UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Natalija N. Verović

Uticaj konzervanasa na sprečavanje mikrobiološkog

kvarenja medovine

Master rad

Niš, 2018.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Uticaj konzervanasa na sprečavanje mikrobiološkog

kvarenja medovine

Master rad

Kandidat:

Natalija N. Verović

Mentor:

Dr Nataša Joković

Niš, Oktobar, 2018.

UNIVERSITY OF NIS

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Master thesis

Effect of preservatives on microbial mead spoilage

Candidate:

Natalija N. Verović

Mentor:

Nataša Joković, PhD

Niš, 2018.

Rad koji je pred vama poslednji je kamenčić u mozaiku mog petogodišnjeg

obrazovanja i čini samo jedan delić znanja koje sam stekla na ovom fakultetu.

Ovaj master rad, kao i sve ostalo pre njega, sigurno ne bi mogao nastati bez

pojedinih ljudi koji su mi tokom studija pružali ogromnu podršku, usmeravali me

i činili da iz ovog procesa izađem sa diplomom i osnovama znanja koje ću čitavog

života nadograđivati.

Neizrečivu zahvalnost najpre dugujem mom mentoru, prof. dr Nataši Joković,

zbog iskazanog strpljenja, podrške i volje da uvek odgovori na moja bezbrojna

pitanja i ispravi sve moje početničke propuste.

Ništa manju zahvalnost želim da iskažem i asistentu Nikoli Stankoviću čiji su

dragoceni saveti učinili da iz oblasti koja je predmet ovog rada svakog dana, pa i

noći, naučim nešto novo i razjasnim nešto što, bez pravog usmerenja, verovatno

nikada ne bih mogla sama.

Iako u poslednjim redovima, možda i najveća zahvalnost ide ljudima koji su me

trpeli, kritikovali i podržavali, nervirali me i tešili, ali uvek razumeli i voleli,

ljudima koji su meni svoj život posvetili, a kojima ja posvećujem ovaj rad kao i

sve svoje obrazovanje. Hvala vam što ste uvek bili više od roditelja i što ste mi put

ka samostalnosti učinili mnogo lakšim.

Biografija kandidata

Ime i prezime: Natalija Verović

Datum rođenja: 25. novembar 1994. godine

Mesto rođenja: Knjaževac

Osnovna škola: OŠ „Učitelj Tasa“ u Nišu (2001-2009. god.)

Srednja škola: Gimnazija „Svetozar Marković“ u Nišu, društveno-jezički smer (2009-2013.

god.)

Fakultet: Prirodno-matematički fakultet u Nišu (2013-2018. god.)

Osnovne akademske studije: smer biologija (2013-2016. god.)

Master akademske studije: smer biologija (2016-2018. god.)

Sažetak

Alkoholna fermentacija je biološki proces transformacije šećera u etanol. Medovina je

alkoholni napitak sličan vinu koji nastaje fermentacijom medne šire. Konzervansima se smatraju

sva jedinjenja koja usporavaju ili sprečavaju mikrobiološko kvarenje hrane. U ovom radu

korišćeno je osam uzoraka medovine na kojima je ispitivana antimikrobna aktivnost natrijum

benzoata, kalijum metabisulfita i propolisa. Određena je minimalna inhibitorna koncentracija

mikrodilucionom metodom. U prvom delu eksperimenta ispitivana je aktivnost konzervanasa na

centrifugiranim uzorcima. U drugom delu uzorci nisu bili centrifugirani već samo tretirani

konzervansima.

Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da se centrifugiranje može koristiti za

konzervisanje medovine. Natrijum benzoat je pokazao najbolje rezultate u inhibiranju rasta

bakterija i kvasaca u uzorcima koji nisu bili centrifugirani. Kalijum metabisulfit je takođe pokazao

dobre rezultate, inhibirajući rast bakterija u većini uzoraka. Primenjene koncentracije propolisa

imale su najmanji inhibitorni efekat na mikroorganizme u uzorcima.

Ključne reči: Medovina, propolis, natrijum benzoat, kalijum metabisulfit

Abstract

Alcohol fermentation is the biological transformation of sugar into ethanol. Mead is an

alcoholic drink similar to wine produced by the fermentation of honey must. Preservatives are

chemical substances that slow down or prevent microbiological food spoilage. Antimicrobial

activity of sodium benzoate, potassium metabisulfite and propolis was assessed on eight

samples of mead. Minimal inhibitory concentration was determined by the microdilution

method. In the first part of the experiment, inhibitory activity of preservatives was examined in

centrifuged samples. While in the second part the samples were not centrifuged but only treated

with preservatives.

Based on the results obtained, it can be concluded that centrifugation can be used for

preserving mead. Sodium benzoate showed the best results in inhibiting the growth of bacteria

and yeast cells. Potassium metabisulfite also showed good results by inhibiting bacterial growth

in most samples. The applied concentrations of propolis had the weakest inhibitory effect on

the microorganisms in the samples.

Key words: Mead, propolis, sodium benzoate, potassium metabisulfite

Table of Contents 1. Uvo ..................................................................................................................................................... 1

1.1. Vino ............................................................................................................................................ 2

1.1. Medovina .................................................................................................................................... 2

1.2. Kvasci ......................................................................................................................................... 4

1.3. Mikroorganizmi kvarenja vina .................................................................................................... 4

1.3.1. Kvarenje kvascima .............................................................................................................. 5

1.3.2. Kvarenje bakterijama mlečne kiseline ................................................................................ 7

1.3.3. Kvarenje bakterijama sirćetne kiseline ............................................................................... 8

1.3.4. Kvarenje endosporulišućim bakterijama............................................................................. 9

1.3.5. Kvarenje plesnima .............................................................................................................. 9

1.3.6. Kontaminacija pampura .................................................................................................... 10

1.4. Prevencija kvarenja vina ........................................................................................................... 11

2. Ciljevi rada ...................................................................................................................................... 14

3. Materijal i metode ........................................................................................................................... 15

3.1. Materijal .................................................................................................................................... 15

3.1.1. Uzorci medovine ............................................................................................................... 15

3.1.2. Konzervansi ...................................................................................................................... 17

3.2. Metode ...................................................................................................................................... 18

3.2.1. Mikrodiluciona metoda ..................................................................................................... 18

3.2.2. Metoda indirektnog brojanja mikroorganizama ................................................................ 18

3.2.3. Određivanje rezidualnih šećera u uzorcima Benediktovim testom ................................... 20

4. Rezultati i diskusija ........................................................................................................................ 21

4.1. Prvi set eksperimenata .............................................................................................................. 21

4.2. Drugi set eksperimenata............................................................................................................ 23

4.2.1. Minimalna inhibitorna koncentracija ................................................................................ 23

4.2.2. Rast mikroorganizama u uzorcima ................................................................................... 23

4.2.3. Koncentracija rezidualnih šećera ...................................................................................... 28

5. Zaključak ......................................................................................................................................... 30

6. Literatura ........................................................................................................................................ 31

1

1. Uvod

Fermentacija je biotehnološki postupak koji koristi rast i metaboličku aktivnost

mikroorganizama za transformaciju i konzervaciju hrane. Tokom fermentacije, rast

mikroorganizama kvarenja i patogenih organizama inhibiraju metaboliti organizama koji

izvode fermentaciju. Osim konzervacije, fermentacija utiče na aromu, ukus, teksturu i nutritivni

sastav hrane (Terefe, 2016).

Vino je fermentisano alkoholno piće koje nastaje fermentacijom grožđa ili šire. Iako

koncept transformacije šire grožđa u vino nije teško razumeti, proizvodnja ukusnog i stabilnog

vina koje se ne kvari tokom stajanja, smatra se posebnom veštinom. Pića slična vinu mogu se

proizvoditi fermentacijom drugog voća i cveća (Bartowsky, 2009).

Medovina ili vino od meda je alkoholni napitak (8-18% etanola) koji nastaje kao

produkt alkoholne fermentacije medne šire. Tradicionalna medovina je fermentisana smeša

meda i vode. Poslednjih godina u ovu smešu se dodaju voće i začini (Iglesias et al., 2014).

Usled visoke koncentracije šećera, proces fermentacije napreduje polako, zahteva određeni pH,

temperaturu, određene sojeve kvasca ienzima (Sroka i Tuszyński, 2007). Postoji nedostatak

naučnih informacija o fermentaciji medovine ali su proizvođači ustanovili da poboljšanje

kvaliteta medovine uključuje razvoj odgovarajuće formule aditiva i optimizacije uslova

fermentacije. Brojna istraživanja sprovedena na drugim fermentisanim napicima mogu biti od

pomoći za kontrolu fermentacije medovine (Mendes-Ferreira et al., 2010).

