V Encuentro Regional de Biocatálisis y Biotransformaciones

V EnReBB

Libro de Resúmenes

5 - 8 de Noviembre de 2012Centro Científico Tecnológico La Plata

La Plata, Buenos Aires,Argentina

Organizado por SAByB

https://sites.google.com/site/5enrebb2012/home

Quinto Encuentro Regional de Biocatálisis y Biotransformaciones : V EnReBB / Elizabeth Lewkowicz ... [et.al.]. - 1a ed. - San Isidro : Sociedad Argentina

de Biocatálisis y Biotransformaciones, 2012. 176 p. : il. ; 16x21 cm. ISBN 978-987-28696-0-1 1. Química. 2. Enseñanza Universitaria. I. Lewkowicz, Elizabeth

CDD 540.711

Fecha de catalogación: 10/10/2012

Diseño y diagramación: SAByBTirada 150 ejemplaresImpreso en ArgentinaQueda hecho el depósito que marca la ley 11723ISBN 978-987-28696-0-1

No se permite la reproducción total o parcial, de este libro, ni su almacenamiento en un sistema informático, ni su transmisión por cualquier forma o cualquier medio electrónico, mecánico, fotocopia u otros métodos sin permiso previo de los autores.

Se terminó de imprimir en el mes de octubre de 2012.

Instituciones Auspiciantes

1

2

Comité CientíficoLeandro H. Andrade (Brasil)

Alicia Baldessari (Argentina)

Daniel Bustos (Argentina)

Susana A. Ferrarotti, (Argentina)

Guadalupe García Liñares (Argentina)

David Gonzalez (Uruguay)

Luis E. Iglesias (Argentina)

Andrés Illanes (Chile)

Adolfo M. Iribarren (Argentina)

Anita J. Marsaioli (Brasil)

André Luiz Meleiro Porto (Brasil)

Pilar Menéndez (Uruguay)

María da Graça Nascimento (Brasil)

María Dolores Reyes Duarte (México)

Sonia Rodriguez (Uruguay)

Gustavo Seoane (Uruguay)

Eduardo Torres Ramírez (México)

Lorena Wilson (Chile)

Colaboradores

Agradecimientos

-Al Dr Carlos W. Rapela, Director del CCT La Plata, por haber cedido las instalaciones.-A las secretarias del CCT La Plata, las Sras Romina Ronchi y Amelia Metetiero, por su muy buena predisposición en la atención de innumerables consultas.-Al Dr Luis A. Gambaro, Director del CINDECA; por brindar su aval en las solicitudes realizadas al CCT la Plata.

Juan Julio

Martín Ramón

Xavier Kriscautzky

Mónica Baldo

Paola Bianchi

Maria Belén Sabaini

Julieta Bertana Lahourcade

Graciela M. Valle

Monica Petterini

3

Estimados Participantes

Con mucha alegría les damos la Bienvenida al V EnReBB en la ciudad de la Plata. La Sede del V EnReBB es en el Centro Científico Tecnológico La Plata, calle 8 nro. 1467

entre calles 62 y 63.

El libro de resúmenes está dividido en secciones según el tipo de presentación:Conferencias plenarias (CP), Conferencias invitadas (CI), Conferencias orales (CO) y

Presentaciones de Posters (PP).

Las Conferencias Orales y las Presentaciones de Posters se han dividido en las tres áreas del Encuentro:

DB: Area Diseño de BiocatalizadoresB: Area Biotransformaciones

SB: Area Screening de Biocatalizadores

Todos los trabajos están identificados por tipo de presentación (CP, CI, CO o PP), por área si corresponde (para las CO y PP) y por un número de orden asignado según

cronograma. De esta forma la CO-DB5 es la comunicación oral del área Diseño de Biocatalizadores número 5.

El presente libro está organizado de tal manera que usted puede consultar el índice general a continuación y luego ir ubicando los distintos trabajos de su interés en los

índices de cada sección situados al comienzo de cada grupo de trabajos.

Al final encontrará el índice de autores por página, donde cada autor tiene contabilizados todos sus trabajos.

4

Cómo llegar al CCT la Plata, sede del V EnReBB?

1- Desde la Ciudad Autónoma de Buenos Aires

1.1. En Micro: Desde el Obelisco, ubicado en Cerrito al 470/480 - (frente al Banco Galicia) en la Parada del 129, allí paran los micros Costera Metropolitana - Chevallier - Expreso La Plata - Plaza. En La Plata nos pueden dejar en Plaza Paso (Av. 13 y calle 44, a cuatro cuadras de Tribunales) o en la Terminal de micros ubicada en calle 41 entre 3 y 4.

1.2 En tren: Desde la Estación Constitución ubicada en Av. Brasil 1138 utilizando el FFCC Roca es posible llegar a la estación de trenes de La Plata ubicada en calle 44 y Avenida 1.

2. Desde distintos puntos de la Ciudad de La Plata

2.1 Desde Plaza Paso: continuar por la Avenida 44 hacia Plaza Italia y tomar la segunda salida hacia Avenida 7. En el trayecto se bordea la Plaza Rocha y se continúa por Av. 7 y luego girar a la derecha con dirección a la calle 62. Luego de una cuadra girar hacia la izquierda en calle 8.

2.2 Desde la Terminal de Ómnibus de La Plata, tomar la calle 3 y hacer dos cuadras hasta Avenida 44. Tomar la Av. 44 hasta la Plaza Italia (aprox. 3 cuadras), rodear la plaza y salir por Avenida 7. Seguir por esta Avenida (aprox. 16 cuadras) y girar a la derecha en la calle 62 y luego de una cuadra girar a la izquierda para llegar a calle 8. El CCT se encuentra a media cuadra por esta calle.

2.3. Desde el Teatro Argentino de La Plata ubicado en Avenida 51 entre las calles 9 y 10 hacia el CCT La Plata se puede llegar caminando por la Avenida 51 hacia la calle 8 (1 ½ cuadras) y luego seguir por calle 8 aproximadamente 10 cuadras.

2.4. Desde la Catedral de la ciudad de La Plata (y/o Plaza Moreno) ubicada en calle 51 entre calles 14 y 15 hasta el CCT La Plata se puede llegar caminando por la Avenida 51 hacia la calle 14, bordear la Plaza Moreno y encontrará la calle 54. Continuar por la calle 54 (6 cuadras aprox) y girar a la derecha hacia la calle 8. El CCT se encuentra a aprox. 8 1/2 cuadras por la calle 8.

2.5 Desde la estación de trenes ubicada en calle 44 y Avenida 1, seguir por esta Avenida hasta la Av. 62 (aprox. 16 cuadras) y luego girar a la izquierda con dirección a la calle 8 (7 cuadras).

5

Cronograma

7

Hor

ari

o L

un

es 5

M

arte

s 6

Mié

rcol

es 7

Ju

eves

8

8.30

-9.3

0

Col

ocac

ión

de p

oste

rs

9.30

-10.

30

C

P-2

D

r. E

duar

do G

arcí

a-Ju

nced

a C

P-3

D

r. F

ranc

esco

Mol

inar

i

10.3

0-11

.10

Acr

edit

acio

nes

Pos

ters

, PP

DB

1-1

9

Caf

é P

oste

rs, P

P S

B 1

-15

C

afé

CI-

4

Dr.

Ig

nac

io C

arre

ra

Gar

ese

11.1

0-1

1.30

C

P-4

D

r. V

icen

te G

oto

r F

ern

ánd

ez

11.3

0-1

2.10

C

O B

5-8

C

O D

B 4

-6

12.1

0-12

.50

Cie

rre-

En

treg

a d

e p

rem

ios

12.5

0-14

A

lmue

rzo

A

lmue

rzo

A

lmu

erzo

14

.00-

14.3

0 A

pert

ura

14.3

0-15

.10

CP

-1

Dr.

Wol

fgan

g K

rout

il

CI-

2 D

ra. M

arce

la K

urin

a-S

anz

CI-

3 D

r. L

eand

ro H

elgu

eira

A

ndra

de

Act

ivid

ades

so

cial

es y

re

crea

tiv

as

15.1

0-15

.30

Pos

ters

, PP

B 1

-26

Caf

é C

O B

9-1

2

15.3

0-16

.30

CO

DB

1-3

16.3

0-17

.30

Caf

é

CO

SB

1-5

Pos

ters

, PP

B 2

7 -

44

Caf

é

17.3

0-18

.10

CI-

1

Dra

. Geo

rgin

a S

ando

val

Fab

ián

CO

DB

7-1

0

18.1

0-18

.50

CO

B 1

-4

Asa

mbl

ea S

AB

yB

18.5

0-19

.30

19.3

0-21

C

ockt

ail

de b

ienv

enid

a

22:3

0

C

ena

de C

laus

ura

CP

C

onfe

ren

cia

Ple

nar

iaD

B

Áre

a D

iseñ

o d

e B

ioca

tali

zad

ores

CI

Con

fere

nci

a In

vita

da

B

Áre

a B

iotr

ansf

orm

acio

nes

CO

C

omu

nic

ació

n O

ral

SB

S

cree

nin

g d

e B

ioca

tali

zad

ores

PP

P

rese

nta

ción

Pos

ter

Cro

nogr

amaV

Enc

uent

ro R

egio

nal

de

Bio

catá

lisi

s y

Bio

rans

form

acio

nes

(V E

nReB

B, 2

012)

9

Indice general

Conferencias Plenarias

Conferencias Invitadas

Comunicaciones Orales

Area de Diseño de Biocatalizadores

Area de Biotransformaciones

Area de Screening de Biocatalizadores

Presentaciones de Posters

Area de Diseño de Biocatalizadores

Area de Biotransformaciones

Area de Screening de Biocatalizadores

Indice de Autores

Con

Co

Comunicaciones Orales

Presentaciones de Posters

Ind

11 - 16

17 - 22

25 - 36

37 - 52

53 - 59

63 - 85

87 - 136

137 - 155

157 - 164

11

Conferencias Plenarias

Código Conferencista Título y autores Página

CP-1 KROUTIL, Wolfgang

The rise and race of the w-transaminases

Wolfgang Kroutil, Robert C. Simon, Francesco G. Mutti,

Johann H. Sattler, Elina Siirola, Katharina Tauber,

Michael Fuchs, Christine S. Fuchs, Desiree Pressnitz,

Kurt

Faber, Jan Pfeffer, Ferdinand Zepeck

13

CP-2

GARCIA-JUNCEDA

REDONDO, Eduardo

Aldolasas hipertermófilas para la síntesis de análogos

de carbohidratos

I. Oroz-Guinea, I. Ayuso, E. García-Junceda

14

CP-3 MOLINARI,

Francesco

A journey of an organic chemist through biocatalysis: the wonderland of enzymatic

redox reactions

Francesco Molinari

15

CP-4 GOTOR-

FERNÁNDEZ, Vicente

Uso de enzimas hidrolíticas como versátiles herramientas

en química orgánica. Aplicaciones en la síntesis de

fármacos quirales

Vicente Gotor-Fernández

16

12

13

The rise and race of the w-transaminases

1 2 1 1 1Wolfgang Kroutil , Robert C. Simon , Francesco G. Mutti , Johann H. Sattler , Elina Siirola , 1 1 2 2 1Katharina Tauber , Michael Fuchs , Christine S. Fuchs , Desiree Pressnitz , Kurt Faber , Jan

1 1Pfeffer , Ferdinand ZepeckWolfgang.Kroutil@uni-graz.at

1Department of Chemistry, University of Graz, Graz (8010), Austria.2Austrian Centre of Industrial Biotechnology ACIB c/o University of Graz, Graz (8010), Austria.

3Evonik Degussa GmbH, CREAVIS Technologies & Innovation, Marl (45772), Germany.4 Sandoz, Kundl, Austria.

Optically pure a--chiral primary amines can be prepared by reductive amination

employing metal-, ogano- or biocatalysis. Using biocatalysts such a w-transaminases [1], a-chiral primary amines were prepared with e.e. up to >99% at a substrate concentration of 50 mM. The formal asymmetric reductive amination of ketones was achieved giving access to the (S)-as well as the (R)-enantiomer. By this methodology various building blocks for bioactive compounds could be prepared in aqueous buffer [2].

Figure 1. General reaction scheme for the amination of ketones

Using appropriate conditions it was now shown that the amination can also be performed in organic solvents, thereby simplifying workup of the amine compared to reactions in aqueous phase. Furthermore, it was demonstrated, that the biocatalyst can perfectly differentiate between different keto groups within a single molecule; for instance, when transforming 1,5-diketones only the keto moiety in (-1)-position was aminated avoiding thereby sophisticated protection strategies [3].

References

1. Koszelewski, D.; Tauber, K.; Faber, K.; Kroutil, W. Trends Biotechnol. 2010, 28, 324-332. 2. Mutti, F. G.; Fuchs, C. S.; Pressnitz, D.; Sattler, J. H.; Kroutil, W. Adv. Synth. Catal. 2011, 353, 3227-3233 and references therein. 3. Simon, R. C.; Grischek, B.; Zepeck, F.; Steinreiber, A.; Belaj, F.; Kroutil, W. Angew. Chem. Int. Ed. 2012, DOI: 10.1002/anie.201202375.

R R´

O

R R´

NH2

w-Transaminase

(R) and (S)ee >99%

50 mM

*

org. solvent or buffer30°C, 24 h

amine donore.g. 2-propylamineor alanine

coproduct

CP-1

14

Aldolasas hipertermófilas para la síntesis de análogos deCarbohidratos

I. Oroz-Guinea, I. Ayuso, E. García-Juncedaeduardo.junceda@csic.es

Departamento de Química Bio-Orgánica, Instituto de Química Orgánica General, CSIC. Madrid, 28006 Spain.

Las aldolasas dependientes de dihidroxiacetonafosfato (DHAP) dan lugar a cetosas-1-fosfato por reacción aldólica de la DHAP con un aldehído en la que se generan dos nuevos estereocentros. Por ello, han sido ampliamente utilizadas en la síntesis de carbohidratos, miméticos de carbohidratos y otros compuestos [1].

El principal inconveniente que presenta el uso de estas enzimas es la disponibilidad de DHAP ya que es un sustrato caro desde el punto de vista comercial y es lábil a pHs neutros y básicos, que es el rango óptimo para las aldolasas. En este sentido, nuestro grupo de trabajo ha desarrollado un sistema multienzimático que permite la formación one-pot de enlaces C-C a partir de dihidroxiacetona (DHA) [2]. Este sistema está basado en la ruta natural de oxidación del glicerol en la bacteria Citrobacter freundii donde la fosforilación de la DHA se lleva a cabo mediante una dihidroxiacetona quinasa (DHAK) dependiente de ATP. Así, este sistema integra tres elementos en un único paso de reacción: (1) la fosforilación de la DHA catalizada por la DHAK de C. freundii; (2) la reacción aldólica catalizada por la aldolasa y (3) la regeneración de ATP catalizada por la acetato quinasa (AK) de E. coli usando acetilfosfato como donador de fosfato.

La extensión de esta estrategia a las otras aldolasas dependientes de DHAP es necesaria para permitir al acceso a una amplia diversidad estructural en los compuestos que se pretenden obtener. En este sentido, hemos clonado heterólogamente el gen TM1072 de Thermotoga maritima que codifica para una rhamnulosa-1-fosfato aldolasa. Al ser T. maritima una eubacteria hipertermófila cuya temperatura óptima de crecimiento es de 80 ºC, lo cual confiere un interés especial a esta aldolasa ya que las enzimas termófilas ofrecen unas fascinantes posibilidades no sólo desde el punto de vista de la biocatálisis sino también para estudiar la relación estructura-actividad en la catálisis enzimática.

Agradecimientos: Este trabajo ha sido financiado por la Comunidad de Madrid (Grant S2009/PPQ-1752). I. Oroz-Guinea ha sido financiada mediante una beca-contrato del programa JAEPredoc del CSIC.

Bibliografía

1. Iturrate, L.; García-Junceda, E. Multi-Step Enzyme Catalysis: Biotransformations and Chemoenzymatic Synthesis. García-Junceda, E. (ed.) 2008, 61-81, Wiley-VCH Verlag GMBH & Co. KGaA, Weinheim, Germany.2. Sánchez-Moreno, I.; García-García, J. F.; Bastida, A.; García-Junceda, E. Chem. Commun. 2004, 1634-1635.3. Shimazu, M.; Mulchandani, A.; Chen, W. Biotechnol. 2001, 17, 76-80.

CP-2

15

A journey of an organic chemist through biocatalysis: the wonderland

of enzymatic redox reactions

Francesco Molinari

Department of Food, Environmental and Nutritional Sciences (DeFENS), University of Milan, via Celoria 2, Milan 20133, Italy

Focus of our research is the development of synthetically useful selective biotransformations utilizing new microbial enzymes by combining natural and non-natural conditions. The presentation will deal with the use of redox enzymes for (stereo) selective biotransformations useful in organic chemistry.Different applications from our work will be presented:

- chemo-, regio- and steresoselective oxidation of alcohols and diols for the preparation of aldehydes, carboxylic acids, ketones, lactones and oximes

- new recombinant enolate reductases from non-conventional yeasts- reduction of prostereogenic carbonyls for the preparation of optically pure chiral building

blocks using new dehydrogenases from non-conventional yeasts In most of the cases, high stereoselectivity was obtained with stereopreference complementary to the one obtained with conventional chemical methods. Preparative biotransformations will be also discussed.

CP-3

16

Uso de enzimas hidrolíticas como versátiles herramientas en química orgánica. Aplicaciones en la síntesis de fármacos quirales

Vicente Gotor-Fernándezvicgotfer@uniovi.es

Departamento de Química Orgánica e Inorgánica, Instituto Universitario de Biotecnología de Asturias, Universidad de Oviedo, Oviedo (33006), España

Es indudable que la química tiene muchos detractores, pero por mucho que se la intente menospreciar, podemos afirmar sin ninguna duda, que la vida moderna y cualquiera de los aspectos que la caracterizan, sería imposible sin los conocimientos que proporciona la química como ciencia. Así, la aplicación industrial de sus procesos para la preparación de productos básicos, proporciona una mayor calidad de vida al ser humano, acorde con las necesidades de cada época. A lo largo de los años y debido al incremento del número de procesos químicos diseñados, se han elaborado una serie de directrices que dirigen hacia el desarrollo de una Química Sostenible, con el fin de evitar en la medida de lo posible, la generación de contaminación y residuos, mediante el empleo de alternativas más ecológicas. La Biocatálisis cumple a la perfección con estos requisitos y sin duda alguna, hoy en día es una metodología reconocida tanto a nivel académico como industrial.

En esta presentación se hará un repaso al empleo de oxidorreductasas y, principalmente, de hidrolasas en la preparación de muy distintos compuestos como fármacos [1], heterociclos [2] o líquidos iónicos, todos ellos sintetizados a través de rutas asimétricas, que han conducido a la obtención de estos compuestos de alto valor añadido en forma enantiopura y con buenos rendimientos. Además se examinarán las posibilidades que presentan las hidrolasas para el desarrollo de procesos no convencionales como puedan ser la formación de enlaces carbono-arbono o carbono-heteroátomo a través de procesos de promiscuidad catalítica [3], área de especial atención en Biocatálisis durante la última década.

Bibliografía

1. Gotor-Fernández, V.; Brieva, R.; Gotor, V. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2006, 40, 111-120.2. Busto, E.; Gotor-Fernández, V.; Gotor, V. Chem. Rev. 2011, 111, 3998-4035.3. Busto, E.; Gotor-Fernández, V.; Gotor, V. Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 4504-4523.

CP-4

17

Conferencias Invitadas

18

Código Conferencista Título del resumen Página

CI-1

SANDOVAL FABIÁN,Georgina

Coreal

Fuentes y aplicaciones de lipasas y esterasas (Sources

and applications of lipases and esterases)

Georgina Sandoval

19

CI-2

KURINA SANZ, Marcela

Vegetales en Biocatálisis

Marcela Kurina-Sanz

20

CI-3

HELGUEIRA ANDRADE,

Leandro

Enzymatic reactions of boron and selenium compounds

Leandro H. Andrade

21

CI-4

CARRERA GARESE, Ignacio

Producción de cis-ciclohexadienodioles mediante cultivos microbianos de alta densidad y sus aplicaciones

sintéticas.

Agustina Vila, Gustavo Seoane,

Ignacio Carrera

22

19

Fuentes y aplicaciones de lipasas y esterasas

(Sources and applications of lipases and esterases)

Georgina Sandovalgsandoval@ciatej.net.mx / georgina@confluencia.net

Unidad de Biotecnología Industrial, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), Guadalajara, Jalisco (44270), México.

Las lipasas (E.C. 3.1.1.3) se encuentran entre las enzimas más utilizadas en síntesis orgánica debido a su relativa estabilidad en solventes y amplia aceptación de sustratos diferentes de sus sustratos naturales (triglicéridos de cadena larga). Tienen un sinnúmero de aplicaciones en las industrias de alimentos, farmacéutica, detergentes, polímeros y cosméticos entre otras [1]. Sus fuentes más comunes son los microorganismos, principalmente hongos y levaduras; aunque recientemente se está volviendo a prestar atención a las lipasas de plantas y a sus posibles aplicaciones [2].

Por otro lado, algunas esterasas del grupo de las carboxil éster hidrolasas (E.C. 3.1.1.), como las feruloil esterasas (E.C. 3.1.1.73), están siendo cada vez más estudiadas, tanto por sus aplicaciones industriales, como por sus relaciones evolutivas con las lipasas [3].

En esta plática se presentarán algunos resultados de nuestro grupo de investigación, relacionados con la búsqueda, caracterización y mejoramiento lipasas y esterasas; así como algunas de sus aplicaciones, principalmente en los campos de nutracéuticos, biocombustibles y polímeros.

Lipases (E.C. 3.1.1.3) are among the most useful enzymes in organic synthesis because of its relative stability in solvents and its broad acceptance of non-natural substrates. They have countless applications in the food industry, pharmaceuticals, detergents, polymers, cosmetics, etc. [1]. Their most common sources are microorganisms, mainly fungi and yeasts. However, there is a growing interest in plant lipases and their potential applications [2].

Furthermore, some esterases from the carboxyl ester hydrolases group (E.C. 3.1.1.), such as feruloyl esterases (EC 3.1.1.73), are being increasingly studied, due to both, their industrial applications and to their evolutionary relationships with lipases [3].

In this talk we present some results of our research group, related to the screening, characterization and improvement of lipases and esterases, and some of their applications, mainly in the fields of nutraceuticals, biofuels and polymers.

Bibliografía (References)

1. Casas-Godoy, L.; Duquesne, S.; Bordes, F.; Sandoval, G. Meth. Mol. Biol. 2012, 861, 3-30.2. Rivera, I.; Mateos-Díaz, J. C.; Sandoval, G. Meth. Mol. Biol. 2012, 861, 115-122.3.Panda, T.; Gowrishankar, B. S. Appl. Mirobiol. Biotechnol. 2005, 67, 160-169.

CI-1

20

Vegetales en Biocatálisis

Marcela Kurina-Sanzmarcelakurina@gmail.com

INTEQUI-CONICET, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis. CP 5700. San Luis, Argentina.

Las plantas son una irremplazable fuente de moléculas de bajo peso molecular y alta complejidad estructural. Son ejemplo de esta amplia variedad de compuestos los terpenos y esteroles, los alcaloides, los fenilpropanoides, los policétidos y los diferentes derivados glicosilados. La originalidad de muchas reacciones involucradas en las rutas de biosíntesis de los grupos de metabolitos secundarios mencionados no ha sido aún suficientemente explotada a pesar de ofrecer alternativas únicas o difícilmente encontradas en otros organismos. Esto hace que las enzimas vegetales sean una interesante alternativa a la hora de completar el “tool kit” de biocatalizadores ofrecidos por los microorganismos.

Entre las reacciones más preciadas que pueden catalizar los sistemas vegetales están las oxifuncionalizaciones estereoespecíficas, las glicosidaciones de oxihidrilos secundarios, primarios y fenólicos, las alquilaciones regioselectivas y las reducciones estereoselectivas de carbonilos proquirales y enlaces C=C y la formación de enlace C-C.

A pesar de las teóricas ventajas metodológicas que presenta el uso de enzimas aisladas o parcialmente purificadas y de los sistemas de reciclado de cofactores, estas herramientas se encuentran todavía en incipiente desarrollo para sistemas de origen vegetal. Consecuentemente, el uso de células enteras sigue cobrando gran importancia y pueden explotarse eficientemente como biocatalizadores materiales proveniente de plantas silvestres o cultivadas, órganos específicos desarrollados in vitro o células indiferenciadas incluso inmovilizadas. También los genes que codifican para las enzimas vegetales de interés pueden ser identificados, clonados y expresados en forma heteróloga en microorganismos para facilitar procesos a mayor escala, pudiéndose aumentar la eficiencia de biotransformación utilizando técnicas como mutagénesis dirigida.

Adicionalmente los sistemas vegetales in-vitro son una valiosa herramienta para estudiar la metabolización de xenobióticos y elucidar rutas biosintéticas.

CI-2

21

Enzymatic reactions of boron and selenium compounds

Leandro H. Andradeleandroh@iq.usp.br

Instituto de Química, Universidade de São Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes 748, 05508-900,São Paulo, Brazil.

As enzimas são excelentes catalisadores de inúmeras reações químicas que podem produzir diversos compostos orgânicos com grande potencial sintético. Apesar desse potencial, as reações enzimáticas mais estudadas usam como matéria prima compostos químicos constituídos principalmente de C, H, O, N, S e halogênios. Por outro lado, compostos orgânicos contendo hetero-átomos são comumente empregados em síntese orgânica na sua forma aquiral e quiral.Pode-se destacar os compostos de boro, conhecidos pela sua ampla aplicação na formação de novas ligações carbono-carbono. No caso de compostos de selênio, a sua principal aplicação destaca-se como catalisador de reações enantiosseletivas bem como seu crescente uso em sistemas biológicos. Inspirados pelas importantes características de reações enzimáticas decidimos nos dedicar à investigação da reatividade de compostos orgânicos de selênio e boro com diferentes sistemas

1-3enzimáticos visando a preparação de derivados opticamente ativos. Nesta palestra serão apresentadas nossas contribuições referentes ao uso de enzimas (álcool desidrogenases, lipases, transaminases, mono-oxigenases) como catalisadores de reações orgânicas, bem como o uso de

compostos de selêniocomo inibidores de proteases (cisteíno proteases e proteassoma).

References

1. Andrade, L. H.; Barcellos, T. Org. Lett. 2009, 14, 3052-3055.2. Piovan, L.; Alves, M. F. M.; Juliano, L.; Bromme, D.; Cunha, R. L. O. R.; Andrade, L. H. Bioorg. Med. Chem. 2011, 19, 2009-2014.3. Brondani, P. B.; de Gonzalo, G.; Fraaije, M. W.; Andrade, L. H. Adv. Synth. Catal. 2011, 353, 2169-2173.

CI-3

22

Producción de cis-ciclohexadienodioles mediante cultivos microbianos de alta densidad y sus aplicaciones sintéticas.

1 1,2 1,2Agustina Vila, Gustavo Seoane , Ignacio Carrera icarrera@fq.edu.uy

1Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones, Departamento de Química Orgánica, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo 11800 Uruguay.

2Laboratorio de Síntesis Orgánica, Departamento de Química Orgánica, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo 11800, Uruguay.

La dioxigenación de arenos monosustituidos mediante el uso de dioxigenasas bacterianas produce cis-ciclohexadienodioles homoquirales que han sido extensamente utilizados como materiales de partida para síntesis enantioselectivas de productos bioactivos de alta complejidad estructural [1].

La optimización del proceso de biotransformación para la obtención eficiente de estos materiales de partida es de suma importancia para explotar su potencial sintético. Para dicho fin, la utilización de microrganismos recombinantes tiene ventajas de sobre-expresión de la dioxigenasa objetivo lo que puede resultar en rendimientos mayores de biotransformación [2].

En este trabajo desarrollamos el diseño y optimización del uso de cultivos de alta densidad celular de la cepa Escherichia coli JM109 (pDTG601A) recombinante que expresa el complejo enzimático Tolueno-Dioxigenasa (TDO), para la producción de cis-ciclohexadienodioles en un bioreactor de 5L. Los rendimientos de biotransformación obtenidos con este protocolo han sido sensiblemente mayores que los generados por la cepa mutante Pseudomonas putida F39/D utilizado durante más de veinte años en nuestro laboratorio.

A su vez, se presentarán algunas de las aplicaciones sintéticas de estos sintones desarrolladas por nuestro grupo para la obtención de compuestos polifuncionales de alta complejidad estructural e interesante perfil de actividades biológicas.

Figura 1. Producción de cis-ciclohexadienodioles de alto potencial sintético mediante cultivos de alta densidad celular de E.coli JM109 (pDTG601A) .

Bibliografía

1. Reed, J. W.; Hudlicky, T. Synlett. 2009, N° 5, 0685-0703.2. Hudlicky, T.; Gonzalez, D.; Gibson, D. T. Aldrichimica Acta 1999, 32, 35-60.

CI-4

23

Comunicaciones Orales

25

Comunicaciones Orales

Area Diseño de Biocatalizadores

26

Código Autor que

expone Título y autores

Página

CO-DB1 CARDILLO,

Alejandra

Biocatálisis como estrategia para la producción de compuestos de interés farmacéutico:

Alcaloides del tropano

Alejandra B. Cardillo, Sabrina B. Cardillo, Julián Rodriguez Talou y Ana M.Giulietti

27

CO-DB2 JOSE, Carla

Biocatalizadores basados en Lipasa B de Candida antarctica aplicadas a la esterificación

de ibuprofeno Carla José, M. Victoria Toledo, Laura E. Briand, M.

Luján Ferreira

28

CO-DB3 PERALTA

ALTIER, Gabriela

Diseño de un biocatalizador insoluble para la producción enzimática de ciclodextrinas Gabriela Peralta Altier, Carmen Manta y Karen

Ovsejevi

29

CO-DB4 TORRES, Pedro

Estabilización de ß-galactosidasa y glucosa isomerasa mediante estrategias post-

inmovilización Pedro Torres, Francisco Batista-Viera

30

CO-DB5 COSTA, Hernán

Diseño racional de biocatalizadores derivados de una Ciclodextrina Glucosiltransferasa

Hernán Costa, Aurelio Hidalgo, José Berenguer y Susana Alicia Ferrarotti

31

CO-DB6 JUAREZ, Mercedes

α-L-ramnosidasa extracelular termófila de Aspergillus fumigatus: Optimización del medio

de cultivo M. Mercedes Juárez, M. Rita Martearena, Gustavo

Céliz, Alicia Cid, Elsa Scaroni, y Mirta Daz.

32

CO-DB7 CASTAÑEDA,

María T.

Efecto de la Fuente de Nitrógeno en la Producción de L-Fenilalanina amonio liasa

(PAL) empleando Rhodosporidium toruloides María T. Castañeda, Hernán Villagarcía, Roque A.

Hours, Carlos F. Mignone

33

CO-DB8 MENDEZ, Florencia

Obtención de biocatalizadores insolubles de Polifenol Oxidasa de Solanum tuberosum

mediante interacciones mixtas con intercambiadores iónicos

Florencia Méndez, Karen Ovsejevi y Carmen Manta

34

CO-DB9 PANIZZA, Paola

Mutación sitio dirigida de Lip I.3: entendiendo las causas de la activación interfacial

Paola Panizza , Silvia Cesarini, Pilar Díaz, Sonia Rodríguez

35

CO-DB10 WILSON, Lorena

Efecto de las condiciones de inactivación y refolding en la recuperación de la actividad de

catalizadores enzimáticos parcialmente inactivados

Lorena Wilson, Oscar Romero, Valeria Miranda, Rosa Arrieta, y Andrés Illanes

36

27

Biocatálisis como estrategia para la producción de compuestos de interés farmacéutico: Alcaloides del tropano

1 2 1 1Alejandra B. Cardillo , Sabrina B. Cardillo , Julián Rodriguez Talou y Ana M.Giuliettiacardillo@ffyb.uba.ar

1Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, 2Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires (1113), Argentina. Depto de Química Biológica, Facultad

de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires (1428), Argentina

La enzima Hiosciamina 6β-hidroxilasa (H6H) cataliza mediante dos reacciones secuenciales la conversión de hiosciamina en 6β-hidroxihiosciamina y escopolamina, alcaloides ampliamente utilizados en medicina debido a su actividad anticolinérgica (Figura 1). Estos alcaloides son obtenidos a partir de la extracción de plantas pertenecientes a la familia Solanaceae, dado que la síntesis química de los mismos es dificultosa y costosa. Por ésta razón, resulta de interés el desarrollo de un proceso de biotransformación para la producción de los mismos con fines farmacéuticos. En éste trabajo se exploró la posibilidad de producir 6β-hidroxihiosciamina y escopolamina mediante una estrategia alternativa utilizando a la enzima H6H como biocatalizador. Para lograrlo, el gen h6h fue amplificado a partir de preparaciones de ARNt obtenidas desde anteras inmaduras de Brugmansia candida, una planta nativa de Sudamérica y productora de alcaloides del tropano. El h6hADNc fue clonado en diferentes vectores para producir enzimas etiquetadas y no etiquetadas en Saccharomyces cerevisiae. La H6H fue expresada como fusión en su extremo C-terminal al epitope V5 y una cola de histidinas (H6H-V5-6His). Por otro lado, fue fusionada en su extremo N-terminal al dominio de unión a celulosa (CBD-H6H) con el objeto de combinar los pasos de purificación e inmovilización a celulosa, una matriz de bajo costo. Para explorar las distintas estrategias propuestas, se ensayó la actividad de la enzima a partir de extractos crudos de las cepas de levaduras inducidas. Los ensayos se llevaron a cabo a 30°C por 15h. El análisis de los alcaloides se realizó por HPLC con detección UV, fase móvil Ácido octanosulfónico 0,01M pH3/Metanol (65:35) y velocidad de flujo 1 ml/min. Los resultados mostraron que la enzima H6H etiquetada y no etiquetada fueron capaces de transformar hiosciamina, demostrando la expresión funcional del h6hcDNA en levaduras. Sin embargo, los productos obtenidos fueron diferentes de acuerdo a la enzima utilizada. La H6H y la CBD-H6H convirtieron hiosciamina en 6β-hidroxihiosciamina y escopolamina, mientras que la H6H-V5-6His solo produjo 6β-hidroxihiosciamina. Los resultados obtenidos proveerán de herramientas para abordar el desarrollo de procesos biocatalíticos de producción de escopolamina y 6β-hidroxihiosciamina, alcaloides de mayor valor económico, mediante la aplicación de enzimas inmovilizadas.

Figura 1. Reacción catalizada por la H6H y cofactores implicados en la reacción.

CO-DB1

28

Biocatalizadores basados en Lipasa B de Candida antarctica aplicadas a la esterificación de ibuprofeno

1 1 1 2Carla José , M. Victoria Toledo , Laura E. Briand , M. Luján Ferreiracarlajose@quimica.unlp.edu.ar

1Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias Aplicadas, Dr. Jorge J. Ronco (CINDECA), Universidad Nacional de La Plata (UNLP), CONICET CCT La Plata, calle 47 Nº 257, La Plata 1900

Buenos Aires, Argentina2PLAPIQUI-UNS-CONICET Camino La Carrindanga, Km 7, CC 717, 8000 Bahía Blanca, Argentina.

La resolución racémica enzimática de fármacos es un campo científico tecnológico de gran interés, no sólo por la enantio-selectividad inherente a las enzimas, en particular las lipasas, sino también porque los procesos biocatalizados se realizan en condiciones suaves de operación, se evita la formación de productos secundarios, y se generan menos residuos. En este contexto, las enzimas inmovilizadas se recuperan del medio de reacción y pueden reutilizarse. En este trabajo se presentan biocatalizadores basados en la lipasa B de Candida antarctica (CALB) inmovilizada sobre distintos soportes (orgánicos e inorgánicos) aplicados a la resolución racémica de ibuprofeno como catalizadores alternativos al ampliamente conocido Novozym® 435.

Se sintetizaron diversos catalizadores: CALB/Quitosano (Q), CALB/ Glutaraldehído/ Quitosano (G/Q), CALB/Polipropileno (PPL) y CALB-óxidos inorgánicos (TiO , SiO , ZrO , 2 2 2

Nb O ) los cuales fueron aplicados a la esterificación de R/S-ibuprofeno en un medio sin co-2 5

solventes, donde los alcoholes esterificantes (etanol, 1-propanol o 2-propanol) actuaron como sustrato y solvente simultáneamente. En la figura se muestran los resultados obtenidos al emplear etanol. Dichos resultados surgen de utilizar los diferentes catalizadores en las condiciones previamente halladas como óptimas para Novozym®435 [1]. Por lo tanto, si bien faltan optimizar variables de modo de aumentar la enantioselectividad, puede observarse un comportamiento muy prometedor de estos nuevos biocatalizadores, principalmente de CALB/polipropileno, CALB/SiO y CALB//Nb O .2 2 5

Figura 1: Conversión (X%) y exceso enantiomérico hacia el enantiomero S (eeS%). Reacción:

0,5 g R/S-ibuprofeno, 1 mL etanol absoluto, 4.78%V/V agua, 200 rpm, 45ºC, 160 mg

catalizador, 48hs/72hs.

Bibliografía

1. Foresti, M. L.; Galle, M.; Ferreira, M. L.; Briand, L. E. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2009, 84, 1461-1473.

CO-DB2

29

Diseño de un biocatalizador insoluble para la producción enzimática de ciclodextrinas

Gabriela Peralta Altier, Carmen Manta y Karen Ovsejevigperalta@fq.edu.uy

Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

En los últimos años las enzimas se han convertido en una herramienta fundamental en el desarrollo de nuevas estrategias de síntesis orgánica. Adicionalmente, existen productos con alto valor agregado que sólo pueden obtenerse por síntesis enzimática. Tal es el caso de las ciclodextrinas (CD), azúcares cíclicos de amplia aplicación en la industria alimentaria y farmacéutica, las cuales son producidas a partir de almidón por acción de la enzima ciclodextringlicosil transferasa (CGTasa, EC 2.4.1.19).

En este trabajo se propone el diseño de un biocatalizador insoluble en base a CGTasa de Bacillus Thermoanaerobacter (Toruzyme® 3.0L) para la producción de CD. Dicha enzima se seleccionó por ser termoestable, aceptada como GRAS (Generally Recognize As Safe) y de estructura ampliamente estudiada. Esto último resulta muy importante para seleccionar la estrategia de inmovilización a utilizar. Esta CGTasa produce a tiempos cortos de catálisis tres tipos de CD: alfa, beta y gama, mientras que a tiempos largos se obtiene predominantemente beta-ciclodextrina. Esta última también es GRAS y aprobada por la FDA y la OMS como aditivo alimentario.

El método de inmovilización elegido es el covalente reversible, por formación de enlaces disulfuro entre los grupos SH de la enzima y grupos tiol-reactivos del soporte. Esta unión permite no sólo el reuso de la enzima y el diseño de procesos continuos, sino también la recuperación del soporte (por reducción del puente disulfuro formado) una vez que el biocatalizador inmovilizado pierde su actividad. Esto resulta relevante, ya que en muchos casos el costo del soporte suele ser un impedimento al momento de escalar el proceso de inmovilización. Dado que esta enzima en su forma nativa carece de grupos tiol expuestos pero posee un alto contenido de lisinas, se procedió a la introducción de grupos tiol “de novo”, por tiolación de grupos amino de la enzima con N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), resultando un grupo SH por cada amino modificado. La enzima tiolada fue inmovilizada en soportes tiol-reactivos de distinta naturaleza: polisacáridos (TSI-agarosa) y resinas acrílicas (TSI-Toyopearl®).

Se optimizaron el pH, la fuerza iónica, la carga proteica y la temperatura, para determinar las condiciones óptimas de inmovilización en las diferentes matrices activadas. Para ambos soportes se obtuvieron altos rendimientos de inmovilización (cercanos al 70%) en condiciones moderadas de pH 6.8-7.0 a 22ºC. La reversibilidad de la unión enzima-soporte se verificó por elución de la CGTasa inmovilizada por tratamiento con ditiotreitol 100mM, por 30 minutos.

Se estudió la viabilidad de emplear estos derivados insolubles en la síntesis de ciclodextrinas, monitoreándose los productos obtenidos por métodos colorimétricos y por High-Performance Liquid Chromatography (HPLC).

CO-DB3

30

Estabilización de ß-galactosidasa y glucosa isomerasa mediante estrategias post-inmovilización

Pedro Torres, Francisco Batista-Vieraptorres@fq.edu.uy

Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo (11800), Uruguay.

La -galactosidasa de Bacillus circulans es una enzima de interés por su empleo en la hidrólisis de lactosa y en la producción de oligosacáridos [1], en tanto que la glucosa isomerasa de Streptomyces rubiginosus ha sido empleada desde hace décadas en diversos procesos biotecnológicos [2]. En el presente trabajo dichas enzimas se inmovilizaron en Eupergit C y Eupergit C 250 L y se exploraron las posibilidades de estabilización térmica de estos biocatalizadores mediante dos estrategias post-inmovilización: i- bloqueo de los grupos oxirano remanentes con glicina 3 M; ii- tratamiento alcalino durante 7 o 28 horas a pH 8.5 (para favorecer la unión multipuntual enzima-soporte) y posterior bloqueo con glicina. Se determinó la eficiencia catalítica y la estabilidad térmica de los derivados sometidos a ambos tratamientos. En todos los casos la termoestabilidad de los derivados de -galactosidasa fue superior a la de los derivados obtenidos en un trabajo previo mediante estas estrategias cuando se emplean Sepabeads EP y Sepabeads HFA como soportes [3].

Los derivados en Eupergit C 250 L sometidos al proceso de bloqueo [estrategia i] retuvieron 100% (-galactosidasa) y 98% (glucosa isomerasa) de su actividad inmovilizada. Sus vidas medias a 50ºC fueron de 195 y 245 h, respectivamente, claramente superiores a las correspondientes a las enzimas nativas (vidas medias de 12 y 23 h) y sus derivados no bloqueados. Los derivados más termoestables fueron aquellos sometidos a tratamiento alcalino durante 24 horas antes del bloqueo [estrategia ii] con vidas medias de 395 y 491 h a 50ºC para -galactosidasa y glucosa isomerasa, respectivamente. Si bien la eficiencia catalítica se reduce en estos casos, las actividades inmovilizadas son superiores a las de los derivados insolubles en Eupergit C, probablemente debido a la mayor intensidad de unión multipuntual en el caso de este soporte más activado. En tanto que la -galactosidasa de B. circulans es monomérica, la glucosa isomerasa de S. rubiginosus posee cuatro subunidades idénticas, lo cual podría ser la base de las diferencias en estabilidad que se obtienen al utilizar esta estrategia combinada.

Ambos biocatalizadores son la base de un proceso de biotransformación de la lactosa del suero de quesería en un jarabe enriquecido en fructosa, con propiedades edulcorantes. La estabilización lograda permitió realizar esta bioconversión a temperaturas de hasta 60ºC, con el consiguiente aumento en el cociente fructosa/glucosa alcanzado (52%).

Bibliografía

1. Panesar, P. S.; Kumari, S.; Panesar, R. Enz. Res. 2010, 2010, 2-16.rd2. Saha, B. C.; Jordan, D. B.; Bothast, R. J. Encyclopedia of Microbiology 2009, 3 edition, 281-

294.3. Torres, P.; Batista-Viera, F. J. Molec. Catal. B: Enzym. 2011, 74, 230-235.

CO-DB4

31

Diseño racional de biocatalizadores derivados de una Ciclodextrina Glucosiltransferasa

1 2 2 1Hernán Costa , Aurelio Hidalgo , José Berenguer y Susana Alicia Ferrarottihcosta_1999@yahoo.com

1Laboratorio de Química Biológica, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Luján, Luján (6700), Argentina.

2 Laboratorio de biotecnología y genética de bacterias termófilas extremas, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid (28049), España.

La Ciclodextrina Glucosiltransferasa (CGTasa) es una enzima extracelular producida por bacterias, principalmente del género Bacillus perteneciente a la Familia 13 de las glucósidohidrolasas. Su actividad más relevante es la transformación del almidón en ciclodextrinas (CD), las más frecuentes formadas por 6, 7 u 8 unidades de glucosa denominadas -, - o γ-CD, respectivamente. Estos compuestos cíclicos tienen capacidad de formar compuestos de inclusión con moléculas hidrofóbicas modificando sus propiedades fisicoquímicas por lo cual son muy usadas en diversas áreas: industrias de alimentos, química y farmacéutica; agricultura y medio ambiente. Las CGTasas, mediante la biotransformación del almidón, producen mezclas de CD en proporciones variables que son difíciles de separar, razón por la cual muchos investigadores están interesados en desarrollar un biocatalizador que conduzca a la formación de un único tipo de CD.

La CGTasa de B. circulans DF 9R, aislada en nuestro laboratorio, es una α/β-CGTasa. En base a la secuencia nucleotídica del gen que la codifica, se determinó la secuencia aminoacídica de la enzima. En este trabajo se realizó un alineamiento múltiple de secuencias de todas las CGTasas y se identificaron todas las posiciones que muestran residuos propios de las CGTasas que producen principalmente γ-CD y aquellos que resultaron ser exclusivos de la enzima en estudio. Estas posiciones se localizaron en el modelo molecular de la CGTasa de B. circulans DF 9R y se examinaron todo tipo de interacciones con sitios de unión al sustrato y con el sitio catalítico. Esto permitió seleccionar cinco posiciones que fueron sometidas a mutación sitio dirigida simple o combinada. Por expresión heteróloga en E. coli BL21, se obtuvieron nuevos biocatalizadores, se purificaron y se determinó el perfil de CD producido por cada uno.

