VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR HEPTAMINOL HCl …

i

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR HEPTAMINOL HClDENGAN AGEN PENDERIVAT O-FTALALDEHID SECARA

SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Agnes Anania Triavika Sahamastuti

NIM : 078114142

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA2011

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Walau ku harus berjalan

Dalam lembah kekelaman

Perlindungan-Mu, oh, Tuhan

Nyatalah bagi hidupku

Tiada pernah sedetikpun

Tiada pernah Kau tinggalkan

Sungguh mulia dan sempurna

Hanya Kau layak disembah

Yesus, Engkau Juruselamatku

Dalam janji-Mu, kemenanganku

Selamanya kan kunyatakan

Besar setia-Mu, Tuhan, dihidupku..

(True Worshippers)

Best regards for my lovely family,

Papah, Mami, Adit and Angga

For your support, love, and patient for me..

and especially for my Jesus, Who always pour His bless and grace for me..

I belong to You, LORD!!

All for Jesus! Amen!

vi

PRAKATA

Segala puji syukur atas segala kebaikan, hikmat dan rahmat Tuhan Yesus

selama pengerjaan skripsi ini dari awal sampai akhir, sehingga penulis dapat

menyelesaikan seluruh rangkaian penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul

Validasi Metode Penetapan Kadar Heptaminol HCl Dengan Agen Penderivat O-

Ftalaldehid Secara Spektrofotometri UV.

Selama proses pelaksanaan dan penyusunan skripsi, penulis mendapatkan

banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis

mengucapkan terimakasih yang setulus-tulusnya kepada:

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pmbimbing dan dosen

penguji yang telah banyak memberikan waktu dan bantuan berupa saran dan

kritik sehingga penelitian dan penyusunan skripsi ini dapat berjalan dengan

lancar.

3. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan

kritik dan saran yang bermanfaat untuk skripsi ini.

4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan kritik dan

saran yang bermanfaat untuk skripsi ini.

5. PT. Corsa Indonesia, yang telah membantu dalam pengadaan baku heptaminol

HCl dalam jumlah yang cukup banyak.

vii

6. Pak Parlan dan Mas Bimo selaku laboran Laboratorium Kimia Organik dan

Laboratorium Kimia Analisis Instrumental, Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta atas bantuan dan kerjasamanya selama proses

penelitian.

7. Pak Bambang dan Mas Devi selaku laboran Laboratorium Analisis Makanan,

Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta atas bantuan dan

kerjasamanya selama proses penelitian.

8. Semua dosen dan laboran yang telah membantu baik dalam kuliah maupun

dalam praktikum, terimakasih atas banyak ilmu dan bantuan yang telah saya

dapat.

9. Papah, Mami, Adit, dan Angga atas segala dukungan, doa dan semangat yang

selalu diberikan, sehingga walaupun dengan banyak pengorbanan, skripsi ini

akhirnya selesai.

10. Teman-teman satu tim skripsi heptaminol HCl, Aji dan Dudud. Akhirnya,

setelah cukup lama kita berkutat di laboratorium, kita bisa bernafas lega juga.

Terimakasih buat kerjasamanya yang kompak.

11. Sahabat yang sudah kudapat selama 3,5 tahun di Sanata Dharma, Riris, Septi,

Xiang-Xiang, Putri, dan Fetri. Terimakasih buat banyak informasi, pengertian,

waktu dan semangat yang selalu kalian berikan.

12. Teman-teman sepelayananku dan komselku, Ka Iva, Veny, Lilis, Yemi, Tere,

Ka Sabrina, Irma, Vina, Jessi, Sani, Ka Maria, Ko Hendro dan semua ”anak

x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN .............................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................... iv

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... v

PRAKATA ............................................................................................ vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................. ix

DAFTAR ISI ......................................................................................... x

DAFTAR TABEL ................................................................................. xiv

DAFTAR GAMBAR ............................................................................ xv

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................ xvii

INTISARI ............................................................................................. xviii

ABSTRACT ............................................................................................ xix

BAB I. PENGANTAR ......................................................................... 1

A. Latar Belakang ................................................................................. 1

1. Permasalahan ............................................................................. 3

2. Keaslian Penelitian .................................................................... 3

3. Manfaat Penelitian ..................................................................... 4

B. Tujuan Penelitian ............................................................................. 5

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ................................................. 6

A. Heptaminol HCl ............................................................................... 6

xi

B. O-Ftalaldehid (OPA) ....................................................................... 7

C. Derivatisasi ....................................................................................... 8

D. Spektrofotometri UV ....................................................................... 9

E. Validasi Metode Analisis ................................................................. 12

1. Spesifisitas (Specificity) ............................................................. 13

2. Linearitas .................................................................................... 13

3. Batas Deteksi (Limit of Detection/LOD) dan Batas

Kuantitasi (Limit of Quantitation/LOQ) ………………………. 13

4. Ketepatan (Accuracy) ................................................................. 14

5. Ketelitian (Precision) ................................................................. 14

F. Landasan Teori ................................................................................. 16

G. Hipotesis ........................................................................................... 17

BAB III. METODE PENELITIAN ...................................................... 18

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................ 18

B. Variabel Penelitian ........................................................................... 18

1. Variabel Bebas ............................................................................ 18

2. Variabel Tergantung ................................................................... 18

3. Variabel Pengacau Terkendali .................................................... 18

C. Definisi Operasional ......................................................................... 19

D. Bahan ................................................................................................. 19

E. Alat .................................................................................................... 19

F. Tata Cara Penelitian .......................................................................... 20

1. Pembuatan Bufer Borat ............................................................... 20

xii

2. Pembuatan Larutan OPA ............................................................. 20

3. Pembuatan Larutan Stok Heptaminol HCl (4 mg/mL) ................ 20

4. Pembuatan Larutan Baku Heptaminol HCl ................................. 20

5. Pembuatan Kurva Baku Heptaminol HCl ................................... 21

6. Recovery Kurva Baku................................................................... 21

G. Analisis Hasil ..................................................................................... 22

1. Spesifisitas ................................................................................... 22

2. Linearitas Kurva Baku ................................................................. 22

3. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) .................... 22

4. Ketelitian (Precision) .................................................................. 22

5. Ketepatan (Accuracy) ................................................................. 23

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................. 24

A. Pembuatan Larutan ............................................................................ 24

1. Larutan Heptaminol HCl ............................................................. 24

2. Larutan OPA ............................................................................... 24

3. Larutan Baku Heptaminol HCl ................................................... 27

B. Pembuatan Kurva Baku Heptaminol HCl ......................................... 29

C. Validasi Metode ................................................................................ 31

1. Spesifisitas .................................................................................. 32

2. Linearitas ..................................................................................... 35

3. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) .................... 36

4. Ketepatan (Accuracy) .................................................................. 38

5. Ketelitian (Precision) ................................................................... 38

xiii

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................... 40

A. Kesimpulan ........................................................................................ 40

B. Saran .................................................................................................. 40

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. 41

LAMPIRAN ............................................................................................ 44

BIOGRAFI PENULIS ............................................................................ 58

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Kriteria penerimaan akurasi pada konsentrasi analit yang

berbeda ............................................................................. 14

Tabel II. Kriteria penerimaan presisi pada konsentrasi analit yang

berbeda ............................................................................. 15

Tabel III. Elemen data yang dibutuhkan untuk validasi metode

analisis .............................................................................. 16

Tabel IV. Data replikasi kurva baku heptaminol HCl ...................... 30

Tabel V. Data absorbansi blangko larutan OPA dalam bufer

borat pH 9 …………………………………………….... 37

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur molekul heptaminol HCl ………………………. 6

Gambar 2. Struktur molekul o-ftalaldehid .......................................... 7

Gambar 3. Reaksi antara o-ftalaldehid dengan amina primer

bersama merkaptoetanol ................................................... 8

Gambar 4. Diagram tingkat energi elektronik .................................... 9

Gambar 5. Reaksi Cannizzaro pada OPA .......................................... 26

Gambar 6. Usulan reaksi fotodegradasi OPA .................................... 27

Gambar 7. Reaksi antara OPA dengan heptaminol bersama

merkaptoetanol akan menghasilkan senyawa hasil

derivatisasi yang memiliki gugus kromofor dan

auksokrom ………………………………………………. 28

Gambar 8. Gugus kromofor dan auksokrom dari senyawa hasil

derivatisasi (Gugus kromofor ditunjukkan oleh

garis lurus, sedangkan gugus auksokrom ditunjukkan

oleh garis titik-titik) ……………………………………… 29

Gambar 9. Hubungan antara kadar heptaminol HCl dengan

absorbansi derivatnya pada replikasi I .............................. 31

Gambar 10. Spektrum absorbansi OPA ……….................................... 33

Gambar 11. Reaksi degradasi hasil derivatisasi antara OPA dengan

heptaminol (Lindroth, 1985) ……………………………. 33

Gambar 12. (A) Spektrum absorbansi hasil derivatisasi setelah

1,5 menit penambahan reagen OPA; (B) Spektrum

xvi

absorbansi hasil derivatisasi setelah 1 jam reaksi ….……. 34

Gambar 13. Perkiraan spektra absorbansi hasil derivatisasi

setelah 15 menit reaksi ……………………………….…. 35

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat Analisis Heptaminol HCl dari PT. Corsa …….. 45

Lampiran 2. Hasil scanning panjang gelombang larutan OPA ……….. 46

Lampiran 3. Hasil scanning panjang gelombang hasil

derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA setelah

1,5 menit reaksi ………………………………………… 47

Lampiran 4. Hasil scanning panjang gelombang hasil degradasi

dari hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan

OPA ……………………………………………………. 48

Lampiran 5. Contoh Perhitungan Kadar Larutan Baku

heptaminol HCl ………………………………………… 49

Lampiran 6. Perhitungan Persamaan Kurva Baku Heptaminol HCl …. 50

Lampiran 7. Perhitungan LOD dan LOQ ……………………………. 53

Lampiran 8. Perhitungan akurasi dan presisi larutan baku

heptaminol HCl …………………………………………. 55

xviii

INTISARI

Heptaminol merupakan senyawa amina primer alifatis yang tidakmemiliki gugus kromofor ataupun auksokrom, sehingga tidak dapat ditetapkankadarnya secara langsung menggunakan spektrofotometer ultraviolet (UV)ataupun visible (Vis). Untuk dapat menetapkan kadarnya, perlu dilakukanderivatisasi menggunakan agen penderivat tertentu dan menghasilkan senyawaturunan heptaminol yang memiliki kromofor dan auksokrom. Oleh karena itu,dalam penelitian ini dilakukan pengembangan metode spektrofotometri UVdengan derivatisasi menggunakan agen penderivat o-ftalaldehid (OPA) untukmenetapkan kadar heptaminol HCl.

Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental dengan rancanganpenelitian deskriptif. Pada penelitian ini dilakukan pembuatan kurva baku darihasil derivatisasi heptaminol HCl menggunakan regresi linear antara kadar kurvabaku dan absorbansinya. Untuk menentukan kevalidan metode, digunakanparameter spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, ketepatan, danketelitian.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai koefisien korelasi (r) darikurva baku heptaminol HCl sebesar 0,9995, rentang nilai recovery-nya sebesar99,32-101,78%, rentang nilai CV sebesar 0,38-0,98%, batas deteksinya 0,67µg/mL dan batas kuantitasinya 2,23 µg/mL pada pengukuran di panjanggelombang 332 nm. Maka dapat disimpulkan bahwa metode ini memiliki validitasyang baik untuk spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, ketepatan,dan ketelitiannya.

Kata kunci : heptaminol, o-ftalaldehid (OPA), spektrofotometri UV, validasi

xix

ABSTRACT

Heptaminol is a primary amine aliphatic which have neitherchromophore nor auxochrome, and can not directly determined byspectrophotometer ultraviolet (UV) nor visible (Vis). To determine its level, itneeds derivatization with a specific derivatizing agent to produce the derivate ofheptaminol which have chromophore and auxochrome. This research is to developa method of spectrophotometry UV with derivatization by o-phthalaldehyde(OPA) to determine the level of heptaminol HCl.

This research is a descriptive non experimental research. In this study,done by making a standard curve of derivate of heptaminol HCl by using a Linearregression between level of standard curve against their absorbance. To determinethe validity of the method, parameters such as selectivity, linearity, limit ofdetection, limit of quantitation, accuracy, and precision were determined.

The result of correlation coefficient (r) of standard curve of heptaminolHCl was 0,9995, range of recovery values were 99,32-101,78%, range of CVvalues were 0,38-0,98%, limit of detection was 0,67 µg/mL and limit ofquantitation was 2,23 µg/mL, which measured in 332 nm. Therefore, it can beconcluded that the method has good validity for specificity, linearity, limit ofdetection, limit of quantitation, accuracy, and precision.

Keywords: heptaminol, o-phthalaldehyde (OPA), validation

1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Heptaminol merupakan obat turunan amina yang digunakan sebagai

kardiotonik dan vasodilator. Dilihat dari struktur molekulnya, heptaminol adalah

senyawa amina primer alifatis yang tidak memiliki gugus kromofor ataupun

auksokrom, sehingga tidak dapat ditetapkan kadarnya secara langsung

menggunakan spektrofotometer ultraviolet (UV) ataupun visible (Vis). Karena itu,

perlu dilakukan derivatisasi terlebih dahulu untuk menghasilkan senyawa turunan

heptaminol yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom, sehingga dapat

ditetapkan kadarnya dengan lebih spesifik dan sensitif.

Analisis heptaminol yang telah dilakukan antara lain dengan

menggunakan: Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-fotodensitometri, dengan

derivatisasi menggunakan 4-chloro-7-nitrobenzo-2,1,3-oxadiazole (Morros, Borja,

dan Segura, 1985); spektrofotometri dan spektrofluorometri dengan

ditambahkannya reagen asetilaseton-formaldehida (Fattah, El-Yazbi, Belal dan

Abdel-Razak, 1997); serta Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase

terbalik dengan derivatisasi pra-kolom menggunakan o-phthalaldehyde dan

detektor fluoresensi (Brodie, Chasseaud, Rooney, Daragh dan Lambe, 1982).

Dari data tersebut, heptaminol telah dianalisis menggunakan beberapa

agen penderivat, salah satunya adalah o-ftalaldehid (OPA). OPA merupakan

reagen penderivat untuk protein yang umum dipakai. Hal ini disebabkan karena

2

reaksi yang berlangsung hanya memerlukan waktu yang singkat dan hasilnya

sensitif. Menurut Benson dan Hare (1975), dibandingkan dengan agen penderivat

amina primer yang umumnya dipakai, seperti fluorescamine dan ninhidrin, OPA

lebih larut dan stabil dalam larutan bufer, dan sensitivitasnya dalam mendeteksi

protein 5-10 kali lebih besar dibandingkan fluorescamine.

OPA memiliki gugus aldehid yang dapat bereaksi dengan gugus amina

pada heptaminol, sehingga menghasilkan senyawa derivat yang memiliki gugus

kromofor dan auksokrom. Namun, sejauh penelusuran yang ditemukan, masih

jarang dilakukan penetapan kadar heptaminol menggunakan metode

spektrofotometri UV, meskipun alat tersebut umumnya digunakan oleh

laboratorium-laboratorium analisis di Indonesia. Metode spektrofotometri

merupakan metode yang cukup mudah dan cepat untuk dilakukan, serta memiliki

sensitivitas dan spesifisitas yang cukup baik, sehingga umumnya dipilih sebagai

metode awal dalam menetapkan kadar suatu senyawa.

Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian heptaminol HCl dengan

Susanti (2011) dan Mukti (2011). Berdasarkan hasil optimasi dari Susanti (2011),

diperoleh nilai absorbtivitas molar (ε) rata-rata dari hasil derivat antara heptaminol

dengan OPA sebesar 667,3544 M-1cm-1. Nilai ini berada pada tingkat ”sedang”

dari mudah-tidaknya senyawa tersebut dianalisis menggunakan spektrofotometri

UV (Mulja dan Suharman, 1995). Umumnya, analisis menggunakan

spektrofotometri UV memerlukan nilai ε diatas 1000 M-1cm-1, karena absorbansi

yang diperoleh akan lebih besar pada konsentrasi analit yang kecil. Namun, analit

dengan nilai ε yang cukup kecil (100-1000 M-1cm-1) masih diperbolehkan,

3

meskipun intensitas absorbansinya akan jauh lebih kecil dibandingkan dengan

senyawa lain yang memiliki nilai ε lebih besar (Pavia, Lampman, dan Kriz, 2001).

Hal ini dapat diatasi dengan menggunakan analit dengan konsentrasi yang cukup

besar, sehingga dapat meningkatkan intensitas absorbansinya.

Oleh karena itu, perlu dilakukan validasi terhadap metode penetapan

kadar yang digunakan, sehingga metode tersebut sesuai untuk penetapan kadar

heptaminol HCl. Melalui penelitian ini, penulis hendak melakukan validasi untuk

mengetahui sensitivitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi dan

presisi dari metode penetapan kadar heptaminol HCl dengan agen penderivat OPA

secara spektrofotometri UV sesuai dengan hasil optimasi dari Susanti (2011).

1. Permasalahan

Apakah penetapan kadar heptaminol HCl dengan agen penderivat OPA

secara spektrofotometri UV memenuhi kriteria spesifisitas, linearitas, batas

deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi?

2. Keaslian penelitian

Berdasarkan data-data penelitian yang telah dilakukan sebelumnya

mengenai penetapan kadar heptaminol yang diperoleh penulis, masih jarang

ditemukan penetapan kadar heptaminol secara spektrofotometri UV di Indonesia.

Selain itu, sepanjang pengetahuan penulis, analisis heptaminol yang dilakukan

umumnya menggunakan detektor fluoresensi.

Analisis heptaminol dengan metode spektrofotometri yang pernah

dilakukan yaitu penetapan kadar heptaminol dan mexiletine dalam sediaan obat

4

secara spektrofotometri dan spektrofluorometri dengan penambahan reagen

asetilaseton-formaldehida pernah dilakukan oleh Fattah et al. (1997).

Selain dengan metode spektrofotometri, penetapan kadar heptaminol

dalam plasma dan urin pernah dilakukan menggunakan metode KCKT fase

terbalik dengan detektor fluoresensi setelah diderivatisasi dengan OPA. Metode

ini dilaporkan memiliki sensitivitas yang cukup baik untuk studi farmakokinetika

(Brodie et al., 1983). Penetapan kadar heptaminol pada plasma dengan

menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis dan in situ Fluorometri dengan

derivatisasi menggunakan 4-chloro-7-nitrobenzo-2,1,3-oxadiazole juga pernah

dilakukan oleh Morros et al.(1985).

3. Manfaat penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan memiliki manfaat sebagai berikut:

a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

sumbangan ilmiah mengenai metode alternatif untuk penetapan kadar heptaminol

HCl, yaitu menggunakan agen penderivatisasi OPA dengan metode

spektrofotometri UV.

b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat menyediakan metode

penetapan kadar heptaminol HCl yang dapat dimanfaatkan oleh pihak industri

dalam penjaminan kualitas.

5

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui spesifisitas, linearitas, batas

deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi metode penetapan kadar heptaminol

dengan agen penderivat OPA secara spektrofotometri UV.

6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Heptaminol HCl

CH3

NH2OH

CH3CH3 HCl

Gambar 1. Struktur molekul heptaminol HCl

Heptaminol HCl (Gambar 1.) memiliki rumus molekul C8H20ClNO,

dengan bobot molekul 180,7 g/mol (Anonim, 2010a). Heptaminol HCl berbentuk

kristal, dengan titik lebur 178-1800C, larut dalam air dan alkohol, tidak larut

dalam aseton, benzen dan eter (Anonim, 1989). Heptaminol HCl adalah senyawa

turunan amina yang memiliki efek kardiotonik dan vasodilator. Dosis terapinya

berkisar antara 1-3 mg/kg BB (Anonim, 2010b). Heptaminol HCl bekerja pada

sistem kardiosirkulasi serta sistem neuromuskuler, sehingga berkhasiat

meningkatkan tekanan darah dan memperkuat kerja jantung (Hardjasaputra,

Budipranoto, Sembiring dan Kamil, 2002).

