. O RNA foi precipitado acrescentando-se 500L de isopropanol gelado. Os

tubos foram homogeneizados por inversão e armazenados no freezer a -20°C overnight.

No dia seguinte, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 12.000G na

temperatura de 4°C. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e realizaram-se duas

lavagens do RNA com 1mL de etanol 75%, sendo os tubos centrifugados a 7.500G por 5

minutos na temperatura de 4°C. Ao final, descartou-se o sobrenadante, e o pellet de RNA

resultante ficou à temperatura ambiente pelo tempo necessário para sua completa

secagem. O RNA obtido foi ressuspendido com 20 µL de água milli-Q RNase-free.

Para algumas amostras, que apresentaram baixa qualidade do RNA (RIN<6) a extração

do RNA foi realizada novamente. Assim, o RNA foi extraído novamente utilizando-se o

miRNeasy micro kit (Qiagen), de acordo com as recomendações do fabricante. Brevemente,

30mg de tecido tumoral foram adicionadas a 700µL de Qiazol nos tubos com esferas de

cerâmica (CK28) para maceração. Os tecidos foram macerados da mesma maneira como

descrito anteriormente, seguiram a extração pelo protocolo do kit e foram eluídas em 20 µL

de água milli-Q RNase-free.

18

Após a extração, todas as amostras foram quantificadas e submetidas a análise de

qualidade/integridade do RNA e permaneceram estocadas a -80°C até a sua utilização.

4.8 Avaliação da quantidade e da qualidade do RNA total

A quantificação das amostras de RNA total foi realizada inicialmente no

espectrofotômetro NanoVue® (GE Healthcare Life Sciences) por análise da absorbância a

260nm. A pureza do RNA extraído foi avaliada através do cálculo das razões A260/A280 e

A260/A230, que indicam possíveis contaminações da amostra por proteínas e compostos

fenólicos. Posteriormente, para garantir uma quantificação mais precisa das amostras,

utilizamos uma metodologia de fluorescência com o equipamento Qubit (Life Technologies),

usando um kit que possui sondas moleculares específicas de RNA e portanto, se houver

proteína, DNA, ácidos nucleicos degradados presentes na amostra, estes não irão interferir

na quantificação.

A análise da qualidade do RNA total foi realizada por meio de eletroforese microfluida

no equipamento Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies), utilizando o RNA Nano Chip kit

(Agilent Technologies), de acordo com as recomendações do fabricante. Brevemente, após a

preparação do chip foram adicionados 9µL de Small RNA conditioning solution na posição

marcada como CS, 1µL de marcador na posição indicada como ladder e 5µL de RNA small

marker em cada posição do chip reservada para as amostras, bem como na posição do

marcador. As amostras foram desnaturadas por dois minutos a 70°C, para evitar a formação

de estruturas secundárias do RNA, e foi adicionado 1µL (100ng) de cada amostra nas

posições do chip marcadas de 1 a 12. O chip foi agitado no vórtex IKA MS3 (Manca),

horizontalmente por um minuto a 2.200rpm e, em seguida, foi colocado no aparelho para

leitura.

Com o auxílio do Agilent 2100 Expert Software obteve-se o resultado (eletroferograma

e densitometria dos géis) referente à qualidade das amostras que são representados pelo

RNA Integrity Number (RIN). As amostras apresentando RIN entre 1 e 3 foram consideradas

totalmente degradadas; entre 4-7 foram consideradas parcialmente degradadas; entre 8 e

10, amostras íntegras.

19

4.9. Análise de contaminação do RNA com DNA genômico

Dos quatro genes escolhidos nesse estudo, dois (HOTAIR e BCYRN1) são formados por

apenas um exon, sendo assim os ensaios (iniciadores e sonda) para RT-qPCR (PCR em tempo

real) poderiam amplificar o DNA genômico, dessa forma prejudicando a análise de expressão

destes genes. Assim, com o intuito de avaliar a presença de contaminação por DNA nas

amostras de RNA previamente extraídas, nós realizamos uma PCR com iniciadores intrônicos

para o gene KRAS em todas as amostras. A reação foi desenvolvida utilizando-se

aproximadamente 100ng de RNA total, 1x Tampão GoTaq Flexi Buffer, 0,2mM de dNTPs,

2mM de MgCl2, 0,3µM dos iniciadores, 0,5U da enzima Go-Taq Hot Start Polymerase

(Promega), em um volume final de 15µL. Os iniciadores utilizados foram: Direto - 5’

ATGTTCTAATATAGTCACATTTTC 3’ e Reverso - 5’ GTCCTGCACCAGTAATATGC 3’. As amostras

foram incubadas no termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems), de acordo

com as condições descritas na tabela 1.

Tabela 1 - Condições de ciclagem para PCR do gene KRAS

A avaliação da amplificação do gene KRAS em todas as amostras foi realizada por

eletroforese em gel de agarose 2% (Life Technologies), corado com corante Ez-vision in gel

10.000x (Amresco,USA).

4.10 Tratamento com DNase

O tratamento com DNase (Sigma-Aldrich) foi realizado seguindo as orientações do

fabricante. Brevemente, a partir de 1µg de RNA o tratamento foi realizado com 1x do

Estágio Temperatura Tempo Ciclos

Desnaturação inicial 96°C 10 minutos

Desnaturação 96°C 45 segundos

40 X Anelamento 56,5°C 45 segundos

Extensão 72°C 45 segundos

Extensão final 72°C 10 minutos

Final 4°C ∞

20

tampão da enzima, 1U de DNase I, em um volume final de 10µL. As amostras foram

incubadas a 37°C por 20 minutos. Posteriormente, para inativação da enzima adicionou-se

1µL de Stop Solution (50mM EDTA) e as amostras foram incubadas a 70°C por 10 minutos,

sendo em seguida colocadas no gelo.

Para confirmar a eficiência do tratamento, após tratamento com DNase, a PCR do gene

KRAS foi realizada novamente como descrito anteriormente (tópico 4.9).

4.11 Síntese de cDNA

A síntese do cDNA foi realizada a partir de 1µg de RNA total tratado com DNAse

utilizando o High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies), de acordo com

as recomendações do fabricante. Brevemente, 1µg de RNA total tratado foi adicionado a 1x

RT buffer, 4mM de dNTPs, 1x RT Random primers, 50U de MultiScribe Reverse Transcriptase

e 20U de RNAse Inhibitor, em um volume final de 20µL. As amostras foram incubadas a 25°C,

por 10 minutos, 37°C por 120 minutos, 85°C por 5 minutos. A reação foi realizada no Veriti

Thermal Cycler (Applied Biosystems).

4.12 Análise de expressão dos RNAs não codificadores longos por RT-qPCR .

A análise de expressão dos quatro lncRNAs foi realizada por RT-qPCR utilizando-se os

ensaios PrimeTime qPCR assay (Integrated DNA Technologies). Estes ensaios contêm sondas

e iniciadores específicos que permitem a amplificação e avaliação da expressão do gene de

interesse.

Após a síntese, 1µL do cDNA foi utilizado como molde nas reações de RT-qPCR que

foram realizadas com 1x Kapa Probe Fast Master Mix (Kapa Biosystems), 1x PrimeTime qPCR

assay (50X) específico para o gene em análise, em um volume final de 20µL. Essa reação foi

desenvolvida a 95°C por 10 minutos; seguida de 40 ciclos a 95°C por 15 segundos e 60°C por

1 minuto.

Além dos genes de interesse, foi realizada a avaliação dos genes endógenos ACTB e

GAPDH que serviram para a normalização dos dados de expressão dos genes de interesse

avaliados.A expressão normalizada de cada gene de interesse do estudo foi calculada por

meio do modelo matemático 2-∆Ct, no qual o ∆Ct corresponde ao Ct do gene de interesse

subtraído pelo Ct do gene normalizador81. A análise de expressão foi realizada no 7900 HT

21

Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems) e todas as reações foram realizadas em

duplicata.

4.13 Análise estatística

Os dados obtidos dos prontuários foram digitados e arquivados em um banco de

dados com auxílio do programa Statistical Package for Social Science (SPSS) versão 21.0. A

análise estatística foi realizada utilizando-se o mesmo programa.

Para este estudo, foram consideradas as variáveis epidemiológicas: sexo e idade ao

diagnóstico e variáveis clínico-patológicas: tipo histológico, grau de Huvos, localização do

tumor, tamanho do tumor, presença ou ausência de metástase e momento do diagnóstico

da metástase.

Para a análise estatística, algumas variáveis foram categorizadas da seguinte forma:

Sexo: masculino ou feminino;

Idade: menor/igual ou superior a 10 anos;

Tipo histológico: osteoblástico ou condroblástico/fibroblástico/telangectásico;

Grau de Huvos: grau 1/2 ou grau 3/4;

Local do tumor: fêmur ou fíbula/tíbia/úmero;

Tamanho do tumor: menor/igual ou superior a 12cm; a medida foi realizada por um

radiologista através de exames de imagem ao diagnóstico (Raio X /Ressonância/Tomografia

computadorizada;

Presença de metástase: Ausente ou Presente;

Momento do diagnóstico da metástase: não metastático ou metástase ao diagnóstico

ou metástase após diagnóstico;

As variáveis contínuas foram apresentadas como média, desvio padrão, mediana,

valores mínimo e máximo. As variáveis categóricas foram apresentadas pelas frequências e

porcentagens.

Inicialmente, a expressão gênica foi considerada como uma variável numérica e a

correlação da média de expressão dos genes com os fatores clínico-patológicos considerados

no estudo foi realizada utilizando-se o teste de Mann-Whitney. A avaliação da diferença da

qualidade do RNA medida pelo RIN, entre os métodos de extração utilizados (kit ou TRIZOL),

também foi realizada pelo teste de Mann-Whitney.

22

Posteriormente, para categorizar a expressão dos genes foi determinado um ponto de

corte utilizando a curva ROC e considerado o melhor ponto aquele que apresentou a melhor

sensibilidade e especificidade na comparação entre pacientes não metastáticos e

metastáticos. Para a avaliação desse ponto, foram analisados a área sob a curva (AUC), a

sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia e

seus respectivos intervalos de confiança de 95%.

Após essa análise, a expressão dos genes foi correlacionada com as características

clínicas por meio do teste de qui-quadrado ou teste exato de Fisher, quando os pressupostos

no teste do qui-quadrado não foram satisfeitos. Como a variável metástase foi divida em

três categorias (não metastático, metástase ao diagnóstico ou metástase após o

diagnóstico), utilizou-se o teste Kruskal-Wallis para avaliar a correlação com a expressão dos

genes.

A sobrevida global (SG) foi definida como o período da admissão (diagnóstico) até a

avaliação mais recente de acompanhamento ou óbito. Para a análise da sobrevida livre de

eventos (SLE), foi considerado como evento a recaída, a progressão de doença ou óbito (o

que ocorreu primeiro). O tempo até o evento foi estimado entre a data do diagnóstico até a

data do evento.

Para estimar os tempos de sobrevida global e os tempos de sobrevida livre de evento

utilizou-se o método de Kaplan-Meier. Para a comparação das curvas de sobrevida em

relação a cada categoria dentro de uma determinada variável utilizou-se o teste não-

paramétrico de LogRank.

