Uniwersytet w Białymstoku Wydział Biologiczno-Chemiczny...4.5 Organogeneza pędowa i korzeniowa...

Uniwersytet w Białymstoku

Wydział Biologiczno-Chemiczny

Aneta Adamczuk

Modyfikacje morfogenezy lnu zwyczajnego

(Linum usitatissimum L.) typu oleistego i włóknistego

w kulturach in vitro

Rozprawa doktorska

Promotor: dr hab. Iwona Ciereszko, prof. UwB

Promotor pomocniczy: dr Irena Siegień

Białystok, 2017

2

Serdecznie dziękuję:

Pani Promotor,

dr hab. Iwonie Ciereszko, prof. UwB

oraz dr Irenie Siegień,

za niewyczerpane pokłady cierpliwości,

bezcenne rady w trakcie wykonywania

i redagowania tej pracy.

Pani dr Urszuli Kotowskiej i mgr Justynie

Kapelewksiej z Zakładu Chemii

Środowiska, dr Ewie Olchowik-Grabarek

z Zakładu Biofizyki oraz dr Joannie

Leśniewskiej za nieocenioną pomoc

w trakcie prowadzenia badań

oraz cenne wskazówki.

Koleżankom z Zakładu Fizjologii Roślin:

Bożenie, Ewie, Edycie, Irenie i Oli

za pomoc i wsparcie.

Rodzicom, Mężowi i Dzieciom

za ogromne wsparcie i wyrozumiałość.

3

Autorka rozprawy doktorskiej, Aneta Adamczuk, była stypendystką w ramach projektu

pt.: „Stypendia dla doktorantów województwa podlaskiego”, realizowanego na podstawie

Umowy o dofinansowanie projektu Instytucji Pośredniczącej w ramach Programu Operacyjnego

Kapitał ludzki 2007-2013,nr POKL.08.02.02-20-002/12. Działanie 8.2.Transfer wiedzy,

Poddziałanie 8.2.2. Regionalne Strategie Innowacji.

4

Spis treści

Wykaz stosowanych skrótów .......................................................................................... 10

1. Wstęp ................................................................................................................ 13

1.1 Morfogeneza w warunkach in vitro .................................................................. 13

1.2 Czynniki wpływające na morfogenezę ............................................................. 17

1.2.1 Rola światła w regulacji morfogenezy roślin ................................................... 17

1.2.2 Rola węglowodanów w kulturach in vitro ........................................................ 21

1.2.3 Rola hormonów i regulatorów wzrostu w procesie morfogenezy w

warunkach in vitro ............................................................................................ 24

1.3 Działanie abiotycznych czynników środowiskowych na proces morfogenezy 31

1.4 Reaktywne formy tlenu (ROS) w procesie organogenezy w warunkach in

vitro ................................................................................................................... 33

1.4.1 Rola ROS w morfogenezie w warunkach in vitro ............................................ 36

1.4.2 Sygnalna rola ROS w morfogenezie w warunkach in vitro ............................. 37

1.5 Regulacja procesów wzrostowych i morfogenetycznych przez tlenek azotu

(NO) .................................................................................................................. 38

2 Założenia i cel pracy ......................................................................................... 43

3 Materiał i metody .............................................................................................. 46

3.1 Materiał doświadczalny .................................................................................... 46

3.1.1 Charakterystyka gatunku badawczego ............................................................. 46

3.2 Sterylizacja i kiełkowanie nasion lnu ............................................................... 48

3.2.1 Sterylizacja nasion ............................................................................................ 48

3.2.2 Warunki kiełkowania nasion ............................................................................ 48

3.3 Skład podłoży hodowlanych oraz warunki wzrostu kultur in vitro .................. 49

3.3.1 Skład i przygotowanie podłoży do wzrostu kultur in vitro .............................. 49

3.3.2 Badanie oddziaływania wybranych cytokinin i auksyn na proces

organogenezy .................................................................................................... 51

3.3.3 Badanie wzajemnych stężeń cytokininy i auksyny na efektywność procesu

organogenezy .................................................................................................... 51

3.3.4 Warunki wzrostu eksplantatów ........................................................................ 52

3.4 Badanie wpływu stresu osmotycznego na proces organogenezy ..................... 52

3.5 Badanie wpływu nitroprusydku sodu (SNP) na proces organogenezy ............. 54

3.5.1 Badanie wpływu SNP dodanego bezpośrednio do pożywki na organogenezę 54

3.5.2 Badanie wpływu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP na

organogenezę .................................................................................................... 54

3.6 Badanie wpływu c-PTIO (ang. 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-

tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide) na proces organogenezy w

5

kulturach in vitro poddanych działaniu par wydzielających się z wodnego

roztworu SNP ................................................................................................... 56

3.7 Analiza wzrostu materiału doświadczalnego ................................................... 57

3.8 Analiza mikroskopowa początkowych etapów organogenezy pędowej i

korzeniowej w hipokotylach lnu zwyczajnego ................................................. 58

3.9 Oznaczanie zawartości barwników fotosyntetycznych .................................... 59

3.10 Oznaczanie natężenia fotosyntezy netto i oddychania ciemniowego ............... 60

3.11 Izolacja i identyfikacja związków chemicznych przy użyciu chromatografii

gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) .......................................................... 60

3.11.1 Izolacja lotnych związków organicznych (LZO) w kulturach pędowych lnu

zwyczajnego z wykorzystaniem mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej

(SPME) ............................................................................................................. 60

3.11.2 Izolacja związków organicznych w ekstraktach metanolowych kultur

pędowych lnu zwyczajnego .............................................................................. 61

3.11.3 Identyfikacja otrzymanych związków .............................................................. 62

3.12 Oznaczanie zawartości białka w ekstrakcie enzymatycznym .......................... 62

3.13 Oznaczanie zawartości metabolitów wtórnych ................................................ 63

3.13.1 Oznaczanie zawartości antocyjanów i związków fenolowych ......................... 63

3.13.2 Oznaczanie zawartości związków polifenolowych i tanin ............................... 63

3.14 Oznaczenia parametrów stresu oksydacyjnego ................................................ 64

3.14.1 Oznaczanie zawartości H2O2 ............................................................................ 64

3.14.2 Oznaczanie zawartości produktów peroksydacji lipidów reagujących z

kwasem tiobarbiturowym (TBARS) ................................................................. 65

3.15 Oznaczanie zdolności przeciwwolnorodnikowej oraz aktywności enzymów

antyoksydacyjnych ........................................................................................... 66

3.15.1 Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego do oznaczania zdolności

przeciwwolnorodnikowej na zasadzie redukcji stabilnego wolnego rodnika

1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowego (DPPH.) ............................................... 66

3.15.1.1 Oznaczanie zdolności przeciwwolnorodnikowej na zasadzie redukcji

stabilnego wolnego rodnika 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowego (DPPH.) . 66

3.15.2 Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego do oznaczania aktywności

dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i katalazy (CAT) ....................................... 67

3.15.2.1 Oznaczanie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) ............................ 67

3.15.2.2 Oznaczanie aktywności katalazy (CAT) .......................................................... 67

3.16 Analiza statystyczna wyników ......................................................................... 68

4 Wyniki .............................................................................................................. 69

4.1 Wzrost kultur oraz organogeneza pędowa w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) w zależności od rodzaju pożywki ...... 69

6

4.2 Wzrost kultur oraz organogeneza korzeniowa w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego w zależności od rodzaju pożywki ............................................... 72

4.3 Wpływ wybranych auksyn i cytokinin na proces organogenezy ..................... 75

4.3.1 Oddziaływanie wybranych cytokinin na organogenezę pędową lnu

zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) ............................................................ 75

4.3.2 Oddziaływanie wybranych auksyn na organogenezę korzeniową lnu

zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) ............................................................ 81

4.4 Wpływ wzajemnych stężeń cytokininy i auksyny na efektywność procesu

organogenezy .................................................................................................... 87

4.4.1 Oddziaływanie wzajemnych stężeń cytokininy i auksyny na efektywność

organogenezy pędowej ..................................................................................... 87


organogenezy korzeniowej ............................................................................... 90

4.5 Organogeneza pędowa i korzeniowa lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum

L.) w pierwszym tygodniu wzrostu kultur in vitro (analiza anatomiczna) ....... 94

4.5.1 Przebieg procesu organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Szafir .................................................................................. 94


zwyczajnego odm. Selena ................................................................................. 96

4.5.3 Przebieg procesu organogenezy korzeniowej w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Szafir .................................................................................. 97


zwyczajnego odm. Selena ................................................................................. 99

4.6 Zawartość barwników fotosyntetycznych w kulturach pędowych in vitro lnu

zwyczajnego ................................................................................................... 101

