ustilago tesis

Instituto Politécnico Nacional-CBG

‘ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA Y

ANÁLISIS MOLECULAR DEL LOCUS b DE

Ustilago maydis’

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA

GENÓMICA

PRESENTA

MARÍA FERNANDA JIMÉNEZ BECERRIL

DIRECTORES DE TESIS

M.C. SANJUANA HERNÁNDEZ DELGADO

DR. JUAN MANUEL GONZÁLEZ PRIETO

Reynosa, Tamaulipas febrero, 2010

ÍNDICE

ÍNDICE DE CUADROS ..................................................................................................................... 6

ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................................................... 7

ABREVIATURAS ............................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 14

II. ANTECEDENTES ....................................................................................................................... 16

2.1 Generalidades de Ustilago maydis. ......................................................................................... 16

2.1.1 Ciclo de vida ........................................................................................................................... 16

2.1.2 Control de apareamiento y patogénesis .................................................................................... 17

2.1.3 Organización y estructura del locus a y b ................................................................................ 20

2.1.4 Análisis sexual del apareamiento in vitro ............................................................................... 22

2.1.5 Variabilidad genética ............................................................................................................... 23

2.1.6 Uso de marcadores moleculares para estudiar variabilidad genética ...................................... 24

2.1.7 Marcadores moleculares AFLP ............................................................................................... 25

2.1.8 Análisis de variabilidad genética en U. maydis ....................................................................... 26

2.1.9 Análisis moleculares realizados en el locus b en U. maydis .................................................... 27

III. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................... 29

IV. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 30

4.1 Objetivo general .......................................................................................................................... 30

4.2 Objetivos específicos .................................................................................................................. 30

V. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 31

VI. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 32

6.1 Obtención de tumores de U. maydis en diferentes Regiones y localidades de la República

Mexicana ........................................................................................................................................... 32

6.2 Obtención y purificación de teliosporas a partir de tumores. ...................................................... 33

6.3 Germinación de teliosporas a partir de tumores. ......................................................................... 34

6.4 Determinación del tipo sexual de U. maydis in vitro .................................................................. 34

6.5 Diseño de oligonucleótidos ..................................................................................................... 35

6.5.1 Obtención de DNA genómico de U. maydis ........................................................................... 36

6.5.2 Amplificación del locus b de U. maydis ............................................................................... 37

6.5.3 Purificación del DNA ............................................................................................................... 38

6.5.4 Preparación de muestras para la determinación de la secuencia nucleotídica.......................... 39

6.5.5 Purificación de Reacción de Secuenciación ............................................................................. 40

6.5.6 Análisis Bioinformático de las secuencias del locus b de U. maydis ....................................... 40

6.6 Técnica AFLP ............................................................................................................................. 41

6.6.1 Análisis de Datos AFLP ........................................................................................................... 42

VII. RESULTADOS ......................................................................................................................... 43

7.1 Muestreo y colección de aislados para la detección de variantes alélicas de U. maydis ............. 43

7.2 Determinación del tipo sexual de U. maydis mediante Reacción Fuzz. ...................................... 46

7.3. Amplificación del locus b por Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). .......................... 47

7.4 Análisis Bioinformático de las secuencias del locus b de U. maydis de la República Mexicana.

........................................................................................................................................................... 48

7.5 Análisis AFLP ............................................................................................................................. 62

VIII. DISCUSIÓN ............................................................................................................................ 70

IX. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 75

X. RECOMENDACIONES .............................................................................................................. 77

XI. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 78

XII. GLOSARIO ............................................................................................................................... 81

XIII. ANEXOS .................................................................................................................................. 82

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Oligonucleótidos diseñados empleados en los ensayos de amplificación del locus b de U.

maydis por PCR. .......................................................................................................................................... 35

Cuadro 2. Condiciones de reacción de la amplificación del locus b de U. maydis ..................................... 37

Cuadro 3. Componentes y cantidades empleadas en la reacción de la amplificación del locus b de

U. maydis ..................................................................................................................................................... 38

Cuadro 4. Condiciones de reacción de la amplificación del locus b de U. maydis para la

determinación de la secuencia nucleotídica. ................................................................................................ 39

Cuadro 5. Estados de las diferentes regiones de la República Mexicana muestreados para la

detección de variantes alélicas de U. maydis. .............................................................................................. 44

Cuadro 6. Variantes alelicas encontradas en los diferentes estados y localidades de la Republica

Mexicana ......................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Cuadro 7. Aislamientos de U. maydis sometidos al analisis AFLP. ............................................................ 50

Cuadro 8. Productos AFLP amplificados por combinación en especímenes de U. maydis........................ 67

Cuadro 9. Análisis de varianza Molecular de diferentes individuos de U. maydis colectados de

diferentes localidades y estados de la República Mexicana ......................................................................... 68

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Enfermedad del huitlacoche en el maiz ............................. ¡Error! Marcador no definido.

Figura 2. Etapas del Ciclo biologico de U. maydis, (1) inicia cuando dos celulas sexualmente

compatibles se aparean, (2) formacion de los tubos de conjugacion, (3) conjugacion de esporidias,

(4) formacion del dicarion que penetra e invade la planta(5) formación de teliosporas, (6)

cariogamia, (7) germinación de teliospora y formación de promicelio, (8) promicelio constituido por

cuatro basidioesporas. Tomado de (Ruiz y Martinez,

1998)……………………………………….¡Error! Marcador no definido.

Figura 3. Interacciones entre dos loci de apareamiento durante el desarrollo de U. maydis. El locus a

bialelico codifica para una feromona y un receptor y el reconocimiento de estos desencadena la

fusion celular. Despues de la fusion, alelos diferentes del locus b inducen el desarrollo micelial y

patogénico. Tomado de (Bolker, 2001)……………………………………………………………

¡Error! Marcador no definido.

Figura 4. Organizacion y estructura de los alelos a1 y a2 del locus a de U. maydis. ................ ¡Error!

Marcador no definido.

Figura 5. Organizacion y estructura del locus b multialelico de U. maydis. ..... ¡Error! Marcador no

definido.

Figura 6. Reaccion Fuzz .................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 7. Regiones donde existen diferentes razas del maiz ............. ¡Error! Marcador no definido.

Figura 8. Localidades de la Republica Mexicana donde se colectaron tumores de U. maydis . ¡Error!


Figura 9. Prueba de la reaccion Fuzz en placa. Las cepas que mostraron reaccion positiva se

observan macroscopicamente como una colonia micelial. ............................................................... 46

Figura 10. Morfologia colonial de una reaccion Fuzz positiva de cepas de U. maydis ............ ¡Error!


Figura 11. Gel de agarosa al 0.8% mostrando productos de PCR correspondientes al gen bE de U.

maydis, tamaño de fragmento esperado señalado con flecha. ........... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 12. Grafica que muestra la frecuencia de variantes alelicas distribuidas en la Republica

Mexicana. .......................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 13. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Aguascalientes con base en la

secuencia nucleotidica del locus b de U. maydis .............................................................................. 54

Figura 14. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Chiapas con base en la secuencia

nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 54

Figura 15. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Guanajuato con base en la secuencia

nucleotidica del locus b de U. maydis ............................................... ¡Error! Marcador no definido.

Figura 16. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Jalisco con base en la secuencia

nucleotidica del locus b de U. maydis ............................................................................................... 56

Figura 17. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Nuevo Leon con base en la secuencia


Figura 18. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Michoacan con base en la secuencia


Figura 19. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Oaxaca con base en la secuencia


Figura 20. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Nayarit con base en la secuencia


Figura 21. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Puebla con base en la secuencia

nucleotidica del locus b de U. maydis ............................................................................................... 59

Figura 22. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Queretaro con base en la secuencia


Figura 23. Dendrograma de las variantes alelicas presentes San Luis de Potosi con base en la

secuencia nucleotidica del locus b de U. maydis. ............................................................................. 60

Figura 24. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Tamaulipas con base en la secuencia


Figura 25. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Veracruz con base en la secuencia


Figura 26. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Zacatecas con base en la secuencia


Figura 27. Dendrograma de las relaciones geneticas de U. maydis con base en el metodo UPGMA

entre estados de la Republica Mexicana ........................................................................................... 69

ABREVIATURAS

a1 = locus a1.

a2 = locus a2

a.a = Aminoácidos.

AFLP = Siglas en inglés Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos Amplificados.

AMOVA = Siglas en ingles Análisis de Varianza Molecular.

bE = gen bE.

bW = gen bE.

°C = Grado centígrado.

DNA = Acido desoxirribonucleico.

DNAc = Acido desoxirribonucleico complementario.

DNAg = Acido desoxirribonucleico genómico.

EAFs = Siglas en inglés Fragmentos de restricción asociados a extremos.

EDTA = Etilen Diamino Tetra acético.

EFs = Siglas en inglés Fragmentos de restricción en el extremo.

g = Gramos.

h = Hora.

HCL = Acido Clorhídrico.

HD = Homeodominio.

ID = Índice de Diversidad.

kb = Kilobases.

L = Litros.

mg = Miligramo.

min = minuto.

ml = Mililitros.

mM = Milimolar.

NaCl = Cloruro de Sodio.

NCBI = Centro Nacional de Información sobre Biotecnología.

pb = Pares de bases.

PCR = Siglas en inglés de la Reacción en Cadena de la Polimerasa.

PCR-RFLP = Siglas en inglés Reacción en Cadena de la Polimerasa- Polimorfismos en

la Longitud de Fragmentos de Restricción.

PDA = Agar Papa Dextrosa.

pH = Potencial Hidrogeno.

PK = Proteinasa K.

RAPDs = Siglas en inglés ADN Polimórfico Amplificado al Azar.

rpm = Revoluciones por minuto.

SDS = Dodecilsúlfato Sódico.

TBE = Tris Borato EDTA.

TE = Tris EDTA.

µL= Microlitro.

UPGMA = Agrupamiento de Muestras no Ponderadas con Medias Aritméticas.

RESUMEN

Ustilago maydis (DC) De Candole es un hongo, basidiomiceto, dimórfico,

patógeno, específico del maíz, y el teozintle, agente causal del "huitlacoche" o carbón

común, cuyas características principales son el desarrollo de tumores en las partes aéreas de

la planta. El hongo necesita de la planta para completar su ciclo de vida. El apareamiento y

patogénesis de U. maydis está controlado por dos locus (a y b), el locus a encargado del

apareamiento y consta de dos alelos, (a1 y a2), el locus b controla la patogénesis y posee

25 alelos a la fecha conocidos. México es el lugar de origen, domesticación, y diversidad

genética del maíz y por la estrecha coevolución que existe con el hongo en el presente

trabajo nos dimos a la tarea de estudiar molecularmente el patógeno proveniente de

diferentes localidades y estados de la República Mexicana. El análisis del locus b

multialélico, mediante secuenciación automática por electroforesis capilar identificó en

total 11 variantes alélicas (b1, b3, b7, b9, b13, b14, b15 b17, b18, b18a y b19), distribuidas

en todas las Regiones (Occidente, Altiplano Central, Centro, Maya, Oaxaca y Noreste)

siendo el alelo b7 el más frecuente e identificado en todas las regiones mencionadas ; el

alelo b1 y b3 menos frecuentes, el primero identificado únicamente en el estado de hidalgo

perteneciente a la Región del altiplano Central y el segundo identificado únicamente en

Nayarit perteneciente a la Región Occidente. Con la técnica AFLP, se evaluó la diversidad

genética de dicho hongo, el análisis mostro un polimorfismo del 98% y el AMOVA indico

moderada diferenciación genética entre U.maydis. El análisis de conglomerados con base

en datos AFLP indico que U. maydis es ampliamente diverso ya que no se observaron

agrupamientos bien definidos con base en las regiones mencionadas anteriormente. Los

especímenes de U. maydis de Michoacán pertenecientes a la Región Occidente fueron

genéticamente distintos de la Región Altiplano Central, Centro, Noreste y Maya.

