vacacional 2015ii

AREA DE BIOQUIMICA -UNSAAC

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS, FISICAS, Y MATEMATICAS

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE QUIMICA

GUIA DE PRÁCTICAS DE BIOQUIMICA

ESCUELA PROFESIONAL : BIOLOGIA, ENFERMERIA

DOCENTES DE TEORIA : Quim. Ciro TOMAYLLA CRUZ

SEMESTRE 2015V

CUSCO-PERU

2016

GUIA DE PRÁCTICAS DE BIOQUIMICA – BIOLOGIA Y ENFERMERIA CTC 1


PRESENTACION

La mayoría de las técnicas experimentales y conocimientos que se han adquirido en otros cursos son muy valiosas en el laboratorio de Bioquímica. En este laboratorio raramente se aíslan productos en bioquímica se trabaja a baja escala. Los conocimientos metodológicos para estudiar las biomoléculas avanza a grandes pasos y en la mayoría de las ocasiones se requieren reactivos y equipos costosos, por lo que es más que imposible abarcar la extensa gama de conocimientos relacionados con protocolo bioquímicos.

El presente manual de Bioquímica se ha preparado con algunas prácticas sencillas, y representativas, que intentan explicar algunas de las propiedades de la biomoléculas y utilizan fáciles técnicas para ensayar. Se espera que el estudiante adquiera los conocimientos necesarios para entender cursos posteriores que pudiera tomar durante la licenciatura o bien en algún postgrado dentro del área de bioquímica.



GUIA BREVE PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA YREPORTE DE PRÁCTICAS

Seguridad en el laboratorio

Deben tenerse presente las reglas generales de seguridad. Se debe estar consiente que los reactivos utilizados en el laboratorio son potencialmente tóxicos, irritantes o inflamable. Sin embargo estas sustancias son peligrosas solo cuando no se manipulan correctamente.

Limpieza del material de vidrio

Los resultados de los experimentos, dependen en gran parte, de la limpieza del equipo: 1) muchos reactivos se usan en miligramos o microgramos, por lo tanto cualquier contaminación, podría contribuir a un porcentaje significativo de la muestra experimental total del experimento. 2) Muchas sustancias son sensible a uno o más contaminantes, como iones metálicos, detergentes o residuos orgánicos.

La libreta de laboratorio

Es muy importante hacer un diagrama de flujo antes de iniciar la sesión. Los procedimientos, detalles, observaciones y resultados se deben registrar en una libreta de laboratorio mientras el experimento se esta llevando a cabo.

Guía breve para el reporte de práctica

Introducción

Breve resumen de conceptos y/o importancia del tema. La información debe tener relevancia para la práctica y no debe ser una copia de un libro o de internet. Procurar que no exceda de una cuartilla.

Objetivo

Aquí se debe incluir cual es el objetivo de la práctica, porque lo haces, para que.

Parte experimental

Materiales y métodos

Se describen los reactivos, materiales y equipo que se utilizan, asi como la metodología empleada.

Resultados y discusión

Se describen los resultados obtenidos, se indican los cálculos, tablas, gráficas o figuras, as’ como una explicación con fundamentos científicos del porque se obtuvieron esos resultados.

Cuestionario. Se deben contestar las preguntas indicadas, las cuales están relacionadas con los fundamentos, la relevancia, la ampliación o aplicación de los resultados o los métodos utilizados.

Bibliografía.

Reportar las fuentes utilizadas con el formato estándar: Para libros: Autor(s), año de publicación, título, editorial y páginas consultadas, en el caso de internet señalar la dirección completa. Para el caso de revistas científicas: Autor(es), año, nombre del artículo, nombre de la revista, volumen, número, páginas.



PRACTICA Nº 01

PREPARACION DE SISTEMAS BUFFER Y CAPACIDAD AMORTIGUADORA

1 OBJETIVO: Estudiar la acción de dos sistemas amortiguadores, lo que permitirá comprender la importancia de un sistema buffer.

2. FUNDAMENTO TEORICO: El pH de una solución se puede mantener casi constante si contiene una solución reguladora una de pH. (que esta formado por un acido débil y su base conjugada o una base débil y acido conjugado ). LOS REGULADORES EVITAN CAMBIOS SERIOS EN EL pH. Ciertas combinaciones de soluciones, llamadas reguladores o soluciones amortiguadoras, que evitan los cambios en el pH cuando se agregan pequeñas cantidades de ácidos o bases fuertes a una solución acuosa. Una parte del sistema regulador puede neutralizar H+, y la otra parte puede neutralizar OH -. . Los fluídos que contienen reguladores ajustan los cambios de pH que provocan los H+ o OH-. La sangre y otros fluidos del cuerpo contienen reguladores. Las soluciones fisiológicos se debe mantener su balance ácido-base depende de los reguladores.

EL REGULADOR FOSFATO ES IMPORTANTE DENTRO DE LAS CÉLULAS: Está formado por el par de iones: HPO4

-2 / H2 PO4-.

EL REGULADOR CARBONATO ES IMPORTANTE EN LA SANGRE : está formado por el par conjugado H2 CO3 / HCO3

-

Según la ecuación de Henderson-Hasselbalch, su capacidad amortiguadora depende del valor de pK del acido o dela bese y de la proporción de sus componentes en la mezcla.

