Untersuchungen zur Extrahierbarkeit toxikologisch ... · Zusammenfassung Die...
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Extrahierbarkeit toxikologisch relevanter Verbindungen in
der Systematischen Toxischen Analyse
Teil 1:
Bestimmung der Extraktionsausbeute toxikologisch relevanter Arzneimittel
mit dem Lösungsmittel n-Chlorbutan bei pH 9
Teil 2:
Die Systematische Toxische Analyse in der DDR
Auswertung von unveröffentlichten Forschungsergebnissen aus den achtziger
Jahren: Verteilungsquotienten und pH –Abhängigkeit toxikologisch
relevanter Verbindungen
Abschlussarbeit für das
Postgradualstudium Toxikologie und Umweltschutz
an der Universität Leipzig
Von Claudia Michael
Leipzig, den 14.04.2003
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Die Abschlussarbeit wurde im Zeitraum vom Februar 2003 bis April 2004 am Institut für
Rechtsmedizin der Universität Leipzig in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis
„Extraktion“ der GTFCh angefertigt. Ich erkläre hiermit, die vorliegende Arbeit selbständig
und nur unter Verwendung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt zu haben.
Es bestehen keine Einwände gegen den Verleih oder der Weitergabe der Arbeit.
Claudia Michael
Danksagung
Ich möchte mich bei Herrn Prof. R.K. Müller, Frau DI A.Gräfe und Herrn Dr. U. Demme
für die Bereitstellung des Themas und für die Unterstützung bedanken.
Außerdem gilt mein Dank allen Mitarbeitern der toxikologischen Abteilung, die es mir
ermöglichten, die experimentellen Versuche im Labor durchzuführen.
Ein besonders großes Dankeschön geht natürlich an Markus und an meine Familie, weil ihr
mich die ganze Zeit unterstützt habt. Außerdem danke ich Markus für die hilfreiche
Korrektur meiner Arbeit.
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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................. 5
Zusammenfassung ................................................................................................................. 7
1 Einleitung .................................................................................................................. 9
2 Bestimmung der Extraktionsausbeute toxikologisch relevanter Verbindungen mit dem Lösungsmittel n-Chlorbutan bei pH 9
2.1 Grundlagen der Flüssig-Flüssig-Extraktion .............................................................. 15
2.2 Ergebnisse................................................................................................................... 20
2.2.1 Ergebnisse aus Puffer................................................................................................. 20
2.2.2 Ergebnisse aus Serum................................................................................................. 23
2.3 Diskussion................................................................................................................... 24
2.3.1 Extraktion aus Puffer.................................................................................................. 24
2.3.2 Extraktion aus Serum.................................................................................................. 28
2.3.3 Bedeutung für die STA............................................................................................... 28
2.4 Schlussfolgerung......................................................................................................... 30
2.5 Experimentelles……………………………………………………………………… 31
2.5.1 Geräte und Chemikalien…………………………………………………………….. 31
2.5.2 Durchführung………………………………………………………………………… 32
3 Auswertung von unveröffentlichten Forschungsergebnissen aus den achtziger Jahren: Verteilungsquotienten und pH-Abhängigkeit toxikologisch relevanter Verbindungen
3.1 Einleitung.................................................................................................................... 35
3.2 Grundlagen der Verteilung......................................................................................... 35
3.3 Ergebnisse................................................................................................................... 39
3.4 Auswertung................................................................................................................. 45
3.4.1 Saure Verbindungen................................................................................................... 47
3.4.2 Neutrale Verbindungen............................................................................................... 48
3.4.3 Amphotere Verbindungen.......................................................................................... 49
3.4.4 Basische Verbindungen.............................................................................................. 50
3.5 Diskussion................................................................................................................... 51
3.6 Zusammenfassung....................................................................................................... 54
3.7 Experimenteller Teil................................................................................................... 55
4 Literatur....................................................................................................................... 57
5 Anhang........................................................................................................................ 67
5.1 Abkürzungsverzeichnis............................................................................................... 67
5.2 Saure Verbindungen.................................................................................................... 69
5.3 Neutrale Verbindungen............................................................................................... 79
5.4 Amphotere Verbindungen........................................................................................... 82
5.5 Basische Verbindungen.............................................................................................. 84
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Zusammenfassung Die Flüssig-Flüssig-Extraktion ist eine einfache, kostengünstige und weit verbreitete
Probenvorbereitung zur Isolation körperfremder Stoffe aus biologischem Material. In der
vorliegenden Arbeit wurden 33 Arzneimittel aus einer basischen wässrigen Pufferlösung
(pH 9) mit n-Chlorbutan extrahiert und die Ausbeuten in der organischen Phase mit Hilfe
der UV-Spektrophotometrie und der HPLC ermittelt. Zur Überprüfung der verwendeten
Extraktionsmethode auf ihre Anwendbarkeit auf biologisches Material wurde die
Extraktion bei drei Arzneimitteln parallel auch mit Serum durchgeführt. Die ermittelten
Extraktionsausbeuten konnten mit den Ergebnissen aus Ringversuchen bestätigt werden.
Mit den aus den Ringversuchen vorliegenden Extraktionsergebnissen von über 300
Arzneistoffen kann die Extraktionsmethode gezielt und effektiv für diese Stoffe in der
Systematischen Toxischen Analyse angewendet werden. Zusätzlich ist der Einsatz einer
ergänzenden Extraktionsmethode von Vorteil, um die Anzahl der bestimmbaren Wirkstoffe
zu erhöhen. Mit dieser Arbeit wurde eine Grundlage geschaffen, zukünftig die Probleme
bei den sogenannten „General Unknown“-Fällen zu verringern, die durch die Vielzahl der
in Frage kommenden Stoffe zustande kommen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die experimentellen Daten über
Verteilungsquotienten und pH-Abhängigkeit von über 90 Verbindungen (vorwiegend
Arzneimittelwirkstoffe) ausgewertet. Die Daten wurden Ende der 80er Jahre in der
Rechtsmedizin Leipzig experimentell ermittelt, aber nie ausgewertet. Für die Lösungsmittel
Chloroform und Diethylether, und teilweise auch für Ethylacetat, liegen jetzt die
Extraktionsausbeuten (pH 1 bis 13) von über 300 organischen Verbindungen vor (siehe
auch Müller et al. 1982 / 1983). Für jede dieser Verbindung kann nun im Rahmen eines
Extraktionsverfahren festgestellt werden, ob sie bei einem bestimmten pH-Wert
befriedigend isoliert werden kann oder nicht. Obwohl sich die STA in den letzten 20 Jahren
enorm weiterentwickelt hat, können die Ergebnisse über die Verteilungsquotienten dieser
Verbindungen und deren pH-Abhängigkeit auch heute noch für bestimmte Fragestellungen
hilfreich sein. Mit der genauen Kenntnis der maximalen Extrahierbarkeit und dem
entsprechenden pH-Bereich ist es möglich, das Extraktionsverfahren aus wässriger Phase
zu optimieren. Z.B. können die Ergebnisse für spezielle toxikologische Untersuchungen
eines Stoffes hilfreich sein. Außerdem können aus den Ergebnissen Rückschlüsse auf die
Eignung anderer Lösungsmittel abgeleitet werden.
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1 Einleitung Das Ziel der Systematischen Toxischen Analyse (STA) ist die Aufklärung von unklaren
Krankheitsbildern und Todesfällen, bei denen eine Vergiftung als Ursache in Betracht
gezogen wird. Ohne konkrete Hinweise auf die Art der Vergiftung ergibt sich das Problem,
dass eine Vielzahl von toxischen Stoffen in Frage kommen kann. Aus diesem Grund bedarf
es einer logisch – schematischen Vorgehensweise und besonderen analytischen Strategien
zur Erkennung der vorliegenden Vergiftung (Müller et al. 1991). Diese sprichwörtliche
Suche nach der „Nadel im Heuhaufen“ wird auch als General Unknown Analysis
bezeichnet (Müller 1990, Madea und Brinkmann 2003).
Die Systematische Toxische Analyse ist eine nicht zielgerichtete Untersuchung auf die in
Frage kommenden, potentiell schädlichen Substanzen. Die Aufgabe der chemisch
toxikologischen Analyse beinhaltet nicht nur die schnelle und sichere Erkennung der
Identität der Stoffe, die für die Vergiftung verantwortlich sind, sondern nach Möglichkeit
auch noch eine wenigstens semiquantitative Abschätzung der aufgenommenen Mengen.
Auch wenn konkrete Hinweise bzw. Verdachtsmomente (durch Anamnese, aufgefundene
Medikamente, Zeugenaussagen) vorhanden sind, wird neben der gezielten chemischen
Bestimmung auch eine Durchführung der STA empfohlen (Maurer 1993). Nach einer
Untersuchung von Köppel und Tenczer (1995) konnte nämlich festgestellt werden, dass in
40 Prozent der Fälle sich die Angaben von Seiten des Patienten selbst oder von
Angehörigen als falsch oder zumindest als unvollständig erwiesen hatten.
Welche Stoffe als toxikologisch relevant eingestuft werden und bei einem Verdachtsfall in
der STA überprüft werden sollten, ist nach Müller und Thieme (1995) eine Frage der
Abwägung der Verbreitungs- und Verfügbarkeitswahrscheinlichkeiten für die
Allgemeinbevölkerung. Auf dem Markt sind eine Vielzahl von potentiell schädlichen
Stoffen kommerziell erhältlich, die einen Umfang von mehreren Millionen ausmachen.
Eine STA stellt daher immer einen Kompromiss zwischen der unüberschaubaren Anzahl
der toxisch relevanten Stoffe und dem zeitlichen und ökonomischen Aufwand dar. Aus
diesem Grund wird die Anzahl der toxikologisch bedeutsamen Subtanzen bei einer General
Unknown Analysis stark eingeschränkt. Sie umfasst Stoffe, die im Rahmen der toxischen
Analyse regelmäßig gefunden werden. Zum Beispiel stehen die Medikamentenwirkstoffe,
Reinigungschemikalien oder Kosmetika im Vordergrund, da sie für die Allgemeinheit zur
Verfügung stehen. Insgesamt wird die Anzahl der im engeren Sinne toxikologisch
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bedeutsamen Substanzen immerhin noch auf mehrere Tausend geschätzt (Müller et al.
1991). Hinzu kommen vermutlich noch einmal so viele Begleitstoffe (de Zeeuw 1997) und
probeneigene Matrixbestandteile (Müller et al. 1992), die als potentielle Störstoffe die
chemische Identifikation der toxisch wirkenden Substanzen erschweren können.
Jährlich ereignen sich ca. 250.000 Vergiftungsunfälle in Deutschland. Mehr als die Hälfte
der Vergiftungen betreffen Kinder bis 5 Jahre. Dabei handelt es sich in den meisten Fällen
um einen akzidentellen Kontakt mit Arzneimitteln (33%), Haushaltschemikalien (37%)
oder giftigen Pflanzen, Pilzen und Tieren (24%). Die Vergiftungshäufigkeit mit
Arzneimitteln steht bei den Erwachsenen mit fast 60 Prozent an erster Stelle, die
überwiegend aus suizidaler Absicht eingenommen werden (Giftinformationszentrum der
Länder Mecklenburg-Vorpommern, Sachsen, Sachsen-Anhalt und Thüringen, Thomas
1992).
Vor allem Arzneimittel mit Wirkung auf das Zentralnervensystem (Benzodiazepine,
Sedativa, Antidepressiva, Analgetika, Antiepileptika) und auf das Herz-Kreislaufsystem
(Betablocker, Calciumantagonisten, Herzglykoside) sind verantwortlich für die
Vergiftungen, die oft auch in Kombination mit Alkohol oder als Mischintoxikation mit
anderen Arzneimitteln vorliegen. De Zeeuw (1998) stellte fest, dass Vergiftungen mit
einem Gemisch verschiedener Wirkstoffe eher die Regel als die Ausnahme darstellen.
Bevorzugtes Untersuchungsmaterial ist Vollblut, Serum oder Plasma, da die
Substanzkonzentrationen in Blutproben oft mit der toxischen Wirkung korrelieren und der
Schweregrad einer Vergiftung besser eingeschätzt werden kann. Die analytische
Bestimmung von Post-Mortem-Blut kann aber durch die erhöhe Viskosität des Blutes und
störenden Abbauprodukten (Autolyseprozesse) problematisch sein (Müller et al. 2000).
Alternativ können Urin, Magenspülflüssigkeit, Gallenflüssigkeit oder Gewebeproben
untersucht werden, wenn auch die Konzentrationsbestimmung weniger aussagefähig ist.
Anderseits bringt die Urinbestimmung auch einige Vorteile mit sich. Es werden in der
Regel höhere Substanzkonzentrationen und eine größere Anzahl von Metaboliten gefunden,
so dass auch Substanzen mit einer geringen Halbwertszeit im Blut erfasst werden können.
Eine Urinbestimmung erfordert in der Regel eine vorhergehende Hydrolyse der
vorliegenden Konjugate.
Die Entwicklung der Systematischen Toxischen Analyse begann in den 50-iger Jahren..
1954 wurde von Curry und Powell eine Methode beschrieben, bei der es zum ersten Mal
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gelang, eine größere Gruppe von toxikologisch interessanten Verbindungen mit Hilfe der
Papierchromatographie zu analysieren (Curry und Powell, 1954). Seit diesen ersten
Versuchen mit Papier- und Dünnschichtchromatographie setzte innerhalb weniger Jahre
eine rasante Entwicklung der verschiedenen chromatographischen Techniken ein. Der
weitverbreitete Einsatz der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) und der
Gaschromatographie (GC) führte die Entwicklung der STA voran. Mit der Einführung von
Retentionszeiten (Kovats, 1958) zur Standardisierung der Daten und der Errichtung
umfangreicher Referenzdatenbänke (de Zeeuw et al. 1992, Hill et al 1994) wurden die
Grundlagen für eine weltweite und brauchbare Informationsquelle geschaffen. Mit der
Entwicklung der Massenspektrometrie (MS) und des UV-Diodenarray-Spektrophotometer
(DAD) ab den 70-er Jahren standen sensitive Detektoren für die toxikologische Analyse
zur Verfügung.