4.7 Intensywność fotosyntezy netto (PN) i oddychania ciemniowego (DR) kultur

pędowych in vitro lnu zwyczajnego ............................................................... 103

4.8 Analiza związków chemicznych przy użyciu chromatografii gazowej ze

spektrometrią mas (GC-MS) .......................................................................... 104

4.8.1 Analiza LZO w kulturach pędowych lnu zwyczajnego z wykorzystaniem

mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (SPME) ................................................ 104

4.8.2 Analiza związków organicznych w ekstraktach metanolowych kultur

pędowych lnu zwyczajnego ............................................................................ 109

4.9 Zawartość metabolitów wtórnych w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

(Linum usitatissimum L.) odm. Szafir i odm. Selena ..................................... 113

4.9.1 Zawartość związków fenolowych i antocyjanów w kulturach pędowych in

vitro lnu zwyczajnego ..................................................................................... 113

4.9.2 Zawartość związków fenolowych i antocyjanów w kulturach korzeniowych

in vitro lnu zwyczajnego ................................................................................. 114

7

4.9.3 Zawartość białka w ekstraktach wykorzystywanych do określenia

zawartości związków fenolowych i antocyjanów w kulturach pędowych i

korzeniowych in vitro lnu zwyczajnego ......................................................... 116

4.9.4 Zawartość związków polifenolowych i tanin w kulturach pędowych in vitro

lnu zwyczajnego ............................................................................................. 117

4.9.5 Zawartość związków polifenolowych i tanin w kulturach korzeniowych in


4.10 Aktywność enzymów antyoksydacyjnych w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) odm. Szafir i odm. Selena................ 119

4.10.1 Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w kulturach pędowych in


4.10.2 Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w kulturach



aktywności enzymów antyoksydacyjnych w kulturach pędowych i


4.11 Wpływ stresu osmotycznego na proces organogenezy w kulturach in vitro

lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) odm. Szafir i odm. Selena ......... 125

4.11.1 Wpływ stresu osmotycznego na organogenezę pędową w kulturach in vitro

lnu zwyczajnego odm. Szafir, rosnących na podłożu z dodatkiem różnych

rodzajów cukru ............................................................................................... 125

4.11.2 Zawartość produktów peroksydacji lipidów reagujących z kwasem

tiobarbiturowym (TBARS) w kulturach pędowych lnu odm. Szafir,

rosnących na podłożu z dodatkiem różnych rodzajów cukru ......................... 126

4.11.3 Wpływ stresu osmotycznego (podwyższona zawartość sacharozy) na

organogenezę pędową w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

oraz odm. Selena ............................................................................................. 127


organogenezę korzeniową w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

oraz odm. Selena ............................................................................................. 129


tiobarbiturowym (TBARS) w kulturach pędowych lnu zwyczajnego odm.

Szafir i odm. Selena, poddanych działaniu stresu osmotycznego .................. 132


tiobarbiturowym (TBARS) w kulturach korzeniowych lnu zwyczajnego

odm. Szafir i odm. Selena, poddanych działaniu stresu osmotycznego ......... 132

4.11.7 Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach pędowych lnu

zwyczajnego odm. Szafir i odm. Selena, poddanych działaniu stresu

osmotycznego ................................................................................................. 133

4.11.8 Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach korzeniowych lnu


osmotycznego ................................................................................................. 134

8

4.12 Wpływ SNP, bezpośrednio dodanego do pożywki, na przebieg

organogenezy w kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum

L.) odm. Szafir ................................................................................................ 135

4.12.1 Wpływ SNP, bezpośrednio dodanego do pożywki ,na przebieg

organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir ... 135

4.12.2 Wpływ SNP, bezpośrednio dodanego do pożywki, na przebieg

organogenezy korzeniowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm.

Szafir ............................................................................................................... 137

4.13 Wpływ par wydzielających się z wodnego roztworu SNP na przebieg

organogenezy w kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum

L.) odm. Szafir i odm. Selena ......................................................................... 139

4.13.1 Wpływ par wydzielających się z wodnego roztworu SNP na przebieg

organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir ... 139


organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego ....................... 143


organogenezy korzeniowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego, rosnących

na pożywkach bez dodatku hormonów .......................................................... 146


procesu organogenezy w kulturach in vitro lnu zwyczajnego, rosnących na

pożywkach bez dodatku hormonów ............................................................... 150

4.14 Wpływ c-PTIO (ang. 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-

1-oxyl-3-oxide) na proces organogenezy w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego (Linum usitatissimum L.), poddanych działaniu par

wydzielających się z wodnego roztworu SNP ................................................ 157

4.14.1 Intensywność procesu organogenezy korzeniowej w kulturach

korzeniowych in vitro lnu zwyczajnego, poddanych działaniu par

wydzielających się z wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO .............. 157

4.14.2 Intensywność procesu organogenezy w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

odm. Selena, rosnących na pożywce bez dodatku hormonów, poddanych

działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP w obecności c-

PTIO ............................................................................................................... 160

4.15 Natężenie stresu oksydacyjnego w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

(Linum usitatissimum L.) odm. Selena, poddanych działaniu par


4.15.1 Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

odm. Selena, poddanych działaniu par wydzielających się z wodnego

roztworu SNP ................................................................................................. 164

4.15.2 Zawartość produktów peroksydacji lipidów, reagujących z kwasem

tiobarbiturowym (TBARS) w kulturach in vitro lnu odm. Selena, poddanych

działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP .......................... 166

4.16 Zdolność przeciwwolnorodnikowa oraz aktywność enzymów

antyoksydacyjnych w kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum

9

usitatissimum L.) odm. Selena, poddanych działaniu par wydzielających się

z wodnego roztworu SNP ............................................................................... 168

4.16.1 Zdolność przeciwwolnorodnikowa określona na zasadzie redukcji

stabilnego wolnego rodnika 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowego (DPPH.)

w kulturach in vitro lnu odm. Selena, poddanych działaniu par


4.16.2 Oznaczanie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w kulturach in

vitro lnu odm. Selena, poddanych działaniu par wydzielających się z

wodnego roztworu SNP .................................................................................. 171

4.16.3 Oznaczanie aktywności katalazy (CAT) w kulturach in vitro lnu odm.

Selena, poddanych działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu

SNP ................................................................................................................. 175

4.16.4 Zawartość białka w ekstraktach wykorzystanych do określenia aktywności

enzymów antyoksydacyjnych w kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum


z wodnego roztworu SNP ............................................................................... 176

5 Dyskusja ......................................................................................................... 178

5.1 Optymalne warunki wzrostu oraz przebieg wybranych procesów w

kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) odm. Szafir

(typ oleisty) i odm. Selena (typ włóknisty) ................................................... 178

5.2 Oddziaływanie stresu osmotycznego oraz SNP na modyfikację

organogenezy lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) typu oleistego

(odm. Szafir) i typu włóknistego (odm. Selena) ............................................. 186

6 Podsumowanie i wnioski ................................................................................ 194

Streszczenie .................................................................................................................. 196

Summary ....................................................................................................................... 198

Bibliografia ................................................................................................................... 200

Spis rycin ...................................................................................................................... 227

Spis tabel ....................................................................................................................... 238

Spis fotografii ............................................................................................................... 242

Aneks ........................................................................................................................ 244

10

Wykaz stosowanych skrótów

2,4-D - kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy

2iP - (dimetyloalliloamino)-puryna

ABA - kwas abscysynowy

APX - peroksydaza askorbinianiu

ATP – adenozyno-5’-trifosforan

BA – benzyloaminopuryna

BBM - geny związane z powstawaniem zarodów z komórek somatycznych, ang. baby

boom

BR - brasinosteroidy

B5 - pożywka wg Gamborga

cADPR – cykliczna adenozynodifosforyboza

CAT - katalaza

cGMP – cykliczny guanozyno-3’,5’-monofosforan

CN- - anion cyjankowy

CDPK – kinazy białkowe regulowane przez jony wapnia

c-PTIO – ang. 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide

CPVPP – taniny nie związane z PVPP

Cry1 i Cry 2 – kryptochrom 1 i kryptochrom 2

CT - zawartość tanin

Cu/Zn SOD – rodzina izoform miedziowo-cynkowych SOD

DHAR - reduktaza dehydrosakorbinianu

DNA – kwas deosyrybonukleinowy

DPPH. – stabilny wolny rodnik 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowy

DR – oddychanie ciemniowe

EPR – elektronowy rezonans paramagnetyczny

FAA - formalino–aceto-alkohol

Fe SOD – rodzina izoform żelazowych SOD

GA3 – kwas giberelowy

GC-MS – chromatografia gazowa ze spektrometrem masowym

11

GR - reduktaza glutationowa

GSH - glutation

GSNO - S-nitrozoglutation

HCN - cyjanowodór

H2O2 – nadtlenek wodoru

IAA - kwas indolilo-3-octowy

IBA - kwas indolilo-3-masłowy

JA - kwas jasmonowy

K- kontrola, kultury rosnące w optymalnych warunkach

KCN – cyjanek potasu

KIN – kinetyna

LEC – geny związane z powstawaniem zarodów z komórek somatycznych, ang. leafy

cotyledon

LOV – domeny wchodzące w skład fototropin, ang. light, oxygen, voltage

LZO – lotne związki organiczne

MAPK – kinaza białkowa aktywowana mitogenem

MDA – aldehyd malonowy

MDHAR - reduktaza monodehydroaskorbinaniu

Me-JA - jasmonian metylu

Mn SOD – rodzina izoform manganowych SOD

MS - pożywka wg Murashige i Skoog

MS+B5 - pożywka wg Murashige i Skoog (makroelementy) + pożywka wg Gamborga

(mikroelementy i składniki organiczne)

NAA - kwas naftylo-1-octowy

NADPH – fosforan dinukleotydu nikotynoamido- adeninowego

Ni-NOR - reduktaza azotyn-tlenek azotu

NiR - reduktaza azotynowa

NO – tlenek azotu

NOS-like - enzym o aktywności zbliżonej do syntazy tlenku azotu

NR - reduktaza azotanowa

nsHb - niesymbiotyczne hemoglobiny

12

PAR – promieniowanie fotosyntetycznie czynne

Pfr – forma fitochromu absorbująca światło dalekiej czerwieni (z maksimum λ=730 nm)

PHYA – PHYE - geny kodujące fitochrom u Arabidopsis thaliana

PN – fotosynteza netto

Pr - forma fitochromu absorbująca światło czerwone (z maksimum λ=600 nm)

PSI – fotosystem I

PSII – fotosystem II

PVP - poliwinylopirolidon

PVPP - poliwinylopolipirolidon

RNS – reaktywne formy azotu

ROS - reaktywne formy tlenu

S I – pierwszy wariant stresu osmotycznego (dwukrotne zwiększenie zawartości cukru

w pożywce)

S II – drugi wariant stresu osmotycznego (trzykrotne zwiększenie zawartości cukru w

pożywce)

SD - odchylenie standardowe

SERK - gen związany z powstawaniem zarodów z komórek somatycznych, ang.

somatic embryogenesis receptor kinase

s.m. - sucha masa

SNAP - S-nitrozoacetylo-penicyloamina

SNP – nitroprusydek sodu

SOD – dysmutaza ponadtlenkowa

SPME – mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej

św.m. - świeża masa

TBARS – produkty peroksydacji lipidów reagujące z kwasem tiobarbiturowym

TDZ - tidiazuron

XOR - oksydoreduktaza ksantynowa

13

1. Wstęp

Rozwój roślin jest procesem, na który składają się wzrost, różnicowanie się w

tkanki, organy lub całe organizmy. Zależności pomiędzy rozwojem a wzrostem,

różnicowaniem, ekspresją genów w określonej kolejności i czasie oraz morfogenezą,

prowadzą do wytworzenia całych organizmów roślinnych o skomplikowanej budowie.

Termin morfogeneza (gr. morphe – kształt, genesis – pochodzenie) oznacza szereg

przemian rozwojowych, w wyniku których następuje formowanie komórek, tkanek i

organów w pełni rozwinięty, dojrzały organizm roślinny. Regulacja procesu

morfogenezy odbywa się endogennie i dotyczy mechanizmów warunkujących

aktywację genów oraz sposób ich działania, co skutkuje syntezą specyficznych białek,

determinujących czynności życiowe rośliny (Taiz i Zeiger 2006). Wyizolowana

komórka, pochodząca z pełni ukształtowanej rośliny, może dać początek nowemu

organizmowi, ponieważ każda z nich zawiera kompletną informację, niezbędną do jej

rozwoju. Informacja zawarta w DNA ulega ekspresji w określonej kolejności. Białka

enzymatyczne dają sygnały do wytwarzania innych białek. Regulacja na poziomie

komórkowym obejmuje również procesy indukcji i represji syntezy enzymów

metabolicznych przez specyficzne metabolity komórkowe. Morfogeneza regulowana

jest także poprzez regulację wzajemnego oddziaływania i współzależności komórek,

odbywającej się przy udziale fitohormonów, oraz egzogennie poprzez działanie

czynników środowiska takich jak: światło, temperatura, wilgotność, zapotrzebowanie na

substancje odżywcze, determinujących charakter reakcji morfogenetycznych (Burza

1995, Taiz i Zeiger 2006, Tretyn 2012).

1.1 Morfogeneza w warunkach in vitro

Materiałem wyjściowym do założenia kultury in vitro może być każda część

rośliny, nazywana eksplantatem (organy, tkanki, ich fragmenty, pojedyncze komórki

czy protoplasty), zawierająca żywe komórki z nieuszkodzonym materiałem

genetycznym. Istnieje podział na eksplantaty pierwotne, od których kultura została

zainicjowana, oraz pozostałe, zwane wtórnymi (Bach i Pawłowska 2009).

Regeneracja roślin z komórek somatycznych jest możliwa dzięki ich

totipotencji. Komórki takie charakteryzują się zdolnością wznowienia podziałów

mitotycznych, co prowadzi do różnicowania się w inne typy komórek, a w

konsekwencji do odtworzenia organów czy całego organizmu (Bach i Pawłowska

14

2009). Pobudzenie komórek somatycznych do podziałów następuje przez uszkodzenie

rośliny w warunkach naturalnych, odizolowanie jej fragmentu i przeniesienie do

sterylnych kultur. Inicjacja i przebieg procesów rozwojowych w kulturach in vitro

zależą od rodzaju i wzajemnych proporcji regulatorów wzrostu obecnych w pożywce.

Istnieje pewna ogólna prawidłowość w oddziaływaniu auksyn i cytokinin na

organogenezę (Skoog i Miller 1957, Czerpak i Piotrowska 2003). Zgodnie z przyjętą

regułą, wysoki poziom auksyn stymuluje powstawanie korzeni, podczas gdy wysokie

stężenie cytokinin warunkuje powstawanie pędów. Równe poziomy obu hormonów

wpływają na formowanie samego kalusa, czyli niezróżnicowanej lub słabo

zróżnicowanej tkanki złożonej z komórek parenchymatycznych, której różnicowanie

może nastąpić w wyniku obecności regulatorów wzrostu w pożywce (Ryc. 2) (Su i wsp.

2011).

Rozwój eksplantatów w warunkach in vitro może być ukierunkowany na

bezpośrednie wytworzenie pędów, korzeni, jak też zarodków, z których może powstać

nowa roślina, lub na organogenezę pośrednią poprzedzoną wytworzeniem kalusa, z

którego następnie mogą powstawać organy (Burza 1995, Taiz i Zeiger 2006).

Zasadnicze procesy morfogenetyczne, dotyczące rozwoju roślin w warunkach in vitro,

można podzielić na: organogenezę pędową – kaulogenezę, korzeniową – ryzogenezę i

embriogenezę somatyczną (Ryc. 1).

Ryc. 1. Drogi organogenezy i embriogenezy somatycznej w roślinnych kulturach

in vitro. Zmodyfikowane wg (Adamczuk i wsp. 2012b).

15

Ważnym sposobem regeneracji stała się embriogeneza somatyczna, polegająca

na formowaniu zarodków z komórek somatycznych. Takie podejście skutecznie

zmniejsza ryzyko zaburzeń genetycznych (Attree i Fowke 1993). Embriogeneza

somatyczna może przebiegać w sposób bezpośredni, kiedy zarodki somatyczne

kształtują się na młodych tkankach, podobnie jak niedojrzałe zarodki zygotyczne.

Natomiast embriogeneza na starszych eksplantatach, np. fragmencie liścia, zachodzi

pośrednio, przez stadium kalusa. Sposób regeneracji roślin ze względu na wysoki

współczynnik rozmnażania, znajduje szerokie zastosowanie w nasiennictwie oraz

szkółkarstwie (Park i wsp. 1998).

Właściwy wzrost i rozwój organizmów roślinnych, również w warunkach

in vitro, uzależniony jest od sprawnej komunikacji międzykomórkowej. W

doniesieniach ostatnich lat sugeruje się, że komunikacja symplastowa, zachodząca

dzięki obecności plasmodesm, odgrywa znaczącą rolę w przemieszczaniu się cząsteczek

sygnałowych pomiędzy komórkami roślinnymi, a jednocześnie istotnie wpływa na

różnicowanie komórek i morfogenezę (Sokołowska 2005, Wróbel-Marek i wsp. 2015).