Los resultados obtenidos indican que mutantes en posición 137 se asocian a una disminución en la cantidad de CD obtenidas, con cambio en la especificidad de producto en aquellas mutantes puntuales que involucran la combinación con otras posiciones. Además, la naturaleza fisicoquímica del residuo en posición 179 condiciona la especificidad de producto. Las mutantes simples en posiciones 144, 280 y 329 no producen cambios en la cantidad ni en la relación de CD, sin embargo, biocatalizadores que porten estas posiciones mutadas de manera combinada entre sí o con la posición 137 producen cambios cuantitativos y cualitativos en el perfil de CDs obtenidas.

Este trabajo contribuye al conocimiento entre la relación estructura y función respecto de la especificidad de producto de este importante grupo de enzimas de interés industrial.

CO-DB5

32

α-L-ramnosidasa extracelular termófila de Aspergillus fumigatus:

Optimización del medio de cultivo

M. Mercedes Juárez, M. Rita Martearena, Gustavo Céliz, Alicia Cid, Elsa Scaroni y Mirta Daz.merjuarez@unsa.edu.ar

Laboratorio de Biocatálisis, INIQUI (UNSa-CONICET), Salta (4400), Argentina.

Las enzimas α-L-ramnosidasas escinden unidades de ramnosa terminales de un gran número de productos naturales y poseen interés biotecnológico debido a sus aplicaciones en procesos tales como la remoción del amargor de jugos cítricos, la producción de ramnosa o el realce de aromas en vinos [1].

En este trabajo se empleó una cepa autóctona de Aspergillus fumigatus aislada de suelo de márgenes de la fuente de aguas termales: Arroyo Aguas Calientes (Caimancito; Jujuy) que resultó ser productora de α-ramnosidasa, siendo éste el primer reporte de producción de la enzima por este moho. En un trabajo previo se determinó que la α-ramnosidasa de Aspergillus fumigatus es extracelular, posee máxima actividad a 70 C y presenta una baja inhibición por producto en comparación con otras enzimas comerciales [2], características que hacen atractiva la producción y posterior purificación de esta enzima.

El objetivo del trabajo fue maximizar la producción de la enzima α-ramnosidasa y disminuir la de -glucosidasa ya que la separación de las mismas implica importantes pérdidas de la actividad de interés. La -glucosidasa es indeseable en el proceso de obtención de ramnosa a partir de sustratos naturales tales como naringina, ya que produce la liberación simultánea de glucosa durante la reacción complicando la purificación del producto deseado.

Con este fin, se optimizó la composición del medio de cultivo ensayando diferentes fuentes de carbono: naringina o combinaciones naringina-almidón y naringina-sacarosa; y dos fuentes de nitrógeno: urea y peptona. Posteriormente, habiendo determinado que la enzima α-ramnosidasa se produjo más eficientemente en medios conteniendo naringina como única fuente de carbono se

-1probaron diferentes concentraciones del inductor (2.5 a 7.5 g L ). Los resultados obtenidos respecto a la variación de la fuente de nitrógeno mostraron que la producción de enzima se favoreció con urea, obteniéndose actividades mayores para todas las concentraciones de inductor testeadas. Habiendo seleccionado ésta como fuente de nitrógeno, el aumento de la concentración de naringina prácticamente no produjo aumentos en la actividad α-ramnosidasa y sí en la -glucosidasa, obteniéndose relaciones α-ramnosidasa/-glucosidasa de 3.67, 1.86 y 2.18 con concentraciones de

-1 inductor de 2.5, 5 y 7.5 g L respectivamente. En conclusión, la composición del medio de cultivo con la que se obtuvo la mayor producción de α-ramnosidasa y la mejor relación α-ramnosidasa/-glucosidasa fue: urea como fuente de nitrógeno y la menor concentración de naringina como fuente de carbono.

Bibliografía

1. Yadav, V.; Yadav, P.; Yadav, S.; Yadav, K. Process Biochem. 2010, 45(8), 1226-1235.2. Juárez, M. M. Tesis Doctoral, 2012.

CO-DB6

33

Efecto de la Fuente de Nitrógeno en la Producción de L-

Fenilalanina amonio liasa (PAL) empleando Rhodosporidium

toruloides

María T. Castañeda, Hernán Villagarcía, Roque A. Hours, Carlos F. Mignonecastaneda@biotec.org.ar

Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI; UNLP, CONICET La Plata). Fac. de Cs. Exactas, UNLP. 47 y 115, (B1900ASH) La Plata, Argentina.

La enzima L-fenilalanina amonio liasa (PAL, EC 4.3.1.5) cataliza la biotransformación de L-fenilalanina en ácido trans-cinámico y amoniaco. Presenta diferentes usos potenciales, i.e. elaboración de alimentos para pacientes con fenilcetonuria. La presencia de PAL en plantas y levaduras ha sido previamente reportada. En estas últimas, Rhodosporidium toruloides (IFO 0559), ha sido ampliamente estudiada por su capacidad de producción de PAL en sistema batch, empleando fenilalanina como inductor [1]. Si bien se han ensayado diferentes medios de composición variable a fin de determinar su incidencia en la expresión de la PAL [2], existen escasos registros sobre la influencia de dichos componentes, entre ellos la fuente de nitrógeno (FN) empleada sobre el crecimiento de la cepa y la producción de la enzima.

Con la finalidad de determinar la FN más apta para optimizar la producción de PAL, se utilizaron: sulfato de amonio, glutamato de sodio, nitrato de sodio, urea y peptona ácida de caseína, a razón de 0,015 eq. de N/L de medio, en un medio basal sintético para crecimiento de levaduras. Éste fue suplementado con L-fenilalanina (0,5 g/L) y L-isoleucina (5 g/L). Los medios, cada uno

7por duplicado, se inocularon con R. toruloides a razón de 1,5 × 10 UFC/ml. La incubación se llevó a cabo en condiciones aeróbicas en shaker a 200 rpm y 30°C, en sistema batch, durante 33 h. La actividad de PAL fue medida espectrofotométricamente monitoreando la producción de ácido cinámico a 290 nm, mediante método de Yamada [2] modificado. Una unidad de PAL se define como la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 mmol de ácido trans-cinámico por minuto. La actividad específica (AE) se expresó en términos de unidades enzimáticas por mg de biomasa seca.

La levadura creció y produjo PAL con todas las FN ensayadas confirmando su versatilidad metabólica. Los máximos de AE se observaron en la mitad de la fase exponencial. La peptona de caseína fue claramente la mejor FN, alcanzando valores de AE ~ 70 mU/mg, en tanto que las max

restantes fuentes rindieron valores similares (AE ~ 42 a 48 mU/mg).max

A partir de estos resultados se puede concluir que empleando como FN un sustrato proteico parcialmente hidrolizado, como es la peptona ácida de caseína, se logra incrementar hasta en un 150% la actividad específica de PAL. Estos resultados remiten importancia a la hora de producir la enzima a gran escala por el potencial uso de residuos de origen proteico como componentes del medio de cultivo.

Bibliografía

1. Ogata, K.; Uchiyama, K.; Yamada, H. Agric. Biol. Chem. 1967, 31, 200-206.2. Yamada, S.; Nabe, K.; Izuo, N.; Nacamichi, K.; Chibata, I. Appl. Environ. Microbiol. 1981, 42, 773-778.

CO-DB7

34

Obtención de biocatalizadores insolubles de Polifenol Oxidasa de

Solanum tuberosum mediante interacciones mixtas con

intercambiadores iónicos

Florencia Méndez, Karen Ovsejevi y Carmen Mantaflomendez89@gmail.com

Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Las enzimas resultan herramientas de elección para el desarrollo de tecnologías limpias, compatibles con la preservación del medio ambiente. En los procesos mediados por enzimas se reduce el consumo de solventes orgánicos, se disminuye el consumo de energía y se dispone de una mayor selectividad en los productos de reacción. Con el fin de optimizar el uso de enzimas se han reportado gran variedad de métodos para su inmovilización en soportes sólidos. Se plantea en este trabajo la obtención de biocatalizadores inmovilizados de polifenol oxidasa (PPO) de Solanum tuberosum, mediante el uso de diferentes intercambiadores iónicos.Las polifenol oxidasas son metaloproteínas que se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, que catalizan la hidroxilación de monofenoles a difenoles (actividad cresolasa o monofenol monooxigenasa EC 1.14.18.1), y la oxidación de o-difenoles a o-quinonas (actividad catecolasa EC 1.10.3.1) [1]. En síntesis orgánica, son muy útiles debido a su potencial valor en la producción de catecoles sustituidos, asimismo, es importante el uso de óxido-reductasas para la remoción de fenoles y otros compuestos aromáticos en aguas de descarte de la industria.

En el presente trabajo se presenta un método de inmovilización rápido y muy efectivo para obtener un derivado insoluble de PPO de Solanum tuberosum. Para ello se emplearon dos intercambiadores aniónicos en distintos soportes (DEAE-Sephadex y DEAE-Toyopearl). Se lograron alcanzar rendimientos de inmovilización del 100% con ambos intercambiadores, con actividades del orden de 17500 UE/g de derivado respectivamente, siendo UE la cantidad de enzima necesaria para lograr un cambio de A de 0.001/minuto, a T amb y pH 4.6. Sin embargo, 420nm

la enzima no fue eluída del intercambiador por cambios de fuerza iónica ó de pH, indicando que el proceso no sólo estaría involucrando interacciones iónicas entre la enzima y el soporte. Para elucidar dicho comportamiento, se plantea la inmovilización en un intercambiador catiónico (CM-

Sephadex)en igual condición de pH (que las inmovilizaciones en DEAE), donde no hay atracción de cargas entre la proteína y el soporte, de forma de constatar si la unión ocurre por interacciones de otro tipo. La confirmación de que no hay inmovilización en dicha condición permite plantear la hipótesis de que el proceso de inmovilización involucra dos etapas: una primera, de aproximación al soporte por atracción de cargas opuestas, seguida de un proceso de interacción hidrofóbica. La unión al soporte se daría mediante interacciones multipuntuales de diferentes tipos (iónicas, hidrofóbicas y no específicas), donde la suma de las mismas hace a la unión enzima-soporte irreversible, ya que cuando un tipo de interacción se vuelve débil la otra se fortalece. Esto resulta beneficioso en nuestro caso ya que se obtiene un biocatalizador inmovilizado muy estable que puede ser usado en variadas condiciones de pH y fuerza iónica.

Bibliografía

1. Deirdre, M.; Murphy E.; O´Beirne D. J. Food Sci. 2006, 71(1), 51-58.

CO-DB8

35

Mutación sitio dirigida de Lip I.3: entendiendo las causas de la activación interfacial

1 2 2 1Paola Panizza , Silvia Cesarini , Pilar Díaz , Sonia Rodríguezppanizza@fq.edu.uy

1 Cátedra de Microbiología, Facultad de Química, UdelaR, Montevideo (11800), Uruguay, 2 Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, U. de Barcelona, Barcelona (08028), España

Las lipasas son biocatalizadores de amplia aplicación en biotecnología, capaces de catalizar reacciones de hidrólisis o síntesis actuando en condiciones suaves y con alta regio- y/o estereoselectividad. En trabajos previos, fue identificada y clonada en E. coli una lipasa presente en la cepa Pseudomonas sp. CR-611. Esta lipasa pertenece a la subfamilia I.3, encontrándose filogenéticamente distante de las lipasas más estudiadas en biocatálisis. La Lip I.3, purificada a partir de cuerpos de inclusión, fue caracterizada utilizando métodos espectrofotométricos y espectrofluorimétricos. Al igual que otras lipasas de la subfamilia I.3, esta enzima requiere calcio para su actividad, y tiene preferencia por sustratos de cadena media.

Lip I.3 presenta una homología del 97 % con la lipasa PML de Pseudomonas sp. MIS38[1]; sin embargo, las pequeñas diferencias de secuencia dan lugar a importantes diferencias en la actividad. Mientras que PML tiene un pH óptimo de 7.5, la Lip I.3 presenta su máxima actividad a pH 5.5, siendo la primer lipasa acidófila reportada de la subfamilia I.3. La temperatura óptima también difiere entre ambas lipasas. Además, mientras que la PML presenta activación interfacial, esto no se detectó para la Lip I.3. El estudio comparativo de las secuencias de lipasas de la subfamilia I.3 en la estructura correspondiente al lid 1 reveló que Lip I.3 presenta en esta zona mayor homología con la lipasa SML de Serratia marcescens[2], la cual no presenta activación interfacial, que con PML. Con el objetivo de comparar dichas estructuras, se realizaron mutaciones puntuales en la estructura del lid 1 de la Lip I.3(Fig. 1). La producción de Lip I.3 como cuerpos de inclusión en E. coli dificulta el análisis de los mutantes, por lo cual se realizó la expresión de la proteína silvestre y las mutantes en la cepa Pseudomonas putida KT2440 y se analizó la influencia de dichas mutaciones en la activación interfacial. En este trabajo se presentan los resultados obtenidos y se discute su relevancia para entender el proceso de activación interfacial en lipasas.

Figura 1. Diferencias en el lid 1 entre Lip I.3, PML y SML

Bibliografía

1. Amada, K.; Haruki, M.; Imanaka, T.; Morikawa, M.; Kanaya, S. Biochim. Biophys. Acta, Protein Struct. Mol. Enzymol. 2000, 1478(2), 201-210.2. Li, X.; Tetling, S.; Winkler, U. K.; Jaeger, K. E.; Benedik, M. J. Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61(7), 2674-2680.

.

CO-DB9

36

Efecto de las condiciones de inactivación y refolding en la recuperación de la actividad de catalizadores enzimáticos parcialmente inactivados

Lorena Wilson, Oscar Romero, Valeria Miranda, Rosa Arrieta, y Andrés Illanes lwilson@ucv.cl

Escuela de Ingeniería Bioquímica, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, P.O. Box 4059, Valparaíso, Chile.

Las enzimas tienen un tiempo de vida útil que puede ser mejorado con las técnicas de inmovilización, si a esto se suma una posible recuperación parcial o total del catalizador, el potencial de aplicación a gran escala se ve claramente favorecido.

En el caso de las enzimas inmovilizadas por enlace covalente, existe bastante bibliografía respecto a la recuperación del catalizador. Cuando una enzima es inactivada por el uso de solvente orgánico, como medio de reacción, bajo condiciones moderadas de temperatura y pH, los cambios conformacionales involucrados no incluyen importantes modificaciones químicas; por lo tanto, se ha planteado que la inactivación por solvente orgánico puede ser un proceso reversible parcial o total. Los primeros estudios publicados respecto a la reactivación como una estrategia para prolongar la vida útil de un catalizador se publica en el año 2007, con resultados muy favorables que hacen de la técnica una herramienta de interés para ser aplicada a procesos industriales [1].

Los estudios sobre esta estrategia se han enfocado a evaluar diferentes alternativas que pudiesen tener un impacto positivo tanto en el tiempo como en el nivel de actividad recuperada, lo cual es una variable crítica a la hora de la implementación de un proceso de reactivación a mayor escala. Se han reportados estudios respecto al efecto sobre la reactivación de diferentes tipos de inmovilización, interacción con el soporte en el caso de la penicilina G acilasa grado de inactivación, efecto de la temperatura [2] y efecto de moduladores durante del proceso de refolding de la proteína, como la presencia de sustratos específicos e inhibidores competitivos y cosolventes junto a moduladores [3]. En el caso de las lipasas se han utilizado detergentes para favorecer su reactivación.

Utilizando esta estrategia de reactivación, se han reportado muy buenos resultados de reactivación de penicilina G acilasa inmovilizada, provocando un positivo impacto sobre la productividad de la síntesis de antibióticos β-lactámicos, mostrando el potencial que esta estrategia puede significar para los procesos enzimáticos.

Bibliografía

1. Romero, O.; Vergara, J.; Fernández-Lafuente, R.; Guisán, J.M.; Illanes, A.; Wilson, L. Biotechnol Bioeng., 2009, 103(3), 472-479.2. Romero, O.; Guisán, J. M.; Illanes, A.; Wilson, L. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2012, 74(3–4), 224- 229.3. Miranda, V.; Wilson, L.; Cárdenas, C.; Illanes, A. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2011, 68, 77-82.

Agradecimientos: Proyecto FONDECYT 1100323

CO-DB10

37

Comunicaciones Orales

Area Biotransformaciones

Código Autor que expone Título y autores

Página

CO-B1 DOMÍNGUEZ DE

MARÍA , Pablo

Non-conventional biocatalysis in conventional media: Transesterifications in

bulk water catalyzed by Mycobacterium smegmatis acyl transferase (MsAcT) Lotte Wiermans, Lisa Weigand, Sebastian Hofzumahaus, Marcus Schallmey, Anett Schallmey, Pablo Domínguez de María

41

CO-B2 MASCOTTI, M.Laura

Modificación biocatalítica de esteroides: oxidación de Baeyer-Villiger selectiva sobre

el anillo D María Laura Mascotti, Fabricio R. Bisogno, Walter Lapadula, Maximiliano Juri-Ayub y

Marcela Kurina-Sanz

42

CO-B3 JOSÉ, Carla

Efecto de la naturaleza del alcohol en la resolución enantiomérica de r/s-ibuprofeno

y la estabilidad de NovozymÒ435 Carla José, Victoria Toledo, Laura E. Briand

43

CO-B4 CANTO DUARTE,

Juliana

Fermentação de polióis para produção de ácidos orgânicos por Propionibacterium

acidipropionici Juliana Canto Duarte, Inês Lunardi, José Augusto R. Rodrigues, Paulo José S. Moran, Gustavo Paim

Valença

44

CO-B5 SANDOVAL,

Georgina

Síntesis enzimática de ésteres del ácido ferúlico

Georgina Sandoval, Paula Quintana, Alicia Baldessari y Francisco Plou

45

CO-B6 DANTAS, Joao H.

Biotranformação de óleo de canola utilizando lípase de Thermomyces

lanuginosus e Burkholderia cepacia João Henrique Dantas, Leandro Daniel De Paris, Carlos Eduardo Barão, Cleide Mara Faria Soares, Flávio Faria de Moraes, Pedro A. Arroyo, Gisella

Maria Zanin

46

CO-B7 SALEM, Romina

Bio-reducción de Achalensolido con Rhizopus sp.

Romina Salem, Patricia Varela,Daniela Bustos, Adriana Pacciaroni, Virginia Sosa, Daniel Bustos

47

CO-B8 SANCHEZ, Esteban

Producción de bio-hidrógeno a partir de glicerol empleando catalizadores

inorgánicos y biológicos Esteban Sanchez, Alejandro Beccaria y Raúl

Comelli

48

38

39

CO-B9 MAGALLANES-

NOGUERA, Cynthia

Bio-reducción de 1,3 -diaril-2-propen-1-onas con cultivos in vitro de células vegetales.

Cynthia A. Magallanes-Noguera, Francisco Cecati, Carlos Ardanaz, Elizabeth Agostini, Alejandro

Orden, Marcela Kurina -Sanz

49

CO-B10 SABAINI, María B.

Preparación enzimática de derivados regioselectivamente acilados del nucleósido

antitumoral citarabina María B. Sabaini, César A. Trifone, Adolfo M.

Iribarren y Luis E. Iglesias

50

CO-B11 ROCHA, Gabriela

Biopéptidos obtenidos por hidrólisis enzimática de proteínas del lactosuero con

extractos de frutos de Salpichroa origanifolia

Gabriela Rocha, Francisco Kise, María E. Blotta, Débora Rodríguez, M. E. Díaz, Adriana Rosso y

Mónica Parisi

51

CO-B12 GARCÍA LIÑARES,

Guadalupe

Lipasas como catalizadores en la síntesis de anandamida y sus análogos

Guadalupe García Liñares, Paula G. Quintana, Santiago N. Chanquía y Alicia Baldessari

52

41

Non-conventional biocatalysis in conventional media: Transesterifications in bulk water catalyzed by Mycobacterium

smegmatis acyl transferase (MsAcT)

1 1 2 3Lotte Wiermans , Lisa Weigand , Sebastian Hofzumahaus , Marcus Schallmey Anett

2 1Schallmey , Pablo Domínguez de María

Dominguez@itmc.rwth-aachen.de

1RWTH Aachen University, Institut für Technische und Makromolekulare Chemie (ITMC), Worringer Weg 1, 52074 Aachen, Germany.

2RWTH Aachen University, Junior Professorship for Biocatalysis, Institute of Biotechnology, Worringer Weg 1, 52074 Aachen, Germany

3Forschungszentrum Jülich GmbH, Institute of Bio- and Geosciences, IBG-1: Biotechnology, 52425 Jülich, Germany

Hydrolases catalyze (trans) esterifications in water-free non-conventional media, while they perform hydrolytic reactions in aqueous solutions. Remarkably, an acyl transferase from Mycobacterium smegmatis (MsAcT) catalyzes transesterifications in aqueous systems, due to the special three-dimensional structure of the catalyst, which creates a highly hydrophobic active site [1]. This outstanding performance for a hydrolase opens novel applications and leads to “non-conventional biocatalysis in conventional media”. MsAcT was overexpressed in E. coli BL21 (DE3) and characterized in transesterifications using ethylacetate as acyl donor under different water contents (from 95 to >99%) using neopentylglycol as model substrate [1]. Subsequently, the substrate scope of MsAcT was studied, assessing both its performance with different alcohols (aliphatic and aromatic) and different acyl donors (esters, acids, etc.). In this poster the most relevant data of this study will be presented.

Acknowledgements: Financial support from DFG training group 1166 “BioNoCo” (“Biocatalysis in Non-conventional Media”) is gratefully acknowledged.

References

1. Mathews, I.; Soltis, M.; Saldajeno, M; Ganshaw, G.; Sala, R.; Weyler, W.; Cervin, M. A., Whited, G.; Bott, R. Biochemistry 2007, 46, 8969-8979.

HO OH

MsAcT, BufferOHO OO

O

O

OH

O O O

CO-B1

42

Modificación biocatalítica de esteroides: oxidación de Baeyer-Villiger selectiva sobre el anillo D

1 2 3 3María Laura Mascotti , Fabricio R. Bisogno , Walter Lapadula , Maximiliano Juri-Ayub y 1Marcela Kurina-Sanz

mlmascotti@unsl.edu.ar

1 INTEQUI-CONICET, Fac. Qqa. Bioqca. y Fcia., Universidad Nacional de San Luis (5700) 2INFIQC-CONICET, Fac. Cs. Qcas., Universidad Nacional Córdoba (5000)

3IMIBIO-CONICET, Fac. Qca. Bioqca. y Fcia., Universidad Nacional de San Luis (5700) Argentina.

La capacidad de los hongos filamentosos para transformar esteroides de la serie C19 ha sido ampliamente estudiada [1,2]. En la búsqueda de nuevas cepas con actividad BV monooxigenasa (BVMO) se abordó el estudio de la biotransformación de dehidro-epi-androsteona (DHEA), cortisona y otros esteroides empleando como biocatalizador Aspergillus parasiticus. La especie fue seleccionada por su capacidad de producir aflatoxinas, en cuya biosíntesis se postula que estarían involucradas BVMOs y, debido a que en trabajos previos hemos verificado su capacidad de oxidar estereoselectivamente el sustrato modelo biciclo [3.2.0] hept-2-en-6-ona y distintos sulfuros proquirales [3].

Los perfiles de biotransformación obtenidos bajo diferentes condiciones de trabajo se 1

analizaron mediante GC-MS y, posteriormente, los productos purificados se caracterizaron por H- 13

y C- RMN. Se evidenció que A. parasiticus es capaz de producir como producto mayoritario la lactona normal derivada de DHEA y otros metabolitos minoritarios (figura 1). Este resultado evidencia la capacidad de este microrganismo de llevar a cabo la reacción de BV. La biotransformación se llevó a cabo también a escala semipreparativa con muy buenos resultados, demostrando así la robustez del proceso.

Figura 1. Reacción de Bayer-Villiger catalizada por A. parasiticus

Posteriormente, mediante la búsqueda en bases de datos genómicas y de ESTs (Expressed Sequence Tags), se halló una secuencia con alta similitud con otras BVMOs, la cual podría ser la responsable de la actividad observada. El alineamiento de múltiples secuencias y análisis de inferencias filogenéticas apoyan esta hipótesis. Actualmente, se encuentra en progreso el clonado y la expresión de dicha BVMO para realizar su caracterización como biocatalizador.

Bibliografía

1. Hunter, C.; Khuenl-Brady, H.; Barrett, P.; Dodd, H. T.; Dedi, C. J. Steroid Biochem. 2010, 118, 171-176.2. Yildrim, K.; Uzuner, A.; Gulcuoglu, E. Y. Coll. Czech Chem.Com. 2011, 76, 743-754.3. Mascotti, M. L.; Orden, A.; Bisogno, F. R.; de Gonzalo, G.; Kurina-Sanz, M. J. Mol. Catal. B 2012, http://dx.doi.org/10.1016/j.molcatb.2012.05.003.

HO

O

HO

O O

BVMO

CO-B2

43

Efecto de la naturaleza del alcohol en la resolución enantiomérica de r/s-ibuprofeno y la estabilidad de Novozym 435

Carla José, Victoria Toledo, Laura E. Briand carlajose@quimica.unlp.edu.ar

El alto grado de estereoselectividad de muchos procesos biológicos hacen que la actividad biológica, la toxicidad, la distribución y el metabolismo de un fármaco dependan en gran medida de su estereoquímica, por lo cual estos parámetros farmacológicos y farmacocinéticos pueden ser muy diferentes para cada enantiómero de una mezcla racémica. En este sentido, nuestro grupo de trabajo estudia la resolución racémica de antiinflamatorios no esteroides (AINEs) por medio de la esterificación enantioselectiva catalizada por lipasas inmovilizadas. Previamente, se ha reportado que es posible llevar a cabo la esterificación enantioselectiva de ibuprofeno empleando el biocatalizador comercial Novozym®435 y etanol como sustrato y solvente, sin empleo de co-solvente, de forma alternativa al medio orgánico tradicionalmente empleado [1]. El hallazgo de cierta desactivación de Novozym®435 al ser reutilizado en tal sistema [2] condujo al estudio de la misma reacción empleando 1-propanol y 2-propanol en reemplazo del etanol.

En este contexto, los resultados de conversión y exceso enantiomérico hacia S(+) obtenido en 48 hs de reacción a 45 C, con 1 ml de alcohol, evidenciaron una mayor conversión al emplear 1-propanol (x= 78,5 %; ee = 54,4%), en comparación con etanol (x= 62%; ee =52 %) y 2-propanol (x=12 %; ee = 1,7%). Las investigaciones espectroscópicas evidenciaron que los alcoholes ejercen cierta acción perjudicial sobre la integridad física de las esferas del biocatalizador. Asimismo se demostró una fuerte adsorción de los alcoholes a través del análisis por desorción térmica programada. En este contexto, el etanol, 1-propanol y 2-propanol desorben a 150 ºC, 160 ºC y 200 ºC, respectivamente. En este sentido, se demostró una pérdida de masa de 16,6 %; 1,2 % y 5,9 % para etanol, 2-propanol y 1-propanol., respectivamente, así como una adsorción irreversible de 38,81 %; 3,68 % y 4,04 % para cada alcohol. Por otro lado, se cuantificó por espectroscopía UV-Vis la cantidad de proteína en el medio líquido una vez terminado el tratamiento. Este análisis presentó una pérdida de 2,76 % para etanol, 1,28 % para 2-propanol y 19,00 % para 1-propanol. En este contexto, se concluye que si bien al emplear tanto etanol como 1-propanol se obtienen valores de conversión y de enantioselectividad similares, el etanol es la mejor opción al considerar la mayor estabilidad del biocatalizador además de su menor costo.

Bibliografía

1. Foresti, M. L.; Galle, M.; Ferreira, M.L.; Briand, L.E. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2009, 84, 1461-1473.2. José C.; Bonetto, R. D.; Gambaro, L. A.; Guauque Torres, M. P.; Foresti, M. L.; Ferreira M. L.; Briand L. E. J. Mol. Catal. B: Enz. 2011, 71, 95-107.

Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias Aplicadas, Dr. Jorge J. Ronco (CINDECA), Universidad Nacional de La Plata (UNLP), CONICET CCT La Plata, calle 47 Nº 257, La Plata (1900),

Buenos Aires, Argentina.

CO-B3

44

Fermentação de polióis para produção de ácidos orgânicos por

Propionibacterium acidipropionici

1, 3 2 1 1Juliana Canto Duarte , Inês Lunardi , José Augusto R. Rodrigues , Paulo José S. Moran ,

3Gustavo Paim Valença

Juliana.canto@yahoo.com.br

1Laboratório de Biocatálise e Síntese (LaBioSin), Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, Campinas (13083-970), Brasil.

2Laboratório de Biotecnologia – Braskem S/A3Laboratório para Estudo de Processos de Adsorção e Catálise (LEPAC), Departamento de Engenharia

de Processos, Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas, Campinas(13083-852), Brasil.

O ácido propiônico é um intermediário importante na síntese de diversos produtos como fibras celulósicas, herbicidas, perfumes, produtos farmacêuticos sendo ainda utilizado na indústria alimentícia como conservante de alimentos [1,2]. O ácido succínico é importante para a produção de co-polímeros. Atualmente, estes ácidos orgânicos são produzidos quase exclusivamente via processos petroquímicos. No entanto, o crescente aumento do preço do petróleo e a busca por produtos obtidos através de rotas biológicas têm motivado o interesse industrial pela produção de ácido propiônico e outros compostos a partir de matérias-primas renováveis. A produção convencional de ácido propiônico através de fermentação com matérias-primas renováveis é limitada pela baixa produtividade, rendimento e concentração final devido à forte inibição causada pelo produto final [1,2]. A fonte de carbono é um dos fatores nutricionais mais importantes para a produção de ácido propiônico [1]. No presente trabalho reportamos o resultado do estudo da produção de ácido propiônico a partir de sorbitol, por fermentação com a bactéria Propionibacterium acidipropionici ATCC 4875. A bactéria foi cultivada em meio de cultura descrito por Soccol et al. [3]. As fermentações foram realizadas em um bioreator Multifors

-1contendo o inóculo (10%, v/v), o meio de cultura (250 mL) e sorbitol (80 g L ). O sistema foi ajustado para a temperatura (30 °C), pH (6,5) e agitação adequados (100 rpm). A anaerobiose foi mantida através de um fluxo constante de N . Sorbitol, ácido succínico, ácido acético e ácido 2

propiônico foram analisados por HPLC (Agilent 1200 series), equipado com uma coluna Aminex® HPX-87H (Biorad) e detector de índice de refração (RID), operado a 50 °C e utilizando H SO 5 2 4

-1mmol L como fase móvel (0,6 mL/min). A concentração final de ácido succínico, ácido acético e

-1ácido propiônico obtidas foram 9,4; 3,5 e 36,5 g L , respectivamente e o rendimento foi de 56%. O carbono total recuperado foi de 72,5%, sugerindo que 27,5% foi usado para crescimento celular e formação de CO . 2

Bibliografía

1. Liu, Y.; Zhang, Y. G.; Zhang, R. B.; Zhang, F.; Zhu, J.; Curr. Microbiol. 2011, 62, 152–158.

2. Zhang, A.; Yang, S. T. Process Biochem. 2009, 44, 1346–1351.3. Coral, J.; Karp, S. G.; Vandenberghe, L. P. S.; Parada, J. L.; Pandey, A.; Soccol, C. R. Applied Biochem. Biotechnol. 2008, 151, 333-341.

CO-B4

45

Síntesis enzimática de ésteres del ácido ferúlico

1,2 3 3 1Georgina Sandoval , Paula Quintana , Alicia Baldessari y Francisco Ploug.sandoval@csic.es / georgina@confluencia.net

1 Grupo de Biocatálisis Aplicada, Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid (28049),

España.2 Unidad de Biotecnología Industrial, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del

Estado de Jalisco (CIATEJ), Guadalajara, Jalisco (44270), México.3 Laboratorio de Biocatálisis. Departamento de Química Orgánica y UMYMFOR, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Universitaria, Pabellón 2, piso 3. Buenos

Aires (C1428EGA), Argentina.

El ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxi cinámico, AF, fig. 1), se encuentra en las paredes celulares de diversas plantas. Su abundancia en residuos agroindustriales y sus propiedades biológicas, (que incluyen actividad antioxidante, antimicrobiana, antiviral, antiinflamatoria, antialergénica, antitumoral y protectora contra los rayos UV), han despertado un gran interés por utilizar el ácido ferúlico como ingrediente nutracéutico, farmacéutico y cosmético [1]. Sin embargo, una limitación para su aplicación industrial es su baja solubilidad y estabilidad [2]. Una manera de superar esta limitación es sintetizar derivados esterificados del ácido ferúlico. Para ello, la Biocatálisis es una herramienta preferida sobre la catálisis química, ya que el ácido ferúlico se degrada a altas temperaturas y pHs extremos.

La síntesis de etil ferulato (EF, fig. 1), ha sido de las más estudiadas debido a que el EF puede ser utilizado como sintón para la preparación de otros derivados del ácido ferúlico y a su demanda en el mercado como ingrediente alimentario y cosmético. En este trabajo reportamos la síntesis enzimática de EF y la preparación de lauril ferulato (LF, fig.1), un éster con mayor hidrofobicidad adecuado para uso cosmético; en ambos casos utilizando como biocatalizador la lipasa comercial inmovilizada Novozym 435. Las condiciones de reacción logradas son compatibles con un posible escalamiento industrial mejorando las síntesis previamente reportadas en la literatura [3].

Figura 1. Estructura del ácido ferúlico (AF) y sus ésteres etil ferulato (EF) y lauril ferulato (EF).

Bibliografía

1. Barone, E.; Calbrese, V.; Mancuso, C. Biogerontol. 2009, 10, 97-108.2. Pyysalo, T.; Torkkeli, H.; Honkanen, E. Lebens-Wissensch Technol. 1997, 10, 438-441. 3. Compton, D.; Laszlo, J. A.; Berhow, M. A. JAOCS 2000, 77, 513-519.

O

HO

O

OR1 (EF) R1 : -CH2CH3

(AF) R1 : H

(LF) R1 : -(CH2)11CH3

CO-B5

46

Biotranformação de óleo de canola utilizando lípase de Thermomyces lanuginosus e Burkholderia cepacia

Laboratório de Tecnologia Enzimática, Departamento de Engenharia Química, Universidade Estadual de Maringá, Maringá-PR (87020-900), Brasil

João Henrique Dantas, Leandro Daniel De Paris, Carlos Eduardo Barão, Cleide Mara Faria Soares, Flávio Faria de Moraes, Pedro A. Arroyo, Gisella Maria Zanin

ikedantas@yahoo.com.br

A razão molar, temperatura e quantidade de enzima são variáveis importantes no processo de transesterificação e nesse trabalho sua influência no meio reacional enzimático foram estudadas. O álcool pode propiciar altas velocidades de reação e minimizar as limitações difusionais, entretanto pode inibir a atividade da enzima e diminuir seu poder catalítico [1]. O aumento da temperatura pode provocar redução nas ligações intramoleculares da enzima que propicia maior exposição do sítio ativo e geralmente melhora a atividade enzimática, mas também pode mudar sua estabilidade ao longo da reação. A quantidades de enzima no meio reacional é um fator econômico importante, pois pode significar maiores rendimentos, no entanto pode provocar um efeito agregador das moléculas enzimáticas que dificulta a catálise e pode diminui o rendimento [2]. Dentre as enzimas utilizadas para a produção de ésteres, a lípase de Burkholderia cepacia (BC) possui boa resistência à temperatura pode catalisar reações em meios concentrados de álcool e não é seletiva para as ligações especifica, a lípase de Thermomyces lanuginosus (TL) que é especifica para ligação 1,3 e possui característica de resistência a temperatura. Uma forma eficiente de verificar a influências dessas variáveis sobre a produção de ésteres etílicos do óleo de canola por

3meio das lípases de TL e BC é utilizar um planejamento experimental 2 em que a temperatura (40; 50; 60ºC), razão molar (1:6; 1:9; 1:12) e quantidade de enzima (5, 7,5 e 15%) são estudas como variáveis do processo. Os resultados do planejamento experimental mostraram os fatores que mais influenciaram o rendimento de éster do óleo de canola. Utilizando a lípase de BC a temperatura e a interação entre a temperatura e quantidade de enzima foram os fatores que mais influenciaram, com p-valores de 0,084 e 0,044, respectivamente. Utilizando a lípase de TL as variáveis que mais influenciaram foram a temperatura (p-valor 0,000) a razão molar (0,077) e as interações da temperatura com a razão molar (0,034) e temperatura com a quantidade de enzima (0,080).

Para a lípase de BC, temperaturas e quantidade de enzima mais elevadas tem um efeito de aumento do rendimento de éster. Por outro lado, o aumento da temperatura causa uma drástica inativação da lípase de TL o que implica em baixos valores de rendimento, assim como altos valores de razão molar álcool: óleo que também provocaram o mesmo efeito. Os resultados indicaram que para a lípase de BC o álcool adicionado acima da quantidade mínima de 1:3 apresentou um efeito ativador do meio reacional, assim como a temperatura enquanto que para a lípase de TL tanto o aumento da temperatura quanto o aumento da razão molar diminui o rendimento reacional, indicando os diferentes mecanismos das duas enzimas.

Bibliografía

1. Köse, Ö.; Tüter, M.; Aksoy, H. A. Bioresource Technol. 2002, 83, 125-129.2. Prazeres, D. M. F.; Garcia, F. A. P.; Cabral, J. M. S. Prog. Biotechnol. 1992, 8, 713-718.

CO-B6

47

Bio-reducción de Achalensolido con Rhizopus sp.

1 1 1 2 2Romina Salem , Patricia Varela ,Daniela Bustos , Adriana Pacciaroni , Virginia Sosa , Daniel 1Bustos

aroromy@gmail.com

1Instituto de Ciencias Básicas, Facultad de Filosofía, Humanidades y Artes, Universidad Nacional de San Juan, San Juan, Argentina

2Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba, Argentina

Los hongos fitopatógenos usualmente residen en la parte externa de las plantas y son uno de los principales objetivos del sistema de defensa de las mismas. Para combatirlos las especies vegetales generan compuestos conocidos como fitoalexinas, producidos en respuesta a una infección [1,2]. A su vez, éstos han desarrollado respuestas a las fitoalexinas por medio de enzimas [3].

En este trabajo se hace uso del potencial enzimático de un hongo fitopatógeno como Rhizopus sp., por su capacidad de contrarrestar los efectos de un compuesto orgánico similar a las fitoalexinas. Se informa la biotransformación de achalensolido, un producto natural aislado de Stevia achalensis cuya estructura es la de una lactona sesquiterpénica. Para la transformación de este compuesto se realizó un ensayo preliminar en pequeña escala en dos etapas (I: obtención de biomasa y II: transformación) con células en crecimiento y medio de cultivo líquido. La biotransformación fue seguida por cromatografía. Posteriormente se pasó a escala preparativa, se aisló el compuesto obtenido, se purificó y se determinó su estructura por comparación con una muestra auténtica del mismo compuesto obtenido anteriormente en nuestro laboratorio. Se pudo comprobar que el compuesto obtenido es el 11α-metilachalensolido. Podemos concluir que la o las enzimas responsables de la biotransformación del achalensolido son enoato-reductasas. Además la reducción fue regio y estereoselectiva, dado que se logró sólo la reducción del doble enlace carbono-carbono exocíclico, dando como resultado el grupo metilo de C11 con estereoquímica α. Tanto el compuesto de partida como el metabolito obtenido fueron evaluados in vitro en su capacidad antioxidante, y citotoxicidad mediante el ensayo de letalidad con Artemia salina. Este es el primer reporte de la transformación por biocatálisis de achalensolido, utilizando como fuente de enzimas un hongo fitopatógeno como Rhizopus sp.

Bibliografía

1. Harborne, J.B. Phytochemical Methods, A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis, 1998, Chapman & Hall, London, UK, 89.

2. Cutler S. J.; Cutler, H. G. Biologically Active Natural Products: Pharmaceuticals, 2000, CRC

Press, Boca Ratón, USA, 110.

3. Rojas M. C.; Hedden P.; Gaskin P.; Tudzynski B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 5838-

5843.

O

CH3

O

CH3

CH3

O

H

O

CH3

O

CH2

CH3

O

H

Rhizopus sp.

CO-B7

48

Producción de bio-hidrógeno a partir de glicerol empleando

catalizadores inorgánicos y biológicos

1,2 2 1Esteban Sanchez , Alejandro Beccaria y Raúl Comelliesanchez@fiq.unl.edu.ar

La creciente demanda de hidrógeno necesita fuentes renovables de materias primas para producirlo. El glicerol, subproducto de la síntesis de biodiesel, atrae el interés debido a su creciente producción asociada a la demanda de biocombustibles y por provenir de materias primas renovables, permitiendo un desarrollo medioambiental sostenible. Entre los posibles usos del glicerol se considera su utilización como sustrato bio-renovable para obtener hidrógeno, el cual es propuesto como combustible renovable de próxima generación [1]. El objetivo es obtener H a 2

partir de glicerol, utilizando un catalizador de Ni/Al O en el proceso de reformado con vapor del 2 3

triol y empleando medios de cultivo aptos para el desarrollo de microalgas capaces de producir esta transformación. Se empleó γ-Al O comercial como soporte para preparar un catalizador con una 2 3

carga de 5,1% p/p de Ni, mediante impregnación por humedad incipiente con una solución de Ni(NO ) ·6H O. El material preparado y el soporte fueron caracterizados por técnicas de adsorción 3 2 2

de N , RTP, FTIR y DRX. El catalizador se evaluó en el reformado con vapor de glicerol, 2-1conduciendo el proceso a 700ºC, 1 atm, WHSV 5 h , flujo de solución acuosa de glicerol (70% p/v)

-10,17 ml min y relación molar agua:glicerol 3:1; el tiempo total de reacción fue 24 h, en dos etapas de 12 h, con una regeneración intermedia. Se comparó el desempeño catalítico al alimentar glicerol pro-análisis y amarillo (subproducto del biodiesel). El seguimiento de la reacción fue realizado por cromatografía de gases, utilizando detectores TCD y FID, para analizar productos gaseosos y condensados. El depósito carbonoso se caracterizó por OTP y la regeneración del material fue evaluada luego de cada ciclo de reacción en corriente He-Aire (proporción 50-50) para recuperar la actividad catalítica. El principal producto generado en la reacción fue H , seguido por CO, CH y 2 4

CO [2]; etano, eteno, propano, propeno y buteno fueron otros compuestos minoritarios formados 2

por reacciones laterales que favorecen la formación de depósito carbonoso y aceleran la desactivación del catalizador. Para el estudio de los sistemas biológicos, las cepas de microalgas Nitzschia laevis UTEX B 2047 y Phaeodactylum tricornutum LFF Pt 01 fueron cultivadas con

-2 -1glicerol, mantenidas en incubadora en modo estático a 21±1ºC, con irradiancia de 54 μE m s y ciclo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Los cultivos se caracterizaron mediante parámetros estequiométricos (densidad celular máxima) y cinéticos (velocidad específica de crecimiento y consumo global de glicerol). N. laevis mostró una acción ligeramente inhibitoria del glicerol, aunque su consumo depende de la concentración de glicerol suplementado. En tanto, P. tricornutum mostró una acción trófica hacia el glicerol, siendo posible ensayarla como biocatalizador para producir H [3].2

Bibliografía

1. Pachauri, N.; He, B. ASABE Annual International Meeting 2006, U.S.A.2. Sanchez, E.; Comelli, R. Int. J. Hydrogen Energy 2012, in press.3. Sanchez, E. Tesis de Licenciatura en Biotecnología (FBCB-UNL) 2010, Argentina.

1INCAPE (FIQ-UNL, CONICET), Santa Fe (S3000AOJ), Argentina.2Laboratorio de Fermentaciones, (FBCB-UNL), Santa Fe (S3000ZAA), Argentina.

CO-B8

49

Bio-reducción de 1,3-diaril-2-propen-1-onas con cultivos in vitro de células vegetales.

1 1 1 2Cynthia A. Magallanes-Noguera , Francisco Cecati , Carlos Ardanaz , Elizabeth Agostini ,

1 1Alejandro Orden , Marcela Kurina-Sanz

cynthiamagallanes@hotmail.com

Las 1,3-diaril-2-propen-1-onas (chalconas) son los precursores de flavonoides y poseen un amplio espectro de acción antiviral, actividad alelopática, propiedades anti-inflamatorias y anti-bacteriales. El uso de microorganismos en la biotransformación de chalconas lleva a la formación de varias mezclas de compuestos producidos por diversas bio-reacciones que incluyen ciclaciones, O-demetilaciones, reducciones, hidroxilaciones, etc. [1]. Buscando quimioselectividad se investigó la capacidad de biocatalizadores vegetales a célula entera con probada actividad enoato reductasa [2] para reducir 1,3-diaril-2-propen-1-ona. Los cultivos in vitro de raíces transformadas de Capsicum annuum var. annuum y de células indiferenciadas de Tessaria absinthioides y Medicago sativa demostraron potencialidad para ser utilizados como reductores selectivos del enlace C=C. Al estudiar la cinética de bio-reacción se detectó también el producto de reducción del grupo carbonilo, poniéndose en evidencia que la actividad de la/s carbonilreductasa/s (ADHs) es precedida por la de la/s enzima/s del tipo enoatoreductasa (ER).