Allgemeine Nachweisuntersuchungen der STA:
Immunchemisch auf bestimmte Substanzgruppen (z.B. Opiate, Benzodiazepine)
HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) in Kombination mit selektiven
Detektoren (UV, elektrochemisch, MS)
GC-MS (Gaschromatographie – Massenspektrometrie)
HS-GC (Headspace-Gaschromatographie) zur Bestimmung flüchtiger Substanzen
CE (Kapillarelektrophorese) in Kombination mit UV-Detektion bzw. MS
DC (Dünnschichtchromatographie)
Atomabsorptionsspektrometrie (AAS, Metalle)
Immunchemische Methoden können als Vortest zur Selektion in negative und potentiell
positive Proben verwendet werden. Diese Tests werden in der Regel mit Urin durchgeführt.
Es gewinnt aber auch die immunchemische Bestimmung von Serumproben zunehmend an
Bedeutung. Das Ergebnis des immunchemischen Vortests muss anschließend mit einem
spezifischen Untersuchungsverfahren (z.B. HPLC/DAD, GC-MS) bestätigt werden.
Der Einsatz sensitiver Detektoren setzt eine effektive Probenvorbereitung voraus, um eine
möglichst hohe Ausbeute der toxischen Stoffe zu ermöglichen. Wegen der Vielzahl der
chemisch sehr unterschiedlichen Substanzen sind bei der General Unknown Analysis
immer Kompromisse in Bezug auf die Aufbereitung / Extraktion des biologischen
Materials notwendig (Madea und Brinkmann 2003). Grundsätzlich kommen folgende
Probenaufbereitungen zur Anwendung:
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Flüssig – Flüssig – Extraktion (LLE, „liquid – liquid extraction“)
Festphasen – Extraktion (SPE, „solid phase extraction“).
Andere Methoden (SPME, ”solid phase microextraktion”; Eiweißfällung)
Für die STA zum Nachweis körperfremder Substanzen ohne gerichteten Verdacht besitzen
chromatographische Methoden die höchste Aussagekraft. Sehr oft wird die GC-MS
(Maurer et al. 1992 / 1997/ 1998b / 1999, Solans et al. 1995, Polettini, 1996) oder die
HPLC/DAD (Drummer et al. 1993, Koves 1995, Maier et al. 1995, Gaillard et al. 1997, Lo
et al. 1997, Lai et al. 1997) verwendet. Für die HPLC wird die Flüssig-Flüssig-Extraktion
bevorzugt, während bei der GC oft die SPE zum Einsatz kommt.
In den letzten Jahren wurden häufig Extraktionsmethoden mit der Verwendung von
Festphasen veröffentlicht. Oft wird mit der GC-MS gekoppelt, die eine etwas höhere
Selektivität und Empfindlichkeit als die HPLC/DAD erzielt (Drummer 1999). Jedoch
wurden sowohl die Empfindlichkeit, als auch die spektrale Auflösung der
Photodiodenarraydetektoren in den letzten Jahren erheblich verbessert (Hertzler et al.
2000). Für den Einsatz in der STA ergänzen sich HPLC/DAD und GC/MS eher, als dass
sie als konkurrierende Methoden aufzufassen wären. Bei der LC-MS wird die
Trennungseffizienz der HPLC mit der Sensitivität und Spezifität der MS kombiniert. In
Zukunft wird diese Technik voraussichtlich eine wichtige Rolle in der STA spielen
(Weinmann et al. 1999, 2000). Einige Methoden zur Bestimmung von Drogen mit LC-MS
sind bei Bogusz et al. (1998) und Maurer (1998a) beschrieben.
Im Allgemeinen wird die Flüssig – Flüssig – Extraktion zur Isolation körperfremder Stoffe
aus biologischem Material bevorzugt. Das liegt vor allem an der geringen Störanfälligkeit,
den besseren reproduzierbaren Extraktionsausbeuten und an dem geringeren
Arbeitsaufwand für die Einzelprobe. Universelle LLE werden oft für die General Unkown
Analyse verwendet, wenn die Substanzen mit verschiedenen physikochemischen
Eigenschaften von einer heterogenen Matrix isoliert werden müssen. Bei der SPE ist die
Probenbehandlung abhängig vom Probentyp. Blut und Gewebe können nicht direkt in die
Röhrchen gegeben werden, während für Urin oftmals eine Verdünnung und Zentrifugation
ausreichend ist (Maurer 1999). In den letzten Jahren wurden bei der Festphasenextraktion
erhebliche Fortschritte sowohl bezüglich der Reproduzierbarkeit der Extraktionsausbeuten
als auch bei der Reinheit der Extrakte erzielt. Die Vor – und Nachteile der SPE werden bei
Franke und De Zeeuw diskutiert (1998).
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SPME (Solid-phase microextaction) ist eine neue Alternative zur SPE und LLE. Die
Verwendung von Lösungsmitteln und Konzentrationsschritten wird vermieden. Einige
Methoden wurden schon für spezielle Verbindungen publiziert (Maurer 1999, Hall et al
1997, Li et al. 1997).
Andere Verfahren wie die Kapillarelektrophorese (Maurer 1999, Drummer 1999) werden
wahrscheinlich in Zukunft in der forensischen Toxikologie vermehrt eine Rolle spielen. Die
Vorteile bei der CE liegen einerseits an dem geringen Bedarf an Probevolumen und
anderseits an der Erfassung eines weiten Spektrums von Verbindungen. Nachteilig wirkt
sich das Problem mit der ungenügenden Empfindlichkeit aus. In der Übersicht von Tagliaro
et al. (1998) wird die Methode der Kapillarelektrophorese diskutiert.
Nur noch selten wird die TLC in der STA verwendet (Maurer 1999, Drummer 1999). Ein
Screeningverfahren für verschiedene Drogen (Barbiturate, Diuretika, NSAID, saure
Antikoagulantien) ist bei Iten und Mueller (1994) beschrieben. Einzelne
Veröffentlichungen befassen sich mit der Kopplung von Dünnschichtchromatographie und
leistungsfähigen Detektoren wie der Remissionsspektrometrie (Demme et al. 2000) oder
einem Diodenarraydetektor (Ahrens et al. 2002).
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2 Bestimmung der Extraktionsausbeute toxikologisch relevanter
Arzneimittel mit dem Lösungsmittel n-Chlorbutan bei pH 9
2.1 Grundlagen der Flüssig-Flüssig-Extraktion
Die Flüssig-Flüssig-Extraktion ist eine einfache, kostengünstige und weit verbreitete
Methode zur Isolation körperfremder Stoffe aus biologischem Material. Dabei wird die
wässrige biologische Matrix (Blut, Serum, Urin, Magenspülflüssigkeit) mit einem mit
Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Das Probenmaterial stellt immer ein
wässriges System dar, in welchem die Stoffe gelöst, emulgiert oder suspendiert vorliegen
können. Die Extrahierbarkeit der nachzuweisenden Stoffe beruht auf deren höheren
Lipophilie im Vergleich zur biologischen Matrix. Für schwer extrahierbare Verbindungen
(z.B. Salicylsäure, Paracetamol, einige Antibiotika), die aufgrund ihrer hydrophilen
Eigenschaften oder einer relativ großen Molekülmasse nicht mit einem organischen
Lösungsmittel extrahiert werden können, bietet sich die Proteinfällung z.B. mit Acetonitril
an. Allerdings werden niedermolekulare UV-absorbierende Blutbestandteile bei dieser
Methode nicht abgetrennt, die zu einer hohen Matrixbelastung des Chromatogramms
(besonders bei kurzen Retentionszeiten) führen können. Diese Probenaufbereitung
beinhaltet auch keinen Anreicherungsschritt (die Probe wird sogar verdünnt), so dass
höhere Bestimmungsgrenzen resultieren.
Die Höhe der Extraktionsausbeute der organischen Stoffe wird im wesentlichen von ihrem
Verteilungsgleichgewicht zwischen wässriger und organischer Phase, sowie ihrer
elektrolytischen Dissoziation, die ihrerseits wieder von dem pH-Wert abhängig ist,
bestimmt (Madea und Brinkmann 2003).
Neutrale, nicht-ionisierte, organische Substanzen verteilen sich nach dem NERNSTschen
Gesetz zwischen einer wässrigen Phase und einem nicht mit Wasser mischbaren
organischen Lösungsmittel in einem stets gleichbleibenden Verhältnis.
W
LK C
CV =
LC = Konzentration in der Lipidphase [mol/l]
= Konzentration in der Wasserphase [mol/l]WC
KV = Verteilungskoeffizient
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Die Verteilungskonstante ist eine charakteristische Stoffkonstante, die nur für ideale
Bedingungen gilt:
Temperatur ist konstant
beide Phasen sind völlig unmischbar
der gelöste Stoff ist in keiner der Phasen assoziiert / dissoziiert
Gesamtkonzentration an gelösten Stoff ist in jeder Phase gering
Sehr viele Arzneistoffe sind organische Basen, Säuren oder amphotere Wirkstoffe und
unterliegen in der wässrigen Phase der elektrolytischen Dissoziation. Sie liegen in
Abhängigkeit von dem pH-Wert entweder als freie, undissoziierte Verbindungen oder als
Salze vor. Am Verteilungsgleichgewicht nehmen nur die Neutralmoleküle teil (seltene
Ausnahme: Ionenpaar-Assoziation). Somit bestimmt auch das Dissoziationsgleichgewicht
die Konzentration der Wirkstoffe in der organischen und wässrigen Phase. Eine
elektrolytische Dissoziation in der organischen Phase findet bei den meisten
Lösungsmitteln praktisch nicht statt. Bei organischen Basen wird das biologische Material
alkalisiert (pH >7), um höhere Extraktionsausbeuten zu erzielen und im Fall von Säuren
wird angesäuert (pH <7). Für neutrale Wirkstoffe ist der pH-Wert von geringem Einfluss
(Müller, 1991). Die Praxis beinhaltet daher im allgemeinen je eine Extraktion bei saurem
und bei basischen pH-Wert und zusätzlich eine Proteinfällung zur Erfassung schwer
extrahierbarer Verbindungen.
Natürlich unterliegen auch körpereigene Substanzen dem Verteilungs- und Dissoziations-
gleichgewicht und können anteilmäßig in die organische Phase übergehen. Vor allem
Lipide (Fettsäuren, Cholesterol) werden als Neutralstoffe gut extrahiert und können als
Verunreinigung die Analyse erschweren. Mit sehr polaren Lösungsmitteln wie Ethylacetat
oder dem oft verwendeten Dreiergemisch aus Dichlormethan, Ethylacetat und iso-Propanol
60:3:10 (Pfleger et al. 1992) kann man zwar eine sehr große Anzahl von toxikologisch
interessanten Verbindungen mit hoher Ausbeute extrahieren, aber auch die Höhe des in
erster Linie durch körpereigene Substanzen verursachenden Untergrundes liegt höher.
Weniger polare Lösungsmittel haben den Vorteil, dass weniger Störsignale auftreten, sich
aber Probleme mit einer ungenügenden Extraktionsausbeute ergeben können (Madea und
Brinkmann 2003, Demme et al. 1998).
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Extraktion mit n-Chlorbutan In den Untersuchungen vom Arbeitskreis „Extraktion“ der GTFCh wurde nachgewiesen,
dass n-Chlorbutan bei pH 9 fast matrixfreie Chromatogramme (mit Ausnahme des
Cholesterols) sowohl für die GC-MS als auch für HPLC und DC erzielt (Demme et al
1999). Durch den deutlich geringeren Untergrund (kleinste Gesamtfläche der Störpeaks) im
Vergleich zu anderen Lösungsmitteln wird eine Überlagerung von Substanzsignalen und
eine stärkere Verschmutzung von Säulen und Detektoren vermieden. Aus dem Grund war
es von besonderem Interesse, die Substanzen zu ermitteln, die sich mit diesem
mittelpolaren Lösungsmittel und dem basischen pH-Wert ausreichend extrahieren lassen
und sich für ein Screening in „general unknown“-Fällen eignen.
Deshalb werden derzeitig die Extraktionsausbeuten von einer möglichst großen Zahl
toxikologisch relevanter Verbindungen mit der Flüssig–Flüssig–Extraktion in
Ringversuchen bestimmt.
In der vorliegenden Arbeit wurden 33 Arzneimittel aus einer basischen wässrigen
Pufferlösung (pH 9) mit n-Chlorbutan extrahiert und die Ausbeuten in der organischen
Phase mit Hilfe der UV-Spektrophotometrie und der HPLC ermittelt. Zur Überprüfung der
verwendeten Extraktionsmethode auf ihre Anwendbarkeit auf biologisches Material wurde
die Extraktion bei drei Arzneimittel parallel auch mit Serum durchgeführt.
Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die Medikamente, die im Rahmen dieser
Arbeit untersucht wurden:
Arzneimittelgruppe n Beispiele
Abmagerungsmittel/
Appetitzügler
2 Cathin, Phenylpropanolamin
Analgetika 1 Hydromorphon
Antiarrhythmika 3 Aprindin, Adenosin, Procainamid
Antidiabetika 1 Glibenclamid
Antidota 3 Flumazenil, Nalorphin, Physostigmin
Antiepileptika 1 Mesuximid
Antimykotika 1 Fluconazol
Betablocker/
Calciumantagonisten
5 Celiprolol, Lisinopril, Nicardipin, Nifedipin,
Pindolol
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Gichtmittel 1 Colchicin
Laxantia 1 Bisacodyl
Lokalanäthetika 3 Prilocain, Procain, Ropivacain
Narkosemittel 1 Pentobarbital
Parkinsonmittel 4 Benseracid, Levodopa, Metixen, Procyclidin
Psychopharmaka 6 Amitriptylinoxid, Cyamemazin, Fluspirilen,
Kavain, Lofepramin, Pimozid Tabelle 1
Die folgende tabellarische Übersicht gibt orientierende therapeutische und / oder toxische
Plasma- / Serumkonzentrationen der untersuchten Arzneimittel beim Menschen wieder
(Regenthal et al., 1999). Die komatös-letalen Plasma- / Serumkonzentrationen, die zum
Teil auf Einzelfallbeschreibungen basieren, orientieren sich an unteren Werten, auch wenn
deutlich höhere Spiegel bei Vergiftungen überlebt wurden. Toxikologisch wichtige aktive
Metabolite (*) sind auch aufgeführt.