MATERIALES Y REACTIVOS

PH-metro

Viales y tubos de ensayo

Pizetas con agua destilada

Vaso de precipitados

REACTIVOS:

- Solución de Na2 HPO4 : 0,1M 10 mL- Solución NaH2PO4: 0,1M 10 mL

3 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

1. Preparar el amortiguador de fosfatos: Mezclar muy bien en un vaso de precipitados: Como indica el siguiente cuadro.

Recipiente 1 2 3sol. de Na2 HPO4 0,1M: ml 3 5 7Sol. de NaH2PO4: 0,1M ml 7 5 3pH teóricopH experimental



2. Conociendo los pKs de las soluciones fosfato es 7.2. Calibrar el pH-metro con una solución amortiguadora de pH conocido.

3. Medir el pH de cada uno de las mezclas con el pH-metro y comparar con el valor teórico calculado.

4. Agregue diferentes volúmenes de HCl 0,1M a los viales que contengan soluciones amortiguadoras de carbonato o de fosfato mezcle bien y vuelva a leer el pH

5. Del mismo modo proceder con la solución de NaOH 0.1 M6. Comparar el efecto de acido y base en volumen de agua.7. Con los resultados obtenidos en los procedimientos 6 y 7 determinar la solución de

mayor capacidad tamponante.

CUESTIONARIO:

A) Escriba las ecuaciones iónicas que demuestren cómo el amortiguador carbonato neutralizó el ácido y la base:

B) Escriba las ecuaciones iónicas que demuestren cómo el amortiguador fosfatos neutralizó el ácido y la base:

C) ¿Es útil un sistema amortiguador para mantener neutra una solución? Explique:

D) ¿Por qué son importantes los sistemas amortiguadores de la sangre?

E) Agregue varias gotas de ácido al amortiguador de carbonato .¿podrá amortiguar indefinidamente al ácido que añadió?

F) indique los principales sistemas amortiguadoras fisiológicas.

G) ¿El agua es un sistema amortiguador? Fundamente su respuesta



PRACTICA N°02CAPACIDAD AMORTIGUADORA EN FRUTAS

OBJETIVODeterminar la capacidad amortiguadora.

FUNDAMENTO TEORICO.

La capac idad amor t iguadora se def ine como e l número de m o l e s de un ácido fuerte o de una base fuerte que ocas iona un cambio de 1 .00 un idad de pH a 1 l i t ro de l amor t igu ad or . La c apa c id ad d e u n a mor t i gu ado r n o so lo depende de la concentración total de sus dos componentes también de su relación de concentraciones. La capacidad amortiguadora disminuye con cier ta rapidez a medida que la relación del ácido con respecto a la base conjugada se aleja de la unidad.

Por esta razón, el pKa del ácido seleccionado para un determinado uso, debe estar dentro de ± 1 unidad del pH deseado para que el amort iguador tenga una capacidad amortiguadora adecuada.

MATERIALES REACTIVOS

MATERIALES

· Vasos de precipitados de 250 ml· Pipetas de 10 ml· Bureta

REACTIVOS

· 4 Frutas diferentes· Soluciones de HC1 0.1N estándar· Solución de NaOH 0.1N estándar· Solución indicadora fenolftaleina· Solución indicadora anaranjado de metilo.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. Medir el pH del líquido biológico.2. Medir 5ml de líquido en un vaso de precipitados, añadir 2 a 3 gotas de ind.

Fenolftaleína y valorar desde una bureta con una solución de NaOH 0.1N hasta una coloración rosa débil.

3. Medir el pH de la solución valorada.

A otros 5 ml del mismo liquido agregar 2 a 3 gotas de ind. Anaranjado de metilo y valorar desde una bureta con HCl 0.1N hasta el cambio de color rojo y se mide el pH.

· En caso de la muestra bilógica saliva realizar una dilución 1:3 con agua destilada

Seguir el mismo procedimiento para los demás líquidos biológicos y realizar cálculos.

CALCULOS



Basándose en los datos obtenidos se calcula la capacidad amortiguadora del líquido según Ia formula:

Donde C es Ia capacidad amortiguadora, N es la normalidad del ácido (base) consumida en la valoración de la prueba, "b" es la cantidad de líquido a investigar tomada para Ia valoración, pH0 inicial de la solución a investigar, pH1 al final de Ia valoración.

- Menor volumen gastado, mayor variación de pH, menor capacidad.- Mayor volumen gastado, menor variación de pH, mayor capacidad.

CUESTIONARIO

a. Cuál de los fluidos corporales tiene mayor capacidad amortiguadora.b. Cuando se dice que tiene mayor capacidad amortiguadorac. Que entiende por acidosis y alcalosis metabólica. Explique

PRACTICA 03

REACCIONES DE IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS EN MUESTARAS REPRESENTATIVAS.

OBJETIVOS:

• Mediante reacciones químicas coloreadas, identificar la presencia de

aminoácidos en muestras de cereales y leguminosas.

• Utilizar una muestra de clara de huevo, como patrón de comparación.

•INTRODUCCIÓN

Los aminoácidos, son moléculas orgánicas que contienen un grupo amino y un grupo

carboxilo. Veinte son los constituyentes de las proteínas. Se los conoce como alfa

aminoácidos (a –aminoácidos).