Zmiany w komunikacji symplastowej, z którymi skorelowane są zmiany ekspresji

genów zaobserwowano także w warunkach in vitro. W kulturach tytoniu szlachetnego

(Nicotiana tabacum L.), regenerujące tkanki stanowiły pojedynczą domenę

symplastową, aż do momentu wytworzenia wierzchołka pędu na eksplantacie, a

następnie powstały organ izolowany był symplastowo (Cantrill i wsp. 2001). Na

podstawie analiz wzrostu zarodków somatycznych w kulturach cykorii (Cichorium

intybus L.) oraz embriogennej kultury orzecha kokosowego (Cocos nucifera L.),

stwierdzono, że czasowa izolacja komórek embriogennych jest niezbędna w

zainicjowaniu nowych dróg rozwojowych (Verdeil i wsp. 2001, Marzec i Kurczyńska

2014).

Prace mające na celu wyjaśnienie podłoża genetycznego zdolności roślin do

regeneracji warunkach in vitro, prowadzone są od wielu lat. Poznanie mechanizmów

kontrolujących morfogenezę, pozwoli poprawić efektywność regeneracji roślin w

kulturach in vitro (Burza 1995, Taiz i Zeiger 2006). Udało się zidentyfikować loci cech

ilościowych, związanych z reakcją komórek roślinnych w kulturach in vitro na mapach

sprzężeń markerów molekularnych, a także wyizolować i scharakteryzować geny

zaangażowane w proces somatycznej embriogenezy. Dotychczas zidentyfikowano kilka

genów, związanych z procesem powstawania zarodków z komórek somatycznych,

takich jak m.in.: geny SERK (ang. somatic embryogenesis receptor kinase), LEC (ang.

16

leafy cotyledon), a także BBM (ang. baby boom) (Gruszczyńska i Rakoczy-Trojanowska

2007, Kulus 2013). Gen SERK ulega ekspresji już w komórkach proembriogennych,

bierze udział w przekazywaniu sygnałów i uruchamianiu szeregu procesów

umożliwiających zapoczątkowanie embriogenezy. Geny LEC (LEC1, LEC2 i FUS3)

kodują białka zaangażowane w prawidłowy rozwój zarodka na wszystkich etapach

rozwoju i wzrostu. Zidentyfikowane u rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)

i rzepaku (Brassica napus L.) białka BBM, zaszeregowano do czynników

transkrypcyjnych o kluczowej roli w regulacji szlaków, związanych z embriogenezą

somatyczną. U mutantów z nadekspresją genu BBM, zaobserwowano spontaniczne

formowanie zarodków somatycznych (o podobnej organizacji co zarodki zygotyczne)

oraz struktur podobnych do liścieni (Gruszczyńska i Rakoczy-Trojanowska 2007, Kulus

2013).

Wykorzystanie hodowli in vitro do mikrorozmnażania roślin, jest jednym

z najważniejszych praktycznych zastosowań roślinnych kultur in vitro (Szopa i Kostyń

2006). Zaletą rozmnażania klonalnego, oprócz niewielkiej ilości materiału wyjściowego

wykorzystanego do pozyskiwania dużej ilości roślin potomnych, jest też wyrównanie

genotypowe oraz fenotypowe produkowanych roślin. Głównymi sposobami

mikrorozmnażania, jest otrzymywanie pąków/pędów na drodze organogenezy

bezpośredniej i organogenezy pośredniej oraz somatycznej embriogenezy (Szczygieł

2005, Mikuła i wsp. 1996, 2002, 2015).

Efekt końcowy (wysoka liczba uzyskanych organów) prowadzenia kultur

in vitro zależy od właściwości biochemiczno-fizjologicznych i genetycznych użytego

materiału roślinnego, właściwości fizycznych podłoża oraz substancji odżywczych i

stymulatorów wzrostu w nim zawartych, a także od warunków zewnętrznych, w których

prowadzi się kulturę. Czynnikiem morfogenetycznym podczas wzrostu i rozwoju

eksplantatów w prowadzonych kulturach jest m.in. światło, odpowiedni dobór składu

pożywki i regulatorów wzrostu (Ramage i Williams 2002, Siegień i wsp. 2013).

17

1.2 Czynniki wpływające na morfogenezę

1.2.1 Rola światła w regulacji morfogenezy roślin

Światło słoneczne stanowi istotny czynnik środowiskowy w życiu roślin.

Odgrywa ono ważną funkcję w regulowaniu metabolizmu i morfogenezy. Rola światła

w rozwoju roślin jest naturalnie związana z procesem fotosyntezy, w którym pełni

funkcje czynnika troficznego, oraz z procesami fotomorfogenezy. Światło inicjuje

proces fotosyntezy, wpływa na aktywność niektórych enzymów metabolizmu

fotosyntetycznego, pośrednio reguluje również intensywność transpiracji np. poprzez

wpływ na stopień otwarcia aparatów szparkowych. Promieniowanie fotosyntetycznie

aktywne jest źródłem energii podczas reakcji fotosyntezy, niezbędnym w przemianach

prostych związków nieorganicznych do cukrów, które są prekursorami wszystkich

związków organicznych w roślinie (Taiz i Zeiger 2006, Strzałka 2012), także w

kulturach in vitro (Borkowska 2003).

Absorbowanie promieniowania zależne jest od długości fali, ale też od

właściwości samego organizmu, np. od fizycznych okryw ciała rośliny i ich zdolności

odbijania światła. Tylko część promieniowania docierającego do organizmów

roślinnych jest przez nie absorbowana i wykorzystywana w fazie świetlnej fotosyntezy.

Reszta swobodnie przenika przez liście i przechodzi na zewnątrz, lub jest przez nie

odbijane (Aphalo 2006, Garstka 2007, Strzałka 2012). Liście roślin do przeprowadzenia

reakcji fotosyntezy, w optymalnych warunkach wzrostu, wykorzystują około 5%

całkowitej energii słonecznej, która dociera do powierzchni Ziemi. Promieniowanie

fotosyntetycznie czynne (PAR, ang. photosynthetically active radiation), z którego

rośliny korzystają w procesie fotosyntezy, mieści się w zakresie pomiędzy 400 a 700

nm (Strzałka 2012, Gieczewska 2015). Światło pochłaniane jest przez grupę barwników

fotosyntetycznych, do których zaliczamy m.in. chlorofile a i b absorbujące światło

fioletowoniebieskie (400-480 nm) oraz czerwone (620-680 nm), jak również

karotenoidy (Sulkiewicz i Ciereszko 2016). Barwniki te pełnią rolę fotoreceptorów i są

składnikami anten energetycznych, gdzie współdziałają funkcjonalnie z białkami i

lipidami oraz przekazują energię do fotosystemów (PSI, PSII). Niektóre barwniki

(karotenoidy) chronią ponadto aparat fotosyntetyczny (a zwłaszcza PSII) przed

szkodliwym wpływem nadmiaru promieniowania (Demmig-Adams i Adams 1996,

Szabó i wsp. 2005). Wyróżnia się dwie główne fazy fotosyntezy: 1) fazę reakcji

18

fotochemicznych, zależnych od światła, co w efekcie prowadzi do redukcji NADP oraz

syntezy ATP; 2) fazę reakcji enzymatycznych (niezależnych od światła), zużywających

produkty reakcji fotochemicznych (NADPH, ATP), niezbędnych do związania i

redukcji CO2. Pierwszym trwałym produktem tych reakcji są triozy, przekształcane

następnie do skrobi i/lub sacharozy (Strzałka 2012). Asymilaty, będące produktem

fotosyntezy w liściach, są w większości transportowane do organów (akceptorów),

które nie są w stanie przeprowadzić tego procesu lub poziom, na którym go

przeprowadzają nie pokrywa ich zapotrzebowania na asymilaty. Związki te mogą być

substratami oddechowymi i donorami szkieletów węglowych do syntezy metabolitów

podstawowych i wtórnych, a magazynowane w roślinie - wpływać na wielkość

wytworzonej biomasy (Starck 2008, Ostaszewska-Bugajska i wsp. 2015).