Substanz Plasmakonzentration [µg/ml] HWZ
Therapeutisch Toxisch Komatös-letal (h)
Amitriptylinoxid 0,2 – 0,9 10 – 20
Aprindin 0,75 – 2,5 2 – 3 13 – 50
Celiprolol 0,05 – 0,5 – 1 3 – 6
Colchicin 0,0003 – 0,0025
(-0,004)
0,005 1 – 2
Flumazenil (0,01 -) 0,02 –
0,1
0,5 1 – 2
Glibenclamid 0,1 – 0,2 0,6 2 4 – 10
Hydromorphon 0,001 – 0,03 0,1 2 – 3
Levodopa 0,2 – 4 1 – 3
Lisinoprol 0,001 – 0,14 13
Lofepramin 0,003 – 0,01 10 – 20
Mesuximid
*N-Desmethylsuximid
2,5 – 7,5
10 – 40
10
40
25
2 – 4 (* - 80)
Nicardipin 0,07 – 0,1 7 – 12
18
Nifedipin 0,025 – 0,1 0,1 2 – 5
Pentobarbital 1 – 5 (- 10) 10 15 20 – 48
Phenylpropanolamin 0,1 – 0,5 2 2 – 5
Physostigmin < 0,001 – 0,005 1 – 2
Pimozid Ca. 0,004 – 0,01
(- 0,02)
50 – 60
Pindolol 0,02 – 0,15 0,7 2 – 5
Prilocain 0,5 – 1,5 (-2) 5 – 6 ca. 20 10
Procain 0,2 – 2,5 (- 15) 20 20 - 0,5
Procainamid
* N-Acetylprocainamid
2,5 – 10
5 – 30
8
20
20
2 – 5
3 – 7
Procyclidin - 1 2 7 – 16 Tabelle 2 (entnommen aus Regenthal et al., 1999)
19
2.2 Ergebnisse
2.2.1 Extraktion aus Puffer
Es wurden 33 Arzneimittel aus einer basischen wässrigen Pufferlösung (pH 9) mit n-Chlor-
butan extrahiert und die Ausbeuten in der organischen Phase mittels UV-VIS-
Spektroskopie (UV-VIS-Spektrophotometer CARY 1E, Firma Varian) und HPLC/DAD
(Photodiodenarray-Detektor HP Series 1100) ermittelt. Die HPLC-Messung erfolgte in
einem isokratischen System mit einer RP-8- (Lichrospher 100 RP 8, 5µm ) bzw RP-18-
Säule (Prontosil 120–5 C18 H 5,0µm). Als Bezugssubstanz ist MPPH (5-p-Methylphenyl-
hyndantoin) eingesetzt worden, dass unter den chromatographischen Bedingungen eine
mittlere Retentionszeit aufweist. Der Vorteil der isokratischen Elution gegenüber der
Gradientenelution ist neben der Einsparung von Lösungsmitteln und der ständigen
Einsatzbereitschaft (Konditionierung der Säule nicht notwendig) die hohe
Reproduzierbarkeit der Retentionsparameter.
Die Extraktionsausbeute in der organischen Phase wurde nach den folgenden Formeln
berechnet:
n
vw
nw
vw
EEE
A−
=0
bzw.:
nw
no
EE
A ≈0
Ausbeute in der organischen Phase
Extinktion der wässrige Phase vor der Extraktion
Extinktion der wässrigen Phase nach der Extraktio
0A
vwE
nwE
noE Extinktion der organischen Phase nach Extraktion
ca. Wert, da die Extinktionskoeffizienten in den Phasen unter-
schiedlich sein können 0A
20
Die Extraktionsausbeute R in der organischen Phase ist von Interesse, weil sie für ein
Isolationsverfahren ein wichtiges Kriterium darstellt.
HA
OHAHA Q
QR
)(=
Eine Verbindung mit einer Extraktionsausbeute von R = 1,0 wird vollständig in der
organischen Phase angereichert. Für eine bessere Darstellung der Werte wird oft der
Ausdruck 100R verwendet, der den prozentualen Anteil wiederspiegelt.
Tabelle 3 : Extraktionsausbeuten 100R der Arzneistoffe mit n-Chlorbutan aus Puffer bei
pH 9
Stoff UV-Spektrometermessung HPLC Extraktionsausbeute
Wellenlänge
[nm]
100RUV
100RHPLC
100R
Adenosin 259 0 1 0
Amitriptylinoxid 250 0 30/15 15
Aprindin 255/261 100*/100* 100 100
Benseracid-HCl 210/212 0/7 0 2
Bisacodyl 264 52 34 48
Cathin 208/256 4/0 12/10 6
Celiprolol-HCl 324/335 11*/16* 7/6 10
Colchicin 351 12 9 10
Cyamemazin 269 100 100 100
Fluconazol 208 14 0 7
Flumazenil 245 67 80 73
Fluspirilen 254 100* 100 100
Glibenclamid 301 5 8 7
Hydromorphon 286 7 14 10
Kavain 291 100 99 100
Levodopa 284 0 0 0
HAR Extraktionsausbeute in der organischen Phase
OHAQ )( Anteil der verteilten Verbindung in der organischen Phase
HAQ Gesamtmenge (Einwaage) der Substanz HA
21
Lisinopril 210 0 0 0
Lofepramin-HCl 253 92* 100 96
Mesuximid 208 100 97 98
Metixen-HCl 267 100 100 100
Nalorphin-HBr 287 20 23 21
Nicardipin 347 100* 100 100
Nifedipin 338 100 100 100
Pentobarbital 240 6 18 12 Phenylpropanolamin-HCl 208 0 0 0
Physostigminsulfat 305 77 67 72
Pimozid 294 100 100 100
Pindolol 286 33 37 35
Prilocain 208/245 100 93 96
Procain 289 100 99 100
Procainamid 276 3 7 5
Procyclidin-HCl 257 100* 100 100
Ropivacain 208 100 94 97
* Alternativ: Chlorbutanmethode (S. 33) Tabelle 3
Für die Bestimmung der Extraktionsausbeute wurden für die UV- und HPLC-Messung
jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt und daraus das arithmetische Mittel errechnet.
Die HPLC-Ergebnisse sind über die Peakflächen ausgewertet wurden. Die
Gesamtextraktionsausbeute ergibt sich aus dem arithmetischen Mittel der UV- und HPLC-
Messung.
22
2.2.2 Extraktion aus Serum
Zur Überprüfung der Extraktionsmethode mit n-Chlorbutan auf ihre Anwendbarkeit auf
biologisches Material wurde die Extraktion bei drei Arzneimittel zusätzlich mit Serum
durchgeführt. Es wurden drei verschiedene Testseren eingesetzt und Doppelbestimmungen
durchgeführt. Mittels HPLC wurden die Peakflächen der gleich behandelten Wasser- und
Serumproben ermittelt und ins Verhältnis gesetzt. Die ermittelten Werte geben die
prozentuale Wiederfindung der Extraktionsausbeute an. Das Ergebnis der
Extraktionsmethode aus Wasser wurde 100 Prozent gesetzt.
W (Prozentuale Wiederfindung) = 100 * Peakfläche Serumprobe / Peakfläche Wasserprobe
Substanz
W – Serum 1 [%]
W – Serum 2 [%]
W – Serum 3 [%]
Mesuximid 97 99 113
Prilocain 87 104 102
Procyclidin 103 105 115 Tabelle 4
23
2.3 Diskussion
2.3.1 Extraktion aus Puffer
Die getesteten Arzneimittel wurden aus einer Pufferlösung mit dem Lösungsmittel n-
Chlorbutan bei pH 9 extrahiert (Ergebnisse: siehe Tabelle 3).
Bei einer Extraktionsausbeute 100R 80% ist die Substanz mit dieser Methode sehr gut
isolierbar (Demme et al. 2003). Für diese Arzneimittel ist die Extraktion mit n-Chlorbutan
empfehlenswert. Die Probe kann dann mit gängigen Methoden wie der HPLC in
Kombination mit sensitiven Detektoren oder der GC-MS qualitativ und quantitativ
bestimmt werden.
≥
Der Vorteil der Isolation der Wirkstoffe mit n-Chlorbutan bei pH 9 im Vergleich zu
polareren Lösungsmitteln wie z.B. Ethylacetat liegt in einer deutlich geringeren
Mitextraktion von Matrixbestandteilen. Dadurch ist in vielen Fällen auch eine
Empfindlichkeitssteigerung möglich. Es resultieren sehr saubere Chromatogramme. Es
können Fettsäuren und Cholesterol mitextrahiert werden, diese stören aber wegen fehlender
UV-Absorption die Untersuchung nicht. Im Gegensatz zu z.B. polaren Lösungsmitteln
werden Säulen und Detektoren weniger verschmutzt (Demme et al. 1998).
Voraussetzung für einen generellen Einsatz einer Extraktionsmethode bei der
Systematischen Toxischen Analyse ist neben einem erwünschten geringen Untergrund auch
eine hohe Ausbeute vieler Wirkstoffe. Mit dieser Arbeit wurden die Extraktionsausbeuten
von 33 Wirkstoffen bestimmt.
In der folgenden Tabelle sind die Arzneistoffe mit einer Extraktionsausbeute 100R ≥ 80%
aufgelistet:
Nr.
Arzneistoff
Extraktionsausbeute 100R
1 Aprindin 100
2 Cyamemazin 100
3 Fluspirilen 100
24
4 Kavain 100
5 Lofepramin-HCl 96
6 Mesuximid 98
7 Metixen-HCl 100
8 Nicardipin 100
9 Nifedipin 100
10 Pimozid 100
11 Prilocain 96
12 Procain 100
13 Procyclidin-HCl 100
14 Ropivacain 97 Tabelle 5
Von den getestete Wirkstoffen sind 14 Arzneimittel sehr gut extrahierbar (100R ≥ 80%).
Zusätzlich sind die Arzneistoffe Flumazenil (73%) und Physostigminsulfat (72%)
ausreichend isolierbar. Das bedeutet, dass eine ausreichende Extraktionsausbeute bei der
Hälfte der hier untersuchten Arzneimitteln vorhanden ist.
Vergleich mit anderen Laborergebnisse
Da es sich um einen Ringversuch handelt, wurden die meisten Substanzen parallel auch in
anderen Laboren bestimmt. Zum Vergleich wurden die ermittelten Extraktionsausbeuten
den Ergebnissen der anderen Labore gegenübergestellt (Demme et al 2003).
Wirkstoff
Leipzig
1
Labor
2
Labor
3
Labor
4
Labor
5/6
Mittel-
wert
s n
100 R (%)
Aprindin 100 100 88 96 7 3
Cyamemazin 100 100 100 0 2
Fluspirilen 100 80 75 102 90 89 12 5
Kavain 100 100 71/60 77 100 /90 85 16 7
Lofepramin-HCl 96 60 / 80 96 100 87 17 5
Mesuximid 98 100 99 1 2
Metixen-HCl 100 100 100 0 2
25
Nicardipin 100 59 80 28 2
Nifedipin 100 100 100 43 91 87 25 5
Pimozid 100 93 100 98 4 3
Prilocain 96 100 93 96 4 3
Procain 100 93 77 81 88 11 4
Procyclidin-HCl 100 100 100 0 2
Ropivacain 97 100 99 2 2
Adenosin 0 0 0 0 0 3
Amitriptylinoxid 15 16 3 11 7 3
Benseracid-HCl 2 0 0 1 1 3
Bisacodyl 48 64 101 34 81/100 71 28 6
Cathin 6 6 9 10 8 2 4
Celiprolol-HCl 10 ~10 10 0 2
Colchicin 10 12 96 15 17 30 37 5
Fluconazol 7 90 7,4 35 48 2
Flumazenil 73 85 80 79 6 3
Glibenclamid 7 27 41 6 20 16 4
Hydromorphon 10 17 0 13 10 7 4
Levodopa 0 0 0 0 2
Lisinopril 0 0 1 1 1 1 4
Nalorphin-HBr 21 36 7 30 24 13 4
Pentobarbital 12 45 37 24 30 15 4 Phenylpropanol-
amin-HCl 0 - - 1
Physostigminsulfat 72 72 - 1
Pindolol 35 36/38 15 20 16 27 9 6
Procainamid 5 10 28 4 12 11 4 Tabelle 6
Die Ringversuche zur Bestimmung der Extraktionsausbeuten sind notwendig, um
verlässlichere Ergebnisse zu erzielen, da mögliche Einflussfaktoren und Fehlerquellen von
den einzelnen Laboren dadurch minimiert werden können. Aus diesem Grund wurde die
26
Standardabweichung zur Charakterisierung der Ergebnisse mitangegeben (siehe Tabelle 6).
Man schätzt die Standardabweichung ausgehend von der Stichprobe. Sie ist ein Maß dafür,
wie weit die jeweiligen Werte um den Mittelwert streuen (Berechnung S. 34).
Die Streuung um die Mittelwerte ist bei den meisten Substanzen gering (≤ 10). Große
Abweichungen (s 20%) konnten bei den Arzneimitteln Bisacodyl, Nicardipin, Nifedipin,
Colchicin und Fluconazol festgestellt werden. Diese Streuung wird wahrscheinlich durch
Ausreißerwerte verursacht. Z.B. wurde bei Fluconazol in zwei Laboren ein Extraktion unter
10% gemessen, während im dritten Labor eine Extraktionshöhe von 90% ermittelt wurde.
≥
Diese Arzneimittel sollten in ergänzenden Versuchen noch einmal untersucht werden, um
ein verlässlicheres Ergebnis zu erhalten.
Mit der Einbeziehung der Extraktionswerte aus anderen Laboren wird deutlich, dass sich
die Teilergebnisse aus dem Labor Leipzig bestätigen lassen. Auch hier sind die 16
Arzneimittel (siehe auch Tabelle 6) mit einer Extraktionsausbeute ≥ 70% ausreichend mit
dieser Methode isolierbar. Zusätzlich wurde für Bisacodyl insgesamt eine Ausbeute von
71% erreicht.
Insgesamt ergibt sich damit eine ausreichend hohe Extraktionsausbeute mit n-Chlorbutan
und pH 9 bei 17 von 33 Arzneimitteln. Das bedeutet, dass eine ausreichende
Extraktionsausbeute bei 52 Prozent der hier untersuchten Arzneimittel ermittelt wurde.
Ein wenig anders sieht das Verhältnis aus, wenn die Ergebnisse aller bisher untersuchten
Stoffe mit einbezogen werden. In den Ringversuchen wurden insgesamt 332 toxikologisch
interessante Verbindungen untersucht. Davon sind 225 Verbindungen (entspricht 68
Prozent) sehr gut extrahierbar.
