LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DASAR

KI-3261 METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK

Percobaan 6

UREASE

Nama : Nisrina Rizkia

NIM : 10510002

Kelompok : 6

Tanggal Percobaan : 21 Maret 2013

Tanggal Laporan : 28 Maret 2013

Asisten Praktikum : Ka Sari

LABORATORIUM BIOKIMIAPROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2013

UREASE

I. Tujuan

Menentukan kadar urea dalam sampel urin dengan metode titrasi

II. Dasar Teori

Urin adalah cairan yang disekresikan oleh ginjal dan dikeluarkan dari tubuh

melalui proses urinasi. Kandungan urin diantaranya garam anorganik, urea, senyawa

organik dan garam ammonium organik. Diantara kandungan tersebut urea adalah

kandungan terbanyak yaitu 13.4 mg/L dari 37.057 mg/L (Putnam, 1971). Penetapan

kadar urea dalam tubuh sangatlah penting karena dapat dijadikan analisis untuk

mengetahui disfungsi ginjal. Kadar urea di dalam urin atau cairan lainnya dapat

ditentukan secara enzimatik dengan enzim urease menggunakan alat Conway. Urea

akan diubah menjadi ammonium karbonat. Dengan penambahan alkali, ammonia akan

dibebaskan. Amonia yang bebas akan berdifusi ke dalam cawan-cawan yang berisi

larutan asam borat, sehingga terikat menjadi ammonium tetraborat. Kemudian dititrasi

dengan asam sulfat atau asam klorida menggunakan indikator Tashiro, sehingga kadar

urea dapat ditentukan. Reaksi yang terjadi adalah:

CO (NH2)2 + 2 H2O ⟶ (NH4)2CO3

(NH4)2CO3 ⇌ 2 NH4+ + CO3

2-

2 NH4+ + 2OH- ⇌ 2 NH4OH

2 NH4OH ⟶ 2 NH3 + 2H2O

2 NH3 + 2 H3BO3 ⟶ 2 NH4+ + 2 H2BO3

-

2 NH4+ + 2 H2BO3

- + 2H+ ⟶ 2 NH4+ + 2 H3BO3

III. Data Pengamatan

Alat Conway V titran (mL)

Conway I 0.725

Conway II 0.1

Conway III 4.35

Conway IV 0.075

IV. Perhitungan dan Pengolahan Data

V NH4+ = (VIII - VIV ) – ( VI – VII )

V NH4+ = (4.35 - 0.075 ) – ( 0.725 – 0.1 ) mL

V NH4+ = 3.65 mL

Mol NH4+ = V NH4

+ [HCl]

Mol NH4+ = 3.65 mL x 0.005 M

Mol NH4+ = 0.01825 mmol

Mol urea = ½ mol NH4+

Mol urea = ½ 0.01825 mol

Mol urea = 0.009125 mol

Massa urea = mol urea x Mr urea

Massa urea = 0.009125 mmol x 60 gram/mol

Massa urea = 0.5475 mgram

Kadar urea = massa urea

volumeurine

Kadar urea = 0.5475 mg

0.2mL = 2.7375 mg/mL

V. Pembahasan

Pada percobaan ini ditentukan kadar urea dalam sampel urin manusia. Teknik yang

dilakukan dalam percobaan ini adalah microdifusi Conway. Pada salah satu sisi pemisah

ditambahkan K2CO3 jenuh kemudian pada sisi lainnya ditambahkan urin, aquadest, urin dan

larutan urease, atau aquadest dan laruan urease. Pada bagian tengah diisi dengan asam borat

dan ditambahkan indikator Tashiro. Alat Conway ditutup dengan menambahkan gliserin,

NaOH dan PP. Larutan pada kedua sisi pemisah dicampurkan. Amonia yang dibebaskan dari

reaksi akan ditangkap oleh asam borat yang terlihat dengan adanya perubahan warna

(Institut Pertanian Bogor, 2010).Semula asam borat yang ditambahkan indikator Tashiro

berwarna biru kemudian berubah menjadi berwarna hijau tosca. Pada penentuan kadar urea

ini menggunakan metode titrasi balik di mana, asam borat yang menangkap ammonia

dititrasi dengan menggunakan HCl hingga warnanya berubah seperti semula yaitu berwarna

biru.

Pada percobaan ini menggunakan beberapa reagen yaitu asam borat, gliserin + NaOH

+ PP, K2CO3 jenuh, larutan urease yang mengandung bufer fosfat dan EDTA. Fungsi dari

asam borat adalah untuk menangkap NH3 yang dihasilkan dari reaksi sehingga menjadi

ammonium tetraborat. Gas ammonia yang dilepaskan bersifat basa sehingga diperlukan

larutan yang bersifat asam untuk menangkapnya (Heny Yusrini, 2002). Selain asam borat,

larutan H2SO4 0.1 M juga dapat digunakan untuk menangkap NH3 (Yohanes Setyo, 2007).

