US Patent Cannabis

8/11/2019 US Patent Cannabis

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( 1 2 )Un i t ed S t a t e s Pa ten tHampson e t a l .

US0 0 6 6 3 0 5 0 7 B1

( 1 0 )P a t e n t N 0 . :( 4 5 )Date o f P a t e n t :

U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B 1O c t . 7 , 2 0 0 3

( 5 4 )

( 7 5 )

( 7 3 )

( * )

( 2 1 )

( 2 2 )

( 8 6 )

( 8 7 )

( 6 0 )

( 5 1 )( 5 2 )( 5 8 )

( 5 6 )

CANNABINOIDS AS ANTIOXIDANTS ANDNEUROPROTECTANTS

I n v e n t o r s :A i d a n J . Hampson, I r v i n e ,CA U S ) ;J u l i u s A x e l r o d ,R o c k v i l l e ,MD U S ) ;M a u r i z i oG r i m a l d i , B e t h e s d a ,MD( U S )

A s s i g n e e : Th e Uni ted S t a t e s o f A mer ica a sr e p r e s e n t e d b y t h e D e p a r t m e n to fH e a l t h a n d Human e r v i c e s ,Wa s h i n g t o n ,D C ( U S )

N o t i c e : S u b j e c t t o a n y d i s c l a i m e r , t h e t e r m o f t h i sp a t e n t i s e x t e n d e d o r a d j u s t e d u n d e r 3 5U . S . C . 1 5 4 ( b )b y 0 d a y s .

A p p l . N o . : 0 9 / 6 7 4 , 0 2 8

P CT i l e d : A p r . 2 1 , 1 9 9 9

P C T N o . : PCT/U S9 9 /0 8 7 6 9

3 7 1 ( 6 X 1 ) ,( 2 ) ,( 4 )D a t e : F e b . 2 , 2 0 0 1

P C T P u b . N o . : W O 9 9 / 5 3 9 1 7

P C T P u b . D a t e : O c t . 2 8 , 1 9 9 9

R e l a t e d U . S . A p p l i c a t i o nDataP r o v i s i o n a l a p p l i c a t i o nN o . 6 0 / 0 8 2 , 5 8 9 , ? l e do n A p r . 2 1 ,1 9 9 8 , a n d p r o v i s i o n a l a p p l i c a t io nN o . 6 0 / 0 9 5 , 9 9 3 , ? l e do nA u g . 1 0 ,1 9 9 8 .

In t . C l . 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . A61K 1 / 3 5

U.S. C l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514/454

F i e l d of Search . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 514/454

R e f e r e n c e s C i t e d

U . S . PATENT DOCUMENTS

2 ,3 0 4 ,6 6 9 A 1 2 / 1 9 4 2 Adams . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 5 6 8 / 7 4 3

4 ,876 ,276 A 1 0 / 1 9 8 9 Mechoulam e t a l . . . . . . . . 514 /454

5 , 2 2 7 , 5 3 7 A 7 / 1 9 9 3 Stoss e t a l . . . . . . . . . . . . . . . .. . 5 6 8 / 8 115 ,284 ,867 A 2/1994 K l o o g e t a l . . . . . . . 514/4545 , 4 3 4 , 2 9 5A 7 / 1 9 9 5 Mechou lam e t a l . 5 6 0 / 1 4 15 , 4 6 2 , 9 4 6A 1 0 / 1 9 9 5 M i t c h e l l e t a l . 5 1 4 / 3 1 55 , 5 1 2 , 2 7 0 A 4 / 1 9 9 6 G h i o e t a l . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 424/45

5 ,521 ,215 A 5 /1996 Mechoulam e t a l . . . . . . . . 514 /4545 , 5 3 8 , 9 9 3 A 7 / 1 9 9 6 Mechoulam e t a l . . . . . . . . 514 /454

5 , 6 3 5 , 5 3 0 A 6 / 1 9 9 7 Mechoulam e t a l . . . . . . . . 514 /4545 , 6 9 6 , 1 0 9A 12/1997 Malfroy-Camine e t a l . . 514/1856 , 4 1 0 , 5 8 8 B1 6 /2002 F e l d m a n n e t a l . . . . . . . . .. . 514 /454

FOREIGN PATENT DOCUMENTS

427518 A 1 5 / 1 9 9 1576357 A 1 1 2 / 1 9 9 3656354 A 1 6 / 1 9 9 5658546 A 1 6 / 1 9 9 5

W O 9 3 0 5 0 3 1 A 1 3 / 1 9 9 3W O 9 4 1 2 6 6 7 A 1 6 / 1 9 9 4W O 9 6 1 2 4 8 5 A 1 5 / 1 9 9 6W O 9 6 1 8 6 0 0 A 1 6 / 1 9 9 6W O 9 7 1 9 0 6 3 A 1 5 / 1 9 9 7

99 /53917 * 10/1999

OTHER PUBLICATIONS

W i n d h o l Ze t a l . ,The Merck I n d e x , Te n t h E d i t i o n ( 1 9 8 3 )p .2 4 1 , a b s t r a c t N o . 1723*Mechoulam e t a l . , A To t a l S y n t h e s i s o f d 1 A 1 T e t r ah y d r o c a n n a b i n o l ,t h eA c t i v e C o n s t i t u e n to f H a s h i s h 1 , J o u rn a l o f t h e A m e r i c a nC h e m i c a lS o c i e t y ,8 7 : 1 4 : 3 2 7 3 3 2 7 5( 1 9 6 5 ) .Mechoulam e t a l . , C h e m i c a lB a s i s o f H a s h i s hA c t i v i t y , S c i e n c e ,1 8 : 6 1 1 6 1 2( 1 9 7 0 ) .O t t e r s e n e t a l . , The C r y s t a l a n d M o l e c u l a rS t r u c t u r e o fC a n n a b i d i o l , A c t a C h e m .S c a n d . B 3 1 , 9 : 8 0 7 8 1 2( 1 9 7 7 ) .Cunha e t a l . , C h r o n i cA d m i n is t r a t i o n o f C a n n a b i d i o l t oH e a l t h yVo l u n t e e r sa n d E p i l e p t i cP a t i e n t s l , P h a r m a c o l o g y ,2 1 : 1 7 5 1 8 5( 1 9 8 0 ) .C o n s r o e e t a l . , A c u t e a n d C h r o n i cA n t i e p i l e p t i c Drug

E f f e c t si n A u d i o g e n i cS e i Z u r e S u s c e p t i b l eR a t s , E x p e r im e n t a lN e u r o l o g y ,A c a d e m i cP r e s s I n c . ,7 0 : 6 2 6 6 3 7( 1 9 8 0 ) .T u r k a n i se t a l . , E l e c t r o p h y s i o l o g i cP r o p e r t i e s o f t h e Cann a b i n o i d s , J . C l i n .P h a r m a c o l . ,2 1 : 4 4 9 S 4 6 3 S( 1 9 8 1 ) .C a r l i n i e t a l . , H y p n o t i c a n dA n t i e l p i l e p t i c E f f e c t s o f Cann a b i d i o l , J . C l i n .P h a r m a c o l . ,2 1 : 4 1 7 S 4 2 7 S( 1 9 8 1 ) .K a r l e r e t a l . , The C a n n a b i n o i d sa s P o t e n t i a l A n t i e p i l e pt i c s , J .C l i n .P h a r m a c o l . ,2 1 : 4 3 7 S 4 4 8 S( 1 9 8 1 ) .C o n s r o ee t a l . , A n t i e p i l e p t i cP o t e n t i a l o f C a n n a b i d i o lA n a lg o s , J . C l i n .P h a r m a c o l . ,2 1 : 4 2 8 S 4 3 6 S( 1 9 8 1 ) .

( L i s tc o n t i n u e do n n e x t p a g e . )

P r i m a r yE x a m i n e r K e v i nE . We d d i n g t o n( 7 4 )A t t o r n e y ,A g e n t , o r F i r m K l a r q u i s t S p a r k m a n,LLP

( 5 7 ) A B S T R A C T

Cannabinoids have been found t o have a n t i o x i d a n tp r o p e r t i e s ,u n r e l a t e d t o NMDA e c e p t o r a n t a g o n i s m .T h i sn e W found p r o p e r t y m a k e s C a n n a b i n o i d su s e f u l i n t h e t r e a tment a n d p r o p h y l a x i s o fW i d ev a r i e t y o f o x i d a t io n a s s o c ia t e d d i s e a s e s ,s u c h a s i s c h e m i c , a g e - r e l a t e d ,i n ? a m m a t o r yand au to im m u n e d i s e a s e s . The Cannabinoids a r e found t oh a v ep a r t i c u l a ra p p l i c a t i o n a sn e u r o p r o t e c t a n t s ,f o re x a m p l ei n l i m i t i n gn e u r o l o g i c a ld a m a g ef o l l o w i n gi s c h e m i ci n s u l t s ,such a s s t r o k e and t r a u m a , o r i n t h e t r e a t m e n t o f neurodeg e n e r a t i v e d i s e a s e s , s u c h a s A l Z h e i m e r sd i s e a s e , P a r k i ns o n s d i s e a s e and HIV d e m e n t i a . Nonpsychoact iveC a n n a b i n o i d s ,s u c h a s c a n n a b i d o i l , a r e p a r t i c u l a r l y a d v a n

t a g e o u s t o u s e b e c a u s e t h e y a v o i d t o x i c i t y t h a t i s encount e r e d W i t hp s y c h o a c t i v eC a n n a b i n o i d sa t h i g h d o s e su s e f u l i nt h e method o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n . A a r t i c u l a r d i s c l o s e dc l a s s o f C a n n a b i n o i d su s e f u l a s n e u r o p r o t e c t i v ea n t i o x i d a n t si s f o r m u l a( I )W h e r e i nt h e R g r o u pi s i n d e p e n d e n t l ys e l e c t e df r o m t h eg r o u p c o n s i s t i n g o f H , C H 3 ,a n d COCH3.

( I )

2 6 C l a i m s , 7 Drawing S h e e t s


2/26

U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B1P a g e 2

OTHER PUBLICATIONS

C o l a s a n t i e t a 1 . , O c u l a rH y p o t e n s i o n ,O c u l a rTo x i c i t y, a n dN e u r o t o x i c i t yi n R e s p o n s et o M a r i h u a n aE x t r a c t a n d Cann a b i d i o l , Gen P h a r m . , P e r g a m o n P r e s s L t d . ,1 5 ( 6 ) : 4 7 9 4 8 4( 1 9 8 4 ) .C o l a s a n t i e t a 1 . , I n t r a o c u l a r P r e s s u r e ,O c u l a rTo x i c i t y a n dN e u r o t o x i c i t ya f t e rA d m i n is t r a t i o n o f C a n n a b i n o lo r Cann a b i g e r o l , E x p .E y e e s . ,A c a d e m i cP r e s s I n c . ,3 9 : 2 5 1 2 5 9( 1 9 8 4 ) .Vo l f e e t a l . , C a n n a b i n o i d sBlock R e l e a s e o f S e r o t o n infromP l a t e l e t sI n d u c e db y P l a s m af r m M i g r a i n eP a t i e n t s , I n t .J .C l i n .P h a r m . R e s . ,B i o s c i e n c e E d i p r i n t I n c . ,4 : 2 4 3 2 4 6( 1 9 8 5 ) .A g u r e l l e t a l . , P h a r m a c o k i n e t i c sa n d M e t a b o l i s m o fA 1 T e t r a h y d r o c a n n a b i n o la n d O t h e r C a n n a b i n o i d s W i t h

E m p h a s i so n M a n * , P h a r m a c o l o g i c a l R e v i e W s ,

3 8 ( 1 ) : 2 1 4 3( 1 9 8 6 ) .K a r l e r e t a l . , D i f f e r e n t C a n n a b i n o i d sE x h i b i t D i f f e r e n tP h a r m a c o l o g i c a l a n dT o x i c o l o g i c a lP r o p e r t i e s , N I D AR e s .M o n o g r ,7 9 : 9 6 1 0 7( 1 9 8 7 ) .Samara e t a 1 . , P h a r m a c o k i n e t i c so f C a n n a b i d i o li n D o g s , D r u gM e t a b o l i s ma n d D i s p o s i t i o n ,1 6 ( 3 ) : 4 6 9 4 7 2( 1 9 8 8 ) .C h o i , G l u t a m a t eN e u r o t o x i c i t ya n d D i s e a s e s o f t h e N e rv o u s S y s t e m , N e u r o n , C e l l P r e s s ,1 : 6 2 3 6 3 4( 1 9 8 8 ) .E s h h a re t a l . , N e u r o p r o t e c t i v ea n d A n t i o x i d a n tA c t i v i t i e s o fH U 2 1 1 ,A o v e l NMDA e c e p t o rA n t a g o n i s t , E u r o p e a nJ o u r n a l o f P h a r m a c o l o g y , 28 3 : 1 9 2 9( 1 9 9 5 ) .