SUMMARY

Ustilago maydis (DC) De Candole is a mushroom, basidiomycete, dimorphic

pathogen-specific maize and teozintle, causal agent of "huitlacoche" or common coal,

whose main features are the development of tumors on aerial parts of the plant . The fungus

needs the plant to complete its life cycle. The mating and pathogenesis of U. maydis is

controlled by two loci (b) to charge the mating locus and has two alleles (a1 and a2), the

locus b controls the pathogenesis and has 25 alleles known to date. Mexico is the place of

origin, domestication and genetic diversity of maize and the close coevolution with fungus

that exists in the present work we took on the task of studying the molecular pathogen from

different localities and states of Mexico. The analysis of the multiallelic b locus by

automated sequencing by capillary electrophoresis identified a total of 11 allelic variants

(b1, b3, b7, b9, b13, b14, b15 b17, b18, b19 and B18A), distributed in all regions (West,

Central Highlands, Central, Maya, Oaxaca, and Northeast) being the most frequent allele b7

and identified in all the regions mentioned, the b1 and b3 allele less frequent, the first found

only in the state of gentleman belonging to the Central Highlands region and the latter

found only in Nayarit belonging to the Western Region. With the AFLP technique, we

assessed the genetic diversity of the fungus, the analysis showed a 98% polymorphism and

AMOVA indicated moderate genetic differentiation between U.maydis. Cluster analysis

based on AFLP data indicated that U. maydis is widely diverse and that there were no well-

defined groupings based on the above regions. Specimens of U. maydis Michoacán

belonging to the Western Region were genetically different from the Central Plateau

Region, Central, Northeast and Maya.

I. INTRODUCCIÓN

El huitlacoche (carbón común) es una enfermedad específica del maíz (Zea mays) y

de su antecesor, el teozintle (Zea mays ssp parviglumis) (Ruíz, 2008), caracterizada por la

formación de tumores en los tejidos aéreos de la planta hospedera, causada por el hongo

Ustilago maydis. U. maydis es un patógeno, basidiomiceto y dimórfico, que durante su

ciclo de vida presenta dos formas; a) una forma unicelular (esporidia), la cual es haploide

uninucleada y presenta crecimiento saprofítico; b) una forma filamentosa dicariótica, la

cuál es parasítica y patógenica (Banuett, 1995). El ciclo de vida de U. maydis está regulado

por el sistema de reconocimiento tetrapolar el cual consiste del loci de reconocimiento tipo

a y b. El locus bialélico a codifica para un sistema feromona/receptor requerido para la

fusión de las esporidias. El locus multialélico b codifica para proteínas con homeodominios

bE/bW, las cuales en combinaciones no alélicas se dimerizan para formar un factor de

transcripción activo crucial para el desarrollo patogénico (Banuett, 1995).

Para determinar el tipo sexual del hongo se hace un análisis in vitro conocido como

reacción ‘Fuzz’. Es importante mencionar que mientras más variantes alélicas existan en el

locus b de U. maydis, aumentará el número de apareamientos, recombinación y variabilidad

genética, por lo tanto también aumentará la probabilidad de patogénesis del hongo en la

planta. México es el lugar de origen, domesticación, mayor distribución y diversidad

genética del maíz y por la estrecha coevolución entre el hongo y la planta, se puede suponer

que en la República Mexicana también existe la mayor variabilidad genética de dicho

hongo, sin embargo; a la fecha existen muy pocos análisis de variabilidad genética por

ejemplo. (Valverde y col.,2000) mediante análisis RFLP analizaron la diversidad genética

de 32 especímenes de U. maydis pertenecientes a cinco estados diferentes de la República

Mexicana, trabajo en el cual reportan un alto grado de polimorfismo y una amplia

diversidad genética de dicha especie, distribuida en todos los sitios analizados, también

(Saleh y col., 2006) realizaron análisis de diversidad genética de U. maydis en siete

diferentes localidades de Egipto y la diversidad genética encontrada entre poblaciones fue

del (85.86%), y a la fecha no existe ningún análisis del locus b. Es necesario tener un

conocimiento más amplio para entender el apareamiento y patogénesis en U. maydis. En

dicho hongo se han realizado pocos análisis de variabilidad genética entre los que se

incluyen técnicas que utilizan enzimas de restricción y marcadores moleculares de ADN

como son: Fragmentos de restricción en el extremo (EFs), Fragmentos de restricción

asociados a extremos (EAFs) (Sánchez y col, 1996), y ADN polimórfico amplificado al

Azar (RAPDs). En cuanto a estudios del locus b solamente se han realizado análisis del

tipo de polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción por medio de reacción en

cadena de la polimerasa (PCR-RFLP) . Por lo anterior es necesario tener conocimiento más

amplio para entender el apareamiento y patogénesis en U. maydis, además de estudiar la

variabilidad genética y molecular del locus b del hongo, en aislados colectados de

diferentes zonas rurales de la República Mexicana. En el presente trabajo se analizó la

diversidad genética mediante Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de

amplificación (AFLP), y el locus b de U. maydis se analizó mediante la secuenciación de

sus bases nucleotídicas.

II. ANTECEDENTES

2.1 Generalidades de Ustilago maydis.

Ustilago maydis (DC) De Candole es un hongo, patógeno, basidiomiceto,

dimórfico, que causa enfermedad en el cultivo de maíz comúnmente conocida como

‘huitlacoche’ ó ‘carbón común’, que se caracteriza por inducir clorosis, necrosis,

hiperplasia e hipertrofia, causando el desarrollo de tumores en tallo, hojas, espigas y en los

granos de elote (Figura 1), (Agrios, 1998). En cuanto a su taxonomía U. maydis pertenece

al Reino: Fungi, Subreino: Eumycota, Phylum: Basidiomycota Clase: Basidiomicetes,

Subclase: Heterobasidiomycetydae, Orden: Ustilaginales, Familia: Ustilaginaceae,

Género: Ustilago, Especie: maydis, (Holliday, 1974). Ustilago maydis presenta dos formas

de crecimiento, fuera de la planta es levaduriforme, saprófita, haploide no patogénica, y

dentro de la planta es micelial, parasítica, diploide y patogénica, (Holliday, 1974). U.

maydis tiene dos tipos sexuales: el a y el b, determinados por las regiones que controlan el

apareamiento y la patogénesis denominadas locus a y locus b.

2.1.1 Ciclo de vida

Cuando dos células sexualmente compatibles se encuentran cerca, se atraen

mediante feromonas y emiten tubos de conjugación que se dirigen hacia la célula opuesta

en un ángulo que va de 30º- 45º, (Snetselaar y col, 1996), las células se fusionan y forman

un micelio dicariótico siendo éste la forma parasítica del hongo. El micelio penetra a la

planta a través de los estomas (Banuett y Herskowitz, 1996) por las partes aéreas de la

planta. Posteriormente invade los tejidos y estimula a las células de la planta para que se

dividan incontrolablemente, formando tumores que van desde 1cm hasta 30 cm de diámetro

(Villanueva, 2007) reemplazando a los granos del maíz. El tumor es una masa negruzca

cubierta por una membrana llamada peridio (Villanueva, 2007) y dentro de éste, se

encuentran millones de teliosporas que son liberadas al suelo o dispersadas por el viento a

grandes distancias cuando se rompe el tumor. Si las condiciones son favorables, la

teliospora germina y forma el promicelio o basidio, que produce basidiosporas de diferente

tipo de compatibilidad sexual y nuevamente comienza el ciclo de vida de U. maydis (Figura

2) (Banuett, 1992; Ruiz y Martínez 1998).

2.1.2 Control de apareamiento y patogénesis

El apareamiento de U. maydis está controlado por el locus a bialélico (a1 y a2) cada

alelo contiene los genes mfa y pra que codifican para una feromona y un receptor

respectivamente (Figura 3) (Banuett, 1995). Cuando se une la feromona con el receptor

opuesto de la célula opuesta desencadenan una señal que activa un factor de transcripción,

y éste a su vez se une en la zona intergénica del locus b, que contienen los genes bW y bE,

los cuales codifican para proteínas regulatorias que forman un heterodímero activo bE-bW,

y éste desencadena el crecimiento micelial, activando también diversos genes involucrados

en la patogénesis, (Basse y Steinberg, 2004; Bolker, 2001; Romeis y Col., 1997).

Figura 1. Enfermedad del huitlacoche en el maiz.

.

Figura 2. Etapas del Ciclo biólogico de U. maydis, (1)inicia cuando dos células sexualmente compatibles

se aparean, (2)formación de los tubos de conjugación, (3) conjugación de esporidias, (4)formación del

dicarión que penetra e invade la planta, (5) formación de teliosporas, (6) cariogamia, (7) germinación

de teliospora y formación de promicelio, (8) promicelio constituido por cuatro basidioesporas. Tomado

de (Ruiz y Martinez, 1998).

Figura 3. Interacciones entre dos loci de apareamiento durante el desarrollo de U. maydis. El locus a

bialelico codifica para una feromona y un receptor y el reconocimiento de estos desencadena la fusión

celular. Despues de la fusión, alelos diferentes del locus b inducen el desarrollo micelial y patogénico.

Tomado de (Bolker, 2001).

2.1.3 Organización y estructura del locus a y b

Los alelos a1 y a2 son disimilares, uno de 4.0 kb y el otro de 8.5 kb

respectivamente, cada alelo tiene el gen (mfa) que codifica para una feromona y el gen

(pra) que codifica para un receptor, el alelo a1 tiene los genes pra1 y mfa1, mientras que el

alelo a2 tiene los genes pra2 y mfa2 (Figura 4). El locus b consiste de 25 alelos múltiples

que controla el crecimiento filamentoso y la patogenicidad, (Banuett,1995). De acuerdo a

su estructura molecular, la organización del locus b, consta de dos genes divergentes, bE y

bW, ambos codifican para los polipéptidos bE de 410 a.a y bW de 626 a.a, conteniendo un

motivo homeodominio (HD) (Figura 5). Los genes bE y bW no muestran una secuencia

similar pero su organización es parecida, poseen una región variable de 120 a.a en el

extremo amino terminal para el polipéptido bE y una región conservada en el extremo

carboxilo terminal, de igual manera el polipéptido bW tiene una región variable de 130 a.a

en el extremo amino terminal y una región conservada en el extremo carboxilo terminal.