Para todas as análises foi considerado um nível de significância de 5%.

23

5. RESULTADOS

5.1 Tamanho da Amostra

Nos registros do HCB, das 175 amostras identificadas inicialmente, 76 permaneceram

elegíveis para análise após avaliação dos prontuários.

As demais foram excluídas pelos seguintes critérios:

68 amostras foram coletadas após início de quimioterapia;

12 amostras de pacientes que não receberam tratamento no Departamento de

Pediatria do HCB;

05 amostras possuíam classificação incorreta pelo SisOnco;

03 amostras eram de recidiva;

02 amostras com radioterapia prévia;

03 amostras de metástase;

03 amostras com laudo inconclusivo;

02 amostras não estavam armazenadas no Biobanco;

01 amostra com fragmento pequeno, impossibilitando a avaliação pelo patologista.

As 32 amostras de Ribeirão Preto já haviam sido avaliadas em relação a todos os

critérios de inclusão e de exclusão com exceção da avaliação da integridade do RNA.

Abaixo, segue uma representação esquemática da estratégia utilizada para a avaliação

de expressão dos lncRNAs em osteossarcomas (figura 3). Cada etapa será descrita

detalhadamente nos tópicos a seguir.

24

Figura 3 – Representação esquemática da estratégia desenvolvida neste trabalho para a avaliação da

expressão de lncRNAs em osteossarcoma.

25

5.2 Avaliação da representatividade tumoral

Inicialmente, as 76 amostras do HCB foram avaliadas para a confirmação da presença

de tumor, das quais 56 foram confirmadas com pelo menos 50% de tecido tumoral no

fragmento disponível. As 32 amostras provenientes da FMRP/USP já haviam passado por

essa avaliação anteriormente e, após microdissecção manual houve um enriquecimento

para 80% de tecido tumoral nestas amostras. Assim, foram consideradas para seguimento

no projeto 88 amostras, das quais 71% (77 amostras) apresentaram pelo menos 80% de

tecido tumoral viável. A figura 4 ilustra a quantidade de amostras analisadas e a

porcentagem tumoral presente em cada uma delas.

Figura 4. Representatividade tumoral nas amostras selecionadas para avaliação da expressão dos lncRNAs.

Para as amostras do HCB esta avaliação foi realizada pelo patologista em lâmina de fragmento corado com

hematoxilina e eosina. Para as amostra da FMRP/USP esta avaliação foi feita previamente e as amostras

macrodissecadas garantindo a presença de pelo menos 80% de tecido tumoral viável.

5.3 Extração, quantificação e avaliação da qualidade do RNA total

Inicialmente, a extração do RNA total foi realizada utilizando o método do TRIZOL.

Após a extração, a quantificação e a pureza do RNA extraído foi avaliada pela análise de

absorbância (260/280nm) utilizando o espectrofotômetro NanoVue.

A avaliação da qualidade/integridade do RNA foi realizada com auxílio do equipamento

Bioanalyzer 2100. Das 88 amostras avaliadas, três possuíam um fragmento tumoral muito

pequeno que resultou em baixa quantidade de RNA e não foi possível obter o valor de RIN, e

26

nem a realização de nova extração/análise. Das 85 amostras restantes, 56 apresentaram

degradação parcial do RNA (RIN < 6) e por isso, na tentativa de atingir melhores resultados,

para 25 amostras com tecido remanescente o RNA foi extraído novamente utilizando-se o

miRNeasy micro kit (Qiagen). A re-extração utilizando-se o kit não resultou em uma melhor

qualidade do RNA visto que a maioria das amostras não apresentou diferença relevante em

relação ao valor de RIN observado inicialmente. Neste processo de re-extração, apenas

quatro amostras que inicialmente apresentaram RIN<4, foram recuperadas com RIN>4 e

incorporadas na análise. A comparação dos valores do RIN entre os dois procedimentos de

extração de RNA utilizados estão descritos na figura 5.

Figura 5 - Comparação da integridade do RNA de amostras de osteossarcoma após extração com dois

protocolos diferentes. O gráfico apresenta as médias e desvios padrão dos RINs obtidos nas extrações. A

coluna da esquerda (em vermelho) representa as amostras extraídas com TRIZOL e a da direita (em azul),

extraídas por kit. Não houve diferença estatística significativa (p=01642). Teste de Mann-Whitney.

De acordo com o gráfico, podemos observar que não houve diferença significativa de

qualidade do RNA entre os dois métodos de extração utilizados em nosso trabalho

(p=0,1642).

Em nosso trabalho, amostras com RIN > 4 apresentaram uma qualidade satisfatória

para a análise, o que foi comprovado pela baixa variação dos Cts (1,27) observada na análise

de expressão gênica dos genes normalizadores (endógenos), que será apresentada na tabela

4. Portanto, independentemente do método utilizado para a extração, as 31 amostras que

obtiveram o RIN ≥ 4 foram selecionadas para o estudo. A mesma análise de qualidade foi

aplicada as 32 amostras de RNA provenientes da FMRP/USP. Dessas, 12 amostras

27

apresentaram RIN > 4 e foram incluídas nas análises subsequentes. Assim, totalizando 43

amostras aptas a análise de expressão dos genes alvos (Figura 3).

5.4 Avaliação de contaminação com DNA genômico e tratamento das amostras de RNA

com DNase

Após a extração de RNA, para as amostras do HCB pôde-se observar que todas

amplificaram o gene KRAS, o que confirma a contaminação por DNA nessas amostras (Figura

6).

Figura 6 - Gel de agarose para a avaliação da amplificação do gene KRAS nas amostras de RNA. M: Ladder

(1Kb plus - Life Technologies); C+: controle positivo (DNA genômico); C-: controle negativo (sem amostra). O

tamanho esperado para o fragmento amplificado é de 202 pares de bases.

Após o tratamento com DNAse, as amostras foram novamente submetidas a

amplificação do gene KRAS, para a avaliação da eficiência do tratamento. O tratamento foi

eficiente para eliminar a contaminação das amostras de RNA com DNA genômico, pois não

observamos a amplificação do fragmento esperado deste gene, exceto para a amostra nº 70

(Figura 6). Como não havia mais RNA disponível dessa amostra, optamos por excluí-la das

análises. Estes resultados foram obtidos após a quantificação do RNA com o aparelho Qubit,

para os quais os motivos serão apresentados no tópico a seguir.

Figura 7 - Gel de agarose para a avaliação da amplificação do gene KRAS nas amostras de RNA após

tratamento com DNase. M: Ladder (1Kb plus - Life Technologies); L: linhagem celular de ostessarcoma SAOS;

C+: controle positivo (DNA genômico); C- : controle negativo (sem amostra). O tamanho esperado para o

fragmento amplificado é de 202 pares de bases.

28

5.5 Análise da expressão dos normalizadores e requantificação das amostras utilizando o

Qubit

Para a avaliação da expressão gênica dos alvos selecionados, utilizou-se a técnica de

RT-qPCR. Inicialmente foi avaliada a expressão gênica dos dois genes endógenos (ACTB e

GAPDH) com o intuito de selecionar o melhor gene normalizador, ou seja, aquele que

apresentou menor variação de Cts dentre todas as amostras de osteossarcoma avaliadas.

Sendo assim, a partir da quantificação obtida pelo Nanovue, 1µg de RNA foi tratado

com DNase e após confirmação da eficiência do tratamento, as amostras foram submetidas

a síntese de cDNA e avaliação da expressão dos genes endógenos. Essa análise revelou um

alto desvio padrão na análise de expressão dos genes endógenos quando consideradas todas

as amostras do estudo, o que não é satisfatório para genes que servirão de normalizadores

para a análise de expressão gênica dos genes alvo (tabela 2).

Tabela 2 – Média e desvio padrão dos Cts dos normalizadores ACTB e GAPDH, obtidos após análise de expressão gênica a partir de RNA quantificado por meio do Nanovue.

Gene Média Ct Desvio Padrão

ACTB 24,48 2,66

GAPDH 22,84 2,08

Devido à degradação parcial observada nas amostras de RNA (RIN entre 4 e 7), optou-

se por realizar a quantificação com o Qubit, já que esse método utiliza sondas moleculares

específicas para a quantificação de RNA íntegro e portanto, proporciona uma análise mais

fidedigna da quantidade de RNA nas amostras em estudo.

Diante dos resultados de quantificação descritos na tabela 3, observa-se a grande

variação apresentada entre a quantificação realizada pelo NanoVue e pelo Qubit, o que

mostrou a necessidade de requantificar todas as amostras utilizando-se essa nova

abordagem mais precisa.

29

Tabela 3 – Comparação da quantificação de RNA realizada pelos dois métodos utilizados neste trabalho

Nº Amostra NanoVue (ng/µL) Qubit (ng/µL)

13 2292 17,4

48 1338 556

49 1325 794

63 305 119

64 4276 1350

Assim, após a requantificação das amostras utilizando-se o Qubit, duas foram excluídas

devido à baixa quantidade de RNA disponível e impossibilidade de re-extração do RNA a

partir do fragmento de tecido. Portanto, baseado na quantificação das amostras pelo Qubit,

1µg das 41 amostras de RNA remanescentes foi novamente tratado com DNase e após

confirmação da eficiência do tratamento, houve a necessidade de exclusão de mais uma

amostra. Dessa forma, o RNA de 40 amostras foi submetido a síntese de cDNA e avaliação da

expressão dos genes endógenos.

Ainda, na análise de expressão dos genes endógenos, quatro amostras apresentaram

níveis muito baixos de expressão para estes genes (alto Ct) quando comparados a média

geral das amostras. Mesmo sendo aprovadas em todos os parâmetros determinados em

nosso trabalho, optamos por excluir essas amostras, pois isso poderia gerar um viés nas

análises de expressão dos lncRNAs para estas amostras. Assim, as análises de expressão dos

genes alvos seguiram com 36 amostras de RNAs de osteossarcoma.

A análise de expressão dos genes endógenos (ACTB e GAPDH), nestas 36 amostras

revelou que o gene ACTB apresentou a menor variação de expressão entre todas amostras

avaliadas, sendo então escolhido para normalização dos dados de expressão gênica dos

genes alvos (Tabela 4).

Tabela 4 - Média e desvio padrão dos Cts dos normalizadores ACTB e GAPDH, obtidos após análise de expressão gênica a partir de RNA quantificado por meio do Qubit.

Gene Média Ct Desvio Padrão

ACTB 19,50 1,27

GAPDH 19,00 2,06

30

5.6 Características clínicas, patológicas e demográficas dos pacientes com osteossarcoma

A caracterização das amostras foi realizada para os 36 pacientes, para os quais a

análise de expressão dos genes foi realizada. A maioria eram do sexo feminino (55,6%), com

idade entre 4 e 29 anos. A média de idade ao diagnóstico foi de 15 anos.