Heptaminol HCl mempunyai 2 khasiat utama, yaitu:

1. Heptaminol akan meningkatkan kekuatan sistolik dan kapasitas kerja jantung,

output jantung serta aliran darah koroner. Selain itu, heptaminol juga

memperkuat pembuluh darah perifer.

2. Heptaminol akan memperkuat dan menormalkan sistem neuromuskuler

(Hardjasaputra et al., 2002).

7

Dilihat dari strukturnya, heptaminol hanya memiliki gugus –NH2 dan –

OH yang penting untuk keperluan analisis. Menurut Snyder, Kirkland dan Glajch

(1997), gugus –NH2 tidak memiliki koefisien ekstingsi molar (ε), sehingga

senyawa ini sukar untuk dideteksi menggunakan spektrofotometer UV.

B. O-Ftalaldehid (OPA)

Gambar 2. Struktur molekul o-ftalaldehid

OPA (Gambar 2.) dengan rumus molekul C8H6O2 berbentuk kristal atau

serbuk berwarna kuning. Bobot molekul OPA adalah 134,12 g/mol (Anonim,

2005a).

Penetapan kadar protein menggunakan OPA cepat dan sensitif. OPA

akan bereaksi dengan gugus amina primer pada protein. OPA bereaksi dengan

amina primer dan merkaptoetanol menghasilkan senyawa berfluoresensi biru yang

memiliki panjang gelombang eksitasi maksimum pada 340 nm dan panjang

gelombang emisi maksimum pada 455 nm seperti terlihat pada Gambar 3. Reaksi

ini berlangsung secara spontan, sehingga reaksinya berlangsung dalam beberapa

menit (Ahmed, 2005).

8

H

O

O

H

NH2 R HSOH

N

S

R

OH

Gambar 3. Reaksi antara o-ftalaldehid dengan amina primer bersama merkaptoetanol

OPA memberikan sensitivitas yang lebih besar dalam deteksinya. Hal ini

disebabkan karena dua kriteria penting: pertama, OPA tidak berfluoresensi

sehingga tidak mengganggu deteksi. Kedua, reaksinya terjadi dengan cepat pada

suhu kamar, meminimalkan penggunaan waktu yang lama (Blackburn, 1989).

C. Derivatisasi

Dalam pelaksanaan suatu analisis, kemungkinan banyak terdapat zat-zat

yang memberikan absorbansi maksimal pada panjang gelombang 200-210 nm,

umumnya merupakan bahan-bahan yang dipakai sebagai pelarut, khususnya yang

memiliki ikatan hidrogen. Proses derivatisasi dilakukan untuk mengatasi keadaan

tersebut dengan cara mereaksikan zat yang dianalisis dengan zat tertentu sehingga

terjadi pergeseran panjang gelombang maksimal ke arah pergeseran merah atau

mereaksikan zat yang dianalisis dengan zat tertentu sehingga menghasilkan

senyawa yang berfluoresensi.

Dalam proses derivatisasi, harus diperhatikan bahwa zat penderivat harus

memberikan reaksi yang cepat dan stabil serta meningkatkan sensitivitas

pengukuran (Mulja dan Suharman, 1995).

9

D. Spektrofotometri UV

Spektrofotometri UV adalah salah satu teknik analisis spektroskopik

yang menggunakan radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm) dan

memakai alat spektrofotometer. Pada analisis menggunakan spektrofotometri UV,

dilakukan pembacaan absorbansi (penyerapan) atau transmitansi (penerusan)

radiasi elektromagnetik oleh suatu molekul. Hasil pembacaan absorbansi disebut

sebagai absorban (A) dan tidak memiliki satuan, sedangkan hasil pembacaan

transmitansi disebut transmitan dan memiliki satuan %T (Mulja dan Suharman,

1995).

Adanya radiasi ultraviolet dan cahaya tampak akan meningkatkan energi

elektronik sebuah molekul, dimana energi yang disumbangkan oleh foton-foton

menyebabkan elektron-elektron dapat mengatasi kekangan inti dan berpindah ke

orbital baru yang lebih tinggi energinya (Day dan Underwood, 2002). Transisi

elektron yang mungkin terjadi dapat dilihat pada gambar 4, yaitu:

Gambar 4. Diagram tingkat energi elektronik

σ*

π*

n

π

σ

E

antibonding

antibonding

non bonding

bonding

bonding

10

1. Transisi elektron σ σ*. Elektron di orbital σ bonding akan tereksitasi ke

orbital σ* antibonding. Transisi ini terjadi pada daerah ultraviolet jauh,

membutuhkan energi yang besar dan terjadi pada molekul yang memiliki ikatan

tunggal (Mulja dan Suharman, 1995).

2. Transisi elektron n σ*. Eksitasi elektron terjadi dari orbital n nonbonding ke

orbital σ* antibonding. Transisi ini terjadi pada senyawa jenuh dengan elektron

nonbonding, dan membutuhkan energi yang lebih rendah daripada transisi

elektron σ σ* serta terjadi karena radiasi pada daerah 150-250 nm (Khopkar,

1990).

3. Transisi elektron n π* dan π π*. Sebagian besar penerapan

spektrofotometri UV-Vis pada senyawa organik didasarkan pada transisi ini.

Energi yang diperlukan untuk transisi ini menghasilkan absorban maksimum

pada daerah 200-700 nm (Khopkar, 1990). Transisi n π* terjadi pada

senyawa yang memiliki elektron n nonbonding yang tereksitasi ke orbital π*

antibonding. Transisi π π* terjadi pada senyawa yang memiliki ikatan

rangkap dua atau tiga (alkena dan alkuna) yang menyerap energi yang sesuai

dan terjadi pada daerah ultraviolet dekat (Mulja dan Suharman, 1995).

Iradiasi dari suatu komponen organik dapat menyebabkan terjadinya

eksitasi elektron dari sutau orbital (umumnya berupa pasangan elektron bebas atau

orbital ikatan) ke orbital yang lain (umumnya berupa orvital non-bonding atau

orbital anti-ikatan). Hal ini dapat ditunjukkan berupa:

ε = 0,87 x 1020 x P x a

11

P merupakan kemungkinan terjadinya transisi (bernilai dari 0 sampai dengan 1),

dan a adalah daerah sasaran dari sistem yang mengabsorbsi, dimana sistem yang

mengabsorbsi ini umumnya disebut sebagai kromofor. Umumnya, semakin

panjang gugus kromofornya, semakin besar intensitas absorbansinya (Williams

dan Fleming, 1980).

Bouguer, Lambert dan Beer membuat suatu persamaan matematik yang

menghubungkan antara absorban atau transmitan terhadap intensitas radiasi atau

konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan yang mengabsorbsi:

A = ε. b. c

dimana: T = % transmitan; A = absorban; ε = absorbansi molar (Lt.mol-1 cm-1); c

= konsentrasi (mol.Lt-1); b = tebal larutan (cm). F

Pada pengukuran yang menghasilkan absorban yang rendah, intensitas

sinar yang masuk dengan sinar yang diteruskan hampir sama, sehingga kesalahan

akan menjadi besar, sebab yang terdeteksi adalah perbedaan antara kedua

intensitas tersebut. Sedangkan, pada absorban yang tinggi, energi yang diterima

sangat kecil, sehingga sukar diukur secara akurat (Redja, 1980). Pembacaan

absorbansi sebesar 0,2 – 0,8 atau persen transmitan sebesar 15 - 65% akan

memberikan persen kesalahan analisis yang masih dapat diterima (0,5 – 1%)

(Mulja dan Suharman, 1995).

Nilai ε (daya serap molar atau koefisien ekstingsi molar) adalah

karakteristik untuk molekul atau ion penyerap dalam suatu pelarut tertentu, pada

panjang gelombang tertentu, dan tidak bergantung pada konsentrasi dan panjang

gelombang lintasan radiasi (Sastrohamidjojo, 2001). Secara umum, dapat

12

dikatakan bahwa nilai ε sangat mempengaruhi puncak spektrum yang dihasilkan

oleh suatu zat. Rincian nilai ε terhadap puncak spektrum adalah: 1-10= sangat

lemah; 10-102= lemah; 102-103= sedang; 103-104= kuat; 104-105= sangat kuat

(Mulja dan Suharman, 1995). Semakin besar nilai ε, maka semakin mudah

senyawa tersebut untuk dianalisis menggunakan spektrofotometri UV, karena

semakin besar absorbansi yang diperoleh untuk kadar analit yang sama.

Kriteria pelarut yang baik dalam spektrofotometri adalah tidak

mengabsorbsi radiasi UV pada daerah yang sama dengan analitnya. Biasanya,

pelarut yang dipilih adalah yang tidak memiliki sistem terkonjugasi. Air, etanol

95% dan n-heksana merupakan pelarut yang banyak digunakan. Zat-zat tersebut

tidak terlihat dalam daerah spektrum ultraviolet dimana puncak absorbsi analit

biasanya muncul (Pavia, et al., 2001).

Pengukuran absorbansi senyawa untuk analisis kuantitatif pada

spektrofotometri dilakukan pada panjang gelombang maksimum, yaitu panjang

gelombang dimana terjadi eksitasi elektronik yang memberikan absorbansi yang

maksimum. Pada panjang gelombang maksimal kepekaan analisis yang diperoleh

maksimal. Selain itu, pita absorban disekitar panjang gelombang maksimal

berbentuk datar, dan memberikan kesalahan yang kecil pada pengukuran ulang

(Mulja dan Suharman, 1995).

E. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan

13

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita,

2004). Beberapa parameter yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode

analisis meliputi antara lain linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, ketepatan

dan ketelitian.

1. Spesifisitas (specificity)

Spesifisitas suatu metode adalah kemampuan metode tersebut untuk

mengukur zat tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain

dalam matriks sampel (Anonim, 2006). Spesifisitas ditentukan dengan

membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil

degradasi, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, atau pembawa plasebo dengan

hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tersebut (Harmita, 2004).

2. Linearitas

Linearitas adalah kemampuan metode untuk memberikan respon yang

proporsional terhadap konsentrasi analit di dalam sampel. Syarat suatu metode

dikatakan memiliki linearitas yang baik adalah bila nilai koefisien korelasi (r)-nya

> 0,999, terutama untuk penetapan kadar senyawa utama (Snyder et al., 1997).