Entre ellos existe una región intergénica aprox. De 260 pb (Banuett, 1992, Banuett, 1995).

Figura 4. Organización y estructura de los alelos a1 y a2 del locus a de U. maydis.

Figura 5. Organización y estructura del locus b multialélico de U. maydis.

2.1.4 Análisis sexual del apareamiento in vitro

Para determinar el tipo sexual del hongo se recurre a la reacción Fuzz descrita por

(Banuett, 1995), consiste en colocar una gota de la suspensión celular (a1b1) de U. maydis

sobre una caja petri que contenga PDA con carbón activado al 1% esto con la finalidad de

dar contraste a las colonias crecidas, cuando se observa que la gota esta seca sobre esta

misma se coloca otra gota con la suspensión celular (a2b2), lo anterior se realiza con la

finalidad de aparear dichas células (Figura 6). La reacción fuzz es positiva cuando

fenotípicamente se observa una colonia blanca con apariencia algodonosa, indicando que

las células confrontadas presentan alelos a y b diferentes. Por el contrario la reacción Fuzz

es negativa cuando fenotípicamente se observa una colonia cremosa y brillante que nos

indica que las células confrontadas presentan los dos alelos idénticos.

Figura 6. Reacción Fuzz.

2.1.5 Variabilidad genética

La variabilidad genética se refiere a la variación en el material genético dentro y

entre poblaciones de organismos. La variación surge por recombinación y mutación del

material hereditario, es un requisito necesario para que la especie evolucione y se adapte a

nuevas condiciones (Jiménez y Collada 2000). A partir de los años sesenta las técnicas

desarrolladas para estudiar la variación a nivel molecular abrieron la posibilidad de estudiar

caracteres con un control genético sencillo, como las diferencias de movilidad en proteínas;

con el paso del tiempo ha sido posible estudiar la variación en el ADN. Al estudiar la

variabilidad fenotípica se desconocía la variación subyacente en el genoma, al cuantificar la

variación molecular, ignoramos el efecto que tiene sobre el fenotipo, o por el contrario

puede ser nulo, pues a veces se estudian fragmentos de ADN que no codifican para ningún

carácter. Por lo tanto, existen dos tipos de variación genética: la primera es una diversidad

neutral, la cual no se ve afectada por la selección natural, y la segunda diversidad

corresponde a los caracteres con valor adaptativo. Para determinar la cantidad y

distribución de la diversidad genética en una especie se requiere el análisis de ambos tipos

de variación, pues la acción de distintos procesos evolutivos sobre cada tipo de caracteres

hace que los patrones de variación no se correspondan entre sí. La selección no actúa de

igual modo en todas las partes del genoma, mientras que las tasas de migración son iguales

para todos los genes, por lo que los marcadores neutrales no predicen necesariamente los

patrones de variación de los rasgos sujetos a selección diferencial (Jiménez y Collada

2000).

2.1.6 Uso de marcadores moleculares para estudiar variabilidad genética

Los marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar con un

rasgo genético. Las biomoléculas que pueden ser marcadores moleculares son las proteínas

(antígenos e isoenzimas) y el DNA (genes conocidos o fragmentos de secuencia y función

desconocida) (Claros ,2008). Un marcador molecular monomórfico es invariable en todos

los organismos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad

enzimática, estructura, o sitios de restricción, se dice que es polimórfico. Los marcadores

moleculares nos dan una estimación de la diversidad genética neutral. Existen diversos

tipos de técnicas, que brindan distinto tipo de información dependiendo de las

características de la molécula o fragmento de la molécula analizado. Lo más común es la

detección de diferencias de tamaño; a partir de las frecuencias con que aparecen cada una

de las distintas variantes (alelos) se calculan diversos parámetros que dan la medida de la

diversidad neutral y además permiten comparar entre especies y/o estudios, (Jiménez y

Collada 2000). Los estudios con marcadores son relativamente baratos y ofrecen

rápidamente resultados, los grupos de marcadores se dividen en dos tipos: los que se basan

en el análisis de proteínas (análisis isoenzimático, polimorfismo posicional de péptidos), y

los que se basan en el análisis del ADN. Las características de los marcadores moleculares,

frente a los proteicos: no se ven afectados por variaciones ambientales ni de desarrollo.

Permiten seleccionar regiones concretas dentro de la molécula de ADN para estudios

determinados, el número de polimorfismos detectables es teóricamente ilimitado, permiten

analizar tanto la información que se expresa como la que no y en la actualidad se han

desarrollado un gran número de técnicas adecuadas a diferentes situaciones.

2.1.7 Marcadores moleculares AFLP

La técnica polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP), por

sus siglas en inglés, es una técnica molecular descrita por (Vos y col. 1995), que consiste en

una combinación de las tecnologías de RFLP y PCR, basada en la amplificación selectiva

mediante PCR, de fragmentos de restricción obtenidos de DNA genómico total y DNAc

digerido con 2 enzimas. Es un método altamente sensible para caracterizar el ADN sin

importar su origen ni complejidad, (Blears y col. 1998). La técnica comprende tres etapas,

en la primera etapa se digiere el ADN con enzimas de restricción diferentes, una de corte

frecuente (MseI) y una de corte poco frecuente (EcoRI). Después, se ligan adaptadores

oligonucleótidos que son específicos a los extremos de los fragmentos de ADN digeridos,

con el objetivo de ser la base para la amplificación selectiva. Posteriormente, se amplifican

subconjuntos específicos de los productos de digestión, utilizando combinaciones de

oligonucleótidos selectivos, y por último el polimorfismo se detecta empleando

radioisótopos, tinción de plata, colorantes fluorescentes y fluoróforos. En cuanto a las

reacciones de PCR, se realiza una primera PCR preselectiva, utilizando oligonucleótidos

que son complementarios al adaptador y a los sitios de restricción. Luego se añade un

nucleótido para seleccionar un subconjunto de fragmentos. Los productos de la

amplificación preselectiva son sometidos a otra PCR con la finalidad de seleccionar un

subconjunto de fragmentos, cabe mencionar que en la segunda amplificación selectiva se

añaden otros dos nucleótidos y finalmente los productos amplificados son separados por

medio de electroforesis en geles de poliacrilamida. Las ventajas que ofrecen los AFLP

comparado con otras técnicas es que permiten explorar rápidamente los polimorfismos del

genoma entero, como generan un gran número de bandas, cada marcador da una huella

identificadora de ADN que es sumamente informativa, (Blears y col. 1998., Bensch y

Akesson 2005). Además son altamente reproducibles y no es necesaria la información

previa de las secuencias ni hay que generar sondas de hibridación. Los AFLP se pueden

aplicar para evaluar la diversidad genética, construcción de mapas genéticos, clonación

posicional de genes (Bensch y Akesson 2005), identificación y caracterización de hongos y

bacterias, (Blears y col. 1998), es muy útil en análisis de paternidad y estudios de flujo

genético, análisis de filogenia, y en análisis de distancia genética. (Jiménez y Collada

2000).

2.1.8 Análisis de variabilidad genética en U. maydis

A la fecha se han realizado pocos análisis de variabilidad genética en U. maydis, por

ejemplo en siete localidades de Egipto se obtuvieron ocho diferentes tipos de locus b, con

aproximadamente frecuencias iguales, siendo los alelos b1, b3 y b8 los más frecuentes. La

diversidad total calculada de todas las poblaciones fue de un 85.86% y el promedio dentro

de las poblaciones fue de un 82.79 % y la diversidad de genes entre poblaciones fue de 3.07

indicando que la mayoría de la diversidad génica ocurrió en una escala espacial pequeña.

(Saleh y col. 2006). En 10 muestras de U. maydis, de cuatro regiones geográficas de Egipto

con diferentes tipos de apareamiento por medio de RAPD se generaron 40 bandas de ADN

en un rango de 150-2500 pb de las cuales 27 fueron polimórficas (67.50%) con un

promedio de 8 bandas por iniciador. Por lo tanto estos resultados indicaron que no hay

relación entre los RAPD y los sitios geográficos de donde se colectaron las muestras (Saleh

y col. 2006). Otro de los análisis de variabilidad genética en U. maydis, usando sondas

derivadas de secuencias teloméricas, se realizaron en cuatro grupos de diferentes áreas

geográficas de México, para identificar patrones de huella genética discriminativos,

mediante análisis de fragmentos de restricción en el extremo (EFs) y fragmentos de

restricción asociados a extremos (EAFs) de los cromosomas. La mayoría de los EFs en dos

grupos de cepas mostró una longitud similar y los otros dos grupos se distribuyeron en

longitudes de diferentes clases, y en el caso de los EAFs, permitieron predecir patrones de

huella genética para cada grupo de cepas, basados en la ocurrencia de bandas amplificadas.

(Sánchez y col, 1996). Por otro lado (Valverde y col.,2000) mediante análisis RFLP

analizaron la diversidad genética de 32 especímenes de U. maydis pertenecientes a cinco

estados diferentes de la República Mexicana trabajo en el cual reportan un alto grado de

polimorfismo y una amplia diversidad genética de dicha especie, distribuida en todos los

sitios analizados.

2.1.9 Análisis moleculares realizados en el locus b en U. maydis

También a la fecha existen muy pocos análisis moleculares en el locus b de U.

maydis, por ejemplo, en cuatro localidades de Minnesota se realizaron análisis de los

niveles de diversidad poblacional en U. maydis del locus b de apareamiento, combinando

análisis de apareamiento en placa y polimorfismo en la longitud de fragmentos de

restricción (RFLP) y por PCR se demostraron altos niveles de diversidad del locus b dentro

de poblaciones, con un rendimiento poblacional de 17, de un total de 18 tipos b; los valores

Pairwise Gst fueron de 0.02 a 0.05, encontrándose los tipos de apareamiento común en

distancias geográficas amplias. Estos resultados demostraron que hay muy bajos niveles de

diferenciación entre poblaciones de U. maydis con respecto a la variación del locus b

(Zambino y col.1997). Los tipos b de apareamiento fueron representados en

aproximadamente frecuencias iguales dentro de todas las poblaciones de Minnesota

(Zambino y col.1997).