Figura 1. Reducción de chalconas con biocatalizadores vegetales

Para validar los sistemas biocatalíticos vegetales, una serie de 1,3-diaril-2-propen-1-onas sustituidas con grupos atrayentes y dadores de electrones fueron utilizadas como sustratos y se estandarizó una metodología por CG-EM para el análisis de las cinéticas de bio-reacción.

Bibliografía

1. Corrêa, M.; Nunes, F.; Bitencourt, H.; Borges, F.; Guilhon, G.; Arruda, M.; Marinho, A.; Santos, A.; Alves, C.; Brasil, B.; Santos, L. J. Braz. Chem. Soc. 2011, 22(7), 1333-1338.2. Magallanes-Noguera, C.; Orden, A.; Agostini, E.; Kurina-Sanz, M. XVIII Simposio Nacional de Química Orgánica, 2011.

1INTEQUI-CONICET, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis. CP 5700. San Luis, Argentina.

2Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Química y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto. CP 5800. Río Cuarto, Córdoba, Argentina

O

O

O

OH

+ ER ADH

CO-B9

50

Preparación enzimática de derivados regioselectivamente acilados del nucleósido antitumoral citarabina

1 1 1,2 1María B. Sabaini , César A. Trifone , Adolfo M. Iribarren y Luis E. Iglesiasmsabaini@unq.edu.ar

1-β-D-Arabinofuranosilcitosina (Citarabina, AraC) es uno de los análogos de nucleósidos más empleados en terapias antineoplásicas y suele ser utilizado eficazmente para la quimioterapia de las leucemias agudas. Para lograr el efecto terapéutico deseado debe mejorarse la biodisponibilidad de AraC, por lo cual varias estrategias han tratado de modificar sus propiedades farmacológicas. Un enfoque exitoso consiste en la acilación regioselectiva del OH-5' de AraC con diferentes dadores de acilo [1-2].

Basándonos en trabajos previos de nuestro laboratorio acerca de la regioselectividad de la lipasa B de Candida antarctica en arabinonucleósidos [3], en el presente trabajo hemos realizado biotransformaciones sobre un conjunto de derivados acilados de AraC, empleando dicha enzima como biocatalizador. A partir de los derivados tri-O (1) y N,O-tetraacetilados (2) de AraC, y mediante la elección adecuada del medio de desacetilación (alcohol o buffer), se obtuvieron isómeros regioselectivamente acetilados (por ejemplo 4, 8), productos con distinto grado de acetilación (por ejemplo 4, 5, 7 ), así como también derivados regioselectivamente hexanoilados (6, 9). Todas las reacciones presentadas en la Figura 1 se llevaron a cabo con altos rendimientos, siendo altamente regioselectivas y versátiles para la síntesis de potenciales prodrogas del antitumoral citarabina.

Figura 1. Desacetilación regioselectiva de los derivados acilados de AraC.

Bibliografía

1. Ferrero, M.; Gotor, V. Chem. Rev. 2000, 100, 4319-4347.2. Bergman, A.; Kuiper, C.; Voorn, D.; Comijn, E.; Myhren, F; Sandvold, M.; Hendriks, H.; Peters, G. Biochem. Phamacol. 2004, 67, 503-511.3. Sabaini, M.; Zinni, M.; Mohorcic, M.; Friedrich, J.; Iribarren, A.; Iglesias, L. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2010, 62, 225-229.

1 Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal (1876), Buenos Aires, Argentina.

2 Laboratorio de Síntesis de Ácidos Nucleicos, INGEBI (CONICET), Capital Federal (1428), Buenos Aires, Argentina.

CO-B10

51

Biopéptidos obtenidos por hidrólisis enzimática de proteínas del lactosuero con extractos de frutos de Salpichroa origanifolia

Gabriela Rocha, Francisco Kise, María E. Blotta, Débora Rodríguez, M. E. Díaz, Adriana Rosso y Mónica Parisi

gabrielafernandarocha@hotmail.com

Laboratorio de Química Biológica, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Luján, Ruta 5 y Avenida Constitución, Luján (6700), Buenos Aires, Argentina.

En los últimos años se ha dedicado especial atención al estudio del papel fisiológico de las proteínas de la dieta. El lactosuero y los concentrados proteicos de la leche son cada vez más utilizados como ingredientes versátiles en la elaboración de alimentos, tanto para mejorar su calidad como su funcionalidad. Algunos fragmentos de la secuencia de estas proteínas, pueden liberarse mediante hidrólisis y exhibir efectos positivos sobre la salud, entre ellos, mejoran la respuesta inmunológica, poseen propiedades antimicrobianas, disminuyen la presión arterial e incluso presentan actividad antitumoral, por lo que se estudia la forma de incluirlos como ingredientes funcionales en alimentos. El objetivo de este trabajo es evaluar la actividad antihipertensiva y antimicrobiana de los hidrolizados de lactosuero obtenidos con extractos de frutos de Salpichroa origanifolia.

En los ensayos se empleó un extracto crudo de los frutos como fuente de aspartil peptidasas y una solución de concentrado de lactosuero como sustrato (0.25 % p/V de Lacprodan 80, ARLA FOODS). La reacción enzimática se llevó a cabo a pH 6.0 y 37°C en un agitador orbital a 100 rpm durante 24 hs. Los hidrolizados obtenidos fueron separados secuencialmente por ultrafiltración con membranas AMICON (AMICON® YM10/YM3, Millipore, USA) obteniéndose compuestos de peso molecular entre 3-10 kDa y el permeado de peso molecular inferior a 3 kDa. En ambas fracciones se evaluaron in vitro las actividades antihipertensiva y antibacteriana. La actividad inhibitoria de la Enzima Convertidora de la Angiotensina I (ECA I) se estimó de acuerdo al método descripto por Chang y colaboradores [1]. Se evaluó también la actividad antibacteriana de las fracciones peptídicas sobre cepas de Staphyloccocus aureus, Pseudomona fluorescens, Salmonella gallinarum y Escherichia coli [2]. El seguimiento de la cinética de crecimiento bacteriano se realizó por turbidimetría [3]. Se observó que los hidrolizados del lactosuero presentan inhibición superior al 90% de la actividad de la ECA I en las condiciones de reacción. En los ensayos microbiológicos se encontró que la fracción de peso molecular entre 3-10 kDa presenta una elevada inhibición del crecimiento de S. aureus (100%) y de P. fluorescens (60%), y que el permeado produce una inhibición moderada de ambas cepas microbianas (menor del 50%). Ninguna de las fracciones mostró efecto inhibitorio significativo sobre S. gallinarum ni E. coli en las condiciones del ensayo.

Estos resultados son relevantes desde el punto de vista sanitario y nutricional pues estos compuestos bioactivos podrían ser utilizados como ingredientes en alimentos funcionales o como potencial fuente de nutracéuticos.

Bibliografía1. Herregods, G.; Van Camp, J.; Morel, N.; Ghesquiére, B.; Gevaert, K.; Vercruysse, L.; Dierckx, S.; Quanten, E. y Smagghe, G. J. Agric. Food. Chem. 2011, 59, 552-558.2. Ballows, A. Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos. Técnicas actualizadas. Ed. Médica Panamericana 1976, 125-135. 3. Isenberg, H. D. Ann. NY Acad. Sci. 1984, 428 (1), 236-242.

CO-B11

52

Lipasas como catalizadores en la síntesis de anandamida y sus análogos

Guadalupe García Liñares, Paula G. Quintana, Santiago N. Chanquía y Alicia Baldessarilinares@qo.fcen.uba.ar

Laboratorio de Biocatálisis, Departamento de Química Orgánica y UMYMFOR, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina.

Los canabinoides endógenos, llamados endocanabinoides actúan como agonistas de los receptores para canabinoides CB1 y CB2. Los endocanabinoides son amidas de ácidos grasos (AAG), siendo la araquinoni-.2'-etanolamida, conocida como anandamida, el miembro más importante de esta familia de compuestos.

Los endocanabinoides muestran una actividad biológica muy potente sobre el sistema nervioso central y varios sistemas metabólicos. Constituyen interesantes agentes terapéuticos usados en el tratamiento del dolor, la ansiedad y desórdenes en el sueño, efectos analgésicos y antiinflamatorios, etc. Con respecto a otros efectos metabólicos, las AAG pueden regular la ingesta de alimentos, la obesidad y la diabetes. En condiciones fisiológicas, la anandamida es hidrolizada rápidamente por la hidrolasa de AAG, que es la enzima responsable de su degradación a ácido araquídonico y etanolamina.

Con el objeto de obtener análogos de anandamida que presenten mayor estabilidad en el organismo, en este trabajo se describe la síntesis de una serie de AAG por reacción de ésteres etílicos de ácidos grasos omega-3 y omega-6 con varias alcanolaminas siguiendo una estrategia enzimática.

Figura 1. Síntesis enzimática de anandamida y sus análogos

Entre todas las lipasas evaluadas la de Candida antarctica (CAL B) fue el biocatalizador seleccionado y los parámetros de reacción (temperatura, relación enzima/sustrato, relación alcohol y alcanolamina/ ácido graso, tiempo, solvente, sistema libre de solvente, etc.) fueron estudiados con el objeto de lograr las condiciones óptimas de reacción.

Se describe un procedimiento one pot-two steps para la conversión de ácidos grasos en anandamida y sus análogos via la formación del éster etílico y su posterior aminólisis por alcanolaminas. Los productos, mayoritariamente novedosos, fueron obtenidos en alto rendimiento (70-98%) y la enzima mostró un comportamiento quimioselectivo en relación a los grupos amino e hidroxilo de las alcanolaminas, obteniéndose alcanolamidas de ácidos grasos como únicos productos de reacción.

OR1

O

NHR2

O

1) EtOH

2) R2NH2

R1: -H, -CH3, -CH2CH3

R2: NH2C(R3,R4)(CH2)n OH R3: H, CH3 R4: CH3, Et, n-Bu

CAL B

CO-B12

53

Comunicaciones Orales

Area Screening de Biocatalizadores

54

Código Autor que

expone Título y autores

Página

CO-SB1 NEHER, Bárbara Diglicosidasas como estrategia para la

degradación de flavonoides en procariontes Bárbara Neher, Laura Mazzaferro y Javier Breccia

55

CO-SB2 GUAUQUE

TORRES, M.P.

Optimización de la preparación de agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs) de la

lipasa de Candida antarctica B (CALB) M. P. Guauque Torres, M. L Foresti, M. L. Ferreira

56

CO-SB3 VALLES, Diego

Efecto de agentes químicos y fisicos en la estabilidad estructural de enzimas proteolíticas

de Bromelia antiacantha Diego Vallés, Ana Cantera

57

CO-SB4 MORCELLE,

Susana

Síntesis de peptidil alcoholes catalizada por peptidasas vegetales y su utilización como

sustratos de mutantes de D-fructosa-6-fosfato aldolasa en reacciones de adición aldólica Susana R. Morcelle, Mariana Gutiérrez, Alicia

Cánepa, Juan M. Padró, Carlos Llerena-Suster, Rubén Rimada, Pere Clapés

58

CO-SB5 BIANCHI, Paola

Screening de actividad alcohol deshidrogenasa en hongos para la reducción de cetonas cíclicas

y heterocíclicas Paola Bianchi, Vanesa Ludemann, Adolfo M.

Iribarren y Elizabeth S. Lewkowicz

59

55

Diglicosidasas como estrategia para la degradación de flavonoides en procariontes

Bárbara Neher, Laura Mazzaferro y Javier Brecciabarbaraneher@hotmail.com

Las diglicosidasas son enzimas que hidrolizan diglicoconjugados liberando el disacárido en un solo paso. Hasta el momento, fueron descriptas sólo cinco diglicosidasas, de origen eucarionte (vegetales y fúngicas). Se evaluó la presencia de actividad diglicosidasa en 18 cepas bacterianas y se seleccionó Actinoplanes sp. SES612 como potencial productora. El microorganismo se cultivó en un reactor agitado (0.17 L) con el flavonoide 7-O-rutinosilado hesperidina como fuente de carbono. Éste no produjo actividad α-ramnosidasa extracelular detectable, y la actividad β-glucosidasa fue 1200 veces inferior a la capacidad de desglicosilación de hesperidina, sugiriendo la presencia de actividad diglicosidasa (Figura 1). Esta actividad se confirmó en zimogramas con metilumbeliferil-rutinosido como sustrato, y por la producción del disacárido rutinosa (6-O-α-ramnosilglucósido) desde el flavonoide hesperidina [1]. La actividad diglicosidasa mostró una temperatura óptima aparente de 55°C, con mayor actividad a valores de pH cercanos a la neutralidad. Hasta el momento sólo existe la descripción de una β-glucosidasa promiscua de Pyrococcus furiosus que es capaz de hidrolizar hesperidina en modo “endo” y la mención de una β-primeverosidasa bacteriana en una patente [2,3]. Por lo tanto, este catalizador es la primer diglicosidasa procariota activa sobre el flavonoide hesperidina.

Figura 1. Actividades glicosidasas extracelulares del cultivo sumergido de Actinoplanes sp. SES612 con hesperidina como fuente de carbono.

Bibliografía

1. Mazzaferro, L.; Piñuel, L.; Erra-Balsells, R.; Giudicessi, S.; Breccia, J. D. Carbohydr. Res. 2012, 347, 69–75. 2. Yeom S. J.; Kim B. N.; Kim Y. S.; Oh D. K. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 1535−1541.3. Yamamoto S.; Okada M.; Usui T.; Sakata K.; Toumoto A.; Tsuruhami K. Patent 7109014, 2006.

Laboratorio de Biocatálisis, INCITAP-CONICET-Departamento de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de La Pampa, Santa Rosa (6300), Argentina

CO-SB1

56

Optimización de la preparación de agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs) de la lipasa de Candida antarctica B (CALB)

1 2 1 M. P. Guauque Torres , M. L Foresti , M. L. Ferreira . piliguauque@hotmail.com

La preparación de agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs) implica la precipitación por cambios en la constante dieléctrica o la fuerza iónica del medio y posterior entrecruzamiento con una molécula bifuncional como glutaraldehido (Glut) [1]. La precipitación proteica posee problemas de transferencia de masa por las moléculas de enzima ocluidas en el interior del CLEA sin acceso al sustrato. Asimismo al promover la interacción hidrofóbica entre enzimas, puede disminuir la dinámica conformacional necesaria para el acople enzima-sustrato. La adición de azúcares puede contribuir en la estabilización conformacional del CLEA [2].

Se evaluó el comportamiento de CLEAs sintetizados con CALB usando albúmina sérica bovina (BSA) como proteína de co-precipitación y cantidades variables de Glut. Se efectúo una modificación al proceso convencional de preparación de CLEAs, cambiando el orden de agregado de reactivos para potenciar la precipitación y entrecruzamiento de BSA como núcleo del CLEA con posterior adición de CALB para mejorar su disponibilidad en reacción. Además se contempló la estabilidad en el tiempo de almacenamiento y el reuso de CLEAs sintetizados con y sin dextrosa como estabilizante. La cuantificación del porcentaje de actividad recuperada en la reacción test se obtuvo comparando la actividad específica del CLEA con la actividad específica de la enzima libre. También se observó la importancia de medición de actividad en rangos lineales de Actividad Vs Tiempo y Actividad Vs Concentración de lipasa. [3].

En las condiciones evaluadas, se obtuvo un porcentaje de actividad recuperada máxima de 190% con respecto a CALB-libre con la adición de 50mg Glut (25% p/v). El fenómeno de hiperactivación se mantuvo con la adición de 40 y 60mg Glut. Si bien el uso de dextrosa disminuye el porcentaje de actividad recuperada del CLEA, permite mejorar su comportamiento en el reuso. Este fenómeno podría indicar una mejor disponibilidad de la lipasa en el CLEA para la reacción de esterificación.

Bibliografía

1. Sheldon, R. A. Biochem. Soc. Trans. 2007, 35(6), 1583-1587.2. Wang, M.; Qi, W.; Jia, C.; Ren, Y.; Su, R.; He, Z. J. Biotechnol., 2011, 156, 30-38.3. Guauque Torres M. P.; Foresti M. L.; Ferreira M. L. Anales del XXII Congreso Ibero- americano de Catálisis (CICAT-2010) Cón-Cón Chile, 5-10 de Septiembre de 2010. B-P-12, 1127.

1PLAPIQUI-UNS-CONICET. Camino la Carrindanga Km 7, CC 717, 8000. Bahía Blanca, Provincia de Buenos Aires, Argentina.

2INTECIN, Facultad de Ingeniería,UBA, Las Heras 2214, Capital Federal, Argentina

CO-SB2

57

Efecto de agentes químicos y fisicos en la estabilidad estructural de enzimas proteolíticas de Bromelia antiacantha

1 1, 2Diego Vallés , Ana Cantera

dvalles@fq.edu.uy

La función de las proteínas depende de su habilidad en adquirir una única estructura tridimensional. Entender cómo este proceso ocurre es uno de los grandes retos que la química de proteínas enfrenta hoy en día. Se sabe que las proteínas acumulan diferentes estados conformacionales durante el desplegamiento, inducido por varios agentes desnaturalizantes [1].

Hay una creciente evidencia que, junto con el estado desnaturalizado de la proteína, existe una población de moléculas que todavía poseen una estructura residual, es decir, el estado desnaturalizado no implica una completa pérdida de su conformación [2]. La caracterización del estado desnaturalizado es un tema de reciente interés para la comprensión del plegamiento y estabilidad de las proteínas [2, 3].

Una metodología simple para estudios de este tipo implica el seguimiento de los cambios conformacionales debido a la perturbación de una molécula de proteína por varios agentes como urea y temperatura [4].

En este trabajo se estudia el efecto de la Urea y Cloruro de Guanidinio (agentes químicos comúnmente utilizados como desnaturalizantes de proteínas) sobre la estabilidad de las proteasas presentes en el extracto crudo (EC) de frutos maduros de Bromelia antiacantha y el efecto de la temperatura en la desnaturalización.

El extracto diluido en soluciones de urea 2, 4, 6 y 8 M manifestó un incremento en la actividad proteolítica a tiempos cortos (15 minutos), manteniendo una alta actividad (superior al 90%) al cabo de 60 minutos. Este efecto activador fue observado para todas las condiciones de pH estudiadas, obteniéndose los valores más altos de actividad a pH 6 y 9 (pHs óptimos del extracto). El Cloruro de Guanidinio mostró un efecto activador similar a la urea, siendo este mas pronunciado a concentraciones de 2 y 4M respecto a la solución 6M.

El efecto desestabilizador fue estudiado a temperaturas de 70, 80, 90 y 100ºC. Se observó una completa pérdida de actividad a los 5 minutos de incubación del EC diluido, a todas las temperaturas ensayadas. No se observó restauración de la actividad catalítica luego de retermostatizar dicho extracto a 4 y 25°C durante 3hs.

El EC mostró una alta estabilidad al almacenamiento, manteniendo más de un 80% de la actividad inicial durante 288 hs a 9ºC.

Bibliografía

1. Basir, A.; Tabrez, A. S.; Soghra, K. H.; Rizwan, H. K. J. Biochem. 2007, 141, 251-259. 2. Chang, J.; Li, L.; Canals, F.; Avilés, F. X. J. Biol. Chem. 2000, 275, 14205-14211. 3. Soghra, K. H.; Sheeba, R.; Rizwan, H. K. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 47-52. 4. Devaraj, K. B.; Kumar, P. R.; Prakash, V. Process Biochem. 2011, 46, 458-464.

1Laboratorio de Enzimas Hidrolíticas, Instituto de Química Biológica, Facultad de Ciencias (11400), Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

2 Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química (11800), Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

CO-SB3

58

Síntesis de peptidil alcoholes catalizada por peptidasas vegetales y su utilización como sustratos de mutantes de D-fructosa-6-fosfato

aldolasa en reacciones de adición aldólica

1 2 3 4Susana R. Morcelle , Mariana Gutiérrez , Alicia Cánepa , Juan M. Padró , Carlos Llerena-

1 5 2Suster , Rubén Rimada , Pere Clapés

morcelle@biol.unlp.edu.ar

1LIPROVE, Depto. de Cs. Biológicas, Fac. Cs. Exactas, UNLP, La Plata, (1900) Argentina.

2Grupo de Biotransformaciones y Moléculas Bioactivas, IQAC-CSIC, Barcelona, (08034) España.3Laboratorio de Química Orgánica Superior, Depto. de Química, Fac. Cs. Exactas, UNLP, La Plata,

(1900) Argentina.4Laboratorio de Separaciones Analíticas, División Química Analítica, Fac. Cs. Exactas, UNLP, La Plata,

(1900) Argentina.5LADECOR, Depto. de Química, Fac. Cs. Exactas, UNLP, La Plata, (1900), Argentina.

Los péptidos y sus derivados son objeto de estudios intensivos, ya que pueden utilizarse como drogas terapéuticas, ingredientes cosméticos y aditivos alimentarios. Los peptidil alcoholes son intermediarios clave para la obtención de péptido aldehídos [1]. La síntesis de peptidil alcoholes puede realizarse por vía enzimática, empleando proteasas como biocatalizadores. Las aldolasas son enzimas que catalizan la formación reversible de enlaces C-C mediante la adición aldólica de un dador nucleofílico (un enolato cetónico) y un aldehído nucleofílico, lo que las convierte en biocatalizadores interesantes para la síntesis de compuestos potencialmente bioactivos [2]. En la presente comunicación se informa sobre la síntesis de conjugados de péptidos con polialcoholes e hidroxicetonas mediante una estrategia quimioenzimática en varios pasos. Peptidil alcoholes conteniendo aminoácidos codificados y no codificados como dadores de acilo y aminoalcoholes como nucleófilos (etanolamina y 3-amino-1-etanol) fueron sintetizados utilizando peptidasas vegetales como biocatalizadores con conversiones de hasta 98% (control termodinámico). Se escaló la síntesis de los derivados Cbz-Gly-Glyol y Cbz-Ala-Glyol, obteniéndose rendimientos del 71,0% y 93,3% respectivamente. Los peptidil alcoholes obtenidos fueron oxidados a péptido aldehídos utilizando ácido 2-iodoxibenzoico (IBX). Cbz-Gly-Glyal y Cbz-Ala-Glyal fueron empleados como sustratos de un doble mutante de D-fructosa-6-fosfato aldolasa de E. coli (FSA A129S/A165G) [3], que catalizó la adición de dihidroxiacetona (DHA), obteniéndose 91% y 60% de conversión en producto para cada caso luego de 19 y 6 h de reacción respectivamente. Los productos fueron purificados e hidrogenados en distintas condiciones, según se indica en la Figura.

Bibliografía

1. Naqvi, T.; Bhattacharya, M.; Haq, W. J. Chem. Research (S) 1999, 1999, 424-425.2. Clapés, P.; Fessner, W. D.; Sprenger, G. A.; Samland, A. K. Curr. Op. Chem. Biol. 2010, 14, 154-167.3. Gutiérrez, M.; Parella, T.; Joglar, J.; Bujons, J.; Clapés, P. Chem. Commun. 2011, 47, 5762–5764.

CO-SB4

59

Screening de actividad alcohol deshidrogenasa en hongos para la reducción de cetonas cíclicas y heterocíclicas

1 2 1,3 1Paola Bianchi , Vanesa Ludemann , Adolfo M. Iribarren y Elizabeth S. Lewkowiczpaobianchi85@gmail.com

1Laboratorio de Biotransformaciones, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de 2Quilmes, Bernal (1876), Argentina, Laboratorio de Micología de los Alimentos, Departamento de

3 Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal (1876), Argentina, Laboratorio de ácidos nucleicos, INGEBI, CONICET, Ciudad Autónoma de Buenos Aires (1428), Argentina

En los últimos años se han estudiado y desarrollado diferentes estrategias en la síntesis de compuestos utilizados en tratamientos terapéuticos antivirales y antitumorales. Los análogos de nucleósidos con estructuras que contienen ciclos similares al de la ribosa, como 3TC, D4T y Abacavir, y compuestos como Oseltamivir y Zanamivir cuya base estructural consiste en ciclos o heterociclos como ciclohexeno y dihidropirano, son antivirales con probada actividad biológica, utilizados en el tratamiento del HIV [1] y la Influenza A [2] respectivamente.

Las oxidorreductasas se clasifican de acuerdo al tipo de oxidante que utilizan y la principal fuente de biocatalizadores para llevar a cabo reacciones redox son hongos y levaduras. Mediante reducción catalizada por deshidrogenasas pueden obtenerse diferentes compuestos con alto grado de pureza enantiomérica como alcoholes, hidroxiácidos e hidroxiésteres entre otros [3].

En el presente trabajo se propuso buscar actividad alcohol deshidrogenasa para la reducción de carbonilos de compuestos cíclicos y heterocíclicos en hongos de los géneros Mucor, Aspergillus, Absidia, Fusarium y Neosartoria, que sirvan como precursores de los compuestos con la actividad biológica antes mencionados. Para llevar a cabo el screening se utilizó como biotransformación modelo la reducción de ciclohexanona en medio líquido. Se determinaron las condiciones óptimas de crecimiento y reacción para cada microorganismo, se extrajo el producto y se analizó por cromatografía gaseosa. Se seleccionaron 6 cepas con porcentajes de conversión superiores a 30%. Con dichas cepas se realizó la reacción en las mismas condiciones utilizando como sustrato tetrahidropiranona, tetrahidrotiopiranona, N-metilpiperidona, N-Boc-piperidona, N-Boc-3-pirrolidinona, dihidro-3-tiofenona, 2-pirrolidinona y γ-butirolactona.

Bibliografía

1. De Clercq, E. Biochim. Bioph. Acta 2002, 1587, 258– 275.2. Laillea, M.; Geraldb, F.; Debitusb, C. Cell. Mol. Life Sci. 1998, 54, 167–170.3. Moore, J. C.; Pollard, D. J.; Kosjek, B.; Devine, P. N. Acc. Chem. Res. 2007, 40(12), 1412-1419.

CO-SB5

61

PresentacionesPosters

63

PresentacionesPosters

Area Diseño de Biocatalizadores

64

Código Título y autores Página

PP-DB1 Evaluación de la composición y contenido de lipasa de un caldo

crudo comercial de CALB

Carlos R. Llerena Suster, Laura E. Briand, Susana R. Morcelle 67

PP-DB2

Preparación de a-halohidrinas, epóxidos y dioles quirales enantioméricamente puros en procedimientos “one pot” con

microorganismos extremófilos liofilizados Celeste Aguirre-Pranzoni, Alejandro A. Orden, Fabricio R. Bisogno,

Carlos E. Tonn, Marcela Kurina-Sanz

68

PP-DB3 La yerba mate: un importante inductor de la actividad clorogenato

hidrolasa Ana P. Butiuk, Roque A. Hours, Osao Adachi

69

PP-DB4 Inmovilización de peroxidasa y hematin sobre quitosano con

glutaraldehído como agente acoplante Agostina Córdoba, Ivana Magario, María Luján Ferreira

70

PP-DB5 Inmovilización de Fructosiltransferasa sobre TiO2 para síntesis de

prebióticos Daniel H. Valdeón, Paula Z. Araujo, Mirta Daz, Nora I. Perotti

71

PP-DB6

Investigación de la estructura y actividad proteolítica de papaína en medios acuoso orgánicos homogéneos a distintas temperaturas

Carlos R. Llerena Suster, Carla José, Sebastián Collins, Laura E. Briand, Susana R. Morcelle

72

PP-DB7 Fotobiocatálisis con peroxidasa de rábano y nanopartículas de CdS

inmovilizadas en SBA-15 Abelmar López, Laritza Avendaño, Osnelda Villegas, Eduardo Torres

73

PP-DB8 Diseño de biocatalizadores de Candida antarctica Lipasa B (CALB)

inmovilizada sobre nanopartículas magnéticas Paula Nicolás, Verónica Lassalle y María Luján Ferreira

74

PP-DB9

Efecto de sustratos xenobióticos sobre biocatalizadores vegetales: inducción de muerte celular programada

Abi L. Anello, María L. Mascotti, Alicia S. Molina, Marcela B. Kurina-Sanz y Alejandro A. Orden

75

PP-DB10

Desarrollo de una estrategia de ¨cell display¨ de la fosfotriesterasa de B. diminuta para su uso en la selección de aptámeros

Julieta Bertana Lahourcade, Elizabeth Lewkowicz, Adolfo Iribarren y Eduardo García-Junceda

76

PP-DB11

Oxidação de álcoois por lacase imobilizada em nanosílica via LMS (Laccase Mediator System)

Luiz A. Zampieri, Dávila S. Zampieri, Bruno R.S. de Paula, Paulo J. M. Moran, J. Augusto R. Rodrigues

77

PP-DB12

Redução de α-haloenonas por células imobilizadas de Saccharomyces cerevisiae

Dávila S. Zampieri, Luiz A. Zampieri, Bruno R. S. de Paula, J. Augusto R. Rodrigues, Paulo J. S. Moran

78

65

Código Título y autores Página

PP-DB13

Uso de cultivos microbianos de alta densidad para la optimización de la producción de cis-ciclohexadienodioles como materiales de partida

para síntesis enantioselectivas M. Agustina Vila, Gustavo Seoane, Sonia Rodríguez, Ignacio Carrera

79

PP-DB14 Mejora en la actividad y la estabilidad de la lipasa de Alcaligenes sp.

inmovilizada covalentemente en sílicas porosas Claudia Bernal, Andrés Illanes y Lorena Wilson

80

PP-DB15

Caracterización de perlita expandida y perlita expandida modificada utilizada para inmovilizar a-amilasa de A.oryzae

Juan J. Rodríguez Zotelo, Fernando Soria; Hugo Geronazzo, Hugo Destefanis

81

PP-DB16

Preparación de materiales compuestos poliestireno-divinilbenceno con diatomea y arcilla Pj y su aplicación en la inmovilización de

biomoléculas Juan J. Rodríguez Zotelo; Fernando Soria; Hugo Geronazzo; Mariana

Cabrera; Hugo Destefanis

82

PP-DB17

Clonado y caracterización de biocatalizadores tipo Baeyer-Villiger monooxigenasa para síntesis orgánica

Romina D. Ceccoli, Aneley N. Montaner, Marcela Amongero, Dario A. Bianchi y Daniela V. Rial

83

PP-DB18

Desarrollo de un biocatalizador en fase sólida por inmovilización covalente reversible de lacasa de Trametes villosa en tiolsulfinato-

agarosa Larissa Gioia, Carmen Manta, Karen Ovsejevi y Pilar Menéndez

84

PP-DB19

Desarrollo de procesos biocatalíticos para la preparación de heterociclos en forma ópticamente activa

Vicente Gotor-Fernández, María López-Iglesias, Juan Mangas-Sánchez, María Rodríguez-Mata, Eduardo Busto y Vicente Gotor

85

67

Evaluación de la composición y contenido de lipasa de un caldo crudo

comercial de CALB

1,2 1 2Carlos R. Llerena Suster , Laura E. Briand , Susana R. Morcelle

carlollzz@yahoo.com

1 Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias Aplicadas-Dr. Jorge J. Ronco. Universidad Nacional ode La Plata, CONICET, CCT La Plata. Calle 47 N 257, B1900AJK La Plata, Buenos Aires, Argentina.

2 Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales (LIPROVE), Depto. de Cs. Biológicas, Fac. Cs.

Exactas, Universidad Nacional de La Plata, Calle 47 y 115, La Plata, Argentina.

La lipasa B de Candida antarctica (CALB) (EC 3.1.1.3) es una de las lipasas más ampliamente usadas en biocatálisis debido a que resulta muy activa ante una gran diversidad de sustratos. Además la CALB es estable en solventes orgánicos y puede catalizar reacciones incluso en altas temperaturas.

Aunque para algunos procesos industriales en fase homogénea se pueden usar preparaciones crudas de CALB, resulta útil establecer una estrategia de purificación para la realización de distintos estudios o desarrollos. En este sentido, es útil purificar la enzima para poderla caracterizar bioquímicamente y estructuralmente o para realizar sobre la misma ingeniería genética.

Por otra parte, a partir de la lipasa purificada es posible preparar biocatalizadores que, por un lado posean mejores rendimientos en las reacciones y, por otro, permitan determinar inequívocamente los cambios que pudieran ocurrir en la estructura secundaria y terciaria al inmovilizarla y/o ante la exposición a distintas condiciones de reacción. Estas relaciones fundamentales estructura enzimática-actividad catalítica tendientes al diseño racional de biocatalizadores solo pueden obtenerse con sistemas de composición bien conocida. En este sentido y como una primera etapa en el desarrollo de una metodología de purificación enzimática, se han investigado los componentes y el contenido real de enzima de un caldo crudo de CALB provisto por la empresa Novozymes.

La estrategia empleada en esta investigación involucró primeramente la centrifugación del caldo crudo a 9600×g durante 30 minutos lo que permitió separar una fracción insoluble cuyo contenido es de 79,4 mg por cada 1 ml de caldo. El tratamiento del sobrenadante con sulfato de amonio condujo a la co-precipitación de proteínas y ácidos nucleicos según los análisis por electroforesis en agarosa y SDS-PAGE. En este sentido, los análisis por espectroscopia UV-Vis demostraron la presencia de compuestos con máximos de absorbancia cercanos a 260 nm. El contenido proteico del caldo crudo inicial es de 15,2 mg/ml que corresponde principalmente a CALB (33 kDa), según lo observado mediante análisis por SDS-PAGE. Dicha concentración se reduce hasta un 86 % luego de la separación de insolubles y hasta un 82 % luego de la precipitación con sulfato de amonio. En este contexto, se concluye que el caldo crudo contiene ácidos nucleicos y otras sustancias solubles (precipitables) en un contenido igual a 109,37 mg/ml.

PP-DB1

68

Preparación de a-halohidrinas, epóxidos y dioles quirales enantioméricamente puros en procedimientos “one pot”

con microorganismos extremófilos liofilizados

1 1 2 1Celeste Aguirre-Pranzoni , Alejandro A. Orden , Fabricio R. Bisogno , Carlos E. Tonn , Marcela

1Kurina-Sanz

pranzonica@gmail.com

1INTEQUI-CONICET, Fac. de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis.2INFIQC-CONICET, Fac. Cs. Qcas., Universidad Nacional Córdoba.

El aislamiento de microorganismos extremófilos a partir de emplazamientos específicos es una herramienta interesante como fuente de enzimas novedosas aplicables a procesos biotecnológicos.

El objetivo de este trabajo fue detectar y optimizar nuevos sistemas biocatalizadores a célula entera aplicables a la preparación, en procedimientos “one-pot” de halohidrinas, epóxidos y dioles quirales que son versátiles intermediarios para la síntesis de un vasto número de compuestos bioactivos [1]. Para alcanzar este objetivo se direccionó la búsqueda hacia microorganismos alcalófilos a partir de aislamientos realizados desde suelos dónde se vierten efluentes industriales que contienen hidrocarburos y poseen pHs alcalinos. Las cepas aisladas fueron seleccionadas en función de su capacidad de reducir 2-cloroacetofenona con excelente estereoselección (ee>99%) en un amplio rango de pH de manera poder obtener de tres productos quirales a partir de un mismo sustrato variando las condiciones del sistema de biorreacción como lo esquematiza la figura.

Una levadura fue escogida por sus buenas conversiones, optimizándose el procedimiento de manera de aumentar la tolerancia de sustrato, los rendimientos de producto aislado y el empleo de células enteras liofilizadas sin agregado de cofactores, lográndose un proceso muy conveniente desde el punto de vista biotecnológico.

Bibliografía

1.a)Breuer M.; Ditrich K.; Habicher T.; Hauer B.; Kesseler M.; Stürmer R.; Zelinski T. Angew. Chem. 2004, 116, 806-843; b) Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 788- 824

PP-DB2

Cl

O

* Cl

OH

OH

O

*

O

* OH

OH

Biocatalizador pH 6.5 KOH pH10

Biocatalizador KOH+

KOH pH12

Biocatalizador pH121-feniletano-1,2-diol

ee >99%

2-feniloxiranoee >99%

H2O 2-cloro-1-feniletanolee >99%

69

La yerba mate: un importante inductor de la actividad clorogenato

hidrolasa

1 1 2Ana P. Butiuk , Roque A. Hours , Osao Adachibutiuk@biotec.org.ar

La clorogenato hidrolasa (CHasa, EC 3.1.1.42) es la enzima que cataliza la hidrólisis del ácido clorogénico (ACG) liberando cantidades equimolares de ácidos quínico (AQ) y cafeico (AC). Es una enzima inducible producida por diferentes especies de Aspergillus cultivados en medios suplementados con materiales vegetales ricos en ACG [1]. Se ha reportado que los niveles de ACG en yerba mate (Ilex paraguarienses A. St. Hil) son muy altos, tal vez los mayores de cualquier vegetal (10% base seca) [2].

El objetivo del presente trabajo fue analizar la producción de CHasa por varias cepas fúngicas utilizando materiales derivados de la yerba mate (de diferentes etapas del procesamiento) como inductores de la actividad enzimática.

Se cultivaron diferentes cepas fúngicas (A. niger IFO 3302, A. sojae IFO 3312, A. kawachii IFO 4308 y una cepa silvestre aislada de yerba mate) en medio Czapek modificado, al cual se le adicionó 0,5% (p/V) de extracto acuoso concentrado de yerba mate (EYM) al final de la etapa exponencial de crecimiento. El micelio fue separado, lavado y desintegrado en buffer fosfato de sodio (NPB, pH: 6.5). La suspensión resultante fue centrifugada y el sobrenadante obtenido fue utilizado como fuente de CHasa. La actividad CHasa se evaluó semi-cuantitativamente por TLC utilizando ACG (Sigma) como patrón. La desaparición del ACG y la aparición de AC fueron examinadas bajo luz UV. Además, se evaluaron diferentes materiales derivados del procesamiento de la yerba mate como inductores en diferentes concentraciones: mate cocido instantáneo sin malto dextrina (-MD) y con malto dextrina (+MD), polvo de yerba mate (PD, residuo de la elaboración de yerba mate) y EYM (todos provistos por La Cachuera S.A., Argentina).

Todas las cepas fúngicas ensayadas presentaron actividad CHasa. Sin embargo, se seleccionó A. niger por presentar las manchas más intensas de AC en el TLC con las concomitantes reducciones en ACG. Los ensayos con diferentes cantidades de los inductores antes mencionados revelaron que las mayores actividades de CHasa correspondieron al agregado de 0.125% EYM y 1% -MD bajo las condiciones estudiadas. Un agregado de EYM mayor al 1% resultó en la inhibición de la actividad enzimática. No se detectó actividad CHasa en el micelio crecido en ausencia de inductor.

Los presentes resultados confirmaron que la yerba mate es un potente inductor de la actividad de CHasa fúngica.

Bibliografía

1. Adachi, O.; Ano, Y.; Akakabe, Y.; Shinagawa, E.; Matsushita, K. Appl. Microbiol. Biotech. 2008, 81, 143-151.2. Marques, V.; Farah, A. Food Chem. 2009, 113, 1370-1376.

1 Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI; UNLP, CONICET La Plata). Fac. de Cs. Exactas, UNLP. 47 y 115, (B1900ASH) La Plata, Argentina

2 Laboratory of Applied Microbiology, Department of Biological Chemistry, Faculty of Agriculture, Yamaguchi University, Yamaguchi 753-8515, Japan

PP-DB3

70

Inmovilización de peroxidasa y hematin sobre quitosano con glutaraldehído como agente acoplante

1 1 2Agostina Córdoba , Ivana Magario , María Luján Ferreira

agostinacordoba@gmail.com

Este trabajo presenta el estudio de inmovilización de peroxidasa del rábano picante (HRP) sobre hojuelas de quitosano a los fines de obtener un catalizador efectivo y reutilizable para su empleo en la decoloración de soluciones acuosas de colorantes fenólicos. En términos comparativos se incluyó en este estudio la inmovilización de la protoporfirina de hierro IX o hematin debido a que estudios previos en sistemas homogéneos han demostrado que constituye un sistema catalítico eficiente y de menor costo que mimetiza la acción peroxidativa de la enzima [1,2]. En ambos casos se empleó glutaraldehído como agente acoplante. La efectiva inmovilización de los catalizadores se determinó mediante medidas de actividad con los colorantes comerciales Rojo de Alizarina S y Naranja II. Por otro lado, se determinó la masa de catalizador soportado por espectrometría UV/Visible de las soluciones de sobrenadantes y de lavado. Se evaluó además la capacidad de adsorción de ambos colorantes sobre quitosano en las condiciones de reacción seleccionadas.

Las hojuelas de quitosano tratadas con glutaraldehído demostraron ser buen soporte para la inmovilización de hematin, alcanzando rendimientos de inmovilización de hasta 95 %; mientras que con HRP los rendimientos de inmovilización fueron apenas del 20 %. Hematin inmovilizado presentó una disminución de la actividad del 22 % en la decoloración de Naranja II y 56 % en el caso de Rojo de Alizarina S con respecto a los sistemas solubles. Por otro lado, HRP soportada demostró ser inactiva en la decoloración de Naranja II aunque se observó actividad en la decoloración de Rojo de Alizarina S.

La reacción entre glutaraldehído y hematin se estudió por medio de espectroscopia UV-Visible mediante la cual se observó un paulatino aumento de la absorbacia a 233 nm, lo que se asocia a la formación de enlaces C=C producto de la condensación aldólica de glutaraldehído [3]. Por otro lado, no se detectaron modificaciones en el espectro de Hematin descartando la presencia de enlaces que afecten la estructura de su sitio activo en exceso de glutaraldehído. La relación molar óptima de acoplante:hematin, obtenida en función del rendimiento de la inmovilización y la actividad del catalizador es de 2,4 a 1.

Bibliografía

1. Córdoba, A.; Magario, I.; Ferreira, M. L. J. Mol. Catal. A: Chem. 2012, 355, 44-60. 2. Córdoba, A.; Magario, I.; Ferreira, M. L. Int. Biodeter. Biodegr. Aceptado 7 de Mayo de 2012.3. Margel, S.; Rembaum, A. Macromolecules. 1980, 13, 19–24.

1 I + D + T + Q grupo vinculado a PLAPIQUI-CONICET. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales - Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba (CP: 5000), Argentina.

2 PLAPIQUI-UNS-CONICET. Universidad Nacional del Sur, Bahía Blanca (CP: 8000), Argentina.

PP-DB4

71

Inmovilización de Fructosiltransferasa sobre TiO para síntesis de 2

prebióticos

1 2 3,4 1,2Daniel H. Valdeón , Paula Z. Araujo , Mirta Daz , Nora I. Perottidanielvaldeon@gmail.com

1 2 3 4 PROIMI CONICET, Universidad Nacional de Tucumán, INIQUI , Universidad Nacional de Salta, San Miguel de Tucumán CP4000, Argentina

La fructosiltransferasa (EC. 2.4.1.9) es una enzima capaz de transferir fructosa de una molécula de sacarosa a otra molécula de sacarosa u otro oligosacárido produciendo fructooligosacáridos (FOS). Los FOS son compuestos considerados prebióticos porque estimulan el crecimiento de bacterias benéficas de la microbiota intestinal del individuo. La inmovilización de enzimas es una tecnología ampliamente utilizada en muchos campos, entre ellos el industrial, porque permite la reutilización de la enzima, mejora su estabilidad y posibilita el control automático de la reacción. Los objetivos del presente trabajo fueron evaluar el TiO como soporte 2

para la inmovilización de la enzima y obtener información relevante sobre la aplicación biotecnológica del biocatalizador para la producción de FOS.

La enzima utilizada en este trabajo se produjo por fermentación en medio liquido en un fermentador New Brunswick Serie 100 de 7 litros, utilizando el hongo Aureobasidium sp., ATCC 20524. La enzima fue parcialmente purificada a partir del caldo libre de células por diafiltración, precipitación con etanol y resuspendida en buffer citrato 0,1 mM pH 5,5. Para llevar a cabo la inmovilización se utilizó como soporte TiO (AEROXIDE P25 TiO , Evonik Degussa). Se estudió 2 2

la influencia de las siguientes variables en la inmovilización: pH en el rango de 3 a 8, la concentración de enzima de 500 a 1500 unidades y la presencia de las sales sales KCl, CaCl , 2

MgSO y ZnSO . Se estudió el comportamiento del derivado inmovilizado en las siguientes 4 4

condiciones de reacción: pH en el rango de 4 a 8, temperatura en el rango 30°C a 70°C y concentración de sacarosa en el rango de 5% a 60%. Además se evaluó la variación de la actividad del derivado inmovilizado en ciclos sucesivos de reacción con lavados intermedios. Se observó que a pH 7 no se inmoviliza la enzima y a medida que el pH se aleja, a valores superiores o inferiores a 7 empieza a inmovilizarse. En el rango ensayado, el máximo grado de inmovilización fue a pH 3, determinado como actividad del derivado. El aumento de unidades de enzima ofrecidas al soporte aumenta la cantidad de enzima inmovilizada pero disminuye la eficiencia de inmovilización. Se obtuvo un derivado inmovilizado con una actividad de 900 Unidades por gramo de TiO y una 2

actividad específica de 400 Unidades por miligramo de proteína inmovilizada. La presencia de las sales ensayadas afectó negativamente a la inmovilización de la enzima sobre el TiO .2

Respecto al comportamiento del derivado inmovilizado y comparándolo con la enzima libre, observamos que en las condiciones de pH, temperatura y concentración de sacarosa ensayadas, el derivado mantiene un comportamiento similar al de la enzima libre. En relación a la actividad en ciclos sucesivos de reacción se observó una disminución de actividad en el derivado, llegando al valor de actividad del 75% respecto a la actividad inicial, después de 8 ciclos.

