Vacinologia na Biotecnologia - UFPel · 2011. 10. 20. · Leptospira noguchii and Human and Animal...
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Vacinologia na Biotecnologia - UFPel
Janeiro 1989
Agosto 1989
Agosto 1989
Abril 1991
Mycobacterium bovis BCG
- Resposta imune humoral e celular;
- Única dose;
- Vacina replicante muito estável;
- Apresenta um baixo custo de produção.
- Vacina largamente utilizada em humanos no mundo todo; - Administrada em qualquer época após o nascimento;
- Efeito imunoestimulante e adjuvante;
Janeiro 1995
Agosto 1996
Agosto 1996
Agosto 1996
Agosto 1996
Agosto 1996
Outubro 1996
02 de agosto de 2001
03 de dezembro de 2001
01 de março de 2003
BCG - PRRS
BCG - Anaplasmose
BCG - Babesiose
BCG - Leptospirose
BCG recombinante...
Porque a vacina interfere com o teste de tuberculina!
Por que não é utilizada em animais?
Um teste capaz de diferenciar animais infectados de animais vacinados (DIVA) permitirá introduzir mudanças na atual legislação e possibilitará o uso de vacina contra TB bovina.
BCG recombinante...
Maior eficácia contra tuberculose bovina do que a cepa convencional
Possibilidade de construção de uma vacina multivalente
Leptospirose
TAMANHO
-0,1 a 0,2 m de diâmetro
-6 a 20 m de comprimento
• Zoonose
• Agente etiológico: Leptospira sp.
• Infecta diversos animais e humanos
• Infecção através de contato direto ou água ou solo contaminado com urina de portadores
• Doença febril aguda
Vacinas
• Células inteiras inativadas (Bacterinas)
• Imunidade pouco duradoura (6 a 12 meses)
• Efeitos colaterais
• Sorovares específicas
• Vacinas recombinantes
Leptospira
interrogans: hardjo,
wolffi, pomona,
icterohaemorrhagiae,
grippotyphosa e
canicola.
L. hardjo;
L. icterohaemorrhagiae;
L. wolffi;
L. bratislava;
L. pomona.
O genoma de L. interrogans
Fonte: Nascimento et al., Braz J Med Biol Res 37(4) 2004 Nascimento et al., J Bacteriol. 2004 Apr;186(7):2164-72.
Gel de poliacrilamida 15%
Purificação das proteínas
ÄKTAPrime
Proteínas purificadas
Resposta Imune Humoral
Resposta Imune Humoral
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 21 42 63 84 105tempo (dias)
Ab
so
rbân
cia
s (
OD
450)
rLIC11058
rLIC10054
rLIC20172
rLIC13059
rLIC11567
rLIC10091
rLIC10009
rLIC13305
Controle -
Resposta imune humoral apresentada pelos animais inoculados com as proteínas
recombinantes e do grupo controle negativo salina/Al(OH)3. A medida das respostas
imunes está expressa em absorbância (OD450).
DESAFIO
Vacinação dos Hamsters
Inoculação de doses letais de
Leptospiras patogênicas
Taxa de
Sobrevivência
2005 Parceria Fiocruz/UFPel – Reunião no Mercosul
2006
Primeira produção científica do laboratório – Canadian Journal of Microbiology
2007 SEIXAS, F. K. ; SILVA, E. F.; HARTWIG, Daiane D ; CERQUEIRA, Gustavo M ; AMARAL, M. ; FAGUNDES,
Michel Q ; DOSSA, Robson G ; DELLAGOSTIN, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing the Lipl32 antigen of Leptospira interrogans protects hamsters from challenge. Vaccine (Guildford), v. 26, p. 88-95, 2007.
SILVA, E. F. ; MEDEIROS, M. A. ; MCBRIDE, Alan J A ; STEVES, G. S. ; RAMOS, J. G. R. ; SANTOS, C. S. ; CRODA, J. ; HOMMA, A. ; DELLAGOSTIN, O. A. ; HAAKE, D. A. ; REIS, Mitermayer G ; KO, Albert I . The terminal portion of leptospiral immunoglobulin-like protein LigA confers protective immunity against lethal infection in the hamster model of leptospirosis. Vaccine (Guildford), v. 25, p. 6277-6286, 2007.
