Life Sciences

Medio cromatográfico de intercambio iónico HyperCel™ STAR AX

USD 2831(2)

Medio cromatográfico para cromatografía deintercambio aniónico con recuperación avanzada y tolerancia a la salMedio cromatográfico para cromatografía de intercambio aniónico escalable para la industria diseñado para una elevada productividad en la captura de proteínas y la eliminación de impurezas con una conductividad por la sal moderada o mayor (2 a 15 mS/cm), típica de materias primas biológicas no diluidas (p. ej., sobrenadante de cultivos de células de mamífero, materia prima de E. coli, plasma, otros).

Filtration. Separation. Solution.SM

2

El medio cromatográfico HyperCel STAR AX se fabrica a gran escala, y satisface las necesidades de los usuarios industriales y de las autoridades reguladoras. Se dispone de un Archivo de apoyo para las autoridades reguladoras (RSF) para ayudar a los usuarios al desarrollo de procedimientos de valoración. Este medio cromatográfico ofrece:

Elevada capacidad de unión dinámica (CUD) con tiempos de residencia cortos (2 min o menos)

Captura directa de proteínas o eliminación de impurezas de materias primas no diluidas con conductividad moderada o elevada

Excelentes propiedades de caudal para procesamiento de materias primas rápidas

Selectividad diferencial, que abarca un amplio intervalo deconductividad (2 – 15 mS/cm)

Mejora de la economía del proceso

DescripciónEl medio cromatográfico HyperCel STAR AX está formado por una matriz de celulosa rígida que tiene propiedades de flujo excelentes y genera una contrapresión baja, compatible con las necesidades la producción de proteínas a escala de fabricación. El medio cromatográfico está disponible en diversas configuraciones de empaquetado, como las placas de 96 pocillos AcroPrep™ ScreenExpert diseñadas para el cribado temprano de resinas adecuadas para la purificación de proteínas, además de cómodas columnas PRC preempaquetadas de 1 mL y 5 mL diseñadas para la optimización de métodos rápidos, el cribado selectivo o el trabajo con preparaciones pequeñas. El medio cromatográfico HyperCel STAR AX se presenta como una pasta diluida/suspensión en NaCl 1 M que contiene el 20% (v/v) de etanol, o como una torta húmeda para aplicaciones a escala de procesamiento (el medio cromatográfico en forma de torta húmeda facilita la transferencia del medio cromatográfico, evitando la agitación y la suspensión de grandes volúmenes de material).

El medio cromatográfico HyperCel STAR AX tiene una estabilidad clínica que garantiza la facilidad de la limpieza in situ (LIS) y el almacenamiento. Para la LIS estándar se recomienda el tratamiento con NaOH 0,5 a 1 M, mientras que es posible el almacenamiento a largo plazo en NaOH 10 a 100 mM.

Tabla 1

Propiedades principales

Tamaño de partícula medio 80 μm

Ligando de intercambio iónico Amina primaria

Capacidad de unión dinámica1 >100 mg APB/mL con intervalo de pH 7,5 – 8,0 y conductividad 15 mS/cm

Intervalo operativo típico deconductividad de la materia prima

2 – 15 mS/cm

Condiciones de limpieza recomendadas2

NaOH 1 M

1. Determinado utilizando APB 5 mg/mL en Tris-HCl 25 mM, NaCl 0,14 M con un tiempo

de residencia de 2 min.

2. Inyección de 5 volúmenes de columna (VC) de NaOH 0,5 – 1 M, tiempo de contacto de 1 hora.

El medio cromatográfico HyperCel STAR AX es muy fácil de empaquetar y desempaquetar en el laboratorio, en columnas piloto y columnas a escala de producción, y tiene propiedades de flujo excelentes, compatibles con los requisitos de los procesos de producción avanzados.

El medio cromatográfico se puede empaquetar en amortiguadores económicos estándar. Por ejemplo, una columna de 200 mm de DI x 150 mm de altura empaquetada en un amortiguador de NaCl 10 mM se puede manejar a menos de 1,5 bar (22 psi) de contrapresión (Figura 1).

El rendimiento del empaquetado es compatible con las condiciones de columnas desde el uso de laboratorio hasta gran escala (400 mm de DI), los valores típicos de N/m para > 2000 placas y factores de asimetría (FA) son 1,0<FA<1,4.

