Vežbe iz predmeta sportska farmacija

Katedra za analitiku lekova

Analiziranje biološkog materijala predstavlja

veliki izazov:

� Koncentracija analita je niska

� Matriks je izuzetno kompleksan� Endogene materije

� Metaboliti

� Razgradni produkti

� Lekovi koji se istovremeno primenjuju

� Drugi egzogeni ksenobiotici

� Venska krv, serum ili plazma

� Urin

� Saliva

� Likvor

� Dlaka kose

� Sputum...

� Od posebnog značaja je doping kontrola!

• Pojedina ispitivanja (primena eritropoetina) zahtevaju analizu iz krvi, ali

� Najčešće se koristi urin od svih vrsta biološkog materijala

� Jednostavan način uzimanja

� Neinvazivan način uzimanja

� Uzorci biološkog materijala se ne uzimaju u idealnim uslovima

� Moraju se transportovati do akreditovanih laboratorija

� Može otežati analitički postupak

� Može umanjiti tačnost analitičkog postupka

� Urin je podložan mikrobiološkoj

kontaminaciji, što može smanjiti

reprezentativnost uzorka (npr. ispitivanjenedozvoljene upotrebe steroida)

� Definicija:� Validacija bioanalitčkih metoda uključuje sve postupke

koji dokazuju da razvijena metoda koja je namenjena kvantitativnoj analizi leka ili njegovih metabilita u biološkom matriksu bude pouzdana i reproduktivana za predloženu namenu.

Izvodi se prema smernicama:

• The International Conference on Harmonisation of Technical

Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use(ICH)

• Food and Drug Administration (FDA)

• European Medicines Agency (EMEA)

� Validacija obuhvata ispitivanje:

� Selektivnost

� Osetljivost (limit detekcije, LD) i donji limit kvantifikacije (eng. lower limits of quantification, LLOQ)

� Opseg

� Linearnost

� Preciznost

� Tačnost

� Stabilnost� Ispitivanje efikasnosti postupka

prečišćavanja biološkog materijala

� U okviru postupka validacije uvek se preporučuje izvođenje prevalidacije, odnosno, ispitivanje nekih

od parametara validacije pre drugih:

� Limita detekcije� LLOQ� Selektivnost metode� Opseg kalibracione krive

Ovo se radi zbog uštede vremena. Ukoliko se pokaže da metoda nijeselektivna, dovoljno osetljiva ili da kalibraciona kriva ne može biti uodgovarajućem opsegu, neophodno je ponovo pristupiti razvojubioanalitičke metode.

� Za metodu se može reći da je specifična ukoliko se registruje odgovor koji potiče isključivo od jednoganalita (spektrofotometrijske, titrimetrijske metode).

� Selektivnost metode predstavlja sposobnost da se meri odgovor ispitivanog analita i razlikuje od ostalihodgovora koji ne potiču od analita od interesa (za separacione metode).

� Kako su bioanalitičke metode uglavnom separacione termin selektivnost je češće prikladnijekoristiti.

� Potvrđuje se ispitivanjem uzoraka biološkog materijala dobijenih od najmanje 6 dobrovoljaca različitih godina i pola za koje znamo da nisu koristili u sportu zabranjene supstance - “prazan uzorak”.

� Nakon izvođenja postupka prečišćavanja “praznihuzoraka” uzorci se ispituju prema interferirajućim supstancama poređenjem sa sveže pripremljenim uzorcima biološkog materijala “opterećenim”standardnim rastvorima ispitivanih supstanci u LLOQkoncentraciji.

Interferencije kod biološkog materijala mogu biti endogenog i egzogenog porekla.

