VALIDATION ANALYTIQUE

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© Patrick Séraissol

I-GENERALITES

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PROBLEMATIQUES� Demande croissante en résultats d’analyses

dans différents domaines:

-Environnemental (polluants eaux, sols…)

-Agro-alimentaire (sécurité aliments…)

-Pharmaceutique (contrôle qualité)

-Médico-légal (expertise)

-Industrie en général (Qualité des résultats)

�Garantir la fiabilité et la traçabilité des résultats

Mise en place d’une organisation pour répondre à ce besoin

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HISTORIQUE

• 1990-Conférence de Washington sur la validation des méthodes bioanalytiques

• 1992-Conférence de Barcelone

• 1994-Conférence de Munich

• 1997-Commission SFSTP (Société Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques)

• 1999-Meeting Bioval99 à Londres

• 2000-Groupe de travail à Crystal City (Food and Drug Administration-FDA)

• 2005-Groupes de travail internationaux

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REFERENTIELS• FDA (CDER Décembre 1998)« Guidance for Industry-Bioanalytical Methods Validation for Human Studies »

• FDA (CDER Mai 2001)« Guidance for Industry-Bioanalytical Methods Validation… » �intégration de l’immunologie et de la

microbiologie

• Texte ICH (International Conference on Harmonisation-www.ich.org)-Q2A Validation des procédures analytiques: Définitions et terminologie (1995)

-Q2B Validation des méthodes analytiques : Méthodologies (1997)

-Annexe (Q1A,B et C�Stabilité; Q3A,B et C�impuretés; Q6A et B�Spécification

• STP PHARMA Pratiques

-(1992) 2, 4, 205-226 Méthodologies

-(1992) 2, 4, 227-239 Exemple d’application

-(2003) 13, 3, 101-138 Harmonisation des approches

-(2006) 16, 1, 30-60 Statistiques

• Normes (ISO 5725…)

• EMEA European Medicines Agency (06/09/2011) – applicable au 01/02/2012

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REFERENTIELS

© Patrick SéraissolVALI

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DEFINITIONS

�Bioanalyse

Dosage de substances actives au sein de matrices biologiques

(plasma, sérum, sang total, tissus) en vue d’établir

des paramètres pharmacocinétiques ou bien

d’analyser des substances toxiques.

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DEFINITIONS�Validation Analytique

• ICH (International Conference on Harmonisation)

Le but de la validation d’une procédure d’analyse est de démontrer qu’elle correspond à l’usage pour lequel elle est prévue.

�Relie une procédure à une application.

•USP (Unated States Pharmacopeia)

La validation d’une méthode analytique est le procédé par lequel il est établi que les performances de la méthode correspondent aux exigences requises par l’application prévue.

�Normes réglementaires ou fait par les firmes.

•FDA (Food and Drug Administration)

Valider, c’est établir à l’évidence, avec un degré de confiance élevé et sous forme documentée, qu’un procédé déterminé permet d’obtenir un produit (ou un service) qui atteint effectivement des spécifications définies à l’avance.

�Indication de statistique et de rapport d’analyse.

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OBJECTIFS

�Démontrer les performances de la procédure de dosage pour l’application prévue (prouver que les résultats obtenus sont fiables, ceci dans des limites bien définies).

�Maitrise des étapes critiques de la procédure (mettre en exergue les points critiques)

�Résolution en amont de problèmes analytiques

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QUE VALIDER???VALI

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QUAND VALIDER???VALI

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GENESE D’UNE VALIDATIONVALI

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Ex de mise en œuvre de validation

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Limites d’acceptationVALI

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II -VALIDATION

d’une procédure d’analyse

physicochimique

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validation analytique

ETUDE SCIENTIFIQUE DE LA FIABILITE D’UNE METHODE

OBJECTIFS REGLEMENTAIRESRôle important dans les études pharmacocinétiques, de métabolisme, de bioéquivalence

SCIENTIFIQUES

Garantir la fiabilité d’une méthode (précise et exacte)

INDUSTRIEL

Choix des protocoles d’analyse (minimiser les coûts avec des méthodes optimisées)

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Finalités o Description claire de la procédure d’analyse

« MODE OPERATOIRE NORMALISE »

o Mode de prélèvement de l’échantillon

o Appareillage

o Description précise des modalités de préparation de l’échantillon, des conditions d’analyse, des précautions opératoires

o Vérification de la procédure

o Traitement des données brutes et formules de calculs

o Choix des tests de performance « en routine »oVérification de l’environnement d’analyse