Estos resultados preliminares permiten avizorar un interesante potencial de aplicación del óxido de titanio como soporte para inmovilizar fructosiltransferasa para la síntesis de FOS a partir de sacarosa.

PP-DB5

72

Investigación de la estructura y actividad proteolítica de papaína en medios acuoso orgánicos homogéneos a distintas temperaturas

1,2 2 3 1Carlos R. Llerena Suster , Carla José , Sebastián Collins , Laura E. Briand , Susana R.

2Morcelle

carlollzz@yahoo.com

1 Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias Aplicadas-Dr. Jorge J. Ronco. Universidad Nacional ode La Plata, CONICET, CCT La Plata. Calle 47 N 257, B1900AJK La Plata, Buenos Aires, Argentina.

2 Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales (LIPROVE), Depto. de Cs. Biológicas, Fac. Cs. Exactas, Universidad Nacional de La Plata, Calle 47 y 115, La Plata, Argentina.

3 Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química INTEC, Universidad Nacional del Litoral, CONICET, Güemes 3450, 3000 Santa Fe, Santa Fe, Argentina

Se estudió la estabilidad de papaína en mezclas acuoso-orgánicas mediante determinaciones de actividad residual y distintos análisis espectroscópicos (fluorescencia y FTIR-ATR). Los sistemas investigados contenían acetonitrilo (ACN), metanol (MeOH) y dimetilformamida (DMF) con 1 ó 10% (V/V) de buffer acuoso (pH 8,0). Se evidenció que, en presencia de ACN, la papaína retiene prácticamente toda su actividad catalítica luego de 24 h. de incubación a 298 K y que, al mismo tiempo, adquiere una conformación más compacta. En MeOH, en cambio, la papaína sufrió una importante pérdida de actividad (80%) después de 24 h de incubación a 298 K, pero no se observaron cambios importantes en su estructura secundaria. Esto sugiere que los cambios se localizaron cerca del sitio activo. En DMF se observó una pérdida total de actividad, comprobándose la aparición de cambios irreversibles en su estructura mediante espectros de fluorescencia, y un incremento moderado en las estructuras lámina b y giros b, evidenciados mediante los análisis por FTIR-ATR. En todos los casos se observó que los solventes orgánicos produjeron una estructura más rígida y compacta en la papaína. Estas modificaciones afectarían el sitio activo en los casos de MeOH y DMF.

Por otra parte, se analizaron los efectos del calentamiento a 353°K sobre la estructura secundaria. No se encontraron diferencias apreciables en el contenido de hélices a y láminas b, cuando el solvente es buffer acuoso, mientras que en las mezclas con ACN se observó una leve disminución en ambas estructuras y un aumento en los agregados. En MeOH y DMF, sin embargo, se pudo demostrar que las estructuras hélices a son menos estables con la temperatura que las láminas beta y que cambian a estructuras agregadas.

PP-DB6

Estructura Secundaria Papaína 298K - 353K

0

10

20

30

40

50

Buffer pH8 ACN 90% ACN 99% MeOH 90% MeOH 99% DMF 90% DMF 99%

Po

rce

nta

je

298 K 353 K hélices a láminas b agregados

73

Fotobiocatálisis con peroxidasa de rábano y nanopartículas de CdS inmovilizadas en SBA-15

Abelmar López, Laritza Avendaño, Osnelda Villegas, Eduardo Torres eduardo.torres@correo.buap.mx

En este trabajo se inmovilizó a la enzima peroxidasa de rábano y nanopartíiculas de CdS inmovilizadas en el material SBA-15 para generar un nanobiocatalizador activado por luz. El material y las nanopartículas fueron sintetizadas y caracterizadas por FTIR, y microscopia de transmisión electrónica. El material presentó un tamaño de poro de 6.7 nm, un área específica de

2 3935 m /gr y un volumen de poro de 1.1 cm /gr. Las nanopárticulas presentaron un diámetro de 5 nm. Las nanopartículas semiconductoras de sulfuro de cadmio generan radicales libres de oxigeno bajo irradiación ultravioleta, los cuales pueden activar diversas enzimas oxidativas para catalizar la oxidación de diversos sustratos, según lo reportado previamente [1,2]. El nanobiocatalizador producido fue catalíticamente activo al ser irradiado con luz ultravioleta, 365 nm, en presencia del sustrato modelo amplex red. (Figura 1a) Además, el progreso de la reacción pudo ser modulado por al apagado y encendido de la lámpara (Figura 1b), lo cual no puede ser logrado con un sistema en solución usando el peróxido de hidrógeno como agente oxidante (sustrato natural de las peroxidasas). La enzima inmovilizada y activada por luz mostró una eficiencia catalítica (k /K ) cat M

10 veces mayor comparada a la enzima libre.

Figura 1. Oxidación del amplex red por el nanobiocatalizador activado por luz. (a) Aparición del producto de oxidación a diferentes tiempos de reacción, (b) cinética de reacción

irradiando con luz continua y a intervalos de apagado-encendido

Bibliografía

1. Fruk, L.; Rajendran, V.; Spengler, M.; Niemeyer, C. M. Chem. BioChem. 2007, 8, 2195 – 2198.2. Gandubert, V. J.; Torres, E.; Niemeyer, C. M. J. Mater. Chem. 2008, 18, 3824–3830.

Labaratorio de Bioinorgánica Aplicada, Centro de Química, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla (72530), México

PP-DB7

74

Diseño de biocatalizadores de Candida antarctica Lipasa B

(CALB) inmovilizada sobre nanopartículas magnéticas

1 2 1Paula Nicolás , Verónica Lassalle y María Luján Ferreirapnicolas@plapiqui.edu.ar

Las lipasas son un grupo de enzimas capaces de catalizar diversos tipos de reacciones químicas, tales como hidrólisis, esterificaciones, alcohólisis, entre otras. La inmovilización de la enzima en diferentes soportes permite su fácil remoción del medio de reacción, el reuso de biocatalizador y el incremento de la estabilidad, entre otros beneficios que no se consiguen empleando la enzima libre [1]. El uso de un soporte con propiedades magnéticas potencia fundamentalmente las posibilidades de reuso facilitando la remoción mediante aplicación de un campo magnético de moderada intensidad mientras que el tamaño nano tiene influencia sobre la actividad [2].

El objetivo de este trabajo es inmovilizar CALB sobre nanopartículas (NPs) de magnetita (Fe O ) modificadas con ácido oleico (AO) y quitosano (QUIT). Las NPs preparadas debieron 3 4

tratarse con glutaraldehído (GLUT) para evitar su degradación durante la inmovilización. Se caracterizó el soporte mediante FTIR-DRIFTS, espectroscopía de absorción atómica, dispersión de luz dinámica para determinar tamaños de partícula y medidas de potencial Z. Las mismas técnicas de caracterización fueron empleadas para caracterizar CALB inmovilizada.

La inmovilización de realizó por adsorción simple de CALB, dispersando el soporte en una solución acuosa de la enzima mediante agitación magnética a temperatura ambiente durante 7 horas. Se hallaron diferencias en el tamaño y potencial Z atribuibles a la presencia de la lipasa (Tabla 1). La performance del biocatalizador preparado fue testeada en la reacción de obtención de oleato de etilo a partir de ácido oleico y etanol en condiciones ya estudiadas, registrándose una conversión del 64% a las 3 hs de reacción. Estos resultados son altamente promisorios si se comparan con biocatalizadores comerciales como Novozym435, ya que la conversión de equilibrio en condiciones similares es del 82 % a 45 C [3].

Tabla 1. Potencial Z y Dh del catalizador y el soporte.

Bibliografía 1. Foresti, M. L.; Valle, G.; Bonetto, R.; Ferreira, M. L.; Briand, L. E. Appl. Surf. Sci. 2010, 256, 1624–1635.2. Marszałł, M. P.; Siódmiak, T. Catal. Commun. 2012, 24, 80–84.3. Tesis Dra. María Laura Foresti, 2006, PLAPIQUI-UNS-CONICET, Bahía Blanca.

1 Planta Piloto de Ingeniería Química, UNS-CONICET, Bahía Blanca (8000), Argentina2Instituto de Química del Sur, UNS-CONICET, Bahía Blanca (8000), Argentina

Muestra Diámetro hidrodinámico (nm) Dh Potencial Z (mV)

Fe3O4.AO 689 -20.8

Fe3O4.AO.QUIT 697 -16.6 Fe3O4.AO.QUIT.GLUT 1212 -23.4

Fe3O4.AO.QUIT.GLUT.CALB 1177 +10.4

PP-DB8

75

Efecto de sustratos xenobióticos sobre biocatalizadores vegetales:

inducción de muerte celular programada

1 1 2 1Abi L. Anello , María L. Mascotti , Alicia S. Molina , Marcela B. Kurina-Sanz y Alejandro A. 1Orden

abi_la_88@hotmail.com

1INTEQUI-CONICET, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis,

En trabajos previos se demostró que los cultivos de células vegetales indiferenciadas provenientes de varias especies recolectadas de la región de Cuyo (Argentina), particularmente de un arbusto conocido como Tessaria absinthioides, presentaron una interesante actividad enzimática en la reducción de acetofenona y otras cetonas proquirales a sus correspondientes S-alcoholes. En general, el estudio de las reacciones biocatalíticas a célula entera se centra en las conversiones, selectividades y rendimientos de las mismas. Poco se conoce sobre los efectos que ejercen los compuestos xenobióticos en el metabolismo a nivel celular y molecular. Está claro que su naturaleza química y las concentraciones utilizadas pueden afectar no sólo la actividad enzimática específicamente buscada, sino también la fisiología y bioquímica de las células. Varios estudios permiten evaluar la influencia que tienen estos y otros factores de estrés sobre modelos vegetales. En este trabajo, estudiamos la posible inducción de muerte celular programada (PCD) en células indiferenciadas de T. absinthioides utilizadas como biocatalizadores para la reducción asimétrica de cetonas proquirales.

Para evaluar la inducción de PCD en células tratadas con diferentes concentraciones de metilfenilcetonas, se realizó el análisis de la integridad del ADN por electroforesis en gel de agarosa. En dicha técnica se observa la presencia de fragmentos de ADN múltiplos de 180 pb en forma escalonada (conocido como DNA laddering) en células que han desencadenado este mecanismo de muerte [1, 2].

En base a los resultados obtenidos, se concluye que las concentraciones de acetofenona y derivados sustituídos en el anillo aromático que indujeron PCD son significativamente superiores a las empleadas en las reacciones de biotransformación optimizadas, observándose, cuando esto ocurre, la pérdida total de la capacidad biocatalítica de las células.

Bibliografía

1. Orden, A.; Bisogno, F.; Giordano, O.; Kurina-Sanz, M. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2008, 51, 49-55.2. Palavan-Unsal, N.; Buyuktuncer, E. D.; Tufekci, M. A. J. Cell Mol. Biol. 2005, 4, 9-23.

Chacabuco y Pedernera, San Luis (5700), Argentina.2 Área Química Biológica, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San

Luis, Chacabuco y Pedernera, San Luis (5700), Argentina.

PP-DB9

76

Desarrollo de una estrategia de ¨cell display¨ de la fosfotriesterasa de B. diminuta para su uso en la selección de aptámeros

1 1 1,2Julieta Bertana Lahourcade , Elizabeth Lewkowicz , Adolfo Iribarren y

3Eduardo García-Junceda

jbertana@unq.edu.ar

1Laboratorio de Biotransformaciones, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de

Quilmes, Bernal, Buenos Aires (1876BXD), Argentina.2Laboratorio de Química de Ácidos Nucleicos, Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y

Biología Molecular, CONICET-UBA, Buenos Aires (DNA1428), Argentina.3Departamento de Química Bio-Orgánica, Instituto de Química Orgánica General, CSIC, Madrid

(28006), España.

Los aptámeros son oligonucleótidos a base ARN o ADN simple cadena que forman

estructuras con alta especificidad y afinidad por una gran variedad de blancos, en especial

proteínas. Se obtienen a partir de una metodología de selección in vitro denominada SELEX

(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) [1] que consiste en una sucesión de

pasos que comprenden ciclos de selección-amplificación.

El blanco debe ser adecuadamente purificado e inmovilizado para permitir los procesos de

selección, siendo este paso en muchos casos problemático. Recientemente se han seleccionados

aptámeros utilizando células enteras (Cell-SELEX) [2], permitiendo conservar la conformación

nativa de las proteínas de membranas. Los aptámeros representan una alternativa real a los

anticuerpos monoclonales.

En el presente trabajo se propone como objetivo generar un sistema modelo que permita

exponer sobre la superficie celular una molécula blanco. Dicho modelo está basado en la

sobreexpresión del gen opd (organophosphate-degrading) de Brevundimonas diminuta que

codifica para una fosfotriesterasa (PTE) asociada a la membrana plasmática interna y expuesta al

espacio periplásmico. Para direccionar la PTE a la superficie celular se utilizó un sistema de anclaje

derivado de la proteína INAV de Pseudomonas syringae [3]. Para ello se clonó el extremo N- y C-

terminal del gen inaV fusionado al gen opd. Dicha construcción, clonada en el vector pET28b(+) se

sobreexpresó en células E. coli BL21. Se confirmó la identidad de la proteína fusión por análisis de

la huella peptídica mediante espectrometría de masas MALDI TOF. Además, se comparó la

actividad fosfotriesterasa de las células conteniendo la enzima sobreexpresada con la de la cepa

wild type de B. diminuta utilizando como modelo la hidrólisis de paraoxón. Cabe destacar que la

estrategia de “cell display” también puede ser utilizada en la biotransformación de compuestos

organofosforados.

Agradecimientos. Este trabajo ha sido financiado por la Comunidad Autónoma de Madrid

(S2009/PPQ-1752) y por la Universidad Nacional de Quilmes. Julieta Bertana Lahourcade ha

recibido financiación de la Fundación Boehringer Ingelheim. Nestlé Research Center aportó el

plásmido pDP245.

Bibliografía

1. Tuerk, C.; Gold, L. Science 1990, 249, 505–510.

2. Shamah, S.; Healy, J.; Cload, S. Accounts Chem. Res. 2008 41,130-138.

3. Shimazu, M.; Mulchandani, A.; Chen, W. Biotechnol 2001, 17, 76-80.

PP-DB10

77

Oxidação de álcoois por lacase imobilizada em nanosílica via LMS (Laccase Mediator System)

1 1 1Luiz A. Zampieri , Dávila S. Zampieri , Bruno R.S. de Paula, Paulo J. M. Moran , 1J. Augusto R. Rodrigues

arthur@iqm.unicamp.br

Lacases catalisam a redução de dioxigênio para água pela transferência de 4 elétrons, apresentando larga faixa de substrato, o que lhes confere importância para aplicações

1biotecnológicas e podendo ter sua aplicação expandida para compostos mais difíceis de oxidar 2 através da adição de mediadores, formando o sistema LMS (Laccase Mediator System. Os

biocatalisadores foram preparados através de funcionalização da nanosílica utilizando APTES (aminopropiltrietoxisilano), seguido da formação de ligações cruzadas entre a enzima e o suporte,

3utilizando glutaraldeído como reagente bifuncional, numa única etapa. Os biocatalisadores foram utilizadas nas reações de oxidação dos álcoois anísico (Figura

1), 2,4-dimetoxibenzílico e piperonílico, utilizando TEMPO (N-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina) como mediador, produzindo os aldeídos correspondentes.

Figura 1. Exemplo de oxidação de álcool primário por LMS utilizando TEMPO

As reações foram feitas em 4 ciclos reacionais de 48 horas, reutilizando os biocatalisadores em reações sucessivas (Tabela 1). Para o álcool anísico foram feitas reações até o 10º ciclo reacional (Tabela 2).

Tabela 1. Porcentagem de formação do aldeído correspondente até o 4º ciclo reacional

Tabela 2. Porcentagem de formação do aldeído anísico após o 5º ciclo reacional

Os biocatalisadores preparados foram caracterizados por microscopia eletrônica de varredura e as reações foram acompanhadas por GC/MS.

Bibliografía

1. Arends, I. W. C. E.; Li, Y. X.; Ausan, R.; Sheldon, R. A. Tetrahedron 2006, 62, 6659-6665.2. Potthast, A.; Rosenau, T.; Chen, C. L.; Gratzl, J. S. J. Org. Chem. 1995, 60, 4320-4321.3. Zimmermann Y. S.; Shahgaldian P.; Corvini, P. F. X.; Hommes G. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, 92, 169-178.

1LaBioSin, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CP. 6154, CEP 13083-970, Campinas, São Paulo, Brasil.

M eO

O H N an o S i-L acase

T E M P OM eO

O

Álcool 1º uso 2º uso 3º uso 4º uso anísico 100 80 73 37

2,4-dimetoxi-benzílico

100 80 67 57

piperonílico 41 10 10 4

Álcool 5º uso 6º uso 7º uso 8º uso 9º uso 10º uso anísico 39 31 31 30 17 17

PP-DB11

78

Redução de α-haloenonas por células imobilizadas de Saccharomyces cerevisiae

1 1 1 1Dávila S. Zampieri , Luiz A. Zampieri ,Bruno R. S. de Paula , J. Augusto R. Rodrigues , Paulo 1J. S. Moran

davila@iqm.unicamp.br

A utilização de células íntegras em biocatálise representa uma maneira elegante na obtenção de produtos da química fina e tem a vantagem da reciclagem do cofator nas reações que envolvam as oxidoredutases. Os processos industriais visam bons rendimentos na formação do produto de interesse, preparação simples dos catalisadores e baixo custo, tornando a imobilização de células uma técnica atrativa[1].

Neste trabalho, as células de S. cerevisiae foram imobilizadas em esferas de alginato e também em esferas de alginato revestidas com quitosana. As esferas preparadas com alginato foram utilizadas nas reduções de 1a e 1b, produzindo as haloidrinas 3a e 3b, em conversões de 82% e 90% respectivamente determinadas na fase aquosa, e com excessos enantioméricos (ee)>99%, após 12 horas de reação. Utilizando-se as esferas de alginato revestidas com quitosana, as reduções de 1a e 1b levaram à formação das halocetonas 2a e 2b, em conversões de 82 % (88% ee) e 26 % (87% ee) respectivamente determinadas na fase aquosa, após 12 horas de reação.

A imobilização das células de S. cerevisiae permitiu o controle quimioseletivo do processo, além de contornar outros problemas observados quando estas mesmas reações foram realizadas com células livres, como a toxicidade destes substratos halogenados [2] e a ocorrência da desalogenação dos substratos 1a e 1b.

Esquema 1. Reduções mediadas por células de S. cerevisiae imobilizadas.

Bibliografía

nd1. Guisán, J. M. (Edited by), Immobilization of Enzymes and Cells, 2 edition, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2006.2. Zampieri, D. S.; Zampieri, L. A.; de Paula, B. R. S.; Rodrigues, J. A. R.; Moran, P. J. S. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2011, 72, 289-293.

1LaBioSin, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CP. 6154, CEP 13083-970, Campinas, São Paulo, Brasil.

PP-DB12

79

Uso de cultivos microbianos de alta densidad para la optimización de la producción de cis-ciclohexadienodioles como materiales de partida

para síntesis enantioselectivas

M. Agustina Vila, Gustavo Seoane, Sonia Rodríguez, Ignacio Carreraavila@fq.edu.uy

La oxidación de compuestos aromáticos mediada por dioxigenasas bacterianas es una importante transformación que da lugar a cis-ciclohexadienodioles enantioméricamente puros (Fig. 1) [1]. Dichos dioles han sido extensamente utilizados como material de partida en diversas rutas sintéticas enantioselectivas para la obtención de complejas moléculas bioactivas [1].

En la literatura aparecen reportados varios organismos recombinantes construidos para la expresión del complejo enzimático Tolueno Dioxigenasa (TDO). El microrganismo más utilizado para la obtención en cantidades preparativas de dioles a escala de fermentador es la cepa recombinante de E. coli JM109 (pDTG601A) [2]. Sin embargo, hasta el momento no se ha elaborado un estudio sistemático de las condiciones de cultivo y biotransformación para la producción eficiente de dioles utilizando dicha cepa.

En el siguiente trabajo presentamos un estudio de la optimización de la producción de cis-ciclohexadienodioles evaluando el crecimiento del microorganismo en cultivos de alta densidad, su actividad enzimática y la toxicidad de los sustratos en una escala de fermentador de 5L. Se presentan también los resultados obtenidos en cuanto a la biotransformación de diferentes sustratos y estrategias para aumentar los rendimientos de dioles obtenidos.

Respecto a la etapa de crecimiento se logró obtener una concentración celular de 51.7g de -1biomasa/L con una velocidad específica de crecimiento promedio de 0.23h . En cuanto a la etapa de

biotransformación de bromobenceno, los parámetros calculados indican una productividad volumétrica Q = 12.3g de diol/h, una velocidad específica de formación de producto q = 0.07g de p p

diol/g biomasa.h y un coeficiente de rendimiento Y = 0.33g de diol/g de biomasa.p/x

Figura 1. Producción de cis-ciclohexadienodioles como materiales de partida para síntesis enantioselectivas.

Bibliografía

1. Reed, J. W.; Hudlicky, T. Synlett. 2009, 5, 0685-0703.2. Hudlicky, T.; Gonzalez, D.; Gibson, D. T. Aldrichimica Acta 1999, 32, 35-60.

Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones, Departamento de Química Orgánica, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo 11800 Uruguay.

PP-DB13

80

Mejora en la actividad y la estabilidad de la lipasa de Alcaligenes sp. inmovilizada covalentemente en sílicas porosas

Claudia Bernal, Andrés Illanes y Lorena Wilsonclaudia.bernal@ucv.cl

Las enzimas inmovilizadas en soportes porosos son biocatalizadores que pueden ser muy importantes para la industria química [1]. El diseño del proceso de inmovilización debe tener en cuenta las propiedades funcionales del biocatalizador, las propiedades mecánicas del soporte y la relación costo-eficiencia del proceso. Las sílicas porosas como soportes, ofrecen características especiales debido a su gran área superficial, porosidad jerárquica, química de superficie adaptable, estabilidad térmica y mecánica, no toxicidad y alta resistencia a ataques microbianos y solventes orgánicos [2].

En este trabajo se utilizó sílica meso-macroporosa para la inmovilización covalente multipuntual de la lipasa de Alcaligenes sp (QL). Esta lipasa es altamente termoestable y ha sido utilizada como catalizador en la reacción de acilación de alcoholes primarios y secundarios, además de la fabricación de intermediarios y productos para la industria farmacéutica, sin embargo no ha sido muy estudiada puesto que, en los soportes típicos, su inmovilización no es muy efectiva [3].

Se evaluó la carga enzimática, la actividad expresada y la estabilidad térmica de biocatalizador final según el tipo de derivatización química, tanto del soporte como de la enzima. De acuerdo a las características estructurales de esta lipasa, la aminación de la enzima fue necesaria para obtener un catalizador activo y estable cuando el soporte empleado fue sílica-glioxyl (9 mg proteina/ g soporte y 130 U/g). Por el contrario en sílica octil-epóxido, la lipasa se inmoviliza y se hiperactiva hasta en 260%, sin necesidad de modificaciones adicionales (16 mg proteina/ g soporte y 332 U/g). La estabilidad a 60ºC mejora con la inmovilización en ambos soportes, sin embargo la estabilización es mayor cuando la lipasa es inmovilizada en el soporte sílica octil-epóxido (tiempo de vida media: 138h) en comparación con el soporte sílica-glioxil (tiempo de vida media: 14h).

La mejora en las propiedades enzimáticas de la lipasa QL cuando es inmovilizada, se atribuye a las características de la sílica y a la orientación específica de la enzima en cada soporte, mostrando a este material como un soporte prometedor para obtener biocatalizadores con altas actividades enzimáticas y estabilidades mayores a los obtenidos a través de metodologías convencionales.

Bibliografía

1. Díaz, I.; Blanco, R. M. Curr. Chem. Biol. 2012, 6, 60-69.2. Popat, A.; Hartono, S. B.; Stahr, F.; Liu, J.; Qiao, S. Z.; Lu, G. Q. Nanoescale 2011, 3, 2801-2818.3. Wilson, L.; Palomo, J. M.; Fernández-Lorente, G.; Illanes, A.; Guisán, J. M. Enzyme Microb. Technol. 2006, 39, 259–264.

Escuela de Ingeniería Bioquímica, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, P.O. Box 4059, Valparaíso, Chile

PP-DB14

81

Caracterización de perlita expandida y perlita expandida modificada utilizada para inmovilizar a-amilasa de A.oryzae

Juan J. Rodríguez Zotelo; Fernando Soria; Hugo Geronazzo; Hugo Destefanisjrodriguez@unsa.edu.ar

INIQUI– CONICET, Universidad Nacional de Salta, Av. Bolivia Nº 5150, Salta (Código Postal 4400) – Argentina.

La perlita es un vidrio volcánico de alto contenido en sílice y álcalis, con muy bajos tenores de Fe, Ca y Mg, que puede expandirse cuando se expone a altas temperaturas. La inmovilización de proteínas en materiales sólidos inorgánicos permite su reutilización, facilita la separación del biocatalizador de la mezcla de reacción, evitando la contaminación del producto. La ventaja del uso de la perlita expandida en la inmovilización de proteínas reside en que este material es altamente disponible, de bajo costo, de gran estabilidad térmica y mecánica, carece de toxicidad y presenta alta resistencia al ataque microbiano. La α-amilasa fue elegida por su importancia industrial en la hidrólisis del almidón. También es utilizada conjuntamente con la glucoamilasa en la obtención de glucosa

En el presente trabajo se utilizo PE (perlita expandida) como material de partida. El proceso de expansión se llevó a cabo en un horno de lecho fluido a 1000 ºC, obteniéndose la PE que fue usada directamente como soporte. Además la PE fue sometida a un tratamiento con colorante HE3B (PE-HE3B). Ambos soportes PE y PE-HE3B fueron caracterizados por: IR, SEM, distribución de poros y superficie específica. Estos materiales fueron usados para inmovilizar por unión covalente, previa activación con APTES (Aminopropiltrietoxisilano) y GA (glutaraldehído), -amilasa de A. oryzae (comercial). Los catalizadores obtenidos fueron a su vez caracterizados. La cantidad de proteína fijada en los diferentes soportes se determinó, por el método de Lowry, por la diferencia entre la cantidad de proteína ofertada y la contenida en la solución sobrenadante resultante de la inmovilización. El pH óptimo para la enzima inmovilizada fue medido en un rango de pH entre 4.5 y 8.5 usando buffer Na HPO /ácido cítrico a 50°C. La temperatura de máxima 2 4

actividad para la enzima inmovilizada fue determinada midiendo la actividad (en buffer fosfato de sodio 20 mM pH 5,5) en el rango de 30° a 70°C. La actividad de cada derivado inmovilizado (reuso) se midió siete veces después del primer ensayo de actividad. Entre cada determinación los derivados fueron separados y lavados con buffer fosfato de sodio pH 5.5.

Los resultados de las técnicas utilizadas para caracterizar los soportes muestran diferencias apreciables. La PE-APTES y PE-HE3B-APTES, retuvieron cantidades máximas de 2.6 y 2.1 g de proteína por mg de soporte, actividades de 0.3320 y 0.3160 Kat/mg soporte y actividades específicas de 0.1290 y 0.1490 Kat/mg soporte, respectivamente al aumentar la cantidad de proteína ofertada (20 g de proteína por mg de soporte). El pH óptimo de -amilasa de A.oryzae inmovilizada en ambos soportes resultó de 5.50 y la temperatura de máxima actividad para la enzima inmovilizada en PE-HE3B-APTES fue 50°C y 55°C para la enzima inmovilizada en PE-APTES. Se comparó con el pH óptimo y la temperatura de máxima actividad de la enzima libre. La actividad de los catalizadores obtenidos disminuyó aproximadamente 40% al séptimo reuso.

PP-DB15

82

Preparación de materiales compuestos poliestireno-divinilbenceno con diatomea y arcilla Pj y su aplicación en la

inmovilización de biomoléculas

1 1 1 2Juan J. Rodríguez Zotelo ; Fernando Soria ; Hugo Geronazzo ; Mariana Cabrera ;

1Hugo Destefanis

jrodriguez@unsa.edu.ar

1 INIQUI– CONICET, Universidad Nacional de Salta, Av. Bolivia Nº 5150. Salta (Código Postal 4400) – Argentina.

2 LIKA; Universidad Federal de Pernambuco, Av. Prof. Moraes Rego, S/N, Recife/PE CEP: 50670-901, Recife – Brasil

Los polímeros obtenidos a partir de emulsiones de alta fase interna (HIPE, High Internal Phase Emulsions) tienen características especiales ya que poseen grado de porosidad y entrecruzamiento, son rígidos, no aumentan el volumen en presencia de solventes y presentan cavidades de gran tamaño que permiten inmovilizar enzimas u otras biomoléculas. El uso de enzimas a gran escala está limitado por su inactivación y su elevado costo de producción. En este trabajo se estudió la preparación de materiales compuestos adicionando diatomea y arcilla durante la síntesis de un copolímero poliestireno-divinilbenceno. Los polímeros porosos fueron caracterizados (FTIR y SEM) y utilizados para la inmovilización de -amilasa de A. oryzae comercial.El polímero se preparó mezclando 0.3 mL de divinilbenceno (DVB), 2.7 ml de estireno y 0.6 ml de Tween 80. Se agitó durante 10 minutos y se agregó 10.8 ml de persulfato de potasio 0.025

-1g ml (caudal: 0,80 ml/min.) para continuar agitando 10 minutos más. Posteriormente se agregó Diatomea (tamaño de malla 80/140) al 1.74 % p/V y se continuó con la agitación durante 10 minutos para luego polimerizar a 80°C durante 6 horas. Se enfrió, filtró y secó la muestra a 50°C durante 12 horas. El mismo procedimiento se utilizó cuando se incorporó a la síntesis de Poliestireno-DVB: arcilla Pj. Las muestras fueron caracterizadas por FTIR y SEM. Previo a la inmovilización de la enzima, las muestras (Poliestireno-DVB:Diatomea y Poliestireno-DVB:Pj) fueron activadas tomando fracciones de 20 mg que se pusieron en contacto con 1 ml de glutaraldehído (GA) al 5% V/V en agua durante dos horas a 25ºC y 20 rpm. Para inmovilizar la enzima, a las fracciones de soporte activadas se les agregó 1 ml de solución de -amilasa A. oryzae

-1(1.62 mg ml de proteína) en 20 mM de buffer de fosfatos de pH 5.5 incubados durante 16 horas a 20°C y 20 rpm. La actividad de α-amilasa fue determinada usando almidón como sustrato y el progreso de la reacción se siguió midiendo la cantidad de maltosa producida por el ensayo del DNS. El pH óptimo para la enzima inmovilizada fue determinado en un rango de pH entre 4.5 y 8.5 usando buffer Na HPO / acido cítrico a 50°C. La temperatura de máxima actividad para la enzima 2 4

inmovilizada fue determinada midiendo la actividad a diferentes temperaturas entre 30° y 70°C. Además la actividad de cada derivado inmovilizado se midió diez veces. Entre cada determinación los derivados fueron separados y lavados con buffer fosfato de sodio 20 mM, pH 5,5.

La espectroscopia FTIR y SEM revelaron la incorporación de la Diatomea y arcilla Pj al polímero. El pH óptimo de -amilasa de A. oryzae inmovilizada en ambos soportes resultó de 5.5 y la temperatura de máxima actividad fue de 60°C y 50°C para la enzima inmovilizada en Poliestireno-DVB: Diatomea y Poliestireno-DVB:Pj, respectivamente.

PP-DB16

83

Clonado y caracterización de biocatalizadores tipo Baeyer-Villiger monooxigenasa para síntesis orgánica

1 1 2 2Romina D. Ceccoli , Aneley N. Montaner , Marcela Amongero , Dario A. Bianchi y Daniela V. 1Rial

rominaceccoli@gmail.com

Los procesos biocatalíticos son cada vez más aceptados por el sector académico y el industrial fundamentalmente debido a las ventajas ambientales, metodológicas y económicas que surgen del uso de procesos sustentables. Una estrategia moderna para llevar a cabo transformaciones químicas de moléculas de interés es el empleo de enzimas, células o microorganismos enteros nativos o recombinantes como biocatalizadores y así aprovechar la alta eficiencia y notable selectividad de los mismos. Las Baeyer-Villiger monooxigenasas (BVMOs) constituyen una poderosa herramienta para la obtención de lactonas y ésteres a partir de cetonas [1, 2]. Las lactonas son intermediarios claves para la elaboración de compuestos potencialmente bioactivos y productos naturales [3].

A fin de expandir las alternativas para síntesis química hemos realizado la búsqueda y el análisis bioinformático de flavin-monooxigenasas de diversos orígenes. Hemos clonado una secuencia codificante para BVMO de Leptospira biflexa y dos de Streptomyces coelicolor. Además, hemos optimizado las condiciones de expresión en Escherichia coli. Hemos analizado la presencia de las BVMOs de S. coelicolor en forma soluble e insoluble, y evaluado el efecto de la expresión conjunta de varios sistemas de chaperones moleculares. Sin bien las BVMOs de S. coelicolor fueron clonadas y expresadas previamente [4], de acuerdo a nuestro conocimiento sus perfiles de sustrato aún no han sido caracterizados en detalle. Cuando se analizó la expresión de la BVMO de L. biflexa en E. coli BL21(DE3) se detectaron cantidades similares de proteína recombinante en las fracciones soluble e insoluble. Asimismo, hemos comenzado a estudiar sus capacidades biocatalíticas mediante ensayos de biotransformación de cetonas con diferentes estructuras en sistemas de células enteras. Hasta el momento, hemos encontrado que células de E. coli que sobreexpresan la BVMO de L. biflexa son capaces de oxidar la cetona lineal 2-pentanona. Agradecimientos: Este trabajo recibió apoyo financiero de ANPCyT (PICT 2009-0088). D.V.R. y D.A.B. son miembros de la Carrera del Investigador Científico y Tecnológico de CONICET, R.D.C. y M.A. son becarias postdoctorales de CONICET.

Bibliografía

1. Torres Pazmiňo, D. E.; Winkler, M.; Glieder, A.; Fraaije, M. W. J. Biotechnol. 2010, 146, 9-24.

2. Rial, D. V.; Mihovilovic, M. D. Chimica Oggi/Chemistry Today 2008, 26, 19-22.3. Mihovilovic, M. D.; Bianchi, D.A.; Rudroff, F. Chem. Comm. 2006, 3214-3216.4. Park, J.; Kim, D.; Kim, S.; Kim, J.; Bae, K.; Lee, C. J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17, 1083-1089.

1Área Biología Molecular, Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Suipacha 531, S2002LRK, Rosario, Argentina.

2Instituto de Química Rosario (CONICET-UNR), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Suipacha 531, S2002LRK, Rosario, Argentina.

PP-DB17

84

Desarrollo de un biocatalizador en fase sólida por inmovilización covalente reversible de lacasa de Trametes villosa en tiolsulfinato-agarosa

1,2 1 1 2Larissa Gioia , Carmen Manta , Karen Ovsejevi , Pilar Menéndezlgioia@fq.edu.uy

La enzima lacasa (EC 1.10.3.2, p-difenol: oxígeno oxidoreductasa) forma parte del complejo ligninolítico extracelular de los basidiomicetos de la podredumbre blanca de la madera. Actúan sobre un amplio rango de sustratos, catalizando la oxidación de varios compuestos ricos en electrones como orto y paradifenoles, aminofenoles, polifenoles, poliaminas y aminas aromáticas, utilizando al oxígeno molecular como aceptor de electrones; además en presencia de mediadores redox es capaz de oxidar otros compuestos que presentan potenciales redox mas altos o una estructura que no les permite acceder al sitio activo de la enzima [1]. Esta baja especificidad respecto al sustrato sumado al hecho de que no requiere cofactores para su actividad catalítica, determinan que la lacasa sea una excelente herramienta para el desarrollo de diversos procesos biotecnológicos e industriales.

El empleo de lacasas en forma soluble presenta algunos inconvenientes que pueden solucionarse mediante la inmovilización de la misma. Este proceso puede lograr aumentar la estabilidad, facilitar su separación de los productos de reacción y además posibilitar el diseño de procesos continuos que permitan el reúso de la enzima [2].

En este trabajo se presenta el desarrollo de un biocatalizador insoluble en base a lacasa de Trametes villosa inmovilizada en forma covalente reversible a tiolsulfinato agarosa. Esta metodología implica la formación de un puente disulfuro entre grupos tiol de la enzima y grupos tiol-reactivos del soporte, lográndose una unión fuerte que alarga la vida útil del biocatalizador y posibilita el reúso de la matriz luego que el derivado insoluble pierde su actividad. La ausencia de SH nativos en la enzima no es un impedimento para el empleo de esta metodología, ya que los mismos pueden generarse por reducción de disulfuros nativos o ser introducidos “de novo” en la misma [3], siendo esta última estrategia la utilizada para la obtención de nuestro biocatalizador insoluble.

Se realizó la caracterización del biocatalizador obtenido, y se comparó la capacidad para transformar sustratos fenólicos por la lacasa, en su forma libre e inmovilizada.

Bibliografía

1. Rodríguez Couto S.; Sanromán M.; Gübitz G. M. Chemosphere 2005, 58, 417-422.2. Brandi P.; D'Annibale A.; Galli C.; Gentili P.; Nunes Pontes A. J Mol Catal B: Enzym. 2006, 41, 61–69. 3. Batista-Viera F.; Ovsejevi K.; Manta C. Meth. Biotechnol. 2006 22, 185-204.

1Bioquímica, DEPBIO, Fac. de Química, UdelaR, Montevideo, Uruguay.2Lab. de Biocatálisis y Biotransformaciones, DEPBIO-DQO, Fac.de Química, UdelaR, Montevideo,

Uruguay.

PP-DB18

85

Desarrollo de procesos biocatalíticos para la preparación de heterociclos en forma ópticamente activa

Vicente Gotor-Fernández, María López-Iglesias, Juan Mangas-Sánchez, María Rodríguez-Mata, Eduardo Busto y Vicente Gotor

vicgotfer@uniovi.es

La preparación asimétrica de compuestos heterocíclicos ha despertado una destacada atención a lo largo de la historia debido a sus múltiples aplicaciones como productos agroquímicos, fármacos o de alto valor añadido, sin olvidar los diversos usos de aminoácidos o diaminas en procesos de organocatálisis, ya sea como ligandos o como auxiliares quirales. De entre ellos, los análogos oxigenados y nitrogenados presentan una mayor importancia debido a su presencia en un gran número de productos naturales.

Muchos de las estrategias descritas hasta la fecha incluyen procesos de hidrogenación, acoplamiento o ciclación, la mayoría de los cuales requieren el empleo de reactivos generalmente tóxicos o de elevado coste económico. Por ello, recientemente hemos descrito la síntesis quimioenzimática asimétrica de muy diversas familias de compuestos como derivados de (iso)indolinas,1 benzofuranos2 e isobenzofuranonas3 entre otros, empleando hidrolasas o alcohol deshidrogenasas. Así, estos procesos se han basado en la resolución de los compuestos finales racémicos o bien la modificación de precursores sintéticos para acceder a moléculas orgánicas de interés en forma ópticamente activa. En esta comunicación se presentarán el desarrollo de nuevas metodologías sintéticas, actualmente en progreso, dirigidas hacia la preparación secuencial o en one-pot de benzoxazinas e isocromanonas ópticamente enriquecidas (Figura 1).

Figura 1. Estructura general de benzoxazinas e isocromanonas

Bibliografía

1. Morán-Ramallal, R.; Gotor-Fernández, V.; Laborda, P.; Sayago, F. J.; Cativiela, C.; Gotor, V. Org. Lett. 2012, 14, 1696-1699.2. Mangas-Sánchez, J.; Busto, E.; Gotor-Fernández, V.; Gotor, V. Org. Lett. 2010, 12, 3498-3501.3. Mangas-Sánchez, J.; Busto, E.; Gotor-Fernández, V.; Gotor, V. Org. Lett. 2012, 14, 1444-1447.