2.3.2 Extraktion aus Serum
Parallel zur Extraktionsmethode mit n-Chlorbutan aus Puffer wurden drei Arzneimittel
(Mesuximid, Prilocain, Procyclidin) zusätzlich aus Serum isoliert. Es wurden drei
verschiedene Testseren eingesetzt.
Bei allen drei Arzneimitteln wurde bei der Extraktion aus Puffer eine gute Ausbeute in der
organischen Phase (100R ≥ 80) festgestellt. Mit der Extraktion aus Serum sollte die
Übertragbarkeit der Ergebnisse auf biologisches Material überprüft werden. Dabei können
27
auch Einflüsse wie Eiweißbindung, Komplexbildung, Emulsionsbildung und andere
Faktoren auf die Verteilung des Arzneimittels zwischen der wässrigen und organischen
Phase eine Rolle spielen.
In der Tabelle 4 sind die Werte der prozentualen Wiederfindung aufgeführt. Alle
Ergebnisse liegen in einem Bereich von 87 bis 115 Prozent. Zwei Drittel der Werte ergaben
sogar eine Übereinstimmung von 97 bis 105 Prozent.
Daraus ist für die drei Arzneimittel eine gute Übertragbarkeit der Ergebnisse auf
biologisches Material erkennbar. Zwar kann man aus diesen Ergebnissen keine
übergreifenden Schlüsse auf die andere Stoffe ziehen, aber in der Regel wird eine
Übertragung der Ergebnisse auf biologisches Material in den meisten Fällen sehr gut
möglich sein.
2.3.3 Bedeutung für die STA
In der General Unknown Analysis sind die zu untersuchenden Stoffe unbekannt. Die
Screening-Strategie muß sehr umfassend sein, weil einige tausend relevante toxische Stoffe
berücksichtigt werden müssen. In der Systematischen Toxischen Analyse existiert bis heute
keine Extraktionsmethode, mit der man die Vielzahl der in Frage kommenden, relevant
toxischen Stoffe in einem umfassenden Verfahren isolieren könnte. Zwei oder mehr
Verfahren sind notwendig, um eine respektable Anzahl an toxischen Stoffen ausreichend zu
extrahieren. Oft werden basische/neutrale und saure/neutrale Verbindungen getrennt
voneinander bestimmt.
Auch bei der hier untersuchten Methode wird deutlich, dass sie als alleiniges Screening-
Verfahren nicht ausreichend ist. Die Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Chlorbutan bei pH 9 ist
eine Methode, die bei ausreichender Extraktionsausbeute der Wirkstoffe sehr gute Resultate
liefert. Das äußert sich in fast matrixfreien und dadurch sehr sauberen Chromatogrammen
und dadurch einer geringen Verschmutzung von Säulen und Detektoren.
Die Ergebnisse machen aber deutlich, dass eine ausreichende Extraktionsausbeute bei mehr
als einem Drittel der untersuchten Arzneimitteln nicht gegeben ist. Letztendlich ist aber
gerade die ausreichende Extraktion einer Vielzahl von Wirkstoffen Voraussetzung für den
28
generellen Einsatz einer Extraktionsmethode in der Systematischen Toxischen Analyse.
Somit ist der alleinige Einsatz dieser Isolationsmethode für ein Screening in General
Unknown Fällen nicht empfehlenswert.
Für Arzneimittel, die nur ungenügend mit n-Chlorbutan extrahiert werden konnten, ist der
Einsatz eines polareren Lösungsmittel wie z.B. Ethylacetat oder Dichlormethan/Ether 7:3
vielversprechend. Die Extraktionsausbeute wird mit der Erhöhung der Polarität des
Lösungsmittels gesteigert, gleichzeitig wird aber auch die Höhe des in erster Linie durch
körpereigene Substanzen verursachenden Untergrundes höher liegen.
Eine andere Möglichkeit zur Isolation dieser Stoffe ist z.B. die Verwendung der
Festphasenextraktion, die aber im Verhältnis zur FFE relativ teuer ist.
Von der Firma Biorad wird ein Remedi hs System angebotenen, bei welchem die gesamte
Analyse, d.h. Probenvorbereitung, chromatographische Trennung und Bibliothekssuche
automatisiert ist. Der manuelle Aufwand wird dadurch vermindert, aber weder die
Extraktions- (Festphasenextraktion) noch die Trennbedingungen (HPLC) können verändert
werden.
29
2.4 Schlussfolgerung
Für die Systematische Toxische Analyse ist eine logisch - schematische Vorgehensweise in
Kombination mit effizienten und leistungsstarken analytischen Strategien notwendig, um
unklare Krankheitsbilder und Todesfälle aufzuklären, bei denen eine Vergiftung in Betracht
gezogen wird. Durch die Vielzahl der toxisch wirkenden Substanzen ist es heutzutage
unmöglich, ein alleiniges Screeningverfahren für die STA zu etablieren. Das
Vorhandensein von sauen, neutralen und basischen Stoffen und deren unterschiedlichen
physiko-chemischen Eigenschaften führen z.B. dazu, das kein umfassendes
Extraktionsverfahren für die Systematische Toxische Analyse existiert, welche eine
Vielzahl toxikologisch interessanter Verbindungen zu analysieren vermag. Nur die
Kombination verschiedener Extraktionsmethoden führt zu einer respektablen Anzahl von
Wirkstoffen mit ausreichender Ausbeute, die dann mit gängigen Methoden bestimmt
werden können.
Mit den vorliegenden Extraktionsergebnissen von über 300 Arzneistoffen wurde die
Eignung der Methode für 225 Stoffe bestätigt. Dadurch kann die Screeningmethode gezielt
und effektiv für diese Stoffe in der STA angewendet werden. Zusätzlich ist der Einsatz
einer ergänzenden Extraktionsmethode von Vorteil, um die Anzahl der bestimmbaren
Wirkstoffe zu erhöhen. Mit diesen Arbeiten wurde eine Grundlage geschaffen, um
zukünftig die Probleme, die bei den sogenannten General Unknown Fällen durch die
Vielzahl der in Frage kommenden Stoffe zustande kommen, zu verringern. Auch können
jetzt bei der Analyse gezielt die Stoffe ausgeschlossen werden, die nicht detektiert wurden,
welches bei Nichtkenntnis der Extraktionsausbeute nicht möglich war, weil nicht eindeutig
eine vorhergehende ausreichende Extraktionsausbeute belegt werden konnte.
Eine Vorgehensweise für die STA wäre z.B. die Extraktion der toxischen Stoffe bei zwei
verschiedenen pH-Werten (4 und 9) mit n-Chlorbutan und für die nicht ausreichend
extrahierbaren Wirkstoffe zusätzlich der Einsatz eines wesentlich polareren Lösungsmittels.
Der Aufgabe hat sich der Arbeitskreis der GTFCh (Gesellschaft für Toxikologische und
Forensische Chemie) gestellt, um diese Möglichkeit für die Systematische Toxische
Analyse zu überprüfen.
30
2.5 Experimentelles
2.5.1 Geräte und Chemikalien
Geräte:
UV-VIS- Spektrophotometer CARY 1E, FirmaVarian; Quarzküvetten
HPLC / Photodiodenarray-Detektor HP Series 1100
Säule (System 1): Prontosil 120–5 C18 H 5,0µm
Säule (System 2): Lichrospher 100 RP 8 5µm
Substanzen (Reinsubstanzen):
1. Adenosin 18. Lofepramin-HCl
2. Amitriptylinoxid 19. Mesuximid
3. Aprindin 20. Metixen-HCl
4. Benseracid-HCl 21. Nalorphin-HBr
5. Bisacodyl 22. Nicardipin
6. Cathin 23. Nifedipin
7. Celiprolol-HCl 24. Pentobarbital
8. Colchicin 25. Phenylpropanolamin-HCl
9. Cyamemazin 26. Physostigminsulfat
10. Fluconazol 27. Pimozid
11. Flumazenil (1) 28. Pindolol
12. Fluspirilen 29. Prilocain (2)
13. Glibenclamid 30. Procain
14. Hydromorphon 31. Procainamid
15. Kavain 32. Procyclidin-HCl
16. Levodopa 33. Ropivacain (3)
17. Lisinopril
(1) AnexateR 0,5 mg / Ampulle, Injektionslösung
(2) XylonestR 1% ,Injektionslösung
(3) Naropin 2 mg/ml, Injektionslösung
31
Lösungsmittel:
n-Chlorbutan, Baker Analyzed Reagent, Dichte bei 25°C: 0,882 g/ml
Phosphatpuffer pH 9 (2 Teile Na2HPO4-Lösung [10g/100 ml aqua dest] + 1 Teil
aqua dest)
HPLC-Eluent (System 1): Acetonitril / Phosphatpuffer verdünnt (37:63)
HPLC-Eluent (System 2): Acetonitril / Phosphatpuffer verdünnt (63:37)
Daldrup: Acetonitril / Phosphatpuffer verd. (35:65)
MPPH (5-[4-Methylphenyl–phenylhydantoin]) 1µg/ml (1:4 bzw. 1:5 mit Methanol
verdünnt)
2.5.2 Durchführung
Es wurden 33 Arzneimittel aus einer Phosphatpufferlösung (pH 9) mit n-Chlorbutan
extrahiert und die Ausbeuten in der organischen Phase mit Hilfe der UV-
Spektrophotometrie und der HPLC ermittelt. Bei drei Arzneimitteln wurde parallel mit
Serum gearbeitet.
Extraktion aus Puffer
Zur Herstellung der Lösungen der Wirkstoffe wurden die Reinsubstanzen oder vorhandene
Medikamente (Injektionslösungen) verwendet. Die Substanzen wurden in Puffer mit einer
Wirkstoffkonzentration von 1 mg/ml gelöst oder bei Unlöslichkeit in Puffer auf dem
Ultraschallbad homogen suspendiert. Alternativ wurde auch die Chlorbutanmethode (s.
unten) angewandt.
150 µl dieser Lösung wurde mit einem Phosphatpuffer pH 9 auf 15 ml aufgefüllt
(Puffermethode). Die entstandene Lösung wurde in einem Vorversuch spektroskopisch
vermessen, um einen optimalen Extinktionsbereich (ε ≥ 0,5) zu gewährleisten. Je nach
Bedarf wurde die optimale Konzentration der Lösung eingestellt.
Zur Herstellung der Extraktionslösungen wurden jeweils 3,5 ml der obigen Lösung in die
Reagenzgläser A,B,C und D überführt. Anschließend wurden 3,5 ml n-Chlorbutan zu den
Reagenzgläsern C und D zugegeben. Alle 4 Untersuchungslösungen wurden danach zwei
Minuten geschüttelt und zwei Minuten bei 3200 Umdrehungen zentrifugiert. Die obere
32
organische Phase (Dichte 0,882 g/ml) und die untere wässrige Phase (Dichte 1 g/ml ) von C
und D wurden sauber abgetrennt und in neue Reagenzgläser überführt.
Die sechs Untersuchungslösungen wurden anschließend am Photospektrometer gegen einen
Leerwert (Phosphatpuffer bzw. n-Chlorbutan) einmal vermessen. Für die Aufnahme der
UV-Spektren wurde ein Wellenbereich von 200 bis 400 nm gewählt.
Alternativ wurde bei einigen Substanzen (Aprindin, Celiprolol-HCl, Fluspirilen,
Lofepramin-HCl, Nicardipin, Procyclidin-HCl) wegen der Unlöslichkeit in Phosphatpuffer
wie folgt vorgegangen:
1 ml der Substanzlösung wurde mit n-Chlorbutan auf 15 ml aufgefüllt
(Chlorbutanmethode). Auch mit dieser entstandenen Lösung wurde im Vorversuch die
optimale Konzentration eingestellt. Zur Herstellung der Extraktionslösungen wurden
jeweils 3,5 ml der Lösung in die Reagenzgläser A,B,C und D überführt. Anschließend
wurden 3,5 ml Phosphatpuffer pH 9 zu den Reagenzgläsern C und D zugegeben. Analog
zur Puffermethode wurde dann weiter verfahren.
Zur Kontrolle wurden alle Extraktionslösungen mit der HPLC bei 220 nm vermessen. Es
wurden jeweils 0,5 ml der Lösung mit 1 ml Daldrup versetzt und 50 µl externer Standard
(MPPH) zugegeben.
Extraktion aus Serum
Zur Testung der Extraktionsmethode mit n-Chlorbutan auf Serum wurde wie folgt
vorgegangen:
1 ml Serum bzw. Wasser (als Vergleich) wurde mit einer Spatelspitze Natriumhydrogen-
carbonat zur pH-Wert Einstellung versetzt. Für biologisches Material wird diese Methode
wegen einer geringeren Emulsionsbildung verwendet.
Anschließend wurde die entsprechende Menge Arzneistoff (siehe Tabelle 7) zugesetzt .
Nach Zugabe von 3 ml n-Chlorbutan wurde das Schliffglas vorsichtig einige Minuten
geschüttelt. Ein Überschuss des organischen Lösungsmittels ist meistens vorteilhaft, um
eine Emulsionsbildung zurückzudrängen.
Nach zweiminütigen Zentrifugieren bei 3200 Umdrehungen und der Abtrennung der
organischen Phase vom Serum bzw. von der Wasserphase wurden 1 ml der
Chlorbutanphase entnommen, mit 10 µl externen Standard MPPH versetzt und unter
33
Stickstoff im Eppendorfgefäß eingedampft. Zur Vorbereitung der HPLC-Probe wurden 200
µl Phosphatpuffer und 400 µl Daldrup zugegeben. Mit der HPLC wurden bei 220 nm die
Peakflächen der Substanz und des externen Standard ermittelt.
Insgesamt sind drei verschiedene Seren zum Einsatz gekommen. Es wurden Doppelbe-
stimmungen durchgeführt.
Tabelle 7 verschafft einen Überblick über die eingesetzte Arzneistoffmenge in Bezug auf
ihre therapeutischen und toxischen Plasmakonzentrationen.