� Endogenog porekla su:

� metaboliti analita kao i njihovi prekursori

� degradacioni proizvodi analita

� lekovi koji se istovremeno primenjuju

� vitamini i njihovi metaboliti i / ili degradacioni proizvodi

� supstance koje se normalno nalaze u krvi kao što su hormoni, proteini, lipidi…

� Egzogenog porekla su:

� nečistoće koje potiču iz reagenasa koji se koriste za pripremu uzoraka

� supstance koje se koriste u proizvodnji laboratorijske opreme (npr. plastifikatori)

� Limit detekcije predstavlja najmanju koncentraciju ispitivanog analita koja se može detektovati predloženom bioanalitčkom metodom.

� Na ovaj način definiše se osetljivost bioanalitičke metode. Potvrda da je osetljivost metode zadovoljavajuća, dobija se analizom uzoraka biološkog materijala uzetih od ispitanika i na taj način se potvrđuje da li je osetljivost postavljene metode zadovoljavajuća.

• LLOQ je ona koncentracija u kojoj je odgovor analita 5 puta veći u poređenju sa odgovorom „praznog uzorka” biološkog materijala na tom retencionom vremenu.

� Pikovi ispitivanih supstanci bi trebalo da budu jasno uočljivi, odvojeni od pikova koji potiču iz biološkog materijala i reproduktivni sa preciznošću od 20 % i tačnošću u opsegu 80 % – 120 %.

� Za procenu preciznost i tačnost u LLOQ koncentraciji koristi se po 5rastvora za ispitivanu supstancu.

� Tačnost je izražena kao Recovery vrednost (%), dok se preciznost izražava kao relativna standardna devijacija (RSD, %).

� Prva tačka na kalibracionoj krivoj je u LLOQ koncentraciji.

• Kalibraciona kriva uspostavlja vezu između odgovora detektora i poznatih koncentracija analita

• Da bi se dobila odgovarajuća veza odgovora detektora i koncentracije analita neophodno je koristiti dovoljan broj standarda:

• “praznog uzorka” biološkog materijala• “nulti uzorak” (“prazan uzorak” biološkog materijala opterećen internim standardom)• 6 – 8 “praznih” uzoraka materijala opterećenih rastućim koncentracijama ispitivanog analita

�Opseg koncentracija se bira u odnosu na očekivane koncentracije u biološkom materijalu koji će biti dobijen od pacijenata

� Preciznost metode predstavlja stepen rasipanja pojedinačnih rezultata dobijenih iz više paralelnih određivanja iz homogenih uzoraka pod istim uslovima.

� Preciznost metode se određuje u tri tzv. QC (eng. Quality Control) koncentracije (niska, srednja i visoka) i to po 5 uzoraka za svaku koncentraciju.

� Preciznost se određuje: � u toku jednog dana - intra–day preciznost i� u toku tri uzastopna dana- inter–day preciznost

� Preciznost se izražava kao RSD (%) za svaku od tri navedene QC koncentracije.

� Zahtev prema FDA smernicama je da preciznost mora biti ± 15 %, osim za LLOQ, gde se dozvoljava ± 20 %.

� Tačnost metode predstavlja meru usaglašenosti eksperimentalno dobijenih rezultata predloženom metodom sa pravim vrednostima.

� Tačnost metode se određuje u tri tzv. QC koncentracije (niska, srednja i visoka), i to po 5 uzoraka za svaku koncentraciju.

� Tačnost metode se izražava kao Recovery vrednost (R, %).

� Zahtev prema FDA smernicama je da tačnost mora biti 85 % – 115 %, sem za LLOQ gde se dozvoljava 80 % – 120 %.

� Stabilnost analita u biološkom materijalu zavisi od:hemijskih osobina ispitivanih supstanciprirode matriksa

ambalaže u kojoj se analit čuva.

� Shodno tome, stabilnost analita u različitim biološkim matriksima i u različitoj vrsti ambalaže se mora posebno ispitivati.

� Uslovi pri kojima se ispituje stabilnost biraju se na taj način da realno odražavaju uslove kojima će uzorci biološkog materijala biti izloženi.