3. Batas Deteksi (limit of detection/LOD) dan Batas Kuantitasi (limit of

quantitation/LOQ)

Batas deteksi adalah konsentrasi terkecil suatu analit dalam sampel yang

dapat terdeteksi. Batas deteksi digambarkan sebagai perbandingan signal-to-noise

(S/N) antara hasil uji sampel dengan analit yang diketahui konsentrasinya dan

blangko. Rasio signal-to-noise untuk batas deteksi adalah sekurangnya 3:1

(Snyder et al., 1997). Penentuan batas deteksi juga dapat didasarkan pada

14

perhitungan tiga kali nilai standar deviasi blangko dibagi dengan nilai slope kurva

baku (Anonim, 2005b).

Batas kuantitasi adalah konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang

masih dapat menunjukkan pengukuran secara teliti dan tepat. Penentuan batas

kuantitasi didasarkan pada perhitungan sepuluh kali nilai standar deviasi blangko

dibagi dengan nilai slope kurva baku (Anonim, 2005b).

4. Ketepatan (accuracy)

Ketepatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil

analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Ketepatan dinyatakan sebagai

persen perolehan kembali analit yang ditambahkan (Harmita, 2004). Kriteria

penerimaan akurasi ditentukan berdasarkan kadar analit, dinyatakan dalam persen

(%) perolehan kembali, seperti yang tertera pada Tabel I.:

Tabel I. Kriteria penerimaan akurasi pada konsentrasi analit yang berbeda

Kadar analit (%) Perolehan kembali (%)100 98-10210 98-1021 97-103

0,1 95-1050,01 90-107

0,001 80-1100,0001 80-110

0,00001 80-1100,000001 60-115

0,0000001 40-120

(Huber, 2003)

5. Ketelitian (precision)

Ketelitian adalah derajat kesesuaian antara hasil uji individual yang

diperoleh dari pengambilan sampel yang berulang suatu sampel yang homogen

dengan menggunakan suatu metode analisis. Presisi umumnya dinyatakan dengan

15

koefisien variasi (CV) atau standar deviasi relatif (RSD), seperti yang tertera pada

tabel II (United States Pharmacopeial Convention, 2005):

Tabel II. Kriteria penerimaan presisi pada konsentrasi analit yang berbeda

Kadar analit (%) CV (%)100 1,310 2,71 2,8

0,1 3,70,01 5,3

0,001 7,30,0001 11

0,00001 150,000001 21

0,0000001 30

(Huber, 2003)

Metode uji yang berbeda membutuhkan validasi yang berbeda. Kategori

metode pengujian dengan validasi metode yang diperlukan adalah sebagai berikut,

seperti yang juga dicantumkan dalam Tabel III (United States Pharmacopeial

Convention, 2005):

a. Kategori I: metode analitik yang digunakan untuk penetapan kadar komponen

utama dalam bahan baku atau bahan aktif (termasuk pengawet) dalam produk

akhir sediaan farmasi;

b. Kategori II: metode analitik yang digunakan untuk penetapan ketidakmurnian

dalam bahan baku atau bahan aktif atau hasil degradasi senyawa dalam produk

akhir sediaan farmasi;

c. Kategori III: metode analitik yang digunakan untuk penetapan karakteristik

penampilan obat (misalnya disolusi, pelepasan obat);

d. Kategori IV: metode analitik yang digunakan untuk uji identifikasi.

16

Tabel III. Elemen data yang dibutuhkan untuk validasi metode analisis

Karakteristik analisis Kategori I Kategori II Kategori III Kategori IVKetepatan Ya Ya * * TidakKetelitian Ya Ya Tidak Ya TidakSpesifisitas Ya Ya Ya * YaBatas deteksi Tidak Tidak Ya * TidakBatas kuantitasi Tidak Ya Tidak * TidakLinearitas Ya Ya Tidak * TidakRentang Ya Ya * * Tidak

Keterangan : * tergantung dari masing-masing uji

F. Landasan Teori

Heptaminol merupakan obat turunan amina yang digunakan sebagai

kardiotonik dan vasodilator. Berdasarkan strukturnya, heptaminol adalah senyawa

amina primer alifatis yang tidak memiliki gugus kromofor ataupun auksokrom.

Karena itu, perlu dilakukan derivatisasi terlebih dahulu agar menghasilkan

senyawa turunan heptaminol yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom,

sehingga dapat ditetapkan kadarnya dengan lebih spesifik dan sensitif.

Reagen penderivat OPA memiliki gugus aldehida yang dapat bereaksi

dengan gugus amina primer pada heptaminol. Reaksi ini akan menghasilkan

senyawa turunan heptaminol yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom

sehingga dapat ditetapkan kadarnya menggunakan spektrofotometri UV, yang

akan semakin meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas pengukurannya.

Metode spektrofotometri UV merupakan metode yang cukup mudah dan

cepat untuk dilakukan, serta memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang cukup

baik, sehingga umumnya dipilih sebagai metode awal dalam menetapkan kadar

suatu senyawa. Adanya peningkatan sensitivitas karena proses penderivatisasian

diharapkan akan membantu dalam memberikan linearitas yang baik antara kadar

17

derivat dengan absorbansinya, memperkecil batas deteksi dan batas kuantitasi,

serta memberikan akurasi dan presisi yang baik dalam pengukuran absorbansinya.

Penelitian ini dilakukan untuk melihat apakah metode penetapan kadar

heptaminol HCl dengan agen penderivat OPA secara spektrofotometri UV

memenuhi parameter validasi yang baik untuk spesifisitas, linearitas, batas

deteksi, batas kuantitasi, akurasi dan presisi. Dalam hal ini, spesifisitas dianalisis

berdasarkan perbandingan spektra absorbansi masing-masing senyawa (hasil

derivatisasi dan OPA), linearitas dianalisis berdasarkan koefisien korelasi ≥ 0,999,

batas deteksi dan batas kuantitasi berdasarkan perhitungan antara standar deviasi

blangko dan slope kurva baku, akurasi dianalisis berdasarkan % recovery antara

98-102%, dan presisi dianalisis berdasarkan CV (Coefficient of Variance) ≤

1,3%.

G. Hipotesis

Berdasarkan landasan teori di atas, dapat disusun hipotesis bahwa metode

spektrofotometri UV yang dikembangkan untuk heptaminol HCl memiliki

validitas yang baik untuk parameter spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas

kuantitasi, akurasi, dan presisi.

18

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan

rancangan penelitian deskriptif. Jenis penelitian non eksperimental karena tidak

dilakukan variasi uji dan manipulasi terhadap subjek uji, yaitu heptaminol HCl.

Rancangan penelitian bersifat deskriptif karena hanya mendeskripsikan keadaan

yang ada.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah seri kadar larutan heptaminol

HCl.

2. Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah spesifisitas, linearitas,

batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi.

3. Variabel pengacau terkendali

Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah cahaya, suhu

reaksi, dan kemurnian pelarut yang digunakan. OPA bersifat fotosensitif, dimana

OPA akan rusak oleh adanya cahaya. Untuk mengatasinya, maka larutan OPA

dimasukkan dalam gelas Bekker yang telah dibungkus dengan kertas aluminium,

untuk mencegah interaksi antara OPA dengan cahaya. Suhu reaksi diatur pada

19

suhu kamar terkendali (15-300C). Pelarut yang digunakan adalah pelarut dengan

derajat pro analysis yang memiliki tingkat kemurnian yang tinggi.

C. Definisi Operasional

1. Heptaminol HCl yang divalidasi adalah heptaminol HCl yang berasal dari PT.

Corsa, Indonesia (Certificate of Analysis terlampir di Lampiran 1).

2. Sistem spektrofotometri yang digunakan adalah seperangkat alat

spektrofotometer UV-Vis merek Genesys 10 UV.

3. Absorbansi yang diamati adalah absorbansi hasil derivatisasi antara heptaminol

HCl dengan OPA.

4. Parameter validasi metode yang digunakan adalah spesifisitas, linearitas, batas

deteksi, batas kuantitasi, akurasi, dan presisi.

D. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi heptaminol

HCl baku pembanding (PT. Corsa); o-ftalaldehid (p.a., Nacalai); merkaptoetanol;

metanol; asam borat; NaOH; KCl (p.a., E. Merck); aquabidestilata (LPPT UGM).

E. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Spektrofotometer

UV-Vis merk Genesys 10 UV, kuvet UV, vortex merk Thermolyne, pH meter

merk pHep Family, neraca merk PJ Precisa Junior, neraca analitik merk Precisa

20

125 A SCS, mikropipet 100-1000 µL, seperangkat alat gelas yang lazim

digunakan di laboratorium analisis.

F. Tatacara Penelitian

1. Pembuatan bufer borat pH 9

Larutkan 0,75 g H3BO3 dan 0,95 g KCl dalam aqua bidestilata sampai

125 mL. Kemudian ditambahkan dengan 52 mL larutan NaOH 0,1 M dan aqua

bidestilata sampai volume 250 mL. Ukur pH larutan, kemudian tepatkan pH-nya

menjadi 9 dengan menambahkan larutan H3BO3 atau larutan NaOH (Perrin dan

Dempsey, 1974).

2. Pembuatan larutan OPA

Timbang lebih kurang seksama 100,0 mg OPA, kemudian dilarutkan

dalam 2 mL metanol. Tambahkan 100 µL merkaptoetanol dan 200 mL bufer borat

pH 9. Campur sampai homogen. Simpan dalam lemari es dan ditempat gelap.

Larutan OPA inilah yang kemudian ditambahkan pada larutan baku heptaminol

HCl.

3. Pembuatan larutan stok heptaminol HCl (4 mg/mL)

Timbang lebih kurang seksama 100,0 mg baku heptaminol HCl,

masukkan ke dalam labu takar 25,0 mL, larutkan dengan aqua bidestilata hingga

tanda.