Figura 1Relación presión-caudal del medio cromatográfico HyperCel STAR AX

0 200 400 6000

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Pres

ión

(bar

)

Velocidad lineal (cm/h)

Columna: 200 mm de DI x 150 mm de altura del lecho. Amortiguador de empaquetado: NaCl 10 mM

Características y ventajasElevada capacidad de unión dinámica en amplias condiciones de funcionamiento de conductividad: evita la dilución de la materia prima y facilita el procesamiento en sentido distal

Figura 2Relación entre la capacidad de unión dinámica y el tiempo de residencia, en función del pH y la conductividad del medio cromatográfico HyperCel STAR AX

7 7,25 7,5 7,75 8 8,25 8,5

4

6

8

10

12

14

16

18

20

4

6

8

10

12

14

16

18

20

4

6

8

10

12

14

16

18

20

7 7,25 7,5 7,75 8 8,25 8,5 7 7,25 7,5 7,75 8 8,25 8,5

60

80 100

120

140

160

180

6080

100

120

140

160

180

200

6080 100

120

140

160

180200

Tiempo de residencia = 1 min Tiempo de residencia = 2,5 min Tiempo de residencia = 4 min

Cond

uctiv

idad

pH pH pH

Columna: 0,5 cm de DI x 5 cm de altura del lecho (~1 mL). Muestra: 5 mg/mL de APB en amortiguador de equilibrio. Amortiguador de equilibrio: Tris-HCl 25 mM, pH 7,0 – 8,5. Conductividad 3 – 20 mS/cm. Tiempo de residencia: 1 – 4 min (0,25 – 1 mL/min). Los números indican la capacidad de unión a APB en mg/mL de medio cromatográfico.

3www.pall.com

Se realizó un estudio con diseño experimental (DE) para analizar la influencia de diversos valores de pH (7,0 a 8,5), conductividad (3 a 20 mS/cm) y tiempo de residencia (1 a 4 min) sobre la capacidad de unión dinámica a la albúmina plasmática bovina (APB) utilizada como modelo.

Los datos muestran el efecto del pH y la conductividad sobre la CUD a APB en el medio cromatográfico HyperCel STAR AX. Los gráficos de contorno de la Figura 2 muestran que el medio cromatográfico consigue una elevada CUD (> 100 mg/mL) en un amplio intervalo de valores de pH y conductividad con tiempos de residencia cortos, lo que permite una flexibilidad y una productividad óptimas de los procesos.

Figura 3Capacidad de unión dinámica del medio cromatográfico HyperCel STAR AX a la albúmina plasmática humana (APH) procedente de plasma no diluido y diluido

0

5

10

15

20

25

30

35

40

HS

Am

g/m

L

Hyp erC el S TAR AX DE AE rigid agaros e

7 mS/cm

11 mS/cm

HyperCel STAR AX DEAE-agarosa rígida

APH

mg/

mL

La Figura 3 muestra la CUD a la APH del medio cromatográfico HyperCel STAR AX comparado con un medio cromatográfico de intercambio aniónico convencional de DEAE-agarosa rígida con valores de conductividad correspondientes a plasma no diluido (11 mS/cm) y diluido (7 mS/cm).

Los datos que se muestran en la Figura 3 confirman que la CUD se ve menos afectada por la conductividad en el intervalo de 7 – 11 mS/cm que el medio cromatográfico convencional. Esto permite la carga directa de plasma no diluido en el medio cromatográfico HyperCel STAR AX.

Combinado con estas excelentes características de flujo con contrapresiones bajas (Figura 1), se pueden procesar directa y rápidamente grandes volúmenes de materia prima, lo que aumenta el rendimiento total del proceso y reduce el riesgo de degradación de las proteínas.

La elevada capacidad de unión facilita el funcionamiento con columnas de volumen y espacio pequeños, lo que permite una reducción adicional de los requisitos de volumen de amortiguador, y permite ahorros de equipo y reducción de los costes de inversión de los medios cromatográficos.

Excelente selectividad y eficiencia de separación en un amplio intervalo de valores de conductividad

Figura 4Separación de una mezcla de proteínas en el medio cromatográfico HyperCel STAR AX a 10 mS/cm.

0

20

40

60

80

mUA

0 10 20 30 40 50 60 Ml

Citocromo C

TransferrinaAlbúmina

Gradiente de conductividad

Columna preempaquetada HyperCel STAR AX PRC de 1 mL; mezcla de 100 µl (2 mg/mL de citocromo C, 10 mg/mL de transferrina humana, 10 mg/mL de albúmina plasmática bovina [APB]). Carga: Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, 10 mS/cm. Elución: gradiente 0 – 50% Tris-HCl 25 mM, pH 8,0 + NaCl 1 M.

La selectividad del medio cromatográfico es un parámetro fundamental para discriminar entre la proteína diana y la contaminación de la materia prima. El estudio de la selectividad del medio cromatográfico es fundamental, y se debe realizar en fases tempranas del desarrollo del proceso.