Substanz Plasmakonzentration [µg/ml] Eingesetzte
Therapeutisch Toxisch Komatös-letal Konzentration
[µg/ml]
Mesuximid 2,5 – 7,5 10 25 10
Prilocain 0,5 – 1,5 (-2) 5 – 6 ca. 20 10
Procyclidin 1 2 1 Tabelle 7
Berechnung:
Die Standardabweichung wurde nach folgender Formel berechnet:
( )( )1
)22
−∑−∑
=nn
xxns
34
3 Auswertung von unveröffentlichten Forschungsergebnissen aus den
achtziger Jahren: Verteilungsquotienten und pH – Abhängigkeit
toxikologisch relevanter Verbindungen
3.1 Einleitung
Es wurden die experimentellen Daten über die Verteilungsquotienten und pH-Abhängigkeit
von über 90 Verbindungen ausgewertet. Die Daten wurden Ende der 80er Jahre in der
Rechtsmedizin Leipzig ermittelt. Durch die politischen, wirtschaftlichen und
wissenschaftlich/technischen Umstellungen, die im Zusammenhang durch die
Wiedervereinigung Deutschlands im Jahre 1989 entstanden, wurden die experimentell
gewonnenen Daten nie ausgewertet. Obwohl sich die STA in den letzten 20 Jahren enorm
weiterentwickelt hat, können die Ergebnisse über Verteilungsquotienten und pH–
Abhängigkeit von toxikologisch relevanten organischen Verbindungen auch heute noch für
bestimmte Fragestellungen hilfreich sein.
3.2 Grundlagen der Verteilung
Die Grundlagen der Systematischen Toxischen Analyse (Bedeutung, Methoden,
Verteilungs -und Dissoziationsverhalten) wurden schon im ersten Teil dieser Arbeit
besprochen und sollen hier nicht wiederholt werden. In diesem Teil sollen kurz die
Grundlagen über Verteilungungsquotienten und pH-Abhängigkeit betrachtet werden.
Es wurden die experimentellen Daten über die Verteilungsquotienten und pH-Abhängigkeit
von über 90 Verbindungen ausgewertet. Der untersuchte pH-Bereich liegt bei den meisten
Verbindungen zwischen pH 1 bis 13.
Die pH-abhängige (scheinbare) Verteilungskonstante DC ist das Verhältnis der
Konzentration der verteilten Substanz [HA] in der organischen und wässrigen Phase.
WHA
OHA
WW
OC c
cAHA
HAD)()(
][][][
=+
= −
35
Falls die Verteilung einer Substanz pH-abhängig ist, kann die pH-abhängige
Verteilungskonstante DC aus der pH-unabhängigen (wahren) Verteilungskonstante KD unter
Berücksichtigung des Dissoziationsgrades α errechnet werden, denn nur die
Neutralmoleküle können an der Verteilung teilnehmen.
)1()( , α−⋅== DDC KpHKfD
D
K
α
C pH-abhängiger Verteilungsqoutient
Verteilungskonstante (pH-unabhängig) D
Extinktion der wässrigen Phase nach der Extraktion
Menge der Substanz HA in der organischen Phase
Menge der Substanz HA in der wässrigen Phase
Menge der Substanz A- in der wässrigen Phase
Konzentration der verteilten Substanz in der organischen Phase
Konzentration der verteilten Substanz in der wässrigen Phase
OHA][
[ ]WHA
[ ]−WA
OHAc )(
( WHAc )
Berechnung:
Berechnung der Extraktionsausbeute R (nur gültig für ein Phasenverhältnis 1:1):
ι
ι
OOHA
OOHA
VQVQR⋅⋅
=)()( Abdampfrückstand aus dem abpipettierten Anteil der
organischen Phase
Anteil der verteilten Verbindung in der organischen Phase
Volumen der org. Phase (nach der Gleichgewichtseinstellung)
abpipettiertes Aliquot der org. Phase mit dem Anteil
der verteilten Verbindung
ιOHAQ )( ι
OV
OHAQ )(
OV
ι
OV ιOHAQ )(
HA
OHA
R)(
100100 ⋅= ι
ι
OOHA
OOHA
VQVQ⋅⋅
=)()(
36
Berechnung der Verteilungskonstante KD:
111
−=
R
K D
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte mittels der Bestimmung der Extraktionsausbeute
100R.
Die experimentellen Ergebnisse über die Verteilungsquotienten und deren pH-
Abhängigkeit von 91 toxikologisch relevanten Verbindungen wurden mit dem
Statistikprogramm SPSS ausgewertet.
37
38
3.3 Ergebnisse Die Extraktionsausbeuten 100R von 91 Wirkstoffen in Abhängigkeit von dem pH-Wert sowie die maximale Ausbeute mit der entsprechenden Dissoziationskonstante sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
Verbindung LM 100 R bei pH 100R KD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max
Acetylsalicylsäure
Et 1
Clf 97,5 47 24,6 3,4 0 2,7
5,8 5,1 97,5 39,00 Acetyl-Sulfafurazol
Clf 30,2 38,9 29,7 39,6 41,7
29,5 35,9 36,7
20,8
16,2
41,7 0,72 Eto 26,6 23,9
23,1 31,1
25 25,8
13,4 15,9
1,3 1 31,1 0,45
Acetyl-Sulfamerazin, N4-
Eto 15,2 13,3 21,4 5,1 1,1 0 21,4 0,27 Clf 8,6 44,5
33,1 35,4 29,5 11,5
2,6 0 44,5 0,80
Acetyl-Sulfanilamid, N4-
Clf 0 0 0 0 0 0,5
0,5 0,01 Eto 6,4 16,9 15,5 18,6 13,2 6,6
2,6 18,6 0,23
Eta 52,7 63,4 66,4 75,6 66,6 39 41,2 75,6 3,10 Acetyl-Sulfisomidin, N4-
Eto 7,7 1,1 19,4 24,6 1,9 6,9 8,9
6,7
1,3
24,6 0,33 Clf 1,5
8,6 12,6 8,7 6,6 5,8 21,8 8,4 0 0 21,8 0,28
Allobarbital
Eto 86,9 98,6 94,4
69 4,4 98,6 70,43 Clf 74,8 77,6 23,2 0 77,6 3,46
Allopurinol Eto 0 0 0,16 0,1 0,85 1 0,2 1 0,01 Allylethylbarbitursäure
Eto 93,2
97 93,3 91,8 58,9 2,4 0,2 97 32,33 Clf 63,1 63,2 70 16,4 1,1 70 2,33
Amobarbital
Clf 103,3 104,2 104,4 94,1 5,5 ~ 100 ~ 99 Eto 100 102,3 99,7 99,1 98 22,7
4,2 ~ 100 ~ 99
Aprobarbital Clf 93,2 92,8 90,4 91,2 85,6
38,8
6,3 0,4 4,60
3,8 93,2 13,71 Azidamphenicol Eto 28,8 33,7
46,4 41,4 42 35,2
14,8
46,4 0,87
Barbital
Clf 40,88
48,4
50,1
53,1
50,6
35,1
10,8
0,6 2,1 2,3 53,1 1,13 o
81 4,26
Eta 88,5 86 88,5 7,70 Benzylhydrogenphthalat
Clf 100 95,8 15,1 1,5 1,7 100 ~ 99
Biperiden
Clf 105,3
113,9
97,7
103 99 97,2 103,2
~ 100 ~ 99 Eto 0 0,1 15,4 13,4 41
101,1 104,2 99,8
96,6 ~ 100 ~ 99
Bisacodyl Clf 98,7
84,7 94,7 101,3 102,9 101,7 96 90,6 ~ 100 ~ 99 Bromhexin Clf 112,1 102,3 97,9 105 107,7 99,8 108,7 ~ 100 ~ 99
39
Fortsetzung von Tabelle 8 Verbindung LM 100R bei pH 100R K D
1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max
Eto 0 8,1 103,3 97,9
91,4 87,9 96,1 95,8
~ 100 ~ 99 Bromisoval Clf 86,4 93 95,8 88,4 92,1
72,9 7,30
1,1 95,8 22,81
Bromsalicylsäureisopropylamid
Clf 98,8 100,5 99 104 93,4
39,7 0 ~ 100 ~ 99 Buformin
Clf 0 5,8 3 1,6 6,2 5,8 0,06 Eto 2,8 31,7 0 0 0 0 0 31,7 0,46
Busulfan
Eto 14 14,2 14,3 16,5
14,4 12 13,8 16,5 0,20 Clf 100,7 98,5 101,6 99,7 101,6 ~ 100 ~ 99
Carbamazepin
Clf 106,8
106,7
105,2
103,6
107,7
107,9
108,6
~ 100 ~ 99 Eto 68,8 78,8 73,4 79,3
88,6 81,3 82,8 78 88,6 7,77
Clenbuterol
Eto 0,32,8 5,7 0,4 0 19,3 80,1
96,2 94,6 96,8 96,8 30,25 Clf 1,3 2,2 56,6
100,5
93,4
90,8 ~ 100 ~ 99 Clomethiazol
Eto 0,7 1,4 2,1
2,1 0,02 Clf 3,1 4,6 5,7 4,3 5,3 5,1 5,7 0,06 Eta 2,5 2,8 0 0 0 13,1 0 13,1 0,15
Clomipramin Clf 128 115,5
11 102,6
103 99,2 104 ~ 100 ~ 99 Eto 2,9 6,8 45,4 104,5
96,6 108,1
101,2
100,9 94,5 ~ 100 ~ 99 Clonazepam
Eto 60,8 95,2
94,6 96 102,2
96 5,6 ~ 100 ~ 99 Clf 102,4
103,1
107,2
104,6
37,5
~ 100 ~ 99 Coff a 2,4 0,02 Cytisin
Clf 0,07
0,05
7,7 10,9
24,2
62,1 64,9 75,4 75,4 3,07 2,1 3,6 3,8 3,8 0,04
EtA 6,1 0,06 Demoxepam
Eto 60,4
63,4 83,4 80 47,6 83,4 5,02
Clf 95 101,3 102,5
97,8 102,8
101,2
3,4
~ 100 ~ 99 Denaverin
Eto 64,4
34,2 60,5 97,4
97,5 85,1
85,2 79,1
97,5 39,00 Clf 107,2
111,1 100,6 109,1 103,7 ~ 100 ~ 99
Desipramin
Eto
4,9 2,5 5,3
37 89
111,1 120,6 ~ 100 ~ 99 Clf 94,3 106,9 61,6 113,7 115,5 106,7 110,6 ~ 100 ~ 99
Detajmium
Eto 3 3,2 1,4 0 11,3 19,1
68 62,2 63,3 68 2,13 Clf 2,2 46,4 69,3 68,5
69,3 2,26
Diacetyl-Sulfanilamid, N1, N4- Eto 14,7 15,8 13 7,1 7,1 5,4 0,1 0,8 15,8 0,19
3
ein Et 2,4
c 4,1 6,1
77,2 92,5
1,6
Eto
40
Fortsetzung von Tabelle 8 Verbindung LM 100R bei pH 100R KD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max
Clf 2 3 7 0,1 0 0,18 7 0,08 Eta 76,1 73,9 86,1 3,1 2 0 1,6 86,1 6,19
Diclofenac
Eto 83,9 99,7 94,9 97,2100,5
74,4
51,2 2,1 9,7 1,7 ~ 100 ~ 99 Clf 92,4 107
91,7 77,1 7 0,9 0,4 ~ 100 ~ 99
2,4-Dioxo-5,5-dimethyloxazolidin
Eto 42,4 66,1
70 81,5
54,2 58,1
20,2 0 7,7 3,9 81,5 4,41 Clf 15,6 24,5 28,4 1,2 0 28,4 0,40
Dipyridamol
Clf 11,1
92,9
99,2 100,3
100,4
99,2 ~ 99 Eto 0 27,7
41,6 69,1 67,8 72,2 65,8
72,2 2,60
Diuron
Eto 97,4 99,5
105,5
111,9 103,8
100,4
101 ~ 100 ~ 99 Clf 102,9
105,1
103 ~ 100 ~ 99 Ergometrin
Eta 104,3
100,4 75 ~ 100 ~ 99 Clf 2,8
1,8 6 100,5 110,8 ~ 100 ~ 99
Eto 7 4,5 11,5
11 8,9 33,40
24,8 33,4 0,50 Ergotamin
Clf 18,2
51,8 79,8 86,5 101,1
66,5 ~ 100 ~ 99 Eto 4,4 11,7 19,7 20,1 11,1 20,1 0,25 Eta 59,9 65,4 62,4 78,5 80,6 96,4
52,2
96,4 26,78
Ethosuximid
Eto 63,2
50,8 60 54,9 52,8
49,3 55,9
44,9 33,6
1,5 4,7
60 1,50 Clf 55,7 69,1 55,5 55,7 41,5 5,5
8,5 4 69,1 2,24
Etilefrin
Eto 4,82,8 3,8 5,82,2 1,3 0 2,5 5,4 4,6 5,8 0,06 Clf 0
2,2
1,2 1,7 1,2 5,9 4,5
5,9 0,06 Euparen Eto 73,7 48,8
49,8 48 44,3 73,7 2,80
Fenuron
Eto 47,9 51,1 57,8
65,2
55,3
57,6 65,2 1,87 Clf 98,2 93,4 101,7 ~ 100 ~ 99
Fominoben
Clf 81 104 100,1
101,8
98,5 ~ 100 ~ 99 Eto 0,8 6 41,4 85,4
78,7 79,8 87,4 80,6 96,3 98,6
94,8 98,6 70,43
Furosemid
Eto 70,3 68,7 86,7 85,7 18 5 0,4 0,4 86,7 6,52 Clf 7,4 11,8 8,5 8,5
5,2 0,6 2,9 11,8 0,13
Eta 84,3 116,2 104,1 82,4 5,5 9,5 ~ 100 ~ 99 Glibenclamid
Clf 113,2
110,4
104,9
106,2
99,8 27,6 8,2
~ 100 ~ 99 Eto 20,2 20,7 20 16,5 26,2
24,5 0 26,2 0,36
Guajacolglycerolether
Eto 26,5 31,8 32,6 30,8
23,1 21 32,6 0,48 Clf 61,7 69,1 70,9 67,2 60,9 70,9 2,44
41
Fortsetzung von Tabelle 8 Verbindung LM 100R bei pH 100R KD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max
