V. Longo - PROPRIETA' NUTRACEUTICHE DI CARNE BOVINA DA AGRICOLTURA SIMBIOTICA
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CNR-IBBA
Vincenzo LongoIstituto di Biologia e Biotecnologia Agraria
CNR, PisaEmail: [email protected]
PROPRIETA’ NUTRACEUTICHE DI CARNE BOVINA DA AGRICOLTURA SIMBIOTICA
1
2
Uno degli obiettivi dell’Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria
Sede Secondaria di Pisa-CNR è
valorizzare alimenti di qualità ottenuti con tecniche sostenibili ed
innovative focalizzando l’attenzione sulle proprietà nutraceutiche
CNR-IBBA
L’agricoltura eco-simbiotica si basa
sul principio che per migliorare le
tecniche produttive una delle
possibilità più innovative da
esplorare è il ricorso all’utilizzo di
microrganismi come biostimolanti
delle piante.
Sui terreni coltivati viene rispettata
la turnazione e non sono utilizzati
fertilizzanti chimici, pesticidi né
antibiotici ma funghi arbuscolari
micorrizici.
3
L’obiettivo del nostro lavoro:
caratterizzare la carne proveniente da animali
di razza bovina piemontese allevati
con agricoltura eco-simbiotica.
Parte I: Caratterizzazione
biochimica e stabilità ossidativa
Parte II: Digestione in vitro e
isolamento dei peptidi bioattivi della carne
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Proteine Lipidi Minerali
Ferro Zinco Fosforo Magnesio Calcio Potassio
(g/100g) (mg/kg)
23,6±0,55 1,12±0,12 10,4±1,3 26,0±1,3 0,70±0,03 203 ± 3,4 138 ± 2,1 2611±52,8
Media±DS (n=6) del contenuto totale di proteine e lipidi misurati con metodo di Lowry e di Folch ed espressicome g su 100g di carne e del contenuto di ferro e zinco, magnesio, calcio, potassio e fosforo misuratimediante spettrometria d’assorbimento atomico ed espressi come mg/Kg di carne.
6
g/100g di acidi grassi totali
C14:0 1,93±0,17 C17:1 0,82±0,14
C14:1 0,48±0,06 C18:0 13,23±0,20
C15:0 0,26±0,03 C18:1n-9 37,28±1,65
C16:0 20,85±0,49 C18:1n-7 2,76±0,11
C16:1 3,09±0,23 C18:2n-6 9,71±1,13
C16:2 0,56±0,04 C18:3n-3 0,61±0,06
C17:0 1,10±0,18 CLA 0,42±0,05
C16:3 0,67±0,08 C20:4n-6 2,50±0,55
Media±DS (n=6) degli acidi grassi nel muscolo semimembranoso della fesa mediante gas cromatografia.
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Glutatione Perossidazione
lipidica
Carbonilazione
proteica
Catalasi Glutatione
perossidasi
Superossido
dismutasi
(μg GSH/g) (nmol MDA
eq/g)
(nmol NPH/g) (μmol/g x
min)
(μmol/g x min) (U/g)
109,2±18,1 1,97±0,06 166,13±13,24 153,5±9,1 0,93±0,08 156,9±8,4
Media±DS (n=6) del contenuto di glutatione (saggio di Ellman), la perossidazione lipidica (TBARS) , la carbonilazioneproteica (DNPH) e l’ attività degli enzimi: catalasi, glutatione perossidasi e superossido dismutasi misurati con saggispettrofotometrici.
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➢ Misura la capacità di un campione di inibire l’ossidazione delle LDL.
➢ Questo processo determina la formazione di dieni coniugati che assorbono a 240 nm.
➢ I risultati vengono confrontati con un controllo negativo, le LDL, e uno positivo, la Vitamina C.
Risultati riportati come profilo cinetico dei dieniconiugati (A) e come lag time ossia il temponecessario all’ossidazione delle LDL (B). **=p<0,01vs LDL; ***=p<0,001 vs LDL.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 5000 10000 15000 20000
Con
jugate
Die
nes
Time (Sec)
LDL
Vit C (0,5) µg/ml
La granda
A
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
LDL ECO Vit C 0,5 μg/ml
Lag
Tim
e (s
ec)
**
***
La granda
B
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ZEA α-ZOL β-ZOL
(ng/g) (ng/g) (ng/g)
ND 4,6±0,79 ND
Risultati della HPLC-UV detector espressi come media± DS (n=3) di ng/g di carne.
