upstream elements

promoter elements

transcription START site

introns

exons

TRANSCRIPTIONCAPPING

SPLICINGPOLYADENYLATION

m7G

m7G AAAAAAAAAn

m7G AAAAAAAAAn

TRANSPORT

TRANSLATION

gene

pre-mRNA

polyadenylated pre-mRNA

mature mRNA

Espressione genica negli eucarioti

Splicing del pre-mRNA

Scoperta della struttura del gene in esoni ed introni

Tipico gene di mammifero: Regione di circa 16kb 7-8 esoni

Esoni: corti (circa 100-200 bp)Introni: anche molto estesi (>1kb)

Gene dell’ovalbumina di pollo ibridato con il suo mRNA e visualizzato al microscopio elettronico

Come si studia lo splicingCome si studia lo splicing• Procedura Procedura

-Trascrivere l’RNA in vitro-Trascrivere l’RNA in vitro

-Incubare l’RNA in estratti nucleari di cellule HeLa-Incubare l’RNA in estratti nucleari di cellule HeLa

-Estrarre l’RNA dopo diversi tempi di incubazione-Estrarre l’RNA dopo diversi tempi di incubazione

-Analizzare i prodotti della reazione tramite -Analizzare i prodotti della reazione tramite elettroforesielettroforesi

• Procedura Procedura -Trascrivere l’RNA in vitro-Trascrivere l’RNA in vitro

-Incubare l’RNA in estratti nucleari di cellule HeLa-Incubare l’RNA in estratti nucleari di cellule HeLa

-Estrarre l’RNA dopo diversi tempi di incubazione-Estrarre l’RNA dopo diversi tempi di incubazione

-Analizzare i prodotti della reazione tramite -Analizzare i prodotti della reazione tramite elettroforesielettroforesi

Sequenze “consensus” per lo splicing

La reazione di splicing

Analisi in vitro dei complessi di splicing

gel nativo

1 - tempo 0’

3 - tempo 30’

2 - tempo 90’

5 snRNPs1. snRNAs = piccoli RNA nucleari (ricchi in Uracile, a localizzazione nucleoplasmatica): U1, U2, U4, U5 and U6

2. Componenti proteici specifici per ciascuna particella insieme ad un set comune a tutte le snRNPs (Sm)

e

centinaia di proteine (U2AF,BBP…..)

Per lo splicing dei pre-mRNA è richiesto lo SPLICEOSOMA:

small nuclear ribonucleoproteins