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Etudes réalisées en amont de la validation d’une procédure analytique

o Qualification de l’appareillage

o Optimisation des conditions opératoireso Préparation des échantillons

o Mesure de la solution analytique

o Définition d’une substance de référence

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Critères de validation: critères généraux application

o Spécificité, sélectivitéo Fonction réponse

o Courbe de calibrage, linéarité

o Intervalle de dosage(amplitude)

o Exactitude, biaiso Précision

o Répetabilitéo précision intermédiaire

o Seuil de détectiono Seuil de quantification

o Identification

o Essai limite (impuretés)

o Dosage (principe actif, impuretés)

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APPARAILLAGE HPLCVALI

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Rendement d’extraction

Le rendement d’extraction absolu peut être définicomme étant le rapport des signaux mesurés,

d’une part, après traitement de l’échantillon chargéavec une quantité connue,

d’autre part, après injection directe dans le systèmeanalytique d’une gamme non biologique deréférence contenant une concentration équivalentede substance à examiner.

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Réponse

TempsTR

------ Après extraction

Sans extraction

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Rendement d’extraction


Spécificité (Specificity)

• C’est l’aptitude d’une méthode à engendrer un signal nedépendant que de la seule substance à mesurer en présenced’autres substances potentiellement présentes(impuretés, produits de dégradation, métabolites,composés endogènes)

Nb - en HPLC on préfère parlé de sélectivité

• En pratique on réalise des blancs avec des matricesprovenant d’au moins 6 origines différentes

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Spécificité (Specificity)VALI

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Spécificité (phase de pré-validation)

Conc. théorique

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Conc. ObtenuesTracé idéal

Biais constant

Biais proportionnel


Linéarité (Linearity)

La linéarité d’une procédure d’analyse est sonaptitude, à l’intérieur d’un certain intervallede concentrations, à fournir des résultatsdirectement proportionnels à laconcentration (ou la quantité) de substanceà analyser dans l’échantillon.

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UE …Linéarité

SFSTP: 6 points de gamme X 3

0 15 25 37,5 50 100

Washington Conférence: 5 à 8 points de gamme X 1

0 5 10 20 40 80 100

5

60

Penninckx: 3 à 4 points de gamme X 9

30

100 100502500 30 60

Mc Dowall: 4 points de gamme X 2

75 10050250


Linéarité et phase de validation

o Etude de la fonction réponse: Réponse = f (Conc.)o Fonction monotone (tjr dans le sens de la conc)

o Constance de la variabilité de réponse (homogéneité desvariances de la réponse sur tout le domaine deconcentrations)�scédasticité

o Détermination du domaine de calibrage (domaine delinéarité)

o Validation du modèle

o Etude de la linéarité proprement dite

Conc. Calculées = f (Conc. Vraies)

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Linéarité et phase de validation

o OBTENTION DES DONNEES BRUTESo Sélection du plan expérimental

o Réalisation des expérimentations

o CREATION DU MODELEo Evaluation visuelle du modèle

o Elimination des valeurs aberrantes (ex: droite de Henry,test de dixon)

o Calcul du modèle (ex: y=ax+b)

o VALIDATION DU MODELEo Méthodes des résidus Yobs – Ycal en fonction de C

o Analyse de variances (corrélation, qualité de l’ajustement)

o Test de l’ordonnée à l’origine

o PROPOSITION D’UNE FONCTION REPONSE

X ijki=nb réplicat

J=nb conc

K=nb jour

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Buts de l’étude de linéarité

Etablir les conditions de l’analyse de routine :

- nombre de solutions témoins

- distribution au sein du domaine de

concentrations

tout en réduisant la charge de travail de l’analyse

de routine

gardant les exigences d’exactitude et de précision

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Linéarité (Valeurs aberrantes)

2 typesValeurs aberrantes Valeurs aberrantes dans ladues à la régression distribution des réponses

par concentration

Analyse des résidus - Cause expérimentale- Etude statistique (Dixon)

Au moins 4 replicats / conc. pour éliminer 1 point aberrant

Au moins 6 replicats / conc. pour éliminer 2 points aberrants

Le nombre total de valeurs aberrantes est au plus égal à 2

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Elimination valeurs aberrantesVALI

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z

x

Droite de Henry avec toutes les mesures


Elimination valeurs aberrantesVALI

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z

x

Droite de Henry après suppression de 2 valeurs aberrantes


Linéarité (Régression linéaire)

b

Pente a

Yi valeurs observées

Yi valeurs calculées par le modèle

Résidu:

e=Yi-Yi

Réponse Y

Concentration X

Y Y= aX+ b

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Linéarité (validation modèle régression)

X i j k série (jours)