Cuando una célula viva sintetiza proteínas, el grupo carboxilo de un aminoácido

reacciona con el grupo amino de otro, formando un enlace peptídico. El grupo

carboxilo del segundo aminoácido reacciona de modo similar con el grupo amino del

tercero, y así sucesivamente hasta formar una larga cadena Dentro de las propiedades

químicas que presentan los aminoácidos se consideran reacciones de coloración como



también reacciones generales que identifican cualquier aminoácido caso de las

reacciones de la ninhidrina

MATERIALES Y REACTIVOS:

• Vasos de precipitados• Tubos de ensayo• Papel filtro• Probeta de 25 Ml.• Pipetas y baguetas.• Solución de HC1 y NaOH 0.1 N• Reactivo de ninhidrina al 0.2 % en alcohol ó acetona• Reactivo de acido nítrico HNO3 concentrado• Reactivo de acido sulfúrico H2SO4 concentrado• Reactivo de hidróxido de sodio NaOH al 10 y 20 %• Reactivo de acetato de plomo al 5%• Solución de clara de huevo al 25 %• Harina de cereales ó leguminosas

PROCRDIMIENTO.

En el caso de cereales : en un vaso de precipitado, colocar 5 g.de la muestra y disolver

con 50 ml de agua destilada, agitar varias veces y dejar en reposo por espacio de 20

minutos para solubilizar las ldehído ó los oligopeptidos presentes en las muestras.

• Proceder a filtrar para realizar las diferentes pruebas.

• Medir el Ph de la muestra con papel indicador universal, si el color es muy ámbar

puede interferir en el análisis para lo cual se procede a una dilución de 1/10.

• Seguir los diferentes análisis que se presentan a continuación:

1.- REACCIÓN DE LA NINHIDRINA:

La reacción con la ninhidrina se utiliza ampliamente tanto para la detección de aminoácidos como para su cuantificación en materiales biológicos.

Los alfa aminoácidos calentados en solución acuosa en presencia de ninhidrina producen un color azul o violeta formando la base de Schiff. Esta base se descompone con liberación de CO2 y por hidrólisis de 2 amino -1,3 diceto hidrindeno y un ldehído. El aminodiceto se condensa con otra molécula de ninhidrina dando un complejo de color azul.

La coloración azul depende del Ph, si este es muy ácido la coloración puede no producirse.

Algunos aminoácidos como la prolina, hidroxiprolina y la asparragina dan un color amarillo.



PROCEDIMENTO

Colocar de 0.5 a 1 ml de muestra en un tubo de ensayo, agregar 2 a 3 gotas de solución

etanólica de ninhidrina, calentar hasta la formación del color violeta.

2.- REACCIÓN XANTOPROTEICA

La reacción xantoprotéica permite descubrir la presencia de aminoácidos con radicales

aromáticos en la molécula de proteína. Esto debido a la formación de un compuesto

aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico

concentrado. La prueba de resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos

portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia de la tirosina una vez

realizada la prueba se realiza la prueba de la neutralización con un álcali vira un color

anaranjado oscuro.

PROCEDIMIENTO

En un tubo de ensayo se vierten 0,5 ml. A 1 ml de solución problema y se añaden 2 a 3

gotas de HNO3 © con un ligero calentamiento se pone amarillo, enfriar y añadir gotas

de NaOH al 10 % hasta la aparición de un color naranja

2.- REACCIÓN PARA EL TRIPTOFANO.

La reacción se fundamenta en que bajo la influencia del ácido sulfúrico ocurre la

hidrólisis de la sacarosa en sus monosacáridos, los que se deshidratan convirtiéndose en

liidroximetil furfural. El triptófano al combinarse con el hidroximetil fúrfural, forma un

complejo de color guinda-rojizo

PROCEDIMIENTO



En un tubo de ensayo verter 0,5 a 1 ml. De muestra, añadir 2 gotas de sacarosa, mezclar

y luego dejar caer en el hondo del tubo l ml de ácido sulfúrico concentrado, al contacto

de los líquidos aparece una coloración roja en forma de anillo, (no agitar)

5. REACCIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS AZUFRADOS.

Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo.

Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos,

el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo.

PROCEDIMIENTO

Colocar en el tubo de ensayo de 2 a 3 ml de muestra, luego añadir 2 ml de solución de

NaOH al 20% posteriormente agregarle 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5 %

; calentar el tubo hasta ebullición, si se forma un precipitado de color negruzco nos

indica que se ha formado sulfuro de plomo, virilizándose el azufre de los aminoácidos,

lo que nos sirve para identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos

con azufre.

CUESTIONARIO

1.- En base a sus observaciones y a los fundamentos expuestos en la guía elabore un

cuadro con sus resultados y conclusiones.

2.- Dentro de los alfa aminoácidos cuales son considerados como esenciales y cual su

importancia en la dieta de los seres humanos.

4.- Haga un cuadro de posibles aminoácidos que den reacción positiva: con Ninhidrina,

acetato de plomo, HNO3.



PRÁCTICA N° 04

DETERMINACIÓN DE PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA GLICINA

OBJETIVO

Demostrar que los aminoácidos pueden dar lugar a fenómenos de disociación que corresponden a los grupos amino y carboxilo, por medio de una curva de titulación donde se puede establecer fácilmente el pK de cada fenómeno.

FUNDAMENTO

Los aminoácidos por ser grupos amino y carboxilo se comportan como ácidos o bases, denominándose sustancias anfóteras.

Los aminoácidos que se disocian en solución acuosa dan lugar a iones dipolares de tipo H3N+ y COO", una molécula de este tipo puede reaccionar con ácidos o bases formando ácidos conjugados o bases conjugados.