Quanto às características clínicas, ao diagnóstico, a maioria dos pacientes (53,6%)

apresentaram tumores menos volumosos (<12cm). Dos 36 pacientes do estudo, foi possível

obter o tamanho do tumor de 20 pacientes, sendo que a medida de 9 pacientes foi obtida

através da radiografia convencional, 7 através de ressonância magnética e 4 por tomografia

computadorizada. A localização mais frequente do tumor foi o fêmur em 16 pacientes

(44,4%), sendo o subtipo histológico mais comum o osteoblástico, que foi confirmado em 28

casos (77,8%). Em relação ao grau de resposta à quimioterapia (grau de Huvos-Ayala), a

maioria dos pacientes apresentou resposta parcial com mais de 50% de necrose, grau 2 de

Huvos-Ayala que foi observado em 14 pacientes (41,17%), sendo que 12 pacientes (35,3%)

não responderam a quimioterapia (grau 1 de Huvos-Ayala), seis (17,64%) apresentaram mais

que 90% de necrose tumoral, com tumor viável presente, dois (5,88%) apresentaram grau 4,

sem tumor viável e, para dois pacientes o grau de Huvos não se aplicava pois os pacientes

não realizaram cirurgia após quimioterapia. Em relação à presença de metástases, 20

pacientes (55,6%) não apresentaram metástases, e nos 16 pacientes metastáticos (44,4%), a

metástase pulmonar foi a mais frequente. Todos esses dados podem ser visualizados na

tabela 5.

31

Tabela 5 – Características clínicas, patológicas e demográficas dos pacientes com osteossarcoma para a análise

de expressão dos lncRNAs.

Variável Categoria n (%)

Sexo feminino 20 (55,6)

masculino 16 (44,4)

Idade ao diagnóstico

<10 anos 7 (19,4)

>10 anos 29 (80,6)

Média 15 anos

Local do tumor

Fêmur 16 (44,4)

Tíbia 11 (30,6)

Úmero 6 (16,7)

Fíbula 3 (8,3)

Tipo histológico

Osteoblástico 28 (77,8)

Condroblástico 5 (13,9)

Fibroblástico 2 (5,6)

Telangectásico 1 (2,8)

Grau de Huvos*

Grau 1 12 (35,3)

Grau 2 14 (41,17)

Grau 3 6 (17,64)

Grau 4 2 (5,88)

Tamanho do tumor*

<12 15 (53,6)

>=12 13 (46,4)

Metástases*

Não metastático 20 (57,1)

Metástase ao diagnóstico

7 (20,0)

Metástase após diagnóstico

8 (22,9)

*nº de pacientes cuja variável foi possível obter os dados

5.7 Análise da expressão dos lncRNAs

O presente estudo avaliou a expressão dos lncRNAs nas 36 amostras tumorais de OS

por meio da RT-qPCR.

Os resultados obtidos e normalizados mostram uma ampla variação na expressão dos

quatro genes avaliados. Interessante notarmos que para algumas amostras, a expressão dos

32

genes não foi detectada demonstrando que os genes não eram expressos nestas amostras,

principalmente para os genes HOTAIR e BCYRN1. Neste experimento, foi utilizada uma

linhagem celular de osteossarcoma (SAOS2) a fim de verificar o perfil de expressão desses

genes nesta linhagem. Como podemos notar, estes genes apresentam uma baixa expressão

nessa linhagem celular de osteossarcoma.

Abaixo estão demonstrados os gráficos (Figura 8), referentes a expressão de cada um

dos lncRNAs nas 36 amostras de OS.

Figura 8 - Expressão normalizada dos lncRNAs em osteossarcoma avaliada por RT-qPCR. A: MALAT1; B: HULC;

C: HOTAIR; D: BCYRN1. No eixo x, cada número representa uma amostra. No eixo y está representado o valor

normalizado de expressão do lncRNA avaliado. A normalização foi realizada de acordo com o modelo

matemático 2- ΔCt, sendo o gene endógeno ACTB utilizado como normalizador.

33

Figura 8 (Continuação) - Expressão normalizada dos lncRNAs em osteossarcoma avaliada por RT-qPCR. A:

MALAT1; B: HULC; C: HOTAIR; D: BCYRN1. No eixo x, cada número representa uma amostra. No eixo y está

representado o valor normalizado de expressão do lncRNA avaliado. A normalização foi realizada de acordo

com o modelo matemático 2- ΔCt, sendo o gene endógeno ACTB utilizado como normalizador.

5.8 Associação da expressão dos lncRNAs com os fatores clínico-patológicos dos

pacientes

Tendo em vista o potencial papel dos lncRNAs na carcinogênese e sua influência no

prognóstico de pacientes com câncer, foi avaliada a correlação da expressão desses genes

com os fatores clínicos-patológicos considerados no estudo como tipo histológico, grau de

Huvos, sexo, idade ao diagnóstico, local do tumor, tamanho do tumor e presença de

metástase.

34

Considerando a expressão dos genes como uma variável numérica, podemos observar

que para o gene BCYRN1 sua maior expressão está associada significativamente com

pacientes que apresentam idade acima de 10 anos (p=0,036). Apesar de não significativos,

nós podemos destacar algumas observações como por exemplo o grupo de tumores com

grau histológico condroblástico, fibroblástico e telangectásico, apresenta em média pelo

menos quatro vezes maior expressão de BCYRN1 quando comparado aos tumores

osteoblásticos. Além disso, a maior expressão deste gene também pode ser observada nos

tumores menos responsivos a quimioterapia (grau Huvos 1/2) quando comparados aos que

respondem (Huvos 3/4). Em relação a presença de mestástases, tumores associados a

metástases apresentaram maior expressão de BCYRN1 (em média três vezes maior) em

comparação aos casos não metastáticos (Tabela 6).

Para o gene HOTAIR, apesar da associação da expressão gênica e as características

clínico-patológicas dos pacientes não serem significativas, podemos observar maior

expressão de HOTAIR no grupo de tumores com tipo histológico condroblástico, fibroblástico

e telangectásico, aproximadamente 13 vezes maior, quando comparado aos tumores

osteoblásticos. Podemos observar também uma maior expressão de HOTAIR nas amostras

de pacientes não metastáticos, ainda em tumores localizados na fíbula, tíbia ou úmero ou

que responderam pior à QT pré-operatória (Huvos 1/2) e que ao diagnóstico apresentaram

tamanho do tumor menor que 12cm (Tabela 7).

Para o gene HULC, a associação da expressão gênica e as características clínico-

patológicas dos pacientes também não foram significativas, entretanto podemos observar

que a média de expressão foi maior em pacientes que apresentaram tumores do tipo

histológico osteoblástico, em tumores de pacientes com idade igual ou superior a 10 anos e

em tumores para os quais o paciente apresentou metástase após o diagnóstico (Tabela 8).

Em relação ao MALAT1, sua maior expressão foi associada significativamente a

pacientes com idade igual ou superior a 10 anos. Apesar de não encontrarmos associação

significativa às demais características clínico-patológicas, observamos a maior expressão de

MALAT1 em pacientes do sexo masculino, em tumores localizados na fíbula, tíbia ou úmero.

Ainda, quando consideramos a presença de metástase independente do momento,

observamos uma expressão um pouco aumentada de MALAT1 em pacientes não

metastáticos. Entretanto, quando os pacientes que tem metástase são estratificados em

35

dois grupos, observamos que a maior expressão do gene ocorre nos tumores de pacientes

que desenvolvem metástase ao longo do tratamento (Tabela 9).

Analisando os resultados obtidos, podemos notar que as amostras analisadas

mostraram uma ampla variação de expressão dos quatro genes analisados, como

demonstrado anteriormente (Figura 8). Os valores de média, desvio padrão, mediana e

percentis dos resultados obtidos para os genes analisados estão demonstrados nas tabelas

de 6 a 9.

36

Tabela 6 – Comparação da média de expressão do BCYRN1 com as características clínico-patológicas dos pacientes avaliados.

Contagem Média Desvio padrão Mínimo Percentil 25 Mediana Percentil 75 Máximo p-valor

Tipo histológico

Osteoblástico 28 0,781883 0,828815 0,053557 0,209929 0,482505 1,111098 3,509397

0,138 Condroblástico/Fibroblástico Telangectásico

8 3,389459 5,869342 0,081406 0,490397 1,275666 2,941804 17,618533

Grau de Huvos* Grau 1 / 2 26 1,581165 3,385022 0,061554 0,252257 0,869527 1,426408 17,618533

0,155 Grau 3 / 4 8 0,509721 0,432008 0,053557 0,155135 0,408658 0,798371 1,299885

Sexo Feminino 20 1,865601 3,865963 0,053557 0,295323 0,815225 1,284110 17,618533

0,504 Masculino 16 0,731024 0,662778 0,081406 0,185287 0,428737 1,319098 2,160619

Idade ao diagnóstico <10 anos 7 0,675498 1,347527 0,053557 0,081406 0,190994 0,302513 3,722989

0,036 >=10 anos 29 1,526894 3,201655 0,061554 0,351490 0,864022 1,299885 17,618533

Local do tumor

Fêmur 16 1,036519 1,100962 0,061554 0,327002 0,679728 1,284110 3,722989

0,610 Fíbula, Tíbia e Úmero 20 1,621205 3,844194 0,053557 0,185287 0,640261 1,295311 17,618533

Tamanho do tumor* <12 cm 15 1,102877 1,078174 0,053557 0,106236 0,864022 1,465697 3,722989

0,695 >=12 cm 13 0,911535 0,944459 0,061554 0,302513 0,450207 1,299885 3,509397

Metástase Ausentes 20 0,687126 0,565351 0,053557 0,240560 0,553916 0,951154 2,160619

0,373 Presentes 16 2,204118 4,285407 0,061554 0,136692 0,999978 2,178777 17,618533

Metástase*

Não metastático 20 0,68742 0,56535 0,5356 0,24087 0,55397 0,95125 2,16062

0,787 Metástase ao diagnostico* 7 1,423940 1,56189 0,6155 0,10624 0,87504 3,51087 3,73304

Metástase após diagnostico* 8 2,999230 6,0173 0,8144 0,12866 0,78793 2,18982 17,69960

p-valor < 0,05 *nº de pacientes cuja variável foi possível obter os dados

37

Tabela 7 - Comparação da média de expressão do HOTAIR com as características clínico-patológicas dos pacientes avaliados.


Tipo histológico

Osteoblástico 28 0,004895 0,010908 0,000006 0,000200 0,000649 0,003271 0,049928

0,543 Condroblástico/Fibroblástico Telangectásico

8 0,053119 0,144645 0,000001 0,000248 0,002224 0,004468 0,411069


0,256 Grau 3 / 4 8 0,003746 0,007745 0,000074 0,000118 0,000271 0,003271 0,022579

Sexo Feminino 20 0,004219 0,007400 0,000001 0,000292 0,000649 0,004029 0,025486

0,874 Masculino 16 0,029852 0,102391 0,000084 0,000184 0,000981 0,002734 0,411069


0,510 >=10 anos 29 0,018988 0,076161 0,000001 0,000299 0,000857 0,003902 0,411069

Local do tumor Fêmur 16 0,006980 0,013925 0,000006 0,000321 0,000649 0,003914 0,049928



0,093 >=12 cm 13 0,004059 0,008893 0,000006 0,000167 0,000343 0,001106 0,025486


0,799 Presentes 16 0,005777 0,013314 0,000001 0,000249 0,000936 0,002772 0,049928

Metástase*

Não metastático 20 0,023573 0,091767 0,000077 0,000185 0,000785 0,004040 0,412760

0,966 Metástase ao diagnostico 7 0,004605 0,009369 0,000028 0,000205 0,000555 0,003925 0,025625

Metástase após diagnostico 8 0,007505 0,017220 0,000001 0,000279 0,001455 0,003315 0,049940


38

Tabela 8 - Comparação da média de expressão do HULC com as características clínico-patológicas dos pacientes avaliados.