Lo Zearalenone (ZEA) è unamicotossina prodotta principalmentedai funghi delle specie Fusarium che sisviluppano soprattutto nelle colturecerealicole. Lo ZEA e i suoi metabolitiα-Zol, β-Zol, α-Zal e β-Zal, si leganoai recettori per gli estrogeni favorendola sintesi dell’RNA, di proteine e laproliferazione cellulare.
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Glutatione Perossidazione lipidica
Carbonilazione proteica
Media±DS (n=6) nella carne fresca, congelatasottovuoto e non sottovuoto.***=p<0,001;**=p<0,01; *=p<0,05 vs carne fresca.
0
20
40
60
80
100
120
140
fresca congelata sv congelata non sv
μg
GS
H/g
***
11
Media±DS (n=6) nella carne fresca, congelatasottovuoto e non sottovuoto. ***=p<0,001;**=p<0,01; *=p<0,05 vs fresca.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
fresca congelata sv congelata non sv
μm
ol/
g x
min *
*
Catalasi
12
La carne bovina proveniente dagli allevamenti che utilizzanol’agricoltura eco-simbiotica presenta:
➢buon contenuto di minerali e acidi grassi mono e polinsaturi;
➢azione inibitoria sul processo di ossidazione delle LDL;
➢livelli minimi di contaminazione da α-ZOL e nessuno di ZEA e β-ZOL;
➢elevata stabilità ossidativa sia nel prodotto fresco che congelatosottovuoto in quanto non si osservano variazioni nel contenuto diglutatione, nella carbonilazione proteica e nella attività di due enzimiantiossidanti, la superossido dismutasi e la glutatione perossidasi.
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14
Sequenze di 2-40 amminoacidi, inattivi nelle proteine native, funzionali in seguito a digestione in vivo, idrolisi enzimatica in vitro o fermentazione.
Studi recenti ne hanno dimostrato l’attività antiossidante (Rajapakse et al., 2005), anti-infiammatoria, anti-ipertensiva, anti-diabetica, anti-batterica etc..(Lafarga et al., 2014).
Tali attività dipendono soprattutto dalla sequenza amminoacidica.
Principali fonti: latte, legumi ed estratti proteici muscolari di carne e pesce.
15
➢ Omogenizzazione della fesa cruda;
➢ Estrazione delle proteine sarcoplasmatiche e miofibrillari;
➢ Dosaggio delle proteine con metodo di Lowry;
➢ Digestione:
Step orale (α-amilasi,10’, 37°C)
Step gastrico (Pepsina in ambiente acido, 2h, 37°C)
Step duodenale (Pancreatina+ Bile in ambiente basico, 2h, 37°C)
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Pre-Dig PS Idrolisato PS PS<30KDa 3<PS<30KDa PS<3KDa
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
0,06±0,01 0,23±0,01** 0,36±0,04** 0,11±0,03* 0,29±0,03**
Pre-Dig PM Idrolisato PM PM<30KDa 3<PM<30KDa PM<3KDa
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
μmoli TE
/mg proteine
μmoli TE/
mg proteine
0,07±0,01 0,22±0,04** 0,40±0,09*** 0,14±0,01** 1,38±0,05***###
Risultati del test ABTS come media±DS (n=6) nelle proteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari (PM)espressi come μmoli Trolox Equivalenti/mg di proteine. *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001 vs Pre-Dig.#=p<0,005 vs Idrolisato.
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0,00E+00
5,00E+02
1,00E+03
1,50E+03
2,00E+03
2,50E+03
3,00E+03
3,50E+03
4,00E+03
Pre-Dig PS Idrolisato PS PS<30 3 > PS < 30 PS< 3
μm
oli
TE
/mg p
rote
ine
***##
***
0,00E+00
5,00E+02
1,00E+03
1,50E+03
2,00E+03
2,50E+03
3,00E+03
Pre-Dig PM Idrolisato PM PM<30 3 > PM< 30 PM< 3
μm
oli
TE
/mg p
rote
ine
***##***
Risultati del test ORAC. Media±DS (n=6) nelleproteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari(PM) espressi come μmoli TE/mg di proteine.***=p<0,005; ***=p<0,001 vs Pre-Dig PM.##=p<0,01 vs Idrolisato.
18
0
20
40
60
80
100
120
% A
CE
-in
ibiz
ion
e
***
0
20
40
60
80
100
120
% A
CE
-in
ibiz
ion
e
#
***
Media±DS della % di inibizione dell’enzima ACE nelle proteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari (PM). ***=p<0,001 vs Pre-Dig. #=p<0,05 vs Idrolisato.