Cuando se titulan potenciométricamente los aminoácidos con soluciones de concentraciones conocidas de hidróxido de sodio y ácido clorhídrico se forman curvas de titulación meq. de ácido o base versus pH y en un punto de estas curvas el aminoácido se comporta como sal neutra para este pH la carga neta sobre el aminoácido es nula o cero. El punto isoeléctrico vendría a ser igual a:

Donde:

PK1 y PK2 representan respectivamente las constantes de disociación del grupo carboxilo y del grupo amino.


REACTIVOS:

· Ácido clorhídrico 0.1 N· Hidróxido de sodio 0.1 N· Indicadores (fenolftaleína y anaranjado dé metilo)



PROCEDIMIENTO

1. Calibrar el pH- metro con una solución buffer estándar de pH=7.

2. Titulación de los grupos carboxilo- En un vaso de precipitados medir 10 ml de la solución de glicina 0,1 M y añadir una gota de indicador anaranjado de metilo.- Medir el pH inicial de la solución de glicina utilizando el pH metro.- Cargar la bureta con HCI 0.1 N y titular la solución de glicina, dejando caer desde la bureta un volumen de 0.5 - 1.0 ml de ácido, medir el pH después de cada adición hasta que el pH sea aproximadamente 1.5.- Tomar nota de todos lo valores obtenidos, tabular, graficar los puntos teniendo en cuenta meq

de HCI versus pH, teniendo la curva encontrar el pK correspondiente al grupo carboxilo, que corresponde al punto de inflexión de la curva.

3. Titulación de los grupos amino.

- En un vaso de precipitados medir 10ml de glicina 0.1 M, más una gota de fenolftaleína y medir el pH inicial de la solución.- Añadir desde una bureta solución de NaOH 0.1N de 0.1 a 0.2 ml medir el pH después de cada adición, titular hasta valores superiores a pH 11.- Del mismo modo que con la titulación acida tabular los valores obtenidos y graficar.- Encontrar el pK2 correspondiente al grupo amino-CUESTIONARIO:

1. Con los valores de pK y pK2 obtener el Pl de la glicina.2. ¿Por qué el uso del indicador fenolftaleína3. ¿Qué sucedería si la titulación se realiza de 5 en 5ml ya sea de NaOH o HCI?.4. Compare los resultados experimentales con los reportados en la teoría.5. ¿Cuál es la carga neta de la glicina a pH2, pH9, pH6

PRACTICA N° 05

CUANTIFICACION DE PROTEINAS TOTALES EN SUERO SANGUINEO

OBJETIVO

Determinar cuantitativamente proteínas totales (Albúmina y Globulina en suero

sanguíneo)

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son compuestos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el organismo y esenciales para la vida. Actúan como elementos estructurales y de transporte, aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulación, etc. La proteína más abundante es la albúmina. Una de sus funciones más importantes es la de permitir el transporte de ácidos grasos, hormonas esferoides, bilirrubina, catecolamina, que en forma libre son insolubles en medio acuosos.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES



Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ion cúprico en medio alcalino para dar un complejo color violeta debido a los enlaces peptídicos de las moléculas proteicas; la reacción del biuret da a conocer la proporcionalidad que existe entre la intensidad del color obtenido de las proteínas encontradas en reacción. La absorción máxima es a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

• Reactivo EDTA / Cu• Suero patrón : Solución de albúmina en estado nativo con título conocido de

proteínas ( P.T. = 5.1 g/dl)• Muestra cereal• Agua destilada• Espectrofotómetro o fotocolorímetro • Pipetas automáticas• Baño isotérmico

PROCEDIMIENTO. Utilizar cinco tubos de ensayo y colocar en cada uno de ellos,

como se indica en el siguiente cuadro:•Reactivos Blanco 1 2 3 M1

Agua destilada 100uL 90uL 60ul 30uL 60uL -

Estándar 5 g/dl - 10 uL 40uL- 70uL -

Muestra - - - - 40 uL

Reactivo EDTA / Cu 3. mL 3.mL 3. mL 3. mL 3.mL

Abs.

• Mezclar, incubar por 15 minutos a 37 °C. Leer en espectrofotómetro a 540 nm o

en fotocolorímetro con filtro verde ( 520 - 560 nm) , llevando a cero con el blanco.

CALCULO DE RESULTADOS:

VALORES DE REFERENCIA

CUESTIONARIO:

1. Calcule la concentración de proteínas totales, compare con la bibligrafia2. Cuáles son las funciones de la albúminas3. Que otras proteínas importantes están en el suero

sanguíneo.

4. En qué casos se tiene deficiencia o exceso de proteínas.

5. Qué es hipo albuminemia?

6. Realice la reacción química del complejo Biuret proteína



7. Qué son las inmunoglobulinas

PRACTICA N° 6

FACTORES QUE AFECTAN EN LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA AMILASA SALIVAL

OBJETIVO

- Analizar y verificar la acción de la enzima amilasa salival.

- Observar a diferentes temperaturas la actividad de la enzima amilasa salival.

- Observar el efecto de las cofactores e inhibidores sobre la actividad de la enzima

amilasa salival.FUNDAMENTO

Las enzimas son proteínas específicas que poseen funciones catalíticas, las mismas que

participan en procesos químicos de los organismos vivos, constituyendo la esencia del

metabolismo.

Las características de las enzimas, como su especificidad, su sensibilidad al cambio de

temperatura, la influencia del pH, así como la presencia de activadores e inhibidores, son

determinantes en la actividad de las enzimas.

Las enzimas al actuar sobre un determinado sustrato, lo hacen a una determinada temperatura,

que en anímales oscila entre 36 y 41 °C si se sobrepasa la temperatura óptima, empieza

gradualmente la desnaturalización.