Contagem Média Desvio padrão

Mínimo Percentil 25 Mediana Percentil 75 Máximo p-valor

Tipo histológico

Osteoblástico 28 0,000038420 0,000036056 0,000000999 0,000009198 0,000026801 0,000062379 0,000126349

0,119 Condroblástico/Fibroblástico/ Telangectásico

8 0,000021071 0,000037211 0,000000904 0,000001697 0,000006115 0,000020671 0,000110694

Grau de Huvos*

Grau 1 / 2 26 0,000032895 0,000035429 0,000000904 0,000006021 0,000019150 0,000058980 0,000119445 0,394

Grau 3 / 4 8 0,000047261 0,000041736 0,000001921 0,000008204 0,000051891 0,000064813 0,000126349

Sexo Feminino 20 0,000031637 0,000036392 0,000000999 0,000002119 0,000013231 0,000053670 0,000119445

0,484 Masculino 16 0,000038224 0,000037522 0,000000904 0,000006996 0,000025021 0,000067190 0,000126349


<10 anos 7 0,000012347 0,000015860 0,000001921 0,000002102 0,000009950 0,000012230 0,000046800 0,105

>=10 anos 29 0,000039927 0,000038205 0,000000904 0,000007970 0,000025805 0,000064756 0,000126349

Local do tumor

Fêmur 16 0,000032168 0,000034274 0,000000904 0,000003990 0,000017751 0,000057981 0,000119445 0,702

Fíbula, Tíbia e Úmero 20 0,000036482 0,000038988 0,000000999 0,000005125 0,000020671 0,000067190 0,000126349

Tamanho do tumor*

<12 cm 15 0,000028590 0,000030117 0,000000999 0,000001960 0,000017106 0,000056982 0,000087958 0,369

>=12 cm 13 0,000044040 0,000041784 0,000000904 0,000010426 0,000033252 0,000060002 0,000126349


0,171 Presentes 16 0,000032151 0,000043198 0,000000904 0,000001626 0,000007986 0,000069012 0,000119445

Metástase*

Não metastático 20 0,00003 0,00003 0,00000 0,00001 0,00003 0,00005 0,00013




39

Tabela 9 - Comparação da média de expressão do MALAT1 com as características clínico-patológicas dos pacientes avaliados.


Tipo histológico

Osteoblástico 28 4,49462 2,59922 0,31235 2,67482 3,83030 5,87172 10,31942

0,879 Condroblástico/Fibroblástico

Telangectásico 8 7,11100 7,97581 1,11040 1,62371 3,56961 12,57206 20,24685


0,685 Grau 3 / 4 8 4,92796 2,93913 1,82188 2,51630 4,12311 7,00178 10,31942

Sexo Feminino 20 4,47554 4,14551 0,31235 2,45454 3,33675 4,66701 19,30773

0,252 Masculino 16 5,82666 4,67299 1,42553 3,25912 3,88384 7,59785 20,24685


0,048 >=10 anos 29 5,48901 4,60057 0,31235 2,93827 3,98345 6,67541 20,24685

Local do tumor Fêmur 16 3,97204 2,60823 0,31235 2,22625 3,29498 5,43569 9,78187



0,534 >=12 cm 13 4,27727 2,33912 1,42553 2,93028 3,79895 4,05027 9,78187


0,126 Presentes 16 4,33174 4,49858 0,31235 1,82685 2,93428 4,66701 19,30773

Metástase*

Não metastático 20 5,68325 4,30610 1,95837 3,20250 3,95382 7,02332 20,28665




40

5.9 Associação do perfil de expressão dos lncRNAs com as características clínico-

patológicas dos pacientes

Com o intuito de categorizar a expressão dos genes (maior e menor expressão) nós

utilizamos a análise da curva ROC. Uma vez que esses genes são marcadores de metástase

em outros tumores, o ponto determinado na curva ROC para cada gene foi aquele que

apresentou a melhor especificidade e sensibilidade para discriminar entre pacientes

metastáticos e não metastáticos.

Assim, considerando os resultados de expressão obtidos para cada gene, podemos

observar que a análise da curva ROC não revelou nenhum ponto de corte com significância

estatística que permitisse a discriminação das amostras entre metastáticas e não

metastáticas (tabela 10 e 11)

Sendo assim, utilizamos para cada gene o ponto da curva ROC que apresentava a

maior sensibilidade e especificidade para determinação desses grupos. Portanto, para as

amostras cujos resultados de expressão encontravam-se acima deste ponto foram

consideradas com alta expressão do gene, em contrapartida àquelas abaixo do ponto

determinado consideradas com baixa expressão do gene.

Tabela 10 – Área sob a curva, desvio padrão, p-valor e intervalo de confiança determinados pela curva ROC.

IC 95%

Gene Área sob a curva Desvio padrão p-valor Limite inferior Limite superior

BCYRN1 0,588 0,105 0,373 0,382 0,793

HOTAIR 0,475 0,099 0,799 0,281 0,669

HULC 0,366 0,106 0,171 0,158 0,573

MALAT1 0,65 0,096 0,126 0,463 0,837

41

Tabela 11 – Ponto de corte, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo

negativo (VPN) e acurácia, de acordo com a curva ROC.

Assim, após a categorização da expressão dos genes nas amostras avaliadas, nós

realizamos as análises de associação do padrão de expressão dos genes com as

características clínico-patológicas dos pacientes.

Para o gene BCYRN1, nossos resultados mostraram que 90,5% dos pacientes que

apresentaram baixa expressão do gene pertenciam ao tipo histológico osteoblástico

(p=0,046). Apesar de não ter significância estatística, podemos observar que dos pacientes

que apresentaram alta expressão do gene 93,3% tinham idade ao diagnóstico maior ou igual

a 10 anos e 93% apresentaram baixa resposta ao tratamento (Grau Huvos 1/2). Ainda,

daqueles pacientes cuja expressão foi alta, 60,0% apresentavam metástase em algum

momento (Tabela 12).

Em relação ao HOTAIR, 75% dos pacientes com alta expressão do gene apresentaram

tamanho do tumor < 12cm (p=0,049) e, apesar de não significativo, considerando a baixa

expressão, 60% não eram metastáticos (Tabela 13).

Para o gene HULC não houve associação estatística significativa entre a o perfil de

expressão do gene e as características clínico-patológicas avaliadas. Entretanto, podemos

destacar algumas observações, como por exemplo 88,9% dos pacientes que apresentaram

alta expressão do gene pertencia ao tipo histológico osteoblástico e, 94,4% apresentavam

idade ao diagnóstico igual ou superior a 10 anos (p-valor = 0,088) (Tabela 14).

Em relação a expressão do MALAT1, 95,5% dos pacientes que apresentaram alta

expressão tinham 10 anos ou mais ao diagnóstico (p=0,008). Apesar dos outros resultados

encontrados não terem sido estatisticamente significativos, podemos destacar que a maioria

Gene Ponto de corte Sensibilidade % Especificidade % VPP VPN Acurácia

BCYRN1 0,86952666 40

(19,17-63,93) 35,71

(18,67-55,93) 30,77

(14,37-51,79) 45,45

(24,42-67,77) 37,5

(25,22-51,64)

HOTAIR 0,00056915 50

(27,23-72,77) 67,9

(47,65-84,09) 52,6

(28,9-75,51) 65,5

(45,67-82,04) 60,4

(46,31-72,98)

HULC 0,0000107873 55

(31,55-76,9) 71,4

(51,33-86,74) 57,9

(33,53-79,7) 69

(49,17-84,68) 64,6

(50,44-76,57)

MALAT1 3,6699867 60

(36,07-80,83) 71,4

(51,33-86,74) 60

(36,07-80,83) 71,4

(51,33-86,74) 66,7

(52,54-78,32)

42

dos pacientes (68,2%) com alta expressão do gene não eram metastáticos e a baixa

expressão do gene foi vista no grupo de pacientes do sexo feminino (71,4%) e que

apresentavam tamanho do tumor ao diagnóstico menor do que 12 cm (66,7%). (Tabela 15).

43

Tabela 12 – Associação do perfil de expressão do BCYRN1 com as características epidemiológicas e clínico-

patológicas.

Baixa expressão Alta expressão p-valor n % n %

Tipo histológico

Osteoblástico 19 90,5 9 60,0

0,046 Condroblástico/Fibroblástico/

Telangectásico 2 9,5 6 40,0

Grau de Huvos* Grau 1 / 2 13 65,0 13 92,9

0,102 Grau 3 / 4 7 35,0 1 7,1

Sexo Feminino 11 52,4 9 60,0

0,650 Masculino 10 47,6 6 40,0

Local do tumor Fêmur 9 42,8 7 46,7

0,821 Fíbula, Tíbia e Úmero 12 57,2 8 53,3

Idade ao diagnóstico <10 anos 6 28,6 1 6,7

0,200 >=10 anos 15 71,4 14 93,3

Tamanho do tumor* <12 cm 8 50,0 7 58,3

0,662 >=12 cm 8 50,0 5 41,7

Metástase Ausentes 14 66,7 6 40,0

0,112 Presentes 7 33,3 9 60,0

Metástase*

Não metastático 14 66,7 6 42,9

0,410 Metástase ao diagnóstico 3 14,3 4 28,6

Metástase após diagnóstico 4 19 4 28,6

44

Tabela 13 – Associação do perfil de expressão do HOTAIR com as características epidemiológicas e clínico-patológicas

Baixa expressão Alta expressão p-valor

n % n %

Tipo histológico



3 15,0 5 31,3


0,999 Grau 3 / 4 5 26,3 3 20,0

Sexo feminino 11 55,0 9 56,3

0,940 masculino 9 45,0 7 43,8

Local do tumor Fêmur 10 50,0 6 37,5 0,453

Fíbula, Tíbia e Úmero 10 50,0 10 62,5

Idade ao diagnóstico <10 anos 4 20,0 3 18,8 0,999

>=10 anos 16 80,0 13 81,3

Tamanho do tumor* <12 cm 6 37,5 9 75,0 0,049

>=12 cm 10 62,5 3 25,0

Metástase Ausentes 12 60,0 8 50,0 0,549

Presentes 8 40,0 8 50,0

Metástase* Não metastático 12 63,2 8 50,0


Metástase após diagnóstico 3 15,8 5 31,3

45

Tabela 14 – Associação do perfil de expressão do HULC com as características epidemiológicas e clínico-

patológicas

HULC

Baixa expressão Alta expressão p-valor

n % n %

Tipo histológico



6 33,3 2 11,1


0,693 Grau 3 / 4 3 18,8 5 27,8


0,502 Masculino 7 38,9 9 50,0



Idade ao diagnóstico <10 anos 6 33,3 1 5,6

0,088 >=10 anos 12 66,7 17 94,4

Tamanho do tumor* <12 cm 8 61,5 7 46,7

0,431 >=12 cm 5 38,5 8 53,3


0,18 Presentes 10 55,6 6 33,3

Metástase*




46

Tabela 15 – Associação do perfil de expressão do MALAT1 com as características epidemiológicas e clínico-

patológicas

Baixa expressão

Alta expressão p-valor

n % n %

Tipo histológico


0,683 Condroblástico / Fibroblástico / Telangectásico

4 28,6 4 18,2


0,999 Grau 3 / 4 3 23,1 5 23,8


0,126 Masculino 4 28,6 12 54,5




<10 anos 6 42,9 1 4,5 0,008

>=10 anos 8 57,1 21 95,5

Tamanho do tumor*

<12 cm 8 66,7 7 43,8 0,229

>=12 cm 4 33,3 9 56,3


0,056 Presentes 9 64,3 7 31,8

Metástase*




47

5.10 Análise de sobrevida global e sobrevida livre de eventos

A população avaliada em nosso estudo sem metástase ao diagnóstico e com metástase

ao diagnóstico apresenta sobrevida global em 5 anos de 62,7% e 28,6%, respectivamente e

sobrevida livre de eventos de 59,6 e 28,6%, respectivamente (figura 9).