EDTA yang ditambahkan berfungsi untuk mengikat logam-logam yang terdapat pada

sampel urin, sehingga terbentuk kompleks dengan logam-logam contohnya saja dengan Ca2+

dan Mg2+. Urease memiliki gugus –SH yang peka terhadap logam, sehingga apabila apabila

gugus –SH berikatan dengan logam tersebut akan menyebabkan enzim urease tidak aktif.

EDTA yang merupakan chelating agent dapat mengikat ion logam lebih kuat daripada –SH.

Dengan adanya logam dan terbentuk kompleks logam-protein akan membuat protein sulit

larut, entalpi pelarutan akan naik. Sehingga menyebabkan protein terdenaturasi. Gliserin

dibutuhkan untuk memvakumkan alat Conway agar tidak adanya amoniak yang keluar. Pada

gliserin juga ditambahkan dengan NaOH dan PP yang berfungsi untuk mengetahui adanya

kebocoran aliran gas NH3, hal tersebut dapat terlihat dengan warna merah muda pada tutup

alat Conway. K2CO3 jenuh berfungsi untuk menghasilkan OH- sehingga reaksi bergeser ke

arah pembentukan NH4OH dan NH3. Buffer digunakan untuk menstabilkan ion ammonium

yang terbentuk karena dalam air akan membentuk NH4OH. Pada alat Conway I berfungsi

untuk mengetahui kadar ammonia dari urin, pada Conway II sebagai control ammonia dari

aquadest, pada Conway III untuk mengetahui ammonia dari hasil kerja urease, sedangkan

Conway IV untuk mengetahui ammonia yang berasal dari urease itu sendiri.

Batas kadar urea normal dalam urin manusia adalah 9.3 g/L, dalam percobaan kali ini

diperoleh kadar urea dalam sampel urin adalah 2.7375 mg/mL atau 2.7375 g/L, hal tersebut

menandakan bahwa kadar urea dalam urin termasuk normal. Apabila kadar urea dalam urin

cukup tinggi dapat disebabkan oleh penyakit ginjal yang berakibat pada penurunan aktivitas

filtrasi glomerulus untuk urea sehingga urea meningkat dan juga obstruksi saluran keluar

urin. Kadar urea yang rendah dapat disebabkan karena kecepatan anabolisme protein yang

tinggi dapat timbul selama pengobatan untuk karsinoma payudara dan juga malnutrisi

protein jangka panjang.

Di dalam tubuh manusia terdapat siklus urea. Reaksi keseluruhan dari siklus urea

tersebut dapat dilihat pada gambar 1. Gugus asam amino yang pertama masuk dalam siklus

urea adalah ammonia bebas dari deaminasi oksidatif glutamat yang dikatalisis oleh

glutamate dehidrogenase di dalam mitokondria sel hati.

Gambar 1. Siklus urea

Glutamat - + NAD + + H2O α- ketogluarat 2- + NH4+ + NADH + H+

Kemudian ammonia tersebut bereaksi dengan CO2 yang dihasilkan di dalam mitokondria

karena adanya proses respirasi, sehingga akan terbentuk karbamoil fosfat. Reaksi ini

membutuhkan ATP dan enzim karbamoil fosfat sintese I.

Kemudian karbamoil fosfat memberikan gugus karbamoil kepada ornitin untuk membentuk

sitrulin dan melepaskan fosfat, dalam reaksi ini memerlukan Mg2+ dan ornitin

transkarbamoilase.

Sitrulin yang terbentuk meninggalkan mitokondria dan menuju sitosol sel hati. Gugus amino

selanjutnya berasal dari L-aspartat yang dihasilkan dari reaksi transaminasi dengan bantuan

aspartat transaminase.

Oksaloasetat + L-glutamat L-aspartat + α-ketogluarat

Aspartat dan sitrulin bereaksi dengan bantuan ATP dan argininosuksinat sintetase – enzim

yang bergantung pada Mg2+- , sehingga membentuk argininosksinat.

Kemudian argininosuksinat berubah menjadi arginin dan fumarat dengan bantuan enzim

argininosuksinase

Kemudian arginase hati menguraikan arginin untuk menghasilkan urea.

Urease disebut juga urea amidohidrolase. Urea ditemukan dalam jumlah besar pada

jack bean, kacang kedeai dan biji tanaman, beberapa jaringan binatang dan pencernaan

mikroorganisme. Urease bekerja pada ph optimum 7.4 dan suhu optimim 64oC. Urease

adalah enzim metallo nikel yang mengkatalisis degradasi urea menjad ammonia. Peran

utama urease adalah menyediakan energy internal dan eksternal bagi organism untuk

menyediakan urea atau hidroksiurea sebagai sumber Nitrogen. Enzim urease yang

ditemukan dalam Helicobacter pylori diperkirakan memberikan stabilitas tambahan yang

berfungsi memproduksi amoniak untuk menetralisisr asam lambung. Urease juga digunakan

untuk mendeteksi ion logam berat pada pencemaran air, yang terdiri dari elektroda emas dan

selaput enzim yang terbentuk pada bagian sensitif. Mekanisme reaksi urease dapat terlihat

pada gambar 2.