Al bajar la temperatura la enzima disminuye su actividad inactivándola mas no

desnaturalizándola. La regulación de la actividad de las enzimas se realiza tanto en la célula

como fuera de ella, mediante la fijación sobre molécula de enzima de una serie de sustancias de

bajo peso molecular, tales sustancias pueden causar efecto positivo o negativo. Los que causan

efecto positivo se denominan activadores, estos pueden ser iones, Na+, K+ Mg+2, CI" etc. Los

que causan efecto negativo se denominan inhibidores, por ejemplo, los iones metálicos pesados

como el Pb+2, Ag+2, Hg+2.

La actividad de la amilasa de la saliva en presencia de activadores e inhibidores puede verse

favorecida o desfavorecida, a la vez que la máxima actividad de la amilasa debe ser a la

temperatura óptima.

La actividad de la alfa amilasa presente en la saliva cataliza la hidrólisis de los enlaces alfa 1,4

glicosídicos del almidón (amilasa más amilopectina), lo que puede comprobarse con el reactivo

de lugol



MATERIALES

• Tubos de ensayo

• Pipetas .goteros

• Baño de hielo

• Vasos de precipitados

• Termómetro

• Baño maría

REACTIVOS

• Solución de saliva.

• Solución de almidón al 1%.

• Solución de NaCI 0.9%.

• Acetato de plomo.

• Reactivo de lugol.

• Buffer fosfato pHPROCEDIMIENTO

1. Tomar una muestra de saliva (enjuagar la boca 2-3 veces con bastante agua).

2. La saliva secretada se vierte en un vaso de precipitados, luego filtrar y guardar en un

tubo de ensayo.

3. Rotular 10 tubos de ensayo y proceder de acuerdo al siguiente cuadro:

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

Sol.de almidón 1% 2 2 2 2 2 - - - - -

Buffer fosfato 2 2 2 2 2 - - - - -

Sol. NaCl 0.9% - 0.5 - - - - - - - -

Acetato de Pb - - 0.5 - - - - - - -

Agua destilada 1 0.5 0.5 1 1 - - - - -

Sol. de saliva - - - - - 0.5 05 0.5 0.5 0.5

4. Mezclar cada tubo y colocarlo a un baño isotérmico regulado a 37°C por un tiempo de 5

min. el tubo 9 a 0°C, el tubo 10 a temperatura de ebullición.



5. Luego trasvasar el contenido de los tubos 6,7,8,9,y 10 a los primeros tubos

respectivamente y volver a colocar a 37 °C los 3 primeros, el 4to a 0°C y el 5to a

ebullición por el tiempo de 10 min; sacar del baño isotérmico y añadir a todos los tubos 2ml

de HCI 0.1 N y finalmente 1 gota de Lugol.

Observar las coloraciones que presentan con el Lugol después de la hidrólisis enzimática,

discutir los resultados.

CUESTIONARIO

1.- ¿En qué se fundamenta la reacción del lugol? (sabiendo que entre sus componentes está el yodo)

2.- ¿Cómo demuestra que el almidón siguió la acción de la alfa amilasa salival?

3.- ¿Cómo actúa la amilasa salival cuando entra en contacto con los carbohidratos del bolo alimenticio? Explicar.

4.- ¿Cómo influye cada uno de los factores investigados, sobre la actividad de las enzimas?

5.- ¿La amilasa salival y pancreática tiene la misma acción?

PRACTICA 07

EFECTO DE TEMPERATURA, ACTIVADORES E INHIBIDORES EN LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA

OBJETIVO

■ Observar la actividad de la Catalasa sobre el Peróxido de Hidrógeno por efecto de temperatura, activadores e inhibidores

FUNDAMENTO:

La catalasa es una enzima del grupo del óxido reductasa, cuya actividad es catalizar la descomposición del peróxido de hidrógeno según la siguiente reacción:

La catalasa es una hemoproteína que presenta el grupo Hemo, como parte del sitio catalítico.



Centro activo de la Catalasa

La catalasa aumenta la velocidad de la reacción en 107 - 108. La región de la enzima que participa en la reacción se denomina "Centro Activo", es a través de este lugar que se puede explicar la eficiencia de las enzimas, que implica la formación del complejo [ES].

MATERIALES Y REACTIVOS:

Tubos de ensayo Probeta 20 ml Bureta Pipetas Vasos de precipitados Baño isotérmico Catecol 0.01 M Regla Hielo H202 (3%) Sulfato de cobre 0.1 M Fenol 0.01 M Termómetro

PROCEDIMIENTO

Mezclar el contenido de los 2 tubos y medir la altura de la espuma después de 5 minutos.

En 10 tubos de ensayo acondicionar las soluciones según que indica en el siguiente Cuadro:

N° de tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Temperatura(°C) Ambiente 0° 37 89 37Sol. Enzima (mL) 2 2 2 2 2

CuS04.5H2 O (ml) 0.5H2O2 al 3% (mL) 3 3 3 3 3

CUESTIONARIO



1. Haga los gráficos de la variación de la altura de la espuma contra el tiempo. Coloque el tiempo en el eje de las abcisas y la altura de la espuma en el de las coordenadas. También grafique a la altura de la espuma con las temperaturas de la solución.

2. Qué efecto produce el sulfato de cobre sobre la enzima?. Explique de acuerdo a sus

resultados en la práctica

PRÁCTICA N° 08

HIDRÓLISIS ACIDA ESCALONADA DEL ALMIDÓN

OBJETIVO.