Światło działa na roślinę bezpośrednio, jako czynnik morfogenetyczny, będący

bodźcem inicjującym określone zmiany rozwojowe. Wszystkie etapy cyklu życiowego i

rozwoju roślin, od kiełkowania do indukcji kwitnienia, a także starzenie, regulowane są

m.in. przez światło (Taiz i Zeiger 2006). Reakcją na promieniowanie czerwone jest

wzmożony proces kiełkowania, natomiast światło dalekiej czerwieni daje efekt

przeciwny, co zaobserwowano podczas kiełkowania nasion cebuli (Allium cepa L.)

oraz sałaty (Lactuca sativa L.) (Warening i Philips 1985). Do reakcji fizjologicznych

wywołanych działaniem światła czerwonego i dalekiej czerwieni, zalicza się również

odginanie się haczykowato zgiętego epikotylu, powiększanie się liści, czy inicjację

korzeni. Antagonistyczne efekty działania światła czerwonego i dalekiej czerwieni

wykazano na poziomie subkomórkowym i molekularnym w reakcjach takich jak ruchy

chloroplastów, synteza enzymów, czy zmiany przepuszczalności membran

cytoplazmatycznych (Hopkins i Hüner 2004). Wymienione reakcje zachodzące pod

wpływem światła, możliwe są dzięki występowaniu w roślinach barwników, będących

receptorami światła czerwonego, niebieskiego i ultrafioletu (Ahmad i wsp. 1998, Casal

2000, Lin 2000, Keller i wsp. 2011). Kryptochrom, fototropina lub zeaksantyna

odbierają bodźce świetlne z zakresu krótkofalowego promieniowania słonecznego (320

- 500 nm), natomiast fitochromy z zakresu długofalowego (580 - 730 nm) (Cashmore i

wsp. 1999, Casal 2000). Zaabsorbowanie fali świetlnej o odpowiedniej długości

zapoczątkowuje szereg przemian zakończonych odpowiedzią fizjologiczną, oddziałując

na sposób funkcjonowania genów związanych ze wzrostem, różnicowaniem się

komórek lub na zmianę równowagi hormonalnej (Hopkins i Hüner 2004, Taiz i Zeiger

2006, Igamberdiev i wsp. 2014).

19

Fitochromy są najdokładniej i najwcześniej poznanymi receptorami światła

czynnego morfogenetycznie. Biorą udział w wielu różnych procesach rozwojowych,

takich jak np. indukcja i regulacja wzrostu, kiełkowaniu nasion, deetiolacji czy

kwitnieniu (Mohr i Schopfer 1994, Casal 2000, Gabryś 2012). Maksimum absorpcji

barwnika przypada na długości fal, które odpowiadają światłu czerwonemu (660 nm) i

dalekiej czerwieni (730 nm). Fitochrom występuje w roślinach w dwóch formach, które

różnią się między sobą pod względem własności spektralnych i aktywności

fizjologicznej. Forma nieaktywna biologicznie Pr, pochłania promieniowanie z pasma o

długości 600 nm i pod jego wpływem przekształca się w aktywną biologicznie formę Pfr

reagującą na światło o długości 730 nm. Pfr może ulegać degradacji, bądź ponownemu

przekształceniu do Pr. Fitochromy kodowane są przez niewielką rodzinę genów. U

rzodkiewnika pospolitego białkowe składniki tych fotoreceptorów kodowane są przez

pięć genów (PHYA, B, C, D, E), z czego stosunkowo silniejszej ekspresji ulegają geny

PHYA i PHYB (Baba‐Kasai i wsp. 2014).

Ogromna rozpiętość energetyczna procesów sterowanych przez fitochromy,

doprowadziła do wyszczególnienia trzech kategorii reakcji fitochromowych: bardzo

nisko energetycznych (VLFR), niskoenergetycznych (LFR), wysokoenergetycznych

(HIR) (Franklin i Quail 2010). Charakterystyczną cechą reakcji fitochromowych LFR,

do których zalicza się m.in. kiełkowanie nasion niektórych odmian sałaty czy ruchy

senne liści, jest możliwość odwrócenia działania światła czerwonego przez daleką

czerwień. Reakcje VLFR np. indukcja ekspresji genu LHCB kodującego białko wiążące

chlorofile a i b w kompleksie antenowym, wywoływane przez światło czerwone, daleką

czerwień lub niebieskie, nie są odwracalne. Warunkiem wywoływania

wysokoenergetycznych reakcji HIR, takich jak: deetiolocja siewek, jest naświetlanie

rośliny przez dłuższy czas światłem o dużym natężeniu (Gabryś 2012).

Fitochromy mają zdolność także „odczytywania” długości dnia i nocy oraz

regulowania przez to procesu kwitnienia u gatunków roślin fotoperiodycznie

wrażliwych. Zmiany w zawartości poszczególnych form fitochromu pozwalają

regulować reakcje związane z cyklem dobowym (Kopcewicz 2012).

Kryptochromy są fotoreceptorami światła niebieskiego obecnymi u wszystkich

gatunków roślin. Odkryto je także u koralowców, jak również u owadów, ptaków i

ssaków. Stanowią podklasę receptorów światła niebieskiego – flawoprotein,

regulujących kiełkowanie, elongację, fotoperiodyzm i inne reakcje wzrostowe roślin

(Cashmore i wsp. 1999, Casal 2000, Keller i wsp. 2011). Kryptochromy absorbują

20

promieniowanie w zakresie 370 - 500 nm. Reakcje, które są inicjowane światłem

niebieskim, nie są odwracalne (Mohr i Schopfer 1995). U większości roślin występują

dwa homologiczne kryptochromy: cry1 i cry2. W efekcie naświetlenia światłem

niebieskim, ultrafioletowym i zielonym, obserwuje się szybki spadek poziomu cry2. W

momencie niskiego natężenia oświetlenia, deetiolacja jest kontrolowana przez obydwa

kryptochromy, tymczasem przy dużym natężeniu, dominującą rolę pełni cry1 (Ahmad i

wsp. 1998, Cashmore i wsp. 1999, Casal 2000).

Fototropiny są białkami receptorowymi, należącymi do kinaz, które ulegają

fosforylacji w odpowiedzi na światło niebieskie. Występują w błonie komórkowej

roślin wyższych (Casal 2000). Fototropiny w N-końcowym, fragmencie posiadają dwie

domeny LOV1 oraz LOV2 połączone z grupą chromoforową mononukleotydu

flawinowego (FMN), natomiast fragment C-końcowy, posiada domenę katalityczną

(kinaza serynowo- treoninowa). Fototropiny funkcjonują w dwóch odmianach aktywnej

(na świetle) lub nieaktywnej (w ciemności). Za odbieranie bodźców środowiskowych,

które zmieniają stan oksydoredukcyjny komórki, odpowiada domena LOV (Casal 2000,

Demarsy i Fankhauser 2009). Współdziałając z kryptochromem i fitochromem,

odpowiadają za regulację fototropizmu. Odgrywają również ważną rolę w ruchach

aparatów szparkowych, chloroplastów wewnątrz komórki, rozwoju liści czy w

pierwszych zmianach (przed uaktywnieniem kryptochromu), związanych z

wydłużaniem łodygi (Lin 2000, Luesse i wsp. 2010).

Zeaksantyna jest barwnikiem absorbującym światło niebieskie, zaliczanym do

karotenoidów. Występuje ona w błonach tylakoidów chloroplastów. Jest wytwarzana w

skutek odwracalnego przeobrażenia wiolaksantyny w cyklu ksantofilowym (Demmig-

Adams i Adams 1996, Szabó i wsp. 2005). Wykazano, że widmo czynnościowe ruchu

aparatów szparkowych pokrywa się z widmem absorpcyjnym zeaksantyny (Hopkins i

Hüner 2004).

W ostatnich latach wykryto, i częściowo scharakteryzowano, także inne

fotoreceptory, m.in. UVR8 (Kong i Okajima 2016 i literatura tam cytowana).

Światło wpływa również na procesy morfogenetyczne w kulturach in vitro.

Prawidłowy przebieg rozwoju eksplantatów, zależy od wyznaczenia takich właściwości

światła, jak jego natężenie, czas ekspozycji oraz długość fali świetlnej. Jakość oraz

natężenie światła uczestniczy np. w wytwarzaniu i namnażaniu pędów, kształtowaniu

anatomii, wielkości liścia czy w wytwarzaniu korzeni w kulturach in vitro (Reuveni i

Evenor 2007). Światło niebieskie i ultrafioletowe przeważnie wpływa negatywnie na

21

komórki hamując ich podziały i wzrost, uniemożliwiając indukcję i proliferację kalusa,

czy hamując powstawanie pąków przybyszowych. Wykazano, że światło zielone i żółte

może stymulować wytwarzanie pąków przybyszowych z części hipokotyli. W

warunkach in vitro, analogicznie do warunków naturalnych, najbardziej efektywnym

jest światło fotosyntetycznie aktywne (400-700 nm). U woskownicy europejskiej

(Myrica gale L.) wysoka intensywność światła indukuje wytwarzanie oraz wydłużanie

korzeni, jak również ma stymulujący wpływ na masę i długość pędów (Tavares i wsp.

1998). Natomiast w przypadku eksplantatów korzeni czosnku pospolitego (Allinum

sativum L.), indukcję i proliferację kalusa warunkuje zupełny brak światła, zaś światło

ma stymulujący wpływ na organogenezę pędową (Martín-Urdíroz i wsp. 2004). Światło

białe, czerwień i daleka czerwień, wpływają stymulująco na kaulogenezę dzikiej

odmiany pomidora (Lycopersicon esculentum Mill.) natomiast światło niebieskie

powoduje spadek zdolności regeneracyjnej (Bertram i Lercari 2000).