Departamento de Química Orgánica e Inorgánica, Instituto Universitario de Biotecnología de Asturias, Universidad de Oviedo, Oviedo (33006), España

NH

O

R1*

R2 O

O

R1

R2*

*R3

PP-DB19

87

PresentacionesPosters

Area Biotransformaciones

88

Código Título y autores Página

PP-B1

Produçã o de ésteres pela transesterificação enzimática dos óleos de canola e pinhão manso na presença de etanol

Leandro Daniel De Paris, João Henrique Dantas, Carlos Eduardo Barão, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin

93

PP-B2

Benzaldehyde Lyase-catalyzed diastereoselective C-C bond formation by simultaneous carboligation and kinetic resolution

Christoph R. Müller, María Pérez - Sánchez, Pablo Domínguez de María

94

PP-B3 Deep-eutectic-solvents: Promising bio-based non-conventional media for

biocatalysis Zaira Maugeri, Pablo Domínguez de María

95

PP-B4

Synthesis of optically active 2-hydroxyketones in multi-step enzymatic reactions

María Pérez Sánchez, Saravanakumar Shanmuganathan, Christoph R. Müller, Pablo Domínguez de María

96

PP-B5

Glicosilación enzimática de apomucinas de Fasciola hepática y Echinococcus granulosus como herramienta para la obtención de vacunas

anti tumorales Ernesto Rodríguez, Carolina Chiale, Eduardo Osinaga y Teresa Freire

97

PP-B6 Síntesis enzimática de fructosil-galacto-oligosacáridos

Cecilia Guerrero, Carlos Vera y Andrés Illanes 98

PP-B7 Preparación enzimática y encapsulación de bioconjugados de extractos

vegetales con poder antioxidante Leandro N. Monsalve, Lucila Moras, Analía Vázquez

99

PP-B8 Oxidación selectiva de isocromano mediante reacciones de

biotransformación Gabriela I. Furque, Virginia E. Sosa

100

PP-B9

Paulina Urrutia, Francisco Plou, Bárbara Rodriguez-Colinas, Lorena Wilson, Andrés Illanes

101

PP-B10

Producción de maltooligosacáridos en batch y en reactor de membrana catalizada por una ciclodextrina glucosiltransferasa

Jorgelina Andrea Rodríguez Gastón, Hernán Costa, Ana Lía Rossi, Norberto Krymkiewicz y Susana Alicia Ferrarotti

102

PP-B11 Extracto acuoso de yerba mate: novedoso sustrato para la cuantificación de

clorogenato hidrolasa Ana P. Butiuk, Roque A. Hours, Carlos F. Mignone

103

PP-B12

Esterificación de R/S-ketoprofeno con isopropanol como reactivo y solvente catalizada por Novozym® 435 bajo condiciones seleccionadas

M. Victoria Toledo, Sebasti án E. Collins, Rita D. Bonetto, M. Luján Ferreira, Laura E. Briand

104

Caracterización de galacto-oligosacáridos producidos con β-galactosidasa de Aspergillus oryzae soluble e inmovilizada

89

Código Título y autores Página

PP-B13

Síntesis quimioenzimática de Sitofilato, feromona de agregación de Sitophilus granarius, plaga de granos almacenados de importancia

económica en Uruguay y la región Silvana Ravía, Silvana Vero y Daniela Gamenara

105

PP-B14 Aminoácidos livres em hidrolisados proteicos de resíduos agroindustriais

Fabiana Dieterich, Wilson Rogério Boscolo, Ap. Sonia de Souza, Maria Teresa Bertoldo Pacheco, Giovani Sampaio Gonçalves, Rose Meire Vidotti

106

PP-B15 Avances en la síntesis quimioenzimática de 2-C-metilribosa para la

preparación de nucleósidos con potencial actividad antiviral Patricia Alfonso, Estefanía Dibello, Daniela Gamenara y Gustavo Seoane

107

PP-B16

Síntesis quimioenzimática de Dominicalure I y II, componentes de la feromona de agregación de Rhyzopertha dominica

Estefanía Dibello, Lucía Derrudi, Patricia Saenz-Méndez, Gustavo Seoane y Daniela Gamenara

108

PP-B17 Avances en la síntesis quimioenzimática del carboazúcar precursor de

Neplanocina A Mariana Pazos, Daniela Gamenara, Gustavo Seoane y Margarita Brovetto

109

PP-B18 Síntesis de 1,3-dicaproilglicerol mediante esterificación enzimática de

ácido cáprico y glicerol en solvente orgánico Daniel Alberto Sanchez, Gabriela Marta Tonetto y María Luján Ferreira

110

PP-B19

Esterificação do ácido oléico com alcoóis alifáticos por lipase de Candida antarctica e quantificação do biodiesel por RMN 1H

Isac G. Rosset, Maria C. H. T. Cavalheiro, Elisabete M. Assaf e André L. M. Porto

111

PP-B20 Triagem de fungos marinhos para a bio-oxidação do (-)-sclareol

Mariana Provedel Martins, Jamal Ouazanni, André Luiz Meleiro Porto 112

PP-B21

Avaliação da redução do citronelal do óleo essencial de Corymbia citriodora por Saccharomyces cerevisiae

Gelson Jose Andrade Conceição, Natália Ferreira Duarte, Fernando Torres Machado e Henrique Kuriki

113

PP-B22 Glucosilación enzimática de hesperetina en presencia de codisolventes Laura Leemans, Francisco J. Plou, Antonio O. Ballesteros, Daniel Padilla,

Rubén de Regil, Georgina Sandoval 114

PP-B23

Influência da Correção do pH Reacional no Teor de Proteínas do Hidrolisado Enzimático de Farelo de Soja

Raquel Ströher, André Álvares Monge Neto, João Henrique Dantas, Gisella Maria Zanin

115

PP-B24 Glicosilación enzimática de hidroxiurea: una estrategia para aumentar su

selectividad Cecilia Porciúncula, Gabriela Irazoqui, Cecilia Giacomini

116

PP-B25 Crecimiento de Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson LPSC # 876 sobre

escamas de quitina María Cecilia Gortari, Betina Galarza, Roque Alberto Hours

117

90

Código Título y autores Página

PP-B26 Producción de enzimas queratinolíticas utilizando un residuo sólido de

curtiembre Betina Galarza, Cecilia Gortari, Carlos Cantera

118

PP-B27 Biotransformación de vinaza en biomasa utilizando levaduras

Juan Manuel Alfaro, María Rita Martearena, Elsa Scaroni y Silvano Locatelli 119

PP-B28 Hidroxilación de (-)-Ambróxido por Aspergillus Níger

Nancy Manzano, Vanesa Brochero, Cintia Cánovas, Jorge Allendes, Daniel Bustos

120

PP-B29 Preparación de análogos acíclicos quirales de nucleósidos mediante el uso

de aldolasas dependientes de piruvato Martín Palazzolo, Adolfo Iribarren y Elizabeth Lewkowicz

121

PP-B30

Reducción de una dicetona terpénica por vegetales y microorganimos endofíticos

Paula Rodriguez, Lucía Zeballos, Adrian Anzorena, Carmela Molinaro, Pilar Menéndez, Sonia Rodríguez y David Gonzalez

122

PP-B31 Estudio de diferentes lacasas para la biotransformación de sustratos no

fenólicos Victoria Giorgi, Emiliana Botto, Carlos García y María del Pilar Menéndez

123

PP-B32 Preparación quimioselectiva de derivados de nucleósidos N-

monoacetilados Cyntia M. Palacio, María B. Sabaini, Adolfo M. Iribarren y Luis E. Iglesias

124

PP-B33

Fosfotriesterasas en la síntesis biocatalizada de potenciales prodrogas nucleotídicas

Lucas A. Dettorre, Julia Y. Santillán, Elizabeth S. Lewkowicz y Adolfo M Iribarren

125

PP-B34

Procesos de desimetrización enzimática catalizados por lipasas. La autopista hacia una nueva familia de compuestos con potenciales

aplicaciones en organocatálisis Vicente Gotor-Fernández, Daniel Méndez-Sánchez, Eduardo Busto, Nicolás

Ríos-Lombardía y Vicente Gotor

126

PP-B35 Síntese de ésteres do biodiesel empregando lipases de Burkholderia

cepacia LTEB11 produzidas por fermentação no estado sólido Diniara Soares, David Alexander Mitchell, Nadia Krieger

127

PP-B36 Biotransformación del Alcohol Perílico por Aspergillus Níger

Roxana Aciar, Melisa Rosa, Martha Mansú Re, Lisandro Hergert, Soledad Ravetti y Daniel Bustos

128

PP-B37 Aplicación de lipasas en la síntesis de derivados del ácido

quenodesoxicólico Paula Quintana, Guadalupe García Liñares y Alicia Baldessari

129

PP-B38

Acetilación y desacetilación regioselectiva de pregnanos catalizadas por lipasas

Guadalupe García Liñares, Javier Eiras, Andrea Bruttomesso y Alicia Baldessari

130

91

Código Título y autores Página

PP-B39 Síntesis de fenilacetamidas sustituidas catalizada por lipasas

Guadalupe García Liñares, Alejandra Elisei Schicchi y Alicia Baldessari 131

PP-B40 Aplicación de lipasas en la síntesis de derivados de 2- y 3-hidroxipiridinas

con actividad antiparasitaria Guadalupe García Liñares, Gonzalo Parraud y Alicia Baldessari

132

PP-B41

Síntesis enzimática de un β-peptoide y su conjugación con complejos macrocíclicos de gadolinio (III) con potencial uso como agentes de

contraste para imágenes por resonancia magnética Guadalupe García Liñares, Eduardo Miguel Rustoy y Alicia Baldessari

133

PP-B42 Biotransformação de chalconas pelo fungo marino Penicillium citrinum

Irlon M. Ferreira, Lenilson C. Rocha, Lucas Pizzuti, André L. Meleiro Porto, Alex H. Jeller

134

PP-B43 Resolução enzimática da (±)-2,4,5-trifluoro-1-feniletanol pela lipase

CALB através da irradiação micro-ondas Sandra Santos Ribeiro, André Luiz Meleiro Porto

135

PP-B44 Purificación de péptidos inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina-I a partir de hidrolizado de proteínas de lactosuero

Carolina Villadóniga y Ana María B. Cantera 136

93

Produção de ésteres pela transesterificação enzimática dos óleos de

canola e pinhão manso na presença de etanol

Leandro Daniel De Paris, João Henrique Dantas, Carlos Eduardo Barão, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zaninleandroparis@hotmail.com

Laboratório de Tecnologia Enzimática, Departamento de Engenharia Química, Universidade Estadual de Maringá, Maringá-PR (87020-900), Brasil

Neste trabalho foi realizada a produção de ésteres etílicos, pela transesterificação enzimática dos óleos de canola e pinhão manso, a 40 e 60 °C, com uma razão molar álcool:óleo de 12:1 e 10% (m/m) de lipase de Burkholderia cepacia em relação ao óleo. O etanol foi adicionado ao meio reacional em três etapas (no início da reação e após 720 e 1440 min, conforme indicado na Figura 1). Os maiores rendimentos em ésteres, para ambos os óleos, foram obtidos a 60 °C (Figuras 1B e 1D). Temperaturas mais elevadas empregadas neste processo podem facilitar a formação de uma emulsão entre o óleo e o álcool, favorecendo a atuação da enzima na interface do meio reacional. Todos os ensaios apresentaram comportamentos semelhantes com relação ao consumo dos triacilgliceróis, formação e consumo dos diacil e monoacilgliceróis e produção dos ésteres. As maiores quantidades de monoacilgliceróis, após 4320 min, indicam que a etapa lenta da reação é a conversão destes compostos em ésteres.

Figura 1. Rendimento em ésteres, mono e diacilgliceróis e consumo de triacilgliceróis para os óleos de: (A) canola a 40 °C, (B) canola a 60 °C, (C) pinhão manso a 40 °C, (D) pinhão manso a 60 °C.

PP-B1

94

Benzaldehyde Lyase-catalyzed diastereoselective C-C bond formation by simultaneous carboligation and kinetic resolution

Christoph R. Müller, María Pérez-Sánchez, Pablo Domínguez de Maríadominguez@itmc.rwth-aachen.de

Institut für Technische und Makromolekulare Chemie (ITMC), RWTH Aachen University. Worringer Weg 1. 52074 Aachen, Germany

Thiamine-diphosphate dependent lyases (ThDP-Lyases) are very valuable biocatalysts for the enantioselective C-C bond formation. Among them, Benzaldehyde Lyase (BAL; EC 4.1.2.38) from Pseudomonas fluorescens Biovar I, catalyzes the carboligation of aromatic and aliphatic aldehydes to the corresponding 2-hydroxy ketones, typically with up to 99% yield and 99% enantiomeric excess in a homo or cross-coupling fashion [1]

In this poster, the BAL diastereoselectivity – producing two stereogenic centers in one catalytic turnover – is assessed for the first time. To this end, different racemic 2-methyl substituted aliphatic aldehydes have been tested in combination with benzaldehyde. Dependent on the length of the aliphatic residue, diastereoselectivities with up to 98% and enantiomeric excesses of > 99% could be achieved. Therefore, it is shown that enantioselective carboligations – well-known performances for BAL [1] – can be smartly coupled to kinetic resolutions, to afford the production of highly valuable chemicals, already affording two chiral centers, in each catalytic turnover.

Acknowledgement: Financial support from DFG training group 1166 “BioNoCo” (“Biocatalysis in Non-conventional Media”) is gratefully acknowledged.

Bibliografía

1. Hoyos, P.; Sinisterra, J. V.; Molinari, F.; Alcántara, A.R.; Domin guez de Maria , P. Acc. Chem. Res. 2010, 43(2), 288–299.

H

O

H

O

CH 3

O

OH+

BAL

Buffer, DMSO

Up to 63 % yieldUp to ee > 99 %Up to de >98 %

PP-B2

95

Deep-eutectic-solvents: Promising bio-based non-conventional media for biocatalysis

Zaira Maugeri, Pablo Domínguez de Maríadominguez@itmc.rwth-aachen.de

Institut für Technische und Makromolekulare Chemie (ITMC), RWTH Aachen, Worringer Weg 1, 52074 Aachen, Germany

Deep-eutectic-solvents (DES) are formed by complexion of quaternary ammonium salts (e.g. choline chloride) with hydrogen bond donors (HBD) such as amines, amides, alcohols, or carboxylic acids) [1]. The interaction of the HBD with the quaternary salt reduces the anion–cation electrostatic force, decreasing the freezing point of the mixture. DES share many characteristics of conventional ionic liquids, yet being DES components often cheaper and biodegradable. Furthermore, DES syntheses do not require purification. Promising applications of DES have

already been reported in biocatalysis[1]

In this poster novel choline-chloride-based DES with renewable HBD (carboxylic acids and some saccharide-derived polyols) are presented. Interestingly, some of them (e.g. D-sorbitol, D-Isosorbide) are chiral, and therefore chiral DES can be formed in a straightforward manner. DES were characterized by measuring melting point, pH, water content, viscosities and investigating solubilities in protic and aprotic solvents [2]

Finally, as a model biocatalytic reaction, the kinetic resolution of rac-1-phenylethanol catalyzed by immobilized Candida antarctica lipase B (CAL-B) was conducted in some of novel DES. Reactions proceed with excellent enantioselectivities (ees> 99 %). In addition, emphasis will be put in using DES as separating agents for product mixtures obtained by enzymatic reactions [3]

Acknowledgements: Financial support from DFG training group 1166 “BioNoCo” (“Biocatalysis in Non-conventional Media”) is gratefully acknowledged.

References

1. Domínguez de María P.; Maugeri Z. Curr. Op. Chem. Biol., 2011, 15, 220-225.2. Maugeri Z.; Domínguez de María P. RSC Adv., 2012, 2, 421-425.3. Maugeri, Z.; Leitner, W.; Domínguez de María, P. Manuscript Submitted. 2012.

PP-B3

96

Synthesis of optically active 2-hydroxyketones in multi-step enzymatic reactions

María Pérez Sánchez, Saravanakumar Shanmuganathan, Christoph R. Müller, Pablo Domínguez de María

dominguez@itmc.rwth-aachen.de

Institut für Technische und Makromolekulare Chemie, Worringer Weg 1 52074 Aachen, Germany.

Optically active 2-hydroxyketones are very important building blocks for the synthesis of many biologically active compounds [1]. In biocatalysis, thiamine-diphosphate dependent lyases (ThDP-Lyases) and in particular Benzaldehyde lyase (BAL), have been extensively employed in C-C ligation of aldehydes to generate these 2-hydroxyketones [1].

This poster assesses different routes for the production of 2-hydroxyketones in multi-step reactions, taking BAL-ligation as core central step. To this end, in situ production of volatile and toxic aldehydes catalyzed either by alcohol oxidases (starting from bio-based alcohols) or by CAL-B (hydrolyzing vinyl esters) will be shown [2,3]. Subsequently, some of the formed 2-hydroxyketones will be subsequently assessed in ADH-catalyzed enantioselective ketone reduction, leading to optically active alcohols in one-pot, several steps, in an efficient manner. By means of these multi-step approaches, efficient syntheses can be proposed with a limited waste formation during work-up procedures.

References

1. Hoyos, P.; Sinisterra, J. V.; Molinari, F.; Alcántara, A. R.; Domínguez de María, P. Acc. Chem. Res. 2010, 43, 288-299.2. Shanmuganathan, S.; Natalia, D.; Greiner, G.; Domínguez de María, P. Green Chem. 2012, 14, 94-97.3. Pérez-Sánchez, M.; Domínguez de María, P. ChemCatChem. 2012, 4, 617-619.

H

O

+

R

O

HBAL

O

OH

R

R OH

alcoh

ol

oxidas

e

R O

O

CALB

Carboligation - Core Step

ADH OH

OH

Up to 99 % eeUp to 99 % yield

R

O

H

PP-B4

97

Glicosilación enzimática de apomucinas de Fasciola hepática y Echinococcus granulosus como herramienta para la obtención de

vacunas anti tumorales

Ernesto Rodríguez, Carolina Chiale, Eduardo Osinagay Teresa Freire

erodriguez@fmed.edu.uy

Departamento de Inmunobiología, Facultad de Medicina, Montevideo, Uruguay

El cáncer representa uno de los problemas de salud más importantes en el mundo, lo que ha motivado la búsqueda de estrategias que permitan eliminar células tumorales sin dañar tejidos normales. En este contexto, durante las últimas décadas se ha puesto especial énfasis en la inmunoterapia contra el cáncer: la activación del sistema inmune del paciente contra estructuras propias de las células tumorales para mediar así su eliminación. Uno de los principales cambios que se producen en células tumorales es la O-glicosilación incompleta, lo que conduce a la aparición de estructuras que en células normales se encuentran enmascaradas por otros glúcidos. Tal es el caso del Antígeno Tn, una estructura asociada específicamente a cáncer, que consiste en un residuo de N-Acetil Galactosamina (GalNAc) unido directamente al esqueleto peptídico. El mismo es producto de la acción de una familia de enzimas denominadas UDP-GalNAc:polipeptido GalNAc-transferasas (ppGalNAcT), que cataliza la transferencia de un residuo de GalNAc desde el azúcar activado con UDP, al grupo hidroxilo de una serina o una treonina del esqueleto peptídico de las proteínas. El desarrollo de vacunas hemi-sintéticas acoplando el Antígeno Tn a diversas mucinas empleadas como carriers constituye una estrategia de interés en inmunoterapia anti-tumoral.

En el presente trabajo llevamos a cabo la adición enzimática del antígeno Tn a péptidos sintéticos derivados de mucinas de origen parasitario, uno de Fasciola hepatica (Fhmuc) y dos de Echinococcus granulosus (Egmuc y Egmuc2). Todos ellos poseen un alto contenido serinas y treoninas, sitios potenciales de O-glicosilación. Para la glicosilación, utilizamos tres ppGalNAcT humanas recombinantes (ppGalNAcT2, T3 y T6).

Nuestros resultados muestran que de éstos péptidos, sólo Fhmuc y Egmuc2 pueden ser glicosilados por las ppGalNAcT ensayadas, obteniéndose mayores niveles de glicosilación con la ppGalNAcT2. Para dicha enzima, y utilizando Fhmuc como sustrato, ensayamos diferentes condiciones en la glicosilación como relación enzima/sustrato, equivalentes de UDP-GaNAc, tiempo de reacción y combinando con la enzima ppGalNAcT3. Se seleccionaron las mejores condiciones para su utilización en glicosilaciones semi-preparativas de Fhmuc y Egmuc2, a partir de la cual se purificaron los glicopéptidos por cromatografía de afinidad. Esta estrategia nos permitió obtener ambos glicopéptidos con un rendimiento del 79% para Tn-Fhmuc y 30% para Tn-Egmuc2, cuya pureza se determinó por SDS-PAGE.

Posteriormente, se estudió su internalización por parte de células dendríticas, las cuales juegan un rol fundamental en el desarrollo de respuestas inmunitarias efectivas. Se pudo observar que ambos glicopéptidos, Tn-Fhmuc y Tn-Egmuc2, son internalizados en más eficientemente que los respectivos péptidos sin glicosilar. Estos datos ponen de manifiesto la importancia del residuo de GalNAc en dicho proceso, y resultan alentadores en el desarrollo de vacunas antitumorales basadas en el Antígeno Tn.

PP-B5

98

Síntesis enzimática de fructosil-galacto-oligosacáridos

Cecilia Guerrero, Carlos Vera y Andrés Illanes aillames@ucv.cl

Laboratorio de biocatálisis, Escuela de Ingeniería Bioquímica, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile.

Las β-galactosidasas tienen la capacidad de catalizar tanto reacciones de hidrólisis como de transgalactosilación, siendo esta última actividad una vía de producción de compuestos de alto valor agregado derivados de la lactosa. Dentro de ellos destacan los galacto-oligosacáridos (GOS), la lactulosa y la lactosacarosa. No obstante, se ha demostrado, que las β-galactosidasas pueden emplear no sólo lactosa como sustrato, sino que reconocen como sustratos una gran variedad de oligosacáridos con galactosa terminal no reductora. Recientemente, se ha reportado que la β-galactosidasa es capaz de aceptar lactulosa como donador y aceptor de la galactosa transgalactosilada, dando origen a la síntesis de fructosil-galacto-oligosacáridos (fGOS). Los fGOS son oligosacáridos de galactosa unidos a una molécula terminal de fructosa, lo cuales han sido reportados como compuestos con gran potencial prebiótico. El objetivo de este trabajo es seleccionar la fuente de β-galactosidasa más apropiada para llevar a cabo la síntesis de fGOS y optimizar mediante superficie de respuesta las condiciones operacionales de la síntesis que maximicen el rendimiento y la productividad de la reacción.

Se llevó a cabo la síntesis por lotes de fGOS con tres preparados comerciales de β-galactosidasa de distintos orígenes (Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis y Bacillus circulans). Dentro de los preparado evaluados, el de A. oryzae produjo el mayor rendimiento de lactulosa en fGOS (0,38 g fGOS/g lactulosa inicial); el preparado de K. lactis produjo un rendimiento de sólo 0,2 g fGOS/g lactulosa inicial, mientras que el preparado de B. circulans produjo el menor rendimiento de tan sólo 0,14 g fGOS/g lactulosa inicial. Por tal motivo, se seleccionó el preparado de A. oryzae para las etapas siguientes en las que se determinó el efecto de la concentración de fructosa y galactosa sobre la actividad de hidrólisis y transgalactosilación de la β-galactosidasa, sus constantes de afinidad por lactosa y lactulosa, el efecto de la temperatura y concentración inicial de lactulosa sobre el rendimiento y la productividad específica de la síntesis de fGOS. La temperatura y la concentración inicial de lactulosa no afectaron significativamente el rendimiento de la síntesis de fGOS; no obstante, la productividad específica fue fuertemente dependiente de ambos parámetros. Adicionalmente, se optimizó la síntesis de fGOS mediante diseño estadístico de superficie de respuesta, empleando la temperatura y la concentración inicial de lactulosa como variables, obteniéndose un rendimiento máximo de 0.39 g fGOS/g lactulosa inicial a 53.1 % p/p de lactulosa y 53.2 °C, mientras que la productividad específica máxima obtenida fue de 0.82 g/hmg a 44.6 % p/p de lactulosa y 54 °C.

Agradecimiento: Trabajo financiado por proyecto Fondecyt 1100050, Conicyt, Chile

PP-B6

99

Preparación enzimática y encapsulación de bioconjugados de extractos vegetales con poder antioxidante

Leandro N. Monsalve, Lucila Moras, Analía Vázquezlmonsalve@fi.uba.ar

Laboratorio de Polímeros y Materiales Compuestos, Instituto de Tecnologías y Ciencias de la Ingeniería (INTECIN), Facultad de Ingeniería, UBA - CONICET, Las Heras 2214 (C1127AAR), CABA, Argentina

Muchos extractos vegetales contienen compuestos con actividad antioxidante, mayormente polifenoles. Los compuestos con este tipo de actividad son potencialmente beneficiosos para la salud humana y la preservación de alimentos debido a que son capaces de inhibir las especies reactivas de oxígeno responsables de la oxidación de las biomoléculas. No obstante, su absorción por parte de los seres vivos es pobre y su compatibilidad con algunas matrices poliméricas es limitada debido a su baja lipofilicidad [1].

En este trabajo se presenta una metodología enzimática para la producción de bioconjugados de extractos vegetales que contienen polifenoles con aceite de girasol empleando la lipasa de Candida antarctica B (esquema 1). Los extractos se obtuvieron a partir de sarandí blanco, té verde y orujo de uva malbec. Se estudió la influencia de la temperatura y el solvente en la reacción. Los extractos modificados enzimáticamente se caracterizaron por su perfil cromatográfico, su capacidad antioxidante in vitro y por la eficiencia de encapsulación en una matriz de nanocápsulas de policaprolactona.

Esquema 1. Acilación de polifenoles catalizada por CAL B.

Como resultado, los extractos modificados presentaron una actividad antioxidante similar a los extractos antes del tratamiento. También aumentó su lipofílicidad y pudieron encapsularse con mayor eficiencia que los extractos sin tratamiento.

En conclusión, esta metodología permite mejorar las propiedades de los extractos vegetales y presenta una buena alternativa para su aplicación en tecnología de alimentos, cosmética, salud humana y animal, entre otras.

Bibliografía

1. Mullen, W.; Rouanet, J. M.; Auger, C.; Teissedre, P. L.; Caldwell, S. T.; Hartley, R. C.; Lean, M. E.; Edwards, C. A.; Crozier, A. J. Agric. Food. Chem. 2008, 56, 12127-12137.

polifenoles + triglicéridos

CAL Bpolifenoles acilados acilgliceroles

transesterificación+

PP-B7

100

Oxidación selectiva de isocromano mediante reacciones de biotransformación

Gabriela I. Furque, Virginia E. Sosagfurque@fcq.unc.edu.ar

Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba,

Córdoba, (X5000HUA), Argentina. IMBIV-CONICET-UNC

Isocromano (1) y muchos de sus derivados han sido aislados de fuentes naturales y se encuentran en cultivos de microorganismos y en diversas plantas [1]. Los compuestos de la familia del isocromano poseen aplicación en síntesis orgánica dado que en los últimos años resultó ser la base estructural de un amplio número de compuestos biológicamente activos.

El objetivo propuesto en este trabajo consistió en la modificación estructural del compuesto de partida (1) por biotransformación, en la modalidad de célula entera, con cepas de las especies de los géneros Aspergillus y Cunninghamella y de la levadura Saccharomyces cerevisiae (Baker's yeast). En todos los ensayos realizados se observó la bioconversión del sustrato mencionado obteniendo como metabolitos mayoritarios los compuestos 2 y 3 (Figura 1). Se ha reportado la formación del compuesto 3 partiendo de isocromano (1) por diversos métodos sintéticos ambientalmente no agresivos y con rendimientos intermedios [2].

Del estudio comparativo de la cinética de formación y abundancia de los productos por GC-MS, se propuso que el mecanismo de la biorreacción de oxidación selectiva del metileno en posición 1 estaría dado por la acción de enzimas monooxigenasas del CYP y ADH presentes en los microrganismos [3]. A fin de confirmar la ruta catabólica y las enzimas involucradas en estas reacciones se trabajó con sistemas de células en reposo de A. niger empleando piperonil butóxido como inhibidor enzimático de las monooxigenasas del Cit-P450 impidiendo así la formación de la vía oxidativa presentada frente al sustrato analizado. Los productos de oxidación obtenidos fueron analizados y purificados mediante técnicas cromatográficas e identificados por métodos espectroscópicos.

Figura 1. Biotransformacion de isocromano (1).

Bibliografía

1. a) Ogawa, A.; Murakami, C.; Kamisuki, S.; Kuriyama, I. Bioorg. Med. Chem. 2004, 14, 3539-3543. b) Kuramochi, K.; Saito, F.; Nakazaki, A.; Takeuchi, T.; Tsubaqui, K.; Sugawara, F. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2010, 8, 1635-1640.2. Bovicelli, P.; Lupattelli, P.; Crescenzi, B. Tetrahedron. 1999, 55, 14719-147283. Zhang, W.; Tang, W.; Wang, D.; Li, Z. Chem. Commun. 2011, 47, 3284-3286.

O9

310

5

6

7

8

2

4

1

1

*O

2

O

3

+

OH O

PP-B8

101

Caracterización de galacto-oligosacáridos producidos con β-galactosidasa de Aspergillus oryzae soluble e inmovilizada

1 2 2 1 1Paulina Urrutia , Francisco Plou , Bárbara Rodriguez-Colinas , Lorena Wilson , Andrés Illanes paulinaurrutiaa@yahoo.com

1Escuela de Ingeniería Bioquímica, Facultad de Ingeniería, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso (2362804) Chile.

2Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid (28049), España.

Los galacto-oligosacáridos (GOS) son carbohidratos no digeribles con reconocida capacidad prebiótica, cuya síntesis a partir de lactosa puede ser catalizada por β-galactosidasas de distintos orígenes. Tanto el tipo de enlace glicosídico (Tzortzis y Vulevic, 2009) como el grado de polimerización (Gopal et al., 2001; van Laere et al. 2000) influirán en el tipo de bacterias del colon que serán capaces de metabolizarlos y en consecuencia ambas propiedades son factores determinantes en la capacidad prebiótica de los GOS generados. En base a esto, se estudió en detalle

®la síntesis de GOS catalizada con la β-galactosidasa comercial de A.oryzae (ENZECO ) en su forma soluble e inmovilizada sobre el soporte heterofuncional amino-glioxil agarosa. El rendimiento máximo de síntesis de GOS alcanzado empleando una concentración de lactosa inicial de 400 g/L en tampón citrato-fosfato 0,1M pH 4,5 15 UI/ mL y 40°C fue similar con la enzima soluble e inmovilizada (26,8% p/p, correspondiendo a 107 g/L). Una unidad internacional de actividad de β-galactosidasa (UI) fue definida como la cantidad de enzima que produce 1 μmol of o-nitrofenol (ONP) por minuto a partir de una solución 45 mM de o-nitrofenil β-D-galactopiranósido (ONPG) en tampón citrato-fosfato 0,1M pH 4,5 a 25°C. El perfil de GOS obtenido fue similar con la enzima soluble e inmovilizada, siendo los principales productos de la reacción el 6-O-β-galactosil-lactosa, 6-O-β-galactosil-glucosa (alolactosa), 6-O-β-galactosil-galactosa (6-galactobiosa), 3-O-β-galactosil-glucosa y 4-O-β-galactosil-lactosa, indicando que esta enzima presenta una tendencia a la formación preferente de enlaces glicosídicos β(1→ 6), seguido por enlaces β(1→ 3), con una menor formación de enlaces β(1→4). La concentración total de trisacáridos representó el 57% de los GOS totales, siendo el principal producto el 6-O-β-galactosil-lactosa (31% de los GOS totales), mientras que los disacáridos representaron un 37 % del total de GOS generado, siendo la alolactosa el principal disacárido producido (17% de los GOS totales). De este modo se logró una completa caracterización del tipo de enlace y grado de polimerización de los principales GOS generados al utilizar como catalizador la β-galactosidasa de A.oryzae en su forma libre e inmovilizada.Agradecimientos: Proyecto Fondecyt 1100050, Conicyt, Chile; Proyecto CYTED 108RT0362 y becas de Doctorado Nacional y Pasantía Doctoral en el Extranjero de Conicyt, Chile otorgadas a la Sra. P.Urrutia.

Bibliografía

1. Tzortzis, G.; Vulevic, J. Galacto-oligosaccharide prebiotics. En: Charalampopoulos D. y Rastall R.A (Eds) Prebiotics and Probiotics Science and Technology. Springer Science Business Media, Nueva York, 2009. 2. Gopal, P. K.; Sullivan, P. A.; Smart, J. B. Int. Dairy J. 2001, 11, 19-25.3. Van Laere, K. M J.; Abee, T.; Schols, H. A.; Beldman, G.; Voragen, A. G. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 1379-1384.

PP-B9

102

Producción de maltooligosacáridos en batch y en reactor de membrana catalizada por una ciclodextrina glucosiltransferasa

Jorgelina Andrea Rodríguez Gastón, Hernán Costa, Ana Lía Rossi, Norberto Krymkiewicz y Susana Alicia Ferrarotti

jorgelinar77@yahoo.com.ar

Laboratorio de Química Biológica, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Luján, Luján (6700), Argentina

La ciclodextrina glucosiltransferasa (CGTasa) cataliza la síntesis de ciclodextrinas a partir de almidón mediante transglucosilación intramolecular. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, la reacción puede ser dirigida hacia la producción de dextrinas lineales, con disminución de la síntesis de ciclodextrinas. Así, el almidón actúa como molécula donante y los oligosacáridos de bajo peso molecular actúan como aceptores en la reacción de transglucosilación intermolecular.

En este trabajo se desarrollaron las condiciones óptimas para transformar almidón en maltooligosacáridos (MOS) empleando glucosa como aceptor y CGTasa de Bacillus circulans DF 9R como catalizador. La producción de MOS se optimizó en un proceso en batch, obteniéndose a partir de almidón de mandioca, MOS de alta pureza de hasta 10 unidades de glucosa (Figura 1), con un rendimiento del 60 % y una productividad de 80 mg /U de enzima. Empleando almidones de diversas fuentes (maíz, trigo, papa y arroz) se obtuvieron rendimientos semejantes.

Por otra parte, se desarrolló un proceso continuo en un reactor BioFlo 110 New Brunswick Scientific, acoplado a una celda de ultrafiltración, modelo 8200, Amicon, provisto de una membrana YM10 (valor de corte 10kDa). El volumen de trabajo fue de 1 L. Se usó una bomba peristáltica para transferir el medio de reacción a la celda de ultrafiltración. Otra bomba permitió recircular el fluido desde la celda al vaso de reacción. Fue necesario incorporar una bomba de vacío externa al sistema para impulsar la salida del permeado que contenía los MOS dado que su PM es inferior a 10 kDa. Por otra parte, empleando el sensor de nivel del equipo se realimentó el reactor con solución de almidón cada vez que el volumen descendió por debajo de un litro. No se observó decaimiento en la actividad de la enzima luego de 10 h de reacción (Figura 2). De esta forma, se alcanzó una productividad de 238 mg /U de enzima y un rendimiento del 71 %.

Fig.1.Productos de reacción obtenidos por acción de la CGTasa sobre almidón empleando glucosa como aceptor

Fig.2.Concentración de MOS obtenida en el proceso continuo durante 10 h.

PP-B10

103

Extracto acuoso de yerba mate: novedoso sustrato para la cuantificación de clorogenato hidrolasa

Ana P. Butiuk, Roque A. Hours, Carlos F. Mignonebutiuk@biotec.org.ar

Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI; UNLP, CONICET La Plata). Fac. de Cs. Exactas, UNLP. 47 y 115, (B1900ASH) La Plata, Argentina

La enzima clorogenato hidrolasa (CHasa, EC 3.1.1.42) cataliza la hidrólisis del ácido clorogénico (ACG), liberando cantidades equimolares de ácido quínico y cafeico. El ACG es un polifenol natural de alto valor comercial con diferentes aplicaciones en las industrias de alimentos y farmacéutica. Tradicionalmente, se ha reconocido a ciertos derivados del café y a otros extractos vegetales como ricos en ACG. Sin embargo, recientemente se ha reportado que su contenido en yerba mate (Ilex paraguarienses A. St. Hil) es substancialmente mayor y del orden de 10% en base seca [1].

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el uso de un extracto acuoso concentrado de yerba mate (EYM) con un contenido en sólidos totales de 215 g/l y de ACG de 71 g/l (generosamente provisto por La Cachuera S.A., Misiones, Argentina) como sustrato alternativo para la cuantificación de actividad CHasa en reemplazo del ACG comercial (Sigma), cuyo costo actual es 250 US$/g.

El extracto enzimático (EE) se obtuvo a partir de una cepa de A. niger cultivada en medio Czapek modificado (pH 7), suplementado con EYM como inductor de la actividad CHasa, en frascos agitados (180 rpm, 30 ºC) durante 48 h. La biomasa obtenida fue separada, lavada y desintegrada en buffer fosfato de sodio (NPB, pH: 6,5). La suspensión resultante fue centrifugada y el sobrenadante obtenido fue utilizado como EE.

La determinación de la actividad de CHasa se hizo con el método de Okamura y Watanabe [2] modificado, utilizando como sustratos el ACG comercial (tradicional) y el EYM (alternativo) midiendo el cambio de A (máximo para el ACG). Las variables analizadas fueron: concentración 350

de sustrato, concentración de enzima y tiempo de reacción. La unidad de actividad CHasa se definió como la cantidad de enzima que hidroliza 1 µmol de ACG por minuto bajo las condiciones de ensayo.

De los resultados obtenidos se proponen las siguientes condiciones de reacción: a) sustrato (250 µl): ACG comercial (1,5 mM en NPB 0,05 M) o EYM (0,75% en NPB 0,05 M), b) tiempo de reacción 5 min (para ambos sustratos) y c) temperatura 30°C. En estas condiciones, el cambio de A es lineal hasta 3,0 unidades de CHasa en la mezcla de reacción usando, tanto el ACG comercial 350

y como el EYM como sustrato.A partir de estos resultados, y considerando el elevado costo del ACG comercial, se puede

concluir que el EYM resulta un novedoso y económico sustrato para la cuantificación de la actividad de CHasa.

Bibliografía

1. Isolabella, S.; Cogoi, L.; Lopez, P.; Anesini, C; Ferraro, G.; Filip, R. Food Chem. 2010, 122, 695-699.2. Okamura, S.; Watanabe, M. Agric. Biol. Chem. 1982, 46, 297-299.

PP-B11

104

Esterificación de R/S-ketoprofeno con isopropanol como reactivo y solvente catalizada por Novozym® 435 bajo condiciones seleccionadas

1 2 1 3M. Victoria Toledo , Sebastián E. Collins , Rita D. Bonetto , M. Luján Ferreira , Laura E. 1Briand

victoriatoledo@quimica.unlp.edu.ar

1Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias Aplicadas-Dr. Jorge J. Ronco, Universidad Nacional de La Plata, CONICET, CCT La Plata. Calle 47 Nº 257, B1900AJK La Plata, Buenos Aires, Argentina

2 Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química INTEC. Universidad Nacional del Litoral-CONICET, Güemes 3450, 3000 Santa Fe, Santa Fe, Argentina

3PLAPIQUI-UNS-CONICET Camino La Carrindanga, Km 7, CC 717, 8000 Bahía Blanca, Argentina

Los fármacos derivados del ácido 2-aril propiónico son mezclas racémicas pertenecientes a la familia de los antiinflamatorios no-esteroideos o AINEs, cuya actividad farmacológica reside en uno de sus enantiómeros, generalmente el isómero S(+). Hoy día, el biocatalizador comercial Novozym®435 es ampliamente utilizado en la esterificación enantioselectiva de ácidos carboxílicos racémicos [1]. Este catalizador está compuesto por esferas de polimetilmetacrilato (PMMA) sobre las que se encuentra inmovilizada físicamente la lipasa B de Candida antarctica (CALB).

En esta investigación se estudia la esterificación enzimática de R/S-ketoprofeno con isopropanol catalizada con Novozym® 435. La baja velocidad de reacción registrada se investigó en términos del efecto del alcohol en la estabilidad fisicoquímica y enzimática del biocatalizador y la interacción de los sustratos con la tríada catalítica a nivel molecular. Se evaluó el efecto del contacto de la mezcla isopropanol:H O en Novozym® 435 luego 2

de un periodo de 8 días a 45 °C. Se observó que la mezcla disuelve el PMMA y que, además, el alcohol penetra en las esferas del biocatalizador permaneciendo fuertemente absorbido (la desorción del mismo sólo es evidenciada al calentar a 187 °C y alterando su textura interior. Adicionalmente, el isopropanol modifica la estructura secundaria de la enzima disminuyendo la contribución de láminas β y aumentando los giros β. El modelado molecular de la interacción de R/S-ketoprofeno e isopropanol con la triada catalítica de la lipasa evidencia un impedimento estérico del alcohol secundario (figura 1).

Bibliografía

1. José, C.; Bonetto, R. D.; Gambaro, L. A.; Guauque Torres, M. P.; Foresti, M. L.; Ferreira, M. L.; Briand, L. E. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2011, 71, 95-107.

Figura 1. Interacción de isopropanol con el

complejo acil-enzima.

PP-B12

105

Síntesis quimioenzimática de Sitofilato, feromona de agregación de Sitophilus granarius, plaga de granos almacenados de importancia

económica en Uruguay y la región

1 2 1Silvana Ravía , Silvana Vero y Daniela Gamenara

dgamenar@fq.edu.uy

1 Grupo de Fisicoquímica Orgánica y Bioprocesos. Departamento de Química Orgánica. 2Laboratorio de Microbiología, Departamento de Biociencias.

Facultad de Química, Universidad de la República (UdelaR), Montevideo(11800), Uruguay

Sitophilus granarius (gorgojo de cereales) es una de las plagas de granos almacenados de mayor importancia económica a nivel mundial, y en especial en Uruguay y la región. Las feromonas de insectos, por presentar una gran especificidad por las especies a controlar, constituyen una muy importante herramienta a la hora de diseñar programas de manejo integrado de plagas (MIP) con fines de monitoreo o control. (2S,3R)-Sitofilato, feromona de agregación de S. granarius, ha sido evaluada en ensayos de laboratorio en cuanto a su capacidad de atracción, demostrando ser activa tanto en combinación con el grano o con sus componentes volátiles [1].

En este trabajo se describe la síntesis enantioselectiva de Sitofilato a través de una ruta quimioenzimática que permite obtener la feromona en forma sencilla y eficiente. Los pasos claves en la síntesis diseñada son la reducción enantioselectiva de 2-metil-3-oxobutanoato de etilo con una cepa de Aerobasidium pullulans [2], para obtener el correspondiente (2S,3R)-β-hidroxiéster con excelentes excesos diastereo- y enantioméricos, y una transesterificación catalizada por lipasa B de Candida antarctica (CAL B, Novozym 435), en una reacción asistida por microondas y en ausencia de disolvente [3], como etapa final.

Figura 1. Síntesis quimioenzimática enantioselectiva de (2S,3R)-Sitofilato

Bibliografía

1. Wakefield, M. E.; Bryning, G. P.; Chambers, J. J. Stored Prod. Res. 2005, 41, 145-161.2. Ravía, S.; Carrera, I.; Seoane, G.; Vero, S.; Gamenara, D. Tetrahedron: Asymmetry 2009, 20, 1393-1397.3. Risso, M.; Mazzini, M.; Kröger, S.; Saenz-Méndez, P.; Seoane, G.; Gamenara, D. Green Chem. Lett. Rev. 2012, doi: 10.1080/17518253.2012.672596.

O

O OA. pullulans

O

OH OPPh3, APNB, DIAD

THF, T. amb., 72h, 43%

APNB: Acido p-nitrobenzoicoDIAD: DiisopropilazodicarboxilatoM. O:: Irradiación por microondas

O

OH O

100% conv.;syn:ant i ratio: 3:97;

94% ee

OH

CaL B, M. O.98%

O

OH O

(2S,3R)-Sitofilato

PP-B13

106

Aminoácidos livres em hidrolisados proteicos de resíduos agroindustriais

1 2 3Fabiana Dieterich , Wilson Rogério Boscolo , Ap. Sonia de Souza , Maria Teresa Bertoldo 3 4 5Pacheco , Giovani Sampaio Gonçalves , Rose Meire Vidotti

fabianadieterich@yahoo.com.br

1Programa de Pós-Graduação em Aquicultura – CAUNESP – UNESP, Jaboticabal – SP (14884-900), Brasil.

2Engenharia de Pesca, Departamento de Ciências Exatas – UNIOESTE, Toledo (85903-000), Brasil.3 Centro de Ciência e Qualidade de Alimentos – CCQA/ ITAL, Campinas (13070-178) Brasil.

4 Centro de Pescado Continental – Instituto de Pesca de São Paulo (15025-970), Brasil.5Pólo Regional Centro Norte – APTA, UPD – São José do Rio Preto (15025-990), Brasil.

Para utilização alternativa de resíduos agroindustriais este trabalho teve por objetivo desenvolver, a partir de fígado de suíno (FS) e resíduos do processamento da tilápia (RT) (Oreochromis niloticus), hidrolisados proteolíticos com a enzima alcalase (A), para utilização como flavorizante em ração animal. Para otimização das condições os hidrolisados foram produzidos em escala piloto (6 t) na empresa Agropolo Agroindustrial Ltda. Inicialmente as matérias primas foram trituradas, sendo as reações enzimáticas conduzidas em reator sob controle de temperatura e pH. Foram utilizadas as condições de maior atividade catalítica da enzima, equivalente a 60◦C de temperatura, pH 6,5, relação enzima/substrato de 1:100 (p/p), durante 60 minutos. Ao término da hidrólise a enzima foi inativada termicamente a (85ºC/ 15 min.

Os hidrolisados de fígado suíno (FSA) e de resíduos de tilápia (RTA) foram caracterizados quanto ao percentual de aminoácidos livres. O teor de proteína bruta para as matérias primas foi diferente, sendo de 20,45% e 11,83% para o fígado suíno e resíduo de tilápia, respectivamente. Os valores de proteína e o tipo de substrato influenciaram na atividade hidrolítica da alcalase, sendo esta mais efetiva para o fígado suíno. O teor de aminoácidos livres foi de aproximadamente 30% para o FSA, enquanto que para o RTA apresentou aproximadamente 14% dos aminoácidos na forma livre. Os aminoácidos predominantes na forma livre para o fígado suíno foram: ácido glutâmico (4g/100g proteína), leucina (3,7%), alanina (2,5%), histidina (2,25%) e valina (2,1%). Para o resíduo de tilápia os aminoácidos livres predominantes foram o ácido glutâmico (3,5g/100g de proteína), arginina (1,9%) e leucina (1,4%).

Embora a enzima tenha afinidade a sítios específicos para a lise, provavelmente a estrutura do tecido cárneo ocasionou a exposição de diferentes resíduos para atividade de proteolítica. Os aminoácidos exercem importante papel no sabor dos alimentos, podendo conferir diferentes características sensoriais distintas em função do perfil de aminoácidos presente em cada alimento. As diferenças nos percentuais de aminoácidos livres refletem o perfil aminoacídico da matéria prima de origem dos hidrolisados, podendo proporcionar diferenças nas características flavorizantes entre os produtos desenvolvidos.

Bibliografía

1. Dong, S.; Zeng, M.; Wang, D., Liu, Z.; Zhao, Y.; Yang, H. Food Chem. 2008, 107, 1485-1493.2. Guérard, F.; Dufossé, L.; Broise, D. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2001, 11, 1051–105.3. Hagen, S. R.; Frost, B.; Augustin, J. J. AOAC 1989, 72(6), 912-916.

PP-B14

107

Avances en la síntesis quimioenzimática de 2-C-metilribosa para la preparación de nucleósidos con potencial actividad antiviral

Patricia Alfonso, Estefanía Dibello, Daniela Gamenara y Gustavo Seoanepalfonso@fq.edu.uy

Grupo de Fisicoquímica Orgánica y Bioprocesos, Departamento de Química Orgánica, Facultad de Química, Universidad de la República (UdelaR). Montevideo (11800), Uruguay.

En los últimos años se han producido avances en las terapias antivirales, que incluyen la utilización de nucleósidos y sus correspondientes prodrogas para el tratamiento de HIV, hepatitis B y C y herpes, entre otros [1,2]. El uso clínico prolongado de antivirales genera resistencias y tiene efectos secundarios perjudiciales para el paciente. Es importante entonces, disponer de nuevos fármacos, e implementar terapias multidroga. La polifuncionalidad de los nucleósidos purínicos hace que su preparación requiera síntesis complejas, y las metodologías enzimáticas se presentan como una solución a estos problemas [3].

La ruta sintética diseñada para la preparación de 2-C-metilribosa involucra dos etapas biocatalíticas: la biotransformación inicial de bromobenceno con una cepa recombinante de Escherichia coli, E. coli JM109 (pDTG601A) para producir un cis-ciclohexadienodiol homoquiral que posteriormente es funcionalizado por métodos químicos (epoxidación, apertura de epóxidos, protección selectiva de dioles), y la esterificación selectiva del hidroxilo alílico en IV, mediante una reacción catalizada por la lipasa B de Candida antarctica (CAL B, Novozym 435) utilizando butirato de vinilo como dador de acilo. La posterior oxidación del grupo hidroxilo remanente seguida de una reacción de Grignard, imprime a la ruta una versatilidad sintética adecuada para la preparación de otros alquilribósidos con potencial actividad farmacológica. Se han sintetizado con muy buen rendimiento ocho intermedios en la ruta diseñada para la preparación de 2-C-metilribosa. Se continuará trabajando en los pasos finales de la secuencia planteada.

Figura 1. Análisis retrosintético para 2-C-metilribosa.

Bibliografía

1. De Clerq, E. Antiviral Res. 2010, 85, 19-24. 2. De Clerq, E. Rev. Med. Virol. 2009, 19, 287-299. 3. Ferrero, M.; Gotor, V. Chem. Rev. 2000, 100, 4319-4347.

O

HO

OH

OH OH

O

O

O

BuO

OH

OH

Br

E. coli JM109 (pDTG601A)

I II III VI

Br

V

O

O

CH2Cl2, CaL B37 ºC, 150 rpm

O

O

OH

BuO

Br

IV

O

O

OH

HO

Br

PP-B15

108

Síntesis quimioenzimática de Dominicalure I y II, componentes de la feromona de agregación de Rhyzopertha dominica

Estefanía Dibello, Lucía Derrudi, Patricia Saenz-Méndez, Gustavo Seoane y Daniela Gamenara edibello@fq.edu.uy

Grupo de Fisicoquímica Orgánica y Bioprocesos, Departamento de Química Orgánica,Facultad de Química, Universidad de la República (UdelaR). Montevideo (11800), Uruguay.