III. JUSTIFICACIÓN

México es el lugar de origen y domesticación del maíz (Zea mays), en el que existe

la mayor diversidad genética de esta planta, además es importante mencionar que el maíz se

cultiva en casi toda la República Mexicana. U. maydis es el hongo que produce la

enfermedad del ‘huitlacoche’ únicamente en el maíz y teocintle para poder concluir su ciclo

de vida. Por lo tanto entre huésped-hospedero existe una estrecha coevolución. Con

respecto a lo anterior, es de esperarse que también en U. maydis exista una amplia

diversidad genética. Se sabe que el locus b del hongo presenta a la fecha 25 variantes

alélicas, además es el encargado de controlar la patogénesis y desencadenar la enfermedad

en la planta del maíz; por lo anterior es posible que existan mas variantes alélicas y como

consecuencia de esto aumenta la recombinación sexual y genética, aumentando la

probabilidad de que el hongo cause la enfermedad en el maíz. A la fecha, en México no hay

suficientes reportes de estudios de diversidad genética y tampoco en el locus b de

apareamiento de U. maydis. realizar estudios en el locus b de U. maydis permitirá conocer

la distribución de la variantes alélicas en la República Mexicana, los estudios anteriores

permitirán complementar el conocimiento sobre los mecanismos de apareamiento y

patogénesis del hongo, para que en un futuro puedan servir de base y buscar mejores

alternativas para disminuir la probabilidad de patogénesis en el cultivo del maíz o por el

contrario aumentar la patogénesis, ya que el huitlacoche constituye una ganancia para el

agricultor, ya que para muchos agricultores una mazorca infectada tiene un valor de

mercado varias veces mas alto que el de una sana. Cabe destacar que Instituciones

Mexicanas han puesto un interés especial por la biodiversidad de especies mexicanas, y U.

maydis es una especie de la que casi no se conoce nada.

IV. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Determinar la diversidad genética de U. maydis e identificar sus variantes alélicas

en el locus b de aislamientos de la República Mexicana.

4.2 Objetivos específicos

Identificar las variantes alélicas del locus b de U. maydis presentes en aislamientos

de República Mexicana

Analizar genéticamente aislamientos de U. maydis de la República Mexicana.

V. HIPÓTESIS

Existe diferenciación genética significativa entre aislamientos de U. maydis de la

República Mexicana.

Existen variantes alélicas en el locus b de aislamientos de U.maydis de la República

Mexicana.

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Obtención de tumores de U. maydis en diferentes Regiones y localidades de la

República Mexicana

Se realizaron colectas de tumores a pie de carretera, presentes en cultivos de maíz

de zonas rurales de la República Mexicana, con base en las regiones donde existen

diferentes razas de maíz, dichas regiones son: Occidente, Altiplano central, Centro, Maya y

Oaxaca (Muñoz, 2005); otra región que se incluyó en el presente trabajo fue el noreste

(Figura 7 y 8). Los tumores se cortaron cuidadosamente con la mano y se guardaron en

bolsas de papel destrasa (previamente rotuladas) con el objetivo de mantenerlos secos y

fueron trasladados al laboratorio, donde se almacenaron a -70 ˚C hasta su procesamiento.

Figura 7. Regiones donde existen diferentes razas del maíz.

L

Figura 8. Localidades de la República Mexicana donde se colectaron tumores de U. maydis.

6.2 Obtención y purificación de teliosporas a partir de tumores.

Los tumores colectados, fueron macerados en un mortero con agua destilada estéril

para liberar las teliosporas, se filtraron y colectaron en tubos Falcon de 50 ml,

posteriormente se trataron con una solución de sulfato de cobre al 0.5% durante una hora en

agitación constante, para eliminar células vegetales y contaminantes (Holliday, 1974) se

eliminó la solución de sulfato de cobre por centrifugación durante 5 min a 3500 rpm,

después se les añadió 2.5 mL de una solución de antibióticos (0.5g/L de ampicilina, 0.5g/L

kanamicina, 0.5g/L estreptomicina y 0.4g/L gentamicina), finalmente las teliosporas se

almacenaron a 4 ˚C.

6.3 Germinación de teliosporas a partir de tumores.

Se tomó una alícuota de la solución de teliosporas y se colocó en un portaobjetos

para observar al microscopio que dichas esporas estuvieran libres de bacterias y

contaminantes vegetales, después de la solución de teliosporas se tomaron 25 µl de la

dilución 10-1

para ponerlas a germinar en Agar Papa Dextrosa y finalmente se incubaron a

30˚C durante 24 h.

6.4 Determinación del tipo sexual de U. maydis in vitro

De cada tumor se germinaron y aislaron tres colonias, a las que llamamos A, B y C

y en una caja Petri con medio compuesto de 4% de dextrosa, 4% peptona, 2% de extracto

de levadura, 1% de carbón activado, 2.7% de agar y 100 mL de agua destilada (Holliday

y 1974); se cofrontaron entre sí, la presencia de una colonia blanca con aspecto algodonoso

indicó crecimiento micelial del hongo y por lo tanto la Reación Fuzz se consideró positiva

esto indicó que esa colonia presentaba alelos a y b diferentes, la cepa FB2 se usó como

control negativo.(Banuett, 1995).

6.5 Diseño de oligonucleótidos

Con base en el alineamiento de las secuencias parciales de los alelos b disponibles

en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), realizado con el Software Seqman del paquete (DNAstar

versión 6), se diseñarón oligonucleótidos (Cuadro 1) de zonas cien por ciento idénticas de

los genes bE y bW del locus b de U. maydis.

Cuadro 1. Oligonucleótidos diseñados en zonas invariables del locus b de U. maydis.

Nombre Secuencia de 5´ a 3´ Tm (˚C)

bE1484S CATAGCGTGAGCTGATGAAC 60.4

bE1946S CTCGTTGAGGCACTCCAAG 62.32

bE1965R CTTGGAGTGCCTCAACGAG 62.32

bW3480R CCGCTCGACTCTGACGAC 64.46

bW3174R CTTCTTCCCTTTCCGGTTAC 60.4

bW2719R GTGTCCACGACCAGTCTTG 62.32

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

6.5.1 Obtención de DNA genómico de U. maydis

Se usó el método modificado de Hoffman y Wriston (1987). Se inoculó una asada

de una colonia fresca del hongo en 10 mL de medio rico, y se incubó durante 16-18 h en

agitación constante y con buena aeración. Luego el cultivo se centrifugó para obtener una

masa celular, la cual se lavó con 0.5 mL de agua estéril, posteriormente se transfirió a un

tubo eppendorf, luego se centrifugó por 30 s y se descartó el sobrenadante. Las células se

resuspendieron en 0.2 mL de solución de lisis (tritón X-100, 2%; SDS, 1%; NaCl, 0.1M;

Tris-HCL pH8, 10mM y EDTA, 1mM, después se añadió 0.2 mL de fenol-cloroformo (1:1)

y 0.3 g de perlas de vidrio de 0.45 mm de diámetro. El tubo se agitó en un agitador tipo

‘vortex’ por 1 min., y se dejó reposar en hielo durante 1 min (este paso se repitió 3 veces),

después se añadieron 0.2 mL de TE 10:1 (Tris 10 mM y EDTA 1mM) y se centrifugó

durante 10 min a 12000 rpm. Posteriormente la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo y

se añadieron 30 µg de RNAsa de 10 mg mL-1

Luego de una incubación de 5 min a 37 ºC, se

agregaron 10 µL de acetato de amonio 4M y 1 mL de etanol al 100%. El tubo se mezcló

por inversión y se dejó reposar 15 min. a -20 ºC. Se centrifugó por 5 min a 12000 rpm y se

lavó el precipitado con 100 µL de etanol al 70%. Después el sobrenadante se eliminó y el

precipitado se secó durante 1-2 min a una temperatura de 55 ºC. Finalmente el DNA

obtenido se resuspendió en 50 µl de TE 10:1 y se guardó a -20 ºC hasta su uso.(Figura 12).

6.5.2 Amplificación del locus b de U. maydis

El locus b fue amplificado en un termociclador Applied Biosystems modelo 9800

Fast, y se usaron aproximadamente 100 ng de DNA genómico con los oligonucleótidos 5'

1484CATAGCGTGAGCTGATGAAC 3' (sentido) para el gen bE y 3' 3480

CCGCTCGACTCTGACGAC 5' (antisentido) para el gen bW a una concentración de 1.5

µg µL-1

. Los deoxinucleótidos (dNTP´s) se usaron a una concentración de 10 mM, 1.5 µL

de Cloruro de Magnesio a 50 mM, 5 µL de buffer 10X y 0.5 U de enzima Taq DNA

polimerasa (Invitrogen®) en un volumen final de 50 µL. Las condiciones, componentes y

cantidades empleadas para la amplificación del locus b se describen en el (Cuadro 2 y 3 ).

Cuadro 2. Condiciones de reacción de la amplificación del locus b de U. maydis

Condiciones Tiempo T(°C) Ciclos

T°C

desnaturalización

T°C alineamiento

T°C extensión

T°C mantenimiento

3 min

1 min

1 min

2 min

∞

94

94

56

72

4

1

30

∞

Cuadro 3. Componentes y cantidades empleadas en la reacción de la amplificación del locus b de U.

maydis.

Componente Volumen Concentración

DNAg

Oligo bE1484S

bW2719R

MgCL

Buffer

dNTP's

Agua MQ

Enzima Taq

1µL

1µL

1µL

1.5µL

5 µL

1µL

39 µL

0.5 µL

100ng

500 ng/µL

500 ng/µL

50mM

10X

10 mM

5U/µL

6.5.3 Purificación del DNA

La purificación de los productos amplificados por PCR del locus b de U. maydis se

llevó a cabo con el estuche comecial Wizard® SV and PCR Clean-up System de la marca

Promega, y consistió en que una vez obtenidas las bandas de DNA en el gel de agarosa por

electroforesis, fueron cortadas cada una cuidadosamente con un bisturí, y después se

colocaron en un tubo eppendorff de 1.5 mL. posteriormente se añadieron 250 µL de la

solución de unión a la membrana, se dió un vortex por 5 seg y después se incubaron en el

termomixer a 65˚C hasta observar que la agarosa se disolvió completamente, después esta

disolución fue añadida cuidadosamente sobre la minicolumna y luego se centrifugó a

13,000 rpm durante 1min, posteriormente se desechó el filtrado y se añadieron 700 µL de la

solución de lavado de la membrana, nuevamente se centrifugó a 16,000 rpm durante 1 min

y el filtrado se desechó, enseguida se añadieron 500 µL de la solución de lavado de la

membrana y se volvió a centrifugar a 16,000 rpm durante 1 min, luego cuidadosamente la

minicolumna se transfirió a un tubo eppendorf nuevo y finalmente el ADN obtenido se

resuspendió en 40 µl de TE 10:1y se guardó a -20 ºC hasta su uso. (Figura 13).

6.5.4 Preparación de muestras para la determinación de la secuencia nucleotídica

Para determinar la secuencia nucleotídica del locus b de U. maydis, se llevó a cabo

una amplificación por PCR en un termociclador BIORAD® modelo i־ cycler, usando 5 µL

de ADN como templado a una concentración de 50 ng, oligonucleótidos a una

concentración de 5 µM, 4µL de buffer Big Dye v3.1, 5X, 6 µL de agua milli ־Q estéril, 4µL

de buffer Big Dye v3.1 Ready mix, en un volumen final de 20 µL. Las condiciones en que

se llevaron a cabo las amplificaciones se muestran en el (Cuadro 4).

Cuadro 4. Condiciones de reacción de la amplificación del locus b de U. maydis para la determinación de

la secuencia nucleotídica.

.