Diferenciar la hidrólisis acida y la hidrolisis enzimática de la Amilasa Salival.

FUNDAMENTO.

En el curso del calentamiento del almidón con ácido clorhídrico diluido, élse descompone con la formación de los fragmentos de diferente tamañollamados dextrínas. Estas se distinguen entre sí en cuanto a su masamolecular y a la coloración que toman al tratarlos con solución de lugol.

MATERIALES

- Solución de almidón al 1%- HCl concentrado- Disolución de lugol- Solución de NaOH al 10%- Reactivo de FehlingPROCEDIMIENTO:

En un tubo de ensayo se vierten 5 ml de disolución de almidón y se añaden 1ml de ácido clorhídrico concentrado. Se mezcla y se hierve.

Luego de 1 ó 2 minutos de iniciada la ebullición se toma una muestra para la reacción con 1 a 2 gotas de lugol en un tubo que contiene 5 ml de agua destilada.

Se toman muestras cada 2 minutos y se hace la prueba del lugol, hasta que la reacción con lugol sea negativa (color amarillo).

El hidrolizado de almidón se neutraliza, con solución de hidróxido de sodio y se realiza la prueba de fheling. La presencia de un precipitado rojo indica la presencia de azúcares reductores, producto final de la hidrólisis acida del almidón.

HIDRÓLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDON

Obtención de la amilasa salival:

o Elegir un voluntario que proceda a salivar hasta obtener 4 ml de saliva.o Diluir 2 ml de saliva en 18 ml de agua destilada. Esta será la solución saliva 1: 9

del experimento.


eritrodextrinas acrodextrinasamilodextrinasAlmidón

Glucosa. Maltosa Maltodextrinas


EXPERIMENTACIÓN: Tome 2 tubos de ensayos. Añada 1 ml de solución saliva 1:9 y al otro

tubo 1ml de agua. Incubar por 5 minutos cada tubo a la temperatura 37 °C Agregue a cada tubo 5 ml de solución de almidón 1%. Realice la prueba de Lugol cada 3 minutos hasta obtener un resultado

negativo (a los 0, 3, 6, 9 minutos, etc. ). Realice la prueba de Fheling.

CUESTIONARIO

a)Qué ocurre si no neutralizamos el ácido correctamente?

b) Si después de realizar la prueba de Fheling añadimos lugol; ¿podríamos detectar almidón sin hidrolizar?.

c) ¿Se puede realizar una hidrólisis básica del almidón?Escribe las diferencias y semejanzas entre almidón y glucógeno, ¿es posible hidrolizar el glucógenod) Explique la diferencia entre hidrolisis acida y enzimática.

PRÁCTICA N° 10IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN ALIMENTOS.

OBJETIVO: Observar las propiedades químicas que se utilizan para laidentificación de diferentes tipos de carbohidratos.

INTRODUCCIÓN

Los carbohidratos, glúcidos o azucares constituyen una de las más importantes clases de moléculas constituyentes de los organismos.

Los carbohidratos son derivados aldehídos o cetónicos de alcoholes polioxidrilados y por lo tanto tienen las propiedades características de esos grupos como son la formación de oxina e hidrazonas. Existen diferentes tipos de reacciones químicas que sirven para determinar cualitativamente la presencia de carbohidratos (monosacáridos, disacáridos y polisacáridos) como son las siguientes:

(a) La Prueba de Molish: Se basa en la acción deshidratante e hidrolizante del ácido sulfúrico concentrado sobre los carbohidratos. En esta prueba el ácido fuerte cataliza la hidrolisis de cualquier enlace glucosidico presente en la muestra, y la deshidratación del mismo a furfural (pentosas) e hidroximetil furfural (hexosas) de los monosacáridos resultantes. Estos furfurales se condensan con naftol y dan un producto coloreado. Esta prueba para la identificación de azucares en general.



(b) Prueba de Lugol: Se basa en la formación de un complejo entre el ion I-3 y la

molécula de amilosa de almidón, la cual tiene una conformación helicoidal. Al introducirse el ion I-

3 dentro de hélice se forma una solución color azul o negra dependiendo de la concentración. La amilo pectina produce un color purpura rojizo, y el glucógeno un color pardo rojizo.

(c) Prueba de Fheling: Permite distinguir monosacáridos de disacáridos. Aquí el Cu2+

del reactivo (acetato cúprico en ácido acético diluido), es reducido a Cu+ en solución de ácido débil, en un tiempo de 5 a 7 minutos con los monosacáridos. Reducen el ion Cu2+

los disacáridos en un tiempo de 7 a 12 minutos. El Cu2O es un precipitado de color rojo. Es necesario realizar esta prueba en condiciones de pH y de calentamientos fijos y estrictos.

(d) Prueba de Bial: Es una reacción coloreada específica para pentosas y cierto ácidos uronicos que se descomponen al calentarse con ácidos formando pentosas bajo condiciones cuidadosamente controladas de temperatura, tiempo y concentración de HCl, las pentosas son rápidamente convertidas a furfural, mientras que el hidroximetil furfural se forma a partir de hexosas presentes. En presencia del ion férrrico y orcional (5 metil resorcinol), el furfural se condensa rápidamente para producir un complejo colorado verde.