Histapyrrodin
zol t 4,6
Clf 94,5 111,4 95,693,9 101,3 102,5 102,4
101,6 ~ 100 ~ 99 Eto 0 3,1 0 31 96,4 102,1 92,2 ~ 100 ~ 99
Homatropin
Clf 3,3 1,2 1,6 18,3 97,5 67 38,60 8,5 97,5 39,00 Eto 0 4,5 2,5 47,8 55,1 11,60
5,4 55,1 1,23
Hydrastin
Eto 0,3 1,6 38,9 103,2
100,6
102,1
98,9 ~ 100 ~ 99 Clf 77,6
108,9
100,9
102 ~ 100 ~ 99 Hydrastinin
Eto 1,4 3,8 11,4 57,10 62,8 62,8 1,69 Clf 2,9
5,8
95,40
91
95,4 20,74
4-Hydroxyphenazon
Eto 39,9 72,3 60,3
67,2
47,6 22,8
0 0,00
0 72,3 2,61 Clf 92,5 96,7
92,6 10,3 96,7 29,30
Kebuzon
Eto 45 38,1 5,5 6,4 5 45 0,82 Clf 93,3 56 99,1 96,4 16,2 99,1 ~ 99
MCPA
Eto 79,3 83 72,4 58,6
8,6 1,3 0,3 1,4 83 4,88 Clf 78,8 85 29,9
9,8 78,8 3,72
MCPB Clf 81,7 73,2 4,1 0 0 81,7 4,46 Eto 100,6 103
98,8 108,8 69,2
114,6 27,6 9,2 6,9 0,70
2,7 ~ 100 ~ 99
Meclozin
Eto 14,1 59,2
85,2 75,5 86 94,9
91 75,5 94,9 18,61 Clf 10,9 99,5 85,4 91,9 81,2
81 99,5 ~ 99
Medazepam
Eto 0,3 5,9
90,6 104,2 101,3
106 ~ 100 ~ 99 Clf 116,4
, 99 100,7
104
~ 100 ~ 99 Metami E a 2 24,6 0,33 Metoclopramid
Eto 0,5 1 1,2 3 47,7 95,7
97
90,3 95,7 22,26 Clf 1,5 8,8 2,5 3,9 13,6
74,7 93,8
96 95,5 96 24,00
α-Naphtyl-2,3-dihydroxypropylether
Clf 98,8 97,4 102,1 ~ 100 ~ 99 Eto 93,7 87,3 101,4 99,3 ~ 100 ~ 99
Naptalam Clf 57,2 47,3 34,1 6 5,3 4,1 57,2 1,34 Niclosamid
Clf 63,1 59,5 51 56,4 38,1 63,1 1,71 Eto 88,8 96,4 95,1 99,5
88,4 28 1,4 96,4 26,78
Nifedipin
Clf 103,6
95,2 96,2 103,1 97,1 ~ 100 ~ 99 Eto 85,9 96,4
91,8 96,4 100,7
100,4
92,5 97,5 96,9 ~ 100 ~ 99
Noxiptilin
Clf 119,3
115,3
98,1 96,8 100,2
99,6 101,2
~ 100 ~ 99 Eto 0,4 3 12,6 70,8 95,1 92 85,6 93,9 96 96 24
42
Fortsetzung von Tabelle 8 Verbindung LM 100R bei pH 100R KD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max
Osalmid
Clf 77,1 76,3
76,9 78,1
19,1 3,7 5,00 0,6 78,1 3,57 Eto 106 98,5 93,8 33,8
7,2 3,80
0,73
~ 100 ~ 99
Oxyphenbutazon
Eto 112,9 104,1
98,1
86,4 45 11,4 0 4,8 ~ 100 ~ 99 Clf 103,8 98,4 60,1
9,1 0,23
2,0 ~ 100 ~ 99
Pentoxyfyllin Clf 103,7 104,2 104 101,4
99,2 97,0
~ 100 ~ 99 Eto 8,6 17,8 23,05 25,2
27,6 30,2
15,6 16,8 8,8 30,2 0,43
Periciacin
Clf 87,5
53,2
87,1
86,2 104 109,3
105,2 106,1 ~ 100 ~ 99
Eto 1 4,5 34,8
90,4
102,8
109 108,9
103,0
102,0
~ 100 ~ 99 Phenazon Eta 1,5 0,6 1,5 0,02 Phenprocoumon
Clf 100,7 101,2
103,1
101,8 108,5 87,6 46,8 9,2 4,8 4,5 5,8 ~ 100 ~ 99 Eto 101,7 101,4
96,8
68,1
19,9 1,9 2,6 ~ 100 ~ 99 α-Phenyl-α-ethyl-glutaconimid
Eto 101,3 116,3 90,5 93 24,4
0,5 ~ 100 ~ 99 Clf 102 101,9 102,7 104 102,7
93,2 8,6 ~ 100 ~ 99
α-Phenylglutarimid
Clf 103,5
99,3 100,3
100,6
93,2 90 42,9 9,9 1,7 ~ 100 ~ 99 Eto 66,6 70,6 74,9 79,9 74,8 56,7 25,4
0,0 2,3 79,9 3,98
Phenylindandion
Clf 90,6
93,8
100,6
98,3 100,5
57,8
28,8 13,5
6,5
5,1
5,6 ~ 100 ~ 99 Eto 92,1
90,6 47,2 14,9 5 12,8
92,1 11,66
1-Phenyl-3-methylpyrazolon
Clf 78,4 95,5
105,7 97,9
95,4 96,4
68,9 10,7
0,9 2,4 ~ 100 ~ 99 Eto 59
90,6
80,8
96,8
14 0 13,5 96,8 30,25 Phenytoin
Eto 99,4
1,3 99,4 ~ 99 Clf 97,4
93,7
91 43,7
19 1,3 97,4 37,46
Promazin 3,1
63,1 63,1 1,71 Promethazinsulfoxid
Eto 0,9 1 0 4,5 39,2
35,2
39,6
46,9 52,0
57,6 57,6 1,36 Clf 4,1 2,3 82,7 88,1
85,6 88,1 7,40
Prometryn
Clf 112,7118,3 101,2 100,4
98,1 101,9 ~ 100 ~ 99 Eto 39,8 83,8
110,4
98,8 97 99,4
102,9 ~ 100 ~ 99
Propiverin
Clf 109 90,4 92,4 91,8 ~ 100 ~ 99 Eto 4,1 6,4 18 35 78,8 95,1
88,4 97,3
97,2 93,8
96,1
90,0
92,7 97,3 36,04 Propyphenazon
Clf 97 109 105,5 103,2 102,5 ~ 100 ~ 99 Eto 71,7 95
105,7
92,4 96,1 89,4
96 93,4 ~ 100 ~ 99
Pyritinol
Clf 0,1
0 0,1 7,3 15,5
17 2,8
0 0,0 17 0,20 Eto 1,6 1,8 0,8 4,6 2 3,2 4,6 0,05
43
Fortsetzung von Tabelle 8 Verbindung LM 100R bei pH 100R KD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Max
Eta 0
14 25,8
12,2 11,3
10,8 2,9 4,7 25,8 0,35 Rubazon-Säure
Eto 114 99,8 92 30,7 12,2 ~ 100 ~ 99 Clf 111,1 99,8 104,1
104,5
97,8
73,5
0,0
~ 100 ~ 99 Sulfadimethoxin
Eto 64,2 90,2
94,9 94,4 95,9
93,3
41,1 2,3 0,2 95,9 23,39 Clf 83 99,6
104,2
69,4
14,5
2,5 0,97 1,9 ~ 100 ~ 99 Sulfaethidol
Eto 20,4 0 0,0 20,4 0,26 Clf 15,2 84,4 1,3 1,0 84,4 5,41 Eta 49,9 94,4
0 0,0 94,4 16,86
Sulfamerazin
Eto 2,6 3,7 2,6 3,7 0,04 Clf 6,8 30,2 71,1 70 63,3 35,6 5,9 8,2 71,1 2,46
Sulfamethoxazol
Eto 51,7 85,4 90,4 90 97,4 63,4 14,2 1,2
0,3
1,7 90,4 9,42 Clf 31,3 62,1 78,9 81,2 71,5 35,4 3,2 0 0 1,8 81,2 4,32
Sulfatolamid
Eto 40,9
24,2 37,6 36,3 9,7
1,4 0 40,9 0,69 Clf 1,9 4,8 1,9 1,2 2,2 0 0,0 4,8 0,05 Eta 46,9
41 12,8 9,9 9,5 46,9 0,88
Talindol
Clf 4,6 12,3
31,1
93,4
104,8
108 99,6 ~ 100 ~ 99 Eto 2,2 0,7 1,4 6,9
58,9
91,3
95,8
95,0 95,8 22,81 Thioridazin
Eto 12,7
6,9 24,2
10,7
51,7
96,5
96,5 91 84,8 96,5 27,57 Clf 123,3 103 98,7 99,9 ~ 100 ~ 99
Triamteren
Clf 0,6 1 9,6 9,5 6,3 8,6 9,6 0,11 Eto 3,6 1,4 3,2 0,25 6,3 5,4 6,3 0,07
Trimethoprim
Eto 3,2
5 5,3 11
11,9 11,4 11,9 0,14 Clf 0 2 16,7 48,4
92,8 101,6 100,0 ~ 100 ~ 99
Trimipramin
Clf 116,3
93,1 11,7 93,9
101,8
~ 100 ~ 99 Eto 4,1 9,4 31,4
66,2 96,2
96,1
84,8
87,2
76,2 96,2 25,32 Trioxopiperidin-Natrium
Eto 0 0,9 0 0,0 0,9 0,01 Clf 5,6 5,2 10,2
9,6 9 6,3 4,6 10,2 0,11
iso-Valerianylharnstoff
Clf 52,9 64,4 70,9 66,1 54,8
2,7 70,9 2,44 Eto 45,9 61,5
57,8 57,2
53,8
11,5 61,5 1,60
Verapamil
Clf 105,7
92,2
94,6 ~ 100 ~ 99 Eto 0 2,8 14,1 7,9 29,8 77,9 85 92,8 96 96,0 96 24
Abkürzungen: 100R-Extraktionsausbeute in der org. Phase; Berechnung S. 36, KD-Verteilungskonstante, LM-Lösungsmittel, Eto-Ether, Clf-Chloroform, Eta-Ethylacetat
44
3.4 Auswertung
Es wurden die Verteilungsquotienten und pH-Abhängigkeit von 91 toxikologisch relevanten
Wirkstoffen im Zweiphasensystem wässrige Pufferlösung / nichtwassermischbares
Lösungsmittel bestimmt (siehe auch Tabelle 8).
Als Lösungsmittel kamen Ether und Chloroform zum Einsatz, in einigen Fällen wurde bei
ungenügender Extraktionsausbeute zusätzlich noch mit dem wesentlich polareren Ethylacetat
gearbeitet. Einen Überblick über die Höhe der Extraktionsausbeute in Abhängigkeit vom
verwendeten Lösungsmittel verschafft Tabelle 9. Es wurden nur die Werte der maximalen
Extraktionsausbeute (100R-Max) einbezogen.
Tabelle 9: Lösungsmittelvergleich unter Einordnung der Wirkstoffe (100R-Max) in den
dargestellten Extraktionsbereichen
Lösungsmittel n Bereich der Höhe der Extraktionsausbeute 100R (von – bis)
80 – 100 Prozent 60 – 80 Prozent 40 – 60 Prozent > 40 Prozent
Chloroform 87 60 (69%) 11 (13%) 4 (5%) 12 (13%)
Ether 83 47 (57%) 9 (11%) 5 (6%) 22 (26%)
Ethylacetat 14 6 (43%) 1 (7%) 1 (7%) 6 (43%) Tabelle 9
Eine sehr gute Extraktionsausbeute (100R 80) wurde mit dem Lösungsmittel Chloroform
bei 69% und mit Ether bei 57% der Stoffe erzielt. Bei einer ausreichenden Ausbeute (100R
60) konnten sogar 82% der Substanzen mit Chloroform und 68% mit Ether isoliert
werden.
≥
≥
Insgesamt konnten mit Chloroform höhere Extraktionsausbeuten als mit Ether ermittelt
werden. Außerdem ist die Anzahl der schlecht isolierbaren Wirkstoffe (100R ≤ 40; entspricht
40 Prozent) geringer. Ethylacetat wurde zusätzlich bei 14 Wirkstoffen eingesetzt, bei denen
eine unzureichende Isolierung mit Chloroform oder Ether festgestellt wurde. Ethylacetat ist
im Gegensatz zu Chloroform und Ether polarer und konnte in vielen Fällen die
Extraktionsausbeute noch steigern. Bei 50% der Stoffe konnten sogar ausreichende
Extraktionsausbeuten erzielt werden.
45
Im Anhang sind die Extraktionsausbeuten (100R) in Abhängigkeit vom pH-Wert für 87
Wirkstoffe graphisch dargestellt. Dafür wurde das Statistikprogramm SPSS verwendet. Die
Stoffe sind jeweils in einem High-Low-Diagramm dargestellt, welches die Streuung um die
Mittelwerte (Mittelwert Standardabweichung) berücksichtigt. ±
Diese Wirkstoffe wurden in 4 Gruppen eingeteilt:
1. Saure Verbindungen (39)
2. Neutrale Verbindungen (12)
3. Amphotere Verbindungen (5)
4. Basische Verbindungen (31)
Im Allgemeinen gelangen nur die undissoziierten Verbindungen messbar in die organische
Phase (seltene Ausnahme: Ionenpaarextraktion). Da die meisten organischen Arzneimittel
oder Gifte zur elektolytischen Dissoziation fähig sind, kann die Verteilung durch eine
Veränderung des pH-Wertes zu Gunsten der organischen Phase verschoben werden, die damit
letztendlich zu einer erhöhten Extraktionsausbeute führt. Aus diesem Grund wird bei sauren
Verbindungen das biologische Material angesäuert (pH <7), während bei organischen Basen
dieses alkalisiert wird (pH >7). Für neutrale Wirkstoffe ist der pH-Wert von geringem
Einfluss (Müller, 1991). Amphotere Verbindungen besitzen eine oder mehrere basische bzw.
saure Gruppen im Molekül.
Auf den folgenden Seiten sind Übersichtsdiagramme von Substanzbeispielen aufgeführt, die
grundsätzlich das Extraktionsverhalten der vier verschiedenen Gruppen deutlich machen
sollen.
46
3.4.1 Saure Verbindungen
Relevante saure Verbindungen in der klinischen und forensischen Toxikologie sind z.B.
Barbiturate (Aprobarbital, Barbital), nichtsteroidale Antiphlogistika (Diclofenac), Coumarine
(Phenprocoumon) und Diuretika (Furosemid).