Figura 9 - Análise de sobrevida global e sobrevida livre de eventos para os pacientes metastáticos e não

metastáticos ao diagnóstico tratados pelo protocolo GLATO 2006 no Departamento de Pediatria do Hospital

de Câncer de Barretos no período de 2006 a 2013.

Em relação às características epidemiológicas, os resultados encontrados não foram

estatisticamente significativos para a análise de sobrevida, no entanto, podemos observar

que tanto a sobrevida global como a sobrevida livre de eventos em 5 anos é maior em

pacientes do sexo masculino (Tabela 16 e 17).

Tabela 16 - Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação as características epidemiológicas.

SG

Variável Categoria 1 ano 3 anos 5 anos p-valor

Sexo Feminino 73,7 43,6 43,6

0,101 Masculino 93,3 79 64,6

Idade < 10 anos 85,7 57,1 57,1

0,885 > 10 anos 81,5 60,9 51,5

48

Tabela 17 - Sobrevida livre de eventos (SLE) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação as características epidemiológicas.

SLE


Sexo Feminino 60 42,0 42,0

0,136 Masculino 93,3 66,7 66,7

Idade < 10 anos 71,4 57,1 57,1

0,912 > 10 anos 75,0 51,6 51,6

Quanto às características clínico-patológicas, não encontramos significância estatística

em nenhuma das variáveis analisadas em relação a análise de sobrevida, mas podemos

observar que tanto a SG como a SLE em 5 anos é maior para os pacientes com tipo

histológico osteoblástico, que responderam melhor à quimioterapia (Grau de Huvos 3/4),

nos tumores de localização tíbia/fíbula/úmero (Tabela 18 e 19).

Tabela 18 - Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação as características clínico-patológicas.

SG


Tipo histológico

Osteoblástico 82,1 66,2 57 0,225

Condroblástico/Fibroblástico/ Telangectásico

83,3 33,3 33,3

Grau de Huvos Grau 1/2 83,3 56,7 46,4

0,287 Grau 3/4 87,5 72,9 72,9

Local do Tumor

Fêmur 60 52,5 39,4

0,063 Tíbia /Fíbula / Úmero 94,7 68,4 63,2

Tamanho do tumor < 12 cm 86,7 47,7 47,7

0,785 > 12 cm 66,7 66,7 55,6

49

Tabela 19 - Sobrevida livre de eventos (SLE) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação as características clínico-

patológicas.

SLE


Tipo histológico

Osteoblástico 78,6 59,2 59,2 0,1

Condroblástico/Fibroblástico/ Telangectásico

57,1 28,6 28,6

Grau de Huvos Grau 1/2 72 46,9 46,9

0,273 Grau 3/4 87,5 72,9 72,9

Local do tumor

Fêmur 53,3 44,4 44,4

0,150 Tíbia /Fíbula / Úmero 90 60 60

Tamanho do tumor < 12 cm 73,3 49,5 49,5

0,759 > 12 cm 66,7 58,3 58,3

Em relação a expressão dos genes, também não observamos um impacto significativo

na sobrevida global e sobrevida livre de eventos. Entretanto, podemos observar que os

pacientes que apresentaram maior expressão dos genes BCYRN1 e HOTAIR, apresentaram

uma menor sobrevida global e sobrevida livre de eventos em 5 anos (tabela 20 e 21; figura

10 e 11).

Tabela 20 - Sobrevida global (SG) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação a expressão dos lncRNAs.

SG


BCYRN1

Baixa expressão 81 70,8 59,4

0,295 Alta expressão 84,6 40,4 40,4

HOTAIR

Baixa expressão 83,3 64,8 64,8

0,242 Alta expressão 81,3 54,2 40,6

HULC


0,525

Alta expressão 83,3 58,9 44,9

MALAT1 Baixa expressão 84,6 59,8 49,9

0,778 Alta expressão 81 59,,9 54,5

50

Tabela 21 - Sobrevida livre de eventos (SLE) em 1 ano, 3 anos e 5 anos em relação a expressão dos lncRNAs.

SLE


BCYRN1


0,313 Alta expressão 71,4 40,2 40,2

HOTAIR


0,224 Alta expressão 68,8 41,3 41,3

HULC


0,557

Alta expressão 72,2 48,1 48,1

MALAT1 Baixa expressão 69,2 53,8 53,8

0,753 Alta expressão 77,3 53,1 53,1

51

Figura 10 - Análise de sobrevida global de acordo com o perfil de expressão dos lncRNAs. (A) BCYRN1; (B)

HOTAIR; (C) HULC; (D) MALAT1.

52

Figura 11 - Análise de sobrevida livre de eventos de acordo com o perfil de expressão dos lncRNAs. (A)

BCYRN1; (B) HOTAIR; (C) HULC; (D) MALAT1.

53

6 DISCUSSÃO

6.1 Otimização do protocolo de extração e análise da qualidade do RNA

Na otimização do protocolo de extração e análise da qualidade do RNA, observamos

aspectos importantes durante esses passos que muitas vezes não são descritos na literatura,

ou simplesmente não realizados com o rigor necessário.

A avaliação do patologista para garantir uma boa representatividade tumoral foi uma

etapa crucial, pois a contaminação das amostras tumorais com células normais pode levar a

uma interpretação errônea das análises de expressão dos genes. Após essa análise para

confirmação da representatividade tumoral das nossas amostras, 20 foram excluídas do

estudo por possuírem quantidade menor que 50% de tumor, o que ainda é uma quantidade

razoável de células tumorais. Em uma análise de correlação entre a pureza do tecido

tumoral e a expressão gênica foi demonstrado que amostras com menos do que 50% de

tecido tumoral apresentam um viés na expressão gênica, o que leva a interpretação errada

dos resultados, uma vez que a expressão deste gene pode se apresentar de forma diferente

no tecido normal. Conforme a representatividade tumoral (acima de 60-70%) aumenta, a

análise atinge qualidade suficiente para a avaliação da expressão gênica e obtenção de

dados fidedignos e reais de expressão82, 83. A fim de evitar interferência em nossa análise,

atribuída a presença de tecido tumoral, optamos por incluir amostras com

representatividade de tecido tumoral acima de 50%. De fato, podemos avaliar que a maioria

das nossas amostras (71%) foram classificadas com mais de 80% de tecido tumoral. Dessa

forma, podemos inferir que os dados de expressão dos genes avaliados em nosso estudo são

reais e refletem o comportamento destes genes nos tumores, não tendo uma interferência

significativa proveniente de células normais.

Para a extração do RNA, utilizamos o método do TRIZOL de acordo com as orientações

do fabricante em todas as etapas, conforme descrito na metodologia. O TRIZOL é um dos

produtos comerciais mais utilizados para esse fim. Ele consiste de uma solução monofásica

de fenol e guanidina isotiocianato que atua provocando a lise das células mantendo a

integridade do RNA. A vantagem da utilização deste método é o maior rendimento em

relação a quantidade de RNA resgatado. A principal desvantagem é a possibilidade de

contaminação do RNA com DNA genômico, uma vez que a separação do RNA é realizada

manualmente, independente do uso de coluna. Diversos trabalhos na literatura, utilizam o

54

TRIZOL para a extração de RNA de amostras tumorais para avaliar a expressão de genes por

RT-qPCR, inclusive em osteossarcoma30, 33, 84-86.

Ao avaliarmos a qualidade do RNA extraído por TRIZOL, nos deparamos com a maior

parte das amostras apresentando o RNA de parcialmente a totalmente degradado. Com o

intuito de obter um RNA de melhor qualidade, optamos por re-extrair algumas amostras por

meio de um kit comercial de extração de RNA. O kit de extração é um método rápido de

isolamento e purificação do RNA baseado no processo de colunas cromatográficas utilizando

uma resina como matriz de separação. A vantagem deste método é que o RNA purificado

apresenta alta pureza, mas a principal desvantagem é o menor rendimento em termos de

quantidade de RNA. Mesmo com a utilização do kit de extração, nossos resultados

mostraram que não houve melhora significativa na qualidade do RNA extraído (p=0,164).

A integridade do RNA extraído, comumente é avaliada por meio de gel de agarose,

porém, essa técnica é subjetiva e pouco reprodutível87. De maneira crescente na literatura, o

padrão ouro para avaliar a integridade do RNA tem sido a utilização do Bioanalyzer, um

equipamento capaz de separar pequenas quantidades de RNA de acordo com o seu peso

molecular em canais presentes em um chip, para então serem analisadas por fluorescência.

O resultado é dado através de uma curva de eletroesferograma e um algoritmo denominado

RIN (RNA Integrity Number) que indica a qualidade do RNA87, 88.

Para muitas técnicas utilizadas nos estudos de expressão gênica o RNA intacto é

essencial, mas de acordo com alguns autores, recomenda-se um valor de RIN superior a 5

como requisito mínimo para uma quantificação por RT-qPCR de sucesso e de confiança87-89.

Além disso, a utilização de iniciadores e sondas para a amplificação de fragmentos menores

do que 100pb associados a análise de PCR em tempo real, no nosso caso, permitiu a

utilização de amostras com RIN> 4, com resultados satisfatórios para as análises de

expressão dos genes como demonstrado em nossos resultados.

Uma vez que as amostras apresentam um certo grau de degradação, outro ponto

importante é a quantificação do RNA, a qual inicialmente foi realizada por

espectrofotômetro (NanoVue). Ao avaliarmos a expressão dos normalizadores, detectamos

uma variação na expressão desses genes, com um desvio padrão muito alto. Isso nos levou a

realizar a quantificação do RNA pelo método de fluorescência (Qubit), já que o

espectrofotômetro é menos específico uma vez que qualquer partícula na solução poderá

influenciar na leitura e fornecer concentrações superestimadas.