Rast mikroorganizama u hrani može rezultirati konzervacijom ili kvarenjem hrane, u

zavisnosti od vrste mikroorganizama i uslova koji vladaju u hrani (Prescott et al.,1993).

Konzervansi su supstance koje produžavaju trajnost namirnica i štite ih od kvarenja

prouzrokovanog mikroorganizmima. Dodaju se namirnicama u količinama koje su (bar prema

sadašnjim saznanjima) potpuno neškodljive za čoveka, a sami ili u kombinaciji sa drugim

aditivima sprečavaju razvoj mikroorganizama, izazivača kvarenja i propadanja namirnica

(Šumić, 2009).

2

1.1. Vino

Vino je proizvod kompleksne biološke i biohemijske interakcije između šire i raznovrsnih

mikroorganizama (gljiva, kvasaca, bakterija mlečne i sirćetne kiseline) i mikovirusa i bakteriofaga

koji ih napadaju. Proces počinje u vinogradu, nastavlja se kroz fermentaciju i sazrevanje, a

zaključuje flaširanjem. Od svih mikroorganizama, kvasci imaju najznačajniju ulogu, oni sprovode

alkoholnu fermentaciju (pretvaraju širu u etanol i CO2). Osim toga, iako je ukus vina direktno

određen sortom grožđa, kvasci utiču na ukus i kvalitet vina produkcijom i ekskrecijom metabolita

tokom rasta i autolize. U nekim slučajevima, kvasci mogu uticati na kvarenje vina tokom

proizvodnje. Kvasci prisutni tokom fermentacije potiču iz grožđa, vinograda, opreme koja se

koristi u vinskim podrumima, površina u podrumima i spoljašnjih izvora kao što su selekcionisane

kulture dodate kako bi olakšale fermentacije (Jolly et al., 2017).

Glavna uloga mikroorganizama u proizvodnji vina je prevođenje šećera iz grožđa u alkohol,

smanjenje kiselosti i davanje zanimljivih i poželjnih aroma i ukusa vinu. Iako grožđe ima dobar

nutritivni sastav, samo ograničeni broj mikroorganizama može rasti na njemu. Vino koje ima

manje nutritivne vrednosti u odnosu na grožđe je nepogodan supstrat za rast većine

mikroorganizama. Ograničavajući faktori rasta kvasaca i bakterija u grožđu su visoka koncentracija

šećera i nizak pH, a u vinu visoka koncentracija etanola, kiselost, sadržaj SO2 i oskudna količina

nutritijenata. Jedan od ciljeva vinarstva jeste redukcija potencijalnih mikrobnih kvarenja vina

(Bartowsky, 2009).

1.1. Medovina

Medovina se smatra najstarijim fermentisanim napitkom, s obzirom da je med, glavni

sastojak medovine, bio prvi izvor skoro čistog šećera (Piatz, 2014). Medovina je alkoholno piće,

jačine 9%-18% alkohola, koje se dobija fermentacijom medne šire, uz mogućnost dodavanja

različitih začina i voća (Slika 1). Iako med sadrži fermentabilne šećere, nema dovoljno azota,

minerala i faktora rasta koji stimulišu rast kvasaca i fermentaciju. Voćni sokovi, soli i kiseline

koriste se kao aditivi za stimulaciju fermentacije i poboljšanje ukusa. Promenom proporcije meda i

vode i tačke prekida fermentacije, dobijaju se različite vrste medovine (Gupta i Sharma, 2009).

3

Tradicionalna proizvodnja medovine uključuje zagrevanje ili ključanje medne šire

(nefermentisana smeša meda i vode) pre fermentacije u cilju eliminacije proteina i

mikroorganizama (Kahoun et al., 2017). Fermentacija medovine zahteva dosta vremena, ponekad i

po nekoliko meseci, u zavisnosti od vrste meda, soja kvasca i sastava šire. U većini zemalja koje

proizvode medovinu, alkoholna fermentacija je rezultat rasta mikroorganizama koji su prirodno

prisutni u medu, a uspevaju da prežive na korišćenim supstratima i opremi. U ovim slučajevima

alkoholna fermentacija je dosta nepredvidljiva i često je medovina na kraju fermentacije

kontaminirana kvascima i bakterijama, pa se ne može konzumirati. U poslednje vreme koriste se

selekcionisani sojevi kvasaca izolovani iz meda/medovine ili komercijalne starter kulture kvasaca

kako bi se smanjio rizik od kontaminacije (Mendes-Ferreira et al., 2010). Izbor vrste kvasca za

fermentaciju je veoma važan aspekt, s obzirom da utiče na ukus i druge parametre kvaliteta

medovine. Medovina sadrži brojne nutritivne elemente koji su neophodni organizmu i ima

povoljne efekte na varenje i metabolizam. Korišćenje medovine daje rezultate pri lečenju anemije i

hroničnih bolesti gastrointestinalnog trakta (Gupta i Sharma, 2009).

Slika 1. Medovina

4

1.2. Kvasci

Alkoholna fermentacija ili kako se često naziva alkoholno vrenje biohemijski je proces

transformacije monosaharida (glukoza, fruktoza) u alkohol i ugljen-dioksid posredstvom kvasaca,

uz učešće celog niza enzima (Fleet, 2003). Mnoga istraživanja pokazala su dasu vrste rodova

Kloeckera, Metschnikowia, Candida, Hanseniaspora, Rhodotorula, Pichia, Schizosaccharomyces,

Kluyveromyces, Hansenula, Saccharomyces, Zygosaccharomyces i Debaryomyces predominantne

u inicijalnoj fazi spontane fermentacije. Kvasci koji pripadaju rodovima Saccharomyces i

Kluyveromyces mogu izvesti fermentaciju do kraja. Kvasci koji ne pripadaju rodu Saccharomyces

generalno rastu tokom prve faze fermentacije, kada koncentracija etanola raste, etanol-tolerantniji

kvasci roda Saccharomyces završavaju fermentaciju.

Rani rast kvasaca u širi smanjuje ili lišava vino nutritijenata, čineći ga manje poželjnim

okruženjem za dalji rast mikroorganizama. S druge strane, takav rast stvara niz metabolita, neki od

njih mogu biti toksični za druge vrste kvasaca. Inhibitorno dejstvo etanola i kratkih masnih kiselina

na neke mikroorganizme dobro je izučeno (Urso et al., 2008).

1.3. Mikroorganizmi kvarenja vina

Veza između mikroorganizama i fermentacije alkoholnih napitaka datira još iz Biblijskih

vremena. Prvo zapažanje mikroba u fermentisanom vinu omogućio je Antoni van Levenhuk

razvojem mikroskopa sredinom 17. veka, a mikrobiologija vina je objašnjena sredinom 19. veka

kada je Luj Paster primetio da kvasci pretvaraju sok od grožđa u vino. Osim toga, primetio je da

pojedine bakterije koje utiču na kvarenje vina, mogu rasti u medijumu.

Mikroorganizmi su sama srž procesa proizvodnje vina. Bilo da su poželjni ili ne, oni utiču

na kvalitet vina i ekonomsko stanje industrije vina. Proces proizvodnje vina je kompleks ekoloških

niša gde biohemija i interakcija kvasaca, bakterija, gljiva i njihovih virusa igraju ključnu ulogu u

finalnom proizvodu. Zbog toga je od krucijalne važnosti razumevanje uslova pod kojim određeni

mikroorganizmi mogu izazvati kvarenje odnosno produkovati nepoželjne ukuse, arome i boje. Sa

takvim informacijama moguće je izboriti se sa kvarenjem vina i razviti nove metode prevencije.

5

1.3.1. Kvarenje kvascima

Samo dvanaest od svih rodova kvasaca povezano je sa grožđem i vinima, ukazujući na

stepen specijalizacije koji je neophodan da bi se preživeli nepovoljni uslovi u vinu. Termin vinski

kvasci se odnosi na kvasce iz roda Saccharomyces koji mogu izvršiti potpunu fermentaciju sire bez

proizvodnje neželjenih ukusa. Ovi kvasci su tolerantni na visoke koncentracije etanola i šećera.

Termin divlji kvasci se odnosi na kvasce koji ne pripadaju rodu Saccharomyces, a koji mogu

izvesti parcijalnu alkoholnu fermentaciju, često proizvodeći estre. Obe vrste kvasaca mogu uticati

na kvarenje.