S k a p e r e t a l . , T h eALIAmide P a l m i t o y l e t h a n o l a m i d ea n dC a n n a b i n o i d s , b u t n o t Anandamide, a r e P r o t e c t i v e i n a

D e l a y e dP o s t g l u t a m a t eP a r a d i g mo f E x c i t o t o x i c D e a t h i nC e r e b e l l a r G r a n u l e N e u r o n s , N e u r o b i o l o g y ,P r o c . N a t l .A c a d . S c i .USA, 9 3 : 3 9 8 4 3 9 8 9( 1 9 9 6 ) .A l o n s o e t a 1 . , S i m p l eS y n t h e s i s o f 5 S u b s t i t u t e d R e s o r c in o l s :A e v i s i t e d F a m i l y o f I n t e r e s t i n g B i o a c t i v e Mole c u l e s , J . O r g . C h e m . , A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y ,6 2 ( 2 ) : 4 1 7 4 2 1( 1 9 9 7 ) .Combes e t a l . A S i m p l eS y n t h e s i s o f t h e N a t u r a l 2 , 5 D ia l k y l r e s o r c i n o lF r e e R a d i c a l S c a v e n g e r A n t i o x i d a n t :R e s o r s t a t i o n , S y n t h e t i cC o m m u n i c a t i o n s ,M a r c e lD e k k e r ,I n c . ,2 7 ( 2 1 ) : 3 7 6 9 3 7 7 8( 1 9 9 7 ) .Shohami e t a l . , O x i d a t i v e S t r e s s in ClosedHead I n j u r y :B r a i n A n t io x i d a n t C a p a c i t ya s an I n d i c a t o r o f F u n c t i o n a lO u t c o m e , J o u r n a l o f C e r e b r a lB l o o dFlow a n d Metabo

l i s m , L i p p i n c o t t R a v e nP u b l i s h e r s ,1 7 ( 1 0 ) : 1 0 0 7 1 0 1 9( 1 9 9 7 ) .Z u r i e r e t a 1 . , D i m e t h y l h e p t y l T H C 1 1OIC A c i d , A r t h r it i s & R h e u m a t i s m ,4 1 ( 1 ) : 1 6 3 1 7 0( 1 9 9 8 ) .H amp so n e t a l . , Dual E f f e c t s o f An an d ami d e on NMDAR e c e p t o r M e d i a t e dR e s p o n s e s a n d N e u r o t r a n s m i s s i o n , J o u r n a l o f N e u r o c h e m i s t r y ,L i p p i n c o t t R a v e nP u b l i s h e r s ,7 0 ( 2 ) : 6 7 1 6 7 6( 1 9 9 8 ) .Hampson e t a 1 . , C a n n a b i d i o la n d ( ) A 9 t e t r a h y d r o c a n n ab i o n o a r eN e u r o p r o t e c t i v eA n t i o x i d a n t s , M e d i c a lS c i e n c e s ,P r o c . N a t l .A c a d . S c i .USA, 8 2 6 8 8 2 7 3( 1 9 9 8 ) .* c i t e d b y examiner


3/26

U . S . P a t e n t 0a . , 2 0 0 3 S h e e t 1 0 f 7 US , 6 3 0 , 5 0 7B 1

:55w -m

Q63835

3 -w.-

m _

HU F m

0ln

9 9 9 9 1 9 1H67 1 1 : )


4/26


2 1 M

pn

, . . .H


5/26


3 .

Q 6E E

0 5m ui m

3 .-2 1g s u m1omuaum

1E mu m

c 6 .: L Al? N

(Wu 0 L 5 )Q O U Q O S Q J O H ]1

2oEEmw

mU H H

2 9mA2.( V 0 )1 1 1 9 1 1 0 1 )


6/26


5 9 2 } ,5

gig5gimaU


7/26


Q 6555i8

mioi( [ 8 3 W 1 1I K q1 1 0 1 m m

wU E

Dag520;

|

0

L 0

(mu 7 5 3 )9 3 1 1 1 2 1 1 0s q e [ 1 1 03 0


8/26


9/26

Cameo?nE Q05

282 mmom

25 x 2ESS

momvESQU

U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B 1

Fo m

7

H m m

m

m ,3

7

in:

U S P a t e n t

u o p o n p o l dHqq 1 1 , 03 0


10/26


11/26

U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B13

N o s i g n s o f t o x i c i t y o r s e r i o u s s i d e e f f e c t s h a v e b e e no b s e r v e df o l l o w i n gc h r o n i c a d m i n i s t r a t i o n o f c a n n a b i d i o lt oh e a l t h y v o l u n t e e r s ( C u n h a e t a l . , Pharmacology2 1 : 1 7 5 1 8 5 ,1 9 8 0 ) ,e v e n i n l a r g e a c u t e d o s e s o f 7 0 0 m g / d a y( C o n s r o ee t a l . ,P h a r m a c o l . B i o c h e m .B e h a v . 4 0 : 7 0 1 7 0 8 ,

1 9 9 1 ) b u t c a n n a b i d i o l i s i n a c t i v e a t t h e NMDA e c e p t o r.H e n c ei n s p i t eo f i t s p o t e n t i a l u s e i n t r e a t i n gg l a u c o m aa n ds e i Z u r e s , c a n n a b i d i o l h a s n o t been c o n s i d e r e d a n e u r o p r ot e c t i v ea g e n t t h a t c o u l d b e u s e d t o p r e v e n t g l u t a m a t ei n d u c e d da ma ge i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m .

SUMMARY OF THE INVENTION

I t i s a n o b j e c t o f t h i s i n v e n t i o n t o p r o v i d e a n e W c l a s s o fa n t i o x i d a n t d r u g s , t h a t h a v e p a r t i c u l a r a p p l i c a t i o n a sn e u r o p r o t e c t a n t s , a l t h o u g h t h e ya r eg e n e r a l l y u s e f u l i n t h et r e a t m e n t o f m a n y o x i d a t i o n a s s o c i a t e d d i s e a s e s .

Ye t a n o t h e r o b j e c t o f t h e i n v e n t i o n i s t o p r o v i d e a s u b s e to f s u c h d r u g s t h a tc a n b e s u b s t a n t i a l l y f r e eo f p s y c h o a c t i v e

o r p s y c h o t o x i ce f f e c t s , a r e s u b s t a n t i a l l y n o n - t o x i c even a tv e r y h i g h d o s e s ,a n d h a v e g o o d t i s s u ep e n e t r a t i o n ,f o re x a m p l ec r o s s i n g t h eb l o o d b r a i n b a r r i e r .

I t h a s s u r p r i s i n g l y b e e n f o u n d t h a tc a n n a b i d i o l a n d o t h e rcannabinoids can f u n c t i o n a s n e u r o p r o t e c t a n t s , even thought h e y l a c kNMDA e c e p t o r a n t a g o n i s ta c t i v i t y .T h i s d i s c o v e r yWas made p o s s i b l e b e c a u s e o f t h e i n v e n t o r s r e c o g n i t i o no fa p r e v i o u s l y u n a n t i c i p a t e d a nt i o x id a nt p r o p e r t y o ft h e c a nn a b i n o i d s i n g e n e r a l ( a n d c a n n a b i d i o l i n p a r t i c u l a r ) t h a tf u n c t i o n s c o m p l e t e l y i n d e p e n d e n t l yo f a n t a g o n i s m a t t h eNMDA, AMPA n d k a i n a t e r e c e p t o r s . Hence t h e p r e s e n ti n v e n t i o n i n c l u d e s methods o f p r e v e n t i n g o r t r e a t i n g d i se a s e s c a u s e dby o x i d a t i v e s t r e s s ,s u c h a s n e u r o n a lh y p o x i a ,b y a d m i n i s t e r i n g a p r o p h y l a c t i co r t h e r a p e u t i c a l l ye f f e c t i v ea m o u n t of a cannabinoid t o a s u b j e c t Who has a d i s e a s ec a u s e dby o x i d a t i v e s t r e s s .

The c a n n a b i n o i dm a y be a c a n n a b i n o i do t h e r t h a n T H C ,HU-210, o r o t h e r p o t e n t c a n n a b i n o i dr e c e p t o r a g o n i s t s .Thec a n n a b i n o i d m a y a l s o be o t h e r t h a n H U - 2 11 o r any o t h e rNMDA r e c e p t o r a n t a g o n i s t t h a t h a s p r e v i o u s l y b e e nr e p o r t e d . A o t e n t c a n n a b i n o i dr e c e p t o r a g o n i s t i s o n e t h a th a s a n EC5O t t h e c a n n a b i n o i dr e c e p t o r o f 50 nM r l e s s ,b u ti n more p a r t i c u l a r e m b o d i m e n t s 190 nM r 250 nM r l e s s .I n disclosed e m b o d i m e n t s t h e cannabinoid i s notp s y c h o a c t i v e ,a n d i s n o t p s y c h o t o x i ce v e n a t h i g h d o s e s . I nsome p a r t i c u l a r l y d i s c l o s e d e m b o d i m e n t s ,t h e c a n n a b i n o i di s s e l e c t e d from t h e g r o u p :

W h e r eA s a r y l ,a n d p a r t i c u l a r l y

R 5

10

1 5

20

25

30

35

40

55

60

6 5

b u t n o t a pinene such a s :

R 5

a n d t h e R1R5g r o u p sa r e e a c h i n d e p e n d e n t l ys e l e c t e d fromt h e g r o u p s o f h y d r o g e n ,l o W e rs u b s t i t u t e d o r u n s u b s t i t u t e da l k y l , s u b s t i t u t e d o r u n s u b s t it u t e d c a r b o x y l ,s u b s t i t u t e d o ru n s u b s t i t u t e d a l k o x y , s u b s t i t u t ed o r u n s u b s t i t u t e d a l c o h o l ,and s u b s t i t u t e d o r u n s u b s t i t u t e d e t h e r s , and R6R7a r e H rm e t h y l .I n p a r t i c u l a r e m b o d i m e n t s ,t h e r e a r e n o n i t r o g e n s i nt h e r i n g s , a n d / o r no amino s u b s t i t u t i o n s on t h e r i n g s .

I n o t h e r embodiments, t h e c a n n a b i n o i d i s o n e o f t h ef o l l o W i n g :

Where t h e r e can be 0 t o 3 double bonds on t h e A i n g , a si n d i c a t e d b y t h eo p t i o n a l d o u b l eb o n d s i n d i c a t e d b y d a s h e dl i n e so n t h e A i n g .The C r i n g i s a r o m a t i c , a n d t h e B r i n gcan b e a pyran. P a r t i c u l a r e m b o d i m e n t s a r e d ibenZ o pyransa n d c y c l o h e x e n y lb e n Z e n e d i o l s .P a r t i c u l a r e m b o d i m e n t so ft h e c a n n a b i n o i d so f t h e p r e s e n t i n v e n t io nm a y a l s o b e h i g h l yl i p i ds o l u b l e , a n d i n p a r t i c u l a r e m b o d i m e n t sc a n b e d i s


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U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B15

s o l v e d i n a n a q u e o u ss o l u t i o n o n l y s p a r i n g l y ( f o re x a m p l e1 0 mg/ml o r l e s s ) .T h e o c t a n o l / Wa t e r p a r t i t i o nr a t i o a tn e u t r a l p H i n u s e f u l embodiments i s 5000 o r g r e a t e r , f o re X a m p l e6 0 0 0o r g r e a t e r .T h i s h i g hl i p i ds o l u b i l i t ye n h a n c e sp e n e t r a t i o n o f t h e d r u g i n t ot h e CNS, a s r e ? e c t e d b y i t s

v o l u m eo f d i s t r i b u t i o n( V ) o f 1 . 5L / k go r m o r e ,f o re X a m p l e3 . 5 L / k g , 7 L / k g , o r i d e a l l y 1 0 L / k go r m o r e , f o r e X a m p l ea tl e a s t2 0 L / k g . P a r t i c u l a r e m b o d i m e n t sm a y a l s ob e h i g h l yW a t e rs o l u b l e d e r i v a t iv e s t h a t a r e a b l e t o p e n e t r a t e t h e C N S ,f o re X a m p l ec a r b o X y ld e r i v a t i v e s .

R 7 _ 1 8a r e i n d e p e n d e n t l y s e l e c t e d f r o m t h e g r o u p o f H ,s u b s t i t u t e d o r u n s u b s t i t u t e da l k y l ,e s p e c i a l l y l o W e ra l k y l ,f o re X a m p l eu n s u b s t i t u t e dC 1 C 3a l k y l ,h y d r o X y l ,a l k o X y ,e s p ec i a l l yl o W e r a l k o X y s u c ha s methoXy o r e t h o X y, s u b s t i t u t e do r u n s u b s t i t u t e d a l c o h o l , and u n s u b s t i t u t e d o r s u b s t i t u t e dc a r b o X y l ,f o re X a m p l eCOOH r COCH3. I n o t h e r embodiments R 7 _ 1 8can a l s o b e s u b s t i t u t e d o r u n s u b s t i t u t e damino,a n d h a l o g e n .

The c a n n a b i n o i d h a s s u b s t a n t i a l l y n o b i n d i n g t o t h eNMDAr f o re X a m p l ea n I C 5 Og r e a t e r t h a n o r e q u a l t o 5 pMo r 1 0 pM), h a s s u b s t a n t i a l l y n o p s y c h o a c t i v ea c t i v i t ym e d ia t e d b y t h ec a n n a b i n o i dr e c e p t o r ( f o re X a m p l ea n I C 5 Oa t t h ec a n n a b i n o i dr e c e p t o r o f g r e a t e r t h a n o r e q u a l t o 300 n M , f o re X a m p l eg r e a t e r t h a n 1 pM n d a K i g r e a t e r t h a n 2 5 0 nM,e s p e c i a l l y5 0 0 1 0 0 0nM, f o r e X a m p l eg r e a t e rt h a n 1 0 0 0n M ) , a n d a n t i o x i d a n t a c t i v i t y ,a s d e m o n s t r a t a b l eb y t h eF e n t o n r e a c t i o n o r c y c l i c v o l t a m e t r y .

I n o t h e r p a r t i c u l a r embodiments, t h e c a n n a b i n o i d sa r e oneo f t h ef o l l o W i n g :

R 1 9

R 2 0O R Z I

R 2 3 R 2 5

H

R 2 2 R 2 4

R 1 9

R 2 0OH

OH R 2 6

R 1 9

R 2 0OH

Where R19 i s s u b s t i t u t e d o r u n s u b s t i t u t e d a l k y l , s u c h a sl o We r a l k y l( f o re X a m p l em e t h y l ) ,l o We ra l c o h o l( s u c h a sm e t h y la l c o h o l ) o rc a r b o X y l( s u c h a s c a r b o X y l i ca c i d )a n do X y g e n( a s i n= 0 ) ; R 2 0 i s h y d r o g e no r h y d r o Xy ; R 2 1i sh y d r o g e n , h y d r o X y ,o r m e t h o X y ; R 2 2i s h y d r o g e n o rh y d r o X y ;R 2 3 i s h y d r o g e no r h y d r o X y ;R 2 4 i s h y d r o g e no rh y d r o X y ;R 2 5i s h y d r o g e no rh y d r o X y ;a n d R 2 6i s s u b s t i t u t e do ru n s u b s t i t u t e da l k y l( f o re X a m p l en - m e t h y la l k y l ) ,s u b s t it u t e d o r u n s u b s t i t u t e d a l c o h o l , o r s u b s t i t u t e d o r u n s u b s t i

t u t e dc a r b o X y.