Gambar 2. Mekanisme reaksi urease (Estiu and Merz, Jr., 2007)

Pertama kali urease diisolasi oleh James B. Sumner, pertama kita ekstrak urease dari

jack bean dengan menggunakan alkohol 30%. Ekstrak alkohol disaring dengan cepat namun

endapan yang terbentuk terdiri dari urease, concavalin A, concavalin B dan protein lain.

Kemudian digunakanlah aseton untuk menggantikan alkohol 30%, melarutkan 316 mL aseton ke

dalam 1000 mL untuk mengekstaksi urease. Setelah ekstrak aseton ditunggu semalaman tidak

timbul adanya endapan. Namun ketika dilihat dibawah mikroskop banyak sekali kristal kecil

yang terbentuk hal tersebut menandakan urease berhasil diisolasi (Sumner, 1946). Filtrat

disentrifuga dan endapan kristal urease dicampurkan dengan 31.6% aseton dan disentrifuga

kembali. Kristal urease yang berhasil diisolasi nampak pada gambar 3.

Prosedur lebih jelas mengenai isolasi urease ini dijelaskan dalam sebuah jurnal.

Pertama digunakan aseton untuk menghilangkan air dan asam dari campuran CaCl2 dan

Ca(OH)2 . Tempatkan 158 cc distilat dalam 500 cc dengan melakukan pengenceran dengan air

suling. Dinginkan hingga suhu mencapai 22oC. dimasukkan 100 gram jack bean. Diaduk hingga

3 sampai 4 menit untuk memecahkannya. Kemudian setelah itu disaring. Kemudian filtrate

ditempatkan pada suhu 2-2.5 oC selama semalam, kemudian sentrifuga Kristal yang terbentuk

dari filtrate tersebut. Kristal yang terbentuk dilarutkan dalam 5-10 cc 31.6% aseton kemudian

disentrifuga dan kemudian disaring. Kristal dilarutkan dalam air suling kemudian disentrifuga

dan diamati Kristal tersebut di bawah mikroskop (Sumner, 1926).

Gambar 3. Kristal urease

Analisis urea di dalam urin dapat dilakukan dengan beberapa metode:

1. Kolorimetri

Urea dihidrolisis menjadi ammonia dan karbondioksida. Kemudian ammonia bereaksi dengan

alkalin hipoklorit dan sodium salisilat, dengan adanya natrium nitroprusida maka akan

terbentuk kompleks berwarna hijau. Diukur abdorbansi dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan kadar urea

dalam sampel.

2. UV Auto Fast-rate

Urea ditambah air dengan adanya urease dan membentuk ammonium dan HCO3- . Amonium

yang terbentuk bereaksi dengan Oxoglutarate dan NADH dengan adanya glutamate

dehidrogenase menjadi L-Glutamat, NAD+ dan air. Penurunan absorban dari NAD+, semakin

rendah berarti semakin banyak NADH yang digunakan dan semakin banyak kandungan urea.

Absorban diukur pada panjang gelombang 340 nm.

3. Metode Barthelot

Urea dipecah menjadi ammonia dan karbondioksida. Amonia yang dibebaskan direaksikan

dengan sodiumphenate dan hypochloric dan membentuk senyawa indofenol kemudian sampel

dibaca absorbansinya pada 546 nm.

4. Kadar urea dalam urin dan dalam darah dapat ditentukan dengan mengguankan 1H NMR

dengan menggunakan sinyal air sebagai referensi konsentrasi. Metode ini bersifat non-

destructive bagi sampel yang akan dianalisis (Liu L, 2011).

VI. Kesimpulan

Kadar urea pada sampel urine yang dianalisis adalah 2.7375 mg/mL

VII. Daftar Pustaka

Heny Yusrini, Penangkapan dan Pengukuran Gas Amonia pada Kotoran Ayam, Temu

Teknis Fungsional non Peneliti, 2002, 98-103

Yohanes Setyo, Kajian Tingkat Pencemaran Udara oleh Gas NH3 dan H2S Pada Proses

Pengomposan Secara Aerob. Agrotekno 13 (1), 2010, 25-28.

http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123456789/55389/BAB%20III%20MATERI

%20DAN%20METODE.pdf?sequence=5 (diakses tanggal 27 Maret 2013 pukul

09.09)

http://digilib.unimus.ac.id/files/disk1/103/jtptunimus-gdl-datiastuti-5150-2-bab2.pdf

(diakses tanggal 27 Maret 2013 pukul 10.50)

Guillermina Estiu and Kenneth M. Merz, Jr, Competitive Hydrolytic and Elimination

Mechanisms in the Urease Catalyzed Decomposition of Urea. J. Phys. Chem. B 2007,

111, 2007, 10263-10274

Sumner J.B, The Chemical Nature of Enzyme, Nobel Lecture, 1946

Sumner J.B, The Isolation and Crystallization of The Enzyme Urease, 1926, 435-441.

Liu L, Mo H, Wei S, Raftery D, Quantitative analysis of urea in human urine and serum

by 1H nuclear magnetic resonance, NCBI, 2012, 595-600

David F. Putnam, Composition and Concentrative Properties of Human Urine, National

Aeronautics and Space Administration, 1971, 40.