Überblick: Saure Verbindungen - LM Chloroform
Überblick: Saure Verbindungen – LM Ether
Überblick: Saure Verbindungen – LM Chloroform
Überblick: Saure Verbindungen – LM Ether
47
3.4.2 Neutrale Verbindungen
Neutrale Verbindungen zeigen über den gesamten pH-Bereich kaum eine Veränderung der
Verteilungskonstanten. Relevante neutrale Verbindungen in der klinischen und forensischen
Toxikologie sind z.B. die Herbizide Fenuron und Diuron und das Antiepileptikum
Carbamazepin.
Überblick: Neutrale Verbindungen – LM Ether
Neutrale Verbindungen – LM Chloroform
48
3.4.3 Amphotere Verbindungen
Relevante amphotere Verbindungen in der klinischen und forensischen Toxikologie sind z.B.
das Parasymphatolytika Homatropin (ein halbsynthetisches Derivat des Atropins, in welchem
der Tropasäure-Anteil durch racemische Mandelsäure ersetzt ist), das Antibiotikum
Sulfamerazin (Sulfanilamid-Derivat mit Sechsringheterocyclus) und das N(4)-Acetyl-Derivat
des Sulfaisomerins, welches wegen der schlechteren Wasserlöslichkeit im Vergleich zum
unveränderten Wirkstoff Nierenschäden durch kristalline Ablagerungen hervorrufen kann.
Amphotere Verbindungen – LM Ether
Amphotere Verbindungen – LM Chloroform
49
3.4.4 Basische Verbindungen
Viele toxikologisch relevanten Verbindungen sind organische Basen. Bedeutend für die STA
sind z.B. Antidepressiva (Desipramin, Trimipramin, Clomipramin), Benzodiazepine
(Medazepam), Hypnotika (Clomethiazol), Mutterkornalkaloide (Ergotamin, Ergometrin),
Morphin, Codein und Cocain.
Basische Verbindungen – LM Ether
Basische Verbindungen – LM Chloroform
50
3.5 Diskussion
Die Verteilungsausbeuten wurden im proteinfreien wässrigen Puffermedium ermittelt. In der
Praxis wird die Extraktion des biologischen Materials durch verschiedene Parameter
beeinflusst. So können z.B. Proteine die Extraktionsausbeuten vermindern. Daher stellen die
ermittelten Ausbeuten meist Maximalwerte dar.
Ein Vergleich zur Extraktionsmethode mit Chlorbutan (siehe Teil 1: Extraktion von toxisch
relevanten Stoffen mit Chlorbutan bei pH 9) kann bei dem folgenden Beispiel aufgezeigt
werden: Es wurden die Extraktionsausbeten der Arzneimittel Bisacodyl, Glibenclamid und
Nifedipin für das Lösungsmittel Chlorbutan im ersten Teil dieser Arbeit ermittelt und für
Chloroform bzw. Ether im zweiten Teil ausgewertet. Bei der Gegenüberstellung wird
deutlich, dass Bisacodyl und Glibenclamid mit Chlorbutan nicht ausreichend isolierbar sind,
dafür aber sehr gut mit Chloroform. Der Calciumblocker Nifedipin geht bei allen drei
Lösungsmitteln sehr gut in die organische Phase über.
Extraktionsausbeute 100R bei pH 9 Arzneimittel
Chloroform Ether Chlorbutan
Bisacodyl 100 48
Glibenclamid 100 26 7
Nifedipin 100 93 100 Tabelle 10
Während Ende der 80er und Anfang der 90er Jahre in der STA oft Chloroform oder
Diethylether als Extraktionsmittel verwendet wurden, wird man heute vor allem
Lösungsmittel wie Dichlormethan, Chlorbutan, Propan, Hexan, Ethylacetat oder Toluol
einzeln oder im Gemisch vorfinden. Damals waren zusätzlich die niedrigen Siedepunkte der
Lösungsmittel Chloroform und Ether vom Vorteil, um die Extraktionsparameter zu
bestimmen.
Es können zwar gute Extraktionsergebnisse mit Chloroform und Ether erzielt werden, aber
der Umgang (Einatmen, Hautkontakt) mit diesen Lösungsmitteln kann zu einer
Beeinträchtigung des Wohlbefindens und zu einer Schädigung der Gesundheit führen. Aus
diesem Grund werden diese Extraktionsmittel heute nur noch selten eingesetzt. Einatmen von
Chloroformdämpfe führt z.B. zu Erregungszuständen, denen sich Empfindungslosigkeit,
Bewusstlosigkeit und tiefe Narkose anschließen. Weitere Chloroformaufnahme verursacht
51
Atemlähmung. Schnelle Zufuhr konzentrierter Dämpfe kann schon nach wenigen Atemzügen
zu Herzkammerflimmern und Herztod führen. Ferner ist Chloroform in der Kategorie 4
(krebserzeugender Arbeitsstoff, nicht-linearen Dosis-Wirkungs-Beziehung, Vorhandensein
einer Wirkungsschwelle) eingestuft (MAK- und BAT-Werte-Liste 2003). Zellschädigende
Effekte sind wahrscheinlich für die Entstehung der im Tierversuch nachgewiesenen Tumore
verantwortlich. Die zellschädigenden Effekte lassen sich aufgrund der Umsetzung von
Chloroform zu reaktiven Stoffwechselprodukten erklären (MAK- und BAT-Werte-Liste
1999).
Ethylacetat wird auch heute noch oft eingesetzt, meistens im Gemisch mit anderen
Lösungsmittels.
Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahren in der
Systemtischen Toxischen Analyse.
Referenz Extraktionsbedingungen Zusätzliche Informationen
Müller et al. 1982 / 1983
Extraktion mit Chloroform, Ether und teilweise Ethylacetat bei pH 3-11 (1-13)
Ermittlung der Verteilungsquotienten und deren pH-Abhängigkeit von über 300 Substanzen (überwiegend Arzneimittelwirkstoffe)
Cox et al. 1989
Bicarbonatpuffer, Extraktion mit Butylacetat
Blut; Wiederfindung: Amitriptylin 73%, Cocain 74% Codein 70%, Diazepam 82%
Drummer et al. 1990
Fällung mit Acetonitril Blut, HPLC/DAD
Franke et al. 1990
Ultraschallbad, Extrelutextraktion mit Dichlormethan bzw. Chloroform
Organe, TLC
Sims et al. 1991
Ammoniaklösung, Extraktion mit Diethylether
Blut; Wiederfindung: Amitriptylin 86%, Diazepam 92%, Thioridazin 70%
Puopolo et al. 1991
Bicarbonat, Extraktion mit Hexan Plasma, Wiederfindung: Amitriptylin 90%, Thioridazin 90%, Propoxyphen 86%
Koves et al. 1992
Ammoniak, Extraktion mit Toluol Reextraktion in mehreren Schritten bei wechselnden pH
Blut; Wiederfindung: Codein79%, Diazepam 84%, Haloperidol 80%, Propanolol 83%
Drummer et al. 1993
Extraktion mit Acetonitril Blut; Wiederfindung: Paracetamol 75%, Salicylsäure 100%, Carbamazepin 90%, Diazepam 50%
52
Drummer et al. 1994
Tris-Puffer pH 9,2, Extraktion mit n-Butylchlorid
Blut; Wiederfindung: Amphetamin 67%, Pentobarbital 18%, Promethazin 90 %
Tracqui et al. 1995
Ammoniumchlorid pH 9,5 Extraktion mit Chloroform/ Propan-2-ol / Heptan (60 :14.26)
Blut, Wiederfindung : Benzodiazepine, Barbiturate, Antidepressiva, Opiate und Neuroleptika über 60%
Kalasinsky et al. 1995
KCl und Phosphatpuffer pH 8, Extraktion mit Butanol / Ethylacetat (1:5)
Blut, Gewebe, Urin ; REMEDi HS (Bio-Rad)
Lambert et al. 1995
1 M K2CO3, Extraktion mit 1-Hexan / Ethylacetat (7:3)
Blut, Urin ; über 130 v.a. basische Drogen detektierbar, aber nicht Morphin
Lillsunde et al. 1996
Saure Verb. : Extraktion mit NaH2PO4-Puffer und Toluol / Ethylacetat (4:1) Bas. Verb.: Extraktion mit Dichlormethan / Toluol (1:9)
Blut; Wiederfindung: Codein 92%, Morphin 66%, Cocain 81%, Benzoylecgonin 84%
Lo et al. 1997
NH4Cl, Extraktion mit Ethylacetat
Blut, Detektion von sauren und neutralen Subsanzen z.B. Analgetika, Barbiturate, Theophyllin
Elliot et al. 1998
Bas. Verb.: Na2CO3, Extraktion mit Butylchlorid und Rückextraktion mit 0,1 M H2SO4 Saure Verb.: H2SO4, Extraktion mit Chloroform
Blut, Plasma, Urin Bibliothek mit über 250 Verbindungen, schnelles HPLC-Screening
Brau et al. 1998
Pufferzugabe, Extraktion mit Dichlorethan / Dichlormethan / Heptan / i-Propanol (96:52:132:20)
Serum, HPLC-DAD
Weinmann et al. 1998
Puffer, Extraktion mit Ethylacetat/ Butylchlorid/ t-Butylmethylether
Serum, HPLC-DAD GC-MS
Pfleger et al. 2000
gesättigte Na2SO4, Extraktion mit Ether/ Ethylacetat (1:1), eindampfen, aufnehmen in Methanol
Plasma, Mageninhalt GC-MS
Boone et al. 2001
Acetonitril (Serum), 2M HCl bzw. 2M NaOH, Extraktion mit Dichormethan
Serum, Urin Kapillarelektropherese
Pragst et al. 2003
ACN und Puffer (Tris-Puffer pH 9 oder Phosphatpuffer pH 2,3,), vortexen, eindampfen, aufnehmen in mobiler Phase
Blut, Serum, Plasma HPLC-DAD
Tabelle 11
53
3.6 Zusammenfassung
Es wurden die Verteilungsquotienten und deren pH-Abhängigkeit von über 90 Verbindungen
(vorwiegend Arzneimittelwirkstoffe) ausgewertet.
Für die Lösungsmittel Chloroform und Diethylether, und teilweise auch für Ethylacetat,
liegen jetzt die Extraktionsausbeuten (pH 1 bis 13) von über 300 organische Verbindungen
vor (siehe auch Müller et al. 1982 / 1983). Für jede dieser Verbindung kann nun im Rahmen
eines Extraktionsverfahren festgestellt werden, ob sie bei einem bestimmten pH – Wert
befriedigend isoliert werden kann oder nicht.
Mit der genauen Kenntnis der maximalen Extrahierbarkeit und dem entsprechenden pH-
Bereich ist es auch möglich, das Extraktionsverfahren aus wässriger Phase zu optimieren.
Z.B. können die Ergebnisse für spezielle toxikologische Untersuchungen eines Stoffes
hilfreich sein. Außerdem lassen sich Verbindungen, die sich gut mit Chloroform oder Ether
extrahieren lassen, voraussichtlich auch ausreichend mit anderen, ähnlich lipophilen
Lösungsmitteln (z.B. Dichlormethan) isolieren. Das Gleiche gilt auch für Ethylacetat, welches
als relativ polares Lösungsmittel eingesetzt wurde, um schwer extrahierbare Verbindungen zu
untersuchen. Aus den Ergebnissen können damit Rückschlüsse auf die Eignung anderer
Lösungsmittel abgeleitet werden.
54
3.7 Experimenteller Teil
Durchführung:
(entnommen aus Müller RK., 1982, Die Pharmazie 37)
Die Verteilungsgleichgewichte wurden in Form von Serienmessungen in speziellen
Reagenzgläsern mit Schliffstopfen ermittelt. Nach der Einwaage der Substanzen ( 20 mg) in
diese Reagenzgläser wurden gleiche Volumina (bei den verschiedenen Messserien zwischen 5
und 25 ml) der wässrigen Pufferlösung (Zusammensetzung s.?) und des organischen
Lösungsmittels einpipettiert.
≈
Die Reagenzgläser wurden dann auf einer Schüttelmaschine (Frequenz 4 s-1 in waagerechter
oder schräger Lage) 10 Minuten geschüttelt. Diese Schüttelzeit war in Vorversuchen für eine
ausreichende Gleichgewichtseinstellung ermittelt wurden.
Unter Beachtung einer sauberen Phasentrennung wurden aliquote Teile der organischen Phase
in Wägegläschen abpipettiert und das Lösungsmittel auf temperierbaren Wärmeplatten bei
Temperaturen unterhalb des Siedepunktes verdampft.
Bei flüchtigen Basen wurden vorher durch Hinzufügen von HCl (1 Tropfen konz. Salzsäure)
die Hydrochloride gebildet.
Die Rückstände wurden nach Trocknen über P4O10 gewogen. Aus den ermittelten Werten des
Abdampfrückstandes und der Extrakt-Aliquote ιV konnte die Extraktionsausbeute
100R berechnet werden.
ιOHAQ )( O
Die Werte für die Extraktionsausbeuten 100R und Verteilungskonstanten KD (Berechnung S.
36) wurden aus 2 bis 10 (meist 5) Messungen einzelner Verteilungsgleichgewichte
arithmetisch gemittelt.
Die Analysenfehler für 100R und KD sind von der Größenordnung des Verteilungsquotienten
abhängig:
im Bereich 0,1 < KD < 10 ist RR∆≤ 0,04
55
kleinere und größere Werte für KD konnten (zumindest gravimetrisch) weniger genau
bestimmt werden
Bei den eingesetzten niedrigen Konzentrationen der Verbindungen (etwa 0,02 bis 0,1 mol)
waren die Verteilungsquotienten konzentrationsunabhängig. Die Pufferkapazität betrug
zwischen 0,5 bis 0,8 Mol. Dadurch änderte sich der pH-Wert nach Substanzeinwaage und
Verteilung kaum.