10

1 5

20

25

30

35

40

45

50

55

6 5

6I n y e t o t h e r embodiments o f t h e i n v e n t i o n , t h e c a n n a b

inoids a r e

CH3

1

6 2 O R 2 7

3

~ ' , , R 2 95 4 I ,

s

Q C H Z :I : 50 R 2 8 , C5H115

H 3 C 1 0

W h e r e i nn u m b e r i n gc o n v e n t i o n sf o re a c h o f t h er i n g p o s it i o n s a r es h o W n ,a n d R 2 7 , R 2 8 a n d R 2 9a r e i n d e p e n d e n t l ys e l e c t e d f r o mt h e g r o u pc o n s i s t i n g o f H , u n s u b s t i t u t e dl o W e ra l k y l s u c h a s CH3, a n d c a r b o X y ls u c h a s COCH3. P a r t i c u l a re X a m p l e so f n o n p s y c h o a c t i v e c a n n a b i n o i d st h a tf a l lW i t h i n

t h i s d e ? n i t i o n a r e c a n n a b i d i o l and

a n d o t h e r s t r u c t u r a la n a l o g s o f c a n n a b i d i o l .

I n more p a r t i c u l a r e m b o d i m e n t s ,t h e c a n n a b i n o i di s u s e dt o prevent o r t r e a t an ischemic o r neurodegenerative d i s e a s ei n t h e c e n t r a l n e r v o u ss y s t e m o f a s u b j e c t , by a d m i n i s t e r i n gt o t h e s u b j e c t a t h e r a p e u t i c a l l y e f f e c t i v e a m o u n t o f a cann a b i n o i d t o p r o t e c t a g a i n st o X i d a t i v e i n j u r y t o t h e c e n t r a lnervous s y s t e m . The cannabinoid m a y be any o f t h e compounds s e t f o r t h a b o v e , o r more s p e c i ? c a l l y

W h e r e i nR 2 7 , R 2 8 a n d R 2 9a r ei n d e p e n d e n t l ys e l e c t e d f r o mt h e g r o u p c o n s i s t i n g o f H , l o W e r a l k y l s u c h a s C H 3 , a n dc a r b o X y ls u c h a s COCH3) a n d p a r t i c u l a r l yW h e r e i n

e )R 2 7 = H ;R 2 8 = R 2 9 = C O C H 3Wh e n R 2 7 = R 2 8 = R 2 9 = H ,t h e n t h ecompound i s c a n n a b i d i o l .Wh e n R27=R29=H a n d R 2 8 = C H 3 ,t h e compound i s C B Dm o n o m e t h y le t h e r .Wh e n R 2 7 = R 2 8 = C H 3a n d R 2 9 = H ,t h ecompound s C B Dd i m e t h y le t h e r .When R27=R28=COCH3a n d R 2 9 = H ,t h ecompound i s C B D d i a c e t a t e .Wh e n R27=Ha n d R28=R29=COCH3,t h e compound s CBD o n o a c e t a t e .The i s c h e m i c o r n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e m a y b e , f o r


13/26

U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B17

e x a m p l e , a ni s c h e m i c i n f a r c t ,A l Z h e i m e r sd i s e a s e , P a r k i ns o n s d i s e a s e ,D o W n ss y n d r o m e ,human i m m u n o d e ? c i e n c yv i r u s ( H I V )d e m e n t i a , m y o c a r d i a li n f a r c t i o n ,o r t r e a t m e n ta n d p r e v e n t i o n o f i n t r a o p e r a t i v eo r p e r i o p e r a t i v e h y p o x i ci n s u l t s t h a tc a n l e a v e p e r s i s t e n t n e u r o l o g i c a ld e ? c i t s f o l l o W

i n g o p e n h e a r t s u r g e r y r e q u i r i n g h e a r t / l u n g b y p a s sm a c h i n e s ,s u c h a s c o r o n a r y a r t e r yb y p a s s g r a f t s( C A B G ) .

The i n v e n t i o n a l s o i n c l u d e s a n a s s a y f o r s e l e c t i n g ac a n n a b i n o i d t o u s e i n t r e a t i n g a n e u r o l o g i c a l d i s e a s e b yd e t e r m i n i n g W h e t h e r t h e c a n n a b i n o i d i s a n a n t i o x i d a n t .Onc e i t h a s been d e t e r m i n e d t h a t t h e c a n n a b i n o i d i s a na n t i o x i d a n t , a n a n t i o x i d a n t e f f e c t i v e amount o f t h e cannabi n o i d i s a d m i n i s t e r e d t o t r e a tt h e n e u r o l o g i c a ld i s e a s e , s u c ha s a v a s c u l a r ischemic event i n t h e c e n t r a l nervous system,

f o r e x a m p l et h e t y p e c a u s e dby a n e u r o v a s c u l a rthromboemb o l i s m . S i m i l a r l y , t h e method o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o ni n c l u d e s d e t e r m i n i n gW h e t h e ra d i s e a s e i s c a u s e dby o x i d at i v es t r e s s ,a n d i f t h e d i s e a s e i s c a u s e d b y o x i d a t i v e s t r e s s ,a d m i n i s t e r i n g t h e c a n n a b i n o i di n a t h e r a p e u t i c a l l y e f f e c t i v e

a n t i o x i d a n t amount.T h e i n v e n t i o n a l s oi n c l u d e s i d e n t i f y i n g a n d a d m i n i s t e r i n g

a n t i o x i d a n t a n d n e u r o p r o t e c t i v e compounds ( s u c h a sc a n n a b i d i o l )W h i c hs e l e c t i v e l yi n h i b i tt h ee n Z y m ea c t i v i t yo fb o t h 5 - a n d 1 5 - l i p o x y g e n a s emore t h a n t h e enZyme a c t i v i t yo f 1 2 - l i p o x y g e n as e .I n a d d i t i o n ,s u c h c o m p o u n d sp o s s e sl o WNMDA n t a g o n i s t a c t i v i t ya n d l o Wc a n n a b i n o i dr e c e pt o ra c t i v i t y .A s s a y sf o rs e l e c t i n gc o m p o u n d sW i t ht h ed e s i r e de f f e c ton l i p o x y g e n a s ee n Z y m e s , a n dmethods f o r u s i n gi d e n t i ? e d compounds t o t r e a tn e u r o l o g i c a lo r i s c h e m i cd i seases a r e a l s o provided. Su c h d i s e a s e s may i n c l u d e a vasc u l a r i s c h e m i c e v e n t i n t h e c e n t r a l nervous s y s t e m , f o rexample a thromboembolism i n t h e b r a i n , o r a v a s c u l a ri s c h e m i ce v e n t i n t h e m y o c a r d i u m .U s e f u la d m i n i s t r a t i o n o f

t h e compounds i n v o l v e s a d m i n i s t r a t i o n b o t h d u r i n g a n da f t e ra n i s c h e m i c i n j u r y .

T h e s e a n d o t h e r o b j e c t s o f t h e i n v e n t i o n W i l l b e u n d e rs t o o d more c l e a r l y by r e f e r e n c e t o t h e f o l l o W i n gd e t a i l e dd e s c r i p t i o na n d d r a W i n g s .

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

F I G . 1 A i s a g r a p h shoWing NMDA n d u c e d c e l l u l a rdamage i n an e u r o n( a sm e a s u r e dby LDH e l e a s e ) i n c e l l st h a t Were e x p o s e d t o g l u t a m a t e f o r 1 0 m i n u t e s , Whichd e m o n s t r a t e st h a ti n c r e a s in g c o n c e n t r a t i o n so f c a n n a b i d i o li n t h ec e l lc u l t u r ep r o t e c t s a g a i n s t c e l l u l a rd a m a g e .

F I G . 1B i s a g r a p h s i m i l a r t o F I G . 1 A , b u t shoWing t h a t

A M PA / k a i n a t er e c e p t o rm e d i a t e d d a m a g e( i n d u c e d b yg l u t a m a t e a n d t h e A M PA / k a i n a t er e c e p t o r p o t e n t i a t i n ga g e n t s c y c l o t h i a Z i deo r c o n c a n a v a l i nA) s a l s o r e d u c e di n ac o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n tm a nne r by t h e p r e s e n c e o f c a n n ab i d i o l i n t h e c u l t u r e medium.

F I G . 2 A i s a b a r g r a p h s h o W i n gc e l l u l a rdamage ( a sm e a s u r e db y LDH e l e a s e )i n t h e p r e s e n c e o f g l u t a m a t ea l o n e ( 1 0 0pM l u ) , a n d i n t h ep r e s e n c eo f g l u t a m a t ea n d 5pM a n n a b i d i o l (CBD) o r 5 pM HC, a n d d e m o n s t r a t e st h a tCBD n d THC e r e s i m i l a r l y p r o t e c t i v e.

F I G .2 B s a b a r g r a p h s i m i l a r t o F I G .2A, b u t shoWing t h ec e l l u l a r damage a s s e s s e d in t h e p r e s e n c eo f t h e c a n n a b i n o i dr e c e p t o r a n t a g o n is tS R 1 4 1 7 1 6 A S R ) , Which Was n o t f o u n dt o a l t e rt h en e u r o p r o t e c t i v ee f f e c to f CBD 5 pM ) o r THC 5MM), i n d i c a t i n g t h e e f f e c ti s n o t a t y p i c a l c a n n a b i n o i de f f e c tm e d i a t e db y t h ec a n n a b i n o i dr e c e p t o r .

F I G . 3 i s a g r a p h s h o W i n gt h e r e d u c t i o n o x i d a t io np o t e nt i a l sd e t e r m i n e dby c y c l i c v o l t a m e t r yf o rsome n a t u r a l a n ds y n t h e t i c c a n n a b i n o i d s ,t h e a n t i o x i d a n t BHT, a n d t h e n o nc a n n a b i n o i da n a n d a m i d e( a r a c h i d o n y le t h a n o l a m i d e )w h i c h

10

1 5

25

35

45

55

6 5

8i s a l i g a n d f o r t h e c a n n a b i n o i dr e c e p t o r. The v o l t a g e a tWhichi n i t i a lp e a k s o c c u r i s a n i n d i c a t i o n o f a n t i o x i d a n t a c t i v i t y .

F I G . 4 i s a g r a p h t h a t d e m o n s t r a t e s t h e a n t i o x i d a n tp r o p e r t i e so f BHT, C B D a n d THC, b y p l o t t i n g t h e? u o r e sc e n c e o f a ? u o r e s c e n t dye a g a i n s t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s e

s u b s t a n c e s , Where d e c l i n i n g ? u o r e s c e n c ei s a n i n d i c a t i o n o fg r e a t e ra n t i o x i d a n ta c t i v i t y .

F I G . 5 A s a g r a p h i l l u s t r a t i n gd e c r e a s e dt - b u t y lp e r o x i d ei n d u c e d t o x i c i t y ( a sm e a s u r e db y L D H r e l e a s e )i n t h ep r e s e n c e o fi n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n so f c a n n a b i d i o l , demo n s t r a t i n g t h a t c a n n a b i d i o l i s a n e f f e c t i v e a n t i o x i d a n t i nl i v i n gc e l l s .

F I G . 5B i s a b a r g r a p hc o m p a r i n gt h e a n t i o x i d a n t a c t i v i t yo f s e v e r a l a n t i o x i da n t sa g a i n s tg l u t a m a t ei n d u c e dt o x i c i t yi nn e u r o n s , s h o W i n gt h a tCBD a s s u p e r i o r a n t i o x i d an t a c t i vi t y .

F I G . 6 A i s a g r a p h s h o W i n gt h e e f f e c to f CBD ( a sm e a s u r e db y t h e c h a n g e in a b s o r b a n c e a t 2 3 4 nm) o n t h e

e n Z y m a t i c a c t i v i t yo f t W o l i p o x y g e n a s e e n Z y m e s ,r a b b i t15-LO a n d p o r c i n e 1 2 - L O ,W h i c hd e m o n s t r a t e st h a tCBDi n h i b i t s 15-LO, b u t n o t 12-LO enZyme.

F I G . 6B s a g r a p h d e m o n st r a t i ngt h a ti n h i b i t o r y e f f e c to fCBD on 1 5 -L O i s c o m p e t i t i v e .

F I G . 7A s a g r a p h s i m i l a r t o F I G . 6 A , b u t Wa s performedi n W h o l ec e l l sr a t h e rt h a n p u r i ? e denZyme p r e p a r a t i o n s , a n ds h o W st h e e f f e c to f CBD a s m e a s u r e db y t h e c h a n g e i na b s o r b a n c ea t 2 3 6 nm) o n t h e e n Z y m a t i ca c t i v i t yo f 5-LOf r o m c u l t u r e d r a t b a s o p h i l l i c l e u k e m i a c e l l s( R B L - 2 H 3 ) ,Which d e m o n s t r a t e st h a t CBD n h i b i t s 5-LO.

F I G . 7 B i s a g r a p h s h o W i n gt h e e f f e c to f CBD ( a sm e a s u r e db y t h e c h a n g e in a b s o r b a n c e a t 2 3 6 nm) o n t h ef o r m a t i o no f 1 2 - H E T E( t h ep r o d u c t o f 1 2 - L O )b y h u m a nl e u k o c y t e s( 1 2 - L Ot y p e1 ) .

F I G . 7 C s a g r a p h s i m i l a r t o F I G . 7 B ,shoWing t h e e f f e c to f CBD a s m e a s u r e db y t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c ea t 2 3 6nm) o n t h e f o r m a t i o n o f 12-HETE b y human p l a t e l e t s( 1 2 - L Ot y p e2 ) .

F I G . 8 i s a b a r g r a p h d e m o n s t r a t i n g t h a t 1 2 -H ETE c a np r o t e c t c o r t i c a l n e u r o n s from NMDAr o x i c i t y most e f f e ct i v e l yWhen a d m i n i s t e r e d d u r i n ga n d p o s t i s c h e m i a .