55

A partir dessa nova quantificação, notamos que a concentração de RNA fornecida pelo

Qubit era menor do que a indicada pelo espectrofotômetro, explicando em parte, o alto

desvio padrão encontrado na avaliação da expressão dos normalizadores. Sendo assim,

concluímos ser a melhor opção a quantificação obtida pelo Qubit e dessa forma, observamos

uma menor variação para um dos normalizadores (ACTB). Com essa estratégia podemos

afirmar que a variação de expressão dos genes avaliados entre as amostras é real e não foi

gerada a partir de artefatos (diferença na quantidade de RNA) devido a degradação das

amostras.

6.2 Caracterização das amostras

Nos últimos 25 anos, notou-se uma melhora significativa no prognóstico de pacientes

com OS, principalmente naqueles com doença localizada. Com a associação da

quimioterapia a cirurgia e com regimes de quimioterapia utilizando multidrogas, e doses

mais elevadas, a sobrevida em 5 anos desses pacientes aumentou de forma progressiva até

a década de 80. No entanto, estudos publicados após essa década, mostraram que não

houve melhoras significativas na sobrevivência de pacientes com OS e destacam a

importância de uma nova estratégia na gestão sistêmica dessa condição ainda muito letal90,

91.

Pelo amplo espectro de apresentação e prognósticos distintos observados no

tratamento do OS, diversos fatores epidemiológicos, clínico-patológicos e marcadores

biológicos têm sido buscados para melhor predizer a evolução dos pacientes e estimar sua

sobrevida10, 92-94.

Entre os fatores reconhecidos com importância prognóstica destacam-se: tamanho

do tumor94, localização e resposta à quimioterapia neodajuvante17, 95. Outros fatores

prognósticos desfavoráveis já foram descritos em alguns estudos e incluem: presença de

doença metastática ao diagnóstico17, 34, 94, 96, tumores volumosos97, idade inferior a 10 anos e

sexo masculino10, 12, 93.

O perfil dos pacientes descritos no nosso trabalho quanto aos fatores prognósticos,

não difere dos padrões observados em outros estudos publicados, com exceção do sexo,

pois na maioria dos estudos, o sexo masculino costuma ser o mais frequentemente

afetado17, 98. Assim, dos 36 pacientes incluídos no estudo, a maior frequência do

osteossarcoma foi no sexo feminino (55,6%), e segundo Mirabello et al.1 que avaliou a

56

incidência e a sobrevida dos pacientes com OS de 1973 a 2004, também encontrou a maior

frequência no sexo feminino. Apesar de alguns autores considerarem o sexo masculino

como um prognóstico desfavorável10, 12, 93, a sobrevida global e a sobrevida livre de eventos

em 5 anos foi maior para o sexo masculino, mas nossa análise não demonstrou resultado

significativo que nos permitisse corroborar estes achados.

Em relação à idade ao diagnóstico, 29 (80,6%) possuíam idade igual ou superior a 10

anos. A média de idade foi de 15 anos, o que condiz com os dados da literatura. Apesar da

média de idade ao diagnóstico ser muito variável na maioria dos estudos17, 95, 99, 100, os dados

reafirmam que o maior pico de incidência desta doença é na segunda década de vida1, 101, 102.

A idade como fator prognóstico na literatura é muito controversa. Pacientes com menos de

14 anos e mais de 40 anos, segundo dois grandes estudos retrospectivos, apresentaram

sobrevidas inferiores12, 103. Entretanto, em um estudo retrospectivo, multicêntrico, com 2680

pacientes de 10 centros de pesquisa do mundo, demonstrou que a idade não foi um

marcador prognóstico93. No Brasil, em um estudo com 225 pacientes, a idade não mostrou

ser um fator prognóstico17. No nosso estudo, a idade não impactou a sobrevida dos

pacientes.

O osteossarcoma pode acometer qualquer osso do esqueleto axial ou apendicular do

corpo humano, mas preferencialmente acomete as metáfises dos ossos longos, como fêmur

distal, tíbia e úmero proximais. Neste trabalho, a grande maioria 91,7% (33/36) apresentou

comprometimento de ossos longos, principalmente fêmur e tíbia, seguido do úmero, além

do predomínio da histologia clássica, corroborando os dados da literatura17, 90, 95. De acordo

com a literatura, tumores axiais possuem um pior prognóstico quando comparados com os

de extremidades, principalmente pela dificuldade de ressecção total do tumor axial.

Osteossarcoma de pelve, coluna e tórax tem uma sobrevida de apenas 20-40% quando

comparado com o de extremidades (60-70%)12, 104, 105. Em nosso trabalho, não temos

tumores localizados em região do esqueleto axial, não sendo possível realizar essa

associação com a sobrevida dos pacientes. Entretanto, nossos dados sugerem que mesmo

considerando apenas o esqueleto apendicular, a presença de tumor em região femural

apresenta SG e SLE aproximadamente 30% menor em 5 anos, comparados aos tumores

localizados em tíbia, fíbula e úmero.

Historicamente, acreditava-se que os subtipos histológicos clássicos de

osteossarcoma (osteoblástico, fibroblástico e condroblástico) apresentavam mesmo

57

comportamento. No entanto, há dados que sugerem que o osteossarcoma condroblástico

esta associado a pior resposta à quimioterapia em comparação com outros subtipos e,

portanto, está associado a um mau prognóstico106. Nossos resultados não encontraram

significância estatística, mas podemos notar que os pacientes que apresentaram uma pior

sobrevida global e livre de eventos estavam no grupo do condroblástico/fibroblástico/

telangectásico. Das oito amostras deste grupo, cinco são do subtipo condroblástico e desses

80% (4) tem resposta pobre a quimioterapia (grau de Huvos 1/2), o que parece corroborar

os dados da literatura. Para o paciente restante, esse critério não se aplicou pois não foi

submetido a cirurgia.

No tratamento do osteossarcoma, o grau de Huvos refere-se ao grau de necrose

tumoral em resposta à quimioterapia neo-adjuvante107. É considerado pela literatura como

um fator prognóstico muito importante na sobrevida dos pacientes com osteossarcoma92, 93,

97. O grau de Huvos é avaliado em porcentagem na análise histopatológica da peça cirúrgica

do paciente, após o início do tratamento. É uma avaliação direta e objetiva da eficácia do

tratamento quimioterápico. No nosso estudo, em relação ao grau de resposta à

quimioterapia encontramos que dos 36 casos, apenas 2 não foram avaliados, pois os

pacientes não foram submetidos à cirurgia pós quimioterapia. Assim, para aqueles em que

esse parâmetro estava disponível, 35,3% (12/34) dos casos foram classificados como grau 1

e 41,17% (14/34) grau 2, ou seja, ~ 76,5% dos casos apresentou resposta pobre à

quimioterapia (índice de necrose tumoral menor ou igual a 90%). Do restante, 17,64%

(6/34) apresentaram grau 3 e 5,88% (2/34) grau 4 e foram classificados com boa resposta à

quimioterapia (necrose tumoral maior que 90%). Para análise estatística, o grau de Huvos foi

dividido em duas categorias: boa resposta à quimioterapia (grau 3 e 4) com somente 22,5 %

(8/34) dos casos e pobre resposta à quimioterapia (grau 1 e 2) com 76,4% (26/34) dos casos.

De acordo com a literatura, pacientes que alcançam pobre resposta ao tratamento,

apresentam uma pior sobrevida quando comparado aos pacientes com boa resposta17, 108.

No nosso estudo, o grau de Huvos não foi associado a sobrevida dos pacientes, mas

podemos observar que a sobrevida global e livre de eventos foi maior em pacientes que

responderam melhor ao tratamento (grau 3/4).

Em relação ao tamanho do tumor, alguns estudos demonstraram que ele pode se

correlacionar com o prognóstico: tumores maiores foram associados com estimativas

inferiores de sobrevida109, 110. Tumores maiores que 10 cm tem sido associados com resposta

58

pobre ao tratamento em alguns estudos111, 112. Outros associaram tamanhos maiores que

12cm17. Entretanto, existe uma dificuldade em se estabelecer um ponto de corte onde a

partir de um tamanho, essa variável se torne importante para indicar o prognóstico dos

pacientes. Isto se deve às diversas técnicas utilizadas na mensuração do tamanho do tumor

e somado a isso, o uso de diferentes modalidades de imagem como a radiografia

convencional, a tomografia computadorizada e a ressonância magnética108. No nosso

estudo, o ponto de corte selecionado foi 12 cm, de acordo com o GBTO17 e o método

utilizado para a mensuração do tamanho do tumor foi preferencialmente a ressonância

quando disponível, seguido pela tomografia e radiografia, neste caso quando apenas este

exame estava disponível. No nosso trabalho, o tamanho do tumor não foi um fator

prognóstico e podemos observar que pacientes com tumores maiores que 12 cm

apresentam uma melhor sobrevida global e livre de eventos. Apesar de ter sido avaliado

pelo mesmo radiologista, esse achado pode ser explicado pelo fato de utilizarmos diferentes

métodos/exames de imagem para determinar o tamanho de tumor ao diagnóstico. A

radiografia convencional proporciona ao radiologista uma menor precisão para a

mensuração do tamanho do tumor, o que pode ter subestimado o tamanho de tumor de

alguns pacientes (9/28). Ainda, para 8 dos 36 pacientes não havia disponível qualquer exame

de imagem para a determinação do tamanho do tumor, o que restringiu a nossa

amostragem para a análise deste aspecto.

A presença de doença metastática tem sido considerada como fator prognóstico, e

menos de 20% dos pacientes têm sobrevida livre de doença em 5 anos12. Em relação à

sobrevida global e livre de eventos de pacientes metastáticos e não metastáticos ao

diagnóstico, nossos dados são comparáveis aos dados da literatura1,17 e podemos ver

claramente que a doença metastática ao diagnóstico confere ao paciente uma sobrevida

significativamente menor quando comparado ao não metastático.

6.3 Expressão dos lncRNAs em osteossarcoma

Devido a raridade da doença, a maioria dos trabalhos que tem por objetivo estudar

alterações moleculares em osteossarcoma tem à disposição casuísticas restritas em torno de

20 a 50 pacientes30, 33, 85, 99, 111, 112. Em nosso caso, apesar da disponibilidade de 175 amostras

de tecido tumoral congelado de osteossarcoma, optamos por ser estringentes nos critérios

de inclusão destas amostras no estudo, principalmente no que diz respeito à qualidade do

59

RNA. Dessa forma, minimizamos a introdução de viés nas análises de expressão gênica,

devido à baixa qualidade do RNA, garantindo que o resultado obtido é fidedigno e reflete a

real expressão destes genes nas amostras avaliadas. Diversos trabalhos que avaliam a

expressão gênica em OS não descrevem a utilização de tais critérios em suas análises63, 99, 113,

114.