Se puede conseguir el cribado rápido y la optimización de las condiciones utilizando una columna preempaquetada PRC de 1 mL de Pall. Una vez que se ha seleccionado la química adecuada, se pueden optimizar las condiciones de uso en una columna PRC de 5 mL aumentando al doble la altura. Se pueden conectar en serie dos columnas de 5 mL para aumentar la altura del lecho de la columna hasta 20 cm, y modelar mejor las condiciones reales en aplicaciones a escala piloto o para aplicaciones desescaladas. También se pueden conectar en serie columnas de 1 mL.

Debido a la diferencia de la estructura de las microesferas, la química del ligando y la densidad de carga iónica específica, como se muestra en la Figura 4, la selectividad y la eficiencia de la separación del medio cromatográfico HyperCel STAR AX se mantienen en un amplio intervalo de valores de conductividad.

Aplicaciones y ejemplos

Las aplicaciones incluyen la captura directa de proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales y policlonales, derivados del plasma u otros productos radiofarmacéuticos.

Debido a su capacidad de capturar directamente las proteínas a partir de materias primas no diluidas, el medio cromatográfico HyperCel STAR AX también se puede utilizar para la eliminación temprana de contaminantes (p. ej., proteínas de las células del anfitrión de ovario de hámster chino, CHO), antes de la purificación de la proteína específica, por ejemplo, antes de la captura de AcM en un paso de afinidad por la proteína A.

4

Aplicación 1. Captura directa de albúmina a partir de plasma no diluido

El objetivo es evaluar el medio cromatográfico HyperCel STAR AX como primer paso en una secuencia de purificación en dos pasos para capturar la albúmina plasmática humana (APH) a partir de plasma no diluido (conductividad 11 mS/cm). El medio cromatográfico HyperCel STAR AX se utilizó como primer paso de captura, seguido por un paso de intercambio catiónico ortogonal realizado con medio cromatográfico S HyperCel, sin ajuste del pH ni de la conductividad del plasma. Se cargó plasma no diluido puro (pH 7,6, 11 mS/cm) con CUD de 30 mg/mL (véase Figura 3).

Se realizó un diseño experimental (DE) en placas filtrantes de 96 pocillos (placas filtrantes AcroPrep™ Advance, Pall) para determinar las condiciones óptimas para conseguir el mejor cociente rendimiento/pureza (en la Figura 5 se muestra un ejemplo de la optimización de las condiciones de lavado/elución).

Posteriormente se transfirieron estas condiciones a la cromatografía en columna de las columnas preempaquetadas PRC de Pall (Figura 6).

Figura 5Efecto de las condiciones de lavado (L) y de elución (E) sobre la pureza de la APH y el rendimiento de la elución (en porcentaje) de la medio cromatográfico HyperCel STAR AX (diseño experimental en placas filtrantes de 96 pocillos)

7,57,06,56,05,5

20

15

10

5

5,55,04,54,03,5

50

30

40

20

10

< 8888 – 9090 – 9292 – 9494 – 9696 – 98> 98

<4040 – 6060 – 8080 – 95> 95

pH del lavado pH de la elución

Cond

uctiv

idad

del

lava

do (m

S/cm

)

Cond

uctiv

idad

de

la e

lució

n (m

S/cm

)

Condición de lavado óptima

Valores de retención

Condición de elución óptima

Pureza (%)

Valores de retención

Rendimiento (%)

pH E 3,5Cond. E 2,0

pH L 7,5Cond. L 2,0

7,57,06,56,05,5

20

15

10

5

5,55,04,54,03,5

50

30

40

20

10

< 8888 – 9090 – 9292 – 9494 – 9696 – 98> 98

<4040 – 6060 – 8080 – 95> 95

pH del lavado pH de la elución

Cond

uctiv

idad

del

lava

do (m

S/cm

)

Cond

uctiv

idad

de

la e

lució

n (m

S/cm

)

Condición de lavado óptima

Valores de retención

Condición de elución óptima

Pureza (%)

Valores de retención

Rendimiento (%)

pH E 3,5Cond. E 2,0

pH L 7,5Cond. L 2,0

La Figura 5 muestra que el rendimiento de la APH depende principalmente de las condiciones de la elución (zona óptima: pH 3,5 – 4,2 y conductividad 2 – 27 mS/cm), mientras que la pureza depende principalmente de las condiciones de lavado (el lavado a conductividad elevada a >15 mS/cm mejora la pureza).

Figura 6Transferencia de las condiciones determinadas en placas de 96 pocillos a la columna preempaquetada de HyperCel STAR AX PRC de 1 mL.

mL100

2500mUA

2000

1500

1000

500

0

.