Nb de pts de concentration

Nb de réplicat

Représentation graphique

Modèle de régression Y=aX+b

Analyse des résidus Analyse de variances

Proposition d’une fonction réponse

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Rappel : Loi normale centrée réduite

Si nous substituons à la variable x, la variable µ nous obtenons la loi normale centrée réduite. Sa moyenne est égale à 0. L’unité de la variable est σOn peut ainsi calculer la valeur µ correspondant à toute valeur de x

Remarque : on obtient généralement les valeurs caractéristiques u = 1,96 pour P = 97,5% soit 1-P=2,5%u = 3,09 pour P = 99,9% soit 1-P=0,1%

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Linéarité (Analyse des résidus)

Validité du modèle: les résidus réduits appartiennent à une distribution normale, centrée, réduite

Résidu: S=ecart type ΣΣΣΣ ei2

ei =Yi-Yi distribution e i: ei = 0; S(x,y) = n- 2

[SCE= Σ (Yi –Yi)2]Distribution des résidus réduits

ei

S (x,y)

[ t (0,05) = 1,96 ]

+ 1,96

- 1,96

Conc.

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Linéarité (Analyse des résidus)

- 1,96

+1,96

Conc.

Conc.

+1,96

- 1,96

Homosédasticité:

Homogénéité des variances sur tout le domaine de concentration

Hétérosédasticité:

Réduire domaine de concentration

Facteur de pondération

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Linéarité (Analyse de variances)

Validité du modèle:

�Homogénéité des variances (test de Cochran)

�Existence d’une pente significative (test de Fisher)

�Validité de la droite de régression

�Homosédasticité

Test de Cochran:

C = S2max / Σ S2

J C < C (α, k, n-1)

α=% tolérance; k=nb de pt de gamme; n=nb de mesure

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�Existence d’une pente significative

Test de Fischer:

F = S2régression/ S2

résiduelle F >> F (α,1,N-2)

Y

S2régression

S2résiduelles moyenne

Conc.

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�Validité de la régression: comparaison de l’erreur d’ajustement et de l’erreur expérimentale

Test de Fischer:

F = S2ajustement/ S2

expérimentale F < F(α,k-2,N-k)

Y

S2ajustement

Conc.

Valeur ajustée

Moyenne expérimentale

S2expérimentale

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Linéarité (test de l’ordonnée à l’origine)

Pour une équation de la forme: y=aX+b On a:a=pente et b=ordonnée à l’origine

b est obtenue par régression linéaire et on calcul S(b)S= écart type

Test de Student:

b – 0t =

S (b)t < t (αααα, N-2)

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α=valeur vrai de b


Linéarité (Intervalle de confiance)

Y

Y

X

1 (Xi – X)2

Y i + t x S(xi,yi) +N ΣΣΣΣ (X i – X)2

G

Conc. X

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Linéarité (Stratégie en routine)VALI

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a1 et a2a1 et a2a1 et a2a1 et a2

b1 et b2b1 et b2b1 et b2b1 et b2


Précision (Precision)

La précision d’une procédure analytique exprimel’étroitesse de l’accord (degré de dispersion) entreune série de mesures provenant de multiplesprises d’un même échantillon homogène analyséselon les conditions décrites.�Indication surles erreurs aleatoires

3 niveaux: répétabilité (repeatability)

précision intermédiaire(intermediate precision)

reproductibilité (reproducibility)CVR

CVr

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Précision ou fidélitéVALI

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Précision

• La précision mesure l’écart de chaque mesure individuelle par rapport à la moyenne des mesures d’un volume d’échantillon unique et homogène: on calcule uncoefficient de variation

• Minimum 3 concentrations x 5 (suivant référentiel)

• ± 15%

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Précision

Concentrations

Réponse

X

X

LLOQ ULOQ

QC Low

QC Medium

QC High

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Précision

QC Low QC Medium QC High

Valeur théorique 40 120 50038 100 42035 112 49942 125 53044 130 50245 122 509

Moyenne (mg/L) 41 118 492Ecart-type (mg/L) 4 12 42Precision (CV %) 10 10 9

mg/L

Valeur observée

Ecart - type / Moyenne x 100

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• Répétabilité– « intra-run »

– « intra-jour »

• Reproductibilité– « inter-run »

– « inter-jour »

1 seule fois

Plusieurs fois:-plusieurs runs sur plusieurs jours-1 run par jour sur plusieurs jours

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UE …Répétabilité

Reproductibilité (fidélité intermédiaire)


Exactitude (Accuracy)

L’exactitude d’une procédure analytique exprime l’étroitesse de l’accord

entre une valeur qui est acceptée comme conventionnellement vraie ou une valeur de référence et la valeur trouvée (=la valeur moyenne obtenue en appliquant la procédure analytique un certain nombre de fois)