FERNANDES, Claudia P H; SEIXAS, Fabiana K; COUTINHO, Mariana L; VASCONCELLOS, Flavia A; SEYFFERT, Nubia; BROD, Claudiomar S; MCBRIDE, Alan J A; DELLAGOSTIN, O. A.; ALEIXO, Jose A G Monoclonal antibodies against LipL32, the major outer membrane protein of pathogenic leptospira: production, characterization and testing in diagnostic applications. Hybridoma (Larchmont), v. 21, p. 35-41, 2007.
SILVA, Everton F; BROD, Claudiomar S; CERQUEIRA, Gustavo M; BOURSCHEIDT, Debora; SEYFFERT, Núbia; QUEIROZ; SANTOS, Cleiton S; KO, Albert I; DELLAGOSTIN, O. A. . Isolation of Leptospira noguchii from sheep. Veterinary Microbiology (Amsterdam), v. 121, p. 144-149, 2007.
SEIXAS, Fabiana K; FERNANDES, Claudia P H; HARTWIG, Daiane D; CONCEIÇÃO, Fabricio R; ALEIXO, José A G; DELLAGOSTIN, O. A. . Evaluation of different ways of presenting LipL32 to the immune system with the aim of developing a recombinant vaccine against leptospirosis. Canadian Journal of Microbiology, v. 54, p. 472-479, 2007.
2008
SILVA, E. F.; SANTOS, C. S.; ATHANAZIO, Daniel A; SEYSSERT, N.; SEIXAS, F. K.; CERQUEIRA, Gustavo M; FAGUNDES, Michel Q; BROD, Claudiomar S; REIS, Mitermayer G; DELLAGOSTIN, O. A.; KO, Albert I . Characterization of virulence of Leptospira isolates in a hamster model. Vaccine (Guildford), v. 26, p. 3892-3896, 2008.
FERNANDES, Claudia P H; SEIXAS, F. K.; COUTINHO, Mariana L; VASCONCELLOS, Flavia A; MOREIRA, Angela N; CONCEIÇÃO, F. R.; DELLAGOSTIN, O. A.; ALEIXO, José A G . An immunomagnetic separation-PCR method for detection of pathogenic leptospira in biological fluids. Hybridoma (Larchmont), v. 27, p. 1-6, 2008.
MIRAGLIA, F.; MORENO, A. M.; PAIXAO, R.; LIUSON, E.; MORAIS, Z. M.; MAIORKA, P.; SEIXAS, F. K.; DELLAGOSTIN, O. A.; VASCONCELLOS, S. A. Isolation and characterization of Leptospira interrogans from pigs slaughtered in São Paulo State, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 39, p. 501-507, 2008.
2009 MCBRIDE, Alan J A; CERQUEIRA, Gustavo M; SUCHARD, M. A.; MOREIRA, A. N.; REIS,
Mitermayer G; HAAKE, D. A.; KO, Albert I; DELLAGOSTIN, O. A. . Genetic diversity of the Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) genes in pathogenic Leptospira spp.. Infection, Genetics and Evolution, v. 9, p. 196-205, 2009.
SILVA, E. F.; CERQUEIRA, Gustavo M; SEYFFERT, Núbia; SEIXAS, F. K.; HARTWIG, Daiane D; ATHANAZIO, Daniel A; PINTO, Luciano S; QUEIROZ; KO, Albert I; BROD, Claudiomar S; DELLAGOSTIN, O. A. . Leptospira noguchii and Human and Animal Leptospirosis, Southern Brazil. Emerging Infectious Diseases, v. 15, p. 621-623, 2009.
Murray, G. L.; Morel, V.; Cerqueira, G. M.; CRODA, J.; Srikram, A.; Henry, R.; Ko, A. I.; DELLAGOSTIN, O. A.; Bulach, D. M.; Sermswan, R.; Adler, B.; Picardeau, M. . Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infection and Immunity, v. 77, p. 810-816, 2009.
CERQUEIRA, Gustavo M; MCBRIDE, Alan J A; Picardeau, M.; RIBEIRO, Samuel G; MOREIRA, A. N.; Morel, V.; REIS, Mitermayer G; KO, Albert I; DELLAGOSTIN, O. A. . Distribution of the Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) genes in pathogenic Leptospira spp. and application of ligB to typing leptospiral isolates. Journal of Medical Microbiology, v. 58, p. 1173-1181, 2009.