DETAILED DESCRIPTION OF SOME SPEC IFICEMBODIMENTS

T h i s i n v e n t i o n p r o v i d e s a n t i o x i d a n t compounds a n dc o m p o s i t i o n s , s u c h a s p h a r m a c e u t i c a lc o m p o s i t i o n s , t h a ti n c l u d e cannabinoids t h a t a c t a s f r e e r a d i c a l scavengers f o ru s e i n p r o p h y l a x i sand t r e a t m e n t o f d i s e a s e . The i n v e n t i o na l s o i n c l u d e s methods f o r u s i n g t h e a n t i o x i d a n t s i n p r e v e nt i o n and t r e a t m e n t o f p a t h o l o g i c a l c o n d i t i o ns such a si s c h e m i a ( t i s s u eh y p o x i a ) ,a n d i n s u b j e c t sWho h a v e b e e nexposed t o o x i d a n t i n d u c i n g a g e n t s such a s c a n c e rc h e m o t h e r a p y ,t o x i n s , r a d i a ti o n , o r o t h e r s o u r c e s o f o x i d at i v es t r e s s .The c o m p o s i t i o n sa n d methods d e s c r i b e d h e r e i na r e a l s o u s e d f o r p r e v e n t i n g o x i d a t i v e damage i n t r a n sp l a n t e do r g a n s ,f o r i n h i b i t i n gr e o x y g e n a t i o ni n j u r yf o l l o Wi n g r e p e r f u s i o n o f i s c h e m i c t i s s u e s( f o re x a m p l ei n h e a r td i s e a s e ) ,a n d f o r a n y o t h e r c o n d i t i o n t h a ti s m e d i a t e d b yo x i d a t i v e o r f r e e r a d i c a l mechanisms o f i n j u r y .I n p a r t i c u l a re m b o d i m e n t so f t h e i n v e n t i o n , t h e compounds a n d compos i t i o n s a r e used i n t h e t r e a t m e n t o f ischemic c a r d i o v a s c u l a ra n d n e u r o v a s c u l a rc o n d i t i o n s , a n d n e u r o d e g e n e r a t i v ed i se a s e s . H o We v e r t h e p r e s e n t invention can a l s o b e u sed a s ana n t i o x i d a n t t r e a t m e n t i n n o n - n e u r o l o g i c a ld i s e a s e s .

M o l e c u l a roxygen i s e s s e n t i a l f o r a e r o b i c o r g a n i s m s ,W h e r ei t p a r t i c i p a t e s i n ma n y b i o c h e m i c a lr e a c t i o n s ,i n c l u d


14/26

U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B1

i n g i t s r o l e a s t h e t e r m i n a l e l e c t r o n a c c e p t o r i n o x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o n .However e x c e s s i v e c o n c e n t r a t i o n so f v a r io u s f o r m so f r e a c t i v e oxygen s p e c i e s and o t h e r f r e e r a d i c a l sc a n h a v e s e r i o u s a d v e r s eb i o l o g i c a l c o n s e q u e n c e s ,i n c l u d i n gt h e p e r o x i d a t i o n o f m e m b r a n el i p i d s ,h y d r o x y l a t i o n o fn u c l e i c a c i d b a s e s , a n d t h e o x i d a t i o n o f s u l f h y d r y l g r o u p sa n d o t h e r p r o t e i n m o i e t i e s . B i o l o g i c a l a n t i o x i d a n t s i n c l u d et o c o p h e r o l s a n d t o c o t r i e n e o l s ,c a r o t e n o i d s ,q u i n o n e s ,b i l i r u b i n ,a s c o r b i c a c i d ,u r i ca c i d ,a n d m e t a l b i n di n g p r ot e i n s .HoWe ve r t h e s e endogenous a n t i o x i d a n t s y s t e m s a r eo f t e n o v e r W h e l m e d b yp a t h o l o g i c a l p r o c e s s e s t h a t a l l o Wpermanent o x i d a t i v e d amag e t o o c c u r t o t i s s u e .

Free r a d i c a l s a r e atoms, i o n s o r molecules t h a t c o n t a i n an

u n p a i r e d e l e c t r o n , a r eu s u a l l y u n s t a b l e , a n d e x h i b i ts h o r th a l f - l i v e s .R e a c t i v e oxygen s p e c i e s (ROS) i s a c o l l e c t i v et e r m , d e s i g n a t i n gt h eo x y g e nr a d i c a l s(eg . 0 2 s u p e r o x i d er a d i c a l ) ,W h i c hb y s e q u e n t i a lu n i v a l e n t r e d u c t i o np r o d u c e sh y d r o g e np e r o x i d e( H 2 0 2 )a n d h y d r o x y lr a d i c a l T h eh y d r o x y l r a d i c a l s e t s o f f c h a i n r e a c t i o n s and c a n i n t e r a c t

W i t h n u c l e i c a c i d s .O t h e r R O S i n c l u d e n i t r i co x i d e ( N O . )a n d p e r o x y n i t r i t e( N 0 0 ) , a n d o t h e r p e r o x y l (R02) a n da l k o x y l ( R O . ) r a d i c a l s .I n c r e a s e d p r o d u c t i o n o ft h e s ep o is o n o u s m e t a b o l i t e s i n c e r t a i n p a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n s i sb e l i e v e d t o c a u s e c e l l u l a r da ma ge t h r o u g ht h e a c t i o n o f t h eh i g h l y r e a c t i v e m o l e c u l e so n p r o t e i n s , l i p i d sa n d D N A . I np a r t i c u l a r , ROS r e b e l i e v e d t o accumulate W h e n t i s s u e s a r es u b j e c t e d t o i s c h e m i a , p a r t i c u l a r l yWhen f o l l o We db y r e pe r f u s i o n .

T h ep h a r m a c e u t i c a lc o m p o s i t i o n so f t h ep r e s e n t i n v e n t i o nh a v e p o t e n t a n t i o x i d a n t a n d / o r f r e e r a d i c a ls c a v e n g i n gp r o p e r t i e s , t h a t p r e v e n t o r r e d u c e o x i d a t i v e damage i nb i o l o g i c a l s y s t e m s , s u c h a s o c c u r s i n i s c h e m i c / r e p e r f u s i o ni n j u r y ,o r i n c h r o n i c n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e s s u c h a sA l Z h e i m e r sd i s e a s e , H I V d e m e n t i a , a n d many o t h e r o x i d at i o n a s s o c i a t e d d i s e a s e s .

D E F I N I T I O N S

O x i d a t i v e a s s o c i a t e d d i s e a s e s r e f e r s t o p a t h o l o g i c a lc o n d i t i o n s t h a t r e s u l ta t l e a s t i np a r t f r o m t h e p r o d u c t i o no fo r e x p o s u r e t o f r e e r a d i c a l s , p a r t i c u l a r l y o x y r a d i c a l s , o rr e a c t i v e oxygen s p e c i e s . I t i s e v i d e n t t o t h o s e o f s k i l li n t h ea r t t h a t most p a t h o l o g i c a l c o n d i ti o n sa r e m u l t i f ac t o r i a l , andt h a ta s s i g n i n g o r i d e n t i f y in g t h ep r e d o m i n a n tc a u s a l f a c t o r sf o ra n y p a r t i c u l a r c o n d i t i o n i s f r e q u e n t l yd i f ? c u l t .F o r t h e s er e a s o n s , t h e term f r e e r a d i c a l a s s o c i a t e d d i s e a s e e n c o mp a s s e s p a t h o l o g i c a ls t a t e s t h a t a r e r e c o g n i Z e da s c o n d i t i o n s

i n Which f r e e r a d i c a l s o r ROS o n t r i b u t e t o t h e p a t h o l o g yo ft h e d i s e a s e , o r Wherein a d m i n i s t r a t i o n o f a f r e e r a d i c a l

i n h i b i t o r( e . g .d e s f e r r o x a m i n e ) ,s c a v e n g e r( e . g .t o c o p h e r o l ,g l u t a t h i o n e )o rc a t a l y s t( e . g .s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ,c a t a l a s e )i s shoWn t o p r o d u c e d e t e c t a b l e b e n e ? t b y d e c r e a s i n gs y m p t o m s ,i n c r e a s i n gs u r v i v a l ,o r p r o v i d i n go t h e r d e t ec t a b l ec l i n i c a lb e n e ? t s i n t r e a t i n go r p r e v e n t i n g t h e p a t h o l o g i c a ls t a t e .

O x i d a t i v ea s s o c i a t e d d i s e a s e s i n c l u d e , W i t h o u tl i m i t a t i o n ,f r e e r a d i c a l a s s o c i a t e d d i s e a s e s , s u c h a s i s c h e m i a , i s c h e m i cr e p e r f u s i o ni n j u r y,i n ? a m m a t o r yd i s e a s e s ,s y s t e m i c l u p u se r y t h e m a t o s i s , m y o c a r d i a l i s c h e m i ao r i n f a r c t i o n , c e r eb r o v a s c u l a ra c c i d e n t s ( s u c h a s a thromboembolic o r hemo r r h a g i cs t r o k e ) t h a t can l e a d t o i s c h e m i ao r a n i n f a r c t i n t h e

b r a i n ,o p e r a t i v ei s c h e m i a , t r a u m a t i ch e m o r r h a g e( f o rexample a hypovolemic s t r o k e t h a t c a n l e a d t o CNS y p o x i ao r a n o x i a ) , s p i n a l c o r d t r a u m a ,DoWns s y n d r o m e ,C r o h n sd i s e a s e , autoimmune d i s e a s e s ( e g r h e u m a t o i da r t h r i t i so rd i a b e t e s ) ,c a t a r a c tf o r m a t i o n ,u v e i t i s ,e m p h y s e m a ,g a s t r i cu l c e r s ,o x y g e n t o x i c i t y ,n e o p l a s i a , u n d e s i r e d c e l l u l a r

5

1 5

25

35

45

55

6 5

1 0a p o p t o s i s , r a d i a t io n s i c k n e s s , a n d o t h e r s .T h e p r e s e n t i n v e nt i o n i s b e l i e v e d t o b e p a r t i c u l a r l y b e n e ? c i a l i n t h e t r e a t m e n to f o x i d a t i v e a s s o c i a t e d d i s e a s e so f t h e C N S , b e c a u s e o f t h ea b i l i t y o f t h e c a n n a b i n o i d st o c r o s s t h e b l o o d b r a i n b a r r i e ra n d e x e r t t h e i ra n t i o x i d a n t e f f e c t s in t h e b r a i n . I n p a r t i c u l a r

e m b o d i m e n t s ,t h e p h a r m a c e u t i c a lc o m p o s i t i o n o f t h ep r e s e n t i n v e n t i o n i s u s e d f o r p r e v e n t i n g , a r r e s t i n g ,o r t r e a ti n g n e u r o l o g i c a ld a m a g e i n P a r k i n s o n s d i s e a s e ,A l Z h ei m e r s d i s e a s e a n d HIV d e m e n t i a ; a u t o i m m u n en e u r o d e g e ne r a t i o n o f t h e t y p e t h a t c a n o c c u r i n e n c e p h a l i t i s , andh y p o x i c o r a n o x i c n e u r o n a l damage t h a t c a n r e s u l t froma p n e a , r e s p i r a t o r y a r r e s t o r c a r d i a c a r r e s t ,and a n o x i a c a u s e dby d r o W n i n g ,b r a i n s u r g e r y o r t rauma ( s u c h a s c o n c u s s i o no rs p i n a lc o r ds h o c k ) .

A s u s e d h e r e i n , a n a n t i o x i d a n t i s a s u b s t a n c e t h a t ,W h e np r e s e n t i n a m i x t u r e c o n t a i n i n g a n o x i d i Z a b l e s u b s t r a t eb i o l o g i c a lm o l e c u l e ,s i g n i ? c a n t l y d e l a y so r p r e v e n t so x i d at i o n o f t h e s u b s t r a t e b i o l o g i c a l m o l e c u l e . A n t i o x i d a n tsc a na c tb y s c a v e n g i n gb i o l o g i c a l l yi m p o r t a n t r e a c t i v ef r e e r a d i

c a l so r o t h e r r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ( 0 ; , H 2 0 2 , . O H ,H O C l ,f e r r y l ,p e r o x y l ,p e r o x y n i t r i t e ,a n d a l k o x y l ) ,o r b yp r e v e n t i n gt h e i rf o r m a t i o n ,o rb y c a t a l y t i c a l l yc o n v e r t i n gt h ef r e e r a d i c a l o r o t h e r r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s t o a l e s sr e a c t i v e s p e c i e s . R e l a t i v e a n t i o x i d a n t a c t i v i t y c a n b e m e as u r e d b y c y c l i cv o l t a m e t r ys t u d i e so f t h et y p e d i s c l o s e d i nE x a m p l e5 ( a n d F I G . 3 ) ,W h e r et h ev o l t a g e ( x - a x i s )i s a ni n d e x o f r e l a t i v ea n t i o x i d a n t a c t i v i t y .The v o l t a g e a t W h i c ht h e ? r s t peak o c c u r si s a n i n d i c a t i o n o f t h e v o l t a g e a t Whichan e l e c t r o n i s d o n a t e d , Which i n t u r n i s an i n d e x o f a n t i o x ida n t a c t i v i t y .

T h e r a p e u t i c a l l y e f f e c t i v e a n t i o x i d a n t d o s e s c a n b ed e t e r m i n e d b y v a r i o u s m e t h o d s , i n c l u d i n g g e n e r a t i n g a ne m p i r i c a ld o s e - r e s p o n s ec u r v e ,p r e d i c t i n gp o t e n c y a n de f ?c a c y o f a c o n g e n e rb y u s i n g q u a n t i t a t i v e s t r u c t u r ea c t i v i t yr e l a t i o n s h i p s(QSAR) m e t h o d so r m o l e c u l a r m o d e l i ng ,a n do t h e r m e t h o d su s e d i n t h e p h a r m a c e u t i c a ls c i e n c e s . S i n c eo x i d a t i v e damage i s g e n e r a l l y c u m u l a t i v e ,t h e r e i s n o m i n imum t h r e s h o l d l e v e l( o r d o s e ) W i t h r e s p e c t t o e f ? c a c y.HoWever, m i n i m u m d o s e s f o r p r o d u c i n ga d e t e c t a b l e t h e r ap e u t i c o r p r o p h y l a c t i ce f f e c t f o r p a r t i c u l a r d i s e a s e s t a t es c a nb e e s t a b l i s h e d .