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Exactitude (Accuracy)

Comparaison valeur individuelle / valeur vraie

erreur systématique + erreur due au hasard

Comparaison valeur moyenne / valeur vraie

erreur systématique + erreur due au hasard

Comparaison valeur moyenne à long terme/ valeur vraie

erreur systématique

Accuracy

trueness

Bias

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Exactitude

• L’exactitude mesure l’écart de la moyenne des résultats par rapport à la vraie valeur (valeur théorique): on calcule un biais

• Minimum 3 niveaux de concentrations x 5 (suivant référentiel)

• ± 15% de la concentration théorique

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Exactitude

Concentrations

Réponse

X

X

LLOQ ULOQ

QC Medium

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QC Low<3 x LLOQ

Cible Bas Cible Moyen Cible Haut

QC High= 75 % ULOQ

Exactitude

QC Low QC Medium QC High

Valeur théorique 40 120 50038 100 42035 112 49942 125 53044 130 50245 122 509

Moyenne (mg/L) 41 118 492Exactitude (%) 2 -2 -2

mg/L

Valeur observée

(Moyenne- Valeur théorique)/Valeur théorique x 100

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Précision et exactitude

Non précis et non exacte Précis et non exacte

Non précis et exacte Précis et exacteVALI

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Précision et exactitude

xi = µ + précision + biaisxi - µ = précision + biais

= erreur totale

X = µ + BiaisBiais = erreur systématique

xi = µ + précisionPrécision = erreur aléatoire

xi = µ + précisionPrécision = erreur aléatoireV

ALI

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UE … xi = résultat individuel (valeur mesurée)

X = résultat moyen

µ = valeur vraie (inconnue)


0 % Biais

Exactitude/PrécisionVALI

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La différence entre le résultat et la valeur vraie doit être dans l’intervalle d’acceptation [-λ, λ]Avec λ = limite d’acceptation (15%)

0 % Biais

X-µ=0

| X - µ | < λ

+ 15%

- 15%

Exactitude/Précision

xi = résultat individuel (valeur mesurée)

X = résultat moyen

µ = valeur vraie (inconnue)

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Attention :

0 % Biais

X-µ=0

+ 15%

- 15%

Précision < 15 % et Biais < 15 %

Exactitude/PrécisionVALI

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Limite de détection (Detection limit)

La limite de détection d’une procédureanalytique est la plus petite quantité d’unesubstance qui peut être détectée mais nonnécessairement quantifiée comme unevaleur exacte.

Elle peut être exprimée comme une quantité ou uneconcentration dans la substance analysée.

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Limite de détection (Detection limit)

o Basée sur une évaluation visuelleo Basée sur le rapport signal / bruit

(entre 3:1 et 2:1)o Basée sur l’écart type de l’intercepte (σ) et la

moyenne des pentes du modèle (S)DL = 3,3 σ / S

o Basée sur la courbe de calibrage (écart type de l’ordonnée à l’origine)

validée par plusieurs mesures réelles à la concentration limite

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Limite de quantification (Quantification limit)

La limite de quantification d’une procédureanalytique est la plus petite quantité d’unesubstance qui peut être quantifiée avec uneexactitude et une précision définies.

Elle peut être exprimée comme une quantité ou uneconcentration dans la substance analysée.

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Limite de quantification (Quantification limit)

o Basée sur une évaluation visuelleo Basée sur le rapport signal / bruit

(entre 10:1)o Basée sur l’écart type de l’intercepte (σ) et la

moyenne des pentes du modèle (S)DL = 10 σ / S

o Basée sur la courbe de calibrage (intervalle de confiance)

validée par plusieurs mesures réelles à la concentration limite: exactitude,précision

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Robustesse VALI

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Notion de test de robustesse

• Modification volontaire d’un,ou plusieurs critères, du mode opératoire ou des conditions analytiques

� Changement de %age de solvant en HPLC, T° de séparation, pH, etc…)

• Élaboration d’un plan d’expérience (ou algorithme simplex)

• Application de la méthode

• Mesure et calcul des performances

• Mise en évidences des points critiques

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III -PROFILD’EXACTITUDE

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Profil d’exactitude (principe) VALI

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Profil d’exactitude (construction)VALI

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Outil de décision: Profil d’exactitudeVALI

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Exemples 1: Profil d’exactitude pour le dosage d’un conservateur

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Exemples 2: Profil d’exactitudeVALI

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Erreur totaleVALI

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ConclusionVALI

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RemerciementsVALI

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Merci de votre attention


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