� Prema FDA predlažu se sledeće vrste stabilnosti koje je potrebno ispitatiti:

� Stabilnosti analita tokom analize uzoraka (eng. post–preparative stability)

� Stabilnost analita pri ponovljenom zamrzavanju i topljenju uzoraka (eng. freeze – thaw cycles)

� Kratkoročna temperaturna stabilnost (eng. short–term temperature stability)

� Dugoročna stabilnost (eng. long term stability)

� U slučaju da za potrebe ispitivanja velikog broja uzoraka biološkog materijala uzorci moraju biti duže u autosampleru preporučuje se i ispitivanje stabilnostianalita tokom analize uzoraka i u dužem vremenskom periodu od 24 h.

� Da bi se izvršila procena ove vrste stabilnosti QC uzorci se prečiste, a zatim čuvaju propisano vreme na sobnoj temperaturi.

� Ispituje se zamrzavanjem uzoraka na temperaturi od –20 ºC i postepenim topljenjem na sobnu temperaturu u tri ciklusa.

� Ovim ispitivanjem potvrđuje se stabilnost i mogućnost zamrzavanja i odmrzavanja uzoraka dobijenih od ispitanika kako bi se analiza ponovila.

� Kratkoročna temperaturna stabilnost uzoraka ispituje se nakon otapanja uzoraka do sobne temperature i čuvanja na ovoj temperaturi 4 h – 24 h.

� Ova dužina čuvanja na sobnoj temperturi je izabrana shodno očekivanju da se uzorci mogu čuvati na sobnoj temperaturi tokom analize.

� Na ovaj način potvrđuje se stabilnost analita u biološkom materijalu za vreme sakupljanja i prečišćavanjauzoraka.

� Ispitivanje dugoročne stabilnosti podrazumeva čuvanje uzoraka na temperaturi od –20 ºC.

� Preporučeno je ispitvanje stabilnosti:� 3 meseca za uzorke urina i

� 6 meseci za uzorke plazme.

� Stabilnost se procenjuje poređenjem srednjih vrednosti koncentracija nakon određenog perioda čuvanja uzoraka i inicijalnih koncentracija ispitivanih analita.

� Stabilnost analita u biološkom materijalu ispituje se u 2 QC koncentracije (nižoj i višoj).

� Za svaku koncentraciju pravi se najmanje po 3rastvora.

� Osim ispitivanja stabilnosti bitno je preduzeti i neke mere opreza kako bi se očuvala stabilnost analita u biološkim matriksima i smanjio gubitak analita.

� Zamrzavanje uzoraka na niskim temperaturama od -80 °C ili u tečnom azotu, kako bi se smanjio stepen degradacije.

� Upotreba odgovarajućih aditiva (antioksidansi, inhibitori enzima, puferi).

� Derivatizacija odmah nakon prikupljana uzoraka, kako bi se dobili stabilni derivati (npr. kaptopril u punoj krvi).

� Brza ekstrakcija analita iz biološkog matriksa i čuvanje u rastvaraču u kome je dokazano da je analit stabilan ili nakon uparavanja do suva.

� Ukoliko ništa od opisanog nije zadovoljavajuće, preporučuje se brza ekstrakcija analita koja je praćenja brzom analizomispitivanog uzorka.

� Prilikom prečišćavanja biološkog materijala nije neophodno da Recovery vrednost analita bude 100 % već da Recovery analita i internog standarda bude dokazano stalan, precizan i reproduktivan.

� Recovery eksperimenti se sprovode u tri koncentracije (niska, srednja i visoka). U svakoj od navedenih koncentracija pravi se po 5 rastvora i porede se rezultati dobijeni iz uzoraka nakon prečišćavanja i standardnih rastvora koji nisu prečišćavani, i koji predstavljaju 100 %.

� Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da li efikasnost postupka prečišćavanja zavisi od koncentracije, kao i da li priroda biološkog materijala pokazuje značajan uticaj na Recoveryvrednosti analita.

Cilj