6.3.1 Correlação da expressão do BCYRN1 com as características clínico-patológicas e

sobrevida

O BCYRN1 é um RNA não codificador seletivamente expresso no sistema nervoso

central de primatas e foi identificado em domínios somatodendríticos de um subconjunto de

neurônios80.

Na literatura, estudos avaliando a expressão de BCYRN1 em tumores humanos são

escassos. Um dos primeiros estudos apenas avaliou a expressão de BCYRN1 em 19 tipos

diferentes de tumor e revelou sua maior expressão nos carcinomas de mama, colo do útero,

esôfago, pulmão e ovário, mas não nos tecidos normais correspondentes80. Posteriormente,

outro grupo avaliou a expressão de BCYRN1 em tecido mamário normal em relação a

carcinomas ductais in situ de baixo grau, alto grau e carcinomas invasivos. Os resultados

mostraram que o BCYRN1 não é expresso em mama normal e não tem expressão

significativa em carcinomas ductais in situ de baixo grau, em contrapartida, está altamente

expresso em carcinomas ductais in situ de alto grau e em todos os carcinomas invasivos. A

alta expressão deste gene foi sugerida como marcador de invasividade, diagnóstico e

prognóstico no câncer de mama. A superexpressão do BCYRN1 nestes tumores pode ser

usada como indicador de progressão tumoral43. Portanto, apesar de poucos relatos, os

primeiros estudos avaliando a expressão deste gene demonstram evidências de que sua

maior expressão ocorre nos tecidos tumorais e, ainda que essa expressão está associada

com a agressividade do tumor, visto que sua maior expressão foi observada nos subtipos de

alto grau e invasivos.

Nós não encontramos na literatura estudos que avaliaram a expressão de BCYRN1 em

osteossarcoma. No nosso estudo, quando comparamos a média de expressão de BCYRN1

entre as características avaliadas apenas encontramos associação em relação a idade. Os

tumores de pacientes com > a 10 anos tem maior expressão do gene comparado ao grupo

menor do que 10 anos (p=0,036). Não houve associação estatisticamente significativa com

60

as outras características avaliadas (tabela 6). Em relação ao padrão de expressão do gene

(análise categórica) nossos resultados demonstraram que alta expressão está associada com

os subtipos condroblástico, fibroblástico ou telangectásico (p=0,046 – Tabela 12). Como já

descrito anteriormente, a literatura aponta o subtipo condroblástico associado a resposta

pobre ao tratamento e pior prognóstico. Apesar de não significativo, nossos dados apontam

que pacientes com este subtipo tumoral apresentam estimativas de SG e SLE 30% menores

quando comparados ao osteoblástico (SG: 33,3% vs 57,0% p=0,225 e SLE: 28,6 vs 59,2 p=0,1,

respectivamente). Nossos dados podem ser as primeiras evidências de que a expressão

deste gene pode estar associado a um pior prognóstico dos pacientes com OS.

Apesar de não significativos, outros achados reforçam esta hipótese. Por exemplo,

pacientes pouco responsivos ao tratamento (Huvos 1/2) apresentaram expressão em média

três vezes maior de BCYRN1 em relação aos que tem boa resposta (Huvos 3/4). Além disso,

pacientes metastáticos ao diagnóstico e com metástase durante o tratamento apresentaram

em média duas vezes e quatro vezes, respectivamente, maior expressão de BCYRN1 quando

comparados aos não metastáticos (Tabela 6). Os pacientes que apresentaram maior

expressão do gene tiveram estimativas de SG e SLE 20% menor em 5 anos em relação aos

que tiveram baixa expressão (SG: 40,4 vs 59,4 p=0,295 e SLE: 40,2 vs 61 p=0,313,

respectivamente).

Embora a maioria das análises não sejam significativas, esses dados em conjunto

apontam para uma possível associação entre a maior expressão do BCYRN1 como um

potencial marcador de pior prognóstico nos pacientes com osteossarcoma. Sendo assim, a

expressão e função deste gene merece uma investigação mais profunda em OS.

6.3.2 Correlação da expressão do HOTAIR com as características clínico-patológicas e

sobrevida

Relatos sugerem que o HOTAIR atua na regulação epigenética pelo recrutamento de

complexos remodeladores de cromatina (polycomb repressive complex 2) sobre sequências

alvo específicas que culmina na supressão de diversos genes44. Recentemente, foi

demonstrado que o aumento de expressão de HOTAIR, induzido por TGF-β1, regula a

ativação do processo de transição epitélio-mesenquima (TEM) em linhagens celulares de

carcinoma colorretal e de mama115. TEM é um importante processo que permite as células

epiteliais desativarem as ligações intercelulares e adquirir propriedades mesenquimais como

61

capacidade migratória aumentada e potencial metastático116. Também foi demostrado que a

ativação da via de sinalização de TGF-β promove a transição epitélio-mesenquima, aumento

de mobilidade celular e invasão na linhagem celular de osteossarcoma U2OS117 e que, a

inibição dessa via resulta no bloqueio do crescimento do tumor primário e o

desenvolvimento de metástases pulmonares em OS118. Apesar de sua função ainda não ter

sido explorado em OS, esses relatos podem indicar um potencial papel funcional do HOTAIR

em OS.

De fato, o aumento de expressão de HOTAIR tem sido associado a presença de

metástases e pior prognóstico em diversos tipos tumorais64, 119-121. Por exemplo, um dos

primeiros relatos a avaliar a expressão de HOTAIR em tumores humanos, demonstrou que a

superexpressão de HOTAIR em tumores primários de mama está associado ao

desenvolvimento de mestástase e menor sobrevida global64. Em tumores primários de

pulmão não pequenas células a alta expressão de HOTAIR foi relacionada com uma

sobrevida significativamente menor dos pacientes119. Em relação a sobrevida, o mesmo foi

observado para carcinoma escamoso de esôfago, além da maior expressão de HOTAIR

também estar associada a um maior tamanho do tumor, estadiamento clínico mais

avançado, presença de metástase linfonodal e menor grau de diferenciação histológica120.

Em tumores gástricos, também foi descrita associação entre alta expressão de HOTAIR com

presença de metástase linfonodal e estágio avançado da doença121.

Apesar de todos esses achados que evidenciam a expressão de HOTAIR como um

marcador de metástase e pior prognóstico, interessantemente, um estudo recente em

tumores de mama demonstrou que não houve correlação significativa entre a

superexpressão do HOTAIR com as características clínico-patológicas avaliadas. Ainda, de

forma surpreendente demonstrou na análise multivariada que pacientes com maior

expressão do HOTAIR tiveram menor risco de recidiva e morte, quando comparados àqueles

com baixa expressão. Sendo assim, os autores sugerem que a expressão do HOTAIR pode

não ser um marcador independente de prognóstico, sendo necessários estudos

independentes de validação em tumores de mama122.

Em relação aos sarcomas, um trabalho avaliou a expressão de HOTAIR em tumores

primários e em metástases. Os autores demonstraram que menores níveis do HOTAIR foram

associados com boa resposta ao tratamento. Neste mesmo estudo, a alta expressão do

62

HOTAIR foi relacionada a uma maior probabilidade de presença de metástases123. Em

relação a avaliação da expressão deste gene em OS, nada foi encontrado.

No nosso estudo, quando a expressão do HOTAIR foi considerada como uma variável

numérica, não encontramos associação significativa entre a média de expressão de HOTAIR

e as características epidemiológicas e clínico-patológicas avaliadas. Apesar disso, vale a pena

destacar nesta análise que a expressão de HOTAIR foi em média 5,4 vezes maior em

pacientes com resposta pobre ao tratamento (Huvos 1/2) comparado aos bons

respondedores (Huvos 3/4) (p=0,256 – Tabela 7), o que parece estar em concordância com

os achados em relação a expressão deste gene em sarcomas123.

Em relação a análise categórica de expressão do HOTAIR, nossos dados demonstraram

que dos pacientes que apresentavam alta expressão do gene, 75% tinham tumores

inferiores a 12cm (p=0,049 – Tabela 13). Na literatura, esse dado é um pouco controverso,

uma vez que alguns estudos descrevem que não há associação significativa entre alta

expressão do HOTAIR e o tamanho do tumor64, 122, 123, enquanto outros estudos descrevem

essa associação120, 124, 125. De qualquer forma, esse achado deve ser avaliado de forma

cuidadosa, uma vez que para essa característica não foi possível resgatar a informação em

oito pacientes e, ainda, do restante há uma variação nos exames utilizados para a

determinação do tamanho tumoral, como descrito anteriormente. Em relação as análises de

sobrevida, ainda que não significativo, a SG e SLE nos pacientes que apresentaram alta

expressão do gene foi inferior quando comparado com aqueles que tiveram baixa expressão

(SG: 40,6% vs 64,8% p=0,242; SLE: 41,3% vs 62,3% p=0,224, respectivamente).

Mesmo que não significativos, nossos dados demonstraram que a maior expressão do

HOTAIR pode ser observada em pacientes que respondem pior ao tratamento e que

apresentam menores estimativas de sobrevida, também podendo ser um potencial

biomarcador de prognóstico em OS. Da mesma forma, a expressão e função deste gene

merece uma investigação mais abrangente em OS.

6.3.3 Correlação da expressão do HULC com as características clínico-patológicas e

sobrevida

Ao avaliarmos a expressão do HULC, não encontramos nenhuma associação

significativa com as variáveis clínico-patológicas estudadas. Podemos notar que mesmo não

obtendo resultados significativos, a maior média de expressão dos genes estava relacionada

63

com pacientes considerados bons respondedores (grau 3 e 4), com idade igual ou superior a

10 anos e com ausência de metástase ao diagnóstico. Quando avaliamos as mesmas

variáveis após categorização da expressão, notamos que a maioria dos pacientes que

apresentaram alta expressão do gene pertencia ao tipo histológico osteoblástico, com idade

igual ou superior a 10 anos (p=0,088) e com ausência de metástase ao diagnóstico (p=0,180).

De acordo com a literatura, no câncer pancreático a alta expressão do HULC foi

associada ao tamanho do tumor, metástase linfonodal e invasão vascular79. No câncer

gástrico, a alta expressão deste gene também foi relacionada com a presença de metástase

linfonodal, metástase à distância e ao estadio mais avançado da doença. Foi observado os

efeitos da superexpressão e do “knockdown” da expressão do HULC e determinou-se que

este gene desempenha um papel importante na proliferação, migração, invasão e na

inibição da apoptose. Neste estudo não foi encontrada associação do gene com outros

fatores clínico-patológicos como idade, sexo, tamanho do tumor, localização e diferenciação

do tumor78.

No carcinoma hepatocelular, a expressão tecidual e plasmática de HULC estava

aumentada entre pacientes com hepatocarcinoma e um grupo controle. Além de serem

constatados níveis significativamente maiores de HULC no tecido/plasma de pacientes com

hepatocarcinoma, houve relação direta entre os valores de expressão do HULC e outras

variáveis, como o grau de diferenciação histológica. Estes resultados sugerem um potencial

uso deste RNA como biomarcador diagnóstico e/ou prognóstico. Além disso, sua expressão

foi maior quando comparada com tecidos normais do fígado e mostrou que a expressão

deste gene pode estar associada com a agressividade e a progressão do tumor77.