Las feromonas de insectos juegan un rol fundamental en la comunicación química intraespecífica, siendo herramientas muy valiosas para la implementación de programas de manejo de plagas. La pureza, tanto química como estereoquímica de estos compuestos es esencial para su actividad. A pesar de que la química de feromonas ha tenido un importante desarrollo en las últimas décadas, sus síntesis estereoselectivas son aún un importante desafío para la síntesis orgánica clásica –[1]

En este trabajo se describe una estrategia que combina aproximaciones órgano- y biocatalíticas para la síntesis estereoselectiva de Dominicalure I y II, componentes de la feromona de agregación de R. dominica [2]

La primera etapa clave en la ruta sintética diseñada es una condensación aldólica organocatalizada por pirrolidina de los aldehídos adecuados en cada caso, para dar 3 y 4. La posterior oxidación en condiciones de Corey [3] seguido de una transesterificación enzimática catalizada por la lipasa B de Candida Antarctica (CaL B, Novozym 435) permite obtener ambos componentes de la feromona con muy buenos rendimientos y excelente pureza enantiomérica.

Figura 1. Síntesis quimioenzimática de Dominicalure I y II.

Se logró obtener una estrategia sintética eficiente para la síntesis estereoselectiva de Dominicalure I, uno de los componentes de la feromona de agregación de Rhyzopertha dominica utilizando metodologías bio- y organocatalíticas. Actualmente se está trabajando en la síntesis del otro componente de la feromona, Dominicalure II.

Bibliografía

1. Mori, K., Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 7505-7523.2. Williams H. J.; Silverstein, R. M.; Burkholder, W. E.; Khorramshahi, A. J. Chem. Ecol. 1981, 7, 759-780.3. Corey, E. J.; Gilman, N. W.; Ganem, B. E. J. Am. Chem. Soc. 1968, 90, 5616-5617.

H

O

H

O

13: (R = H4: (R = CH3)

1. , Hexano

2. HCl (10%)

NH

OCH3

O

R = H: Dominicalure IR = CH3: Dominicalure II

NaCN, MnO2

CH3COOH, CH3OH

OH

CaL B,

30 ºC, 150 rpm

+

R

H

O

2

R = H, CH3R

R

5: (R = H6: (R = CH3)

O

O

R

PP-B16

109

Avances en la síntesis quimioenzimática del carboazúcar precursor de Neplanocina A

Mariana Pazos, Daniela Gamenara, Gustavo Seoane y Margarita Brovettompazos@fq.edu.uy

Grupo de Fisicoquímica Orgánica y Bioprocesos, Departamento de Química Orgánica, Facultad de Química, Universidad de la República (UdelaR). Montevideo (11800), Uruguay.

La gran incidencia de enfermedades virales tales como el Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (SIDA) y Hepatitis B y C, entre otras, así como la elevada toxicidad de los fármacos antivirales utilizados y el desarrollo de resistencias virales y/o celulares que pueden sufrir los pacientes durante el tratamiento, impulsan constantemente al desarrollo de nuevas terapias y a la creación de nuevos antivirales. Entre ellos, los nucleósidos modificados juegan un rol protagónico entre las nuevas drogas con potencial actividad antiviral, habiéndose evaluado compuestos modificados tanto a nivel del carbohidrato como de la aglicona. Neplanocina A es un análogo carbocíclico de adenosina que presenta una potente actividad antiviral frente a un amplio espectro de virus [1,2].

Con el objetivo de sintetizar el carboazúcar precursor de Neplanocina A, se propone una secuencia sintética que incluye, entre otras etapas, la biotransformación de bromobenceno con una cepa recombinante de Escherichia coli, E. coli JM109 (pDTG601A), para dar el bromo-cis-ciclohexadiendiol 2 de partida, y la esterificación selectiva de un grupo hidroxilo no alílico frente a uno alílico (pasaje de 3 a 4) utilizando para ello las lipasas A y B de Candida antarctica (CAL A y CAL B) y acetato de vinilo como dador de acilo. Para la obtención de 3 a partir de 2 se realiza la protección del sistema cis-diol como acetónido seguido de reacciones de formación de iodohidrina, epoxidación y apertura en medio acuoso, sobre el doble enlace distal al bromo.

La posterior funcionalización del doble enlace presente en 4, seguida de una ruptura oxidativa y finalmente una ciclación de McMurry dan lugar al carboazúcar de Neplanocina A.

Figura 1. Etapas biocatalíticas en la ruta sintética diseñada para la preparación del carboazúcar de Neplanocina A.

Bibliografía

1. de Clercq, E. Antimicrob. Agents Chemother. 1985, 28, 84-89.

2. Kitaoka, S.; Konno, T.; de Clercq, E. Antiviral Res. 1986, 6, 57-65.

PP-B17

110

Síntesis de 1,3-dicaproilglicerol mediante esterificación enzimática de ácido cáprico y glicerol en solvente orgánico

Daniel Alberto Sanchez, Gabriela Marta Tonetto y María Luján Ferreira dsanchez@plapiqui.edu.ar

Planta Piloto de Ingeniería Química (PLAPIQUI-UNS-CONICET), Camino la Carrindanga km 7, B8000CPB Bahía Blanca, Argentina

Se ha estudiado la síntesis de 1,3-dicaprilglicerol (1,3-dicaprina) [1] por esterificación enzimática de ácido cáprico y glicerol. La lipasa Lipozyme RM IM (Novo Nordisk, A/S) proveniente de Rhizomucor miehei soportada sobre una resina macroporosa aniónica fue utilizada como catalizador en esta reacción [2].

Los principales factores que influyeron en el grado de esterificación y rendimiento de 1,3 dicaprina fueron la cantidad de enzima, temperatura, y relación molar glicerol/ácido. El uso de combinaciones de solventes fue estudiado para mejorar la disponibilidad de glicerol en el medio de reacción, el efecto de este reactivo sobre la actividad de la enzima también fue analizado. Se evaluaron las condiciones que maximizan la obtención del diglicérido de interés minimizando los efectos de acilmigración con la consecuente generación de enantiómeros del diglicérido y tricaprina.

Las óptimas condiciónes de reacción fueron: 250 mg de glicerol adsorbido sobre 500 mg de sílica gel, 110 mg de ácido cáprico, 20 mg de enzima (alimentada en 2 etapas, 10 mg al inicio de la reacción y los restantes a las 3 hs de reacción), 60 ºC y 3ml de n-heptano en un tiempo de reacción de 6 horas. En tales condiciones se logra, además, la máxima actividad enzimática (0.023 mmol ácido consumido por cada mg de enzima soportada). Para estas condiciones se obtuvo una conversión de 72.6 % del ácido, con una selectividad a dicaprina de 75.7 %, 9.6 % a monocaprina y 14.7% a tricaprina.

Figura 1. Esterificación de glicerol utilizando una lipasa 1,3 específica.

Bibliografía

1. Rosu, R.; Yasui, M.; Iwasaki, Y.; Yamane, T. J. Am. Oil Chem. Soc. 1999, 76, 839-843.2. Watanabe, T.; Shimizu, M; Sugiura, M.; Sato, M.; Kohori, J.; Yamada, N.; Nakanishi, K. J. Am. Oil Chem. Soc. 2003, 80, 1201-1207.

PP-B18

111

Esterificação do ácido oléico com alcoóis alifáticos por lipase de 1Candida antarctica e quantificação do biodiesel por RMN H

Isac G. Rosset, Maria C. H. T. Cavalheiro, Elisabete M. Assaf e André L. M. Porto

Laboratorio de Química Orgânica e Biocatálise, Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo CEP 13560-970, São Carlos, São Paulo, Brasil

Reações de esterificação enzimática tem a vantagem de não formar produtos de saponificação, como é observada em processos alcalinos. Assim, o processo enzimático é limpo e requer um menor número de etapas na purificação do biodiesel em comparação aos procesos

1químicos homogêneos . Usualmente, a quantificação é realizada por CG-FID, no entanto, já foi

1 2demostrado que a quantificação por RMN H é eficiente no processo de transesterificação . Neste trabalho foi realizada a esterificação enzimática do ácido oléico com alcoóis alifáticos por lipase de

1C. antarctica e o biodiesel produzido foi quantificado por RMN H.As reações foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 50 mL onde foram adicionados o

ácido oléico (0,5g), 1,5 mL do respectivo álcool (metanol, etanol, n-propanol ou n-butanol) e a enzima (0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5 e 5,0% m/m em relação à quantidade de ácido oléico). A reação permaneceu sob agitação orbital a 32ºC e 130 rpm por 24 h. Após término da reação, a enzima foi filtrada, o álcool remanescente foi evaporado sob pressão reduzida e os produtos foram

1 1quantificados por CG-FID e RMN H. A quantificação por RMN H baseou-se na área dos sinais dos hidrogênios metilênicos (α-CH ) do éster (biodiesel, A) e do ácido oléico (B), obtendo-se uma 2

curva analítica. Como pode-se observar pela figura 1, com 5,0% de enzima foi obtido o melhor rendimento de biodiesel para todos os alcoóis (90,8, MeOH; 96,5, EtOH; n-PrOH, 95,0; 91,0, n-BuOH). Esses resultados mostram que o emprego da catálise enzimática foi eficiente para a

1produção de biodiesel e a metodologia de quantificação por RMN H foi adequada.

Figura 1. Esquema geral da reação de esterificação enzimática do ácido oléico 1

catalisada pela lipase CALB, análise e quantificação por RMN H. (A) α-CH do oleato de etila. 2

(B). α-CH do ácido oléico. (C). Mistura 1/1 oleato de etila/ácido oléico.2

Bibliografía

1. Knothe, G.; Van Gerpen, J.; Krahl, J. The biodiesel handbook, AOCS PRESS, Champaign, Illinois, USA, 2004.2 Rosset, I. G.; Cavalheiro, M. C. H. T.; Assaf, E. M.; Porto, A. L. M. Appl. Catal. A: General 2011, 392, 136-142.

Agradecimentos: À Fapesp e ao CNPq pelo apoio aos projetos (ALMP). Ao CNPq pela bolsa de doutorado (IGR).

PP-B19

112

Triagem de fungos marinhos para a bio-oxidação do (-)-sclareol

1 2 1Mariana Provedel Martins , Jamal Ouazanni , André Luiz Meleiro Porto

mareprovedel@iqsc.usp.br

Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, BrasilInstitut de Chimie des Substances Naturelles, Centre National de la Recherche Scientifique, Paris,

France

As mono-oxigenases do citocromo P450 (CYPs) pertecem a uma superfamília de heme-enzimas que apresenta mais de 4000 membros. Essas enzimas podem ser encontradas em todos os organismos vivos, onde participam das mais diversas vias metabólicas, como na biossíntese de hormônios em animais e de metabólitos secundários em plantas. As CYPs catalisam reações como a hidroxilação de alcanos, N-oxidação, desaminação, desalogenação e epoxidação de olefinas. Dentre as reações realizadas por mono-oxigenases, a hidroxilação de carbonos não-ativados é uma das mais úteis biotransformações devido esta reação ser dificilmente realizada por métodos sintéticos convencionais [1].

Neste trabalho realizou-se uma triagem com 7 fungos marinhos (Aspergillus sydowii Ce19, Penicillium oxalicum F30, Penicillium citrinum F53, Botryosphaeria sp. Br09, Eutypella sp. Br23, Hidropisphaera sp. Br27, Xylaria sp. Br61) para promover a bio-oxidação do sclareol. Os fungos foram cultivados em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo extrato de malte 2% (100 mL)

oem agitador rotativo (28 C, 150 rpm, 72 h). Posteriormente foi adicionado o sclareol (20 mg, 0,065 ommol) e as reações foram mantidas em agitação orbital (150 rpm, 32 C, 5 dias). As reações foram

acompanhadas por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). As reações mostraram que os fungos Botryosphaeria sp. Br09, Eutypella sp. Br23 e Xylaria sp. Br61 promoveram a biotransformação do sclareol. As reações foram realizadas

1 13em quintuplicata para o isolamento e a caracterização dos compostos por RMN H e C. Os produtos obtidos nas bio-oxidações foram o 3-β-hidróxi-sclareol (Botryosphaeria sp. Br09, 62%; Eutypella sp. Br23, 34%; Xylaria sp. Br6, 41%) e o 18-hidróxi-sclareol (Xylaria sp. Br61, 26%).

Bibliografía

1. Pandey, B.; Yun, H.; Kim, B.; Biotechnol. Bioeng. 2010, 105, 697-704.

Agradecimentos: À Fapesp e ao CNPq pelo apoio aos projetos (ALMP) e à Capes pela bolsa de doutorado sanduíche (MPM).

H OH

OH

H

H OH

OH

HHO

fungos marinhos

5 dias, 32oC

sclareol 3-b-hidróxi-sclareol

+ H OH

OH

H

OH18-hidróxi-sclareol

PP-B20

113

Avaliação da redução do citronelal do óleo essencial de Corymbia citriodora por Saccharomyces cerevisiae

1 1 1Gelson Jose Andrade Conceição , Natália Ferreira Duarte , Fernando Torres Machado ,

1Henrique Kuriki

juliana.canto@yahoo.com.br

1Laboratório Integrado de Biocatálise e Síntese (LIBIS), Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de Zooctenia e Engenharia de Alimentos, Pirassununga-SP (13635-900), Brasil.

2Laboratório para o estudo de processos de adsorção e catálise (Lepac), Departamento de Engenharia de Processos, Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas, Campinas(13083-852), Brasil.

Citronelal (3,7-dimetil-6-octenal, 1) é um monoterpeno, predominantemente formado pelo metabolismo secundário de plantas. É tipicamente isolado como uma mistura não-racêmica dos enantiômeros R e S (Figura 1), por destilação à vapor ou extração com solvente, a partir dos óleos de Corymbia citriodora (HOOK) Hill e Johnson (ex Eucalyptus citriodora Hook). O citronelal é, junto com citral, geranial, linalool e citronelol, um dos terpenos mais importantes. A produção anual

2de óleo de citronela (que contém 40-50% de citronelal) é cerca de 2300 toneladas métricas. Os enantiômeros do citronelal possuem odores distintos. Vários trabalhos descrevem a biotransformação de citronelal em compostos de aplicação industrial e sua bioconversão em

3b,4citronelol por enzimas isoladas ou células íntegras. O citronelol (3,7-dimetil-6-octenol) é comercialmente cobiçado por seu caracerístico odor de rosas. Além da sua utilização como matérias primas importantes na indústria de perfumaria, citronelal e citronelol são empregados

5como intermediários na síntese de vários terpenóides naturais tais como 1-mentol. No entanto, a biotrasformação de monoterpenos com células íntegras é uma tarefa desafiadora, pois normalmente o processo é limitado pela toxidade e volatilidade dos substratos e produtos, fomação de subprodutos, dificuldade de transferência de masssa devido baixa solubilidade em água e,

4 conseguentemente, baixo rendimento do produto. A bactéria foi cultivada utilizou-se o meio de cultura descrito por Soccol et al. [3]. As fermentações foram realizadas em um bioreator Multifors

-1contendo o inóculo, o meio de cultura (250 mL) e sorbitol (80 g L ). O sistema foi ajustado para a temperatura (30 °C), pH (6,5) e agitação adequados (100 rpm). A anaerobiose foi mantida através de um fluxo constante de N . Sorbitol, ácido succínico, ácido acético e ácido propiônico foram 2

analisados por HPLC (Agilent 1200 series), equipado com uma coluna Aminex® HPX-87H (Bio -1rad) e detector de índice de refração (RID), operado a 50 °C e utilizando H SO 5 mmol L como 2 4

fase móvel (0,6 mL/min). A concentração final de ácido succínico, ácido acético e ácido propiônico -1

obtidas foram 9,4; 3,5 e 36,5 g L , respectivamente e o rendimento foi de 56%. O carbono total recuperado foi de 72,5%, sugerindo que 27,5% foi usado para crescimento celular e formação de CO . 2

Bibliografía

1. Liu, Y.; Zhang, Y. G.; Zhang, R. B.; Zhang, F.; Zhu, J. Curr.Microbiol. 2011, 62, 152–158.

2. Zhang, A.; Yang, S. T. Process Biochem. 2009, 44, 1346–1351.3. Coral, J.; Karp, S. G.; Vandenberghe, L. P. S.; Parada, J. L.; Pandey, A.; Soccol, C. R. Applied Biochem. Biotechnol. 2008, 151, 333-341.

PP-B21

114

Glucosilación enzimática de hesperetina en presencia de codisolventes

1 1 1 2 2Laura Leemans , Francisco J. Plou , Antonio O. Ballesteros , Daniel Padilla , Rubén de Regil ,

1,2Georgina Sandoval

g.sandoval@csic.es / georgina@confluencia.net

1 Grupo de Biocatálisis Aplicada, Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid (28049), España.

2 Unidad de Biotecnología Industrial, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), Guadalajara, Jalisco (44270), México.

La hesperidina es una flavanona muy abundante en cítricos con excelentes propiedades biológicas potenciales [1]. No obstante, a pesar de presentar dos restos glicosídicos su solubilidad en agua es muy baja; por ello, se comercializa a gran escala un derivado glucosilado de hesperidina que es 10000 veces más soluble que la flavanona de partida [2].

Dado que la aglicona de la hesperidina, denominada hesperetina (Fig. 1), es significativamente más soluble que la hesperidina, tanto en agua como en otros disolventes polares, hemos estudiado su glucosilación directa empleando diversos sistemas enzimáticos.

Figura 1. Estructura de la hesperidina y de su aglicona hesperetina.

El objetivo general del trabajo es la obtención de antioxidantes más estables y con diferentes propiedades físicoquímicas y de biodisponibilidad que permitan extender su uso en los diferentes campos de aplicación.

Dentro de las enzimas capaces de transferir un residuo glicosilo desde un donador hacia un sustrato aceptor, se han ensayado b-fructofuranosidasas, levansacarasas y ciclodextrina-glucanotransferasas (CGTasas). Éstas últimas han resultado ser las más exitosas. Se ha estudiado el efecto del medio de reacción (adición de codisolventes en distintas proporciones para favorecer la solubilidad de la hesperetina), del donador de glucosilo (almidón, ciclodextrinas) así como de otras variables de reacción.

Bibliografía

1. Dong, S.; Zeng, M.; Wang, D., Liu, Z.; Zhao, Y.; Yang, H. Food Chem. 2008, 107, 1485-1493.2. Zhang, J.; Tozuka, Y.; Uchiyama, H.; Higashi, K.; Moribe, K., Takeuchi, H.; Yamamoto, K. J. Pharm. Sci. 2011, 100(10), 4421-4431.

O

OH

O

OH O

O

O

OHHO

HO

O

O

OH

HO

HO

Hesperidina

O

OH

O

OH O

HO

Hesperetina

PP-B22

115

Influência da Correção do pH Reacional no Teor de Proteínas do Hidrolisado Enzimático de Farelo de Soja

Raquel Ströher, André Álvares Monge Neto, João Henrique Dantas, Gisella Maria Zaninikedantas@yahoo.com.br

Laboratório de Tecnologia Enzimática, Departamento de Engenharia Química, Universidade Estadual de Maringá, Maringá-PR (87020-220), Brasil.

A introdução na dieta de hidrolisados enzimáticos ricos em pequenos peptídeos pode ser importante, no sentido de propiciar uma melhor utilização das proteínas [1]. Especificamente para a proteína de soja, os hidrolisados produzidos têm várias aplicações em fórmulas nutricionais destinadas a adultos, geralmente utilizados em combinação com outros hidrolisados de proteínas ou então com proteínas intactas [2].

Neste trabalho, foi realizada a hidrólise enzimática do farelo de soja utilizando a enzima Alcalase® 2.4 L na concentração de 1% proteína enzima/proteína substrato, sob as seguintes condições: (A) a 60 °C, sem correção do pH, em shaker/incubadora; (B) a 60 °C, pH 6,8, em pH stat; (C) a 50 °C, pH 8,0, em pH stat. Determinou-se o teor de proteína dos hidrolisados obtidos (sobrenadantes das reações) e também dos sólidos restantes pelo método de Kjeldahl utilizando-se o valor de 6,25 como fator de conversão de nitrogênio.

Pelos resultados obtidos verificou-se que todas as condições empregadas extraíram a proteína do farelo de soja. Considerando que o teor proteico do farelo de soja utilizado nos experimentos é 49%, a reação em shaker a 60 °C extraiu em torno de 50% da proteína inicialmente presente nesse substrato. Sendo assim, o sólido remanescente da reação ainda contém uma quantia considerável de proteína e pode ser aproveitado para a fabricação de produtos destinados à alimentação animal. Comparando-se as reações sob as condições (A) e (B), verificou-se um teor de proteína bruta bastante semelhante. Sendo assim, a correção do pH do meio reacional sob a temperatura de 60 °C não é indicada pois acrescenta substâncias químicas ao produto final, sem que aumente significativamente a quantidade de proteína presente no hidrolisado. Em comparação com a reação (A), as condições de menor temperatura e maior pH da reação (C) não aumentaram o teor de proteína solubilizada pela enzima.

Concluiu-se que a correção do pH desse meio reacional não é indicada pois incorpora reagentes inorgânicos ao produto final da reação sem favorecer o aumento do teor de proteína presente no hidrolisado.

Bibliografía

1. Afonso, W. O.; Biasutti, E. A. R.; Geraldi, L. M.; Silva, V. D. M.; Capobiango, M.; Silvestre, M. P. C. Rev. Soc. Bras. Alim. 2009, 34, 97-114.2. Hrcková, M.; Rusnáková, M.; Zemanovic, J. Czech J. Food Sci. 2002, 20, 7-14.

PP-B23

116

Glicosilación enzimática de hidroxiurea: una estrategia para aumentar su selectividad

Cecilia Porciúncula, Gabriela Irazoqui, Cecilia Giacominidcpg@fq.edu.uy

Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo (C.P. 11800), Uruguay

La investigación en nuevas terapias para el cáncer es un área en permanente desarrollo. Si bien existen drogas quimioterápicas efectivas generalmente presentan enormes desventajas como baja selectividad y alta toxicidad lo que genera efectos secundarios nocivos. Por esta razón continúa vigente la búsqueda de fármacos que presenten mayor selectividad por los tejidos tumorales; dado el mayor consumo de monosacáridos de estos tejidos respecto a los tejidos normales, se propone como estrategia para lograr este objetivo la glicosilación de drogas antineoplásicas.

La hidroxiurea es un antineoplásico utilizado en la terapia contra cáncer en particular para ciertos tipos de leucemias, melanoma, así como también en determinados tipos de cáncer de ovario. Dadas las características de esta molécula, pequeña y con un grupo hidroxilo, es un aceptor potencialmente adecuado para ser glicosilado enzimáticamente, lo cual es el objetivo principal del presente trabajo.

La glicosilación de hidroxiurea se llevó a cabo utilizando el sistema de transglicosilación catalizado por la beta-galactosidasa de Aspergillus oryzae, lactosa (80 mM- 347 mM) e hidroxiurea (87 mM- 500 mM) como donor y aceptor del grupo galactosilo respectivamente.

Figura 1. Esquema de síntesis del compuesto galactosil-hidroxiurea

Las máximas concentraciones de hidroxiurea (111 mM) se alcanzaron entre los 60 y 120 minutos cuando la relación de concentraciones lactosa: hidroxiurea fue de 1.4: 1 (347 mM: 248 mM) y 25° de temperatura. La galactosil hidroxiurea se purificó por cromatografía de exclusión molecular a los efectos de poder confirmar su estructura. Se observó un efecto inhibitorio de la hidroxiurea sobre la enzima en el rango de concentraciones utilizadas en el trabajo, siendo más pronunciado en el entorno de 0,5M.

Los excelentes resultados obtenidos en la glicosilación enzimática de hidroxiurea convierten a este sistema de transglicosilación en una potencial herramienta biotecnológica aplicable para la glicosilación de otras drogas quimioterápicas.

PP-B24

117

Crecimiento de Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson LPSC # 876 sobre escamas de quitina

1, 2 1, 2 1María Cecilia Gortari , Betina Galarza , Roque Alberto Hours

gortari@biotec.org.ar

1Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI; UNLP, CONICET La Plata). Fac. de Cs. Exactas, UNLP. 47 y 115, La Plata (B1900ASH), Argentina

2CIC-PBA

La quitina, el aminopolisacárido biodegradable más abundante en la naturaleza, está presente en varios organismos pero se obtiene fundamentalmente del exoesqueleto de los crustáceos [1]. Este biopolímero y sus derivados tienen aplicaciones en la industria alimenticia, farmacéutica, cosmética y textil, en el tratamiento de residuos y en agricultura. Los métodos tradicionales de obtención de quitina de residuos de crustáceos no sólo afectan las propiedades del producto sino que constituyen un problema medioambiental y económico. Esta situación ha generado interés en la aplicación de procesos biotecnológicos para el tratamiento de estos residuos considerando que los microorganismos son los principales degradadores ambientales de la quitina [2]. El objetivo de este trabajo fue evaluar el crecimiento sobre quitina y la producción enzimática de un hongo autóctono, Paecilomyces lilacinus LPSC # 876.

Paecilomyces lilacinus se cultivó durante 22 días en un medio compuesto por escamas de quitina de cangrejo humedecidas con Medio Mínimo. Se estimó la biomasa a partir del contenido de proteína total y la producción de enzimas extracelulares quitinolíticas y proteolíticas a partir de extractos crudos. El contenido proteico se determinó por el método de Bradford. La actividad quitinolítica total se midió a través de la cantidad de poder reductor liberado por el método de Somogyi-Nelson usando N-acetyl-D-glucosamina (GlcNAc) como patrón y la actividad proteolítica se estimó sobre azocaseina. La detección de GlcNAc como producto final se evaluó por cromatografía de alta resolución (HPLC).

El hongo creció utilizando a la quitina como única fuente de C y N, con producción de ciclos de actividad de quitinasa. La disminución de esta actividad podría explicarse por una rápida utilización de partículas de sustrato biodisponibles y la consecuente formación de productos potencialmente represores, por una limitación de elementos nutritivos o por la desnaturalización enzimática producida por la actividad proteolítica del hongo. La producción de proteasas, proteínas solubles y biomasa se produjo a expensas de la actividad quitinolítica. El nivel más alto de proteasas fue coincidente con una disminución de la actividad quitinolitica. Bajo las condiciones del ensayo se detectó GlcNAc como parte de los productos de biotransformación.

Las escamas de exoesqueleto de cangrejo resultaron adecuados para el crecimiento de P. lilacinus y para la inducción de enzimas quitinoliticas y proteolíticas. P. lilacinus no ha sido utilizado en la biotransformación de residuos quitinosos, sin embargo esta experiencia constituye un primer aporte en la iniciación de estos estudios.

Bibliografía

1. Suraini, A. A.; Teoh, L. S.; Noorjahan, A.; Neelam, S.; Kamarulzaman, K. J. Biol. Sci. 2008, 8(1), 52-59.2. Al-Sagheer, F. A.; Al-Sughayer, M. A.; Muslim, S.; Elsabee, M. Z. Carbohyd. Polym. 2009, 77, 410-419.

PP-B25

118

Producción de enzimas queratinolíticas utilizando un residuo sólido de curtiembre

1 2 1Betina Galarza , Cecilia Gortari , Carlos Cantera

betinagal@hotmail.com

1Laboratorio de Desarrollo, Inti-Cueros ( Citec-CICPBA), La Plata (1900),Argentina2Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales CINDEFI (CCT-La Plata,

CONICET). Fac de Ciencias Exactas, UNLP, (1900), Argentina

Las enzimas fúngicas queratinolíticas obtenidas a partir de cultivos en medio sólido y líquido han demostrado tener actividad frente a los distintos sustratos proteicos de origen queratínico y no queratínico, lo que las hace aplicables a las distintas etapas de la tecnología del cuero.

En este estudio se llevó a cabo la determinación de los parámetros de crecimiento de Trichophyton ajelloi en medio líquido sumergido (batch) adicionado con distintas concentraciones de glucosa como potenciador para la producción de enzimas queratinolíticas.

Se realizaron cultivos de Trichophyton ajelloi en medio líquido (batch) utilizando “residuo pelo vacuno” (RP) proveniente de un depilado conservador del pelo en tecnología del cuero al 1%

4en un medio mineral mínimo de buffer fosfato con trazas de Fe, Zn y Ca. El inóculo fue de 10 ufc/ml y se agregaron distintas concentraciones de glucosa: 2,5 g/l (1); 5 g/l(2);10 g/l(3)[1]. También se incubaron: medio sin glucosa (4) y otro igual con 5mM de ácido tioglicólico (5). De cada sistema se extrajeron muestras cada 3 o 4 días durante 28 días para determinar los siguientes parámetros: actividad azocaseinolítica y queratinolítica, concentración de: proteínas, amonio, sulfhidrilos en el sobrenadante del cultivo y de la actividad queratinolítica, glucosa remanente,

Se observa que en el medio 3 se alcanza un máximo en la actividad azocaseinolítica en el día 25 de cultivo que supera en 24.4 unidades el valor del mismo parámetro en relación al medio 4. La concentración de sulfhidrilos libres en el sobrenadante del cultivo y en el de la actividad queratinolítica es dosable en todas las muestras. La máxima concentración de amonio se produce en el medio 5 en el día 28 debido al efecto reductor del ácido tioglicólico sobre los enlaces disulfuro de la queratina que facilita la proteólisis [1]. La alta concentración de amonio liberado en la degradación de la proteína queratina, no interfirió en la síntesis enzimática.

Finalmente se concluye que la adición de glucosa actuó como inductor positivo en la síntesis de enzimas queratinolíticas, posiblemente al aumentar la generación de biomasa, constituyendo una alternativa eficiente para la producción enzimática.

Bibliografía

1. Matikevičienė, V.; Grigiškis, S.; Levišauskas, D.; Sirvydytė, K.; Dižavičienė O.; Masiliūnienė

D.; Ančenko O. Env. Tech. Res. Proc. 8th. Int. Sc. Pract. Conf. 2011, 1, 294-300.

PP-B26

119

Biotransformación de vinaza en biomasa utilizando levaduras

†Juan Manuel Alfaro, María Rita Martearena, Elsa Scaroni y Silvano Locatelli

jmalfaro@exa.unsa.edu.ar

Consejo de Investigación Universidad Nacional de Salta, Instituto de Investigaciones para la Industria Química, Universidad Nacional de Salta, Salta (A4408FVY), Argentina.

† Ing. Silvano Locatelli, fallecido el 16 de junio de 2012

Entre los residuos industriales más abundantes en la Región del Noroeste Argentino se puede citar a la vinaza, un subproducto del proceso de obtención de etanol a partir de la melaza y de jugos de caña de azúcar. Posee alta cantidad de materia orgánica, 50 - 70 g/L aproximadamente como demanda química de oxígeno (DQO) [1] y es uno de los residuos más recalcitrantes [2]. Investigaciones han demostrado que la eliminación de la vinaza en las cuencas de los ríos no es una solución adecuada ya que puede causar daño a la vida acuática, especialmente cuando es arrojado en grandes volúmenes. El objetivo de este trabajo es estudiar los parámetros que influyen en el desarrollo de Rhodotorula mucilaginosa utilizando vinaza como fuente de carbono, con el fin de reducir la contaminación sobre el medio ambiente y obtener un producto que pueda ser utilizado como enmienda orgánica en suelos. Se inoculó 0.08 g/L de Rhodotorula mucilaginosa en vinaza obtenida de un Ingenio azucarero de la Provincia de Salta (73 g/L DQO), con el agregado de sulfato de amonio. Se incubó a distintas temperaturas (24, 30, 37, 40 y 50ºC) y pH (5, 6 y 6,5) durante siete días a 180 rpm. Se tomaron muestras a distintos tiempos, se centrifugaron, se secaron, se determinó la biomasa producida en g/L y la velocidad de crecimiento en g/L h. En la biomasa obtenida se analizó el contenido de nitrógeno por el método de Kjeldhal y el de potasio por absorción atómica. Al sobrenadante se le determinó DQO. Los mejores resultados se obtuvieron a 30ºC y pH 6 con una producción de biomasa de 14.8 g/L y con una velocidad de crecimiento de 0.210 g/l h. Al final del tratamiento biológico se determinó la DQO en el sobrenadante lográndose una eficiencia de conversión del 80% de la materia orgánica de vinaza. La biomasa obtenida tiene 7.7% de nitrógeno, 48 % de proteínas y 1.26 % de potasio. Comparando estos datos con el abono más utilizado en el NOA, el estiércol vacuno: 1.1 - 3%N y 0.8 - 2%K, la biomasa producida podría ser aprovechada como enmienda orgánica para suelos.

Bibliografía

1. Scaroni, E.; Martearena M. R.; Alfaro, J. M.; Locatelli S. Revista Argentina de Microbiología 2010, Supl. 1, 42, 222-223.2. Fitzgibbon, F.; Nigam, P.; Singh, D.; Archant, R. J Basic. Microbiol. 1995, 35, 293-301.

PP-B27

120

Hidroxilación de (-)-Ambróxido por Aspergillus niger

Nancy Manzano, Vanesa Brochero, Cintia Cánovas, Jorge Allendes, Daniel Bustoslicnancymariela@hotmail.com

Instituto de Ciencias Básicas, FFHA, UNSJ, Av. I. de la Roza 230 (O)-5400-San Juan Argentina

El (-)- ambróxido (1) es un compuesto terpénico accesible comercialmente; es también un sustrato atractivo para la biotransformación dado que está estructuralmente relacionado con algunas fitoalexinas. La transformación de compuestos orgánicos se puede llevar a cabo por microorganismos a través de reacciones enzimáticas, utilizando enzimas oxidativas como mono- y dioxigenasas o peroxidasas, mediante el uso de células enteras sin necesidad de agregar un cofactor [1]. Es posible realizar biotransformaciones en centros pocos reactivos químicamente, como la oxidación de enlaces C-H de hidrocarburos para la obtención de compuestos oxifuncionalizados [2].

La reacción de biotransformación de (-)-ambróxido (1) se llevó a cabo mediante un protocolo en dos etapas usual en nuestro laboratorio, pero en esta ocasión se partió de una suspensión de esporas del hongo seleccionado agregada al medio de cultivo líquido Sabouraud, en

4una concentración final de 2.7 x10 esporas/mL de medio. En la segunda etapa se agregó una solución del sustrato 1, de manera de lograr una concentración final de 0.2 mg/mL de medio. El seguimiento se realizó por cromatografía en capa delgada [3].

De los metabolitos logrados se identificó, inequívocamente, el diol 3β, 14-dihidroxiambroxido (2) al compararse con una muestra auténtica del mismo compuesto obtenida anteriormente en nuestro laboratorio, utilizando un protocolo distinto al descripto. Se determinó la capacidad antioxidante del metabolito 2, comparándola con el compuesto de partida 1. De acuerdo a los datos de la bibliografía, este compuesto es totalmente nuevo ya que no ha sido reportado anteriormente.

Bibliografía

1. Leuenberger, H. G. W. Pure & Appl. Chem. 1990, 62, 753-776.2. Barnes, A. G.; Bevan, P. C., US Patent 4585737, 1986.3. Castellanos, F.; Villamil A.; López C. Scientia et Technica 2007, XIII, 137-140.

PP-B28

121

Preparación de análogos acíclicos quirales de nucleósidos mediante el uso de aldolasas dependientes de piruvato

1 1,2 1Martín Palazzolo , Adolfo Iribarren y Elizabeth Lewkowicz

mpalazzolo@unq.edu.ar

1Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal (1876), Argentina.

2Laboratorio de Química de Acidos Nucléicos, INGEBI (CONICET), Ciudad Autónoma de Buenos Aires (1428), Argentina.

Los nucleósidos modificados son moléculas clave en el tratamiento de un amplio espectro de infecciones virales debido a su acción sobre enzimas blanco. Hasta la fecha, más de 40 análogos de nucleósidos han sido aprobados en terapias contra los virus del herpes, los retrovirus, los virus de las hepatitis B y C y el citomegalovirus, entre otros [1].

El descubrimiento de la actividad antiviral de dos análogos acíclicos de guanosina y adenosina en 1978, 9-(2-hidroxietoximetil)-guanina, conocido como aciclovir, y S-9-(2,3-dihidroxipropil)-adenina (S-DHPA) respectivamente, dio inicio al estudio de este tipo de compuestos. Estas estructuras poseen una cadena alquílica unida a un átomo de N de la base nitrogenada, sustituida con al menos un grupo hidroxilo, que simula el anillo furanósico de los nucleósidos naturales. El enlace N-C de los derivados acíclicos posee mayor estabilidad química y enzimática respecto de la unión N-glicosídica de los nucleósidos naturales [2].

Las aldolasas son enzimas que catalizan reacciones de formación de nuevos enlaces C-C estereoselectivamente [3]. Por ello, constituyen una herramienta promisoria y novedosa para producir análogos acíclicos quirales de nucleósidos a través procesos con menor impacto ambiental respecto de las tradicionales metodologías de síntesis orgánica.En el presente trabajo, se utilizaron dos enzimas complementarias, la 2-oxo-4-hidroxi-glutarato aldolasa (KHGA) y la ácido siálico aldolasa (NeuAcA), para preparar estructuras análogas a DHPA mediante la condensación de piruvato y distintas bases nitrogenadas purínicas y pirimidínicas conteniendo un grupo 2-oxoetilo en las posiciones N-9 y N-1 (Figura 1), respectivamente, con buenos rendimientos. Actualmente, se encuentra en estudio la estereoselectividad de las biotransformaciones desarrolladas

Figura 1. Síntesis de análogos de nucleósidos acíclicos biocatalizada por aldolasas.

Bibliografía

1. De Clercq, E. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2011, 51, 1-24.2. D'Alonzo, D.; Guaragna, A.; Palumbo, G. Chem. Biodiversity 2011, 8, 373-413.3. Cheriyan, M.; Toone, E. J.; Fierke, C. A. Biochemistry 2012, 51, 1658−1668.

PP-B29

122

Reducción de una dicetona terpénica por vegetales y microorganimos endofíticos

Paula Rodriguez, Lucía Zeballos, Adrian Anzorena, Carmela Molinaro, Pilar Menéndez, Sonia Rodríguez y David Gonzalez

paularod@fq.edu.uy

Laboratorio de Biocatalaisis y Biotransformaciones, DQO-DepBio, Facultad de Química, Universidad de la República (UdelaR), Montevideo (11200), Uruguay

Los compuestos terpénicos obtenidos a partir de aceites esenciales son utilizados en perfumería y cosmética por su aroma, volatilidad y abundancia natural. También se los estudia por su potencial como antimicrobianos y plaguicidas naturales de baja toxicidad. Los terpenos oxigenados son los más valiosos y menos abundantes por lo que nuestro grupo ha estudiado la oxidación (oxigenación) biocatalítica de hidrocarburos terpénicos como el 1,8-cineol [1]. Asimismo, compuestos obtenidos por la oxidación química del 1,8-cineol pueden resultar sustratos de interés para la reducción biocatalítica del grupo carbonilo.

Recientemente, estudiamos la biorreducción de la dicetona 1 obtenida químicamente. En nuestro estudio, observamos que al exponer el compuesto 1 a una suspensión de fragmentos de Curcubita máxima se obtuvieron los compuestos 2 y 3. Durante el experimento se aislaron dos microorganismos endofíticos: la levadura Wickerhamomyces anomalus Z1 y la bacteria Leuconostoc sp. Z2. Al realizar la biotransformación de 1 con los microorganismos aislados la levadura endófita dio lugar al compuesto 2 mientras que durante el ensayo con la bacteria se formó únicamente el fenol 3, presumiblemente por un mecanismo no enzimático [2]. La reducción lograda con W. anomalus Z1 dio lugar a un compuesto ópticamente activo. Esto sugiere que la levadura estaría involucrada en la reducción de la dicetona 1 mediada por C. máxima.

Bibliografía

1. Rodriguez, P.; Sierra, W.; Rodríguez, S.; Menéndez, P. Biotechnol. J. 2006, 9, 212-216.2. De Boggiatto, M. V.; De Heluani, C. S.; De Fenik, I. J. S.; Catalán, C. A. N. J. Org. Chem. 1987, 52, 1505-1511.

O

OO

O

OH

O

+

Wickerhamomyces anomalus Z1

aD = +52

H1 2 3

OHHO

C. maxima

PP-B30

123

Estudio de diferentes lacasas para la biotransformación de sustratos no fenólicos

Victoria Giorgi, Emiliana Botto, Carlos García y María del Pilar Menéndezvgiorgi@fq.edu.uy

Laboratorio de Biocatálisis y Bioransformaciones, Departamento, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo 11800, Uruguay

Las lacasas son enzimas oxidorreductasas que catalizan la oxidación de diferentes sustratos aromáticos, particularmente fenólicos, acoplado con la reducción de oxígeno molecular a agua [1]. Son producidas por diferentes organismos y cumplen un rol importante en la naturaleza ya que forman parte del metabolismo de la lignina. Sin embargo, el potencial redox de las mismas no es lo suficientemente alto para oxidar compuestos que no sean fenólicos. A pesar de eso, en presencia de moléculas conocidas como “mediadores” que actúan transfiriendo un electrón, las lacasas son capaces de oxidar estructuras no fenólicas y compuestos de alto potencial redox. Existen numerosas sustancias reportadas como mediadores, dentro de las que se encuentran el ABTS, TEMPO y HBT [2]. El interés en estas enzimas “amigables con el medio ambiente” ha crecido enormemente en los últimos años gracias a sus diversas aplicaciones que van desde ser utilizadas para la industria textil y para la producción de pulpa de celulosa hasta su utilización para procesos de biorremediación y síntesis orgánica [3].

En este trabajo se presenta el uso del sistema lacasa + mediador, para la biotransformación de sustratos no fenólicos. Las enzimas utilizadas se obtuvieron de distintos basidiomycetes aislados de plantaciones de Eucalyptus del Uruguay.

Bibliografía

1. Mayer, A. M., Staples R. C. Phytochemistry 2002, 6, 551-565.2. Burton S. G. Curr. Org. Chem. 2003, 7, 1317-1331.3. Ncanana, S.; Baratto, L.; Roncaglia, L.; Riva, S.; Burton, S. G. Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 1507-1513.

PP-B31

124

Preparación quimioselectiva de derivados de nucleósidos N-monoacetilados

1 1 1,2 1 Cyntia M. Palacio , María B. Sabaini , Adolfo M. Iribarren y Luis E. Iglesias

msabaini@unq.edu.ar

Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal (1876), Buenos Aires, Argentina.

2 Laboratorio de Síntesis de Ácidos Nucleicos, INGEBI (CONICET), Capital Federal (1428), Buenos Aires, Argentina.

De los fármacos antivirales y antitumorales desarrollados hasta el presente, un gran número pertenece al grupo de los nucleósidos modificados, cuya especificidad se debe a la inhibición selectiva de enzimas involucradas en los metabolismos virales y de

células tumorales de nucleósidos y nucleótidos [1]. En la preparación de dichos análogos uno de los problemas centrales es lograr la reactividad selectiva de los diversos grupos nucleofílicos presentes en el nucleósido. En este sentido, en la síntesis de oligonucleótidos los grupos aminos exocíclicos deben ser previamente protegidos, lo que suele efectuarse empleando estrategias químicas de protección-desprotección [2].

El presente trabajo describe una alternativa para la preparación de derivados N-monoacetilados de nucleósidos mediante una desacetilación quimioselectiva, aprovechando el ya conocido potencial de las enzimas hidrolíticas [3]. De esta forma, se obtuvieron diferentes derivados de ribo- (6, 7, 10) y 2'-desoxirribonucleósidos (8, 9) bajo condiciones suaves de reacción y con altos rendimientos (88-100%). Cabe destacar que los resultados más satisfactorios se observaron empleando como biocatalizadores las acilasas I de Aspergillus sp, y de riñón de cerdo, y la lipasa B de Candida antarctica. Particularmente, las acilasas I mostraron quimioselectividad hacia la hidrólisis del éster y no de la amida. Estos resultados no sólo amplían la información sobre la selectividad de estas enzimas sino que también demuestran por primera vez sus aplicaciones sintéticas en el campo de los nucleósidos.

Figura 1. Obtención quimioselectiva de nucleósidos N-monoacetilados empleando diversas hidrolasas.

Bibliografía

1. Cihlar, T.; Ray, A. Antiviral Res. 2010, 85, 39-58.2. Reese, B. Org Biomol Chem. 2005, 3, 3851-3868.3. Li, N.; Smith, J.; Zong, M. Biotechnol Adv. 2010, 28, 348-366.

1

PP-B32

125

Fosfotriesterasas en la síntesis biocatalizada de potenciales prodrogas nucleotídicas

1 1 1 1,2Lucas A. Dettorre , Julia Y. Santillán , Elizabeth S. Lewkowicz y Adolfo M Iribarren .

ldettorre@unq.edu.ar

1Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal (1876), Buenos Aires, Argentina.

2Laboratorio de Química de Ácidos Nucleicos, Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI), CONICET-UBA, Buenos Aires (1428), Argentina.

Actualmente, numerosas drogas antivirales y antitumorales son antimetabolitos pertenecientes a la familia de los análogos nucleosídicos. Sin embargo, la administración directa de este tipo de fármacos posee ciertas desventajas: suelen ser rápidamente catabolizados a derivados inactivos, poseen baja biodisponibilidad y en algunos casos, requieren un primer paso de fosforilación enzimática para producir el nucleósido 5'-monofosfato (NMP), intermediario metabólico del nucleósido 5'-trifosfato (NTP), la droga activa [1].