4. Pembuatan larutan baku heptaminol HCl

Pipet 375; 500; 625; 750; dan 875 µL dari larutan stok heptaminol HCl,

masukkan dalam labu takar 10 mL. Kemudian encerkan dengan aqua bidestilata

21

hingga volume tepat 10,0 mL, sehingga diperoleh kadar kurva baku sebesar 0,15;

0,2; 0,25; 0,3; dan 0,35 mg/mL.

5. Pembuatan kurva baku heptaminol HCl

Masukkan masing-masing 3 mL larutan OPA ke dalam 5 vial yang telah

dibungkus dengan kertas aluminium. Tambahkan masing-masing 300 µL seri

larutan baku 0,15; 0,2; 0,25; 0,3 dan 0,35 mg/mL. Vortex campuran selama 10

detik. Ukur absorbansinya pada panjang gelombang 332 nm menggunakan

spektrofotometer UV setelah didiamkan ditempat gelap dan pada suhu kamar

selama 15 menit (terhitung setelah 1,5 menit sesudah penambahan larutan

heptaminol HCl ke dalam larutan OPA). Buat kurva regresi linear antara kadar

heptaminol dengan absorbansi senyawa hasil derivatisasi, kemudian ditentukan

persamaan garis regresi linear dan tentukan nilai koefisien korelasinya.

6. Recovery kurva baku

Masukkan masing-masing 3 mL larutan OPA ke dalam 3 vial yang telah

dibungkus dengan kertas aluminum. Tambahkan masing-masing 300 µL seri

larutan baku 0,15; 0,25; dan 0,35 mg/mL. Vortex campuran selama 10 detik. Ukur

absorbansinya pada panjang gelombang 332 nm menggunakan spektrofotometer

UV setelah didiamkan ditempat gelap dan pada suhu kamar selama 15 menit

(terhitung setelah 1,5 menit sesudah penambahan larutan heptaminol HCl ke

dalam larutan OPA). Replikasi masing-masing konsentrasi dilakukan sebanyak 5

kali sehingga diperoleh 15 data. Catat absorbansi yang diperoleh. Kadar

heptaminol HCl dihitung dengan memasukkan nilai absorbansi ke persamaan

kurva baku yang diperoleh.

22

G. Analisis Hasil

Validasi metode analisis yang digunakan dalam penetapan kadar

heptaminol pada penelitian ini dapat ditentukan berdasarkan parameter berikut:

1. Spesifisitas

Bandingkan antara spektra panjang gelombang maksimal yang dihasilkan

oleh reagen OPA dan pelarut dengan spektra panjang gelombang maksimal

campuran heptaminol HCl dengan reagen OPA. Jika panjang gelombang

maksimal serapannya berbeda, dikatakan bahwa metode tersebut spesifik

(Anonim, 2005b). Spesifisitas metode ini juga dilihat dari seberapa besar tingkat

overlapping yang terjadi antara hasil derivatisasi dengan reagen OPA.

2. Linearitas kurva baku

Linearitas dilihat dari nilai koefisien korelasi (r) dari hasil pengukuran

seri larutan baku heptaminol. Suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang

baik jika nilai r ≥ 0,999 (Snyder et al., 1997).

3. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)

Ukur absorbansi larutan baku konsentrasi terkecil minimal 3 kali. Nilai

LOD diperoleh pada 3 x SD dibagi slope dan nilai LOQ diperoleh pada 10 x SD

dibagi slope (Anonim, 2005b).


Akurasi metode analisis dinyatakan dengan koefisien variasi (KV) yang

dihitung dengan cara berikut:

KV = . x 100 %

23

Kriteria presisi yang diterima untuk kadar zat aktif ≥ 0,1 % adalah KV ≤ 3,7 %

(Huber, 2003).


Akurasi metode analisis dinyatakan dengan % perolehan kembali

(recovery) yang dihitung dengan cara berikut:

% recovery = x 100 %

Kriteria akurasi yang diterima untuk kadar zat aktif ≥ 0,1 % adalah 95-105 %

(Huber, 2003).

24

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pembuatan Larutan

1. Larutan heptaminol HCl

Dalam pembuatan larutan heptaminol HCl digunakan aqua bidestilata

sebagai pelarut. Heptaminol yang digunakan sebagai baku adalah heptaminol

HCl, yang berbentuk garam, sehingga mudah larut di dalam air. Sebagai pelarut

digunakan aqua bidestilata, yaitu air yang mengalami penyulingan sebanyak dua

kali, untuk menjamin kemurniannya serta tidak mengandung bahan-bahan lain

yang mungkin dapat mengganggu pada saat analisis. Aqua bidestilata juga

memenuhi kriteria pelarut yang baik untuk analisis secara spektrofotometri, yaitu

tidak mengabsorbsi radiasi UV pada daerah yang sama dengan analitnya, tidak

memiliki sistem rangkap terkonjugasi, tidak berwarna, tidak berinteraksi dengan

analit, serta memiliki kemurnian yang tinggi (dibandingkan dengan aqua destilata)

sehingga dapat digunakan untuk analisis.

2. Larutan OPA

Pembuatan larutan OPA mengikuti cara pembuatan reagen yang

tercantum dalam deskripsi produk untuk “OPA, Amine Detection Reagent” dari

Uptima. OPA dilarutkan dalam metanol, karena OPA larut dalam metanol

(Anonim, 2010c). Metanol merupakan pelarut organik yang cukup polar, dengan

indeks polaritas metanol sebesar 6,6 dan memiliki kelarutan dalam air sebesar

100% (Stauffer, Dolan, dan Newman, 2008). Metanol juga memiliki UV-cut off

25

pada panjang gelombang 205 nm (Pavia, et al., 2001), sehingga kehadirannya

tidak akan mengganggu pengukuran absorbansi analit. Setelah dilarutkan dalam

metanol, kemudian ditambahkan merkaptoetanol, yaitu senyawa pengkopling

yang akan menambah gugus auksokrom dari derivat yang terbentuk antara

heptaminol dengan OPA. Gugus auksokrom ini akan memperpanjang konjugasi

gugus kromofor dari hasil derivatisasinya, sehingga kemudian akan meningkatkan

nilai absorbtivitas molar (ε) dari derivatnya, yang menyebabkan peningkatan nilai

absorbansi pada konsentrasi yang sama. Merkaptoetanol merupakan senyawa

organik, sehingga lebih mudah bercampur dalam pelarut metanol.

Dalam larutan OPA ini kemudian ditambahkan bufer borat pH 9. pH

yang digunakan dipilih berdasarkan hasil optimasi dari penelitian Susanti (2011),

yaitu mengenai optimasi metode penetapan kadar heptaminol dengan agen

penderivat OPA secara spektrofotometri UV. Larutan OPA dibuat bersifat basa

karena pada pH di bawah 6, tidak terjadi reaksi antara OPA dengan amina primer

(Blackburn, 1989). Hal ini disebabkan karena pada suasana basa, amina primer

akan terdapat dalam bentuk molekul seluruhnya, sehingga akan terbentuk reaksi

antara OPA dengan amina primer yang optimal.

Pada pH yang lebih tinggi (pH > 10) dan pada suhu tinggi (> 400C),

gugus aldehid dari OPA akan mengalami reaksi Cannizzaro (self reaction)

menghasilkan ion o-hidroksimetil benzoat (Gambar 5.). Senyawa hasil reaksinya

ini sukar bereaksi dengan heptaminol, karena gugus C karbonilnya akan menjadi

kurang elektrofil dibandingkan dengan C karbonil dari OPA. Hal ini disebabkan

karena adanya stabilisasi resonansi antara elektron bebas dari gugus O karbonil

26

kepada gugus C karbonilnya. Menurut McDonald dan Sibley (1981), pada pH 10-

14, terjadi penurunan nilai ε dari OPA. Penurunan ini disebabkan karena adanya

pengurangan gugus kromofor OPA, dimana ikatan rangkap dari gugus aldehid

OPA akan hilang. Oleh karena itu, maka dalam penelitian ini digunakan larutan

OPA pada pH 9, dimana seluruh heptaminol HCl telah berubah menjadi

heptaminol, dan mencegah terjadinya reaksi Cannizzaro dari OPA.

O

O

H2O

OH

OH

O

O

OH

O

-OH

O

O

OH

-OH

O

O

O

O

O

O

-OH -OH

Gambar 5. Reaksi Cannizzaro pada OPA (McDonald dan Sibley, 1981)

Larutan OPA yang telah siap kemudian dimasukkan kedalam lemari

pendingin, karena larutan ini hanya dapat tahan pada suhu ruangan selama 2 jam

saja. Selain itu, OPA mudah rusak oleh cahaya (fotodegradatif), sehingga harus

disimpan dalam tempat yang gelap. Dengan adanya cahaya yang memberikan

OPA

27

energi, kemungkinan OPA dapat mengalami oksidasi oleh udara, sehingga

menghasilkan bentuk karboksilatnya seperti terlihat pada Gambar 6. Namun,

reaksi ini hanya merupakan usulan reaksi, karena belum ada referensi yang

memberikan reaksi fotodegradasi OPA yang sesungguhnya.

H

O

O

H

O2

O

OH

O

H

4 3 2

2-formylbenzoic acidO-phthalaldehyde

O

OH

O

OH

phthalic acid

Gambar 6. Usulan reaksi fotodegradasi OPA

Dalam suasana basa, asam 2-formilbenzoat dan asam ftalat berada dalam

bentuk terion, yang menyebabkan sangat sukarnya terjadi reaksi adisi amina

nukleofilik oleh gugus amina dari heptaminol. Stabilisasi resonansi antara gugus

O dengan C karbonil akan menyebabkan atom C karbonil semakin stabil dan

kurang elektrofilik. Oleh karena itu, jika OPA telah mengalami fotodegradasi,

maka tidak akan memberikan hasil derivatisasi dengan heptaminol seperti yang

diharapkan.

3. Larutan baku heptaminol HCl

Larutan baku heptaminol HCl terdiri dari larutan heptaminol HCl yang

dicampur dengan larutan OPA. Secara teoritis, reaksi antara heptaminol dengan

OPA membutuhkan heptaminol dan OPA dengan perbandingan molekul yang

sama (1:1). Namun, untuk menjamin bahwa semua heptaminol telah

terderivatisasi, maka penambahan OPA dibuat berlebih. Pembuatan larutan baku

ini mengikuti prosedur preparasi sampel yang terdapat dalam deskripsi produk

2

28

OPA dari Uptima, yaitu dengan perbandingan sekitar 1:40. Reagen OPA memiliki

absorban maksimal pada panjang gelombang 206 nm (Gambar 10.), sehingga sisa

reagen OPA ini tidak akan mengganggu perhitungan absorbansi dari hasil derivat

yang terbentuk.