A s used h e r e i n , a c a n n a b i n o i d i s a c h e m i c a lc ompound( s u c h a s c a n n a b i n o l ,THC r c a n n a b i d i o l )t h a t i s f o u n di n t h ep l a n ts p e c i e sC a n n a b i ss a l i v a( m a r i j u a n a ) ,a n d m e t a b o l i t e sa n d s y n t h e t i c a n a l o g u e st h e r e o f t h a t m a y o r m a y n o t h a v ep s y c h o a c t i v ep r o p e r t i e s .C a n n a b i n o i d s t h e r e f o r ei n c l u d e( W i t h o u tl i m i t a t i o n )c o m p o u n d s( s u c ha s THC) t h a th a v eh i g h a f f i n i t yf o r t h ec a n n a b i n o i d r e c e p t o r( f o re x a m p l eK i < 2 5 0n M ) , a n d c o m p o u n d st h a td o n o t h a v e s i g n i ? c a n ta f ? n i t y f o r t h ec a n n a b i n o i dr e c e p t o r ( s u c h a s c a n n a b i d i o l ,CBD). C a n n a b i n o i d sa l s o i n c l u d e compounds t h a th a v e ac h a r a c t e r i s t i cd i b e n Z o p y r a nr i n g s t r u c t u r e( o f t h et y p e s e e ni nT H C ) a n d c a n n a b i n o i d sWhich d o n o t p o s s e s s a p y r a n r i n g( s u c h a s c a n n a b i d i o l ) . Hence a p a r t i a ll i s t o f c a n n a b i n o i d si n c l u d e sTHC, CBD, d i m e t h y l h e p t y l p e n t y lc a n n a b i d i o l( D M H P - C B D ) ,6 , 1 2 - d i h y d r o - 6 - h y d r o x y - c a n n a b i d i o l( d e s c r i b e d i n US. P a t . N o . 5 , 2 2 7 , 5 3 7 , i n c o r p o r a t e db yr e f e r e n c e ) ;( 3 S , 4 R ) - 7 - h y d r o x y - A 6 - t e t r a h y d r o chomologs a n d d e r i v a t i v e s d e s c r i b e d i n U S. P a t .N o . 4 , 8 7 6 ,2 7 6 , i n c o r p o r a t e db y r e f e r e n c e ;( + ) - 4 - [ 4 - D M H - 2 , 6d i a c e t o x y -p h e n y l ] - 2 - c a r b o x y -6 , 6 - d i m e t h y l b ih e p t - 2 - e n , a n d o t h e r 4 - p h e n y l p i n e n ed e r i v a t i v e s d i s c l o s e d i nUS. a t . N o . 5 , 4 3 4 , 2 9 5 ,W h i c hi s i n c o r p o r a t e db y r e f e r e n c e ;a n d c a n n a b i d i o l ( ) ( C B D )a n a l o g s s u c h a s ( ) C B Dm o n o m e t h y l e t h e r ,( ) C B Dd i m e t h y le t h e r ;( ) C B Dd i a ce t a t e ;( ) 3 - a c e t y l - C B D m o n o a c e t at e ;a n d : A F l l , a l l o fWhich a r e d i s c l o s e d i n Consroe e t a l . ,J . C l i n . Phannacol.


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U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B11 1

2 1 : 4 2 8 S 4 3 6 S ,1 9 8 1 ,W h i c hi s a l s oi n c o r p o r a t e db y r e f e re n c e . M a n y o t h e r c a n n a b i n o i d s a r e s i m i l a r l y d i s c l o s e d i nA g u r e l l e t a l . ,P h a r m a c o l .R e v . 3 8 : 3 1 4 3 ,1 9 8 6 , W h i c hi sa l s oi n c o r p o r a t e d b y r e f e r e n c e .

A s r e f e r r e d t o h e r e i n , t h e t e r m p s y c h o a c t i v i t y means

c a n n a b i n o i d r e c e p t o r m e d i a t e d p s y c h o a c t i v i t y . S u c he f f e c t si n c l u d e ,e u p h o r i a , l i g h t h e a d e d n e s s ,r e d u c e d m o t o rc o o r d i n a t i o n ,a n d memory i m p a i r m e n t .P s y c h o a c t i v i t yi s n o tmeant t o i n c l u d e n o n - c a n n a b i n o i dr e c e p t o r mediated e f f e c t ss u c h a s th e a n x i o l y t i c e f f e c t o f C B D .

The l i p o x y g e n a s eenZyme a c t i v i t y r e f e r st o t h e r e l a t i v el e v e l o f l i p o x y g e n a s e enZyme a c t i v i t yf o r a p a r t i c u l a rl i p o x g e n a s e , such a s 5 - , 1 5 - o r 1 2 - l i p o x y g e n a s e ,a s m e as u r e d i n Example 8 . A ompound Would b e s a i d t o s e l e ct i v e l yi n h i b i ta l i p o x g e n a s eenZyme i f t h e c o n c e n t r a t i o n o fi n h i b i t o r r e q u i r e d t o r e d u c e enZyme a c t i v i t y by 5 0 Was a tl e a s t a b o u t 5 t i m e s l e s s t h a n t h e amount r e q u i r e d t o r e d u c ea c t i v i t yo f a s e c o n dl i p o x g e n a s eenZyme by t h e same d e g r e e( u n d e r t h e same c o n d i t i o n s , i e t e m p e r a t u r e , s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ,e t c . )

A n a n t a g o n i s t i s a compound t h a tb i n d s a n d o c c u p i e sar e c e p t o r W i t h o u ta c t i v a t i n g i t . I n t h e p r e s e n c e o f a s u f ? c i e n tc o n c e n t r a t i o n o f a n t a g o n i s t , a n a g o n i s t c a n n o t a c t i v a t e i t sr e c e p t o r .T h e r e f o r e ,a n t a g o n i s t s m a y d e c r e a s e t h e n e u r o t o xi c i t ym e d i a t e db y NMDA a s d e s c r i b e d i n E x a m p l e3 ) o rAMPA n d K a i n a t e ( a sd e s c r i b e d i n E x a m p l e4 ) .

An a g o n i s t i s a compound t h a t a c t i v a t e s a r e c e p t o r .W h e n t h e r e c e p t o r i s a c t i v a t e d f o r a l o n g e r t h a n n o r m a lp e r i o d o f t i m e , t h i sm a y c a u s e n e u r o t o x i c i t y , a s i n t h e c a s eo f N M D A ,AMPA n d k a i n a t e r e c e p t o r s ( s e eE x a m p l e s3a n d 4 ) .

The t e r m a l k y l r e f e r st o a c y c l i c ,b r a n c h e d ,o r s t r a i g h tc h a i n a l k y lg r o u pc o n t a i n i n go n l y c a r b o na n d h y d r o g e n ,a n du n l e s s o t h e r W i s ementioned c o n t a i n s one t o t W e l v e carbona t o m s . T h i s t e r m i s f u r t h e r exempli?ed b y g r o u p s s u c ha sm e t h y l ,e t h y l ,n - p r o p y l ,i s o b u t y l ,t - b u t y l ,p e n t y l ,p i v a l y l ,h e p t y l ,a d a m a n t y l ,a n d c y c l o p e n t y l .A l k y l g r o u p s c a ne i t h e rb e u n s u b s t i t u t e d or su b s t i t u t e d Wi t h o n e or more

s u b s t i t u e n t s ,e . g . h a l o g e n , a l k y l ,a l k o x y ,a l k y l t h i o ,t r i ? u o r o m e t h y l ,a c y l o x y ,h y d r o x y , m e r c a p t o ,c a r b o x y ,a r y l o x y , a r y l o x y ,a r y l ,a r y l a l k y l ,h e t e r o a r y l ,a m i n o ,a l k y l a m i n o , d i a l k y l a m i n o ,m o r p h o l i n o ,p i p e r i d i n o ,p y r r o l i d i n - 1 - y l ,p i p e r a Z i n - 1 - y l ,o r o t h e r f u n c t i o n a l i t y .

The t e r m loWer a l k y l r e f e r s t o a c y c l i c , branched o rs t r a i g h t c h a i n monovalent a l k y l r a d i c a l o f one t o s e v e nc a r b o n a t o m s . T h i s t e r m i s f u r t h e r e x e m p l i ? e dby s u c hr a d i c a l sa sm e t h y l ,e t h y l ,n - p r o p y l ,i - p r o p y l , n - b u t y l ,t - b u t y l ,i - b u t y l ( o r2 - m e t h y l p r o p y l ) ,c y c l o p r o p y l m e t h y l ,i - a m y l ,n - a m y l , h e x y l a n d h e p t y l .LoWer a l k y l g r o u p s c a na l s ob eu n s u b s t i t u t e d o r s u b s t i t u t e d , Where a s p e c i ? c example o f as u b s t i t u t e d a l k y li s 1 , 1 - d i m e t h y lh e p t y l .

H y d r o x y l r e f e r s t o OH. A l c o h o l r e f e r st o ROH, h e r e i n R s a l k y l ,e s p e c i a l l y

l o We ra l k y l( f o re x a m p l ei nm e t h y l ,e t h y lo rp r o p y la l c o h o l ) .An a l c o h o l m a y be e i t h e r l i n e a r o r b r a n c h e d , such a si s o p r o p y l a l c o h o l .

C a r b o x y l r e f e r s t o t h e r a d i c a l COOH, n d s u b s t i t u t e dc a r b o x y lr e f e r s t o COR here R s a l k y l ,l o W e ra l k y l o ra carboxylic a c i d o r e s t e r .

The te rm a r y l o r Ar r e f e r s t o a monova len t u n s a t u ra t e da r o m a t i c c a r b o c y c l i cg r o u p h a v i n ga s i n g l e r i n g( e . g .p h e n y l ) o r m u l t i p l e c o n d e n s e d r i n g s( e . g .n a p h t h y l o ra n t h r y l ) , Which c a n o p t i o n a l l y b e u n s u b s t i t u t e d o r s u b s t it u t e dW i t h , e . g . , h a l o g e n , a l k y l ,a l k o x y , a l k y l t h i o ,t r i ? u o r o m e t h y l ,a c y l o x y ,h y d r o x y ,m e r c a p t o ,c a r b o x y ,

1 5

25

35

45

55

6 5

1 2a r y l o x y ,a r y l ,a r y l a l k y l ,h e t e r o a r y l ,a m i n o ,a l k y l a m i n o ,d i a l k y l a m i n o ,m o r p h o l i n o ,p i p e r i d i n o ,p y r r o l i d i n - 1 - y l ,p i p e r a Z i n - 1 - y l ,o r o t h e r f u n c t i o n a l i t y .

The term alkoxy r e f e r s t o a s u b s t i t u t e d o r u n s u b s t i tu t e da l k o x y , Where a n a l k o x yh a s t h e s t r u c t u r e OR, here R

i s s u b s t i t u t e d o r u n s u b s t i t u t e d a l k y l . I n a n u n s u b s t i t u t e da l k o x y , t h e R s a n u n s u b s t i t u t e da l k y l .The t e r m s u b s t i t u t e da l k o x y r e f e r s t o a g r o u p h a v i n gt h e s t r u c t u r e OR,Where R s a l k y l Which s s u b s t i t u t e d W i t h a n o n - i n t e r f e r i n gs u b s t i t u e n t . The t e r m a r y l a l k o x y r e f e r s t o a g r o u ph a v i n gt h e s t r u c t u r e ORAr, Where R s a l k y l a n d Ar i s a na r o m a t i c s u b s t i t u e n t . Arylalkoxys a r e a s u b s e t o f s u b s t i t u t e da l k o x y s . E x a m p l e so f u s e f u l s u b s t i t u t e d a l k o x y g r o u p sa r e :b e n Z y l o x y , n a p h t h y l o x y ,a n d c h l o r o b e n Z y l o x y .

The t e r m a r y l o x y r e f e r s t o a group h a v i n g t h e s t r u c t u r eOAr, Where Ar i s a n a r o m a t i c g r o u p . A a r t i c u l a ra r y l o x y g r o u pi s p h e n o x y .

The t e r m h e t e r o c y c l e r e f e r s t o a monovalent s a t u r a t e d ,u n s a t u r a t e d , o r a r o m a t i c c a r b o c y c l i cg r o u p h a v i n g a s i n g l er i n g( e . g .m o r p h o l i n o ,p y r i d y l o r f a r y l )o r m u l t i p l e c o nd e n s e dr i n g s( e . g .i n d o l i Z i n y lo rb e n Z o [ b ] t h i e n y l )a n d h a v i n ga t l e a s t o n e h e t e r o a t o m ,de?ned a s N , O , P , o r S , W i t h i n t h er i n g , Which c a n o p t i o n a l l y b e u n s u b s t i t u t e d o r s u b s t i t u t e dW i t h ,e . g .h a l o g e n ,a l k y l ,a l k o x y ,a l k y l t h i o ,t r i ? u o r o m e t h y l ,a c y l o x y ,h y d r o x y, m e r c a p t o ,c a r b o x y ,a r y l o x y ,a r y l ,a r y l a k y l , h e t e r o a r y l ,a m i n o ,a l k y l a m i n o ,d i a l k y l a m i n o ,m o r p h o l i n o ,p i p e r i d i n o ,p y r r o l i d i n - 1 - y l ,p i p e r a Z i n - 1 - y l ,o ro t h e rf u n c t i o n a l i t y .

Aryla lkyl r e f e r s t o t h e groups RAr an dRHetAr, Where Ar i s a n a r y l g r o u p . HetAr i s a h e te r o a r y l g r o u p , and R s a s t r a i g h t - c h a i n o r b r a n c h e dc h a i na l i p h a t i cg r o u p .E x a m p l eo f a r y l a k l y lg r o u p si n c l u d eb e n Z y la n d f u r f u r y l .A r y l a l k y l g r o u p s c a no p t i o n a l l y b e u n s u b s t it u t e d o r s u b s t i t u t e dW i t h , e . g . , h a l o g e n , a l k y l ,a l k o x y,a l k y l t h i o ,t r i ? u o r o m e t h y l ,a c y l o x y ,h y d r o x y ,m e r c a p t o ,c a r b o x y ,a r y l o x y ,a r y l ,a r y l a l k y l ,h e t e r o a r y l ,a m i n o ,a l k y l a m i n o , d i a l k y l a m i n o ,m o r p h o l i n o , p e p e r i d i n o ,p y r r o l i d i n - 1 - y l ,p i p e r a Z i n - 1 - y l ,o r o t h e r f u n c t i o n a l i t y .