Condiciones Tiempo T(ºC) Ciclos

Desnaturalización 1 min 96

Desnaturalización 10 seg 96 25

Alineamiento 5 seg 50

Alineamiento

T ºC mantenimiento (tiempo

indefinido)

4 min

-

60

4

25

-

6.5.5 Purificación de Reacción de Secuenciación

Para la purificación de la reacción de secuenciación se utilizó el kit Bigdye

Xterminator® Purification, de la reacción de secuenciación se tomaron 10 µL y se

depositaron en un tubo junto con 45 µL de solución SAM, después se agitó vigorosamente

hasta observar una mezcla homogénea, luego al mismo tubo se le añadieron 10 µL de

solución Xterminador, posteriormente el tubo se agitó fuertemente a una temperatura de 25

ºC a 1400 rpm por 30 min y después de una centrifugación de 2 min a 12000 rpm, el

sobrenadante fue separado, y de éste se colocaron 10 µL en la placa del secuenciador

automático ABI 3130, mediante electroforesis capilar.

6.5.6 Análisis Bioinformático de las secuencias del locus b de U. maydis

Para el análisis de las secuencias nucleotídicas del locus b de U. maydis se utilizó el

programa computacional Chromas Lite. En internet se utilizaron las herramientas de la base

de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). La región analizada comprende parte del gen bW y del gen

bE (Anexo), ambos genes incluyeron la región variable y el homeodominio, así como la

región intergénica, el tamaño de las secuencias analizadas fue de 600 pb, y finalmente las

secuencias fueron comparadas con la base de datos blast en el NCBI.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

6.6 Técnica AFLP

El ADNg total se digirió con dos enzimas de restricción (MseI y PstI) que se ligaron

a los adaptadores. Posteriormente, se realizaron dos amplificaciones selectivas mediante

PCR utilizando oligonucleótidos que contienen secuencias comunes a los adaptadores y de

uno a dos nucleótidos arbitrarios serán secuencias selectivas. El total de bandas

polimórficas obtenidas de la reacción se determinó por la especificidad con los iniciadores

de las endonucleasas de restricción usadas para digerir el DNA genómico, el número y la

opción para la elección de iniciadores selectivos en el extremo 3' de los iniciadores de las

enzimas de restricción así como el tamaño y complejidad del ADN. El ADNg del hongo fue

digerido con las enzimas Mse I y Pst I a 37ºC por 2 h, después se calentó 70 ºC durante 15

min con la finalidad de inactivar las enzimas. Posteriormente los fragmentos se ligaron a

los adaptadores Mse I y Pst I durante 2h a 20 ºC. Una vez concluida la reacción, la muestra

de ligación fue diluida con agua estéril y se llevó a cabo la pre-amplificación por 20 ciclos

en la PCR. La amplificación preselectiva y selectiva se llevó a cabo como lo describen

Vos y col. (1995). Los fragmentos amplificados fueron separados mediante electroforesis

en gel de poliacrilamida al 6.5 % con un precorrimiento en un sistema de secuenciación

semiautomática IRD (modelo 4200-029; Li-cor ®; Lincoln, NE, EUA) con amortiguador

TBE 1X por 30 min a 2000 V y la separación de los fragmentos fue por 3 h al mismo

voltaje.Los datos AFLP de las muestras marcadas con el fluoróforo IRDye™ 800 se

obtuvieron del equipo en tiempo real.

6.6.1 Análisis de Datos AFLP

Los cuatro geles se analizaron y las bandas polimórficas y monomórficas se

registraron. Se asumió que las bandas de un mismo peso molecular en diferentes individuos

son idénticas. La presencia de una banda fue indicada por un uno (1) y la ausencia como

cero (0); una vez obtenida la matriz binaria se construyó una matriz de distancias genéticas

empleadas para construir un dendrograma con el algoritmo UPGMA (Método de

Agrupamiento de pares no Ponderados con Medias Aritméticas; Avise, 1994); dicho

análisis se llevo a cabo con el software Statistica versión 7 ( StatSoft™, 2004); Luego se

realizó un análisis de varianza molecular (AMOVA) con el paquete estadístico Info-gen/P

(Balzarini y Di Rienzo., 2004) para determinar si hay diferencias estadísticas entre y dentro

de las cepas de U. maydis de los diferentes aislados de la República. El índice de diversidad

genética fué calculado como ID = 1 – pi2, donde pi es la frecuencia del alelo i

n; en este

caso cada alelo individual se considera locus único y a su vez un fragmento de

amplificación (Powell y col.1996).

VII. RESULTADOS

7.1 Muestreo y colección de aislados para la detección de variantes alélicas de U.

maydis

Los estados de la República Mexicana muestreados para identificar las variantes

alélicas fueron 16 (Tamaulipas, Nuevo león, Hidalgo, Chiapas, Veracruz, Puebla,

Guanajuato, Oaxaca, Tlaxcala, Zacatecas, Nayarit, Jalisco, San Luis Potosí, Michoacán,

Querétaro y Aguascalientes) dicho muestreo se realizó con base en las zonas de mayor

producción y diversidad de las razas del maíz, que se dividen en cuatro (Occidente,

Vertiente del golfo, Altiplano central y Oaxaca); incluyendo también dos estados del norte

de la República Mexicana (Tamaulipas y Nuevo León). Es importante resaltar que en los

estados de Jalisco, Guanajuato, Hidalgo, Zacatecas y Puebla se analizaron un mayor

número de muestras, debido a que el centro de la República Mexicana es el origen, mayor

domesticación, diversidad, y recombinación del maíz y por la estrecha coevolución que

tiene con U. maydis, asumimos que también encontraríamos la mayor diversidad de

variantes alélicas. (Cuadro 5).

Cuadro 5. Estados de las diferentes regiones de la República Mexicana muestreados para la detección

de variantes alélicas de U. maydis.

Regiones Estados Localidad

es

Localidades Variantes alélicas

Occidente

Nayarit 2 Los balastros

Jala

b3, b18

Ixtlán del Rio

b13, b13, b7

Jalisco 13 Autlán de

Jalisco juárez

b19, b19, b15

El grullo b18

Unión de

tula

b15

San Agustín b7

El banco b14, b15

La paz

Cihuatlán

b9

Cocula b9

El saucillo b15, b13

Palo chino b15,18a, b7

Magdalena b15

Los cuartos b17, b9

Tequila b7

Villa

Hidalgo

b7, b19

Michoacán 4 Queréndaro b7, b9, b15

Charo b18

Jesús María b7

Morelia b7

Altiplano Central

Hidalgo 3 Progreso Mixquihuala

b19,b19,b7,b7,b7,b7,b7,b7,b1,b15,b18,b18,b18,

Teocalco 14, 14, 14, 7,7, 7, 7,7, 13, 13, 13, 17, 17, 18, 18

Cruz Azul b7, b17

Zacatecas 6 Juchipila b7, b18a, b18

Felipe

Angeles

b7, b14

San Luis de Costique

b14

Villanueva b15, b19, b19

Jalpa b9, b7, b18, b17, b19

Moyahua b17, b17, b7

Puebla 5 Quetzalapa b13, b15

Sebastian

Zinacatepec

b15, b15, b15, b15, b15, b17, b18

Cuesta

Blanca

b19, b15

Esperanza b13, b7

Ciudad Serdán

b18, b17, b17, b17, b7

Tlaxcala 1 Huamantla b15, b15, b7, b7, b7, b7, b7, b14, b14, b14, b14,

b18, b17, b17

Región

Centro

Querétaro 2 Cadereyta b7, b14

Camarco b19, b18

Guanajuato 9 San Luis de

la Paz

b14, b9, b13, b14, b14, b7

Irapuato b18, b18, b7

Tomelópez b14, b18

Temporales

Victoria

b17, b15, b15, b18, b18, b18a

Hacienda de

Higueras

Victoria

b18, b18

Milpillas b9

Dolores

Hidalgo

b7

La cuevita b7, b17, b7

Victoria carretera

Juventino

Rosas

b14

Aguascalie

ntes

1 Apozotlán b17, b17

Región Maya Chiapas 3 Chichilca municipio de

Comitan

b17, b17, b7, b7, b7, b7, b7, b7, b7, b7, b13, b13, b13, b13, b13, b13, b19, b19,

Riviera de la Victoria

b7

Rincón

Chamula

b13, b17, b17, b18, b14

Noreste Nuevo

León

1 San cayetno

de vacas

b7, b17

Tamaulipas 3 San Lorencito

7

Rancho

Nuevo

b14, b7, b7

Reynosa b15, 1b9

San Luis

Potosí

1 Entronque

Real de

catorce

b18

Oaxaca Oaxaca 2 Unión

Zapata

b17, b7

Santiago

Tilantongo

b7

7.2 Determinación del tipo sexual de U. maydis mediante Reacción Fuzz.

La técnica in vitro para detectar el tipo sexual del hongo consistió en la observación

y comparación macroscópica y microscópica de las cepas de U. maydis cultivadas que

fueron confrontadas en medio completo con carbón activado, el crecimiento de una colonia

blanca con aspecto algodonoso (Figura 9) nos indicó que las cepas confrontadas se

aparearon y por lo tanto presentaron alelos a y b diferentes y se considera una Reacción

Fuzz positiva (Cuadro 6), el crecimiento de una colonia blanca brillante con aspecto

cremoso se consideró una Reacción Fuzz negativa. La confirmación de una Reacción Fuzz

positiva consistió en la observación del crecimiento micelial en microscopio (Figura 10); la

cepa FB2 se utilizó como control negativo.

.

Figura 9. Prueba de la reacción Fuzz en placa. Las cepas que mostraron reacción positiva se observan

macroscópicamente como una colonia micelial.

.

Figura 10. Morfologia colonial de una reacción Fuzz positiva de cepas de U. maydis.

7.3. Amplificación del locus b por Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Figura 11. Gel de agarosa al 0.8% mostrando productos de PCR correspondiente al gen bE de U.

maydis, tamaño de fragmento esperado señalado con flecha.

7.4 Análisis Bioinformático de las secuencias del locus b de U. maydis de la República

Mexicana.

Los criterios considerados para analizar las secuencias nucleotídicas del locus b de

U. maydis fueron que presentaran un alto porcentaje de cobertura e identidad que varió del

90 al 100% y posteriormente fueron comparadas con la base de datos del NCBI. Es

importante mencionar que a la fecha existen 25 variantes alélicas reportadas (b1, b2, b3, b4,

b5, b6, b7, b19, b14, b12, b18, b18a, b9, b15, b10a, b16, b11, b10, b8, b4a, b4b, b13, b6a,

b6b, b6c), y en nuestro trabajo de las 25 variantes alélicas reportadas encontramos 11

(b7,b14, b15, b19, b18, b1, b17, b13, b9, b18a, y b3), distribuidas en diferentes localidades

y estados de la República mexicana, véase (cuadro) En total se encontraron 52 alelos b7,

este fue el más frecuente y corresponde al 30.4%, el segundo alelo con mayor frecuencia

fue el b18 y corresponde al 14%, el tercer alelo con mayor frecuencia fue el b15 y

corresponde al 12.2%; el alelo b17 corresponde al 10.5%; el alelo b13 corresponde al 9.9%;

el alelo b14 corresponde al 9.3%; el alelo b19 corresponde al 7.6%; el alelo b9 corresponde

al 4%; y los alelos con menor frecuencia fueron el b18a, b3y b1, cada uno corresponde al

0.5% del total de las secuencias analizadas, véase (figura 12). Ver (Figura 13, 14, 15,16,17,

18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26).