Refermentacija. Saccharomyces može uticati na kvarenje vina ukoliko se u pogrešno

vreme nađe na pogrešnom mestu (npr. u boci poluslatkog vina) izazivajući refermentaciju.

Saccharomyces ludwigii, pronađena u bocama vina, često se označava kao noćna mora

vinara. Ova vrsta kvasca je visoko tolerantna na etanol i otporna na SO2 i sorbat.

Shizosacchamyces pombe izaziva kvarenje vina kada započne rast u flaši i formira talog na

dnu. Kvasac Zygosaccharomyces bailii jedan je od najznačajnijih uzročnika kvarenja,

refermentišući sok ili vino tokom skladištenja.

Formiranje estra. Hansenula anomala (po novoj klasifikaciji Pichia anomala), Kloeckera

apiculata i Hanseniaspora uvarum uglavnom se vezuju za kvarenje vina estrima, što je

povezano sa velikim količinama sirćetne kiseline. Estri se mogu povezati i sa prisustvom

etil acetata i metilbutil acetata koji daju karakterističan ukus pokvarenim vinima. Rast

Zygosaccharomyces bailii, takođe može dovesti do povećanja koncentracije sirćetne i

ćilibarne kiseline u vinima, a smanjenja L-jabučne kiseline i opštem smanjenju pH i

izmenjenoj koncentraciji estara.

Hidrogen sulfat i isparljiva sumporna jedinjenja. Sposobnost kvasaca da proizvode H2S,

varira između različitih sojeva i zavisi od uslova sredine u kojoj se nalaze, npr. sadržaj šire

(čvrste materije, vitamini i slobodan amino nitrogen), temperatura fermentacije, pH vina i

upotreba fungicida sa elementarnim sumporom.

6

Isparljive kiseline. Visoke koncentracije isparljivih kiselina posledica su rasta vinskih

kvasaca, divljih kvasaca i bakterija sirćetne kiseline. Sirćetna kiselina formira se kao nus-

produkt kvasaca tokom ranih faza alkoholne fermentacije. Saccharomyces sojevi pokazuju

variranja u produkciji acetata, a ovaj fenomen zavisi od temperature fermentacije, pH,

sadržaja sirovine (koncentracije šećera i azota), koncentracije acetil-CoA sintetaze i

prisustva drugih mikroorganizama. Kvasci uključeni u preveliku acetifikaciju vina

uključuju vrste iz rodova Brettanomyces, Dekkera, kao i vrste Pichia anomala, Kloeckera

apiculata i Candida krusei.

Formiranje filma. Neke vrste rodova Candida, Metschnikowia i Pichia mogu formirati

film na površini vina. Razvoj ovih kvasaca zavisi od prisustva kiseonika, tako da do

njihovog rasta dolazi ukoliko je vino izloženo vazduhu i polupraznim buradima. Finalni

produkti, sirćetna kiselina, acetalaldehid i estri acetata nastaju od etanola.

Deacidifikacija. Kiselost vina je značajna osobina jer direktno utiče na ukus, a indirektno

na pH, boju, stabilnost i kvalitet vina. Deacidifikacija može nastati konverzijom jabučne

kiseline u mlečnu kiselinu i ugljen dioksid. Ovaj proces se naziva malolaktičkom

fermentacijom, a izvode je bakterije mlečne kiseline, pre svega Oenococcus oeni.

Saccharomyces cerevisiae slabije koristi jabučnu kiselinu, za razliku od vrsta rodova

Candida, Hansenula, Kloeckera i Pichia, dok u najvećoj meri to rade kvasci koji pripadaju

vrstama Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans i

Zygosaccharomyces bailii.

7

1.3.2. Kvarenje bakterijama mlečne kiseline

Bakterije mlečne kiseline (BMK) igraju ključnu ulogu u sekundarnoj fermentaciji vina

izvodeći malolaktičku fermentaciju, ali mogu uticati negativno na kvalitet vina ako se razviju u

pogrešnoj fazi proizvodnje vina.

Rodovi koji se povezuju sa vinima su Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus i

Pediococcus. Neke vrste ovih rodova izolovane su iz vina i povezuju se sa kvarenjem.

Spoljašnji uslovi određuju prirodne populacije BMK i sukcesije vrsta i sojeva, pre, tokom i

posle alkoholne fermentacije. BMK su tolerantne na stresne faktore u vinu; adaptirane su na nizak

pH, prisustvo alkohola, SO2, niske temperature i ograničene nutritijente. Tokom alkoholne

fermentacije, one ne povećavaju svoj broj zbog interakcije sa kvascima i njihovih masnih kiselina,

prisustva povećane koncentracije etanola i bakteriocina koje proizvode određene BMK. Nakon

alkoholne fermentacije, ovi oportunisti se mogu razviti i uticati na kvalitet vina, čak i štetno.

Kiseline. BMK mogu povećati koncentraciju kiselina u vinu proizvodeći mlečnu i sirćetnu

kiselinu. D-mlečna kiselina se vezuje za kvarenje vina, a L-mlečna kiselina je proizvod

malolaktičke fermentacije. Homofermentativni laktobacili i pedikoke formiraju D-mlečnu

kiselinu redukcijom piruvata. Heterofermetativni laktobacili, Leuconostoc spp. i

Oenococcus spp. proizvode D-mlečnu kiselinu i sirćetnu kiselinu preko 6-

fosfoglukonatskog puta. Osim organoleptičkog uticaja, sirćetna kiselina može usporiti ili

zaustaviti fermentaciju. Ostale organske kiseline, pre svega limunska, vinska i sorbinska

koje su proizvodi metabolizma određenih BMK, utiču na kvalitet vina. Najznačajniji

metabolit razgradnje limunske kiseline je diacetil, zbog čega vina imaju aromu mlečnih

proizvoda. Količina diacetila koju proizvode malolaktičke starter kulture relativno su male

u odnosu na produkte laktobacila i pediokoka koje rastu u vinu nakon malolaktičke

fermentacije. Sorbinsku kiselinu produkuju vrste iz roda Oenococcus, a nije zabeležena

sinteza ove kiseline kod laktobacila i pediokoka. Vina podložna razgradnji vinske kiseline

su ozbiljno pokvarena, a za to su odgovorni sojevi vrsta Lactobacillus plantarum i

Lactobacillus brevis.

Refermentacija poznata i kao malolaktička fermentacija na pogrešnom mestu, može se

desiti u flaširanom vinu na pH>3,5 u prisustvu BMK i nutritijenata (malat ili rezidualni

8

šećeri) koji pospešuju rast. Nakon sekundarnog rasta BMK, vino je deacidifikovano, a pH

raste iznad 3,5.

Manitol. Manitol produkuju heterofermentativni laktobacili redukcijom fruktoze ili

fruktozo-6-fosfata. Sam manitol nije štetan već problem predstavlja prateća proizvodnja

sirćetne kiseline, D-mlečne kiseline, propanola, butanola i diacetila.

Viskoznost je posledica prisustva ekstracelularnih polisaharida, pre svega D-glukana, a

mikroorganizmi odgovorni za njih pripadaju rodovima Leuconostoc i Pediococcus.

Akrolein nastaje prilikom bakterijske razgradnje glicerola i sam po sebi nije štetan.

Međutim, reakcijom sa fenolnim grupama antocijanina daje vinima nepoželjnu gorčinu.

Akrolein formiraju vrste rodova Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus i Pediococcus.

Metabolizam arginina. Pojedine BMK iz vina mogu metabolisati agrinin, one uključuju

sojeve vrsteOenococcus oeni i heterofermentativne BMK (npr. Lactobacillus brevis,

Lactobacillus buchneri, Lactobacillus hilgardii). Katabolizam arginina daje prekursore etil

karbamata, poznatog humanog i životinjskog kancerogena.

1.3.3. Kvarenje bakterijama sirćetne kiseline

Bakterije sirćetne kiseline pripadaju porodici Acetobacteraceae. One su gram-negativni,

aerobni, katalaza-pozivtivni mikroorganizmi, a korišćenjem glukoze daju sirćetnu kiselinu.