Campuran antara heptaminol dan OPA kemudian disimpan ditempat

gelap pada suhu kamar. Hal ini disebabkan karena OPA bersifat fotodegradatif,

sehingga akan rusak oleh cahaya. Jika OPA telah rusak oleh cahaya, maka tidak

akan terbentuk hasil derivatisasinya dengan heptaminol. Reaksinya dilakukan

pada suhu kamar, karena menurut Braithwaite dan Smith (1999) serta Blackburn

(1989), reaksi antara amina primer dengan OPA berlangsung cepat pada suhu

kamar, selain itu pengendalian suhunya menjadi lebih mudah. Menurut Direktorat

Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI (1995), suhu kamar terkendali adalah

suhu dengan rentang 15-300C.

OPA bereaksi dengan heptaminol menghasilkan senyawa yang memiliki

kromofor dan auksokrom. Senyawa hasil derivatisasi inilah yang kemudian diukur

absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV. Reaksi yang terbentuk antara

heptaminol dengan OPA ditunjukkan dalam Gambar 7. Gugus kromofor dan

auksokrom dari senyawa hasil derivatisasi ditunjukkan dalam Gambar 8.

O

O

H

HNH2

CH3

OH

CH3HS

OHS

OH

N

CH3 CH3

OH

Gambar 7. Reaksi antara OPA dengan heptaminol bersama merkaptoetanol akanmenghasilkan senyawa hasil derivatisasi yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom

29

S

OH

N

CH3 CH3

OH

Gambar 8. Gugus kromofor dan auksokrom dari senyawa hasil derivatisasi (Guguskromofor ditunjukkan oleh garis lurus, sedangkan gugus auksokrom ditunjukkan oleh garis

titik-titik)

Seri larutan baku heptaminol HCl yang dibuat memiliki konsentrasi 0,15;

0,2; 0,25; 0,3; dan 0,35 mg/mL. Dari seri larutan baku ini, kemudian dibuat kurva

regresi linear untuk heptaminol HCl.

B. Pembuatan Kurva Baku Heptaminol HCl

Kurva baku heptaminol HCl dibuat dengan mengukur absorbansi dari

masing-masing seri larutan baku heptaminol HCl, kemudian ditentukan

persamaan kurva bakunya menggunakan persamaan regresi linear. Kurva baku ini

merupakan hubungan antara absorbansi derivat yang terbentuk dengan kadar

heptaminol HCl. Seluruh heptaminol akan bereaksi dengan OPA membentuk

derivatnya, sehingga absorbansi derivat menunjukkan absorbansi dari heptaminol

HCl (A derivat ≈ A heptaminol HCl). Berdasarkan kurva baku ini, kadar

heptaminol HCl dalam sampel dapat diketahui.

Kurva baku heptaminol HCl dibuat menggunakan lima seri kadar

heptaminol HCl, yaitu 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; dan 0,35 mg/mL, serta dilakukan tiga

kali replikasi untuk masing-masing konsentrasi. Pemilihan seri kadar ini

dilakukan berdasarkan kadar yang memberikan absorbansi sekitar 0,2 – 0,8.

Menurut Mulja dan Suharman (1995), pada rentang absorbansi 0,2 sampai 0,8

30

memberikan persentase kesalahan yang kecil, yaitu 0,5 – 1,0%. Pengukuran

absorbansi dilakukan pada panjang gelombang maksimum derivat yang terbentuk,

yaitu pada panjang gelombang 332 nm dan pada waktu reaksi optimum 15 menit

(terhitung setelah 1,5 menit sesudah penambahan larutan heptaminol HCl ke

dalam larutan OPA) berdasarkan hasil optimasi penelitian Susanti (2011).

Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi seri kadar heptaminol HCl,

diperoleh data seperti yang tertera dalam Tabel IV. Untuk selanjutnya, data

absorbansi tersebut kemudian ditentukan persamaan kurva bakunya dan koefisien

korelasi (r) untuk masing-masing replikasi.

Tabel IV. Data replikasi kurva baku heptaminol HCl

Konsentrasiheptaminol HCl

(mg/ml)Absorbansi*(replikasi I)

Absorbansi*(replikasi II)

Absorbansi*(replikasi III)

0,1430 0,281 0,279 0,269

0,1906 0,391 0,396 0,401

0,2383 0,493 0,502 0,505

0,2859 0,617 0,593 0,623

0,3336 0,717 0,709 0,702Persamaan kurva

baku y = 2,3043 x – 0,0492 y = 2,2182 x – 0,0327 y = 2,2833 x – 0,044Koefisien korelasi

(r) 0,9995 0,9992 0,9968

Α 66,540 65,730 66,340

* = absorbansi hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA.

Berdasarkan ketiga replikasi tersebut, kemudian dipilih yang

memberikan linearitas yang paling baik. Linearitas yang baik dilihat dari koefisien

korelasinya (r), yang menyatakan hubungan antara kadar heptaminol HCl dan

absorbansi derivatnya. Menurut Snyder et al. (1997), syarat koefisien korelasi

yang baik adalah ≥ 0,999. Baik replikasi I maupun II memiliki nilai r > 0,999.

Namun, yang digunakan selanjutnya adalah persamaan kurva baku dari replikasi I

31

karena memiliki nilai koefisien korelasi yang paling besar, yang menunjukkan

bahwa hubungan antara kadar heptaminol HCl dan absorbansi derivatnya semakin

besar. Hal ini berarti bahwa dengan peningkatan kadar heptaminol HCl, maka

absorbansi yang diperoleh akan semakin besar, dan peningkatannya linier.

Hubungan antara kadar heptaminol HCl dan absorbansi derivatnya ini dapat

diamati pada Gambar 9.

*= absorbansi hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPAGambar 9. Hubungan antara kadar heptaminol HCl dengan absorbansi derivatnya pada

replikasi I

C. Validasi Metode

Parameter validitas metode untuk penetapan kadar heptaminol HCl

secara spektrofotometri UV yang diamati dalam penelitian ini adalah spesifisitas,

linearitas, LOQ, LOD, akurasi, dan presisi.

32

1. Spesifisitas

Spesifisitas suatu metode adalah kemampuan metode tersebut untuk

mengukur zat tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain

dalam matriks sampel (Anonim, 2006). Spesifisitas metode dalam penelitian ini

dilakukan dengan membandingkan antara panjang gelombang maksimal yang

dihasilkan oleh reagen OPA dan pelarut dengan panjang gelombang maksimal

campuran heptaminol HCl dengan reagen OPA, serta tingkat overlapping yang

terjadi. Jika panjang gelombang maksimal absorbannya berbeda, dikatakan bahwa

metode tersebut spesifik (Anonim, 2005b). Hal ini disebabkan karena pada

panjang gelombang pengukuran tersebut tidak terdapat absorban dari senyawa

lain selain analitnya, sehingga hanya absorbansi dari analit saja yang terukur.

Berdasarkan hasil penelitian diperoleh bahwa panjang gelombang

maksimum untuk reagen OPA adalah 206 nm, seperti terlihat pada Gambar 10.

Panjang gelombang maksimum untuk hasil derivatisasi antara OPA dengan

heptaminol HCl adalah 332 nm, yang terlihat pada Gambar 12 (A). Pada spektra

absorbansi yang diperoleh dari reagen OPA, diketahui bahwa OPA tidak

memberikan absorbansi yang berarti pada panjang gelombang 332 nm.

33

*= absorbansi larutan OPA (0,05 mg/mL) dalam bufer borat pH 9.

Gambar 10. Spektra absorbansi OPA

Derivat yang terbentuk antara OPA dengan heptaminol memiliki

keterbatasan, yaitu akan terdegradasi seiring berjalannya waktu.

SOH

N

CH3 CH3

OHN

OCH3 CH3

OH

Gambar 11. Reaksi degradasi hasil derivatisasi antara OPA dengan heptaminol(Lindroth, 1985)

Setelah dilakukan scanning panjang gelombang maksimal hasil degradasi

derivatnya, maka diperoleh bahwa hasil degradasinya memiliki absorban

maksimal pada panjang gelombang 269 nm (Gambar 12. (B)).

λ = 206 nm

34

*= absorbansi hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA (kadar 0,25 mg/mL).

Gambar 12. (A) Spektra absorbansi hasil derivatisasi setelah 1,5 menit penambahan reagenOPA; (B) Spektra absorbansi hasil derivatisasi setelah 1 jam reaksi

Berdasarkan Gambar 12.(A) terlihat bahwa pada waktu 1,5 menit setelah

penambahan reagen OPA, telah terjadi degradasi dari hasil derivatisasinya.

Kemudian, pada waktu 1 jam setelah reaksi berlangsung, absorbansi dari hasil

degradasi meningkat, sedangkan absorbansi hasil derivatisasinya menurun

(Gambar 12. (B)).

Salah satu keterbatasan pada penelitian ini adalah tidak dilakukannya

pengukuran spektrum absorbansi dari hasil derivatisasi pada menit ke-15. Dari

spektrum ini kemudian dapat dilihat bagaimana pengaruh hasil degradasinya

terhadap hasil derivatisasi, yaitu seberapa besar tingkat overlapping-nya. Tetapi,

perkiraan spektrum absorbansi pada menit ke-15 ini dapat dibuat dengan

menggunakan perbandingan antara absorbansi yang diperoleh pada menit ke-0

(1,5 menit setelah penambahan larutan OPA) dengan absorbansi yang diperoleh

pada menit ke-60. Seperti yang terlihat pada Gambar 13., tingkat overlapping

λ = 269 nm

35

antara spektrum absorbansi hasil derivatisasi dengan spektrum absorbansi hasil

degradasinya hanya terjadi sangat sedikit, sehingga dapat dikatakan bahwa hasil

degradasinya tidak mengganggu dalam pengukuran absorbansi hasil derivatisasi

antara heptaminol HCl dengan OPA.