W badaniach nad wpływem cukrów oraz intensywnością światła na wzrost

rzodkiewnika pospolitego w warunkach in vitro zaobserwowano, iż wyższe stężenie

sacharozy w pożywce niweluje negatywne działanie światła o silnym natężeniu na

proces fotosyntezy oraz cykl ksantofilowy (Eckstein i wsp. 2012). Niską zdolność

fotosyntetyczną roślin hodowanych in vitro przypisuje się słabemu rozwojowi aparatu

fotosyntetycznego, niskiej aktywności enzymów uczestniczących w wiązaniu CO2,

niewystarczającej wymianie gazowej oraz uszkodzeniu aparatów szparkowych (Rival i

wsp. 1997, Zenkteler i Borkowska 2002). W przypadku kontrolowanych warunków

temperaturowych i świetlnych w trakcie wzrostu roślin w warunkach in vitro, to skład

chemiczny podłoża odgrywa znaczącą rolę w rozwoju i aktywności aparatu

fotosyntetycznego (Rybczyński i wsp. 2007).

1.2.2 Rola węglowodanów w kulturach in vitro

Cukry pełnią istotne funkcje we wzroście i rozwoju roślin: budulcowe,

zapasowe, są substratami reakcji oddechowych, czy metabolitami pośrednimi szeregu

procesów biochemicznych; mogą także chronić przed czynnikami stresowymi, np. jako

osmoprotektanty (Ciereszko 2006). Glukoza i sacharoza regulują ponadto procesy

wzrostowe i metaboliczne oraz funkcjonują jako cząsteczki sygnałowe (Ciereszko 2007,

van den Ende 2014). Zmiany stężenia i składu sacharydów następują w tkankach roślin

w ciągu doby oraz w czasie kolejnych etapów wzrostu i rozwoju. Dlatego u roślin

22

funkcjonują sprawne systemy percepcji i transdukcji sygnałów wywołanych zmianami

dostępności cukrów. Cukry wpływają na podziały komórkowe, proces kiełkowania,

wzrost wegetatywny, zakwitanie oraz starzenie roślin, często w sposób niezależny od

funkcji metabolicznych (Ciereszko 2007, Ciereszko 2016). Cukry wpływają na wzrost,

wytwarzanie i metabolizm liści, pędów oraz korzeni. Zmiany poziomu glukozy lub

sacharozy, wpływają na intensywność fotosyntezy i eksport asymilatów z liści oraz na

metabolizm oddechowy (Ciereszko 2006). Starzenie się roślin może być natomiast

indukowane deficytem cukrów (Morkunas i wsp. 2012). Cukry wpływają również na

strukturę lub ruchy organelli komórkowych (van Dingenen i wsp. 2016). Sacharoza

oddziałuje np. na morfologię, wielkość i liczbę chloroplastów w komórkach liści

rozetowych rzodkiewnika, obserwuje się wówczas mniejsze i nieregularne plastydy w

komórkach mezofilu (van Dingenen i wsp. 2016). Badania ostatnich lat wskazały także

na trehalozo-6-P, jako czynnik sygnalny, regulujący wiele procesów wzrostowych

roślin (Figueroa i Lunn 2016).

Deficyt sacharozy prowadzi do indukcji głównych punktów kontrolnych (PCP1 i

PCP2, ang. principal control points), które blokują cykl komórkowy odpowiednio w

fazie G1 i G2 (Polit i Ciereszko 2009 i literatura tam cytowana). Wzbogacenie pożywki

w cukier uruchamia aktywność replikacyjną i mitotyczną, jednak z opóźnieniem

kilkunastogodzinnnym. Czas może być modulowany przy pomocy fitohormonów:

cytokinina podana z sacharozą przyspieszała, natomiast auksyna - opóźniała

wznowienie replikacji (Polit i Ciereszko 2009 i literatura tam cytowana). Ostatnie

badania wskazały, że cukry (wraz z auksyną) regulują ekspresję cyklin typu D podczas

interfazy (Wang i Ruan 2013).

Drogi transdukcji sygnałów wywołanych przez cukry, współdziałają ze szlakami

hormonalnymi, a także odpowiedzią na zmiany czynników środowiska tworząc w

komórkach sieć komunikacyjno-sygnalizacyjną, kontrolującą procesy wzrostowe i

rozwojowe roślin. Charakterystyka mutantów cukrowych i hormonalnych (głównie z

zaburzoną syntezą ABA i etylenu), dostarczyła dowodów współdziałania hormonalnych

dróg sygnalnych i wywołanych przez cukry (Ciereszko 2007 i literatura tam cytowana).

Kolejne badania wskazały na współdziałanie cytokinin, giberelin oraz kwasu

jasmonowego, salicylowego czy brasinosteroidów ze szlakami cukrowymi (Ljung i

wsp. 2015, Ciereszko 2016 i literatura tam cytowana).

W warunkach kultury in vitro, węglowodany, jako składniki pożywek, są

niezbędnym czynnikiem dla rosnących i różnicujących się tkanek. Działają również

23

jako induktory lub rep resory, genów regulując wzrost i rozwój tkanek oraz zachodzące

w nich procesy metaboliczne (Koch 1996). Odgrywają znaczącą rolę w przekazywaniu

sygnałów indukujących morfogenezę, wzrost komórek czy odpowiedź na stres (Ho i

wsp. 2001). Stanowią źródło węgla organicznego, wykorzystywane są jako materiał

energetyczny i substrat do syntez w różnych szlakach metabolicznych. Węglowodany, a

zwłaszcza alkohole cukrowe, takie jak sorbitol, mannitol, oddziałują na procesy

morfogenetyczne tkanek poprzez wpływ na potencjał osmotyczny pożywki (Neto i

Otoni 2003, Staikidou i wsp. 2005). W hodowlach in vitro ciągłe dostarczanie

cukrowców z podłoża jest niezbędne z powodu zredukowanej aktywności

fotosyntetycznej kultur, w wyniku niskiej intensywności światła, ograniczonej wymiany

gazowej oraz wysokiej wilgotności (Bogunia i Przywara 1999). Jednak wysokie

egzogenne stężenie sacharozy w pożywce, zmniejsza zdolności fotosyntetyczne

hodowanych roślin oraz pędów w warunkach in vitro (Fuentes i wsp. 2005). Najczęściej

używanym źródłem węgla dla podtrzymania wzrostu in vitro i różnicowania się tkanek,

a także dobrze poznanym pod tym względem węglowodanem, jest sacharoza. Cukier

ten pod wpływem wydzielanej przez eksplantaty inwertazy, rozkładany jest do glukozy

i fruktozy (Tremblay i Tremblay 1995).

W badaniach nad wpływem różnych cukrów na morfogenezę w kulturach in

vitro lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.), najefektywniejszą kaulogenezę

zaobserwowano na podłożu z dodatkiem maltozy, natomiast obecność sacharozy

stymulowała namnażanie kalusa i ryzogenezę (Millam i wsp. 1992). W kulturach

rzepaku, najwyższą ilość tkanki kalusowej uzyskano na pożywkach z 1% i 3% glukozą,

natomiast najsłabsze namnażanie kalusa zanotowano na podłożu z rybozą. W kulturach

rosnących na pożywce zawierającej sacharozę, stwierdzono czterokrotny przyrost

biomasy, podczas gdy w obecności fruktozy, masa kalusa zwiększyła się półtorakrotnie.

Użycie cukru w stężeniu 10%, w każdym z testowanych wariantów doświadczenia,

indukowało najsłabszy przyrost kalusa (Bogunia i Przywara 1999). Z badań nad

embriogenezą somatyczną w kulturach zawiesinowych kukurydzy, wynika, że mannitol,

jak i sacharoza, stymulowały embriogenezę. Sacharoza w stężeniu 6% wpływała

ponadto na akumulację skrobi i dojrzewanie zarodków somatycznych. Natomiast w

obecność 2% sacharozy obserwowano formowanie pędów i korzeni na drodze

organogenezy pośredniej (Emons i wsp. 1993). W kulturach fasoli wielokwiatowej

(Phaseolus coccineus L.) oraz róży (Rosa sp. L.), glukoza była bardziej efektywna niż

24

sacharoza w indukowaniu kaulogenezy (Genga i Allavena 1991, Hsia i Korban 1996).