Figura 12. Gráfica que muestra la frecuencia de variantes alélicas distribuidas en la República

Mexicana.

Cuadro 6. Variantes alelicas encontradas en los diferentes estados y localidades de la República

Mexicana.

Estado Localidad Muestra

(nomenclatura)

Variante

alelica

Cobertura Identidad

(%)

Coordenadas

Hidalgo

Chiapas

Progreso Mixquihuala

Teocalco

Cruz Azul

Chichilca

Tumor3/cepa13

Tumor7/cepa4

Tumor6/cepa1

Tumor11/cepa1

Tumor11/cepa1

Tumor9/cepa16

Tumor2/cepa3

Tumor8/cepa14

Tumor1/cepa3

Tumor12/cepa2

Tumor1/cepa2

Tumor4/cepa2

Tumor1/cepa4

Tumor 12/cepa2

Tumor 2/cepa2

Tumor 4/cepa 3

Tumor 5/cepa 16

Tumor16/cepa3

Tumor18/cepa3

Tumor17/cepa3

Tumor6/cepa12

Tumor15/cepa2

tumor4/cepa3

Tumor 5/cepa 16

Tumor16/cepa3

Tumor18/cepa3

Tumor17/cepa3

Tumor6/cepa12

Tumor15/cepa2

Tumor4/cepa3

Tumor 13/cepa1

Tumor 3/cepa12

Tumor 4 /cepa5

Tumor14/cepa11

Tumor3/cepa13

Tumor6/cepa12

Tumor1/cepa3

Tumor1/cepa1

Tumor21/cepa1

Tumor23/cepa3

Tumor9/cepa13

Tumor7/cepa7

Tumor22/cepa13

Tumor11/cepa14

Tumor20/cepa3

Tumor18/cepa10

Tumor1/cepa3

Tumor14/cepa3

b19

b7

b1

b15

b7

b18

b7

b18

b7

b18

b7

b19

b7

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b7

b13

b13

b14

b13

b17

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b7

b13

b13

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b13

b17

b18

b7

b7

b14

b17

b7

b7

b18

b7

b17

b7

b17

b7

b7

b7

b7

b13

b19

b13

b7

99

100

85

95

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100

99

100

98

100

99

99

94

99

99

99

100

100

90

98

99

100

89

100

100

90

98

99

100

89

99

90

99

99

99

99

90

99

87

80

96

100

100

99

100

100

97

100

98

98

97

96

98

99

94

94

99

99

98

97

97

97

97

98

91

94

93

97

89

98

98

91

94

93

97

89

98

98

86

99

89

98

97

99

98

97

86

93

97

99

98

98

100

98

91

99

Lat 20 1331 N Lon 99 10 42 W

Lat 20 5 38 N Lon 99 17 27 W

Lat 19 59 26 N

Lon 99 20 44 W

Lat 16 14 49 N

Lon 92 5 46 W

Guanajuato

Rivera de la Victoria

Rincon Chamula

Sebastian

Cuesta blanca

Esperanza

Ciudad Serdán

San Luis de la Paz

Irapuato

Tomelópez

Temporales Victoria

Hacienda de Higueras

Dolores Hidalgo

La cuevita

Victoria

Tumor23/cepa15

Tumor5/cepa9

Tumor8/cepa5

Tumor17/cepa7

Tumor2/cepa2

Tumor23/cepa2

Tumor9/cepa2

Tumor1/cepa9

Tumor1cepa1

Tumor1cepa1

Tumor3/cepa9

Tumor4/cepa10

Tumor1/cepa11

Tumor1/cepa2

Tumor3/cepa7

Tumor 1/cepa2

Tumor1/cepa3

Tumor1/cepa2

Tumor1/cepa1

Tumor8/cepa1

Tumor5/cepa2

Tumor3/cepa2

Tumor1/cepa1

Tumor6/cepa3

Tumor 4/cepa3

Tumor 2/cepa3

Tumor2/cepa2

Tumor2/cepa2

Tumor1/ cepa1

Tumor1/ cepa1

Tumor1/ cepa 2

Tumor1/cepa1

Tumor3/cepa1

Tumor1/cepa3

Tumor 4/cepa1

Tumor4/cepa2

Tumor2/cepa10

Tumor5/cepa7

Tumor1/cepa13

Tumor4/cepa6

Tumor3/cepa9

Tumor5/cepa14

Tumor2/cepa2

Tumor3/cepa1

Tumor3/cepa3

Tumor2/cepa1

Tumor1/cepa3

Tumor7/cepa2

Tumor2/cepa1

Tumor6/cepa3

Tumor4/cepa2

Tumor8/cepa1

b13

b19

b13

b7

b13

b17

b13

b7

b7

b7

b13

b17

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b14

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b7

b13

b15

b15

b15

b15

b15

b17

b15

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b15

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b19

b15

b13

b7

b18

b17

b17

b7

b17

b14

b9

b13

b14

b14

b7

b18

b18

b7

b14

b18

b17

b18

b15

b15

b18

100

98

100

97

100

100

92

99

100

100

100

99

100

99

100

94

90

99

100

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100

99

100

98

98

99

100

100

96

100

98

96

99

99

100

99

100

92

100

100

93

94

100

99

100

91

99

99

100

100

100

100

97

98

98

97

98

98

98

99

96

96

98

88

97

90

88

97

97

100

99

85

99

99

99

98

91

99

99

99

96

99

97

93

91

93

95

99

98

89

99

99

96

97

99

99

94

90

92

98

100

96

95

99

Lat 16 54 14 N

Lon 93 26 46 W

Lat 18 19 52 N

Lon 97 15 11 W

Lat 18 49 22 N

Lon 97 29 27 W

Lat 18 51 55 N

Lon 97 23 21 W

Lat 19 0 56 N

Lon 97 27 39 W

Lat 20 39 7 N Lon 101 21 28 W

Oaxaca

Tlaxcala

Tamaulipas

Unión Zapata

Santiago Tilantongo

Huamantla

San Lorencito

Rancho Nuevo

Reynosa

Reynosa CBG

Juchipila

Felipe Angeles

San luis de Costique

Villanueva

Jalpa

Moyahua

Los balastros

Ixtlán del río

Autlán

El grullo

Unión de Tula

San Agustin

El banco

La Paz Cihuatlán

Cocula

El saucillo

Tumor1/cepa3

Tumor2/cepa2

Tumor3/cepa2

Tumor1/cepa1

Tumor1/cepa2

Tumor5/cepa1

Tumor3/cepa1

Tumor4/cepa2

Tumor1/cepa2

Tumor1/cepa2

Tumor1/cepa 1

Tumor 1/cepa 2

Tumor 1/cepa 3

Tumor 5/cepa 2

Tumor 6/cepa 3

Tumor 1/cepa 3

Tumor 4/cepa 1

Tumor 7/cepa1

Tumor7/cepa 2

Tumor 4/cepa 6

Tumor2/cepa 2

Tumor 1/cepa 1

Tumor 3/cepa 1

Tumor 5/cepa 1

Tumor 3/cepa 3

Tumor 6/cepa1

Tumor4/cepa2

Tumor 1/cepa 1

Tumor 3/cepa 3

Tumor 2/cepa 1

Tumor 1/cepa 2

Tumor 1/ cepa1

Tumor 1 / cepa1

Tumor 3/cepa 1

Tumor 1/cepa 3

Tumor 2/cepa 3

Tumor 2/cepa 1

Tumor 1/cepa 3

Tumor 1/cepa 1

Tumor 3/cepa 1

Tumor 1/cepa 2

Tumor 5/cepa 2

Tumor 5/cepa 1

Tumor 2/cepa 2

Tumor 3/cepa 3

Tumor 4/cepa 2

Tumor 1/cepa 2

Tumor 3/cepa 3

Tumor 1/cepa 2

Tumor 2/cepa 3

Tumor 2/cepa 2

Tumor 1/cepa 3

Tumor 2/cepa 3

Tumor 4/cepa 3

b18a

b18

b18

b9

b7

b7

b17

b17

b14

b17

b7

b7

b7

b15

b7

b7

b14

b18

b15

b17

b7

b14

b14

b7

b7

b14

b17

b7

b14

b7

b7

b15

b19

b18a

b7

b18

b7

b14

b14

b15

b19

b19

b9

b7

b18

b17

b19

b17

b17

b7

b3

b18

b13

b7

96

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99

84

99

99

90

90

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91

99

99

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93

96

100

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98

98

98

41

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96

100

99

88

97

96

100

97

98

60

75

100

99

96

95

100

100

98

100

100

100

100

99

100

98

100

99

99

99

96

97

99

100

88

94

98

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91

99

90

99

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99

99

96

98

95

91

86

96

80

80

98

98

98

98

99

98

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95

96

88

98

96

95

97

95

97

98

98

97

93

92

100

98

84

97

100

96

100

96

99

92

98

Lat 16 55 25 N

Lon 96 24 45 W

Lat 17 27 33 N

Lon 97 13 28 W

Lat 23 23 54 N Lon 99 24 23 W

Lat 21 25 56 N Lon 6 9 00 W

Lat 22 33 3 N Lon 102 47 32 W

Lat 21 58 30 N Lon 102 52 52 W

Lat 21 4 14 N Lon 104 26 40 W

Lat 21 15 45 N

Lon 103 09 35 W

Lat 21 4 9 N

Lon 104 26 53 W

Lat 21 2 11 N

Lon 104 23 39 W

Lat 20 25 9 N

Lon 103 37 8 W

Palo chino

Magdalena

Los cuartos

Tequila

Villa Hidalgo

Entronque Real de catorce

Queréndaro

Charo

Jesús María

Morelia

Cadereyta

Camarco

San cayetano de vacas

Apozotlán

Tumor 1/cepa 1

Tumor 2/cepa 2

Tumor 2/cepa 1

Tumor 3/cepa 2

Tumor 1/cepa 3

Tumor 1/cepa 2

Tumor 1/cepa 3

Tumor 1/cepa 2

Tumor 2 /cepa2

Tumor 1/cepa 2

Tumor 1/cepa 3

Tumor 1/cepa 1

Tumor 2/cepa 2

Tumor 2/cepa 2

Tumor 2/cepa 3

Tumor 1/cepa 3

Tumor 1/cepa 2

Tumor 1/cepa 2

Tumor 2/ cepa 3

Tumor 1 /cepa 1

Tumor 1/cepa 1

Tumor 1/ cepa 3

Tumor 2/cepa 2

Tumor 3/cepa 2

Tumor 5/cepa 2

Tumor 7/cepa 2

Tumor 1 /cepa 3

Tumor 1/cepa 1

Tumor 1/ cepa 3

Tumor 1/cepa 1

Tumor 2/cepa 2

Tumor 1/cepa 3

Tumor 2/cepa 3

Tumor 1/cepa 1

Tumor 1/cepa 3

Tumor 1/cepa 2

b13

b19

b19

b15

b18

b15

b7

b14

b15

b9

b9

b15

b13

b15

b18a

b7

b15

b17

b9

b7

b7

b19

b18

b7

b9

b15

b18

b7

b7

b7

b14

b19

b18

b7

b17

b17

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100

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99

99

99

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100

99

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36

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99

100

100

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100

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100

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97

83

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90

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95

91

91

96

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93

98

100

100

98

99

87

97

99

100

97

90

Lat 19 49 9 N

Lon 104 14 1 W

Lat 19 59 48 N

Lon 104 11 16 W

Lat 20 5 8 N

Lon 104 12 10 W

Lat 19 46 56 N

Lon 104 14 14 W

Lat 20 21 38 N

Lon 103 53 11 W

Lat 21 1 40 N

Lon 104 10 8 W

Lat 19 29 45 N

Lon 104 34 56 W

Lat 20 16 0 N Lon 103 56 2 W