The t e r m h a l o o r h a l i d e r e f e r s t o ? u o r o , bromo,c h l o r o a n d i o d o s u b s t i t u e n t s .

The t e r m amino r e f e r s t o a chemical f u n c t i o n a l i t y N R R Where R a n d R a r e i n d e p e n d e n t l y h y d r o g e n ,a l k y l ,o r a r y l .The t e r m q u a t e r n a r y a m i n e r e f e r s t o t h ep o s i t i v e l y c h a r g e dg r o u pN+RR, W h e r eRR a n d R a r ei n d e p e n d e n t l y s e l e c t e d a n d a r e a l k y l o r a r y l .A a r t i c u l a ra m i n o g r o u p i s N H 2 .

A p h a r m a c e u t i c a la g e n t o r d r u g r e f e r s t o a c h e m i c a l

compound o r c o m p o s i t i o nc a p a b l e o f i n d u c i n g a d e s i r e dt h e r a p e u t i c o r p r o p h y l a c t i ce f f e c tWhen p r o p e r l y a d m i n i st e r e d t o a s u b j e c t .

A l l c h e m i c a l c o m p o u n d si n c l u d e b o t h t h e ( + )a n d ( )s t e r e o i s o m e r s , a s W e l l a s e it h e r t h e ( + ) o r ( )s t e r e o i s o m e r .

Other c h e m i s t r y t e r m sh e r e i n a r e used a c c o r d i n g t o conv e n t i o n a l u s a g e i n t h e a r t ,a s e x e m p l i ? e dby The M c G r a wH i l l D i c t i o n a r y o f C h e m i c a l T e r m s( 1 9 8 5 ) a n d T h e Cond e n s e d C h e m i c a lD i c t i o n a r y ( 1 9 8 1 ) .

T h e f o l l o W i n ge x a m p l e ss h o Wt h a tb o t h n o n p s y c h o a c t i v ec a n n a b i d i o l , a n d p s y c h o a c t i v ec a n n a b in o i ds s u c ha s THC,c a n p r o t e c t n e u r o n s from g l u t a m a t e i n d u c e d d e a t h , by amechanism i n d e p e n d e n t o f c a n n a b i n o i dr e c e p t o r s .C a n n a bi n o i d s a r e a l s o b e shoWn t o b e p o t e n t a n t i o x i d a n t s c a p a b l e o f

p r e v e n t i n g ROS o x i c i t y i n n e u r o n s .

EXAMPLE

P r e p a r a t i o n o f C a n n a b i n o i d s a n dN e u r o n a lC u l t u r e s

C a n n a b i d i o l ,THC n d r e a c t a nt s o t h e r t h a n t h o s e s p e c i ?c a l l yl i s t e db e l o WW e r e p u r c h a s e df r o m S i g m a C h e m i c a l ,


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U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B11 3

C o .( S t .L o u i s ,M o . ) .C y c l o t h i a Z i d e ,g l u t a m a t e r g i cl i g a n d sa n d M K - 8 0 1 Were o b t a i n e d from To c r i s Cooksonihydrorhodamine Was s u p p l i e d b y M o l e c u l a r P r o b e s

( E u g e n e ,O r e g . ) .T- b u t y lh y d r o p e r o x i d e ,t e t r a e t h y l a m m onium c h l o r i d e , f e r r i c c i t r a t ea n d sodium d i t h i o n i t e Were a l l

p u r c h a s e dfrom A l d r i c h A l l c u l t u r e media Were G i b c o /BRL ( M D )p r o d u c t s .

S o l u t i o n s o f c a n n a b i n o id s , c y c l o t h i a Z i d e a n d o t h e r l i p op h i l e s W e r e p r e p a r e d b y e v a p o r a t i n g a 1 0 mM t h a n o l i cs o l u t i o n ( u n d e r a s t r e a m o f n i t r o g e n ) i n a s i l i c o n i Z e d m i c r oc e n t r i f u g et u b e .D i m e t h y l s u l f o x i d e ( DM SO, l e s s t h a n0 .0 5 o f ? n a l volume) Wa s added t o e t h a n o l t o p r e v e n t t h el i p o p h i l e c o m p l e t e l y d r y i n g o n t o t h e t u b e W a l l .A f t e re v a p o r a t i o n , 1 ml o f c u l t u r e media Was a d d e d a n d t h e d r u gWas d i s p e r s e d u s i n g a h i g h p o W e rs o n i c p r o b e . S p e c i a la t t e n t i o n Wa s u sed t o ensure t h e s o l u t i o n did not overheat o rg e n e r a t e f o a m . F o l l o W i n gd i s p e r s a l ,a l ls o l u t i o n s W e r emadeu p t o t h e i r? n a l volume n s i l i c o n i Z e d g l a s s t u b e s by m i x i n gW i t h a n a p p r o p r i a t e q u a n t i t y o f c u l t u r e m e d i a .

P r i m a r yn e u r o n a lc u l t u r e sW e r ep r e p a r e d a c c o r d i n gt o t h emethod o f Ve n t r a e t a l . ( J .N e u r o c h e m .6 6 : 1 7 5 2 1 7 6 1 ,1 9 9 6 ) . F e t u s e sWere e x t r a c t e d by C e s a r i a ns e c t i o n from a 1 7d a y p r e g n a n t W i s t a rr a t ,a n d t h e f e r a lb r a i n s W e r ep l a c e di n t op h o s p h a t eb u f f e r e d s a l i n e . The c o r t i c e s Were t h e n d i s s e c t e do u t ,c u t i n t os m a l l p i e c e s a n d i n c u b a t e dW i t h p a p a i nf o rn i n eminutes a t 37 C . A f t e r t h i s t i m e t h e t i s s u e Wa s d i s s o c i a t e db y p a s s a g e t h r o u g ha ? r e p o l i s h e d P a s t e u r p i p e t t e ,a n d t h er e s u l t a n tc e l ls u s p e n s i o ns e p a r a t e d by c e n t r i f u g a t i o n o v e r ag r a d i e n t c o n s i s t in g o f 1 0 mg/ml b o v i n e s e r u ma l b u m i n a n d1 0 m g / m lo v o m u c o i d( a t r y p s i ni n h i b i t o r )i n E a r l sb u f f e r e ds a l t s o l u t i o n .The p e l l e tWas t h e n r e - s u s p e n d e d i n h i g hg l u c o s e ,p h e n o lr e d f r e eD u l b e c o sm o d i ? e dE a g l e smediumc o n t a i n i n g 1 0 f e t a lb o v i n e s e r u m , 2mM l u t a m i n e , 1 0 0I U p e n i c i l l i n ,a n d 1 0 0p i g / m ls t r e p t o m y c i n( DM E M ) .C e l l sW e r e c o u n t e d , t e s t e df o r v i t a l i t yu s i n g t h e t r y p a n b l u ee x c l u s i o n t e s t a n d s e e d e d o n t o p o l y - D - l y s i n e c o a t e d24m u l t i We l lp l a t e s .A f t e r 9 6 h o u r s ,1 0 pM u o r o - d e o x y u r i d i n ea n d 1 0 pM r i d i n e W e r e a d d e d t o b l o c k g l i a l c e l lg r o W t h .T h i s p r o t o c o l r e s u l t e d in a h i g h l y n e u r o n - e n r i c h e dc u l t u r e .

EXAMPLE 2

P r e p a r a t i o n o f A s t r o c y t e s a n d C o n d i t i o n e dM e d i a

A s t r o c y t e c o n d i t i o n e dDMEM Was u s e d t h r o u g h o u tt h eA M PA / k a i n a t et o x i c i t yp r o c e d u r ea n d f o l l o W i n gg l u t a m a t ee x p o s u r ei n t h e NMDAr e d i a t e d t o x i c i t yp r o t o c o l . Media

Wa s c o n d i t i o n e db y 24 hour t r e a t m e n t o v e r a con?uen t l a y e ro f t y p e I a s t r o c y t e s , p r e p a r e d f r o m t W od a y o l d W i s t a r r a tp u p s . C o r t i c e s Were d i s s e c t e d , c u t i n t o s m a l l p i e c e s , ande n Z y m a t i c a l l yd i g e s t e d W i t h0 . 2 5 %t r y p s i n .T i s s u e Was t h e nd i s s o c i a t e d by p a s s a g e t h r o u g ha ? r e p o l i s h e d P as t e u rp i p e t t ea n d t h ec e l ls u s p e n s i o np l a t e d i n t ou n t r e a t e d 7 5 cm2T- ? a s k s . A f t e r 24 h o u r s t h e media Was r e p l a c e d and u n a tt a c h e d c e l l sr e m o v e d .Once a s t r o c y t e s a c h i e v e dc o n ? u e n c e ,c e l l s Were d i v i d e d i n t o f o u r ? a s k s . M ed i a f o r e x p e r i m e n t sWas c o n d i t i o n e d by a 24 hour e x p o s u r et o t h e s e a s t r o c y t e s ,a f t e r Which t i m e i t Wa s f r o Z e n a t 20 C . u n t i l u s e . A s t r o c y t ec u l t u r e s Were used t o c o n d i t i o n DMEM o r no l o n g e r t h a ntWo months.

EXAMPLE

NMDA e d i a t e d To x i c i t y S t u d i e s

G l u t a m a t en e u r o t o x i c i t y c a n b e m e d i a t e d by NMDA,AMPA r k a i n a t e r e c e p t o r s . To exa mine NMDAr mediatedt o x i c i t y ,c u l t u r e d n e u r o n s ( c u l t u r e d f o r 1 4 1 8d a y s ) W e r e

10

1 5

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

1 4e x p o s e d t o 250 pM l u t a m a t e f o r 1 0 m i n u t e s i n a magnesium f r e e s a l i n e s o l u t i o n . The s a l i n e Wa s composed o f 1 2 5mM a C l , 2 5 mM l u c o s e , 1 0 mM EPES (pH . 4 ) ,5 mMKCl, 1 . 8 mM a l c i u m c h l o r i d e a n d 5 b o v i n e seruma l b u m i n .F o l l o W i n ge x p o s u r e ,c e l l s Were Washed t W i c eW i t h

s a l i n e ,a n d i n c u b a t e d f o r 1 8 h o u r s i n c o n d i t i o n e d DMEM.The l e v e l o f l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e( L D H ) i n t h e media Wasused a s a n index o f c e l l i n j u r y .

To x i c i t y W a s c o m p l e t e l yp r e v e n t e d b y a d d i t i o n o f t h eN M D A ra n t a g o n i s t ,MK-801 ( 5 0 0 nM, d a t a n o t s h o W n ) .H o W e v e r ,F I G . 1 A shoWs t h a tc a n n a b i d i o l a l s op r e v e n t e dn e u r o t o x i c i t y(maximum r o t e c t i o n8 8 : 9 % )W i t ha n E C 5 Oo f2 4p s p e c i ? c a l l ya b o u t 3 . 5p M ) .

EXAMPLE 4

AMPA n d K a i na t e R e c e p t o rM e d i a t e dTo x i c i t yS t u d i e s

U n l i k eNMDA e c e p t o r s , W h i c ha r e r e g u l a t e d by magnes i u m i o n s ,A M PA / k a i n a t er e c e p t o r s r a p i dl yd e s e n s i t i Z ef o ll o W i n g l i g a n d b i n d i n g . T o e x a m i n e AMPA a n d k a i n a t er e c e p t o r mediated t o x i c i t y, n e u r o n sWere c u l t u r e d f o r 7 13d a y s , t h e n e x p o s e d t o 1 0 0 pM g l u t a m a t e a n d 5 0 pMc y c l o t h i a Z id e ( u s e d t o p r e v e n t AMPA r e c e p t o rd e s e n s i t i Z a t i o n ) . C e l l s W e r ei n c u b a t e d W i t h g l u t a m a t ei n t h ep r e s e n c e o f 5 0 0 nM M K - 8 0 1 ( a n NMDAr n t a g o n i s t ) f o r1 8 2 0h o u r s p r i o r t o a n a l y s i s .S p e c i ? cAMPA n d k a i n a t er e c e p t o r l i g a n d s W e r e a l s o u s e d t o s e p a r a t e l y e x a m i n et h ee f f e c t s o f c a n n a b i n o i d s on AMPA and k a i n a t e r e c e p t o rm e d i a t e de v e n t s . F l u o r o W i l l a r d i i n e( 1 . 5 p M ) Was t h e AMPAa g o n i s ta n d 4 - m e t h y lg l u t a m a t e ( 1 0 pM) W a s t h ek a i n a t ea g o n i s t u s e d t o i n v e s t i g a t er e c e p t o r m e d i a t e dt o x i c i t y .Wh e ns p e c i ? c a l l ye x a m i n i n gk a i n a t e r e c e p t o ra c t i v i t y ,c y c l o t h i a Zi d e Was r e p l a c e d W i t h 0 . 1 5 mg/ml C o n c a n a v a l i n - A .

C a n n a b i d i o lp r o t e c t i o na g a i n s tA M PA / k a i n a t em e d i a t e dn e u r o t o x i c i t y i s i l l u s t r a t e din F I G . 1 B , W h e r eLDH n t h em e d i a Was used a s a n index o f c e l l i n j u r y . The neuroprot e c t i v e e f f e c t o f c a n n a b i d i o l Was s i m i l a r t o t h a t observed i nt h eNMDA e d i a t e d t o x i c i t ym o d e l( F I G . 1 A ) .C a n n a b i d i o lp r e v e n t e dn e u r o t o x i c i t y( m a x i m u mp r o t e c t i o n8 0 : 1 7 % )W i t h a n E C 5 Oo f 2 4pM ( s p e c i ? c a l l y a b o u t 3 . 3 p M ) .Comparable r e s u l t s Were o b t a i n e d W i t h e i t h e r t h e AMPAr e c e p t o r l i g a n d , ? u o r o W i l l a r d i i n eo r t h e k a i n a t e r e c e p t o r

s p e c i ? cl i g a n d ,4 - m e t h y l - g l u t a m a t e( d a t an o ts h o W n ) .H e n c ec a n n a b i d i o lp r o t e c t s s i m i l a r l y a g a i n s tt o x i c i t ym e d i a t e db yNMDA, AMPA r k a i n a t e r e c e p t o r s .