Rzodkiewnik pospolity, hodowany w warunkach in vitro, wymagał obecności cukru w

podłożu, jako dodatkowego źródła węgla. Wykazano ponadto, że bardzo niskie stężenia

sacharozy oraz glukozy, były odpowiednie do prawidłowego wzrostu i rozwoju roślin w

warunkach in vitro (Eckstein i wsp. 2012). W kulturach goryczki (Gentiana kurroo

Royle), prawidłowy rozwój i funkcjonowanie aparatu fotosynetycznego

zaobserwowano przy zawartości 0,2-0,4% sacharozy w pożywce. Natomiast brak

sacharozy w podłożu oraz sacharoza o stężeniu 3% nie wpływała korzystnie na

aktywność aparatu fotosyntetycznego (Rybczyński i wsp. 2007).

1.2.3 Rola hormonów i regulatorów wzrostu w procesie morfogenezy w

warunkach in vitro

Procesy wzrostu i rozwoju roślin regulowane są przez niskocząsteczkowe endo-

i egzogenne substancje zwane fitohormonami lub hormonami roślinnymi. Występują

one powszechnie w roślinach, są aktywne biologicznie w bardzo małych ilościach, a

niektóre z nich, podobnie jak hormony zwierzęce, działają daleko od miejsc swojej

biosyntezy. Regulatory wzrostu, hormony roślinne i ich syntetyczne analogi: auksyny i

cytokininy (stosowane najczęściej w kulturach), gibereliny, kwas abscysynowy i etylen,

jasmoniany czy brassinosteroidy, są charakterystycznymi składnikami używanymi do

pożywek w kulturach in vitro, silnie wpływającymi na efekt prowadzonej kultury

(Bishop i wsp. 2015). Kierunek morfogenezy w kulturach in vitr,o uzależniony jest w

dużym stopniu od rodzaju zastosowanych hormonów, jak też współdziałania między

nimi. Koordynując wiele procesów fitohormony mogą oddziaływać niezależnie od

siebie, lub wzajemnie wzmacniać, bądź eliminować swoje efekty (Taiz i Zeiger 2006,

Bajguz i Hayat 2009, Frankowski i wsp. 2009, Adamczuk i wsp. 2012b, Bishop i wsp.

2015).

Cytokininy są pochodnymi adeniny syntetyzowanymi głównie w korzeniach.

Stymulują one podziały komórek, uczestniczą w ich różnicowaniu, regulują wzrost,

spoczynek, transport i akumulację asymilatów, syntezę kwasów nukleinowych,

aktywność enzymów. Dobrze znaną właściwością cytokinin jest opóźnianie procesu

starzenia liści. Stymulują one rozwój liści, otwieranie aparatów szparkowych, syntezę

chlorofilu i karotenoidów. Zwiększają ilość białek fotosyntetycznych, na poziomie

transkrypcyjnym, jak i potranskrypcyjnym (Pilarska i wsp. 2015 i literatura tam

25

cytowana). Hormony te wpływają na morfogenezę, znosząc dominację wierzchołkową,

indukują powstawanie pędów przybyszowych i hamowanie formowania korzeni

przybyszowych. Cytokininy są regulatorami wzrostu niezbędnymi do zainicjowania

merystemów pędowych w kulturach in vitro. Hormonami należącymi do tej grupy,

stosowanymi w kulturach in vitro są naturalne – zeatyna, 6(ɣ,ɣ-dimetyloalliloamino)-

puryna (2iP) oraz syntetyczne – benzyloaminopuryna (BA), kinetyna (Ružić i Vujović

2008). Naturalne cytokininy zeatyna, 2iP, to pochodne zasady purynowej adeniny, w

której do grupy aminowej przyłączony jest najczęściej pięciowęglowy izoprenowy

łańcuch alifatyczny, a rzadziej aromatyczny podstawnik benzylowy, w różnych

modyfikacjach chemicznych. Aktywność cytokininową wykazują również niektóre

związki syntetyczne, pochodne mocznika, jak, np., tidiazuron (TDZ) (Czerpak i

Piotrowska 2003).

Najczęściej obserwowane działanie cytokinin na kultury roślinne in vitro to

inicjacja merystemów pędowych, stymulacja kaulogenezy, zahamowanie tworzenia

korzeni, redukcja długości pędów i opóźnianie procesu starzenia. Fitohormony te są

substancjami, które powodują odmłodzenie eksplantatów co ma ogromne znaczenie w

przypadku rozmnażania starych, wartościowych drzew leśnych lub starych klonów

roślin sadowniczych. Pierwszą reakcją na dodatek cytokininy do pożywki jest

zwiększenie świeżej masy eksplantatów (Orlikowska 1997). Najwyższy procent

reagujących eksplantatów oraz najwyższą liczbę pędów obserwowano na pożywce z

dodatkiem BA, m.in. w kulturach rumiana szlachetnego (Anthemis nobilis L.) czy

różnych odmian lnu (Linum usitatissimum L.) (Echeverrigaray i wsp. 2000, Belongova i

Raldugina 2006, Janowicz i Wojciechowski 2009). Organogeneza pędowa, niezależnie

od gatunku żywopłonu (Aeschynomene spp.) z jakiego pochodziły eksplantaty, była

najwyższa, gdy pożywka zawierała stosunkowo niską koncentrację NAA, w

porównaniu do użytej cytokininy (Rey i Mroginski 1996).

Obecnie znanych i stosowanych jest kilka cytokinin mocznikowych. Szczególne

znaczenie ma tidiazuron (TDZ): N-fenylo-N’-1,2,3-tiodiazylo-5-yl-mocznik, który

wykazuje bardzo silną aktywność cytokininową. Stwierdzono, że TDZ jest potężnym

regulatorem odpowiedzi morfogenetycznych u wielu gatunków roślin. Odpowiedzi te

obejmują somatyczną embriogenezę, mikropropagację, regenerację, formowanie pędów

i pobudzanie uśpionych pąków (Jasiwal i Sawhney 2006). Stosowany jest w kulturach

in vitro, m.in. tych roślin, które słabo reagują na BA (Borkowska 1997). Indukcję

embriogenezy somatycznej przez TDZ obserwowano w kulturach bambusa (Bambusa

26

sp. Shreb.), wiśni (Cerasus sp. Mill.) czy pieprzowca rocznego (Capsicum annum L.)

(Khan i wsp. 2006). TDZ okazał się także bardzo skuteczny w indukowaniu

organogenezy pędowej in vitro takich roślin jak: kiwi (Actinidia sp. Lindl.), jabłoń

(Malus sp. Mill.), groch (Pisum sp. L.) czy sezam indyjski (Sesamum indicum L.)

(Magioli i wsp. 1998, Were i wsp. 2006). W kulturach żyworódki (Kalanchoë

blossfeldiana Poelln.), TDZ okazał się efektywniejszym stymulatorem kaulogenezy niż

BA (Sanikhani i wsp. 2006). Siewki lnu hodowane na pożywce z dodatkiem TDZ

wykazywały wyraźną wieloraką odpowiedź na ten związek: zahamowanie wydłużania

korzeni, skrócenie hipokotyla, zgrubienie nasady hipokotyla oraz przyleganie liścieni do

wierzchołka. Konsekwencją działania TDZ na fragmenty hipokotyli lnu, obok

wymienionych efektów było indukowanie kaulogenezy (Gairi i Rashid 2002, Mundhara

i Rashid 2006).

Auksyny odpowiedzialne są głównie za wydłużanie komórek, indukcję

tworzenia korzeni przybyszowych, formowanie kalusa oraz hamowanie wzrostu pąków

kątowych. Syntetyzowane są w młodych częściach roślin, takich jak wierzchołki

pędów, rozwijające się liście, młode owoce. Szczególną właściwością tych

fitohormonów jest ich polarny transport, kontrolowany przez białka PIN odpowiadające

za wypływ auksyn z komórki. Białka te odgrywają znaczącą rolę w asymetrycznym

rozmieszczeniu stężenia auksyn w roślinie, co wpływa znacząco na wzrost i rozwój

rośliny (Tanaka i wsp. 2006, Wiśniewska i wsp. 2006). Prawidłowy przebieg rozwoju

zarodkowego, tworzenie korzeni bocznych uwarunkowany jest dynamiczną zamianą

lokalizacji białek PIN (Wiśniewska i wsp. 2009 i literatura tam cytowana). Wszystkie

obserwowane dotychczas reakcje morfogenetyczne roślin na auksyny, stwierdzono

również w kulturach in vitro. Auksyny wraz z cytokininami indukują bezpośrednią

organogenezę (Tilkat i Onay 2009). Efektem działania auksyn na eksplantaty w

warunkach in vitro jest stymulacja podziałów komórkowych, prowadząca do

wytworzenia kalusa, a przy współdziałaniu z cytokininami organogenezy korzeniowej i

pędowej oraz somatycznej embriogenezy (Korach i wsp. 2002). Rozwój kalusa

obserwuje się na pożywkach z dodatkiem auksyny jako jedynego regulatora, ale

dodatek cytokininy przyspiesza jego wzrost. Podwyższenie poziomu auksyny w

podłożu pobudza tworzenie korzeni (Ryc. 2). Auksyna stymuluje biosyntezę etylenu w

tkankach, który wpływać może na szybsze starzenie kultur. Najczęściej stosowany w

kulturach in vitro jest kwas indolilo-3-octowy (IAA) – auksyna naturalna, jak też kilka

syntetycznych: kwas indolilo-3-masłowy (IBA), kwas naftalenooctowy (NAA), kwas

27

2,4- dichlorofenoksyoctowy (2,4-D), pikloram czy dikamba (Gaspar i wsp. 1996). W

kulturach in vitro auksyny są wykorzystywane do pobudzania regeneracji brakujących

organów, inicjowania wegetatywnych pąków, namnażania kalusa w obecności

cytokinin.