*=absorbansi hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA (kadar 0,25 mg/mL)

Gambar 13. Perkiraan spektra absorbansi hasil derivatisasi setelah 15 menit reaksi

Karena pada panjang gelombang pengukuran (332 nm) tidak terdapat

gangguan dari senyawa lain, baik dari pereaksi, pelarut, maupun hasil

degradasinya, maka dapat dikatakan bahwa metode ini spesifik untuk penetapan

kadar heptaminol HCl.

2. Linearitas

Linearitas dalam metode ini ditentukan berdasarkan koefisien korelasi (r)

yang diperoleh dari persamaan kurva baku untuk heptaminol HCl. Menurut

Snyder et al. (1997), syarat suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik

adalah bila nilai koefisien korelasi (r)-nya ≥ 0,999. Nilai r menunjukkan hubungan

antara kadar analit dengan absorbansi yang dihasilkan. Semakin besar nilai r,

maka hubungan antara kadar analit dan absorbansinya semakin linear. Jika nilai r

λ = 269 nm

λ =332 nm

36

≥ 0,999, maka dikatakan bahwa hubungan tersebut linear. Berdasarkan hasil

pengukuran dari tiga replikasi diperoleh nilai r masing-masing 0,9995; 0,9992;

dan 0,9968 (tabel IV). Dari hasil ini dapat dikatakan bahwa replikasi 1 dan 2

memenuhi syarat linearitas yang baik. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa

metode penetapan kadar heptaminol HCl dengan agen penderivat OPA secara

spektrofotometri UV memiliki linearitas yang baik.

3. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)

Menurut United States Pharmacopeial Convention (2005), penetapan

kadar zat aktif dalam suatu sediaan obat termasuk dalam kategori I, dimana

metode validasinya tidak memerlukan parameter batas deteksi dan batas

kuantitasi. Namun, dalam penelitian ini dilakukan penetapan batas deteksi dan

batas kuantitasi, dengan maksud memberikan informasi mengenai sensitivitas dari

metode ini dalam mendeteksi heptaminol HCl dalam suatu sediaan farmasi.

Informasi batas deteksi dan batas kuantitasi ini juga akan membantu dalam

penentuan kadar seri larutan baku yang akan digunakan.

LOD adalah konsentrasi terkecil suatu analit dalam sampel yang dapat

terdeteksi. Dalam metode spektrofotometri, LOD secara teoritis diperoleh dengan

rumus: LOD = (Anonim, 2005b).

Berdasarkan persamaan kurva baku replikasi pertama yang digunakan

dalam penetapan kadar selanjutnya, maka slope-nya adalah 2,3043. SD (standard

deviation) yang digunakan diperoleh dari pengukuran blangko sebanyak 10 kali.

Blangko yang digunakan adalah larutan OPA dalam bufer borat pH 9. Data

absorbansi blangko yang diperoleh dapat dilihat dalam tabel V.

37

Tabel V. Data absorbansi blangko larutan OPA dalam bufer borat pH 9

Absorbansi

0,070

0,069

0,069

0,070

0,070

0,070

0,069

0,069

0,069

0,069

= 0,0694

SD = 0,000516

CV = 0,74%

Secara teoritis, berdasarkan rumus tersebut diperoleh bahwa LOD dari

metode ini sebesar 0,67 µg/mL. Cara perhitungannya dapat dilihat dalam

Lampiran 7.

LOQ adalah konsentrasi terkecil suatu analit dalam sampel yang masih

memenuhi syarat akurasi dan presisi yang baik. Dalam metode spektrofotometri,

LOQ secara teoritis diperoleh dengan rumus: LOQ = (Anonim,

2005b).

Seperti pada LOD, nilai slope untuk penentuan LOQ berasal dari slope

kurva baku, yaitu 2,3043. Demikian pula nilai SD yang digunakan berasal dari

nilai SD pengukuran blangko larutan OPA dalam bufer borat pH 9 sebanyak 10

kali. Berdasarkan rumus tersebut, LOQ secara teoritis dari metode ini diperoleh

pada kadar 2,23 µg/mL (cara perhitungannya dapat dilihat pada Lampiran 7.).

LOQ dalam penentuan kadar zat aktif yang terdapat di dalam suatu sediaan tidak

dapat digunakan sebagai kadar terkecil dari kurva baku, namun dapat digunakan

38

sebagai kadar terkecil kurva baku dalam metode bioanalisis (Mulja dan

Suharman, 1995).


Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan kedekatan antara kadar yang

terukur dalam suatu metode dengan kadar sebenarnya. Menurut Harmita (2004),

akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali analit yang ditambahkan (%

recovery). Dalam suatu larutan baku (konsentrasi 100%), syarat % recovery yang

baik menurut Huber (2003) adalah 98-102%.

Setelah dilakukan 5 kali replikasi dari masing-masing konsentrasi larutan

baku, baik rendah, tengah dan tinggi, diperoleh bahwa % recovery dari masing-

masing konsentrasi terdapat dalam rentang antara 98-102%. Persen recovery

untuk larutan baku heptaminol HCl kadar 0,1446 mg/mL berkisar antara 99,93-

100,89%, untuk kadar 0,241 mg/mL berkisar antara 99,96-101,78%, dan untuk

kadar 0,3374 mg/mL berkisar antara 99,32-101,24% (Lampiran 8.). Hal ini

menunjukkan bahwa pengukuran heptaminol HCl menggunakan metode ini

memberikan akurasi yang bagus, baik pada konsentrasi rendah, tengah, maupun

tinggi.


Presisi adalah derajat kesesuaian nilai antar data yang diperoleh untuk

beberapa sampling pada suatu sampel homogen menggunakan suatu metode

analisis. Menurut United Stated Pharmacopeial Convention (2005), presisi suatu

metode ditentukan dari koefisien variasi (CV) yang diperoleh dari pengulangan

39

pengukuran suatu sampel homogen. Dalam suatu larutan baku (konsentrasi

100%), syarat CV yang baik menurut Huber (2003) adalah ≤ 1,3%.

Setelah dilakukan 5 kali replikasi dari masing-masing konsentrasi larutan

baku, baik rendah, tengah dan tinggi, diperoleh bahwa CV dari masing-masing

konnsetrasi berada di bawah 1,3%. CV untuk larutan baku heptaminol HCl kadar

0,1446 mg/mL sebesar 0,38%, untuk kadar 0,241 mg/mL sebesar 0,98%, dan

untuk kadar 0,3374 mg/mL sebesar 0,85% (Lampiran 8.). Hal ini menunjukkan

bahwa pengukuran heptaminol HCl menggunakan metode ini memiliki presisi

yang baik untuk konsentrasi 0,1446, 0,241, dan 0,3374 mg/mL.

40

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Metode spektrofotometri UV yang dikembangkan untuk penetapan kadar

heptaminol HCl dengan agen penderivat OPA memiliki validitas yang baik untuk

parameter spesifisitas, linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi dan

presisi.

B. Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai aplikasi metode

penetapan kadar heptaminol HCl dengan agen penderivat OPA secara

spektrofotometri UV dalam sediaan obat yang beredar di masyarakat.

41

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1989, The Merck Index, an Encyclopedia of Chemicals, Drugs, andBiologicals, 11th ed., Merck&Co., Inc., USA, pp.4576.

Anonim, 2005a, Safety Data for O-Phtalaldehyde,http://msds.chem.ox.ac.uk/PH/o-phthalaldehyde.html, diakses 28 Mei2010.

Anonim, 2005b, Validation Of Analytical Procedures: Text And MethodologyQ2(R1), International Conference On Harmonization Of TechnicalRequirements For Registration Of Pharmaceuticals For Human Use, 7,11-12.

Anonim, 2006, Validation,http://www.labcompliance.com/methods/methval.htm#validation%20of%20standard%20methods, diakses tanggal 6 Juni 2010.

Anonim, 2010a, VentiCardyl®, http://www.agrovetmarket.com/Files/046885c0-6ae7-4346-8371-6022b05e69cc.pdf, diakses tanggal 28 Mei 2010.

Anonim, 2010b, Committee For Veterinary Medicinal Products, Heptaminol;Summary Report, EMEA, 043, 95.

Anonim, 2010c, Material Safety Data Sheet O-Phthalaldehyde MSDS,http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9926544, diakses tanggal28 Mei 2010.

Ahmed, H., 2005, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification,and Characterization, CRC Press, USA, pp.64-66.

Benson, J.R., dan Hare, P.E., 1975, o-Phthalaldehyde: Fluorogenic Detection ofPrimary Amines in the Picomole Range. Comparison with Fluorescamineand Ninhydin, Proc. Nat. Acad. Sci., 72(2), 619-622.

Blackburn, S., 1989, Handbook of Chromatography, CRC Press, USA, pp.268.

Braithwaite, A., dan Smith, F.J., 1999, Chromatographic Methods, 5th ed., KluwerAcademic Publishers, The Netherlands, pp.499.

Brodie, R.R., Chasseaud, L.F., Rooney, L., Darragh, A., dan Lambe, R.F., 1983,Determination of Heptaminol In Human Plasma and Urine By High-Performance Liquid Chromatography, J. Chromatogr. B Biomed. Sci.Appl., 274, 179-186.

Day, R.A., dan Underwood, A.L., 2002, Quantitative Analysis ed.6,diterjemahkan oleh Iis Sopyan, Penerbit Erlangga, Jakarta, pp.385,388.

42

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, FarmakopeIndonesia, jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta,pp.li.

Fattah, A., El-Yazbi, F.A., Belal, S.F., dan Abdel-Razak, O., 1997,Spectrophotometric and Spectrofluorometric Determination of Heptaminoland Mexiletine in Their Dosage Forms, Analytic. Lett., 30, 2029-2043.

Hardjasaputra, P., Budipranoto, G., Sembiring, S.U., dan Kamil, I., 2002, DOI :Data Obat di Indonesia, edisi 10, Grafidian Medipress, Jakarta, pp.837-838.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3), 117-134.

Huber, L., 2003, Validation of Analytical Methods and Processes, in Nash, R.A.,and Wachter, A.H., Pharmaceutical Process Validation, an InternationalThird Edition, Revised and Expanded, Marcell Dekker, Inc., USA, pp.518-520.