2010 Cerqueira, G. M.; McBride, A. J. A.; Queiroz, A.; Pinto, L. S.; SILVA, E. F.; HARTSKEERL, R. A.; Ko,
A. I.; DELLAGOSTIN, O. A. . Monitoring Leptospira Strain Collections: The Need for Quality Control. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 82, p. 83-87, 2010.
VASCONCELLOS, Flávia Aleixo; COUTINHO, Mariana L; SILVA, Everton F; FERNANDES, Claudia P H; Monte, Leonardo G.; SEYFFERT, Núbia; DELLAGOSTIN, O. A.; ALEIXO, José A G . Testing different antigen capture ELISA formats for detection of Leptospira spp. in human blood serum. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 104, p. 259-264, 2010.
SEIXAS, F. K.; BORSUK, S.; FAGUNDES, Michel Q; HARTWIG, Daiane D; SILVA, E. F.; CERQUEIRA, Gustavo M; DELLAGOSTIN, O. A. . Stable expression of Leptospira interrogans antigens in auxotrophic Mycobacterium bovis BCG. Biological Research (Print), 2010.
ESLABAO, M. R.; DELLAGOSTIN, O. A.; CERQUEIRA, Gustavo M . LepBank: a Leptospira sequence repository and a portal for phylogenetic studies. Infection, Genetics and Evolution (Print), 2010.
….
VACINA CONTRA
PNEUMONIA
MICOPLÁSMICA SUÍNA
Produção e Avaliação de
Outros Antígenos
Clonagem Direcional
- Seleção de genes de M. hyopneumoniae
- Amplificação por PCR
- Clonagem
pET200D-TOPO
5741 bp
6xHis
EK recognition
Kanamycin
pBR322 Ori
T7 promoter
RBS
T7 termination
pET200D-TOPO
5741 bp
6xHis
EK recognition
Kanamycin
pBR322 Ori
T7 promoter
RBS
T7 termination
NRDF 429 bp
CACC Stop codon
10 PCR A10 PCR A
For
RevFor mut
Rev mut
RevFor
TGG
RevFor
TGG
pET200D-TOPO
5741 bp
6xHis
EK recognition
Kanamycin
pBR322 Ori
T7 promoter
RBS
T7 termination
pET200D-TOPO
5741 bp
6xHis
EK recognition
Kanamycin
pBR322 Ori
T7 promoter
RBS
T7 termination
Mutação sítio dirigida
Bactérias recombinantes
Plasmídio
Transformação em
E. coli
Transformação em cepa de expressão BL21(DE3)
DNA recombinante
Seleção de clones recombinantes
Purificação ÄKTA_Prime Multiplicação
42 kDa Proteína Purificada
Purificação de Proteínas
Expressão
Antigenicidade das proteínas
10 proteínas recombinantes
testadas no ELISA
-10 soros de suínos SPF
- 37 soros de suínos convalescentes
50 ng
1:6000
1:100
SDS-PAGE corado com Commassie Blue, mostrando 9 proteínas recombinantes
purificadas por cromatografia de afinidade ao níquel.
Resultados
Médias calculadas com os soros avaliados em triplicata
Análise estatística - GraphPad Prism 4 (GraphPad Software)
Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando o P≤ 0,05
Resultados
*
*
*
* * * * * * *
Projetos em andamento
• Avaliação de antígenos recombinantes de
Mycoplasma hyopneumoniae: desenvolvimento de
vacinas e testes diagnósticos (Edital
CNPq/MAPA/SDA Nº 64/2008)
– Valor: R$ 488.000,00
– Início em fevereiro 2009
• Núcleo de excelência em desenvolvimento de
vacinas veterinárias (PRONEX – FAPERGS/CNPq)
– Valor: R$ 631.000,00
– Início em abril de 2010
• Produção e avaliação de uma vacina recombinante
contra tuberculose bovina e de teste de
diagnóstico diferencial (DIVA) (CNPq e Biotecsur)
– Valor: 350.000,00
– Início em janeiro de 2009
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