FT W1 W2

E

20

FT W1 W2 E PTF para la carga de plasma puro Lavado 1

Lavado 2, pH 7,5, 20 mS/cm

Elución, pH 4,0, 2 mS/cm

AlbúminaIgG

TransferrinaAlbúmina

P = Plasma

Las condiciones determinadas en las placas de 96 pocillos se aplicaron a la cromatografía del plasma no diluido en el medio cromatográfico HyperCel STAR AX en una columna preempaquetada PRC de 1 mL. El cromatograma (Figura 6) y el análisis de SDS-PAGE de las fracciones confirmaron que la mayoría de los contaminantes se eliminaban mediante lavado a conductividad elevada, lo que dio lugar a una fracción de APH con una pureza del 99% en un único paso, con un rendimiento del 90%.

Además, como ya se ha mostrado en la Figura 3, el medio cromatográfico HyperCel STAR AX utilizado en el paso de captura con plasma no diluido tenía una CUD >30 mg/mL, más de 2 veces mayor que la de un medio cromatográfico de DEAE-agarosa convencional estudiado en estas condiciones.

La APH se eluyó mediante una reducción simple del pH (4,0), sin adición de sal, lo que permitió la carga directa en una columna de intercambio catiónica ortogonal (medio cromatográfico S HyperCel).

Este último paso de pulido en el medio cromatográfico S HyperCel llevó a una fracción purificada de APH eluida a pH 7,0 con una pureza >99%, y una capacidad de aproximadamente 65 mg/mL (Tabla 2).

Tabla 2

Purificación en dos pasos de albúmina plasmática humana procedente de plasma no diluido.

Carga Capacidad (mg/mL)

Rendimiento Pureza

Captura en medio cromatográfico HyperCel STAR AX

Plasma no diluido

> 30 mg/mL 90% 99%

Pulido en medio cromatográfico S HyperCel

Eluato a pH 4,0 obtenido del medio cromatográfico HyperCel STAR AX

65 mg/mL 95% > 99%

5www.pall.com

Aplicación 2. Extracción temprana de POHC antes de la captura de un anticuerpo monoclonal (AcM) con Protein A

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del paso previo de purificación utilizando el medio cromatográfico HyperCel STAR AX antes de la captura con el medio cromatográfico convencional Protein A de un anticuerpo monoclonal (AcM) de una materia prima procedente de un cultivo celular de mamífero (Figura 7).

Se comparó el contenido de las POHC (proteínas de ovario de hámster chino) contaminantes utilizando un método de análisis de ELISA comercial para los dos esquemas de purificación que se muestran en la Figura 7.

Figura 7

Esquemas convencional y alternativo de purificación de AcM que incluyen el paso de previo de purificación con medio cromatográfico HyperCel STAR AX

40033003620004130000

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

Con

teni

do d

e P

OH

C x

1000

(ppm

)

SCC Proteína AHyperCelSTAR AX

HyperCelSTAR AX

+ Proteína A

SCCPOHC: 413.000 ppm

HyperCel STAR AXmodo TF

POHC: 362.000 ppm

Proteína A(modo unión/elución)

POHC: 400 ppm

Proteína A(modo unión/elución)

POHC: 3.300 ppm

Los datos muestran que la utilización del medio cromatográfico HyperCel STAR AX antes de Protein A lleva a una mayor reducción de las POHC (>8 veces). Debido a este efecto sinérgico, comenzando con un contenido inicial de proteínas de las células del anfitrión (PCA) de 413.000 ppm, la concentración final de POHC se reduce hasta ~400 ppm (reducción de 3 Log), con una recuperación de AcM del 90%.

Un paso de purificación previo puede influir positivamente en la economía del proceso porque prolonga la vida útil de las costosas columnas Protein A utilizadas como paso estándar para la captura de AcM.

Información sobre pedidosHyperCel STAR AX Medio cromatográfico

Descripción Referencia

5 mL 20197-018

25 mL 20197-026

100 mL 20197-032

1 L 20197-046

5 L 20197-058

10 L 20197-064

Columnas preempaquetadas HyperCel STAR AX PRC

Descripción Referencia

Columna PRC 5x50HyperCel STAR AX, 1 mL

PRCSTARAX1ML

Columna PRC 8x100HyperCel STAR AX, 5 mL

PRCSTARAX5ML

Placas de medio cromatográfico HyperCel STAR AX

Descripción Referencia

Placas AcroPrep ScreenExpert: medio cromatográfico de intercambio aniónico HyperCel STAR AX

96WPSTARAX50

Sede centralPort Washington, NY, USATel. gratuito: +1.800.717.7255 (EE. UU.)Tel.: +1.516.484.5400correo-e: biopharm@pall.com

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