Khopkar, S.M., 1990, Basic Concepts of Analytical Chemistry, diterjemahkanoleh Saptorahardjo, UI Press, Jakarta, pp.191,201-202.

Lam, H., 2004, Performance Verification of HPLC,http://www.cvg.ca/images/HPLC-PV.pdf, diakses tanggal 6 Juli 2010.

Lindroth, P., Hamberger, A., dan Sandberg, M., 1985, Neuromethods; 3, AminoAcids, The Humana Press, Inc., USA, pp.98-100.

McDonald, R.S., dan Sibley, C.E., 1981, The Intramolecular Cannizzaro Reactionof Phthalaldehyde, Can. J. Chem., 59, 1061- 1067.

Morros, A., Borja, L., dan Segura, J., 1985, Determination of Heptaminol InPlasma By Thin-Layer Chromatography and In Situ Fluorimetry, J.Pharm. Biomed. Anal., 3, 149-156.

Mukti, A.A., 2011, Penetapan Kadar Heptaminol HCl Dalam Sediaan TabletDengan Agen Penderivat O-Ftalaldehid Secara SpektrofotometriUtraviolet, Skripsi, 1-3, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga,Surabaya, pp.6-11, 26-34, 267.

Mulja, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik(Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Airlangga, 3(2), 71-76.

Munson, J.W., 1984, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkanoleh Harjana, Universitas Airlangga Press, Surabaya, pp.15, 33-34.

43

Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, UGM Press, Yogyakarta, pp.16-17.

Pavia, D.L., Lampman, G.M., dan Kriz, G.S., 2001, Introduction to Spectroscopy,3th ed., Thomson Learning, Inc., USA, pp.187, 358-359, 381-382.

Perrin, D.D. dan Dempsey, B., 1974, Buffers for pH and Metal Ion Control,Chapman and Hall, London, pp.147.

Redja, W., 1980, Teori Dasar Analisa Farmasi ed. I, Departemen Kesehatan RI,Jakarta, pp.102-119.

Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, Liberty, Yogyakarta, pp.1-43.

Smith, R.M., 1988, Gas and Liquid Chromatography in Analytical Chemistry,Willey, New York, pp.177.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., dan Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC MethodDevelopment, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp.67, 161, 687-691.

Stauffer, E., Dolan, J.A., dan Newman, R., 2008, Fire Debris Analysis, Elsevier,Inc., USA, pp.389.

Susanti, F., 2011, Optimasi Metode Penetapan Kadar Heptaminol HCl DenganAgen Penderivat O-Ftalaldehid Secara Spektrofotometri Ultraviolet, Skripsi,1-3, 46, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

United States Pharmacopeial Convention, 2005, The United States Pharmacopeia,28th edition, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville,pp.2748-2751.

Williams, D.H., dan Fleming, I., 1980, Spectroscopic Methods in OrganicChemistry, 3th ed., McGraw-Hill Book Company (UK) Limited, England,pp.4.

45

Lampiran 1. Sertifikat Analisis Heptaminol HCl dari PT. Corsa

46

Lampiran 2. Hasil scanning panjang gelombang larutan OPA

*= absorbansi larutan OPA (0,05 mg/mL) dalam buffer borat pH 9

λ= 206 nm

47

Lampiran 3. Hasil scanning panjang gelombang hasil derivatisasi antaraOPA dan heptaminol setelah 1,5 menit reaksi

*= absorbansi hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA (kadar 0,25 mg/mL)

λ= 332 nm

48

Lampiran 4. Hasil scanning panjang gelombang hasil degradasi dari hasilderivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA

*= absorbansi hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA (kadar 0,25 mg/mL) setelah 1

jam reaksi

λ= 269 nm

49

Lampiran 5. Contoh Perhitungan Kadar Larutan Baku Heptaminol HCl

a. Skema pembuatan

Kurang lebih 100 mg serbuk heptaminol HCl ditimbang seksama

Larutkan dalam 25 mL aqua bidestilata

Pipet 375; 500; 625; 750; dan 875 µL

Encerkan masing-masing dengan aqua bidestilata sampai volumenya tepat 10

mL.

b. Perhitungan seri kadar heptaminol HCl

Bobot heptaminol HCl hasil penimbangan = 95,3 mg

Kadar heptaminol HCl dalam 25 mL aqua bidestilata = 95,3 mg/25 mL

= 3,812 mg/mL

Seri kadar Perhitungan kadar heptaminol HCl

1 = 0,1430 mg/mL

2 = 0,1906 mg/mL

3 = 0,2383 mg/mL

4 = 0,2859 mg/mL

5 = 0,3336 mg/mL

50

Lampiran 6. Perhitungan Persamaan Kurva Baku Heptaminol HCl

a. Pengukuran absorbansi seri larutan baku heptaminol HCl

C (mg/mL) A I A II A III

0,1430 0,281 0,279 0,269

0,1906 0,391 0,396 0,401

0,2383 0,493 0,502 0,505

0,2859 0,617 0,593 0,623

0,3336 0,717 0,709 0,702

b. Perhitungan persamaan kurva baku heptaminol HCl menggunakan regresi

linear

Replikasi 1 : y = 2,3043 x – 0,0492

r = 0,9995

Replikasi 2 : y = 2,2182 x – 0,0327

r = 0,9992

Replikasi 3 : y = 2,2833 x – 0,044

r = 0,9968

51

c. Kurva baku heptaminol HCl

Replikasi 1

*= absorbansi hasil derivatisasi antara heptaminol HCl dengan OPA

Replikasi 2


52

Replikasi 3


53

Lampiran 7. Perhitungan LOD dan LOQ

Bobot OPA hasil penimbangan = 100 mg

a. Skema pembuatan larutan blangko (OPA dalam larutan bufer borat pH 9)

Timbang 100 mg OPA

Tambahkan 2 mL methanol p.a. dan 100 µL merkaptoetanol p.a. Aduk hingga

OPA larut.

Tambahkan 200 mL larutan bufer borat pH 9. Aduk homogen.

b. Pengukuran absorbansi larutan blangko

Absorbansi

0,070

0,069

0,069

0,070

0,070

0,070

0,069

0,069

0,069

0,069= 0,0694

c. Perhitungan SD dan CV blangko

SD = = 0,00516

CV = x 100% = x 100% = 0,74%

54

d. Perhitungan LOD

LOD = = = 0,67 µg/mL

e. Perhitungan LOQ

LOQ = = = 2,23 µg/mL

55

Lampiran 8. Perhitungan akurasi dan presisi larutan baku heptaminol HCl

Bobot heptaminol HCl hasil penimbangan = 96,4 mg

Kadar heptaminol HCl dalam 25 mL aqua bidestilata = 96,4 mg/25 mL

= 3,856 mg/mL (Li)

a. Skema pembuatan

Pipet 375; 625; dan 875 µL dari larutan stok (Li) heptaminol HCl

Encerkan masing-masing dengan aqua bidestilata sampai volumenya tepat

10 mL.

Pipet 300 µL dari tiap konsentrasi, masukkan dalam vial, tambahkan 3 mL

larutan OPA.

Vortex selama 10 detik, kemudian diamkan selama 16,5 menit.

Ukur absorbansinya pada λ 332 nm. Lakukan 5 kali replikasi untuk tiap

konsentrasi.

b. Perhitungan akurasi dan presisi

Larutan baku heptaminol HCl kadar 0,1446 mg/mL

Absorbansi Kadar terukur (mg/mL) % recovery (%)0,287 0,1459 100,890,286 0,1455 100,620,286 0,1455 100,620,284 0,1445 99,930,286 0,1455 100,62

0,2858

SD 0,00109CV 0,38%

56

Contoh perhitungan kadar terukur

Persamaan kurva baku heptaminol HCl : y = 2,3043 x – 0,0492

x = kadar terukur; y = absorbansi

y = 2,3043 x – 0,0492

0,287 = 2,3043 x – 0,0492

x = 0,1459 mg/mL

Demikian pula untuk perhitungan kadar terukur lainnya.

Contoh perhitungan % recovery

% recovery = x 100 %

% recovery = x 100 % = 100,89%

Demikian pula untuk perhitungan % recovery lainnya.

Larutan baku heptaminol kadar 0,241 mg/mL


0,5112

SD 0,00501CV 0,98%

57

Larutan baku heptaminol HCl kadar 0,3374 mg/mL


0,7288

SD 0,00622CV 0,85%

58

BIOGRAFI PENULIS

Agnes Anania Triavika Sahamastuti lahir di Bekasi, 6

Januari 1990. Anak kedua dari pasangan Bpk. Ir.

Joehantono dan Ibu Tjan Giok Giem ini menempuh

pendidikan TK di TK Santa Maria Monica Bekasi, dan

melanjutkan pendidikan SD di SD Santa Maria Monica

Bekasi. Penulis kemudian menempuh pendidikan SMP di SMP Marsudirini

Bekasi pada tahun 2001 dan SMF BPK Penabur Jakarta pada tahun 2004.

Setelah lulus SMA, penulis melanjutkan pendidikan ke Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta di tahun 2007. Selama kuliah, penulis

sempat mengikuti beberapa kegiatan fakultas, antara lain Persekutuan Mahasiswa

Kristen (PMK) Apostolos 2007-2009, anggota Jaringan Mahasiswa Kesehatan

Indonesia (JMKI) 2007-2009, anggota Pengabdian Masyarakat (PM) mengenai

Penyuluhan Penggunaan Antibiotika yang Baik dan Benar tahun 2009, ketua

Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) tahun 2009 dengan judul Pembuatan Nata

dari Kulit Buah Rambutan dan anggota PKM tahun 2009 dengan judul Pembuatan

Sediaan Cold Cream Anti Histamin Ekstrak Umbi Bawang Merah (Allium cepa

L.) dengan Metode Simplex Lattice.

Selain itu, penulis juga sempat menjadi asisten untuk beberapa mata kuliah

praktikum, antara lain Kimia Organik 2008, Kimia Analisis 2009 dan 2010, FTS

Semi Solid Liquid 2010, dan Analisis Makanan 2010.

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR HEPTAMINOL HCl …

Documents

Transcript of VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR HEPTAMINOL HCl …