Zusammensetzung der verwendeten Pufferlösung:
pH 1: HCl (0,2 mol/l)
pH 2: Glykokoll 19,513 g; NaCl 15,210 g; HCl (1 mol/l) 240 ml
pH 3: Glykokoll 30,770 g; NaCl 23,985 g; HCl (1 mol/l) 90 ml
pH 4: Citronensäure 32,274 g; Na2HPO4 x 2H2O 34,329 g
pH 5: Citronensäure 25,472 g; Na2HPO4 x 2H2O 45,861 g
pH 6: KH2PO4 59,914 g; Na2HPO4 x 2H2O 10,688 g
pH 7: KH2PO4 26,553 g; Na2HPO4 x 2H2O 54,333 g
pH 8: KH2PO4 3,745 g; Na2HPO4 x 2H2O 84,171 g
pH 9: Glykokoll 33,397 g; NaCl 26,032 g, NaOH (1 mol/l) 55 ml
pH 10: Glykokoll 23,453 g; NaCl 18,281 g, NaOH (1 mol/l) 187,5 ml
pH 11: Glykokoll 19,325 g; NaCl 15,064 g, NaOH (1 mol/l) 242,5 ml
pH 12: Glykokoll 17,262 g; NaCl 13,455g, NaOH (1 mol/l) 270 ml
pH 13: Glykokoll 2,814 g; NaCl 2,194 g; NaOH (1 mol/l) 462,5 ml
56
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419.
Müller RK. (1983): Parameter für die Flüssig / Flüssig-Extraktion toxikologisch relevanter
Verbindungen. 2. Mitteilung: Abhängigkeit der Extraktionsausbeute von Verteilungs-
61
konstante, Phasenverhältnis und Stufenzahl; (Ergebnisse für neutrale Verbindungen). Die
Pharmazie 38, H. 7, 462 - 466.
Müller RK. (1983): Parameter für die Flüssig / Flüssig-Extraktion toxikologisch relevanter
Verbindungen. 3. Mitteilung: Extraktionsausbeute und Fraktionierung (pH-abhängige
Verteilungsquotienten für basische Verbindungen). Die Pharmazie 38, H. 9, 596 - 600.
Müller RK, Holzapfel H. (1983): Parameter für die Flüssig / Flüssig-Extraktion
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65
66
5 Anhang
5.1 Abkürzungsverzeichnis AAS Atomabsorptionsspektrometrie
α Extinktion der wässrigen Phase nach der Extraktion
AO Ausbeute in der organischen Phase
BAT Biologischer Arbeitsstoff - Toleranzwert
CE Kapillarelektrophorese
CL Konzentration in der Lipidphase [mol/l]
Clf Chloroform
CW Konzentration in der Wasserphase [mol/l]
DAD (Photo-)Diodenarraydetektion/-detektor
DC pH-abhängige (scheinbare) Verteilungskonstante
Eto Diethylether
Eta Ethylacetat vwE Extinktion der wässrige Phase vor der Extraktion
nwE Extinktion der wässrige Phase nach der Extraktion
noE Extinktion der organischen Phase nach Extraktion
GC Gaschromatographie
GC-MS Gaschromatographie mit massensensitivem Detektor
GTFCh Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie
HCl Salzsäure
HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie
HPLC-DAD Hochleistungsflüssigchromatographie mit Photodiodenarraydetektion
HS-GC Headspace-Gaschromatographie
H2SO4 Schwefelsäure
KCl Kaliumchlorid
K2CO3 Kaliumcarbonat
KD Verteilungskonstante (pH-unabhängig)
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
LC Flüssigchromatographie (liquid chromatography)
LC-MS Flüssigchromatographie mit massensensitiver Detektion
67
LLE Flüssig-Flüssig-Extraktion (Liquid Liquid Extraction)
LM Lösungsmittel
MAK Maximale Arbeitsplatz - Konzentration
MeOH Methanol
MPPH 5-(p-Methylphenyl)-5-phenylhydantoin
MS Massensensitive(r) Detektion/Detektor
NaCl Natriumchlorid
Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat
NaH2PO4 Natriumdihydrogenphosphat
NaOH Natronlauge
Na2SO4 Natriumsulfat
NH4Cl Ammoniumchlorid
pH Negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
pKa Negativer dekadischer Logarithmus der Säuredissoziationskonstanten
R Extraktionsausbeute in der organischen Phase
100R Extraktionsausbeute (in Prozent)
RP Umkehrphase (Reversed Phase)
s Standardabweichung
SPE Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction)
SPME Festphasenmikroextrakiton
SPSS Statistical Package for the Social Sciences (Statistiksoftware)
STA Systematische Toxikologische Analyse
TLC Dünnschichtchromatographie (Thin Layer Chromatography)
UV Ultraviolett(er Teil des elektromagnetischen Spektrums), UV-Spektroskopie
VIS Sichtbares Licht (Visible Light)
VK Verteilungskoeffizient
WF Wiederfindung(srate)
68
5.2 Saure Verbindungen
Zeichenerklärung: Clf: Chloroform, Eta: Ethylacetat, Eto: Ether
100R: Extraktionsausbeute in der organischen Phase (entspricht Prozent)
Acetylsalicylsäure
Clf: 100R – Max bei pH 3 (97,5 %)
Acetyl-Sulfafurazol
Clf: 100R – Max bei pH 5 (41,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 4 (31,1 %)
Acetyl-Sulfamerazin, N4-
Clf: 100R – Max bei pH 2 (44,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (21,4 %)
Allobarbital
Clf: 100R – Max bei pH 5 (77,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (98,6 %)
69
Allylethylbarbitursäure
Clf: 100R – Max bei pH 7 (70,0 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (97,0 %)
Amobarbital
Clf: 100R – Max bei pH 7 (104,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (102,3 %)
Aprobarbital
Clf: 100R – Max bei pH 1 (93,2 %)
Azidamphenicol
Eto: 100R – Max bei pH 3 (46,4 %)
70
Barbital
Clf: 100R – Max bei pH 7 (53,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 1 (81,0 %) Eta: 100R – Max bei pH 3 (88,5 %)
Benzylhydrogenphthalat
Clf: 100R – Max bei pH 3 (100 %)
Bromisoval
Clf: 100R – Max bei pH 7 (95,8 %)
Bromsalicylsäureisopropylamid
Clf: 100R – Max bei pH 7 (104 %)
71
Clonazepam
Clf: 100R – Max bei pH 5 (107,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (102,2 %)
Demoxepam
Clf: 100R – Max bei pH 9 (102,8 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (83,4 %)
Diacetyl-Sulfanilamid, N1, N4-
Clf: 100R – Max bei pH 5 (7 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (15,8 %)
Eta: 100R – Max bei pH 5 (86,1 %)
Diclofenac
Clf: 100R – Max bei pH 3 (107 %) Eto: 100R – Max bei pH 6 (100,5 %)
72
2,4-Dioxo-5,5-dimethyloxazolidin
Clf: 100R – Max bei pH 5 (28,4 %)Eto: 100R – Max bei pH 4 (81,5 %)
Ethosuximid
Clf: 100R – Max bei pH 3 (69,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 2 (63,2 %)
Euparen
Clf: 100R – Max bei pH 3 (73,7 %)
Furosemid
Clf: 100R – Max bei pH 3 (11,8 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (86,7 %) Eta: 100R – Max bei pH 3 (116,2%)
73
Glibenclamid
Clf: 100R – Max bei pH 1 (113,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (26,2 %)
4-Hydroxyphenazon
Clf: 100R – Max bei pH 3 (96,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (72,3 %)
Kebuzon
Clf: 100R – Max bei pH 5 (99,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 1 (45 %)
MCPA
Clf: 100R – Max bei pH 3 (85 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (83 %)
74
MCPB
Clf: 100R – Max bei pH 1 (81,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (114,6 %)
Naptalam
Niclosamid
Clf: 100R – Max bei pH 1 (63,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (99,5 %)
Osalmid
Eto: 100R – Max bei pH 1 (106 %)
Clf: 100R – Max bei pH 1 (57,2 %)
Clf: 100R – Max bei pH 7 (78,1 %)
75
Oxyphenbutazon
Eto: 100R – Max bei pH 3 (112,9 %)
Phenprocoumon
Clf: 100R – Max bei pH 7 (108,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 1 (101,7 %)
α-Phenyl-α-ethyl-glutaconimid
Clf: 100R – Max bei pH 7 (104 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (116,3 %)
α-Phenylglutarimid
Clf: 100R – Max bei pH 1 (103,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (79,9 %)
Clf: 100R – Max bei pH 3 (103,8 %)
76
Phenylindandion
Clf: 100R – Max bei pH 5 (100,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (92,1 %)
1-Phenyl-3-methylpyrazolon
Clf: 100R – Max bei pH 3 (105,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (6,8 %)
Phenytoin
Clf: 100R – Max bei pH 1 (97,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 2 (99,4 %)
Rubazonsäure
Clf: 100R – Max bei pH 1 (111,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (114 %)
77
Sulfadimethoxin
Clf: 100R – Max bei pH 5 (104,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 6 (95,9 %)
Sulfamethoxazol
Clf: 100R – Max bei pH 5 (81,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 6 (97,4 %)
Iso-Valerianylharnstoff
Eto: 100R – Max bei pH 3.(61,5 %)
Clf: 100R – Max bei pH 9 (70,9 %)
78
5.3 Neutrale Verbindungen
Bisacodyl
Clf: 100R – Max bei pH 7 (102,9 %)
Busulfan
Clf: 100R – Max bei pH 5/13 (101,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (16,5 %)
Carbamazepin
Diuron
Clf: 100R – Max bei pH 7 (105,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (111,9 %)
Clf: 100R – Max bei pH 13 (108,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 7 (88,6 %)
79
Fenuron
Guajacolglycerolether
Clf: 100R – Max bei pH 5 (70,9 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (32,6 %)
α-Naphtyl-2,3-dihydroxypropylether
Clf: 100R – Max bei pH 13 (102,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 11 (101,4 %)
Nifedipin
Clf: 100R – Max bei pH 1 (103,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (100,7 %)
Clf: 100R – Max bei pH 13 (101,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (65,2 %)
80
Pentoxyphyllin
Clf: 100R – Max bei pH 3 (104,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 8 (30,2 %)
Propyphenazon
Clf: 100R – Max bei pH 5 (109 %) Eto: 100R – Max bei pH 83 (105,7 %)
Triamteren
Clf: 100R – Max bei pH 7 (9,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (6,3 %)
Trioxopiperidin-Natrium
Clf: 100R – Max bei pH 7 (10,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (0,9 %)
81
5.4 Amphotere Verbindungen
Acetyl-Sulfisomidin, N4-
Clf: 100R – Max bei pH 7 (21,8 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (24,6 %)
Buformin
Clf: 100R – Max bei pH 13 (6,2 %) Eto: 100R – Max bei pH 3 (31,7 %)
Homatropin
Clf: 100R – Max bei pH 9 (97,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 11 (55,1 %)
Pyritinol
Clf: 100R – Max bei pH 9 (17 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (4,6 %)
Eta: 100R – Max bei pH 4 (25,8%)
82
Sulfamerazin
Clf: 100R – Max bei pH 3 (71,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (3,7 %)
83
5.5 Basische Verbindungen
Eto: 100R – Max bei pH 11 (1,0 %)
Biperiden
Clf: 100R – Max bei pH 3 (113,9 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (104,2 %)
Bromhexin
Clf: 100R – Max bei pH 1 (112,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 4 (103,3 %)
Clenbuterol
Clf: 100R – Max bei pH 9 (100,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (96,8 %)
Allopurinol
84
Clomethiazol
Clf: 100R – Max bei pH 5 (5,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (2,1 %) Eta: 100R – Max bei pH 11 (13,1 %)
Clomipramin
Clf: 100R – Max bei pH 1 (128 %) Eto: 100R – Max bei pH 8 (108,1 %)
Cytisin
Clf: 100R – Max bei pH 13 (75,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (3,8 %) Eta: 100R – Max bei pH 13 (6,1 %)
Denaverin
Clf: 100R – Max bei pH 3 (111,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 5 (97,5 %)
85
Clf: 100R – Max bei pH 9 (115,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (120,6 %)
Detajmium
Clf: 100R – Max bei pH 11 (69,3 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (63,3 %)
Dipyridamol
Clf: 100R – Max bei pH 13 (100,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 11 (72,2 %)
Ergometrin
Clf: 100R – Max bei pH 11 (110,8 %) Eto: 100R – Max bei pH 12 (40 %) Eta: 100R – Max bei pH 9 (104,3%)
Desipramin
86
Ergotamin
Clf: 100R – Max bei pH 11 (101,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (20,1 %) Eta: 100R – Max bei pH 11 (9,4%)
Etilefrin
Clf: 100R – Max bei pH 11 (5,9 %)
Clf: 100R – Max bei pH 3 (104 %) Eto: 100R – Max bei pH 11 (98,6 %)
Histpyrrodin
Clf: 100R – Max bei pH 3 (111,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (102,1 %)
Eto: 100R – Max bei pH 6 (5,8 %)
Fominoben
87
Clf: 100R – Max bei pH 3 (108,9 %) Clf: 100R – Max bei pH 12 (95,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (62,8 %)
Meclozin
Clf: 100R – Max bei pH 3 (99,5 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (94,9 %)
Medazepam
Clf: 100R – Max bei pH 1 (116,4 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (106 %)
Hydrastin
Eto: 100R – Max bei pH 7 (103,2 %)
Hydrastinin
88
Metoclopramid
Clf: 100R – Max bei pH 9 (96 %) Eto: 100R – Max bei pH 11 (97 %)
Noxiptilin
Clf: 100R – Max bei pH 1 (119,3 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (96 %)
Periciacin
Clf: 100R – Max bei pH 9 (109,3 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (109 %)
Promethazinsulfoxid
Clf: 100R – Max bei pH 11 (88,1 %) Eto: 100R – Max bei pH 13 (57,6 %)
89
Prometryn
Clf: 100R – Max bei pH 1 (118,3 %)
Propiverin
Clf: 100R – Max bei pH 1 (109 %) Eto: 100R – Max bei pH 8 (97,3 %)
Talindol
Clf: 100R – Max bei pH 9 (104,8 %) Clf: 100R – Max bei pH 1 (123,3 %) Eto: 100R – Max bei pH 6/7 (96,5 %)
Eto: 100R – Max bei pH 3 (110,4 %)
Eto: 100R – Max bei pH 11 (95,8 %)
Thioridazin
90
Clf: 100R – Max bei pH 9 (101,6 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 (11,9 %)
Trimipramin
Clf: 100R – Max bei pH 1 (116,3 %) Eto: 100R – Max bei pH 6 (96,2 %)
Verapamil
Clf: 100R – Max bei pH 1(105,7 %) Eto: 100R – Max bei pH 9 /13 (96 %)
Trimethoprim
91