En este sentido, el empleo de prodrogas de nucleótidos (pronucleótidos o ProTides) se ha transformado en una alternativa prometedora. Se trata de compuestos nucleotídicos en los que un NMP ha sido derivatizado con funcionalidades que eliminan la carga del grupo fosfato y que pueden ser removidos intracelularmente. Esto permite la libre difusión a través de membranas biológicas y evita el primer paso limitante de fosforilación.

En nuestro laboratorio, con el objetivo de efectuar la síntesis biocatalizada de este tipo de prodrogas, hemos evaluado el empleo de fosfotriesterasas (PTEs, EC.3.8.1.1) en la preparación de nucleósidos 5'-dimetilfosfato (DMIMP) [2]. Las PTEs son enzimas que naturalmente catalizan la hidrólisis estereoselectiva de organofosfotriésteres [3]. Nuestros estudios han demostrado que, además de hidrolizar este tipo de compuestos, son capaces de catalizar la transesterificación de ciertos fosfotriésteres empleando alcoholes como nucleófilos.

En este trabajo se presentarán los resultados obtenidos partiendo de metilparaoxón (MPO), empleando la PTE parcialmente purificada de Brevundimonas diminuta y diversos nucleósidos naturales y modificados como nucleófilos en medio orgánico anhidro. Mediante esta metodología, ha sido posible sintetizar 5'-dimetilfosfato de inosina, 2',3'-O-diacetilinosina, 2',3'-O-isopropilideninosina, arabinoinosina, 2'-desoxiinosina, adenosina, guanosina, citidina, uridina y timidina con conversiones de hasta el 96% respecto de MPO. Estos resultados demuestran que es posible utilizar el biocatalizador con fines sintéticos y su versatilidad en relación a la aceptación del sustrato nucleosídico.

Bibliografía

1. Lavie, A.; Konrad, M. Mini-Rev. Med. Chem. 2004, 4, 351-359.2. Iribarren, A; Lewkowicz, E; Dettorre, L. PCT International application PCT/EP 2011/06 6988.3. Bigley, A.N.; Raushel, F. M. Biochim. Biophys. Acta 2012, en prensa.

PP-B33

126

Procesos de desimetrización enzimática catalizados por lipasas. La autopista hacia una nueva familia de compuestos con potenciales

aplicaciones en organocatálisis

Vicente Gotor-Fernández, Daniel Méndez-Sánchez, Eduardo Busto, Nicolás Ríos-Lombardía y Vicente Gotor

vicgotfer@uniovi.es

Departamento de Química Orgánica e Inorgánica, Instituto Universitario de Biotecnología de Asturias, Universidad de Oviedo, Oviedo (33006), España

Una de las mayores demandas por parte del sector químico industrial es la preparación de moléculas orgánicas ópticamente activas, debido al diferente perfil biológico que presentan sus estereoisómeros. En este sentido la Biocatálisis proporciona herramientas muy útiles para el desarrollo de procesos de resolución cinética de racematos,1 o bien de desimetrización enzimática de compuestos proquirales.2 Sin embargo, la asimetrización enzimática de formas meso permanece aún hoy en día escasamente explorada.

Recientemente, el grupo de Seidel ha sido capaz de llevar a cabo la desimetrización exitosa de meso-1,2-diaminas, por medio de un proceso de benzoilación químico estereoselectivo, a través de la acción cooperativa de dos catalizadores, la 4-(N,N-dimetilamino)piridina y un complejo quiral de tiourea.3 Tomando una aproximación enzimática, nuestro grupo de investigación ha desarrollado el estudio de procesos de desimetrización de diferentes meso-1,2-diaminas catalizadas por lipasas (Figura 1). Este tipo de procesos ha permitido el aislamiento de una serie de interesantes monocarbamatos con elevadas purezas ópticas y buenos rendimientos.

Figura 1. Procesos de desimetrización de meso-1,2-diaminas

Bibliografía

1. Hudlicky, T.; Reed, J. W. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 3117-3132.2. García-Urdiales, E.; Alfonso, I.; Gotor, V. Chem. Rev. 2005, 105, 313-354 (una actualización ha sido recientemente publicada en Chem. Rev. 2011, 111, PR110-PR180).3. De, C. K.; Seidel, D. V. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 14538-14541.

NH2

NH2

R1

R1

Enzima+

O OR3

O

R2

Disolvente orgánico

NH

NH2

R1

R1

O

R2O

**

formas meso

PP-B34

127

Síntese de ésteres do biodiesel empregando lipases de Burkholderia cepacia LTEB11 produzidas por fermentação no estado sólido

1 1 2Diniara Soares , David Alexander Mitchell , Nadia Krieger

nkrieger@ufpr.br

1 Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná, Curitiba (Cep 81531-980), Brasil

2Laboratório de Tecnologia Enzimática e Biocatálise, Departamento de Química, Universidade Federal do Paraná,Curitiba (Cep 81531-990), Brasil

O uso de ésteres de ácidos graxos como biocombustível renovável é uma alternativa

potencial para substituição dos combustíveis de origem fóssil. A catálise enzimática para a síntese

de biodiesel utilizando lipases possui diversas vantagens quando comparada aos processos que

utilizam catalisadores químicos, como atuação em condições brandas, biodegradabilidade do

catalisador, redução de água de lavagem e de contaminantes. No entanto, estes processos

demandam enzimas estáveis, com custo reduzido, e que sejam passíveis de reutilização.

O presente trabalho teve por objetivo o estudo da síntese enzimática de ésteres etílicos por

esterificação de diferentes fontes de ácidos graxos e etanol utilizando o sólido contendo a lipase de

Burkholderia cepacia LTEB11 produzida por fermentação no estado sólido (FES). O sólido

fermentado (SF) foi produzido por fermentação de uma mistura de bagaço de cana-de-açúcar e

farelo de semente de girassol (50:50 m/m), a 29°C, por 72 h. Após fermentação, o sólido foi seco até

umidade menor do que 10% em uma coluna com fluxo de ar seco. O sólido contendo lipases foi

utilizado diretamente no meio reacional de esterificação, sem extração e purificação da enzima.

Inicialmente foi avaliada a atividade de esterificação do SF com os ácidos palmítico, esteárico,

oleico e linoleico, que são os principais ácidos graxos constituintes do biodiesel. Além destes,

foram determinadas também a atividade de esterificação com misturas de ácidos graxos

provenientes da hidrólise do óleo de soja, óleo e gordura residual, sebo animal e borra ácida

proveniente do processo de refino do óleo de soja. Para isto, foram feitas reações em frascos

mantidos em um agitador orbital a 200 rpm, a 40°C. Em cada frasco foi adicionado 800 mg de SF e

10 mL de meio reacional composto por 70 mM de ácido graxo e 210 mM etanol na presença do

cossolvente hexano (96% v/v). A maior atividade de esterificação quando se utilizaram ácidos -1

graxos puros foi obtida com o ácido palmítico (12,7 U.gSS ). Dentre as misturas de ácidos graxos

testadas, as maiores atividades de esterificação foram obtidas utilizando como substrato os ácidos -1 -1

graxos do óleo de soja (6,8 U.gSS ) e da borra ácida (7,0 U.gSS ), com conversões superiores a

90% em 4 h de reação.

O uso de fontes de ácidos graxos de baixo custo e a aplicação do sólido fermentado

diretamente no meio reacional contribui para a redução dos custos dos processos industriais de

produção de biodiesel utilizando lipases.

PP-B35

128

Biotransformación del alcohol perílico por Aspergillus niger

1 1 1 2 3Roxana Aciar , Melisa Rosa , Martha Mansú Re , Lisandro Hergert , Soledad Ravetti y Daniel

1Bustos

raciar@gmail.com

1Instituto de Cs. Básicas, FFHA, Universidad Nacional de San Juan, San Juan (5400), Argentina2Instituto Académico Pedagógico de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Nacional de Villa

María, Córdoba, Argentina3Dpto. Farmacia, Fac. Cs. Qs., Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba (5000), Argentina

La biotransformación microbiana es una estrategia relevante para obtener compuestos naturales de alto valor agregado a través de procesos amigables con el medio ambiente1.

Los hongos fitopatógenos tienen la capacidad de modificar químicamente una amplia variedad de compuestos orgánicos convirtiéndolos en productos estructuralmente relacionados.

En el presente trabajo se evalúan las biotransformaciones realizadas por el hongo filamentoso fitopatógeno Aspergillus niger sobre el sustrato alcohol perílico, empleando el medio de cultivo líquido Sabouraud.

El alcohol perílico (POH) es un monoterpeno, derivado hidroxilado de limoneno, con un gran valor farmacéutico y comercial. Es una sustancia con baja toxicidad, propiedades terapéuticas y actividad quimiopreventiva y/o quimioterapéutica contra una amplia variedad de cánceres 2,3.

En la biotransformación se obtienen los productos metabólicos aldehído perílico y ácido perílico.

Los productos de la transformación microbiana se identifican mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) y resonancia magnética nuclear de protón y

1 13carbono (RMN H y C).

Bibliografía

1. Leuenberger H. G. W. Pure & Appl. Chem. 1990, 62(4), 753-768.2. Keiloff, G. J.; Boone, C. W.; Crowell, J. A.; Steele, V. E.; Lubet, R. A.; Doody, L. A.; Malone, W. F. ; Hawk, E. T.; Sigman, C. C. J. Cell Biochem. Suppl. 1996, 26, 1–28. 3. Yeruva, L.; Pierre, K. J.; Elegbede, A.; Wang, R. C.; Carper, S.W. Cancer Lett. 2007, 2, 216–226.

PP-B36

129

Aplicación de lipasas en la síntesis de derivados del ácido quenodesoxicólico

Paula Quintana, Guadalupe García Liñares y Alicia Baldessari linares@qo.fcen.uba.ar

Laboratorio de Biocatálisis, Departamento de Química Orgánica y UMYMFOR, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina.

Los ácidos biliares se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza como derivados oxigenados de esteroides. Esta clase de compuestos actúa esencialmente como detergente natural. Entre ellos, el ácido quenodesoxicólico es uno de los dos ácidos biliares más importantes en el metabolismo humano. Actúa reduciendo la secreción de colesterol que se genera en las células del hígado y disminuyendo su nivel de saturabilidad [1].

En el presente trabajo se presenta la síntesis de nuevos análogos del ácido quenodesoxicólico catalizada por lipasas. Estos derivados presentan mayor lipofilicidad que el ácido quenodesoxicólico permitiendo incrementar su poder emulsificante. Con este objetivo se prepararon ésteres a partir de alcoholes de cadena media y larga y amidas por reacción con aminas mono y bifuncionales. Las lipasas catalizaron las reacciones de esterificación y aminólisis. (Esquema 1).

Esquema 1. Síntesis enzimática de análogos de ácido quenodesoxicólico

Para llevar a cabo el objetivo propuesto, se evaluaron lipasas de diversas fuentes. También se estudió la variación de diferentes parámetros como solvente, relación enzima/sustrato, relación alcohol o amina/sustrato, tiempo de reacción y temperatura para determinar las condiciones óptimas de reacción en la síntesis de la serie de análogos.

Bibliografía

1. Pellicciari, R.; Gioiello, A.; Costantino, G.; Sadeghpour, B.M.; Rizzo, G.; Meyer, U.; Parks, D. J.; Entrena-Guadix, A.; Fiorucci, S. J. Med. Chem. 2006, 49, 4208-4215.

PP-B37

130

Acetilación y desacetilación regioselectiva de pregnanos

catalizadas por lipasas

1 2 2 1Guadalupe García Liñares , Javier Eiras , Andrea Bruttomesso y Alicia Baldessari

1Laboratorio de Biocatálisis, Departamento de Química Orgánica y UMYMFOR, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina.

2Laboratorio de Biología Química, Departamento de Química Orgánica y UMYMFOR, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina.

La síntesis de derivados esteroidales útiles como moduladores de la biosíntesis de andrógenos es un campo activo de investigación relacionado al desarrollo de nuevas terapias antitumorales. Uno de los procesos clave en esta biotransformación es la formación de dehidroepiandrosterona a partir de pregnenolona catalizada por la 17α-hidroxilasa /17,20-liasa (CYP17). Los esteroides conteniendo heterociclos unidos al anillo D son inhibidores de esta

óxidorreductasa[1].Estos derivados heterocíclicos se generan a partir de compuestos carbonílicos como el 17-carbaldehído 3, que se prepara siguiendo la secuencia descripta en la Figura 1, partiendo del diol 1. En este compuesto ambos hidroxilos, en C-3 y C-20, son muy reactivos frente a la oxidación. Debido a ello, resulta necesario contar con un precursor en donde el hidroxilo de C-3 se encuentre selectivamente protegido (2). Con el propósito de obtener el intermediario 2, se aplicaron dos estrategias enzimáticas utilizando lipasas: la acetilación regioselectiva del diol 1 y la desacetilación regioselectiva del derivado peracetilado 4.

Figura 1. Estrategia sintética quimioenzimática del carbaldehído 3.

Se estudió la variación de diferentes parámetros como solvente, relación enzima/sustrato, relación enzima/agente acetilante o nucleófilo, tiempo de reacción y temperatura para determinar las condiciones óptimas de reacción. La estrategia fue luego extendida a pregnanos con diferentes grupos funcionales en el carbono 17 como -COCH OH, -CHOHCH OH y –COOH.2 2

Bibliografía

1. Moreira, V.; Vasaitis, T.; Njar, V.; Salvador, J. Steroids 2007, 72, 939-948.

linares@qo.fcen.uba.ar

HO

1

O

HO

2

OH

AcO

OH

AcO

OAc

Ac2O/Pyr

AcOR / Lipasa

R'OH / Lipasa

4

3

PP-B38

131

Síntesis de fenilacetamidas sustituidas catalizada por lipasas

Guadalupe García Liñares, Alejandra Elisei Schicchi y Alicia Baldessarilinares@qo.fcen.uba.ar

Laboratorio de Biocatálisis, Departamento de Química Orgánica y UMYMFOR (CONICET), Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina.

Los derivados de fenilacetamidas son compuestos de gran interés en el campo farmacéutico. Presentan diversos tipos de propiedades biológicas que permiten su aplicación como antifúngicos,

antibacterianos, antihistamínicos, anticonvulsivantes y antiparasitarios [1,2].

En el presente trabajo presentamos la síntesis enzimática de análogos de fenilacetamidas por aminólisis de los ésteres etílicos correspondientes, que fueron preparados a partir de los ácidos también a través de catálisis enzimática (Esquema 1).

Esquema 1. Síntesis de fenilacetamidas sustituidas catalizadas por lipasas. Para llevar a cabo el objetivo propuesto, se evaluaron lipasas de diversos orígenes y se

estudió la reacción de una serie de ácidos fenilacéticos conteniendo variados sustituyentes con diversas aminas alifáticas y aromáticas. Se evaluó la variación de diferentes parámetros como solvente, relación enzima/sustrato, relación alcohol o amina/sustrato, tiempo de reacción y temperatura para determinar las condiciones óptimas de reacción. Se obtuvo una serie de 30 compuestos novedosos con rendimientos que mostraron que la actividad de la lipasa está relacionada con la sustitución del anillo aromático en el ácido fenilacético.

Bibliografía

1. Wang, Y.; Jiao, X.; Kayser, F.; Liu, J.; Wang, Z.; Wanska, M.; Greenberg, J.; Weiszmann, J.; Ge, H.; Tian, H.; Wong, S.; Schwandner, R.; Lee, T.; Li, Y. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 493–498.2. Shelke, S. M.; Bhosale, S. H. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 4661–4668.

OH

OR

R1NH2

lipasa

NHR1

OR

EtOH

lipasa

OEt

OR

R = -OH, -OMe, -NO2

1 2 3

R1 = CH3(CH2)n-

n = 2-17

PP-B39

132

Aplicación de lipasas en la síntesis de derivados de 2- y 3-hidroxipiridinas con actividad antiparasitaria

Guadalupe García Liñares, Gonzalo Parraud y Alicia Baldessarilinares@qo.fcen.uba.ar

Laboratorio de Biocatálisis, Departamento de Química Orgánica y UMYMFOR, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina.

El presente trabajo se refiere a la síntesis de nuevos compuestos con actividad antiparasitaria contra T. cruzi y Leishmania spp. La enfermedad de Chagas o los distintos tipos de leishmaniasis se encuentran entre las enfermedades parasitarias más importantes distribuidas por

todo el mundo. Son pocas las drogas utilizadas actualmente para el tratamiento clínico de este tipo de enfermedades y todas presentan importantes desventajas [1]. Por ello es esencial el desarrollo de una quimioterapia alternativa segura y efectiva.

Numerosos compuestos biológicamente activos contienen un anillo de piridina en su estructura [2] y, considerando que pueden inhibir la enzima dihidrofolato reductasa, llevamos a

cabo la síntesis de nuevos compuestos derivados de 2- y 3-hidroxipiridina sustituidos con grupos alquiloxi de diferente longitud de cadena y sus derivados acilados.

La preparación se efectuó a través de una estrategia quimioenzimática, involucrando dos pasos de reacción (Esquema).

Esquema 1. Síntesis quimioenzimática de derivados de 2- y 3-hidroxipiridinas

Se presentará la serie de compuestos novedosos obtenidos mediante esta estrategia sintética que fueron totalmente identificados por métodos espectroscópicos y los ensayos biológicos realizados para determinar la actividad antiparasitaria de los mismos contra Leishmania mexicana y Trypanosoma cruzi.

Bibliografía

1. García Liñares, G.; Ravaschino, E. L.; Rodríguez, J. B. Curr. Med. Chem. 2006, 13, 335–360.2. a) Thapa, P.; Karki, R.; Thapa, U.; Jahng, Y.; Jung, M-J.; Nam, J. M.; Na, Y.; Kwon, Y.; Lee, E-S. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 377–386; b) Onnis, V.; Cocco, M. T.; Fadda, R.; Congiu, C. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 6158–6165.

N

XOH

n+

N

O

nOH

N

OO R1

O

n

OH

1a: 3-OH1b: 2-OH

KOH/DMSO

2a: X = Cl, n=52b: X = Br, n=62c: X = Br, n=72d: X = Br, n=82e: X = Br, n=92f: X = Br, n=102g: X = Br, n=11

3a: 3-OH, n=5 3b: 3-OH, n=63c: 3-OH, n=73d: 3-OH, n=83e: 3-OH, n=93f: 3-OH, n=103g: 3-OH, n=113h: 2-OH, n=53i: 2-OH, n=63j: 2-OH, n=73k: 2-OH, n=83l: 2-OH, n=93m: 2-OH, n=103n: 2-OH, n=11

4a: 3-OH, n=5, R1 = CH3

4b: 3-OH, n=6, R1 = CH3

4c: 3-OH, n=7, R1 = CH3

4d: 3-OH, n=8, R1 = CH3

4e: 3-OH, n=9, R1 = CH3

4f: 3-OH, n=10, R1 = CH3

4g: 3-OH, n=11, R1 = CH3

4h: 2-OH, n=5, R1 = CH3

4i: 2-OH, n=6, R1 = CH3

4j: 2-OH, n=7, R1 = CH3

4k: 2-OH, n=8, R1 = CH3

4l: 2-OH, n=9, R1 = CH3

4m: 2-OH, n=10, R1 = CH3

4n: 2-OH, n=11, R1 = CH3

4o: 3-OH, n=10, R1 = CH2CH3

4p: 2-OH, n=10, R1 = CH2CH3

R1COOEt

lipasat.a.

PP-B40

133

Síntesis enzimática de un β-peptoide y su conjugación con complejos macrocíclicos de gadolinio (III) con potencial uso como agentes de

contraste para imágenes por resonancia magnética

Guadalupe García Liñares, Eduardo Miguel Rustoy y Alicia Baldessarilinares@qo.fcen.uba.ar

Laboratorio de Biocatálisis, Departamento de Química Orgánica y UMYMFOR, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina.

En el contexto de la técnica de Imágenes por Resonancia Magnética (IRM), los agentes de contraste (ACs) son compuestos que tienen la capacidad de mejorar la visualización de tejidos internos debido a su capacidad de disminuir los tiempos de relajación, T1 o T2, de los protones de algunas moléculas de agua u otras que tengan protones intercambiables presentes en los tejidos. La capacidad de los ACs de generar estas variaciones en los tiempos de relajación puede diferir de un núcleo a otro de acuerdo a su entorno. Estas diferencias inducidas permiten aumentar o disminuir la intensidad de una señal y por lo tanto mejorar la diferenciación y visualización de diferentes zonas de un mismo tejido. Por lo tanto IRM es una poderosa herramienta en la medición in vivo de importantes parámetros fisiológicos como la temperatura y el pH, que pueden variar del estado fisiológico normal al anormal, éste último generado por alguna enfermedad. Los agentes de

3+contraste formados por n (n = 1, 2, etc.) equivalentes de un complejo de gadolinio (Gd ) conjugado a diferentes -péptidos o peptoides son interesantes debido a su estabilidad frente a diferentes peptidasas y proteasas y su capacidad de transportar varios equivalentes del complejo mencionado [1]. Considerando estos resultados, en el presente trabajo se describe la síntesis enzimática y caracterización del -peptoide: Poli[N-(3-hidroxipropil)--alanina] (1) y su conjugación con un complejo macrocíclico polidentado de gadolinio (III) (2) (Figura 1). La síntesis del peptoide, a partir del aminoester N-sustituido [2] fue catalizada por la lipasa de Candida antarctica en diisopropil éter a temperatura ambiente. El producto fue caracterizado por métodos espectroscópicos.

Figura 1. Síntesis quimioenzimática del conjugado -peptoide con el complejo macrocíclico de gadolinio

Bibliografía

1. De León Rodríguez, L.M.; Lubag, A.; Udugamasooriya, D. G.; Proneth, B.; Brekken, R. A.; Sun, X.; Kodadek, T.; Sherry, A. D. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132(37), 12829-1283.2. Monsalve, L. N.; Gillanders, F.; Baldessari, A. Eur. J. Org. Chem. 2012, 1164-1170.

HN

O

NH

OH

O

O

OH

O

N

N

N

-O

O-

O-

O

O

O

Gd3+

n

NH2

O

OEt

NH

O

OEt

+

EtOH CAL BHO

HO

N

O

NH

HO

HOn

O O

OH

NN

N

O-

O--O

O

OOGd3+

1

2LINKER

LINKER

PP-B41

Biotransformação de chalconas pelo fungo marino Penicillium citrinum

1 1 2 1Irlon M. Ferreira (PG), Lenilson C. Rocha (PG), Lucas Pizzuti (PQ), André L. Meleiro Porto

3(PQ), Alex H. Jeller (PQ)

1 Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos-SP2 Faculdade de Ciências Exatas e Tecnologia, Universidade Federal da Grande Dourados, Dourados-MS

3 Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Dourados-MS

O uso de células inteiras, em geral de microrganismos, são muito úteis em biotransformações, pois catalisam reações em condições brandas, como temperatura e pressão ambientes.

Diidrochalconas são importantes intermediários para a síntese de produtos naturais e fármacos.1As chalconas (3a-e) foram preparadas via reação de condensação aldólica, entre derivados de acetofenona (1) com derivados de benzaldeído (2). Todos os produtos foram caracterizados por

1RMN de H e CG/EM (Esquema 1). O meio de cultura para o fungo P. citrinum foi preparado contendo água do mar artificial e extrato de malte (2%) a pH 8. Após ser autoclavado adicionou-se 5 fragmentos de agar (0,5 x 0,5 cm) contendo micélios do fungo P. citrinum, os quais foram transferidos para 100 mL de meio de cultura líquido em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL. O fungo foi incubado por 6 dias em agitador orbital rotativo (130 rpm, 32ºC). Após este período as células/micélios foram recolhidos por filtração em funil de Büchner. As reações biocatalíticas foram realizadas em frascos Erlenmeyer (250 mL) contendo 2,5 g de micélios (massa úmida) e 50 mg de substrato (3a-e) previamente dissolvidos em 400 µL de DMSO contendo 100 mL de tampão fosfato (Na HPO /KH PO ; pH 7; 0,1 mol/L). A mistura foi incubada em agitador orbital rotativo 2 4 2 4

(130 rpm, 32ºC). Após 6 dias de reação a mistura reacional foi filtrada a vácuo, e o filtrado foi extraído com AcOEt (3 x 30 mL). Os produtos das biotransformações foram caracterizados por

1RMN de H e CG/EM e apresentaram bons rendimentos (Tabela 1).

Esquema 1. Síntese de chalconas, por condensação aldólica seguida por redução biocatalítica.

Tabela 1. Diidrogenação de chalconas pelo fungo P. citrinum.

a bRendimento determinado por análise de CG/EM. Rendimento após purificação em cromatografia em coluna.

A conversão de chalconas em suas correspondentes diidrochalconas sofreram uma possível influência dos grupos substituintes (R e R ). O composto 4a (R =F) apresentou maior rendimento 2 3 3

para a diidrogenação que o composto 4b (R =Br). A chalcona 3e inicialmente apresentava o 3

substituinte R =NO , após a biotransformação pelo fungo P. citrinum resultou na redução da ligação 2 2

α,β-insaturada e na redução do grupo nitro para o grupo amino, o qual foi devidamente -1caracterizado pelo espectro de IV devido a presença da banda de NH em 3.410 cm e CG/EM. O 2

fungo marinho Penicillium citrinum mostrou-se eficiente frente à biorredução de cetonas α,β-insaturadas, em particular a classe de compostos derivados de chalconas.

Bibliografía

1. Siddaiah, V.; Rao, C.; Venkateswarlu, S.; Subbaraju, G., Tetrahedron 2006, 62 (5), 841-846. Os autores agradecem à FAPESP e ao CNPq pelo apoio financeiro.

alexjell@iqsc.usp.br

134

O

+

O

NaOH

EtOH, 12 h, t.a.

1 23a-e

H

O

R1

R2

R3

R2

R3R1

O

4a-e

Penici ll ium cit rinum

6 dias130 rpm

32 ºC R1

R2

R3

Composto R1 R2 R3 Composto R1 R2 R3 Rendimentoa %

3a H H F 4a H H F 98 (79)b 3b H H Br 4b H H Br 49 (20)b 3c H H CH3 4c H H OCH3 72 (37)b 3d OCH3 H H 4d OCH3 H H 91 (50)b 3e H NO2 H 4e H NH2 H 97 (30)b

PP-B42

135

Resolução enzimática da (±)-2,4,5-trifluoro-1-feniletanol pela lipase CALB através da irradiação micro-ondas

Sandra Santos Ribeiro, André Luiz Meleiro Portosandrinhasr@iqsc.usp.br

Laboratório de Biocatálise, Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos,

SP, Brasil

A síntese de compostos orgânicos fluorados tem apresentado importante contribuição para o desenvolvimento do setor farmacêutico, agroquímico e de materiais, devido especialmente à influência do forte grupo retirador de elétrons do átomo de flúor [1, 2].

Esse trabalho teve como objetivo investigar a resolução enzimática da (±)-2,4,5-trifluoro-1-feniletanol 1 usando a lipase de Candida antarctica frente a irradiação micro-ondas (M.O.) e em agitador orbital (A.O.). A resolução enzimática foi realizada adicionando-se a lipase CALB (160 mg), (±)-2,4,5-trifluoro-1-feniletanol 1 (40 µL, 0,3 mmol), tolueno (10 mL) e acetato de vinila (500 µL, 0,54 mmol) (Figura 1). As reações foram conduzidas em reator micro-ondas (65ºC, 200 W) e em agitador orbital (32C, 130 rpm). O progresso das reações foi monitorado coletando-se as amostras (20 µL) em diferentes intervalos de tempo e em seguida diluídas com acetato de etila (1,5 mL) e analisadas em CG-FID com coluna capilar de fase estacionária quiral de β-ciclodextrina. Em agitador orbital, após 48 h de reação obteve-se excelente conversão e excessos enantioméricos para o (S)-álcool 1 (c=41%, ee>99%) e para o (R)-acetato 2 (c=59%, ee>99%). Enquanto que utilizando a técnica de irradiação micro-ondas obteve-se uma eficiente resolução em apenas 1 hora de reação com excelente conversão e excessos enantioméricos para o (R)-1 (c=56%, ee>99%) e para o (S)-2 (c=44%, ee>99%).

Figura 1. Resolução enzimática da (±)-2,4,5-trifluoro-1-feniletanol 1 em agitador orbital e irradiação micro-ondas com a lipase de C. antarctica.

Bibliografía

1. Bogár, K.; Backvall, J. E. Tetrahedron Lett. 2007, 48, 5471-5474.2. Sakai, T.; Miki, Y.; Nakatani, M.; Ema, T. Uneyama, K.; Utaka, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 5233-5236.

Agradecimientos: FAPESP pela bolsa de estudos, CNPq e CAPES pelo apoio financeiro

CH3

OH

(rac)-1

CH3

OH

CH3

OAc

(S)-1 (R)-2

lipase, toluenoacetato de vinila

A.O. (32ºC, 130 rpm)ou M.O. (65ºC, 200W)

F F F F F F

F F F

+

PP-B43

136

Purificación de péptidos inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina-I a partir de hidrolizado de proteínas de lactosuero

1 2Carolina Villadóniga y Ana María B. Cantera

carolinav@fcien.edu.uy

1Laboratorio de Enzimas Hidrolíticas, Instituto de Química Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo (11400), Uruguay.

2Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo (11800), Uruguay.

La enzima convertidora de angiotensina–I (ECA-I) juega un rol clave en la regulación de la presión arterial debido a que cataliza la producción de un potente vasoconstricor (angiotensina II) y paralelamente la descomposición de bradiquinina (vasodilatador). Entre los fármacos de primera línea en el tratamiento de la hipertensión arterial se encuentran los inhibidores de ECA-I sintéticos, aunque presentan efectos adversos. Los péptidos derivados de proteínas de alimentos con actividad inhibitoria de ECA-I (péptidos bioactivos) son una alternativa natural y segura a los de síntesis. Las proteínas de la leche son un reservorio de péptidos inhibidores de ECA-I que pueden ser liberados por proteólisis enzimática. La liberación de péptidos inhibidores de ECA-I ha sido lograda fundamentalmente por proteólisis con enzimas digestivas, microbianas o en procesos fermentativos [1]. Las proteasas de plantas han sido poco explotadas para este fin.

En este trabajo se presentan los avances en la purificación de los péptidos inhibidores de ECA-I presentes en un hidrolizado de lactosuero obtenido con peptidasas de Bromelia antiacantha Bertol., una nueva fuente vegetal autóctona de peptidasas cisteínicas [2]. La aplicación de nuevas enzimas abre la posibilidad de encontrar nuevas secuencias bioactivas. Para poder identificar y estudiar las propiedades de los péptidos inhibidores de la ECA-I es necesario purificarlos. La estrategia de purificación que se plantea se centra en la separación por tamaño molecular ya que todos los péptidos inhibidores de la ECA-I identificados hasta el momento por otros autores presentan una masa molecular inferior a 2000 Da [3]. Combinando ultrafiltración, cromatografía de exclusión molecular (Superdex Peptide) y RP-HPLC (C18) se obtuvieron fracciones que presentan actividad inhibitoria de ECA-I superior al 90%.

Bibliografía

1. Hernández-Ledesma, B.; Contreras, M.; Recio, I. Adv. Colloid Interfac. Sci. 2011, 165, 23–35.2. Villadóniga, C.; Macció, L.; Vallés, D.; Barros, M.; Cantera, A. Actas del III Encuentro Regional de Biocatálisis y Biotransformaciones, 2008, CO-8.3. Murray, B. A.; FitzGerald, R. J. Curr. Pharm. Des. 2007, 13, 773-791.

PP-B44

137

PresentacionesPosters

Area Screening de Biocatalizadores

138

Código Título y autores Página

PP-SB1 Aislamiento, purificación y caracterización cinética de una β-

glucosidasa de Aspergillus niger de ambiente natural Viviana López Aca; Marcos Colmán; Fátima Yubero

141

PP-SB2

Desglicosilación enzimática de 3-O-rutinosil-flavonoides por el hongo Acremonium sp. DSM24697

Gisela Weiz, Lucrecia Piñuel, Laura S. Mazzaferro y Javier D. Breccia

142

PP-SB3

Catálisis enzimática aplicada a la obtención sostenible de derivados de almidón y celulosa de interés en el área de

materiales María Laura Foresti, Florencia Laura Allevatto, María del Pilar

Williams, Susana Raquel Morcelle y Analía Vázquez

143

PP-SB4

Preparación de soportes de quitosano químicamente modificados para la inmovilización covalente de L-arabinosa

isomerasa Ricardo M. Manzo, Marylane de Sousa, Melina Michlig, Cecilia L.

Fenoglio, Amelia Rubiolo, Luciana Rocha Barro Gonçalves y Enrique Mammarella

144

PP-SB5

Determinación de la actividad antimicrobiana del extracto acuoso de polen de Acacia caven (mol) Molina, por el método

cinético-turbidimetrico Gustavo Quiroga, Juan Manuel Talia, Cristina Barcia y Sonia

Barberis

145

PP-SB6

Nuevas proteasas vegetales y su aplicación como aditivos en detergentes de lavandería

Grisel Bersi, Diego Vallés, Ana Cantera, Cristina Barcia y Sonia Barberis

146

PP-SB7 Purificación y caracterización de una aminopeptidasa del polen

de Acacia caven (Mol) Molina Cristina Barcia, Sonia Barberis y Paula Veríssimo

147

PP-SB8

Propiedades de la lipasa de Araujia hortorum, un biocatalizador novedoso para la síntesis de ésteres y amidas

Ma Elisa Fait, Paula Di Santo Meztler, Ma Laura Foresti, Susana R. Morcelle

148

PP-SB9

Aplicação Biocatalítica de Nova Lipase Metagenômica (Lip-LifC6G9) Imobilizada em Suporte Hidrofóbico

Viviane Paula Martini, Robson Carlos Alnoch, Arnaldo Glogauer, Emanuel M. de Souza, Fabio de O. Pedrosa e Nadia Krieger

149

PP-SB10

Estudio del potencial biocatalítico de plantas aromáticas y sus comunidad endófita

Facundo Marconi, César Iglesias, David Gonzalez, Sonia Rodríguez y Paula Rodriguez

150

PP-SB11

Nuevos biocatalizadores de utilidad en la síntesis de un intermediario quiral de Atorvastanina

Cesar Iglesias, David Gonzalez, Paula Rodriguez y Sonia Rodriguez

151

139

PP-SB12

Sistema planta-microorganismos endófitos como biocatalizadores

Cynthia Magallanes-Noguera, Paula Rodríguez Bonnecarrere, David Gonzalez, Sonia Rodríguez Giordano, Marcela Kurina-Sanz

152

PP-SB13

Caracterización del extracto extracelular con actividad lipolítica de la cepa de Janibacter R02 aislada de la Antártica

Diego Rodríguez, Agustín Castilla, Silvia Cesarini, Paula González, Sonia Rodríguez, Gabriela Irazoqui, Pilar Díaz

153

PP-SB14

Screening y evaluación de nuevas fosfotriesterasas bacterianas en la degradación de compuestos organofosforados

Julia Santillán, Lucas Dettorre, Elizabeth Lewkowicz y Adolfo Iribarren

154

PP-SB15

Estudos de Imobilização e Aplicação de uma Lipase de Metagenômica na Síntese de Ésteres

Aline Dutra Madalozzo, Keyla Kaori, Viviane Paula Martini, Emanuel M. de Souza, Fabio de O. Pedrosa e Nadia Krieger

155

141

Aislamiento, purificación y caracterización cinética de una β-glucosidasa de Aspergillus niger de ambiente natural

Viviana López Aca; Marcos Colmán; Fátima Yuberofyubero@qui.una.py

Dpto. de Fisicoquímica, Dirección de Investigación, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Asunción, Campus Universitario de San Lorenzo (CP 1055), Paraguay

.

Varias enzimas glucolíticas son obtenidas a fin de producirlas comercialmente, aunque para conseguir una producción constante se requieren pasos previos como la identificación inicial de las cepas de microorganismos que las producen con una actividad adecuada.

El objetivo de este trabajo fue seleccionar hongos del género Aspergillus niger productores de β-glucosidasa cultivados a partir de sedimento costero (interfase agua-suelo) del Lago Ypacaraí ubicado en el Departamento Central de Paraguay, a fin de evaluar la capacidad que tiene esta enzima de transformar esteviósido y determinar su actividad β-glucosidasa. Una vez que se tomaron las muestras de sedimento costero de interfase agua-suelo se determinó el pH, la conductividad eléctrica y la temperatura del ecosistema. La cepa aislada y tipificada fue inducida por dos fuentes de carbono diferentes, una de naringina y otra de una mezcla de esteviósido y rebaudiósido A, a fin de producir glucosidasas y explorar las condiciones y utilidad de la enzima para futuras aplicaciones. Para ello se evaluó en todo momento el recuento de microorganismos, la concentración de proteínas y la determinación de la actividad β-glucosidasa [1]

Nuestros resultados demostraron que la cepa ambiental de Aspergillus niger responde a un efecto inductor asociado al crecimiento de esporas del hongo al utilizar esteviósido y rebaudiósido A al compararlo con naringina como fuente inductora de carbono donde la actividad β-glucosidasa producida por el hongo fue similar en ambos casos. Una vez alcanzada las condiciones de máxima actividad catalítica se aplicaron técnicas bioquímicas de purificación de la enzima. Una vez purificada la enzima se determinaron las constantes catalíticas Km, Vmax y Kcat/Km para una mezcla de esteviósido y rebaudiósido A en tiempos cortos.

Los estudios realizados por nuestro grupo corroboraron los determinados por otros investigadores [2] que señalan que las moléculas de glicósidos de estevia son hidrolizadas por cepas de Aspergillus niger en condiciones de fermentación.

Bibliografía

1. Yeoh, H. H.; Tan, T. K.; Chua, L.; Lim, G. World J. Microbiol. Biotechnol. 1988, 4, 425-430.2. Milagre, H. M. S.; Martins, L. R.; Takahashi, J. A. Braz. J. Microbiol. 2009. 40, 367-372.

PP-SB1

142

Desglicosilación enzimática de 3-O-rutinosil-flavonoides por el hongo Acremonium sp. DSM24697

Gisela Weiz, Lucrecia Piñuel, Laura S. Mazzaferro y Javier D. Breccia javierbreccia@exactas.unlpam.edu.ar

Laboratorio de Biocatálisis, INCITAP-CONICET-Departamento de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de La Pampa, Santa Rosa (6300), Argentina

El hongo Acremonium sp. DSM24697 fue descripto como productor de la diglicosidasa α-ramnosil-β-glucosidasa (EC 3.2.1.168), específica para flavonoides 7-O-rutinosilados (Fig. 1A) [1]. En el presente trabajo se estudió su sistema enzimático para la desglicosilación del flavonoide 3-O rutinosilado rutina (Fig. 1B). El microorganismo cultivado en un medio agarizado con rutina como fuente de carbono tuvo una tasa de crecimiento radial (K ) de 0.73 ± 0.04 mm/día y una tasa de r

clarificación (K ) de 1.27 ± 0.05 mm/día. La producción de actividad desglicosilante de rutina en c

cultivo sumergido (25ºC, pH 5) fue máxima luego de 3 días (0.24 ± 0.02 U/L). Se encontró que los productos de la reacción fueron rutinosa y la aglicona quercetina, sugiriendo la producción de una diglicosidasa específica para flavonoides 3-O-rutinosilados. El análisis zimográfico mostró dos bandas de actividad frente al sustrato 4-metilumbeliferil-rutinósido: una de ellas -con igual R f(0.27) a la α-ramnosil-β-glucosidasa previamente descripta- fue capaz de hidrolizar sólo hesperidina, mientras que la otra fue específica para rutina (R 0.08). Dichos resultados f

confirmaron que Acremonium sp. DSM24697 posee distintas estrategias de desglicosilación de flavonoides dependiendo de los enlaces azúcar-flavanona.

Figura 1. Estructura química de los flavonoides (A) hesperidina (hesperetina 7-O-(6-O-α-L-ramnopiranosil-β-D-glucopiranósido)) y (B) rutina (quercetina 3-O-(6-O-α-L-

ramnopiranosil-β-D-glucopiranósido))

Bibliografía

1. Mazzaferro, L.; Piñuel, L.; Minig, M.; Breccia, J. D. Arch Microbiol. 2010, 192, 383-393.

PP-SB2

AB

143

Catálisis enzimática aplicada a la obtención sostenible de derivados de almidón y celulosa de interés en el área de materiales

1 1 1María Laura Foresti , Florencia Laura Allevatto , María del Pilar Williams , Susana Raquel

2 1Morcelle y Analía Vázquez

mforesti@fi.uba.ar

1Laboratorio de Polímeros y Materiales Compuestos, Instituto de Tecnologías y Ciencias de la Ingeniería(INTECIN), Facultad de Ingeniería, UBA - CONICET, Las Heras 2214, Buenos Aires (1127), Argentina. 2Laboratorio de Investigación de Proteínas Vegetales (LIPROVE), Depto. de Cs. Biológicas, Fac. Cs.

.Exactas, Univ. Nacional de La Plata, Calle 47 y 115, La Plata (1900) Argentina

Las enzimas son catalizadores biológicos reconocidos por su alta actividad, selectividad, biodegradabilidad y operación eficiente bajo condiciones moderadas de temperatura y presión. Si bien la catálisis enzimática aplicada a procesos con sustratos en fase líquida ha registrado gran interés en las últimas décadas, la acción de las enzimas frente a macromoléculas en fase sólida ha sido menos estudiada.

En el presente trabajo se presentan resultados del uso de catálisis enzimática aplicada a la obtención sostenible de derivados de celulosa y almidón de interés en el área de los materiales. Se estudió en primera instancia la factibilidad de utilizar enzimas específicas para la obtención sostenible de nanocelulosa, un producto de alto valor agregado por sus atractivas propiedades mecánicas, alta reactividad, baja densidad y biodegradabilidad. Las nanofibras de celulosa encuentran aplicación como refuerzo de materiales compuestos, membranas acústicas, papeles de alta resistencia, y en materiales biomédicos. Actualmente las nanofibras de celulosa de distinta relación de aspecto se obtienen mediante homogenización a alta presión con muy elevada demanda energética, o bien mediante hidrólisis con ácido sulfúrico concentrado y en caliente. Esto lleva a que si bien se obtiene un producto “verde” a partir de una materia prima “verde”, el proceso no lo es. La Figura 1 muestra los nanowhiskers de celulosa con diámetros en el orden de 20-30nm obtenidos en nuestro laboratorio mediante el uso de endoglucanasas, enzimas reconocidas por hidrolizar selectivamente las regiones amorfas de la celulosa. Con el fin de reducir la hidrofilicidad de las nanofibras y mejorar así su potencial aplicación como material de refuerzo de matrices hidrofóbicas, se estudió también la capacidad de diversas lipasas (Araujia Hortorum, Thermomyces lanuginosa, Candida antarctica B) para esterificar la superficie de las nanofibras, con resultados promisorios en el caso de CALB.

En cuanto a la obtención de derivados de almidón, se estudió la capacidad de las a-amilasas para obtener micro y nanopartículas de alta cristalinidad para su potencial uso como refuerzo de

materiales. La Figura 2 ilustra la acción preferencial de las a-amilasas sobre los anillos amorfos de los gránulos de almidón.

Figura 1. Nanowhiskers de celulosa. F igura 2. Hidrólisis selectiva de anillos

amorfos del almidón

PP-SB3

144

Preparación de soportes de quitosano químicamente modificados para la inmovilización covalente de L-arabinosa isomerasa

1 2 1 1Ricardo M. Manzo , Marylane de Sousa , Melina Michlig , Cecilia L. Fenoglio , Amelia

1 2 1Rubiolo , Luciana Rocha Barro Gonçalves y Enrique Mammarella

manzoricardo@yahoo.com.ar

1Grupo de Ingeniería de Alimentos y Biotecnología, Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Argentina

2 Universidade Federal do Ceará, Departamento de Engenharia Química, Fortaleza, Ceará, Brasil

La obtención de D-tagatosa a partir de D-galactosa por medios biológicos utilizando la enzima L-arabinosa (D-galactosa) isomerasa (EC 5.3.1.4), es un proceso de alto interés tecnológico, particularmente en la industria de productos alimenticios, como endulzante de alimentos especiales [1]. El interés en este cetoazúcar reside en que la D-tagatosa es un azúcar raro que posee numerosos efectos beneficiosos para la salud por tratarse de un endulzante hipocalórico que promueve la pérdida de peso [2], que posee un efecto glucémico nulo y efecto prebiótico reconocido, además de no poseer efectos colaterales indeseados.

En la búsqueda de un catalizador conveniente [3] para la producción de este azúcar, se obtuvo un preparado purificado y caracterizado de la enzima L-arabinosa isomerasa proveniente de la cepa Enterococcus faecium DBFIQ E36 aislada de leche cruda bovina. En este trabajo, fueron sintetizados 22 soportes de quitosano, material de bajo costo y con excelentes características fisicoquímicas, en diferentes condiciones experimentales. En primer lugar, a través de la modificación en las etapas previas a la formación de la partícula (reacción con fructosa o alcohol polivinílico, entre otros), luego durante la coagulación (empleando tripolifosfato de sodio o cloruro de polialuminio, entre otros) y, finalmente, modificando las partículas ya formadas (reacción con TNBS o DMF, por ejemplo). Seguidamente, se evalúo el efecto de la inmovilización covalente multipuntual de la enzima L-arabinosa isomerasa a través de la activación de las partículas sintetizadas por dos métodos: con glutaraldehído y con epiclorhidrina. Los mejores resultados, a través del cálculo del rendimiento del proceso de inmovilización en términos de proteína y actividad inmovilizada, han sido obtenidos con el soporte previamente reaccionado con fructosa a 50°C por 4 horas, para el caso de la activación con glutaraldehído y con el soporte coagulado con cloruro de polialuminio, para el caso de la activación con epiclorhidrina.