Lat 20 52 38 N Lon 103 48 58 W

Lat 23 50 36 N

Lon 100 48 58 W

Lat 19 48 25 N Lon 100 52 33 W

Lat 19 45 9 N

Lon 101 2 46 W

Lat 20 00 22 N

Lon 102 57 32 W

Lat 20 41 47 N

Lon 99 43 54 W

Lat 21 6 30 N Lon 19 43 14 W

Lat 23 59 01 N

Lon 100 25 27 W

Figura 14. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Aguascalientes con base en la secuencia

nucleotídica del locus b de U. maydis

Figura 14. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Chiapas con base en la secuencia

nucleotidica del locus b de U. maydis.

Figura 13. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Aguascalientes con base en la secuencia


Figura 15. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Guanajuato con base en la secuencia

nucleotídica del locus b de U. maydis

Figura 16. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Jalisco con base en la secuencia


Figura 17. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Nuevo León con base en la secuencia

nucleotídica del locus b de U. maydis.

Figura 18. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Michoacán con base en la secuencia


Figura 19. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Oaxaca con base en la secuencia


Figura 20. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Nayarit con base en la secuencia


Figura 21. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Puebla con base en la secuencia

nucleotidica del locus b de U. maydis

Figura 22. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Querétaro con base en la secuencia


Figura 23. Dendrograma de las variantes alélicas presentes San Luis de Potosí con base en la secuencia


Figura 24. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Tamaulipas con base en la secuencia


Figura 25. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Veracruz con base en la secuencia


Figura 26. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Zacatecas con base en la secuencia


7.5 Análisis AFLP

Se probaron seis combinaciones de oligonucleótidos AFLP, pero cuatro fueron las

mas polimórficas y generaron informacion en los 60 individuos de U. maydis (Cuadro),

colectados en distintas regiones geográficas y localidades de la República Mexicana. Las

cuatro combinaciones de oligonucleótidos selectivos amplificaron un total de 273 productos

de los cuales 267 (98 %) fueron polimórficos y 6 monomórficos (2%) ( Figura 21). El

análisis de varianza molecular (AMOVA) indicó la existencia de diferencias significativas

(p<0.0001) entre estados en U. maydis. Asimismo, se observó que el factor estado explicó

la mayor parte de la varianza detectada en el AMOVA (92 %) (Cuadro 8), en cambio el

factor de variación dentro de poblaciones solo explicó el (8%) de la varianza; el valor Fst

obtenido fue de 0.07 el cual explica que existe una diferenciación genética moderada. El

análisis de conglomerados con base en datos AFLP (Figura 22) mostró la formación de dos

grupos principales de individuos de U. maydis, donde las distancias genéticas variaron de

2.3 a 6.2 %. En primer lugar se agrupan los especímenes de U. maydis colectados de

Hidalgo, Guanajuato, Zacatecas y Jalisco con distancias genéticas que varían de 2.8-3.5 %.

En el segundo grupo están incluidos los especímenes de U. maydis colectados en los

estados de Tamaulipas, San Luis Potosí, Querétaro, Nayarit, Tlaxcala, Chiapas, Puebla, y

Michoacán con distancias genéticas que varían de 2.3- 6.3. Sin embargo los especímenes de

U. maydis no se agruparon con base en las regiones de mayor diversidad de las razas de

maíz, aunque los especímenes de U. maydis colectados de la región noreste son los únicos

incluidos dentro de un mismo grupo. Con los especímenes de U. maydis empleados para los

AFLP, se realizó un dendrograma con base en las secuencias nucleotídicas, en el cual se

formaron claramente 6 grupos de conglomerados, se observó que se agruparon en base al

tipo de variante alélica, el alelo b18 formó el mayor grupo, el alelo b7 formo dos grupos, el

alelo b14, b15 y b19, están agrupados claramente; el alelo b18 fue el más frecuente y el

alelo b3 es el menos frecuente, según el dendrograma el alelo b7 esta mas estrechamente

relacionado con el alelo b19 y b13, los alelos b3 y b9 también están estrechamente

relacionados, el alelo b17 tiene una relación menor con respecto al b7, b19, b13, b14, b18,

b15,b3, b9.

Cuadro 7. Aislamientos de U. maydis sometidos al análisis AFLP

Estado Localidad No. De Muestras

Hidalgo Teocalco 15/2 6

Teocalco 7/1

Teocalco 12/2

Progreso 9/16

Progreso 3/13

Progreso 7/4

Oaxaca Santiago Tilantongo 1/2 1

Tlaxcala Huamantla 4/1 3

Huamantla 5/2

Huamantla 7/1

Chiapas Rincón Chamula 1/11 7

Rincón Chamula 3/15

Chichilca Comitan 7/7




Rivera de Victoria 21/1

Guanajuato SLPZ 21/1 8

SLPZ 2/10

SLPZ 3/9

Temporales 7/2

Hacienda de Higueras 2/2

Milpillas 1/1

Dolores Hidalgo 1/1

Irapuato 2/2

Puebla Esperanza 1/1 3

Sebastian 5/2

Quetzalapa 3/2

Tamaulipas Rancho Nuevo 2/1 3

Rancho Nuevo 3/3

San Lorenzo 1/1

Jalisco El grullo 1/3 8

Autlan 1/2

Autlan 2/2

Palo chino 1/3

Los cuartos 1/2

Magdalena 1/2

Hastotipaquillo 1/1

Autlan 1/3

Nayarit Los balastros 2/2 3

Ixtlan del rio 4/3

Ixtlan del rio 2/3

Michoacan Querendaro 7/2 3

Queredaro 9/2

Querendaro 5/2

Queretaro Cadereyta 1/1 2

Camarco 1/3

Zacatecas Villa Nueva 2/3 8

Villa Nueva 5/2

Apozotlan 3/3

Villa Nueva 3/1

Juchipila 3/1

Jalpa 4/2

Jalpa 3/3

Juchipila 2/3

SLP Real de Catorce 1/2 2

Real de Catorce 2/2

Nuevo León San Diego de Vacas 1/1 1

Figura 21. Productos AFLP de individuos de U. maydis colectados de diferentes localidades y estados de

la República Mexicana. M pb = Marcador de pares de bases; * Numero de accesión.

Cuadro 8. Productos AFLP amplificados por combinación en especímenes de U. maydis

Combinación AFLP Productos amplificados

Monomórficos Polimórficos Total

Polimorfismo (%)

AG/AC 1 45 46 97.8

AG/AT 1 64 65 98.4

AG/AG 2 102 104 98.0

AC/ AC 1 57 58 98.2

Total/Media 1 67 273 98.1

Cuadro 9. Análisis de Varianza Molecular de diferentes individuos de U. maydis colectados de

diferentes localidades y estados de la República Mexicana.

Fuente de

Variación Suma de

Cuadrados

Grados

de

libertad

Cuadrados

Medios

p-valor Iter. # varianza

explicada

(%)

Entre

estados

15433.18 11.00 1403.02 < 0.0001 750 92

Dentro de

poblaciones

1343.98 36.00 37.09 < 0.0001 750 8

Total 16777.16 54 310.69 100

27. Dendrograma de las relaciones geneticas de U. maydis con base en el metodo UPGMA entre estados

de la Republica Mexicana.

.

.

VIII. DISCUSIÓN

A la fecha se han reportado 25 variantes alélicas en el locus b de U. maydis, en el

presente trabajo fueron analizadas 173 secuencias nucleotídicas de dicho locus, para

conocer la diversidad de variantes alélicas presentes en diferentes localidades, estados y

regiones de la República mexicana, en nuestro trabajo solo se encontraron 11 variantes

alélicas (b7, b14, b15, b19, b18, b1, b17, b13, b9, b18a, y b3) de un total de 26, y los que

no encontramos fueron (b2, b4, b5, b6,b12,b10, b10a, b11, b16, 4a, 4b, 6a, 6b, 6c,); era de

esperarse que como México es el centro de origen del maíz domesticacin, y mayor

diversidad, por la estrecha coevolución que tiene con U. maydis también estarían presentes

la mayoría de las variantes alélicas y sin embargo no fue así, probablemente se debe a que

los que no encontramos no son tan frecuentes, o valdría la pena analizar un mayor número

de muestras es posible que en los estados y localidades no muestreados estén presentes. En

total de las secuencias analizadas el alelo b7 fue el más frecuente y el menos frecuente fue

el b1 ya que solo se encontró en la localidad de Progreso Mixquihuala, (Saleh y col., 2006)

reportan haber identificado 8 variantes alélicas (b1, b2, b3, b4, b5, b6, b7 y b8) en 7

localidades de Egipto, a diferencia de nosotros ellos identifacarón con frecuencias iguales

los alelos b1, b3 y b8, siendo los alelos b4 y b6 los menos frecuentes, los alelos

identificados que tenemos en común con (Saleh y col., 2006) son el b1, b3 y b7. Jalisco fue

el estado donde se encontró una mayor diversidad de variantes alélicas en dicho estado

están presentes 10 alelos b de un total de 11, en Jalisco el alelo b15 fue el mas frecuente y

esta disperso en 5 localidades diferentes, en este estado no se observo que existirá relación

geográfica con algún tipo de variante alelica; en el estado de Gto.se muestrearon 6

localidades y también se encontraron 6 alelos b diferentes, se observó que existe una

relación geográfica entre las localidades del Norte de Guanajuato (San Luis de la Paz y