(e) Prueba de Selliwanoff: Es una reacción coloreada que es específica para cetosas. En solución de HCl concentrado, las cetosas sufren una deshidratación para producir derivados del furfural con más rapidez que como lo hacen las aldosas. Posteriormente los derivados del furfural forman complejos con el resorcinol para producir color. Consecuentemente los grados relativos del color desarrollado en una solución que contiene azucar, HCl y resorcinol, proporciona evidencia sobre si el azucar es una aldohexosa o cetosa. Las cetosas generalmente producen un color rojo. En las condiciones que se efectua la prueba, todas las cetosas que pueden estar unidas en enlace glucosidico quedarán en libertad y originarán reacción positiva.



Materiales y reactivos

· 10 tubos de ensayo· Vaso de precipitado· Gradilla· Mechero· Tela de asbesto· Agitador de vidrio· Vidrio de reloj· 2 pipetas de 10 ml.· 5 portaobjetos· 1 pinza para tubo de ensayo

Reactivos

Naftol, etanol al 95 %, yodo, yoduro de potasio, acetato de cobre, ácido acético concentrado, orcinol, ácido clorhídrico concentrado, cloruro de fiero, resorcinol, ácido sulfúrico concentrado, ácido nítrico concentrado, clorhidrato de fenilhidracina, acetato de sodio, solución de carbohidratos: glucosa, galactosa, fructosa, sacarosa, lactosa y almidón.

Preparación de reactivos

Reactivos de Molish:

Disolver 10 g de naftol en 100 ml de etanol al 95%

Reactivo de Lugol:

Moler y mezclar finamente en un mortero 50 g de yodo y 100 g de yoduro de potasio. Disolver con agua destilada y aforar hasta un volumen de 1 litro.

Reactivo de Bradford:

Disolver 13.3 g de acetato cúprico con 200 ml de agua y filtrar si es necesario, añadir 1.9 ml de ácido acético concentrado.

Reactivo de Bial:

Disolver 1.5 g de orcinol en 500 ml de HCl concentrado y añadir de 20-30 gotas de una solución acuosa de cloruro férrico al 10%.

Reactivo de Silliwanoff:

Disolver 0.5 g de resorcinol en 100 ml de HCl diluido 1:2.

PROCEDIMIENTO

Ensayos

Nota. Antes de realizar las pruebas, elabore una tabla de manera que en la primera fila escriba el nombre de las muestras de carbohidratos y en la primera columna el nombre de la prueba a efectuarse, dibuje dos columnas adicionales: una para escribir las observaciones y la otra para resumir el resultado indicando si la prueba fue positiva o negativa.



Prueba de Molish

Prepare una serie de 6 tubos de ensaye en una gradilla, a cada uno añádales 2 ml de las soluciones a prueba. Enseguida adicione 5 gotas del reactivo de Molish y agite. Luego incline cada tubo y deposite cuidadosamente por las paredes del tubo 2 ml de ácido sulfúrico concentrado. La aparición de un anillo rojo violeta en la interfase indica la presencia de carbohidratos en la solución.

Prueba de Lugol.

A una serie de 6 tubos transfiera 2 ml de cada una de las soluciones de prueba. Acidifique las muestras con 5 gotas de HCl 1 M. Luego adicione 1 gota de lugol. La aparición de un anillo rojo violeta en la interfase indica la presencia del carbohidrato en la solución.

Prueba de Fheling.

Coloque 5 ml de reactivo de Barford en cada tubo de una serie de 6 tubos de ensaye, adicione 1 ml de los carbohidratos a prueba y caliente a Baño Maria hirviendo durante 2 minutos, saque los tubos, déjelos reposar y anote sus observaciones.

Prueba de Bial.

Prepare una serie de 6 tubos de ensaye y coloque 5 ml de reactivo de Bial a cada tubo. Adicione 2 ml de la solución de carbohidrato y caliente suavemente las soluciones en un mechero hasta la aparición de un color verde o bien hasta que las primeras burbujas alcancen la superficie. Un color azul verde en la solución a prueba indica un resultado positivo.

Prueba de Selliwanoff.

Es una serie de 6 tubos de ensaye coloque 5 ml de una muestra de carbohidrato. Acidifique la solución con 10 gotas de ácido acético glacial y adicione 3 gotas de fenilhidrazina (o 0.4 g de clorhidrato de fenilhidrazina) y una pequeña porción de acetato de sodio solido. Disuelva con agitación y caliente en un baño de agua durante 5 minutos. En frie los tubos y observe al microscopio los cristales formados.

Resuma sus observaciones en una tabla e interprete los resultados.

Cuestionario

1. Escribe la reacción química que sucede entre el reactivo de Molish y uno de los carbohidratos que usaste.2. Escribe la reacción química que sucede entre el reactivo de Barford y uno de los carbohidratos que usaste?.3. Que es un azúcar reductor y uno no reductor?. Cual es el reactivo que tradicionalmente (mas común) se emplea para saber si es reductor o no reductor?

PRACTICA N° 11

CUANTIFIFICACIÓN DE COLESTEROL TOTAL

OBJETIVOS



Cuantificar la cantidad del colesterol total determinado LDL y HDL en el suero sanguíneo, por el método enzimático.

INTRODUCCION

El colesterol es un lípido poli cíclico no saponificable que se encuentra en todos los animales. Forma parte de la estructura de membranas celulares y es precursor de muchos compuestos como las hormonas, vitamina D, etc.

Su estructura química presenta 4 anillos designados como A, B, C y D. y circula a través de la sangre asociado a proteínas específicas formando complejos macromoleculares denominados lipoproteínas.