Rodovi Acetobacter i Gluconobacter značajni su za industriju vina. Mogu oksidovati etanol

do sirćetne kiseline (acetifikacija), dok acetobakterije mogu oksidovati sirćetnu i mlečnu kiselinu

do CO2i H2O u Krebsovom ciklusu. Rodu Gluconobacter pripadaju tri vrste, Gluconobacter asaii,

Gluconobacter frateurii i Gluconobacter oxydans, od kojih je Gluconobacter oxydans važna u

vinarstvu. Rod Acetobacter čine sedam vrsta, a četiri su značajne za vinarstvo: Acetobacter aceti,

Acetobacter hansenii, Acetobaceter liquefaciens i Acetobacter pasteurianus.

9

Isparljive kiseline. Sirćetna kiselina je značajna komponenta vina povezana sa isparljivim

kiselinama. Osim toga, moža izmeniti strukturu drugih jedinjenja u vinu.

Dihidroksiaceton. Glicerol, poreklom od kvasaca i plesni, A. aceti i G. oxydans koriste kao

izvor ugljenika. Ove dve vrste mogu konvertovati glicerol u dihidroksiaceton pod aerobnim

uslovima. Dihidroksiaceton utiče na senzorne karakteristike vina, čineći ih

slatkim/eteričnim. Dihidroksiaceton može uticati i na antimikrobna svojstva vina, s

obzirom da ima sposobnost vezivanja SO2.

Acetaldehid. Vina sa velikim brojem bakterija sirćetne kiseline sadrže značajne

koncentracije acetaldehida, intermedijalne metabolite u produkciji sirćetne kiseline od

etanola u uslovima sa smanjenim sadržajem kiseonika. Ovakva vina imaju izmenjena

organoleptička svojstva. Acetaldehid vezuje SO2 i utiče na antimikrobno delovanje SO2.

Acetoin. Sojevi iz rodova Acetobacter i Gluconobacter mogu oksidovati mlečnu kiselinu

do acetoina u uslovima niske koncentracije kiselina. Osim što utiče na senzorne

karakteristike, acetoin vezuje SO2 i smanjuje antimikrobno dejsto.

1.3.4. Kvarenje endosporulišućim bakterijama

Zabeleženi su i retki slučajevi mikrobiološkog kvarenja vina vrstama iz rodova Bacillus i

Clostridium. Rod Bacillus čine aerobne, gram-pozitivne, katalaza-negativne, endosporulišuće,

štapićaste bakterije. Bakterije roda Clostridium su gram-pozitivni, obligatno anaerobni,

endosporulišući štapići.

1.3.5. Kvarenje plesnima

Ukoliko rast filamentoznih gljiva (plesni) nije pod kontrolom, može imati katastrofalne

posledice po kvalitet vina. Zabeleženo je da vrste plesni iz rodova Alternaria, Aspergillus, Botrytis,

Cladosporium, Mucor, Oidium, Penicillium, Plasmopara, Rhizopus i Uncinula mogu ugroziti

kvalitet vina. Plesni mogu produkovati i mikotoksine koji mogu biti kancerogeni. Njih produkuju

vrste iz dva roda Aspergillus i Penicillium.

10

1.3.6. Kontaminacija pampura

Mikrobiološka kontaminacija pampura može delovati na kvalitet vina produkovanjem

nepoželjnih aroma; pampure kao supstrat koriste mikroorganizmi, izlučujući metabolite u finalni

proizvod. Rodovi gljiva koji mogu napasti pampure su Aspergillus, Cladosporium, Monilia,

Paecilomyces, Penicillium i Trichoderma. Rodovi kvasaca su Candida, Cryptococcus,

Rhodotorula, Saccharomyces i Sporodiobolus, a bakterija Bacillus, Micrococcus, Streptococcus i

Streptomyces (Toit and Pretorius, 2000).

11

1.4. Prevencija kvarenja vina

Konzervansi su jedinjenja koja usporavaju ili u idealnom slučaju sprečavaju mikrobiološko

kvarenje hrane. Mikrobiološki kontaminirana hrana je rezultat rasta kvasaca, plesni i bakterija, ali i

stvaranja toksina, pogotovo onih koje proizvode bakterije i plesni (Bakočević, 2011).

Med. Antimikrobni efekat meda zasniva se na delovanju više supstanci iz meda i zavisi od

njegovog botaničkog porekla. Med inhibira rast bakterija i gljiva i može da ima

mikrobicidno ili mikrobiostatičko delovanje. Zabeleženo je bakteriostatičko, kao i

baktericidno dejstvo meda na brojne sojeve bakterija, od kojih su mnogi patogeni.

Antimikrobna aktivnost meda je posledica male količine vode u medu, niske pH vrednosti

meda kao i prisustva enzima i drugih hemijskih jedinjenja. Druga osobina meda koja

doprinosi njegovoj antimikrobnoj aktivnosti je niska pH vrednost (3,2 do 4,5) pri kojoj se

većini mikroorganizama zaustavlja rast. Dejstvom enzima glukozne oksidaze nastaje

vodonik peroksid, jedinjenje koje ima najveću ulogu u antimikrobnom dejstvu meda

(Molan i Zealand, 1997).

Šećer. Najstarije civilizacije koristile su šećer kao konzervans, skladištenjem hrane u

šećeru ili medu (Nummer, 2002). Visoka koncentracija šećera prirodni je konzervans protiv

mikroorganizama koji mogu prouzrokovati kvarenje hrane. Kada se šećer doda hrani,

vezuje vodu i na taj način je čini nedostupnom za mikrooganizme. Slično slanoj vodi,

menja osmotski pritisak, npr. kada se ćelija stavi u koncentrisaniji rastvor šećera, voda

izlazi iz ćelija mikrooorganizama i oni više ne mogu opstati u toj sredini. Drugi

antibimikrobni mehanizam soli i šećera uključuje ometanje enzimske aktivnosti

mikroorganizama i slabljenje molekularne strukture njihove DNK. Šećer takođe

omogućava posredan način konzervacije ubrzavajući akumulaciju antimikrobnih jedinjenja

određenih mikroorganizama. U prilog tome ide primer pretvaranja šećera u etanol od strane

kvasaca ili u organske kiseline od strane bakterija mlečne kiseline (Mason, 2013).

Alkohol. Ćelijska membrana omogućava toleranciju i zaštitu ćeliji od različitih stresova iz

spoljašnje sredine. Etanol je posebno poznat po svojoj sposobnosti da fluidizuje membranu,

rezultujući nekontrolisanim transportom rastvorenih supstanci koje mogu smanjiti fluks

12

protona kroz membranu i izazvati izlivanje važnih kofaktora, kao što je Mg. Etanol takođe

može inaktivisati membranske i citosolne enzime, npr. ATPaze i glikolitičke enzime,

onemogućavajući rast. Stoga se predpostavlja da je izmenjena ćelijska membrana

odgovorna za smanjenu stopu rasta i ćelijske vijabilnosti kada je mikroorganizam izložen

alkoholu (Huffer et al., 2011).

Sulfiti i sumpor dioksid. Sumpor-dioksid i njegovi derivati dugo se koriste u

konzerviranju namirnica. Dodaju se hrani u svrhu inhibicije i kontrole rasta

mikroorganizama, sprečavanja neenzimskog posmeđivanja, inhibicije reakcija

katalizovanih enzima, kao antioksidanti. Kalijum metabisulfit (“vinobran”) je najčešće

korišćeni oblik sumpornih jedinjenja, posebno u manjim podrumima. Kao produkt tokom

njegovog rastvaranja u vodi nastaju tri jedinjenja: sumpor-dioksid, bisulfit i sulfit. Svako

od njih vezuje slobodni kiseonik iz vina. Takav kiseonik mikroorganizmi ne mogu koristiti

zbog čega ne mogu opstati. Sumpor-dioksid (SO2) i njegovi derivati metabolišu se do

sulfata i izlučuju u urin bez vidljivih patoloških efekata.

Benzoeva kiselina. Benzoeva kiselina (C6H5COOH) ima široku primenu kao

antimikrobno sredstvo u hrani, a prirodno je prisutna u brusnicama, šljivama, cimetu i

klinčiću. Natrijum benzoat se bolje rastvara u vodi od same kiseline i češće se koristi. U

proizvodu jedan deo soli prelazi u aktivni kiseli oblik, koji je najdelotvorniji protiv

kvasaca i bakterija. Manje je delotvoran na plesni. Mehanizam delovanja počinje

apsorpcijom bezoeve kiseline. Ako intracelularni pH padne ispod 5, dolazi do smanjenja

anaerobne fermentacije glukoze i inhibicije rasta i preživljavanja mikroorganizama koji

mogu prouzrokovati kvarenje hrane. Brzo se izlučuje iz tela prvenstveno nakon

konjugacije sa glicinom dajući hipurinsku kiselinu (benzoil glicin). Ovaj korak

detoksikacije sprečava akumulaciju benzoeve kiseline u telu (Jašić, 2009).