U n l i k ec a n n a b i d i o l ,T H C s a l i g a n d ( a n d a g o n i s t ) f o rt h eb r a i n c a n n a b i n o i d r e c e p t o r . The a c t i o n o f THC t t h e cann a b i n o i d r e c e p t o rh a s b e e n p r o p o s e dt o e x p l a i nt h ea b i l i t yo fTHC t o p r o t e c t n e u r o n s from NMDAr t o x i c i t y i n v i t r o .HoWever i n A M P A / k a i n a t er e c e p t o r t o x i c i t ya s s a y s , THCa n d c a n n a b i d i o lW e r es i m i l a r l yp r o t e c t i v e( F I G . 2 A ) , i n d ic a t i n gt h a tc a n n a b i n o i d n e u r o p r o t e c t i o ni s i n d e p e n d e n t o fc a n n a b i n o i d r e c e p t o r a c t i v a t i o n . T h i s Was con?rmed byi n c l u s i o n o f c a n n a b i n o i dr e c e p t o r a n t a g o n i s tSR-141716A nt h e c u l t u r e m e d i a (SR i n F I G . 2 B ) . S e e Mansbach e t a l . ,P s y c h o p h a r m a c o l o g y1 2 4 : 3 1 5 2 2 ,1 9 9 6 , f o r ad e s c r i p t i o no f SR-141716A. N e i t h e r THC o r c a n na b i di o l n e u r o p r o t e ct i o nWas a f f e c t e db y c a n n a b i n o i dr e c e p t o r a n t a g o n i st ( F I G .2 B ) .

EXAMPLE

C y c l i c Vo l t a m e t e r yS t u d i e s o r Re D o x P o t e n t i a l s

To i n v e s t i g a t e W h e t h e r c a n n a b i n o i d s p r o t e c t n e u r o n sa g a i n s tg l u t a m a t ed a m a g eb y r e a c t i n gW i t h R O S ,t h ea n t i


17/26

U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B11 5

o x i d a n t p r o p e r t i e s o f c a n n a b i d i o l a n d o t h e r c a n n a b i n o i d sWere a s s e s s e d . C y c l i cv o l t a m e t r y , a p r o c e d u r et h a t measurest h e a b i l i t y o f a c ompound o a c c e p t o r d o n a t e e l e c t r o n s u n d e ra v a r i a b l e v o l t a g e p o t e n t i a l , Wa s used t o measure t h e o x id a t i o n p o t e n t i a l s o f s e v e r a l n a t u r a l a n d s y n t h e t i c c a n n a b

i n o i d s . These s t u d i e s Were performed W i t h a n EG&G r i nc e t o n A p p l i e d R e s e a r c hp o t e n t i o s t a t / g a l v a n o s t a t( M o d e l273/PAR 270 s o f t Wa r e , N J ) .The W o r k i n ge l e c t r o d e Was ag l a s s y c a r b o n d i s k W i t h a p l a t i n u m c o u n t e r e l e c t r o d e a n ds i l v e r / s i l v e rc h l o r i d e r e f e r e n c e .T e t r a e t h y l a m m o n i u mc h l or i d e i n a c e t o n i t r i l e ( 0 . 1M ) Was s e d a s a n e l e c t r o l y t e .C y c l i cvoltametry scans Were d o n e f rom + 0 t o 1 . 8 V t scan r a t e of1 0 0 mV e r s e c o n d . The r e d u c i n g a b i l i t yo f c a n n a b i d i o l(CBD), THC, HU-211, a n d BHT e r e m e a s u r e d i n t h i sf a s h i o n . A n a n d a m i d e ,a c a n n a b i n o i dr e c e p t o r l i g a n d W i t h o u ta cannabinoid l i k e s t r u c t u r e , Wa s u sed a s a non-responsivec o n t r o l . Each e x p e r i m e n tWas r e p e a t e d t W i c eW i t h e s s e nt i a l l yt h e same r e s u l t s .

C a n n a b i d i o l ,THC n d t h e s y n t h e t i c c a n n a b i n o i dHU-211a l l donated e l e c t r o n s a t a s i m i l a r p o t e n ti a l a s t h e a n t i o x i d a n tBHT. Anandamide ( a r a c h i d o n y l e t h a n o l a m i d e ) d i d n o tu n d e r g oo x i d a t i o n a t t h e s ep o t e n t i a l s( F I G .3 ) .S e v e r a lo t h e rn a t u r a la n d s y n t h e t i cc a n n a b i n o i d s , i n c l u d i n gc a n n a b i d i o l ,n a b i l o n e , a n d l e v a n a n t r o d o lW e r e a l s o t e s t e d ,a n d t h e y t o oe x h i b i t e d o x i d a t i o n p r o ? l e s s i m i l a r t o c a n n a b i d i o l a n d THC( d a t an o ts h o W n ) .

EXAMPLE

I r o nC a t a l y Z e dD i h y d r o r h o d a m i n eO x i d a t i o n( F e n t o nR e a c t i o n )

The a b i l i t yo f c a n n a b i n o i ds t o b e r e a d i l y o x i d i Z e d , a si l l u s t r a t e d i nE x a m p l e5 , i n d i c a t e d t h e y p o s s e s s a n t i ox i da n t

p r o p e r t i e s c o m p a r a b l et o BHT. T h e a n t i o x i d a n t a c t i v i t yo fBHT Wa s examined i n a Fenton r e a c t i o n , i n Which i r o n i sc a t a l y Z e dt o p r o d u c eROS. C a n n a b i d i o l(CBD) a n d t e t r a h yd r o c a n n a b i n o l(THC) Were e v a l u a t e d f o r t h e i ra b i l i t yt op r e v e n t o x i d a t i o n o f d i h y d r o r h o d a m i n et o t h e ? u o r e s c e n tcompound r h o d a m i n e . O x i d a n tWas g e n e r a t e d b y f e r r o u sc a t a l y s i s ( d i o t h i o n i t er e d u c e df e r r i cc i t r a t e )o ft - b u t y lh y d r op e r o x i d e i n a 5 0 : 5 0W a t e r : a c e t o n i t r i l e( v / v )s o l u t i o n .D i h yd r o r h o d a m i n e( 5 0 p M ) Was i n c u b a t e dW i t h 3 0 0 pM - b u t y lh y d r o p e r o x i d ea n d 0 . 5 pM i r o n f o r 5 m i n u t e s . A f t e r t h i st i m e ,o x i d a t i o n W a sa s s e s s e d b y s p e c t r o ? u o r i m e t r y( E x c i t =500 nm, Emiss=570 n m ) . Va r i o u sc o n c e n t r a t i o n so f c a n n a bi n o i d s and BHT Were i n c l u d e d t o examine t h e i r a b i l i t y t op r e v e n t d i h y d r o r h o d i a m i n eo x i d a t i o n .

C a n n a b i d i o l , T H C a n d B H T a l l p r e v e n t e d d i h y d r o rhodamine o x i d a t i o n in a s i m i l a r ,c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n tm a n n e r( F I G . 4 ) , i n d i ca t i n g t h a tc a n n a b i n o i d sh a v e a n t i o x id a n t p o t e n c yc o m p a r a b l et o BHT.

To c o n ? r m t h a t cannabinoids a c t a s a n t i o x i d a n t s i n t h ei n t a c t c e l l ,neurons Were a l s o i n c u b a t e d With t h e o x i d a n tt - b u t y lh y d r o p e r o x i d ea n d v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f c a n n ab i d i o l( F I G . 5 A ) . T h e t - b u t y lh y d r o p e r o x i d eo x i d a n t W a sc h o s e n f o r i t s s o l u b i l i t y i nb o t h a q u e o u s a n do r g a n i cs o l v e n t s , W h i c hf a c i l i t a t e so x i d a t i o n i n b o t h c y t o s o l i c a n dmembrane c e l lc o m p a r t m e n t s .C e l l t o x i c i t y Was a s s e s s e d1 8 2 0h o u r sa f t e ri n s u l tb y m e a s u r i n gl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e( L D H ) r e l e a s e i n to t h e c u l t u r e m e d i a . A l le x p e r i m e n t sW e r ec o n d u c t e dW i t h t r i p l eo r q u a d r u p l ev a l u e s a t e a c h p o i n t a n da l lp l a t e sc o n t a i n e d p o s i t i v e( g l u t a m a t ea l o n e )a n d b a s e l i n ec o n t r o l s . The a s s a y Was v a l i d a t e d b y comparison W i t h a nXTT a s e d m e t a b o l i ca c t i v i t ya s s a y .As shoWn i n F I G . 5 A ,c a n n a b i d i o l p r o t e c t e d n e u r o n s a g a i n s t ROS t o x i c i t y i n ad o s e r e l a t e d m a n n e r , W i t h a n EC5O o f a b o u t 6 p M . Them a x i m u m p r o t e c t i o n o b s e r v e dWa s 8 8 : 9 .

10

1 5

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

1 6C a n n a b i d i o lWa s a l s o compared W i t hk n o W n a n t i o x i d a n t s

in a n AM PA/ka ina te t o x i c i t y p r o t o c o l . Neurons Weree x p o s e d t o 1 0 0 p M g l u t a m a t e a n d e q u i m o l a r( 5 pM)c a n n a b i d i o l , o t - t o c o p h e r o l ,B H T o r a s c o r b a t e ( F I G . 5 B ) .A l t h o u g ha l l o f t h e a n t i o x i d a n t s a t t e n u a t e d g l u t a m a t e

t o x i c i t y ,c a n n a b i d i o l Was s i g n i ? c a n t l y more p r o t e c t i v e t h a ne i t h e r o t - t o c o p h e r o l o r a s c o r b a t e . The s i m i l a r a n t i o x i d a n ta b i l i t i e so f c a n n a b i d i o l a n d BHT n t h i s c h e m i c a l s y s t e m( F I G . 4 ) , a n d t h e i rc o m p a r a b l ep r o t e c t i o ni n n e u r o n a lc u lt u r e s( F I G . 5 B ) ,i m p l i e s t h a tc a n n a b i d i o l n e u r o p r o t e c t i o ni sdue t o an a n t i o x i d a n t e f f e c t .

EXAMPLE 7

I n v i v o Rat S t u d i e s

The m i d d l ec e r e b r a l a r t e r y o f c h l o r a l h y d r a t e a n e s t h e t i Z e dr a t s Was o c c l u d e db y i n s e r t i o n o f s u t u r e t h r e a d i n t o i t . Theanimals Were alloWed t o recover f rom t h e a n e s t h e t i c andm o v e f r e e l y f o r a p e r i o d o f tWo h o u r s . A f t e r t h i st i m e t h es u t u r e Wa s removed under mild a n e s t h e t i c and t h e a n i m a l salloWed t o r e c o v e r f o r 48 h o u r s . T h en t h e animals Weret e s t e d f o rn e u r o l o g i c a ld e ? c i t s ,s a c r i ? c e d , a n d t h e i n f a r c tvolume c a l c u l a t e d . To e x a m i n et h e i n f a r c t v o l u m e ,a n i m a l sWere a n e s t h e t i Z e d , e x - s a n g u i n a t e d , a n d a m e t a b o l i c a l l ya c t i v ed y e ( 3 - p h e n y l t e t r a Z o l i u m c h l o r i d e )W a s p u m p e dt h r o u g h o u tt h eb o d y . A l l l i v i n gt i s s u e sW e r es t a i n e dp i n k b yt h e d y e , W h i l em o r b i d r e g i o n s o f i n f a r c t e d t i s s u er e m a i n e dW h i t e . B r a i n s Were t h e n ? xe d f o r 24 h o u r s i n f o r m a l d e h y d e ,s l i c e d a n d t h e i n f a r c t volumes m e a s u r e d .

One h o u r p r i o r t o i n d u c t i o n o f i s c h e m i a 2 0 mg/kg o fc a n n a b i d i o l Was a d m i n i s t e r e d b y i n t r a - p e r i t o n e a li n j e c t i o n( i p ) i n a 9 0 s a l i n e : 5 % e m u l p h o r 6 2 0( e m u l s i ? e r ) : 5 %

e t h a n o l v e h i c l e . A e c o n d i p 1 0 mg/kg d o s e o f c a n n a b i d i o lWas a d m i n i s t e r e d 8 h o u r s l a t e r u s i n g t h e same v e h i c l e .C o n t r o l a n i m a l sr e c e i v e d i n j e c t i o n so f v e h i c l e W i t h o u td r u g .I V d o s e s Would b e e x p e c t e dt o b e 35t i m e s l e s s b e c a u s eo fr e d u c t i o n o f ? r s t p a s s m e t a b o l i s m .

The i n f a r c t s i Z e a n d n e u r o l o g i c a la s s e s s m e n t o f t h e t e s ta n i m a l s i s shoWn T a b l e 1 .