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IC50 Pre-Dig PS Idrolisato PS PS<30KDa 3<PS<30KDa PS<3KDa
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg proteine/ml
ND 0,19±0,02*** 0,19±0,01*** 0,38±0,02*** 0,15±0,01***
IC50 Pre-Dig PM Idrolisato PM PM<30KDa 3<PM<30KDa PM<3KDa
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg
proteine/ml
mg proteine/ml
ND 0,20±0,01*** 0,14±0,02*** 0,35±0,06*** 0,11±0,01*** #
Media±DS dell’IC50 dell’enzima ACE nelle proteine sarcoplasmatiche (PS) e miofibrillari (PM). ***=p<0,001vs Pre-Dig. #=p<0,05 vs Idrolisato.
20
0
20
40
60
80
100
120
E. coli E. aerogenes S. typhimurium E. faecalis S. aureus
Cre
scit
a b
att
eric
a (
%)
CNT
Pre-Dig PS
Idrolisato PS
3<PS<30
PS<30
Ps< 3
****
**** **
***###
***###
***###
***###
***###
Media±DS (n=6) della % di crescita batterica, nelle proteine sarcoplasmatiche. **=p<0,01;***=p<0,001 vs Pre-Dig PS. ###=p<0,005 vs Idrolisato PS.
21
0
20
40
60
80
100
120
E. coli E. aerogenes S. typhimurium E. faecalis S. aureus
Cre
scit
a b
att
eric
a (
%)
CNT
Pre-Dig PM
Idrolisato PM
3<PM<30
PM<30
Pm< 3
***###
***###
***###
****
******
**
**
**
Media±DS (n=6) della % di crescita batterica, nelle miofibrillari. **=p<0,01;***=p<0,001 vs Pre-Dig PM. ###=p<0,005 vs Idrolisato PM.
***###
***###
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0
20
40
60
80
100
120
EDTA
0,1mg/ml
EDTA
0,2mg/ml
EDTA
0,5mg/lm
EDTA
1mg/ml
Pre-Dig
PS
Idrolisato
PS
PS<30 3 > PS <
30
PS< 3
Att
ivit
à F
e2
+ c
hel
an
te (
%)
***
#*
Media±DS (n=6) nelle proteine sarcoplasmatiche. #=p<0,05;
***=p<0,001 vs Pre-Dig PS. #=p<0,05 vs Idrolisato PS.23
Media±DS (n=6) nelle proteine miofibrillari. #=p<0,05;***=p<0,001 vs Pre-Dig PM. ##=p<0,01 vs Idrolisato PM.
0
20
40
60
80
100
120
EDTA
0,1mg/ml
EDTA
0,2mg/ml
EDTA
0,5mg/lm
EDTA
1mg/ml
Pre-Dig
PM
Idrolisato
PM
PM<30 3 > PM <
30
PM< 3
Att
ivit
à F
e2
+ c
hel
an
te (
%)
***##
*
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Nell’ambito delle ricerche sui peptidi della carne, questo lavororappresenta una novità per la fonte primaria, rappresentata dalleproteine miofibrillari e sarcoplasmatiche della fesa di bovinopiemontese. Inoltre, è stato messo a punto il processo di digestione invitro ed è stato selezionato il grado d’idrolisi ottimale per le attività.
I risultati hanno messo in luce un aumento del potenzialeantiossidante delle frazioni proteiche dopo la digestione rispetto aicampioni non digeriti.
Dopo la digestione in vitro, i campioni proteici hanno mostrato potereanti-ipertensivo, antibatterico e Fe2+-chelante.
I migliori risultati sono stati riscontrati nei peptidi delle proteinemiofibrillari con peso molecolare minore di 3KDa, in accordo con datipresenti in letteratura che mostrano un maggior potenziale biologicodi peptidi con peso molecolare compreso tra 500 e 1000 Da.
25
I peptidi bioattivi, composti che stanno acquisendo sempre più consensi e approvazione in ambito sperimentale e terapeutico.
26
Siamo all’inizio… necessitano ulteriori studi
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Ringraziamenti
Dr.ssa Della CroceDr.ssa RussoDr.ssa PucciDr.ssa FrassinettiDr. CiardiSig. Caltavuturo
Dr. Valter Lubrano (Fondazione Monasterio)
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