Propolis. Primena prirodnih jedinjenja sa antimikrobnim svojstvima može pružiti

alternativu hemijskim konzervansima. Propolis, prirodni proizvod od meda, ima različite

biološke aktivnosti. Alkoholni ekstrakt propolisa, forma koja se najčešće koristi, ima

veoma komplikovanu strukturu. Sadrži više od 160 jedinjenja, koji se razlikuju u

13

zavisnosti od geografskog i botaničkog porekla (Mirzoevaet al., 1997). Flavonoidi su

dobro poznati po svom antibakterijskom, antifungalnom i antiviralnom delovanju i veruje

se da su odgovorni za delotvornost propolisa. Estri fenolnih kiselina, a posebno kafeati i

ferulati takođe doprinose antibakterijskom, antifungalnom i antiviralnom delovanju

propolisa (Kujumgieva et al., 1999).

14

2. Ciljevi rada

Fermentacijom meda nastaje alkoholni napitak sličan vinu koji se naziva medovina. S

obzirom na veliku količinu šećera u početnom supstratu, deo šećera ostaje nefermentisan u

finalnom proizvodu zbog čega je medovina dobar supstrat za rast različitih mikroorganizama

koji mogu izazvati kvarenje. Zato su ciljevi ovog rada bili:

Određivanje minimalnih inhibitornih koncentracija propolisa, kalijum metabisulfita i

natrijum benzoat na mikroorganizme prisutne u različitim vrstama medovine;

Ispitivanje uticaja propolisa, kalijum metabisulfita i natrijum benzoata na rast

mikroorganizama u različitim vrstama medovine.

15

3. Materijal i metode

3.1. Materijal

3.1.1. Uzorci medovine

U ovom radu korišćeno je 8 uzoraka medovine koji su pravljeni po recepturama prikazanim

u Tabeli 1. Kao starter kulture korišćeni su sojevi Saccharomyces cerevisiae Lalvin ICV K1-1116

i pekarski "C" kvasac.

Šira za dobijanje medovine napravljena je tako što je medu postepeno dodavana voda sobne

temperature uz intenzivno mešanje kako bi se med u potpunosti rastvorio. Male količine šire

dodavane su rehidriranim kvascima, kako bi se izbegao temperaturni šok koji može ugroziti proces

fermentacije. Zatim su postepeno dodavani suplementi kako bi se dobio manji broj vijabilnih ćelija,

tolerantnijih na povišenu koncentraciju etanola i veća količina proteina. Šira je mešana nekoliko

puta dnevno u toku prvih osam dana fermentacije kako bi se oslobodio ugljen-dioksid koji je

toksičan za kvasce, a i može usporiti fermentaciju. Inicijalna fermentacija odvijala se u plastičnoj

kaci sa poklopcem, a kada se smanjio stepen fermentacije, šira je prebačena u balon sa spiralnom

vrenjačom kako ne bi došlo do oksigenacije. Nakon završetka procesa fermentacije, medovina

počinje da se bistri, a ćelije kvasca da flokulišu. Drugi način za određivanje kraja fermentacije jeste

merenje specifične težine uzorka u razmaku od nekoliko dana.

U prvom delu eksperimentapo 50 ml svakog uzorka (L1, L2, L3, L4 i L5) sipano je u

plastične flakone koji su centrifugirani na 4000 g 10 minuta centrifugom „Hettich Univerasal 32

R“. Zatim je supernatan presipan u nove flakone, u koje su dodati konzervansi (propolis i kalijum

metabisulfit u koncentraciji MIK vrednosti), dok u jedan od flakona nisu dodati konzervansi

(kontrola). Uzorci su čuvani u aerobnim uslovima na sobnoj temperaturi. Analize uzoraka rađene

su prvih mesec dana na 4 dana, a naredna tri meseca na 15 dana.

Uzorci L6, K1 i K2 nisu centrifugirani već su samo tretirani konzervansima (propolisom,

kalijum metabisulfitom i natrijum benzoatom u koncentraciji MIK vrednosti), dok kontrolni uzorak

nije tretiran. Na samom početku eksperimenta izmeren je sadržaj šećera širometrom. Po 30 ml

16

svakog uzorka naliveno je u plastične flakone, zatim je dodato po 3 gr šećera i određene količine

konzervanasa. Flakoni su čuvani na sobnoj temperaturi u aerobnim uslovima, a uzorci su

analizirani na 4 dana.

Tabela 1. Recepti medovina

Uzorak Vrsta meda Dodato voće Suplemeti Voda Soj kvasca Trajanje

Fermentac

ije

L1 Livadski

(0.3 kg)

/ Fermaid E

(0.48 gr)

0.6 l Lalvin ICV

K1-1116

(0.24 gr)

25 dana

L2 Livadski

(0.3 kg)

/ Polen

(7.39 gr)

0.6 l Lalvin ICV

K1-1116

(0.22 gr)

17 dana

L3 Livadski

(0.3 kg)

Malina

(87 gr)

Fermaid E

(0.15 gr)

Amonijum

sulfat (0.04 gr)

0.6 l Lalvin ICV

K1-1116

(0.22 gr)

13 dana

L4 Livadski

(0.3 kg)

Malina

(287 gr)

Polen (7.39 gr) 0.4 l Lalvin ICV

K1-1116

(0.22 gr)

17 dana

L5 Livadski

(1.5 kg)

Narandža bez

kore (1), suvo

grožđe (25

zrna), štap

cimeta (1),

kafanfilić (1),

muškatni

oraščić

/ 0.6 l Pekarski "C"

kvasac (7 gr)

11 dana

L6 Livadski

(1.5 kg)

Višnja

(225 gr)

Fermaid E

(1 gr)

1.6 l Lalvin ICV

K1-1116

(2 gr)

18 dana

K1 Kupinov

(6 kg)

/ Fermaid E

(5 gr)

15.3 l Lalvin ICV

K1-1116

(10 gr)

14 dana

K2 Kupinov

(6 kg)

Kupina

(600 gr)

Fermaid E

(5 gr)

15.3 l Lalvin ICV

K1-1116

(10 gr)

14 dana

17

3.1.2. Konzervansi

Za ispitivanje prevencije kvarenja vina korišćeni su natrijum benzoat („konzervans“, „C“

proizvođač), kalijum metabisulfit („vinobran“, „C“ proizvođač) i ekstrakt propolisa (dobijen je

rastvaranjem 30 gr propolisa u 100 ml domaće rakije).

18

3.2. Metode

3.2.1. Mikrodiluciona metoda

Mikrodilucionom metodom određuju se minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)

antimikrobnog agensa. MIK predstavlja onu koncentraciju neke supstance koja zaustavlja vidljiv

rast mikroorganizma nakon inkubacije. Ova metoda primenjena je u oba seta eksperimenata.

U uzorcima L1, L2, L3, L4 i L5 određivana jeMIK vrednost propolisa i kalijum

metabisulfita u mikrotitar ploči. U bunarčiće prvog reda naliveno je 200 µl prethodno

pripremljenog fiziološkog rastvora (0.9% m/V) sa određenim koncentracijama konzervansa, a u

sve ostale po 100 µl bujona. Zatim je u sve bunarčiće naliveno po 100 µl uzoraka medovine. Iz

svakog reda uzeto je po 100 µl i prebačeno u sledeći, tako da je rastvor deset puta razblaženiji u

svakom narednom. Iz svakog bunarića prebačeno je po 10 µl nahranljivi i Sabouraud dekstrozni

agar (Torlak, Srbija). Nakon toga su zasejane ploče inkubirane 24-48 sati na 37 °C.

Za uzorke L6, K1 i K2, osim propolisa i kalijum metabisulfita, određene su minimalne

inhibitorne koncentracije i za natrijum benzoat. Metoda je odrađena na isti način kao i za prethodne

uzorke. Aerobne bakterije inkubirane su na hranljivom agru, anaerobne u top agru (0.7%) 24 sati

na 37 oC, a kvasci na Sabouraud dekstroznom agru 48 sati na 37

oC.