Na literatura, não encontramos relatos sobre a expressão do HULC em amostras de

osteossarcoma. No nosso trabalho, não encontramos nenhum correlação significativa entre

a expressão deste gene e um pior prognóstico, como sugere a literatura.

6.3.4 Correlação da expressão do MALAT1 com as características clínico-patológicas e

sobrevida

MALAT1 foi o primeiro lncRNA associado com um alto potencial metastático e pior

prognóstico em um estudo avaliando pacientes portadores de câncer de pulmão de não

pequenas células com ou sem metástase. MALAT1 mostrou estar superexpresso em muitos

64

tumores sólidos, dentre eles, mama, próstata, cólon, fígado, útero, hepatocarcinoma,

pâncreas e osteossarcoma57, 58, 126-128.

No nosso estudo, a maior expressão do MALAT1 foi associada significativamente a

pacientes com idade igual ou superior a 10 anos quando analisamos a média da expressão

(p=0,048), e após a categorização da expressão (p=0,008). Na literatura, não encontramos

associação significativa deste gene com a idade63, 129-132.

Apesar de não encontrarmos associação significativa com as demais características

clínico-patológicas, observamos uma maior expressão do MALAT1 em pacientes do sexo

masculino, em tumores localizados na fíbula, tíbia ou úmero. MALAT1 se mostrou com uma

expressão um pouco aumentada em pacientes não metastáticos quando avaliamos a

presença de metástase independente do momento diagnosticado. Entretanto, após a

estratificação dos pacientes metastáticos, pudemos observar que a maior expressão do gene

ocorre nos tumores de pacientes que desenvolvem metástase durante o tratamento. Além

disso, observamos também que a maioria dos pacientes com baixa expressão não obtiveram

boa resposta à quimioterapia (grau 1/2).

O mecanismo de ação molecular do MALAT1 é ainda muito discutido. Em linhagem de

células tumorais humanas, a inibição de MALAT1 suprimiu a migração e invasão57. Ao injetar

em camundongos, xenoenxertos de células tumorais de câncer de pulmão não pequenas

células, a formação e o crescimento dos tumores se mostraram prejudicada com a

diminuição da expressão do MALAT1130. Diversos estudos têm mostrado uma forte

associação da superexpressão do MALAT1 com a presença de metástase e um prognóstico

ruim57, 63, 99, 129-132.

Um estudo pioneiro com MALAT1 propôs identificar diferenças na expressão gênica

entre tumores de pulmão não pequenas células que metastatizaram ou não e encontrou

uma expressão maior (cerca de três vezes mais) nas amostras de pacientes que

desenvolveram metástases, além da drástica piora na sobrevida global57.

A superexpressão de MALAT1 foi avaliada em amostras de tumores como mieloma

múltiplo e revelou que este lncRNA possui um papel na patogênese da doença e que a

alteração na expressão desse gene depois do tratamento foi clinicamente significativa e

pode servir como um preditor molecular dos pacientes em risco de progressão precoce.

Além disso, este estudo revelou que pacientes com menor expressão do MALAT1 tinham

65

significativamente maior sobrevida livre de progressão em comparação com os pacientes

com uma menor alteração na expressão62.

Em osteossarcoma, um estudo que teve como objetivo demonstrar a associação entre

os níveis de expressão de MALAT1 e características clínico-patológicas encontrou que a

expressão do gene nos tecidos tumorais foi significativamente maior do que em tecidos

normais; a presença de metástases pulmonares e acometimento linfonodal foram

significativamente mais comuns no grupo de maior expressão; não houve associação entre a

expressão do gene e o sexo, tamanho do tumor e sobrevida em 5 anos, e em relação a

idade, o grupo com maior expressão do MALAT1 foi o mais jovem (em média, 16 anos)

(p=0,05). Neste estudo, o autor concluiu que o osteossarcoma apresenta expressão elevada

de MALAT1 e que o nível de expressão associa-se a uma maior probabilidade de desenvolver

metástases pulmonares e acometimento linfonodal63. Outro estudo em osteossarcoma

mostrou que a expressão do MALAT1 foi significativamente maior no grupo de maus

respondedores ao tratamento quimioterápico, mas não encontrou associação com a

sobrevida global e livre de eventos, assim como no nosso estudo99.

6.4 Limitações do estudo

Como podemos observar, para a maioria das análises desenvolvidas em nosso estudo

não foi possível encontrar associações significativas indicando o papel prognóstico destes

genes em OS. Entretanto, uma limitação do nosso projeto foi o pequeno número de

amostras (36) que pôde ser avaliado, uma vez que temos no biobanco da instituição

amostras tumorais congeladas provenientes de 175 pacientes (os motivos da exclusão

dessas amostras já foi descrito anteriormente). Uma parte considerável dessas amostras foi

excluído devido aos restringentes critérios de qualidade determinados para que as amostras

fossem utilizadas em nossas análises. Em contrapartida, esses critérios nos permitem afirmar

com segurança, que nossos dados refletem com fidelidade a expressão destes genes em OS.

Somado a essa pequena amostragem, temos o fato de que 35% dos pacientes

apresentam um tempo de seguimento menor do que dois anos, o que pode não ser tempo

suficiente para um paciente acometido por OS apresentar metástase ou óbito.

Reconhecemos tais limitações e sugerimos que o aumento da amostragem,

principalmente com a inclusão de pacientes com um tempo maior de seguimento pode nos

revelar o real papel prognóstico destes genes em OS.

66

7 CONCLUSÕES

Não houve diferença em termos de qualidade na extração do RNA entre o TRIZOL e

método comercial baseado em coluna;

A quantificação das amostras utilizando o Qubit é mais precisa e deve ser utilizada nas

análises de expressão gênica quando o RNA apresenta degradação parcial;

A maior expressão de BCYRN1 foi associada significativamente a pacientes com idade

acima de 10 anos e com o subtipo condroblástico/fibroblástico/telangectásico;

A expressão de HOTAIR não tem associação significativa com as características clínico-

patológicas avaliadas;

A expressão de HULC não tem associação significativa com as características clínico-

patológicas avaliadas;

A maior expressão de MALAT1 foi associada significativamente a pacientes com idade

acima de 10 anos;

As expressões de BCYRN1, HOTAIR, HULC e MALAT1 não foram significativamente

associadas a SG e SLE dos pacientes.

67

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78

Anexo A – Ficha de coleta de dados

O1

Identificação 11

22

Nome

22

33

Registro Hospitalar

33

44

Sexo 1- Feminino; 2- Masculino

44

55

Data de nascimento DD/MM/AAAA

55

66

Categoria 1- SUS; 2- Convênios; 3- Outros____________

66

77

Raça 1- Branco; 2- Negro; 3- Pardo; 4- Amarelo; 99- Ignorado

77

88

Naturalidade – Cidade DESCREVER

88

99

Naturalidade – UF DESCREVER

99

110

Estado Civil 1- Solteiro; 2- Casado / União estável; 3- Separado; 4- Viúvo; 99- Ignorado

110

111

Atividade profissional DESCREVER

111

112

Departamento que o atende na nossa instituição DESCREVER

112

113

Origem do paciente 1- Clínica particular; 2- Rede pública; 3- Por conta própria; 99- Ignorado

113

114

Data do primeiro atendimento em nosso serviço DD/MM/AAAA

114

115

Data do diagnóstico DD/MM/AAAA

115

HEMOGRAMA HCB

116

HB

116

117

HT

117

118

Leucócitos

118

119

Neutrófilos

119

220

Plaquetas

220

TRATAMENTO HCB

221

Revisão diagnóstica 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

221

222

AP Revisão DESCREVER

222

223

Modificação diagnóstica 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

223

224

Biópsia 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

224

225

Data da biópsia DD/MM/AAAA

225

226

Local do tumor DESCREVER

226

79

227

Data em que recebeu o primeiro tratamento DD/MM/AAAA

227

228

Quimioterapia neoadjuvante 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

228

229

Protocolo quimioterapia neoadjuvante DESCREVER

229

330

Mudança protocolo quimioterapia neoadjuvante 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

330

331

Motivo da interrupção / Não seguimento no protocolo – Quimioterapia neoadjuvante

1- Crescimento do tumor após indução; 2- Ulceração / Sangramento do tumor;

3- Dor intratável; 4- Outros ____________

331

332

Quimioterapia adjuvante 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

332

333

Protocolo quimioterapia adjuvante DESCREVER

333

334

Mudança protocolo quimioterapia adjuvante 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

334

335

Motivo da interrupção / Não seguimento no protocolo – Quimioterapia adjuvante

1- Crescimento do tumor após indução; 2- Ulceração / Sangramento do tumor;

3- Dor intratável; 4- Outros ____________

335

336

Radioterapia 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

336

337

Cirurgia 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

337

338

Data da cirurgia DD/MM/AAAA

338

339

Tipo de Cirurgia 1- Urgente; 2- Eletiva; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

339

440

Tipo de ressecção 1- Com preservação do membro; 2- Sem preservação do membro

(amputação); 88- Não se aplica; 99- Ignorado

440

441

Se realizou cirurgia, qual resultado? 1- Completamente ressecado com margens livres;

2- Completamente ressecado com margens comprometidas; 3- Ressecção incompleta

441

442

Reconstrução 1- Biológica; 2- Mecânica; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

442

443

Complicações cirúrgicas 0- Não; 1- Sim; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

443

444

Infecção de ferida operatória 0- Não; 1- Sim, precoce (até 30 dias); 2- Sim, tardia; 88- Não se aplica; 99-

Ignorado

444

445

Eventos tromboembólicos 0- Não; 1- TVP; 2- TEP

445

446

Deiscência de ferida operatória 0- Não; 1- Sim, sem necessidade de reabordagem; 2- Sim, com necessidade

de reabordagem; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

446

447

Tipo histológico DESCREVER

447

448

Huvos (Aplicavel apenas para Osteossarcoma) 1- Grau 1; 2- Grau 2; 3- Grau 3; 4- Grau 4; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

448

80

449

Estadiamento utilizado

449

550

Metástases 0- Ausentes; 1- Presentes

550

551

Data da metástase DD/MM/AAAA

551

552

Local da metástase - Pulmão 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

552

553

Local da metástase - Ossos 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

553

554

Local da metástase - Medula Óssea 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

554

555

Local da metástase - SNC 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

555

556

Local da metástase – Outro local 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

556

557

Cirurgia de tórax 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

557

558

Data da cirurgia de tórax DD/MM/AAAA

558

559

DHL

559

660

Data da última informação / óbito DD/MM/AAAA

660

661

Status 1- Vivo sem doença; 2- Vivo com doença; 3- Óbito por câncer; 4-

Óbito por outra doença

661

662

Perdeu seguimento (tempo do retorno x 2) 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado

662

OBS.:

81

Anexo B – Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Câncer de Barretos e do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Universidade de São Paulo.

Vanessa Regina Maciel Uzan A EXPRESSÃO GÊNICA DOS … · A Deus, pelo dom da vida, de amar e me...

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