Bibliografía

1. Boudebbouze, S.; Maguin, E.; Rhimi, M.; Izumori, K. Recent Pat. DNA Gene Seq. 2011, 5, 194-201.2. Moore, M. Curr. Opin. Investig. Drugs 2006, 7, 924-935.3. Chouayekh, H.; Bejar, W.; Rhimi, M.; Jelleli, M.; Mseddi, M.; Bejar, S. FEMS Microbiol. Lett. 2007, 277, 260-267.

PP-SB4

145

Determinación de la actividad antimicrobiana del extracto acuoso de polen de Acacia caven (mol) Molina, por el método cinético-

turbidimetrico

1 2 1 1,3Gustavo Quiroga , Juan Manuel Talia , Cristina Barcia y Sonia Barberis

hgquiroga@unsl.edu.ar

1Laboratorio de Bromatología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis

2 Laboratorio de Química Física, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional de San Luis, San Luis, Argentina.

3.Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CCT-SAN LUIS-CONICET)

Los antibióticos naturales no generan resistencia bacteriana ni los efectos secundarios de las drogas sintéticas. Es por ello que, en los últimos años, las investigaciones se han focalizado en la potencial aplicación de compuestos naturales [1,2].

El objetivo de este trabajo fue evaluar la acción antimicrobiana del extracto acuoso del polen de Acacia caven (Mol.) Molina empleando un método cinético-turbidimétrico.

Se utilizaron cepas de Escherichia coli ATCC 25 922 y Staphylococcus. aureus ATCC 25 923. Para los ensayos de actividad antimicrobiana se preparó un extracto acuoso de polen a pH 7.0 y se utilizó el sobrenadante de la centrifugación (12.000 rpm, 4ºC, 10 min). Se realizaron experiencias cinéticas de control de ambas cepas con caldo de cultivo Müeller – Hinton (sin extracto de polen) en una cámara de cultivo Rosi 1000 (35 ºC, 180 rpm). Se extrajeron alícuotas a intervalos de 20 min durante 5 h y se leyeron las transmitancias a 720 nm, utilizando caldo Müeller–Hinton como blanco. Se determinaron las concentraciones microbianas y las velocidades específicas de crecimiento (π) de ambos microorganismos. Se efectuaron experiencias cinéticas similares con concentraciones crecientes del extracto acuoso de polen, se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) del crecimiento microbiano de E.coli y S. aureus, utilizando el sobrenadante del extracto acuoso de polen de Acacia caven. Posteriormente se ensayaron las actividades antimicrobianas de las fracciones proteicas y del resto de los componentes de dicho sobrenadante.

Se demostró que el sobrenadante del extracto acuoso del polen de Acacia caven tuvo un leve efecto inhibitorio de S. aureus. Sin embargo, la fracción proteica concentrada del sobrenadante del extracto acuoso de dicho polen mostró una significativa actividad inhibitoria de S. aureus pero no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de E.coli. La fracción no proteica concentrada del extracto acuoso del polen de Acacia caven no tuvo ningún efecto inhibitorio sobre ambas cepas.

Bibliografía

1. Onlen, Y.; Duran, N.; Atik, E.; Savas, L.; Altug, E.; Yakan, S.; Aslantas, O. J. Alternative and Compl. Med. 2007, 13(7), 713-718.2. Talia, J. M.; Alvarez, M. A.; Debattista, N.B.; Pappano, N. B. Folia Microbiol. 2009, 54(6), 516-520. 3. Pappano, N. B.; Centorbi, O.P.; Debattista, N. B.; Milán, C. C.; Borkowski, E. J.; Ferretti F. H. Rev. Argent. Microbiol. 1985, 17(1), 27-32.

PP-SB5

146

Nuevas proteasas vegetales y su aplicación como aditivos en detergentes de lavandería

1 3.4 3.4 1 1,2Grisel Bersi , Diego Vallés , Ana Cantera , Cristina Barcia y Sonia Barberis

gbersi@unsl.edu.ar

1Laboratorio de Bromatología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de 2 San Luis. Chacabuco 917 (5700). San Luis, Argentina. INFAP-CCT San Luis-CONICET (Consejo

Nacional de Investigaciones Científicas y Técnica), Chacabuco 917, San Luis, Argentina, 3 4Laboratorio de Enzimas Hidrolíticas. Igua 4224, Uruguay Facultad de Química. Universidad de la

República (UdelaR). Cátedra de Bioquímica. Facultad de Química. Gral.Flores 2124 (1157).Montevideo, Uruguay.

En términos económicos las enzimas proteolíticas representan casi las dos terceras partes de las enzimas que se comercializan en el mercado mundial, estimado en 3.300 millones de USD. A pesar de la gran potencialidad de las proteasas como biocatalizadores de diversos procesos existen muy pocos antecedentes del uso de fitoproteasas como aditivos de detergentes de lavandería. El objetivo de este trabajo fue investigar el comportamiento de dos nuevas plantas autóctonas sudamericanas Solanun leprosum y Bromelia Antiacantha Bertol frente a detergentes puros y comerciales para evaluar su uso como aditivos de detergentes de lavandería. En los ensayos se emplearon extractos enzimáticos obtenidos de látex de frutos de ambas especies pre-purificados con 1-5 volúmenes de acetona fría (-20ºC). El precipitado residual obtenido se resuspendió en 0,1M de buffer de fosfatos (pH 6.0). La actividad proteolítica fue determinada utilizando BAPNA como sustrato sintético y la actividad enzimática se expresó en UI/ml. Se evaluó el efecto de los detergentes puros (Triton x-100, Tween 80, Tween 20, EPA y ARLATONE) en distintas concentraciones (0,1%, 0,4% y 1%) y comerciales (Ala Matic, Skip, Ace Naturals, Ace con y sin suavizante, Drive y Woolite) sobre la actividad proteolítica de los extractos enzimáticos incubados durante 5 min a 25 ºC y a 60ºC. Se encontró que los extractos enzimáticos de Solanun leprosum y Bromelia Antiacantha Bertol. no son inactivados por los detergentes puros y comerciales, sin embargo, el efecto dependió de la concentración, de la temperatura y la naturaleza del detergente usado. Frente a los detergentes puros, tanto Solanun leprosum y Bromelia Antiacantha Bertol manifestaron una actividad residual entre 10 y 120%. En todos los casos, el aumento de la concentración del detergente condujo a una mayor expresión de la actividad enzimática. Este efecto pudo haberse debido a que dichas enzimas actúen mejor en una interfase (hidrofílica-hidrofóbica) que las hace especialmente aptas como aditivos de detergentes comerciales. Por otra parte, la actividad de los extractos enzimáticos no parece depender de la naturaleza de los detergentes puros aunque tanto Solanun leprosum como Bromelia Antiacantha Bertol expresaron las menores actividades proteolíticas frente EPA, el único detergente catiónico usado. Al evaluar el efecto de los detergentes no iónicos (Triton X 100, Tween 80, Tween 20) y aniónico (ARLATONE) se observaron actividades residuales por encima de 50%. Respecto del efecto de la temperatura frente a ambos extractos enzimáticos, se encontró que a 60ºC las actividades residuales fueron superiores que a 25ºC, con todos los detergentes puros usados. Para los detergentes comerciales, ambos extractos enzimáticos retuvieron entre un 50% y 100% de su actividad proteolítica a 25ºC. En consecuencia, la variación de la actividad con la temperatura fue máxima cuando se incubaron los extractos enzimáticos con los detergentes comerciales a 60ºC. La mayor expresión de la actividad a 60ºC se debe a que esta es la temperatura óptima para ambos extractos enzimáticos. Este efecto es muy favorable para el empleo de dichos extractos en detergentes de lavandería.

Bibliografía

1. Vallés, D.; Furtado, S.; Cantera, A. Enzyme Microb. Technol. 2007, 40, 409–413.2. Vallés, D.; Furtado, S.; Villadóniga, C.; Cantera, A. Int. J. Biotechnol. 2004, 6, 4, 346-360.3. Barcia, C.; Quiroga, E.; Ardanaz, C.; Quiroga, G.; Barberis, S., Chap 6. In: Detergents: Types, Components and Uses, Ed. E. T. Hagen 2009 Nova Science Publishers Inc.

PP-SB6

147

Purificación y caracterización de una aminopeptidasa del polen de Acacia caven (Mol) Molina

1 1,2 3Cristina Barcia , Sonia Barberis y Paula Veríssimo

csbarcia@unsl.edu.ar

1Laboratorio de Bromatología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, 25700. San Luis, Argentina. .Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CCT-SAN LUIS-

3CONICET). Departamento de Bioquímica, Centro de Neurociência de Coimbra, Universidade de Coimbra; Rua larga, 3004-517, Coimbra, Portugal.

Acacia caven (Mol.) Molina pertenece a la familia de Leguminosae, sus flores se usan en perfumería y su polen como suplemento dietario [1]. El polen de Acacia caven es una de las causas más comunes de polinosis en las zonas áridas y semiáridas de Sudamérica. Los granos de polen cuando son hidratados liberan varias sustancias entre ellas enzimas proteolíticas [2].

El objetivo de este trabajo fue purificar, identificar y caracterizar las enzimas proteolíticas liberadas por la hidratación del polen de Acacia caven.

Para extraer las proteínas del polen Acacia caven, se agitó el polen con buffer Tris-HCl pH 8.5 a 4ºC y posteriormente se realizó una pre-purificación en batch con DEAE (celulósico). El extracto obtenido se concentró por ultracentrifugación. Para purificar el extracto DEAE concentrado se llevaron a cabo dos etapas cromatográficas (exclusión molecular e intercambio aniónico). Las fracciones recogidas se analizaron por SDS-PAGE y zimografía. Se determinó la presencia de una proteína de 75kDa (Aj peptidasa), que mostro actividad proteolítica por zimografía en geles de poliacrilamida al 12% con 1% de gelatina. La actividad de Aj se evaluó también frente a distintos sustratos fluorogénicos y se encontró que mostró preferencia por Phe-AMC, sustrato específico de aminopeptidasa, además de Gly-Pro-AMC, sustrato específico de X-Prolil Dipeptidil-Aminopeptidasa. Para caracterizar la Aj se llevaron a cabo ensayos con diversos inhibidores específicos, encontrándose un 100% de inhibición con AESF (PEFABLOC), inhibidor

+2 de proteasas serínicas. Se observó también inhibición completa en presencia del ion Zn (1mM). La enzima pura fue analizada por espectrometría MS/MS en el Centro Neurociencias de Coimbra, Coimbra, Portugal y las secuencias obtenidas, se compararon con las disponibles en base de datos, DATA BANK, para investigar la existencia de alguna proteína homologa.

Bibliografía

1. Barcia, C.; Priolo N.; Barberis, S. 2002. I° Congreso Latinoamericano de Fitoquímica. Bs. As. Argentina.2. Cortes, L.; Carvalho, A. L.; Todo-Bom, A.; Faro, C.; Pires, E.; Veríssimo, P. J. Allergy Clin. Immunol. 2006, 118, 878-884.

PP-SB7

148

Propiedades de la lipasa de Araujia hortorum, un biocatalizador

novedoso para la síntesis de ésteres y amidas

1 1 2 1Ma. Elisa Fait , Paula Di Santo Meztler , Ma Laura Foresti , Susana R. Morcelle

mefait86@gmail.com

1LIPROVE, Depto. de Cs. Biológicas, Fac. Cs. Exactas, UNLP, La Plata, (1900), Argentina.2INTECIN, Facultad de Ingeniería, UBA, Capital Federal (1127), Argentina.

Las lipasas vegetales consisten en una alternativa interesante a las microbianas recombinantes para su aplicación a escala industrial. Las más estudiadas han sido las provenientes de semillas, las que se activan durante la germinación, pero tanto su obtención como caracterización son difíciles debido al bajo rendimiento e inestabilidad de este tipo de lipasas. En cambio, las provenientes de látex de familias tales como Caricaceae, Vasconcellea, Euphorbiaceae, Apocynaceae y Asclepiadaceae son fáciles de obtener, aunque su caracterización bioquímica permanece aún sin develar completamente. AHL, la lipasa presente en la fracción insoluble del látex de Araujia hortorum fue obtenida como se indicara previamente [1]. El sólido secado por liofilización fue conservado a distintas temperaturas y se probó su actividad lipolítica luego de distintos tiempos de almacenamiento. Se vio que la actividad enzimática se mantuvo en un 90%, 100% y 60% luego de almacenada 14 meses a -20ªC, 4ªC y temperatura ambiente respectivamente.

Por otro lado, se estudió la capacidad de AHL como biocatalizador en la síntesis de ésteres empleando como dadores de acilo ácidos grasos (0,02 M) de distinto número de carbonos y n-butanol (0,04 M) como alcohol, ensayando como solventes isooctano y hexano. Se comprobó que AHL en isooctano no tuvo actividad en síntesis, en tanto que en hexano se obtuvieron las siguientes actividades enzimáticas específicas (mmoles ácido consumidos/h×mg biocatalizador): 0,0042 (ácido butírico); 0,0025 (ácido hexanoico) y 0,0045 (ácido láurico). Las conversiones en producto obtenidas fueron 25,9% (ácido butírico), 15,2% (ácido hexanoico) y 28,4% (ácido láurico).

También se probó la habilidad de AHL en la síntesis de un surfactante derivado de arginina (Bz-Arg-decilamida, Bz-Arg-NHC ) según la metodología descripta para biocatalizadores 10

basados en peptidasas [2]. Luego de 72 hs de reacción se obtuvo una conversión del 37,4% en Bz-Arg-NHC y del 44,0% en el producto de hidrólisis, Bz-Arg-OH. En las condiciones ensayadas, 10

AHL tendría mayor habilidad para hidrolizar el dador de acilo que en realizar la formación del enlace amida entre Bz-Arg-OEt y la decilamina. Sin embargo, AHL presentó mejores rendimientos en la formación de producto que otras lipasas comerciales (tales como Novozym 435) en la síntesis de otros surfactantes derivados de arginina mediante un método similar [3], lo que convierte a AHL en un biocatalizador promisorio para la obtención de este tipo de productos.

Bibliografía

1. Foresti, M. L.; Di Santo Meztler, P.; Morcelle, S. R. IV Encuentro Regional de Biocatálisis y Biotransformaciones, Uruguay, Diciembre de 2010.2. Morcelle, S. R., Liggieri, C. S., Bruno, M. A., Priolo, N.; Clapés, P. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009, 57, 177-182.3. Morán, C.; Infante, M. R.; Clapés, P. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2001, 17, 2063–2070.

PP-SB8

149

Aplicação Biocatalítica de Nova Lipase Metagenômica (Lip-LifC6G9) Imobilizada em Suporte Hidrofóbico

1 2 2 2Viviane Paula Martini , Robson Carlos Alnoch , Arnaldo Glogauer , Emanuel M. de Souza , 2 1Fabio de O. Pedrosa , Nadia Krieger

nkrieger@ufpr.br

1 Laboratório de Tecnologia Enzimática e Biocatálise, Departamento de Química, Universidade Federal do Paraná,Curitiba (Cep 81531-990), Brasil

2 Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Paraná,Curitiba (Cep 81531-980), Brasil

Genes de uma nova lipase (lipC6G9) e sua foldase (lifC6G9) foram isolados de uma

biblioteca metagenômica, montada a partir de um solo contaminado com gordura animal [1]. Esses

genes apresentam 96% e 77% de identidade, respectivamente, com as proteínas correspondentes de

Aeromonas veronii B565. LipC6G9 e lifC6G9 foram co-expressos para permitir que a lipase fosse

ativa e, então, o complexo foi purificado e caracterizado. As características bioquímicas e cinéticas

da lipase, aqui denominada de Lip-LifC6G9, foram investigadas e verificou-se que a enzima

apresenta elevada atividade em uma ampla faixa de pH (6,5 - 10,5) e temperatura (10 - 40°C), sendo -1a maior atividade (1500 U.mg ) em pH 7,5 a 30°C, contra tricaprilina. Estudos de imobilização de

LipC6G9 foram realizados com o suporte hidrofóbico (Accurel MP-1000) com diferentes -1

concentrações (5 a 15) em miligramas de proteína por grama de suporte, mg g . A cinética de -1

imobilização mostrou uma eficiência imobilização (E) de 68% em 24 h na proporção de 5 mg g . A 1

atividade de hidrólise contra trioleína em n-heptano para o preparado imobilizado foi 219 ± 28 U g

de suporte. O processo de imobilização não causou nenhuma inativação ou desnaturação na

enzima, visto que houve uma retenção de atividade (R) de 248% em meio orgânico em relação à

enzima livre. A enzima imobilizada se mostrou estável nas temperaturas de 30 e 40ºC, mantendo

aproximadamente 95% da sua atividade residual após 8 h incubação. A enzima também se mostrou

estável em diferentes solventes orgânicos como n-heptano (log P 4,0), n-hexano (log P 3,5), etanol

(log P 0,31) e acetona (log P -0,23), mantendo mais de 80% de sua atividade residual após 8 h de

incubação. A atividade de esterificação foi avaliada pela síntese de oleato de etila em n-hexano, -1obtendo-se 36 U g de suporte e uma conversão em éster de 95% em 6 h.

Esses resultados são promissores e fundamentam estudos futuros para a utilização de Lip-

LifC6G9 imobilizada em biocatálise em solventes orgânicos.

Bibliografía

1. Glogauer, A.; Martini, V. P.; Faoro, H.; Couto, G. H.; Müller-Santos, M.; Monteiro, R. A.; Mitchell, D. A.; Souza, E. M.; Pedrosa, F. O.; Krieger, N. Microb. Cell. Fact. 2011, 10, 54-68.

PP-SB9

150

Estudio del potencial biocatalítico de plantas aromáticas y sus comunidad endófita

Facundo Marconi, César Iglesias, David Gonzalez, Sonia Rodríguez y Paula Rodríguezfacupeacecamp@gmail.com

Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones, DQO-DepBio, Facultad de Química, Universidad de la República (UdelaR), Montevideo (11200), Uruguay

Desde el año 2007 nuestro grupo se ha abocado a la búsqueda de biocatalizadores a partir del medio ambiente explotando la diversidad microbiana endófita presente en plantas nativas y cultivadas [1]. En el marco de esta estrategia nos planteamos estudiar microorganismos endofíticos presentes en plantas aromáticas ricas en aceites esenciales volátiles que contienen compuestos terpénicos de valor industrial. Nuestra hipótesis de trabajo es que microorganismos expuestos a este ambiente particular pueden haber desarrollado sistemas enzimáticos capaces de metabolizar algunos componentes del aceite esencial y que por ello pueden resultar en biocatalizadores específicos de interés.

En ese sentido hemos estudiado la reducción de cuatro cetonas proquirales por hojas de Mentha pulegium y por microorganismos aislados de esta planta. En el experimento comparamos sustratos que hemos estudiado previamente (2-, 3- y 4-acetilpiridina) como las piridinas y un sustrato estructuralmente relacionado con los componentes del aceite esencial de la menta como la carvona.

Los resultados preliminares de este proyecto indican que las tres piridinas fueron reducidas para dar los correspondientes alcoholes. En el caso de la carvona, se estudió el efecto del agregado de inhibidores bacterianos y fúngicos para evaluar la incidencia de los microorganismos endofíticos en la conversión. En este caso se observó un producto de biotransformación únicamente cuando el experimento se realizó en presencia de cloranfenicol, un inhibidor del crecimiento bacteriano.

Bibliografía

1. Rodriguez, P.; Reyes, B.; Barton, M.; Coronel, C.; Menéndez, P.; Gonzalez, D.; Rodríguez, S. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2011, 71, 90-94. 2. Rodríguez, P.; Barton, M.; Aldabalde, V.; Onetto, S.; Panizza, P.; Menéndez, P.; Gonzalez, D.; Rodríguez, S. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2007, 49, 8-11.

PP-SB10

151

Nuevos biocatalizadores de utilidad en la síntesis de un intermediario quiral de Atorvastanina

1,2 2 2 1,2Cesar Iglesias , David Gonzalez , Paula Rodriguez y Sonia Rodriguez

ciglesias@fq.edu.uy

1Laboratorio Microbiología Molecular, Departamento de Biociencias , Facultad de Química, Universidad

de la Republica, Montevideo 11800, Uruguay.2Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones, Departamento de Biociencias y Química Orgánica,

Facultad de Química, Universidad de la Republica, Montevideo 11800, Uruguay.

Los alcoholes quirales secundarios juegan un importante rol en la industria agroquímica, farmacéutica y química. En los últimos años se han aplicado pasos de reducción biocatalítica en síntesis como procesos verdes en la obtención de estos sintones. La quiralidad de un compuesto es de fundamental importancia en relación con su actividad biológica. Los antecedentes en la síntesis de fármacos racémicos con un enantiómero nocivo al ser humano son varios y existe un interés creciente en desarrollar procesos capaces de producir drogas ópticamente puras [1]. Un enantiómero individual puede ser producido por síntesis química o quimio-enzimática. La ventaja de la Biocatálisis sobre la síntesis química se refleja en la alta enantio y regioselectividad de las enzimas utilizadas [2]

Este trabajo se centra en la obtención del 3-(S)-4-cloro-hidroxibutirato de etilo por reducción biocatalítica a partir del 4-cloroacetoacetato de etilo, este alcohol es de utilidad en la síntesis de medicamentos anticolesterol inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A (HMG-CoA) reductasa como Atorvastatina. (Figura 1).

Se utilizaron levaduras endofíticas y cepas de E. coli recombinantes como agentes bio-reductores que expresan reductasas de diversos orígenes. En los ensayos realizados a pequeña escala se observó producción del 3-(S)-4-cloro-hidroxibutirato de etilo con tres de las cinco levaduras endofíticas utilizadas, mientras que con las E.coli recombinantes se observó producción del 3-(R)-4-cloro-hidroxibutirato con una de las cuatro cepas utilizadas. Una cepa de Pichia endofítica de zanahoria presentó un e.e de 90%. Con esta cepa se realizaron ensayos a escala de 1L y biotransformación a pequeña escala en sistema bifásico por la conocida inestabilidad del sustrato en agua. En la escala de 1L se mantuvo la producción del alcohol con el mismo e.e, mientras que en el sistema bifásico se observó el aumento de bioconversión y se mantuvo la enantioselectividad algo no observado en otras levaduras al realizar biotransformaciones con células enteras en sistema bifásico con este sustrato.

4-cloro acetoacetato de etilo 3-(S)-cloro-hidroxibutirato de etilo

Figura 1: Síntesis de intermediario quiral

Bibliografía

1. Faber, K. Biotransformations in Organic Chemistry. 5th ed. 2004, Berlin: Springer.2. Patel, R. N. ACS Catalysis 2011, 1(9), 1056-1074.

PP-SB11

152

Sistema planta-microorganismos endófitos como biocatalizadores

1 2y3 3Cynthia Magallanes-Noguera , Paula Rodríguez Bonnecarrere , David Gonzalez , Sonia

2 1Rodríguez Giordano , Marcela Kurina-Sanz

cynthiamagallanes@hotmail.com, paularod@fq.edu.uy

1 INTEQUI-CONICET, Fac. de Química, Bioquímica y Farmacia, UNSL, San Luis, Argentina.2DEPBIO y 3DQO Fac. de Química, UdelaR, Montevideo, Uruguay

Los microorganismos endófitos y sus plantas hospederas se interrelacionan mediante un complejo sistema de comunicación químico y bioquímico. Es razonable pensar que una determinada actividad enzimática observada en una planta pueda deberse total o parcialmente a sus microorganismos endófitos, o bien que la expresión de la/s proteína/s involucradas pueda resultar elicitada por la presencia de estos [1]. Se ha sugerido que, a lo largo de la evolución, los endófitos han ido adaptando su microambiente mediante diversas modificaciones genéticas, entre otras la integración de ADN vegetal en sus propios genomas [2]. Además, se ha descripto que diversos cultivos in vitro de Raphanus sativus permiten obtener R-alcoholes por reducción estereoselectiva de sustratos proquirales [3, 4, 5].

Se abordó el estudio comparativo de sistemas mixtos, vegetales axénicos y microorganismos aislados utilizando como reacción modelo la bio-reducción de la cetona proquiral acetofenona. Se utilizaron cultivos in vitro de plántulas (P), cultivos axénicos de raíces genéticamente transformadas (RT) y tres microorganismos endófitos (ME) aislados de plántulas de R. sativus. Los ME, 2 cepas bacterianas y un hongo filamentoso, fueron identificados y caracterizados mediante la secuenciación del gen 16S rRNA para las cepas bacterianas y la región ITS1-5.8SrRNA-ITS2 para el hongo filamentoso. La contribución que hace cada componente del sistema biológico planta-endófitos a la estereoquímica del producto final será discutida en este trabajo.

Bibliografía

1. Rodríguez, P.; Barton, M.; Aldabadle, V.; Onetto, S.; Panizza, P.; Menéndez, P.; Gonzalez, D.; Rodríguez, S. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2007, 49, 8-11.2. Germaine, K; Keogh, E.; Garcia-Cabellos, G.; Borremans, B.; Lelie, D.; Barac, T.; Oeyen, L.; Vangronsveld, J.; Moore, F. P.; Moore, E. R. B.; Campbell, C. D.; Ryan, D.; Dowling, D. N. FEMS Microbiol. Ecol. 2004, 48, 109–118.3. Orden, A.; Magallanes-Noguera, C.; Agostini, E.; Kurina-Sanz, M. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009, 61, 216-220.

4. Rodríguez Bonnecarrere, P.; Magallanes-Noguera, C.; Gonzalez, D.; Kurina-Sanz, M.; Rodríguez Giordano, S. XVIII Simposio Nacional de Química Orgánica. 2011. 5. Matsuo, K.; Kawabe, S.; Tozuda, Y.; Eguchi, T.; Yamanakab, R.; Nakamura, K.; Tetrahedron: Asymmetry. 2008, 19, 157–159.

PP-SB12

153

Caracterización del extracto extracelular con actividad lipolítica de la cepa de Janibacter R02 aislada de la Antártida

1 2 3 2 1Diego Rodríguez , Agustín Castilla , Silvia Cesarini , Paula González , Sonia Rodríguez , 2 3Gabriela Irazoqui , Pilar Díaz

diegomrf@gmail.com; eacastilla@gmail.com

1Cátedra de Microbiología, Facultad de Química, UdelaR, Montevideo(11800), Uruguay, 2Cátedra de Bioquímica, Facultad de Química, UdelaR, Montevideo(11800), Uruguay,

3Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, U. de Barcelona, Barcelona(08028), España

La necesidad de desarrollar procesos químicos sustentables y de bajo impacto ambiental ha despertado un resurgimiento del interés en la biocatálisis. Entre los biocatalizadores más utilizados a nivel industrial se encuentras las lipasas, con una amplia gama de aplicaciones [1]. Si bien son numerosas las lipasas aisladas, sólo unas pocas son ampliamente utilizadas en biocatálisis dado que son de fácil obtención comercial. Nuestro grupo se ha enfocado en la identificación y caracterización de lipasas a partir de microorganismos nativos, con potencial aplicación en la industria del biodiesel. En este marco se realizaron aislamientos de cepas con actividad lipolítica a partir de muestras de la Antártida, encontrándose una cepa de Janibacter cuyo extracto extracelular crudo resulta un buen biocatalizador para la síntesis de biodiesel.

En base a estos antecedentes se ha planteado el estudio, aislamiento e identificación de las lipasas extracelulares presentes en la cepa de Janibacter R02, según dos abordajes: una estrategia bioquímica clásica y una aproximación molecular. Se ha estudiado la producción de lipasas extracelulares en función del crecimiento, estudiándose además la incidencia de diferentes aceites en la inducción del sistema lipolítico. Se han realizado asimismo estudios de T y pH óptimos, así como la incidencia de diferentes metales como activadores o inhibidores de la actividad enzimática,

+ + ++encontrándose que el K y el Na son esenciales para su actividad, siendo el Ca un activador. Asimismo, se han realizado estudios de especificidad de sustrato con pNP butirato, pNP valerato, pNP oleato y pNP estearato, mostrando mayor actividad con esteres de cadena intermedia (C8). Estos datos aportan la base para la purificación de las enzimas presentes en el extracto con actividad lipolítica. Paralelamente, el análisis de la única cepa secuenciada de Janibacter ha permitido identificar siete genes que potencialmente codifiquen para lipasas. Se han diseñado primers dirigidos a los extremos, y otros dirigidos a las zonas conservadas. La amplificación por PCR de estas zonas permitirá llegar a la identidad total o parcial de los genes que codifican para las lipasas presentes en esta cepa, abriendo la posibilidad de clonar y expresar la misma en forma heteróloga.

Bibliografía

1. Jaeger, K. E.; Eggert, T. Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13, 390-397.

PP-SB13

154

Screening y evaluación de nuevas fosfotriesterasas bacterianas en la degradación de compuestos organofosforados

1 1 1 1,2Julia Santillán , Lucas Dettorre , Elizabeth Lewkowicz y Adolfo Iribarrenyamilasantillan@gmail.com

1Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad

Nacional de Quilmes, Bernal (1876), Buenos Aires, Argentina2Laboratorio de Química de Ácidos Nucleicos, Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y

Biología Molecular (INGEBI), CONICET-UBA, Buenos Aires (1428), Argentina

Las fosfostriesterasas (PTEs, EC 3.1.8.1) son enzimas capaces de hidrolizar es te reose lec t ivamente compues tos organofosforados (OPs) , en par t icu la r arildialquilfosfotriésteres. Estas enzimas catalizan la ruptura de un enlace fosfoéster produciendo dos compuestos generalmente menos tóxicos que el OP de partida. Las PTEs son potenciales candidatas a ser utilizadas en procesos de biorremediación y en profilaxis frente a intoxicaciones agudas por OPs [1], debido a que estos sustratos, por un lado, son altamente tóxicos (por ser inhibidores de acetilcolinesterasa y otras esterasas del sistema nervioso central [2]), y por otro, poseen una amplia disponibilidad comercial y un uso generalizado como insecticidas (38% de los pesticidas en el mundo) [1]

Se ha descrito la presencia de PTEs en una gran variedad de tejidos biológicos de mamíferos, peces, aves, moluscos y en bacterias. En la actualidad, las PTEs estudiadas en mayor detalle son las de Brevundimonas diminuta y Flavobacterium sp., y las paraoxonasas séricas humana y de conejo [3].

Con el objetivo de hallar nuevas fuentes bacterianas wild type de PTEs, se diseñó una metodología de screening en medio de cultivo sólido utilizando un sustrato fluorogénico y se la aplicó a una colección completa de microorganismos. Aquellas bacterias que resultaron positivas fueron posteriormente evaluadas en medio liquido frente a una serie de OPs: metil y etil paraoxón, metil paratión y coroxón. Paralelamente, se evaluaron diversas condiciones de reacción tales como la concentración de sustrato, pH de medio y temperatura de la biotransformación. Mediante esta metodología cualitativa, rápida y sencilla se hallaron cepas de los géneros Arthrobacter, Nocardia y Streptomyces con actividad PTE.

Bibliografía

1. Singh, B. K. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 156–164 2. Aldridge, W. N.; Reiner, E. Acylated amino acids in inhibited B-esterases. En: Neuberger, A., Tatum, E.L. (Eds.), Enzyme Inhibitors as Substrates 1972. North-Holland, Amsterdam, 170–175.3. Vilanova, E.; Sogorb, M. A. Crit. Rev. Toxicol. 1999, 29, 21–57.

PP-SB14

155

Estudos de Imobilização e Aplicação de uma Lipase de Metagenômica na Síntese de Ésteres

1 1 1 2Aline Dutra Madalozzo , Keyla Kaori , Viviane Paula Martini , Emanuel M. de Souza , Fabio de 2 1O. Pedrosa e Nadia Krieger

nkrieger@ufpr.br

1 Laboratório de Tecnologia Enzimática e Biocatálise, Departamento de Química, Universidade Federal do Paraná,Curitiba (Cep 81531-990), Brasil

2 Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Paraná,Curitiba (Cep 81531-980), Brasil

Neste trabalho foram realizados estudos de imobilização de uma lipase de metagenômica denominada de LipC12 [2] em suportes com diferentes tipos de interação/ligação e o seu desempenho na síntese de ésteres foi avaliado. Os suportes utilizados foram Accurel MP-1000, Membrana de Polipropileno, Celite 545 e Immobead 150. Parâmetros como eficiência de imobilização (E) e retenção de atividade (R) foram estudados para cada preparado enzimático com concentrações de proteína/suporte de 10 e 20 mg/g. O valor de E foi maior para as lipases imobilizadas nos suportes Accurel MP-1000 e Immobead 150 na concentração de 10 mg/g (proteína/suporte), 62 e 93 %, respectivamente. A retenção de atividade também foi maior para as lipases imobilizadas nestes suportes, com valores de 242 % para o suporte Accurel MP-1000 e 80 % para Immobead 150. Todos os derivados imobilizados foram testados na reação de síntese do oleato de etila, para determinação das atividades de esterificação e conversões em éster.

As lipases imobilizadas em membrana de polipropileno e Celite 545 praticamente não apresentaram atividade de esterificação. LipC12 em Immobead 150 apresentou uma alta atividade

-1de esterificação, 38 U.g , e conversão em éster de 95% em 4 h. Imobilizada no suporte Accurel MP-

-11000, a lipase apresentou atividade de esterificação de 33 U.g e conversão em éster de 94% em 6 h. Visto que o suporte Immobead 150 proporcionou o melhor resultado de imobilização, foi verificada a estabilidade da enzima imobilizada neste suporte (10 mg/g), frente a diversos ciclos de reação de esterificação. Observou-se que o derivado imobilizado pode ser utilizado por pelo menos 10 ciclos de esterificação mantendo 80% da sua atividade inicial ao final do processo.

Bibliografía

1. Glogauer, A.; Martini, V. P.; Faoro, H.; Couto, G. H.; Müller-Santos, M.; Monteiro, R. A.;

Mitchell, D. A.; Souza, E. M.; Pedrosa, F. O.; Krieger, N. Microb. Cell Fact. 2011, 10, 54-68.

PP-SB15

157

Indice de autores

159

Bersi Grisel, 146ABertana Lahourcade Julieta, 76Aciar Roxana, 128

Adachi Osao, 69Bertoldo Pacheco Maria Teresa, 106

Agostini Elizabeth, 49Bianchi Dario A., 83

Aguirre-Pranzoni Celeste, 68Bianchi Paola, 59

Alfaro Juan Manuel, 119Bisogno, Fabricio R. , 42, 68

Alfonso Patricia, 107Blotta María E., 51

Allendes Jorge, 120Bonetto Rita D, 104

Allevatto Florencia Laura, 143

Alnoch Robson Carlos, 149 Boscolo Wilson Rogério, 106

Álvares Monge Neto André , 115 Botto Emiliana, 123

Amongero Marcela , 83 Breccia Javier, 55, 142

Andrade Conceição Gelson Jose, 113 Brochero Vanesa, 120

Andrade Leandro H., 21 Brovetto Margarita, 109

Anello Abi L., 75 Briand Laura E., 28, 43, 67, 72, 104

Anzorena Adrian, 122 Bruttomesso Andrea , 130

Araujo Paula Z., 71 Busto Eduardo, 85, 126

Ardanaz Carlos, 49 Bustos Daniela, 47

Arrieta Rosa, 36 Bustos Daniel, 47, 120, 128

Arroyo Pedro A., 46 Butiuk Ana P. 103, 128

Assaf Elisabete M., 111

Avendaño Laritza, 73 CAyuso I., 14 Cabrera Mariana , 82

Cánepa Alicia, 58

B Cánovas Cintia, 120 Baldessari Alicia , 45, 52, 129, 130, 131, Cantera Ana, 57, 136, 146

132, 133 Cantera Carlos, 118

Ballesteros Antonio O., 114 Canto Duarte Juliana, 44

Barão Carlos Eduardo, 46, 93 Cardillo Alejandra B., 27

Barberis Sonia, 145, 146, 147 Cardillo Sabrina B., 27 , Barcia Cristina, 145, 146, 147 Carrera Ignacio, 22, 79

Batista-Viera Francisco, 30 Castañeda María T., 33

Beccaria Alejandro, 48 Castilla Agustín, 153

Berenguer José, 31 Cavalheiro Maria C. H. T., 111

Bernal Claudia, 80

160

Cecati Francisco, 49 Domínguez de María Pablo, 41, 94,

Ceccoli Romina D. 83 95, 96

Céliz Gustavo, 32 Dutra Madalozzo Aline, 155

Cesarini Silvia, 35, 153

Cid Alicia, 32 EClapés Pere, 58 Eiras Javier, 130

Collins Sebastián, 72, 104

Colmán Marcos, 141 FComeli Raúl, 48 Faber Kurt , 13

Córdoba Agostina, 70 Fait Ma. Elisa,148

Costa Hernán, 31, 102 Faria de Moraes Flávio, 46, 93

Faria Soares Cleide Mara, 46

CH Fenoglio Cecilia L., 144

Chanquía Santiago N., 52 Ferrarotti Susana Alicia, 31, 102

Chiale Carolina, 97 Ferreira Duarte Natália, 113

Ferreira Irlon M. (PG), 134D Ferreira M. Luján, 28, 56 , 70, 74, 104, Dantas João Henrique, 46, 115, 93, 110Daz Mirta, 32, 71 Foresti M. L., 56, 143, 148De Paris Leandro Daniel, 46, 93 Freire Teresa, 97de Paula Bruno R.S, 77, 78 Fuchs Michael, 13de Regil Rubén, 114 Fuchs Christine S., 13Derrudi Lucía, 108 Furque Gabriela I., 100de Sousa Marylane, 144

de Souza Emanuel M., 149 , 155 GGalarza Betina, 117, 118de Souza Sonia Ap., 106Gamenara Daniela, 105, 107, 108, 109Destefanis Hugo, 81, 82García-Junceda E., 14, 76Dettorre Lucas A., 125, 154García Liñares Guadalupe, 52, 129, Díaz M. E., 51

130, 131, 132, 133Díaz Pilar, 35, 153Geronazzo Hugo, 81, 82Dibello Estefanía, 107, 108Giacomini Cecilia, 116

Dieterich Fabiana., 106 Gioia Larissa, 84

Di Santo Meztler Paula, 148 Giorgi Victoria, 123

161

Giulietti Ana M., 27 Krymkiewicz Norberto, 102

Glogauer Arnaldo, 149 Kuriki Henrique, 113

Gonzalez David, 122, 150, 151, 152 Kurina-Sanz Marcela, 20, 42, 49, 68,

González Paula, 153 75, 152

Gortari María Cecilia, 117, 118

Gotor-Fernández Vicente, 16, 85, 126 LGotor Vicente, 85, 126 Lapadula Walter, 42

Guauque Torres M. P., 56 Lassalle Verónica, 74

Guerrero Cecilia, 98 Leemans Laura, 114

Gutiérrez Mariana, 58 Lewkowicz Elizabeth S., 59, 76, 121,

125, 154

H Llerena-Suster Carlos, 58, 67, 72

Hergert Lisandro, 128 Locatelli Silvano, 119

Hidalgo Aurelio, 31 López Abelmar, 73

Hofzumahaus Sebastian, 41 López Aca Viviana, 141

Hours Roque A., 33, 103, 117, 128 López-Iglesias María, 85

Ludemann Vanesa, 59

I Lunardi Inês, 44

Iglesias César, 150, 151

Iglesias Luis E., 50, 124 MIllanes Andrés, 36, 80, 98, 101 Magallanes-Noguera Cynthia A., 49,

Irazoqui Gabriela, 116, 153 152

Iribarren Adolfo M., 50, 59, 76, 121, Magario Ivana, 70

124, 125, 154 Mammarella Enrique, 144

Mangas-Sánchez Juan, 85

J Mansú Re Martha, 128

Manta Carmen, 29, 34, 84 Jeller Alex H. (PQ), 134Manzano, Nancy, 120José Carla, 28, 43, 72Manzo Ricardo M., 144Juárez M. Mercedes, 32Marconi Facundo, 150Juri-Ayub Maximiliano, 42Martearena M. Rita, 32, 119KMartini Viviane Paula , 149, 155Kaori Keyla, 155Mascotti María Laura, 42, 75Kise Francisco, 51Maugeri Zaira, 95Krieger Nadia, 127, 149, 155Mazzaferro Laura, 55, 142Kroutil Wolfgang, 13

162

Meire Vidotti Rose, 106 Palacio Cyntia M., 124

Menéndez Pilar, 84, 122, 123 Palazzolo Martín, 121

Méndez Florencia, 34 Panizza Paola, 35

Méndez-Sánche Daniel, 126 Parisi Mónica, 51

Michlig Melina, 144 Parraud Gonzalo, 132

Mignone Carlos F., 33, 103 Pazos Mariana, 109

Miranda Valeria, 36 Pedrosa Fabio de O., 149, 155

Mitchell David Alexander, 127 Pérez-Sánchez María, 94, 96

Molina Alicia S., 75 Perotti Nora I., 71

Molinari Francesco, 15 Peralta Altier Gabriela, 29

Molinaro Carmela, 122 Piñuel Lucrecia, 142

Monsalve Leandro N., 99 Pizzuti (PQ) Luca , 134

Montaner Aneley N., 83 Pfeffer Jan, 13Moran Paulo José S., 44, 77, 78 Plou Francisco, 45, 101, 114 Moras Lucila, 99 Porciúncula Cecilia, 116Morcelle Susana R., 58, 67, 72, 143, 148 Porto André L M., 111, 112, 134, 135Müller Christoph R., 94 Pressnitz Desiree, 13Mutti, Francesco G., 13 Provedel Martins Mariana, 112

N Q Neher Bárbara, 55 Quintana Paula, 45, 52, 129Nicolás Paula, 74 Quiroga Gustavo, 145

O ROrden Alejandro, 49, 68, 75 Ravetti Soledad, 128Oroz-Guinea I., 14 Ravía Silvana, 105

Osinaga Eduardo, 97 Rial Daniela,V., 83Ouazanni Jamal, 112 Rimada Rubén, 58Ovsejevi Karen, 29, 34, 84 Ríos-Lombardía Nicolás, 126

Rocha Gabriela, 51P

Rocha (PG) Lenilson C., 134Pacciaroni Adriana, 47

Rocha Barro Gonçalves Luciana, 144

Padilla Daniel, 114Rodriguez-Colinas Bárbara, 101

Padró Juan M , 58Rodríguez, Débora, 51

Paim Valença Gustavo, 44

163

Rodríguez Diego, 153 Simon Robert C., 13

Rodríguez Ernesto, 97 Siirola Elina, 13

Rodríguez Giordano Sonia, 35, 79, 122, Soares Diniara, 127

150, 151, 152, 153 Soria Fernando, 81, 82

Rodríguez Gastón Jorgelina Andrea, 102 Sosa Virginia , 47, 100

Rodrigues José Augusto R. 44, 77, 78 Ströher Raquel, 115

Rodríguez-Mata María, 78

Rodriguez Paula, 122, 150, 151, 152 TRodriguez Talou Julián, 27 Talia Juan Manuel, 145

Rodríguez Zotelo Juan J., 81, 82 Tauber Katharina, 13

Romero Oscar, 36 Toledo M. Victoria, 28, 43, 104

Rosa Melisa, 128 Tonetto Gabriela Marta, 110

Rosset Isac G, 111 Tonn Carlos E., 68

Rossi Ana Lía, 102 Torres Eduardo, 73

Rosso Adriana, 51 Torres Machado Fernando, 113

Rubiolo Amelia, 144 Torres Pedro, 30

Rustoy Eduardo Miguel, 133 Trifone César A., 50

S USabaini María B., 50, 124 Urrutia Paulina, 101

Saenz-Méndez Patricia, 108Salem Romina, 47 V Sampaio Gonçalves Giovani, 106

Valdeón Daniel H., 71Sanchez Daniel Alberto, 110

Vallés Diego, 57, 146Sanchez Esteban, 48

Varela Patricia, 47Sandoval Georgina, 19, 45, 114

Vázquez Analía, 99, 143Santillán Julia Y., 125, 154

Vera Carlos, 98Santos Ribeiro Sandra , 135

Veríssimo Paula, 147Sattler Johann H., 13

Vero Silvana, 105Scaroni Elsa, 32, 119

Vila Agustina, 22, 79Schallmey Anett, 41

Villadóniga Carolina, 136Schallmey Marcus, 41

Villagarcía Hernán, 33 Schicchi Alejandra Elisei, 131

Villegas Osnelda, 73Seoane Gustavo, 22, 79, 107, 108, 109

Shanmuganathan Saravanakumar, 96

164

W ZWeigand Lisa, 41 Zampieri Luiz A,. 77, 78

Weiz Gisela, 142 Zampieri Dávila S, 77, 78

Wiermans Lotte, 41 Zanin Gisella Maria, 46, 93, 115

Williams María del Pilar, 143 Zeballos Lucía, 122

Wilson Lorena, 36, 80, 101 Zepeck Ferdinand, 13

YYubero Fátima, 141

La figura de la portada es propiedad de (USA)

y se ha utilizado con permiso por escrito de la empresa.

Impreso en

Domicilio: calle 10 Nº 814 entre 48 y 49, La Plata.Teléfono: (0221) 425-1733 | omnicop_grafica@hotmail.com

Impresión de 150 ejemplares.

www.PoweredTemplate.com