3.2.2. Metoda indirektnog brojanja mikroorganizama

Kako bi se odredilo da li dodati konzervansi inhibiraju rast mikroorganizama u ispitivanim

uzorcima, rađeno je određivanje broja ćelija različitih mikroorganizama u određenom vremenskom

periodu. U prvom setu eksperimenta brojanje je rađeno prvo na 4, a zatim na 15 dana, a u drugom

setu na 4 dana. Početno razblaženje dobijeno je prebacivanjem 1 ml uzorka medovine u epruvetu sa

9 ml fiziološkog rastvora, a zatim je iz prvog razblaženja prebačen 1 ml u drugu epruvetu sa 9 ml

fiziološkog rastvora što predstavlja drugo razređenje. Po 1 ml se dalje prebacivao u naredne

epruvete kako bi se dobio što manji broj ćelija (Slika 2). Iz razblaženih uzoraka uzeto je po 10 µl i

prebačeno na Petri ploče sa pripremljenim podlogama. Za rast bakterija u aerobnim i anaerobnim

uslovima korišćen je hranljivi agar, a za rast gljiva Sabouraud dekstrozni agar. Za ispitivanje

anaerobnih bakterija hranljivi agar preliven je top agrom (0.7%). Zasejane podloge su inkubirane

19

na 37 oC i nakon inkubacije (24 sati za bakterije, a 48 sati za kvasce) brojane su kolonije na Petri

šoljama.

Broj mikroorganizama u 1 ml uzorka dobija se množenjem broja izraslih kolonija sa

razblaženjem i faktorom korekcije do 1 ml.

Stepen preživljavanja (%) dobijen je deljenjem broja kolonija na određenom razređenju

uzorka sa brojem kolonija na istom razređenju kontrole i množenjem sa 100.

Slika 2. Metoda indirektnog brojanja ćelija

20

3.2.3. Određivanje rezidualnih šećera u uzorcima Benediktovim testom

Benediktov test se koristi za određivanje koncentracije redukovanih šećera (mohosaharida i

nekih disaharida) koji imaju slobodne ketonske ili aldehidne funkcionalne grupe. Neki šećeri poput

glukoze nazivaju se redukovanim jer mogu predati vodonike (elektrone) drugim jedinjenjima u

procesu redukcije. Kada se redukovani šećeri pomešaju sa Benediktovim reagensom i zagrevaju,

dolazi do promene boje usled redukcije jona bakra (Aryal, 2015).

Litar Benediktovog reagensa dobija se mešanjem 100 gr natrijum karbonata, 173 gr

natrijum citrata i 17.3 gr bakar sulfata. Za ovu metodu iskorišćeni su uzorci L6, K1 i K2 u koje su

dodati konzervansi (propolis, natrijum benzoat i kalijum metabisulfit) i uzorci bez konzervansa. U

pripremljene epruvete prebačeno je po 1 ml uzorka i 2 ml reagensa. Epruvete su zatim zagrevane

3-5 minuta u ključalom vodenom kupatilu uz praćenje promene boje. Benediktov reagens je plave

boje, a promena zavisi od koncentracije šećera (Slika 3).

Slika 3. Mogući rezultati Benediktovog testa

21

4. Rezultati i diskusija

4.1. Prvi set eksperimenata

Kvalitet hrane smanjuje se tokom vremena od proizvodnje do konzumiranja. Gubitak

kvaliteta može biti rezultat mikrobioloških, enzimskih, hemijskih i fizičkih promena. Posledice

mikrobioloških promena uključuju opasnost po potrošače usled prisustva mikrobijalnih toksina ili

patogenih mikroorganizama ili dovode do ekonomskih gubitaka zbog nastanka nepoželjnih aroma i

mirisa, tekstura, boja i zamućenja. Konzervansi su hemikalije koje su prisutne u hrani ili se dodaju

kako bi se sprečio rast mikroorganizama. Većina prezervativa ima bakteriostatičko ili fungistatičko

dejstvo pri primenjenim koncentracijama, a ne bakteriocidno i fungicidno. Zbog toga dejstvo

konzervanasa ima ograničeni rok trajanja (Davidson i Taylor, 2007).

Centrifugiranje je tehnika kojom se razdvaja čvrsta od tečne faze. Centrifuge male brzine

(RCF do 6 000 g) rutinski se upotrebljavaju u laboratoriji za taloženje: ćelija, organela i precipitata.

Ova tehnika se može primeniti kao alternativni vid prevencije kvarenja medovine u cilju

izbegavanja upotrebe hemijskih konzervanasa. Zato su uzorci medovine centrifugirani 10 minuta

na 4000 g i nakon toga čuvani su na sobnoj temperaturi (oko 20 oC).

Takođe, određena je MIK vrednost za delovanje propolisa i kalijum metabisulfita za sve

ispitivane uzorke (Slika 4 i Tabela 2). Minimalna inhibitorna koncentracija dobijena je

mikrodilucionom metodom u mikrotitar ploči. Zasejavanja su rađena u Petri pločama sa hranljivim

i Saubouraud dekstroznim agrom. Ustanovljeno je da su uzorci L3 i L5 osetljiviji na dejstvo

propolisa (4 µl/ml) i kalijum metabisulfita (0.1 mg/ml) u odnosu na ostale uzorke. Za uzorak L4

MIK kalijum metabisulfita je takođe 0.1 mg/ml, ali je zato MIK propolisa 8 µl/ml. MIK propolisa i

kalijum metabisulfita za ostale uzorke je 8 µl/ml i 0.25 mg/ml.

22

Table 2. MIK propolisa i kalijum metabisulfita

Propolis Kalijum metabisulfit

L1 8 µl/ml 0.25 mg/ml

L2 8 µl/ml 0.25 mg/ml

L3 4 µl/ml 0.1 mg/ml

L4 8 µl/ml 0.1 mg/ml

L5 4 µl/ml 0.1 mg/ml

U prethodno centrifugirane uzorke medovine stavljane su MIK vrednosti konzervanasa.

Broj aerobnih i anaerobnih bakterija i kvasaca određivan je u svim uzorcima medovine i

kontrolnim uzorcima bez konzervansa. Broj ćelija je određivan prvih mesec dana na 4 dana, a

narednih tri meseca na 15 dana. Rasta nije bilo ni u uzorcima medovine sa konzervansima, ni u

kontrolnim uzorcima.

Taloženje materija je standardna tehnika u vinarstvu s obzirom da je pretakanje jedan od

važnih koraka u tehnologiji dobijanja stabilnog vina, kojim se odstranjuju istaložene ćelije kvasaca,

proteinske materije, razne nečistoće i nepoželjni mikroorganizmi. S obzirom da ni u kontrolnom

uzorku nije došlo do rasta mikroorganizama, može se zaključiti da je obaranje ćelija

centrifugiranjem bilo dovoljno za prevenciju kvarenja.

Slika 4. Određivanje MIK propolisa i kalijum metabisulfita

23

4.2. Drugi set eksperimenata

4.2.1. Minimalna inhibitorna koncentracija

Minimalne inhibitorne koncentracije propolisa, natrijum benzoata i kalijum metabisulfita za

uzorke L6, K1 i K2 dobijene su mikrodilucionom metodom u mikrotitar ploči serijom razblaženja

(Slika 5). Za sva tri uzorka su dobijene iste MIK vrednosti, za propolis to je 0.1 µl/ml, za natrijum

benzoat 1 mgr/ml i za kalijum metabisulfit 0.25 mgr/ml (Tabela 3).

Tabela 3. MIK propolisa, natrijum bezoata i kalijum metabisulfita

Uzorci Propolis Natrijum benzoat Kalijum metabisulfit

L6 0.1 µl/ml 1 mgr/ml 0.25 mgr/ml

K1 0.1 µl/ml 1 mgr/ml 0.25 mgr/ml

K2 0.1 µl/ml 1 mgr/ml 0.25 gr/ml

4.2.2. Rast mikroorganizama u uzorcima

Smatra se da su mikroorganizmi uništeni onda kada se ne mogu razmnožavati, čak ni pošto

su prebačeni na odgovarajući medijum za razmnožavanje pod odgovarajućim uslovima okruženja.

Smrt se razlikuje od inaktiviranosti, posebno među bakterijama i gljivama koje imaju spore, pošto

inaktivirani mikroorganizmi nisu izgubili sposobnost da se razmnožavaju, što je dokazano

Slika 5. Određivanje vrednosti MIK u mikrotitar ploči

24

razmnožavanjem nakon produženog perioda inkubacije, prenošenjem u drugi medijum koji

pogoduje razvoju (Šumić, 2009). Preživljavanje ćelija pod dejstvom konzervanasa praćeno je

brojanjem kolonija nakon inkubiranja ćelija bakterija u aerobnim (Slika 6) i anaerobnim uslovima

na hranljivom i top agru 24 sati na 37 oC i kvasaca na Sabouraud dekstroznom agru (Slika 7) 48

sati na 37 oC.