TABLE

C a n n a b i d i o lp r o t e c t s r a tb r a i n s f r o m i s c h e m i a damage

Volume o f I n f a r c t B e h a v i o r a lD e ? c i t(mm3) S c o r e

A n im a l D r u g C o n t r o l D r u g C o n t r o l

1 1 0 8 . 2 1 1 0 . 5 3 2

2 8 3 . 8 5 1 1 9 . 6 4 43 8 . 4 1 1 1 8 . 9 3 44 7 5 . 5 1 7 7 . 7 1 45 6 0 . 5 3 3 3 . 8 9 1 3

6 2 7 . 5 2 2 5 5 . 5 1 57 2 3 . 1 6 143 1 4

M e a n 5 5 . 3 1 3 7 . 0 2 . 0 3 . 7SEM 1 3 . 8 2 5 . 7 0 . 0 . 4

p = 0 . 0 1 6 s i g n i ? c a n t p = 0 . 0 1 5 s i g n i ? c a n t

* N e u r o l o g i c a ls c o r i n g i s p e r f o r m e do n a s u b j e c t i v e 1 - 5 s c a l eo f i m p a i rm en t . 0 = n o impai rment , 5 = severe ( p a r a l y s i s )

T h i s d a t a shoWs t h a t i n f a r c t s i Z e Was a p p r o x i m a t e l yh a l v e di n t h e a n i m a l s t r e a t e d W i t h c a n n a b i d i o l , Which Was a l s oa c c o m p a n i e dby a s u b s t a n t i a l improvement i n t h e n e u r ol o g i c a l s t a t u s o f t h e a n i m a l .

T h e s e s t u d i e s W i t h t h e n o n p s y c h o t r o p i cm a r i j u a n ac o n s t i t u e n t , c a n n a b i d i o l , d e m o n s t r a t et h a tp r o t e c t i o n c a n b ea c h i e v e d a g a i n s tb o t h g l u t a m a t e n e u r o t o x i c i t y a n d f r e er a d i c a li n d u c e dc e l ld e a t h .THC, t h ep s y c h o a c t i v ep r i n c i p l e


18/26

U S 6 , 6 3 0 , 5 0 7B11 7

o f c a n n a b i s , a l s o b l o c k e d g l u t a m a t e n e u r o t o x i c i t y W i t h ap o t e n c y s i m i l a r t o c a n n a b i di o l . I n b o t h c a s e s , n e u r o p r o t e ct i o n i s u n a f f e c t e dby t h e p r e s e n c e o fa c a n n a b i n o i dr e c e p t o ra n t a g o n i s t .T h e s er e s u l t st h e r e f o r es u r p r i s i n g l y d e m o n s t r a t et h a t c a n n a b i n o i d scan have u s e f u l t h e r a p e u t ice f f e c t s t h a t a r e

n o t m e d i a t e dby c a n n a b i n o i dr e c e p t o r s , and t h e r e f o r e a r e n o tn e c e s s a r i l ya c c o m p a n i e db y p s y c h o a c t i v es i d ee f f e c t s .C a nn a b i d i o l a l s o a c t s a s a n a n t i - e p i l e p t i c and a n x i o l y t i c , Whichmakes t p a r t i c u l a r l y u s e f u l i n t h e t r e a t m e n t o f n e u r o l o g i c a ld i s e a s e s i n Which neuroanatomic d e f e c t s c a n p r e d i s p o s e t os e i Z u r e s( e . g .s u b a r a c h n o i d h e m o r r h a g e ) .

A p a r t i c u l a r a d v a n t ag eo f t h ec a n n a b i n o i dc o m p o u n d so ft h ep r e s e n t i n v e n t i o n i s t h a tt h e y a r eh i g h l y l i p o p h i l i c ,a n dh a v e good p e n e t r a t i o n i n t o t h e c e n t r a l n e r v o u ss y s t e m . Thevolume o f d i s t r i b u t i o n o f some o f t h e s e compounds i s a tl e a s t1 0 0 L n a 7 0 k g p e r s o n ( 1 . 4 L / k g ) , more p a r t i c u l a r l ya t l e a s t 250 L , and most p a r t i c u l a r l y 500 L r even 700 L na 7 0 k g p e r s o n ( 1 0 L / k g ) .T h e l i p o p h i l i c i t yo f p a r t i c u l a rcompounds s a l s o a b o u t a s g r e a t a s t h a t o f THC, c a n n a b i d i o l

o r o t h e r compounds t h a th a v e e x c e l l e n t p e n e t r a t i o n i n t ot h eb r a i n a n d o t h e r p o r t i o n s o f t h e C N S .

C a n n a b i n o i d st h a tl a c k p s y c h o a c t i v i t yo r p s y c h o t o x i c i t ya r e p a r t i c u l a r l y u s e f u l embodiments o f t h e p r e s e n ti n v e n t i o n , b e c a u s e t h e a b s e n c e o f s u c h s i d e e f f e c t sa l l o W sv e r y h i g h d o s e so f t h e d r u g t o b e u s e d W i t h o u t e n c o u n t e r in gu n p l e a s a n t s i d ee f f e c t s( s u c h a s d y s p h o r i a ) o r d a n g e r o u sc o m p l i c a t i on s ( s u c ha s o b t u n d a t i o n i n a p a t i e n t W h o ma ya l r e a d y h a v e a n a l t e r e dm e n t a l s t a t u s ) .F o r e x a m p l e ,t h e r ap e u t i c a n t i o x i da n t b l o o d l e v e l s o f c a n n a b i d i o l c a n b e 5 2 0m g / k g ,W i t h o u ts i g n i ? c a n t t o x i c i t y ,W h i l e b l o o dl e v e l so fp s y c h o a c t i v e c a n n a b i n o i d sa t t h i s l e v e lWould p r o d u c eo b t u n d a t i o n ,h e a d a c h e , c o n j u n c t i v a li r r i t a t i o n ,a n d o t h e rp r o b l e m s . P a r t i c u l a re x a m p l e so f t h e c o m p o u n d so f t h ep r e s e n t i n v e n t i o n h a v e loW a f ? n i t y t o t h e c a n n a b i n o i dr e c e p t o r , f o re x a m p l e a K i o f g r e a t e r t h a n 2 5 0 nM, f o re x a m p l eKi5001000 nM. A ompound W i t h a K; 0 0 0n M s p a r t i c u l a r l y u s e f u l ,W h i c hc o m p o u n dh a s e s s e n t i a l l yn o p s y c h o a c t i v i t ym e d i a t e dby t h e c a n n a b i n o i dr e c e p t o r .

C a n n a b i d i o lb l o c k s g l u t a m a tet o x i c i t yW i t he q u a lp o t e n c yr e g a r d l e s s o f W h e t h e rt h e i n s u l ti s m e d i a t e d b y N M D A ,AMPA r k a i n a t e r e c e p t o r s . C a n n a b i d i o l and THC haveb e e n shoWn t o b e c o m p a r a b l et o t h e a n t i o x i d a n t BH T, b o t hi n t h e i ra b i l i t yt op r e v e n t d i h y d r o r h o d a m i n eo x i d a t i o n a n d i nt h e i rc y c l i cv o l t a m e t r i cp r o ? l e s .S e v e r a l s y n t h e t i cc a n n a bi n o i d s a l s oe x h i b i t e d p r o ? l e s s i m i l a r t o t h eBHT, a l t h o u g hanandamide, Which i s n o t s t r u c t u r a l l y r e l a t e d t oc a n n a b i n o i d s ,d i d n o t .T h e s e ? n d i n g s i n d i c a t e t h a tc a n n a bi n o i d s a c t a s a n t i o x i d a n t s i n a n o n - b i o l o g i c a l s i t u a t i o n ,Which Was con?rmed i n l i v i n g c e l l sby shoWing t h a tc a nn a b i d i o l a t t e n u a t e s h y d r o p e r o x i d e i n d u c e dn e u r o t o x i c i t y .T h e potency of cannabidiol a s an a n t i o x i d a n t Wa s e x a m i n e dby c o m p a r i n gi t on a n e q u i m o l a rb a s i s W i t h t h r e e o t h e rc o m m o n l yu s e d c o m p o u n d s .

I n t h eA M PA / k a i n a t er e c e p t o rd e p e n d e n tn e u r o t o x i c i t ym o d e l , c a n n a b i d io l n e u r o p r o t e c t i o nWas c o m p a r a b l et o t h ep o t e n t a n t i o x i d a n t ,BHT, b u t s i g n i ? c a n t l y g r e a t e rt h a n t h a tobserved With e i t h e r o t - to c o p h e r o l o ra s c o r b a t e . T h i s u n exp e c t e d s u p e r i o r a n t i o x i d a n ta c t i v i t y( i nt h ea b s e n c e o fB H Tt u m o r p r o m o t i n g a c t i v i t y )shoWs f o r t h e ? r s t t i m e t h a tc a n n a b i d i o l , and o t h e r c a n n a b i n o i d s , c a n be used a s a n t io x i d a n t d r u g s i n t h e t r e a t m e n t ( i n c l u d i ngp r o p h y l a x i s )o fo x i d a t i o n a s s o c i a t e dd i s e a s e s , and s p a r t i c u l a r l y u s e f u l a s an e u r o p r o t e c t a n t .T h e t h e r a p e u t i cp o t e n t i a lo f n o n p s y c h o a ct i v ec a n n a b i n o i d si s p a r t i c u l a r l yp r o m i s i n g ,b e c a u s e o f t h ea b s e n c e o f p s y c h o t o x i c i t y, a n d t h e a b i l i t yt o a d m i n i s t e rh i g h e r d o s e s t h a n W i t hp s y c h o t r o p i cc a n n a b i n o i d s , s u c h a sT H C . P r e v i o u ss t u d i e s h a v e a l s o i n d i c a t e d t h a t c a n n a b i d i o l

10

1 5

20

25

30

35

40

45

55

60

6 5

1 8i s n o t t o x i c , even Wh en c h r o n i c a l l y a d m i n i s t e r e d t o h u man so r g i v e n i n l a r g ea c u t e d o s e s ( 7 0 0 m g / d a y ) .

EXAMPLE

E f f e c t o f C a n n a b i d i o lo n L i p o x y g e n a s eEnZymes

T h i s example d e s c r i b e s i n v i t r o a n d in v i v o a s s a y s t oe x a m i n et h e e f f e c to f c a n n a b i d i o l ( C B D ) on t h r e e l i p o x yg e n a s e ( L O )e n Z y m e s :5 - L O , 12-LO a n d 1 5 - L O .I n v i t r oEnZyme A s s a y

The b i l i t yo f CBD o i n h i b i t l i p o x y g e n a s eWas examinedb y m e a s u r i n gt h e t i m e d e p e n d e n tc h a n g e i n a b s o r p t i o n a t2 3 4 nM f o l l o W i n ga d d i t i o n o f 5 U o f e a c h l i p o x y g e n a s e( r a b b i t1 5 - L Op u r c h a s e df r o mB i o m o l( PA ) ,p o r c i n e 1 2 - L Op u r c h a s e d f r o m Cayman c h e m i c a l s ( M 1 ) )t o a s o l u t i o nc o n t a i n i n g1 0 pM ? n a l c o n c e n t r a t i o n )l i n o l e i c a c i d .

EnZyme s t u d i e s Were p e r f o r m e du s i n g a u . v .s p e c t r o p h ot o m e t e r and a 3 ml q u a r t Z c u v e t t ec o n t a i n i n g 2 . 5 ml o f as t i r r e ds o l u t i o n o f 1 2 . 5 pM s o d i u ml i n o l e i ca c i d ( s o d i u m

s a l t )i n s o l u t i o nA(25 mM r i s ( p H8 . 1 ) , 1mM E D TA . 1 %m e t h y lc e l l u l o s e ) .The r e a c t i o n Was i n i t i a t e db y a d d i t i o n o f0 . 5 ml enZyme s o l u t i o n ( 1 0 U/ml enZyme n s o l u t i o n A) a n dr e c o r d e d f o r 60 s e c o n d s . Lipoxygenase e x h i b i t s nonM i c h a e l i s - M e n t e nk i n e t i c s ,a n i n i t i a l l a g ( p r i m i n g )p h a s ef o l l o W e db y a l i n e a rp h a s e W h i c hi s t e r m i n a t e d b y p r o d u c ti n h i b i t i o n .T h e s e c o m p l i c a t i o n sW e r e r e d u c e db y a s s e s s i n ge n Z y m ea c t i v i t y( c h a n g e i n a b s o r p t i o n ) o v e r t h e s t e e p e s t 20 s e c o n d p e r i o d i n a 60 s e c o n d r u n t i m e . R e c o r d i n g se x a m i n e d t h e a b s o r p t i o n a t 234 nm minus t h e v a l u e a t ar e f e r e n c e Wavelength of 2 8 0 n m . L i n o l e i c a c i d Was used a st h e s u b s t r a t e r a t h e r t h a n a r a c h i d o n i ca c i d ,b e c a u s et h e p r o du c t s a r e l e s s i n h i b i t o r y t o t h e enZyme, t h e r e b y p r o v i d i ngal o n g e r l i n e a rp h a s e .C e l l P u r i ? c a t i o n a n d S e p a r a t i o n

Hu m a n l a t e l e t sa n d l e u k o c y t e sW e r ep u r i ? e d f r o mb u f f yc o a t p r e p a r a t i o n s( N I HB l o o d B a n k )u s i n g a s t a n d a r d F i c o l lb a s e d c e n t r i f u g a t i o n method u s e d i n b l o o d b a n k s . P r i o r t ou s e , c e l l s Were Wash ed t h r e e t i m e s t o e l i m i n a t e contaminati n g c e l lt y p e s .C u l t u r e dr a tb a s o p h i l l i c l e u k e m i ac e l l s(R B L2 H 3 ) Were used a s a source of 5 - l i p o x y g e n a s e .I n v i v o D e t e r m i n a t i o no f L i p o x y g e n a s eA c t i v i t y

C e l l s Were i n c u b a t e dW i t ha r a c h i d o n i ca c i d and s t i m u l a t e dW i t h t h e c a l c i u m i o n o p h o r eA23187. L i p i d s W e r ee x t r a c t e da n d s e p a r a t e d b y r e v e r s e p h a s e HPLC. P r o d u c t f o r m a t i o nWa s assessed a s t h e a r e a of a p e a k t h a t co-eluted With ana u t h e n t i c s t a n d a r d , had a g r e a t e r absorbance a t 236 nm h a na t e i t h e r 210 o r 280 n m , a n d t h e formation o f Which Wa s

i n h i b i t e d by a l i p o x y g e n a s ei n h i b i t o r .C e l l p e l l e t s Were t r i t u r a t e d i nDMEM c u l t u r e m e d i a ,

a l i q u o t e d a n d p r e - i n c u b a t e d f o r 1 5 m i n u t e s W i t h2 0 pMa r a c h i d o n i c a c i d

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