VLDL (Very Low Density Lipoprotein), LDL (Low Density Lipoprotein) y HDL (High Density Lipoprotein) cada uno con sus propiedades y papel metabólico diferentes.

FUNDAMENTO QUÍMICO

PROCEDIMIENTO

B S D

Sobrenadante - - 100μL

Standard - 20μL -

Reactivo de trabajo 2 mL 2 mL 2 mL

Absorbancia , 505 nm

Mezclar e incubar 5 minutos a 37 ºC si se usa el reactivo de trabajo de colestat enzimático AA/liquida o 15 minutos a 37 ºC si se usa el de colestat enzimático. Retirar del baño y enfriar. Leer a 505 nm en espectrofotómetro con filtro verde, llevando a cero con el blanco.

CALCULO DE RESULTADOS

LDL Colesterol (g/L) = Colesterol total (*) – (D x f)

f = 0.624/S

(*) Valor obtenido con colestat enzimático o colestat enzimático AA/ liquida.

Valores de referencia

The National Cholesterol Education Program provee los siguientes valores de LDL colesterol:

Riesgo bajo o nulo: Menores a 1.29 g/L

Riego moderado a elevado: Valores entre 1.30 – 1.89 g/L



Riesgo muy elevado: ≥ 1.90 g/L

CUESTIONARIO

1. Explique la importancia del colesterol en la sangre2. En la cuantificación del colesterol que función cumplen las enzimas Lipasa, colesterol

oxidasa y peroxidasa.3. Compare os resultados experimentales obtenidos en el laboratorio con los valores

bibliográficos.4. Explique las diferencias que existe en la función de las lipoproteínas VDLD, HDL,

LDL.5. Cuáles son los valores de referencias del colesterol6. Que alteraciones producen los niveles altos de colesterol

PRACTICA N° 12

AISLAMIENTO DE LA DESOXIRRIBONUCLEOPROTEINA Y RECONOCIMIENTO DEL DNA

OBJETIVO. Realizar el aislamiento y caracterización de la desoxirribonucleoproteina

FUNDAMENTO

En células eucariotas, el DNA esta asociado con histonas (proteínas básicas ricas en arginina o lisina) y constituye un complejo de nucleoproteina llamado cromatina La desoxirribonucleoproteinas como componente principal del núcleo de células esta estrechamente relacionada con los cromosomas.

La mejor fuente de desoxirribonucleoproteinas son los tejidos ricos en núcleos celulares (leucocitos, espermatozoides, glándulas linfáticas, hígado mamas y el oviducto de las aves).

El DNA como componente de las nucleoproteínas, químicamente es considerado como un polinucleótido de doble cadena.

Una propiedad característica de las nucleoproteinas es su capacidad de formar disoluciones muy viscosas en soluciones concentradas de sales (cloruro de sodio y otras). Al ser así precipitadas desde soluciones salinas diluidas, estas sedimentan en forma de hilos muy finos.

El DNA de la nucleoproteínas puede ser reconocida por una serie de reacciones coloreadas con los cuales este puede ser distinguido del RNA. Estas reacciones están condicionadas por la presencia de la desoxirribosa en la molécula del DNA. Es muy utilizado el reactivo de la difenilamina que con el DNA produce una coloración azul.


- Centrífuga - Baño maría- Balanza.



- Tubos de ensayo - Centrífuga - Vasos de precipitados - Probeta- Varilla de madera con entallados.- Gónadas de ovino- Cloruro de sodio 1 N.- Reactivo de difenil amina: 1g de difenilamina disolver en 100 ml de

ácido acético glacial y añadir 2.75ml de ácido sulfúrico concentrado.- Hidróxido de sodio 0.4%

PROCEDIMIENTO

1. Dos gramos de gónadas se desmenuzan con tijeras sobre un vidrio de reloj y luego pasar al mortero.

2. Añadir al mortero 40 a 80 ml de NaCI 1N, triturando el tejidocuidadosamente durante 10-15 minutos. Se puede utilizar también

3. La disolución viscosa reparar en tubos de centrífuga y centrifugar a3000 r.p.m. durante 10 minutos.

4. Descartar el líquido a una probeta graduada y medir su volumen.5. Medir en un vaso de precipitados un volumen séxtuplo de agua con

respecto al líquido centrifugado.6. Agregar al vaso de precipitados el líquido centrifugado girando

lentamente la varilla de madera dentro del líquido, haciendo que los hilosde la nucleoproteínas se enrollen en la varilla.

RECONOCIMIENTO DEL DNA

FUNDAMENTO

CUESTIONARIO1. Explicar la importancia del DNA en el organismo humano. 2. Utilizando la curva de calibración “Absorbancia vs. concentración” determine

la cantidad de desoxirribosa en el DNA aislada. Comparar el resultado con los datos bibliográficos.

3. En la cuantificación de 2-desoxirribosa del DNA porque se calienta a 90oC.



BIBLIOGRAFÍA

· Dr. VILLAVICENCIO NÚÑEZ MARIANO BioquímicaEd. Concytec 1996

· CLARK J.M.Bioquímica Experimental Ed. Acubia - España 1992· MAC FADDIN "Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias

importancia clínica"· BRYAN L. WILLIANS / KEITH WILSON "Principios y Técnicas de Bioquímica

Experimental· A.V. CHECHETLIN BOROMIANSKI POKUSAY "Practicas Bioquímica".· GEORGE RENDINA "Técnicas de Bioquímica Aplicada".· ALDO A. GUERCI "Método de Análisis Clínico y su Interpretación"


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