U Tabeli 4 prikazani su rezultati za sve uzorke. Pozitivne rezultate u sprečavanju rasta

bakterija u uzorku L6 pokazali su kalijum metabisulfit i natrijum benzoat. Nakon dodavanja ovih

konzervanasa u potpunosti je zaustavljen rast bakterija (Slika 8). U L6 uzorku prilikom dodavanja

konzervanasa rast kvasaca je bio trenutno inhibiran, međutim nakon 16. dana došlo je do naglog

rasta ćelija. Natrijum benzoat pokazao se kao najučinkovitiji sa brojem ćelija od 1·102, kalijum

metabisulfit i propolis dali su slabije rezultate (8·102

i 4.5·103 ćelija), dok se u kontroli javio

najveći rast od 3.8·104ćelija. Broj ćelija bakterija i kvasaca varira u svim K1 uzorcima (Slika 9).

Rast kvasaca u najvećoj meri inhibirao je kalijum metabisulfit (4·102 ćelija) u odnosu na kontrolu

(3.3·104ćelija). U uzorku sa propolisom broj ćelija bio je 1.7·10

3, a sa natrijum benzoatom 5.5·10

2.

Natrijum benzoat je totalno zaustavio rast aerobnih i anaerobnih bakterija (Slika 8 i 9). Kalijum

metabisulfit pokazao je bolji inhibitorni učinak prema aerobnim (6·102

ćelija) i anaerobnim

bakterijama (5·102 ćelija) u odnosu na propolis (1.7·10

3 i 1.3·10

3 ćelija). U kontroli javio se rast

aerobnih bakterija od 4.8·104 ćelija, a anaerobnih od 4.3·10

4. U K2 uzorcima, natrijum benzoat i

kalijum metabisulfit imali su pozitivno antimikrobne delovanje prema ćelijama bakterija i kvasaca,

sprečavajući njihov rast (Slika 10). Broj ćelija u uzorku sa propolisom identičan je sa brojem ćelija

u kontroli, 1.8·105.

Slika 7. Rast ćelija kvasaca na SDA podlozi Slika 6. Rast ćelija bakterija na hranljivom agru

25

Table 4. Broj ćelija u uzorcima

SDA1 HA2 TA3

1.dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan 1.dan 4. dan 8. dan 12. dan

16.

dan 1.dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan

L6

kontrola 7·10

2 4.2·10

3 7.7·10

3 / 3.8·10

4 9.2·10

3 7.2·10

3 3·10

4 / / 1.7·10

3 3.3·10

3 3·10

4 1·10

2 /

L6

propolis 1·10

3 / / / 4.5·10

3 1·10

2 / / / / 1·10

2 / / / /

L6

KMS / / / / 8·10

2 / / / / / 1·10

2 / / / /

L6

NB / / / / 1·10

2 / / / / / 5.5·10

2 / / / /

K1

kontrola 1·10

4 2.7·10

3 1.1·10

4 6·10

2 3.3·10

4 7.15·10

3 5.3·10

3 9.6·10

3 4·10

2 4.8·10

4 5.2·10

3 1.5·10

3 2.8·10

4 4·10

2 4.3·10

4

K1

propolis 1.4·10

3 2·10

2 2·10

2 2·10

2 1.7·10

3 / 5.5·10

2 1·10

2 7·10

2 1.7·10

3 6·10

2 8·10

2 / 6·10

2 1.3·10

3

K1

KMS 6·10

2 / 5·10

2 1 ·10

3 4·10

2 1·10

2 3·10

2 2·10

2 3.5·10

3 6·10

2 3·10

2 5.5·10

2 / 4.7·10

3 5·10

2

K1 NB 3.4·103 / 1·10

2 1·10

2 5.5·10

2 2·10

2 1·10

2 1·10

2 / / 2.6·10

3 1·10

2 1·10

2 / /

K2

kontrola 6.5·10

2 2·10

2 3.2·10

3 5.7·10

3 1.8·10

5 1·10

2 2·10

2 3.2·10

3 2.5·10

4 1.8·10

5 4·10

2 / 2.3·10

4 2.5·10

4 1.8·10

5

K2

propolis 6·10

2 5.5·10

2 2.7·10

3 3.8·10

4 1.8·10

5 4·10

2 / 2.1·10

3 3.3·10

4 1.8·10

5 3·10

2 / / 3.3·10

4 1.8·10

5

K2

KMS 2·10

2 / / / / 2·10

2 / / / / 1·10

2 / / / /

K2

NB 5.5·10

2 / / / / 3.9·10

3 / / / / 1.8·10

3 / / / /

1Sabouraud dekstrozni agar

2Hranljivi agar

3Top agar

26

Hemijski konzervansi koriste se vekovima za sprečavanje mikrobiološkog kvarenja hrane

(Koç et al., 2007). Potpuno su bezbedni za upotrebu ukoliko se dodaju doze propisane zakonom.

Natrijum benzoat ima široku primenu u industriji hrane (Stanojevic et al., 2009). S obzirom da

količina nedisociranih kiselina opada sa porastom pH, benzoična kiselina i natrijum benzoat koriste

se kao konzervansi hrane sa nižim pH (Chipley, 2005). Kalijum metabisulfit se često naziva

stabilizatorom jer sprečava kvarenje i dalju fermentaciju uklanjanjem kiseonika (Winemaker's

Academy, 2013). Najefektivniji je kada je pH hrane niži od 4 (Davidson i Taylor, 2007). Dokazano

je da se propolis može koristiti za efikasno konzerviranje i čvste i tečne hrane (Yang et al., 2017).

Propolis ima značajniji uticaj na aktivne ćelije, manje koncentracije od letalne izazivaju trenutnu

inhibiciju deobe ćelija ali nakon lag faze, nastavlja se rast istom stopom kao u kontroli. Nastavak

rasta na nižim koncentracijama propolisa može se objasniti mehanizmima latentne detoksifikacije,

inaktivacije ili isključivanja, nastanka rezistentnih formi ili spontane detoksifikacije aktivnih

komponenti propolisa (Mirzoevaet al., 1997).

0

20

40

60

80

100

1. dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan

Propolis SDA 25 0 0 0 10

Kalijum metabisulfit SDA 0 0 0 0 2.4

Na benzoat SDA 0 0 0 0 0.3

Propolis HA 3 0 0 0 0

Kalijum metabisulfit HA 0 0 0 0 0

Na benzoat HA 0 0 0 0 0

Propolis TA 25 0 0 0 0

Kalijum metabisulfit TA 25 0 0 0 0

Na benzoat TA 25 0 0 0 0

Slika 8. Stepen preživljavanja (%) bakterija i kvasaca u uzorku L6

27

1. dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan

Propolis SDA 21.2 3.6 6 100 4.2

Kalijum metabisulfit SDA 6 0 15.2 100 1.2

Na benzoat SDA 24.2 0 3 50 0.3

Propolis HA 0 1.8 3 100 1.2

Kalijum metabisulfit HA 3 5.5 6 100 0.6

Na benzoat HA 6 1.8 3 0 0

Propolis TA 6 36.4 0 100 4.5

Kalijum metabisulfit TA 9 4.5 0 100 1.5

Na benzoat TA 66.6 4.5 0.3 0 0

0

20

40

60

80

100

Slika 9. Stepen preživljavanja (%) bakterija i kvasaca u uzorku K1

Slika 10. Stepen preživljavanja (%) bakterija i kvasaca u uzorku K2

1. dan 4. dan 8. dan 12. dan 16. dan

Propolis SDA 66.7 50 72.7 100 100

Kalijum metabisulfit SDA 66.7 0 0 0 0

Na benzoat SDA 33.3 0 0 0 0

Propolis HA 100 0 66.7 100 100

Kalijum metabisulfit HA 100 0 0 0 0

Na benzoat HA 100 0 0 0 0

Propolis TA 75 0 0 100 100

Kalijum metabisulfit TA 25 0 0 0 0

Na benzoat TA 100 0 0 0 0

0

20

40

60

80

100

28

4.2.3. Koncentracija rezidualnih šećera

Šećeri koji ne učestvuju u fermentaciji već ostaju u vinu, nazivaju se rezidualnim šećerima.