Victoria) con el alelo b14, esto se debe posiblemente a que dichas localidades son cercanas;

es importante mencionar que el alelo b14 también fue el más frecuente en Guanajuato; por

otro lado también se observo que existe una relación geográfica entre las localidades del

centro de Gto.( Irapuato y Tomelópez) con el alelo b18, ya que este tipo de alelo no se

encontró en ninguna otra localidad de Gto. Hidalgo es el segundo estado con mayor

diversidad de variantes alélicas ya que se identificaron 8 de un total de 11, siendo el alelo

b7 el mas frecuente, cabe mencionar que de todos los estados analizados la variante alélica

b7 se identificó con mayor frecuencia en dicho estado; en el estado de Puebla se

identificaron 5 variantes alélicas diferentes, siendo el b15 el más frecuente y se observo que

existe una relación geográfica y el tipo de variante alelica en la localidad de Sebastian con

el alelo b15; en el estado de Zacatecas se identificaron 7 variantes alélicas diferentes y 2

están en frecuencias iguales (b19 y b17), en esta caso no observó que alguna variante

alélica tuviera afinidad con alguna localidad o bien con el mismo estado como en los casos

anteriormente mencionados. En el estado de Oaxaca a pesar de que solo se analizaron dos

localidades diferentes observamos que en la localidad de Santiago tilantongo únicamente

está presente el alelo b7, en Tlaxcala a pesar de que solo se analizó un localidad están

presentes 5 tipos de alelos diferentes, siendo el mas frecuente el b7. En el estado de San

Luis Potosí solo se analizó una localidad encontrándose únicamente el alelo b18; y en

Nuevo león se analizaron 2 localidades y en una identificamos el alelo b7 y en la otra el

b17, en el caso del estado de Nayarit se analizaron 2 localidades diferentes encontrándose 4

alelos diferentes (b13, b7, b18, y b3), en la localidad de Ixtlán del Rio el alelo b13 es el mas

frecuente, En Michoacán encontramos 5 variantes alélicas diferentes y en la localidad de

Queréndaro están presentes (b7, b9, y b15); en Querétaro fueron analizadas 2 localidades

diferentes en la primera se encuentran (b19, y b18), en la segunda estan presentes el alelo

(b14 y b7), Finalmente en nuestro trabajo se incluyó el estado de Tamaulipas porque

observamos que existen varios ejidos en los que se siembra maíz y nos pareció interesante

conocer que variantes alélicas del locus b de U. maydis están presentes, los alelos b

identificados fueron (b19, b15,b14 y b7), siendo el b7 el más frecuente. Finalmente

podemos decir que solo en algunos casos mencionados líneas atrás, si existe relación

geográfica con el tipo de variante alelica.

Por otro lado en la región occidente se encuentran la mayoría de los alelos b

encontrados a excepción de los alelos b1 y b18a esto concuerda que en dicha región

también se siembran varios tipos de maíz según (Muñoz, 2005) que son aproximadamente

10 razas (Chapalote, Reventador, Tablilla de ocho, Tabloncillo, Harinoso de ocho, Maíz

dulce, Maíz conejo, Cónico Norteño, Celaya, y Jala) ; La Región del Altiplano Central es la

segunda región donde existen varias razas de maíz y también en nuestro trabajo la segunda

con mayor diversidad de variantes alélicas ( b1, b7, b13, b14, b15, b17, b18 y b19) en dicha

región según (Muñoz, 2005) están presentes 8 razas diferentes de maíz ( Palomero,

Toluqueño, Cónico, Cacahuacintle, Elotes cónicos, Pepitilla, Ancho, y Chalqueño ; en la

Región Centro también se encontraron 8 variantes alélicas diferentes, finalmente según

(Muñoz, 2005) en la Región Maya existen 7 razas de maíz diferentes (Nal- tel Olotillo,

Olotón, Tehua, Tepecintle, Vandeño y Comiteco) y en el presente trabajo en dicha región

también existe el menor número de variantes alélicas (b7, b13, b14, b17, b18 y b19), con

base en lo anterior se puede sugerir que existe una relación proporcional entre la diversidad

de variantes alélicas con las regiones donde se siembran varias razas de maíz, es decir a

mayor número de razas de maíz mayor numero de variantes alélicas. Con base en los

resultados obtenidos en la presente investigación se sugiere que 10 de las variantes alélicas

encontradas ninguna está relacionada con una raza de maíz, ya que por ejemplo el alelo b7

esta distribuido en todas las regiones analizadas y entre ellas no existen razas de maíz en

común, sin embargo el alelo b1 únicamente se encontró en la región Altiplano Central.

El análisis AFLP detectó alto nivel de polimorfismo (98%) en las poblaciones de U.

maydis analizadas y discriminó entre individuos de uno y otro estado, el análisis de

conglomerados mostró la formación de dos grupos de especímenes de U. maydis de

acuerdo a su origen, los especímenes de estados más cercanos (Guanajuato, Jalisco,

Hidalgo y Zacatecas) formaron un grupo, y los especímenes oriundos de estados más

lejanos ( Nayarit, Chiapas, Tamaulipas y San Luis Potosí, Tlaxcala, Puebla y Michoacán)

están incluidos en otro grupo. Genéticamente los especímenes del estado de Michoacán son

los más diferentes en comparación con el resto de los estados, y los especímenes de U.

maydis de los estados de Guanajuato y Zacatecas fueron genéticamente los más parecidos;

pero en el trabajo de (Valverde y Col., 2000) con base en algoritmo UPGMA observaron

que entre los estados de Oaxaca y Pachuca existe la mayor identidad poblacional. La

diversidad genética de U. maydis entre estados fue alta (92%); (Saleh y col., 2006)

realizaron análisis de diversidad genética de U. maydis en siete diferentes localidades de

Egipto y la diversidad genética encontrada entre poblaciones fue del (85.86%). En sus

trabajos (Valverde y Col., 2000) y (Zambino y Col., 1997) mencionan haber encontrado

mayor diversidad genética en escalas espaciales pequeñas que en escalas macro

geográficas. En el presente trabajo se analizaron especímenes de U. maydis de 39

localidades diferentes de la República mexicana y a pesar de que (Saleh y col., 2006) solo

analizaron 7 localidades, también obtuvieron un alto porcentaje de diversidad genética; es

importante mencionar que mediante análisis RAPD (Saleh y col., 2006) analizaron solo

diez muestras de U. maydis pertenecientes a cuatro localidades diferentes de Egipto y

reportan un polimorfismo del 67.50%. Los resultados obtenidos en el presente trabajo en

cuanto a diversidad genética y polimorfismo son más altos, debido a que se analizaron un

mayor número de especímenes y de localidades comparado con el trabajo de (Saleh y col.,

2006). Los especímenes de U. maydis no se agruparon con base a la región de origen, ya

que en el primer grupo de conglomerados están incluidas cuatro regiones diferentes de las

seis que se analizaron, y en el segundo grupo tampoco se observó agrupamiento de las

regiones pero en este caso están incluidas todas las regiones de mayor diversidad de las

razas de maíz; las muestras de U. maydis colectadas en la región noreste están incluidas en

el segundo grupo, lo anterior demuestra la amplia diversidad genética de dicha especie y

por lo tanto es de suponer que a mayor diversidad genética mayor recombinación genética

y también mayor número de variantes alélicas en el locus b de U. maydis.(Valverde y

col.,2000) mediante análisis RFLP analizaron la diversidad genética de 32 especímenes de

U. maydis pertenecientes a cinco estados diferentes de la República Mexicana distribuidos

en el norte, centro y sur del país, trabajo en el cual reportan un alto grado de polimorfismo

y una amplia diversidad genética de dicha especie, distribuida en todos los sitios analizados

( Irapuato, Oaxaca, Pachuca, Toluca y Culiacán) lo cual coincide con el presente trabajo;

cabe mencionar que (Valverde y col.,2000) concluyen en su trabajo que no existe una

correlación entre distancias genéticas con distancias geográficas, altitud, o precipitación

anual en poblaciones de U. maydis; en el presente trabajo también se observó que no existe

una correlación entre distancias genéticas con distancias geográficas por región ni por

estados de los especímenes de U. maydis analizados. Por ejemplo a pesar de que el estado

de Michoacán se encuentra geográficamente más cerca de Gto., Hidalgo, Zacatecas y

Jalisco, presenta la mayor distancia genética. Nuestros resultados demostraron que la

técnica AFLP es una herramienta capaz de detectar la variación genética en poblaciones de

U. maydis, además de discriminar las poblaciones entre estados.

IX. CONCLUSIONES

La variabilidad genética de U. maydis en la República Mexicana es significativa y

los aislamientos pueden diferenciarse con base en su origen geográfico.

Existen 11 variantes alélicas (b7, b14, b15, b19, b18, b1, b17, b13, b9, b18a, y b3),

distribuidas en la República Mexicana.

X. RECOMENDACIONES

Resultaría interesante el estudio y evaluación de un mayor número de muestras de

U. maydis de las regiones del Norte y Sur de México, con la finalidad de obtener un

panorama más amplio de la distribución de las variantes alelicas.

También resultaría interesante evaluar un mayor número de aislamientos para tener

conocimiento de las localidades y estados que presentan mayores niveles de diversidad

genética, ya que en el presente trabajo únicamente sesenta aislamientos fueron sometidos al

análisis.

Existen escasos trabajos como el que aquí se describe, se sugiere que se continúe

desarrollando investigaciones sobre U. maydis ya que sus características biológicas,

bioquímicas, genéticas, moleculares, patogénesis y gastronómicas, lo han hecho atractivo

para la ciencia.

XI. BIBLIOGRAFÍA

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XII. GLOSARIO

Basidiomiceto = basidios. Son hongos con micelio tabicado que producen esporas en

estructuras especializadas llamadas

Buffer = Solución amortiguadora.

Dendrograma = Representación grafica de datos en forma de árbol que organiza los datos

en subcategorias que se van dividiendo en otros hasta llegar al nivel de detalle deseado.

Diversidad = Diferencia entre las características de un conjunto o entre los de una misma

clase.

Iniciador = Secuencia sintética de oligonucleótidos que se utiliza para reconocer por

apareamiento complementario secuencias blanco en ADN molde, que consiste

generalmente en ADN genómico.

MseI = Enzima de restricción derivada de Micrococcus species que corta el ADN dentro de

cada una de las cadenas de forma palíndrome (5'…T▼TAA…3').

PstI = Enzima de restricción producida por el microorganismo Providencia stuartii que

posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble dependiente de una secuencia no

metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera

extremos cohesivos.

Radioisótopos = a aquel isótopo que es radiactivo e indica que todos los tipos de átomos de

un mismo elemento se encuentran en el mismo sitio de la tabla periódica.

http://es.wikipedia.org/wiki/Basidio

http://es.wikipedia.org/wiki/Hongo

http://es.wikipedia.org/wiki/Micelio

http://es.wikipedia.org/wiki/Espora

http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima_de_restricci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismo

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Providencia_stuartii&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Diana_de_restricci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/ADN

http://es.wikipedia.org/wiki/Pal%C3%ADndromo

http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima

http://es.wikipedia.org/wiki/Hidrolasa

XIII. ANEXOS

Figura 9. Representación esquemática de las secuencias parciales alineadas de los 25 alelos b de U. maydis, a apartir de las zonas en verde

(Homeodominio), punteada (Región intergénica y café (Región variable), se realizó el análisis de las secuencias. Las líneas en azul y rojo

delimitando la zona de estudio.

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