Sadržaj rezidualnih šećera, prvenstveno heksoza (glukoza, fruktoza) i pentoza (arabinoza, ksiloza)

važan je parametar jer se na osnovu njega može odrediti nivo alkohola u vinu, a ukazuje i na

progres procesa fermentacije. Efikasna kontrola rezidualnih šećera neophodna je radi izbegavanja

refermentacije koja može izmeniti fizičko-hemijska svojstva medovine. Na osnovu koncentracije

ovih šećera vrši se klasifikacija vina na suva i slatka (Fernández-novales et al., 2009). Benediktov

test je standardna tehnika koja se koristi za određivanje rezidualnih šećera na osnovu promene boje

reagensa. Koncentracija šećera u uzorcima merena je širometrom pre dodavanja konzervanasa i

iznosi približno 4 brix-a (40.6 gr/l). Kontrolna epruveta, u koju je umesto uzorka sipana

destilovana voda, nije promenila bolju (ostala je plava), a sve ostale poprimile su narandžastu boju

(Slika 11, 12, 13 i 14). Iz ovog sledi da je koncentracija rezidualnih šećera u svim uzorcima u

rasponu od 15 gr/l do 20 gr/l.

Slika 11. Rezultati Benediktovog testa sa L6, K1 i K2

uzorcima sa propolisom Slika 12. Rezultati Benediktovog testa sa L6, K1 i

K2 uzorcima sa kalijum metabisulfitom

29

Slika 14. Rezultati Benediktovog testa sa L6, K1 i K2

kontrolnim uzorcima

Slika 13. Rezultati Benediktovog testa saL6, K1 i

K2 uzorcima sa natrijum benzoatom

30

5. Zaključak

Na osnovu ovog istraživanja mogu se doneti sledeći zaključci:

Metoda centrifugiranja može se koristiti kao vid konzervacije medovine.

Natrijum benzoat je u potpunosti zaustavio rast svih bakterija u svim uzorcima.

Kalijum metabisulfit je u većini uzoraka zaustavio rast bakterija.

Natrijum benzoat je pokazao najbolje inhibitorno delovanje na kvasce.

Korišćene koncentracije propolisa su pokazale značajnu antimikrobnu aktivnost samo u

medovini napravljenoj od livadskog meda.

31

6. Literatura

Academy, W. (2013) Using Potassium Metabisulfite to Make Wine. Available at:

http://winemakersacademy.com/potassium-metabisulfite-wine/.

Aryal, S. (2015) Benedict’s Test- Principle, Composition, Preparation, Procedure and Result

Interpretation. Available at: https://microbiologyinfo.com/benedicts-test-principle-composition-

preparation-procedure-and-result-interpretation/.

Bakočević, I. (2011) Konzervansi, uvod i klasifikacija. Available at:

https://www.tehnologijahrane.com/enciklopedija/konzervansi-uvod-i-podela.

Bartowsky, E. J. (2009) ‘Bacterial spoilage of wine and approaches to minimize it’, Letters in

Applied Microbiology, 48(2), pp. 149–156. doi: 10.1111/j.1472-765X.2008.02505.x.

Chipley, J. (2005) ‘Sodium Benzoate and Benzoic Acid’, in Davidson, P. M., Sofos, J. N., and

Branen, A. L. (eds) Antimicrobials in Food. Third, pp. 11–49.

Davidson, P. M. and Taylor, T. M. (2007) ‘Chemical Preservatives and Natural Antimicrobial

Compounds’, in Doyle, M. and Beuchat, L. (eds) Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers.

Third. ASM Press, Washington, DC, pp. 713–745.

Fernández-novales, J. et al. (2009) ‘Shortwave-near infrared spectroscopy for determination of

reducing sugar content during grape ripening , winemaking , and aging of white and red wines’,

Food Research International. Elsevier Ltd, 42(2), pp. 285–291. doi: 10.1016/j.foodres.2008.11.008.

Fleet, G. H. (2003) ‘Yeast interactions and wine flavour’, 86, pp. 11–22. doi: 10.1016/S0168-

1605(03)00245-9.

Gupta, J. K. and Sharma, R. (2009) ‘Production technology and quality characteristics of mead and

fruit-honey wines: A review’, Indian Journal of Natural Products and Resources, 8(4), pp. 345–

355.

Huffer, S. et al. (2011) ‘Role of alcohols in growth, lipid composition, and membrane fluidity of

yeasts, bacteria, and archaea’, Applied and Environmental Microbiology, 77(18), pp. 6400–6408.

doi: 10.1128/AEM.00694-11.

Iglesias, A. et al. (2014) ‘Developments in the fermentation process and quality improvement

strategies for mead production’, Molecules, 19(8), pp. 12577–12590. doi:

10.3390/molecules190812577.

Jašić, M. (2009) Konzervansi | Tehnologija hrane. Available at:

https://www.tehnologijahrane.com/enciklopedija/konzervansi (Accessed: 11 October 2018).

Jolly, N. P., Augustyn, O. P. H. and Pretorius, I. S. (2017) ‘The Role and Use of Non-

Saccharomyces Yeasts in Wine Production’, South African Journal of Enology & Viticulture, 27(1),

pp. 15–39. doi: 10.21548/27-1-1475.

Kahoun, D., Řezková, S. and Královský, J. (2017) ‘Effect of heat treatment and storage conditions

on mead composition’, Food Chemistry, 219, pp. 357–363. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.09.161.

32

Koç, A. N. et al. (2007) ‘Antifungal activity of propolis in four different fruit juices’, Food

Technology and Biotechnology, 45(1), pp. 57–61.

Kujumgieva, A. et al. (1999) ‘Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different

geographic origin’, Journal of Ethnopharmacology, 64(3), pp. 235–240.

Mason, J. (2013) Food Preserving. ACS Distance Education.

Mendes-Ferreira, A. et al. (2010) ‘Optimization of honey-must preparation and alcoholic

fermentation by Saccharomyces cerevisiae for mead production’, International Journal of Food

Microbiology. Elsevier B.V., 144(1), pp. 193–198. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2010.09.016.

Mirzoeva, O. K., Grishanin, R. N. and Calder, P. C. (1997) ‘Antimicrobial action of propolis and

some of its components: The effects on growth, membrane potential and motility of bacteria’,

Microbiological Research. Gustav Fischer Verlag, 152(3), pp. 239–246. doi: 10.1016/S0944-

5013(97)80034-1.

Molan, P. C. and Zealand, N. (1997) ‘Honey as an antimicrobial agent’, pp. 27–37.

Nummer, B. A. (2002) Historical Origins of Food Preservation. The University of Georgia.

Piatz, S. (2014) The complete guide to making mead : the ingredients, equipment, processes, and

recipes for crafting honey wine. 978th-1st–6278th edn. Edited by D. Pernu. Voyageur Press.

Prescott, L., Harley, J. and Klein, D. (1993) Microbiology. Second. Edited by K. Kane. Wm. C.

Brown.

Sroka, P. and Tuszyński, T. (2007) ‘Changes in organic acid contents during mead wort

fermentation’, Food Chemistry, 104(3), pp. 1250–1257. doi: 10.1016/j.foodchem.2007.01.046.

Stanojevic, D. et al. (2009) ‘Antimicrobial effects of sodium benzoate, sodium nitrite and

potassium sorbate and their synergistic action in vitro’, Bulgarian Journal of Agricultural Science

Agricultural Academy, 15(4), pp. 307–311.

Šumić, Z. (2009) Sprečavanje rasta mikroorganizama. Available at:

https://www.tehnologijahrane.com/enciklopedija/sprecavanje-rasta-mikroorganizama.

Terefe, N. S. (2016) Food Fermentation, Reference Module in Food Science. Elsevier. doi:

10.1016/B978-0-08-100596-5.03420-X.

Toit, M. and Pretorius, I. S. (2000) ‘Microbial Spoilage and Preservation of Wine : Using Weapons

from Nature ’ s Own Arsenal- A Review’, South African Journal of Enology and Viticulture, 21,

pp. 74–96.

Urso, R. et al. (2008) ‘Yeast biodiversity and dynamics during sweet wine production as

determined by molecular methods’, FEMS Yeast Research, 8(7), pp. 1053–1062. doi:

10.1111/j.1567-1364.2008.00364.x.

Yang, W. et al. (2017) ‘Preservation of orange juice using propolis’, Journal of Food Science and

Technology. Springer India, 54(11), pp. 3375–3383. doi: 10.1007/s13197-017-2754-x.