Ryc. 2. Współdziałanie auksyn i cytokinin w indukcji organogenezy w kulturach

in vitro.

Wzajemna proporcja auksyn w stosunku do cytokinin decyduje zwykle o

kierunku przemian morfogenetycznych. Hormony, działając antagonistycznie,

wpływają na różnicowanie korzeni. Podwyższenie poziomu auksyny, przy braku

cytokininy, może prowadzić do stymulacji rozwoju korzeni bocznych, natomiast

obecność cytokininy hamuje ten proces (Werner i Schmulling 2009). Przewaga

cytokinin nad auksynami w kulturach szparaga (Asparagus densiflorus (Kunth) Jessop),

indukowała powstawanie pędów oraz zwiększała ich liczbę (Benmoussa i wsp. 1996).

W otrzymywaniu pędów dzwonka karpackiego (Campanula carpatica Jacq.) z kalusa,

niezbędna jest obecność zarówno auksyny jak i cytokininy w optymalnych dla tego

gatunku stężeniach w pożywce (Frello i wsp. 2002). Zniesienie dominacji pąka

wierzchołkowego to również wynik współdziałania cytokinin z endo- i egzogennymi

auksynami. Rośliny pomidora otrzymane in vitro na pożywce z hormonami (IAA, BA),

wyróżniały się większą intensywnością wzrostu na początku okresu wegetacji, lepiej

zawiązywały owoce w górnych gronach. Plon tych roślin był wyższy w porównaniu do

roślin z siewu tradycyjnego (Górecka i wsp. 1997). Roślinne regulatory wzrostu

odgrywają także ważną rolę w inicjacji somatycznej embriogenezy oraz w stymulacji

dojrzewania zarodków somatycznych. Powszechnie używane cytokininy w pożywkach

28

indukcyjnych są dodawane również do pożywek regeneracyjnych, w których odgrywają

ważną rolę w procesie dojrzewania zarodków, stymulując tworzenie liścieni (Mikuła i

wsp. 1997).

Gibereliny należą do licznej grupy ponad stu związków. Za główne aktywne

gibereliny w roślinach wyższych uważane są: A1, A3, A4, A7 i A9. Wytwarzane są w

dojrzewających nasionach, owocach, zielonych częściach rośliny, wierzchołkach

wzrostu pędu, korzeniach, pręcikach. Hormony te biorą udział w takich procesach jak:

wydłużanie łodygi roślin karłowatych, indukcja kwitnienia, pobudzanie zawiązywania

owoców, przyspieszanie wychodzenia nasion ze stanu spoczynku, indukują

wytwarzanie α-amylazy, stymulują powstawanie owoców partenokarpicznych. W

kulturach in vitro najczęściej stosowaną gibereliną jest kwas giberelowy (GA3), który

często wywołuje efekt zbliżony do auksyn. Gibereliny w dużych stężeniach indukują

formowanie kalusa, a współdziałając z auksynami, stymulują jego proliferację. Dodatek

gibereliny do kultur, gdzie zapoczątkowany został proces organogenezy stymuluje

liczbę tworzonych struktur. Gibereliny działają jak inhibitory w formowaniu zarodków

somatycznych, jednocześnie ułatwiając dalsze etapy ich rozwoju (Stefaniak 2004, Taiz i

Zeiger 2006).

Kwas abscysynowy (ABA), należący do seskwiterpenów, jest jedynym

przedstawicielem tej grupy hormonów. Najczęstszym efektem działania ABA jest

hamowanie wzrostu czy kiełkowania. Reguluje również szereg procesów takich jak:

dojrzewanie i spoczynek nasion, wzrost korzeni, starzenie się liści, a także

przechodzenie z fazy wzrostu wegetatywnego do generatywnego. Uważany jest za

jeden z głównych, obok, JA i etylenu hormon stresu, umożliwiający roślinie

przystosowanie się do niekorzystnych warunków środowiska. Pośredniczy w regulacji

otwierania aparatów szparkowych oraz wpływa na ekspresję genów związanych ze

stresem (Wasąg i Kowlczyk 2009). W kulturach in vitro ABA zwykle hamuje

formowanie i namnażanie kalusa, jednak w obecności cytokininy stymuluje namnażanie

komórek. W kulturach in vitro roślin cytrusowych może stymulować tworzenie kalusa

oraz współdziałać w dojrzewaniu zarodków somatycznych. W procesie morfogenezy

przyspiesza rozwój organów przybyszowych, indukuje wytwarzanie kwiatów.

Niewielka dawka ABA indukuje embriogenezę somatyczną w komórkach kalusa i

zapewnia prawidłowy rozwój zarodków somatycznych. Działa również jako inhibitor

przedwczesnego kiełkowania zarodków somatycznych (Kępczyńska 2006, Kulus 2013).

Obecność ABA w pożywce inicjującej embriogenezę somatyczną marchwi (Daucus

29

carota L.) i kminku (Carum carvi L.), uniemożliwiało przemiany, mające na celu

nadanie komórkom charakteru embriogennego, natomiast w fazie dojrzewania

zarodków somatycznych sprzyjało prawidłowemu wykształceniu liścieni (Orlikowska

1997).

Kolejnym hormonem wykorzystywanym w kulturach in vitro jest etylen - gaz o

prostej budowie chemicznej, cechujący się dużą lotnością i łatwością przemieszczania

się w roślinie. Hormon ten wytwarzany jest przez wszystkie żywe komórki, stymuluje

kiełkowanie, starzenie się kwiatów i liści, przyspiesza dojrzewanie owoców, zrzucanie

liści, a także tworzenie korzeni przybyszowych oraz hamuje wydłużanie łodyg

(Frankowski i wsp. 2007). Etylen uczestniczy w reakcji roślin na czynniki stresowe.

Syntetyzowany, m.in. w odpowiedzi na zranienie, gromadzi się w naczyniach, w

których prowadzone są kultury in vitro, wywołując efekty zbliżone do auksyn. Zbyt

szczelne zamknięcie naczyń powoduje duże nagromadzenie tego gazu, co może

skutkować szybszym starzeniem kultur. Prowadzi to do zahamowania podziałów

komórkowych, wzrostu komórek oraz przyspiesza ich starzenie. Hamuje proliferację

kalusa i wytworzenie pędów przybyszowych, obniża efektywność somatycznej

embriogenezy (Stefaniak 2004, Frankowski i wsp. 2007).

Jasmoniany (JAs) są grupą roślinnych regulatorów wzrostu, reprezentowaną

przez kwas jasmonowy (JA) oraz jego ester metylowy, nazywany jasmonianem metylu

(Me-JA). Związki te odgrywają ważną regulacyjną rolę we wzroście i rozwoju roślin

oraz w wielu procesach komórkowych. Doniesienia na temat działania kwasu

jasmonowego dotyczyły przyspieszania procesu starzenia (Chung i wsp. 2008). U wielu

badanych roślin m.in. tytoniu szlachetnego (Nicotiana tabacum L.), komosy czerwonej

(Chenopodium rubrum L.) i wolfii bezkorzeniowej (Wolffia arrhiza (L.) Horkel ex

Wimm.), zaobserwowano zahamowanie kwitnienia pod wpływem tego fitohormonu,

natomiast w przypadku rzepaku jasmoniany wpływały na tworzenie się kwiatów (Pak i

wsp. 2009, Wilmowicz i wsp. 2012). Hormony tej grupy mają istotny wpływ na

prawidłowe formowanie płonnych i płodnych części kwiatów oraz otwieranie się pąków

kwiatowych. Dodatkowo kwas jasmonowy powstający w nitkach pręcików, uczestniczy

w dojrzewaniu ziaren pyłku, a koniugat kwasu jasmonowego z izoleucyną uczestniczy

pośrednio w regulowanej przez światło sekrecji nektaru (Wilmowicz i wsp. 2012).

Jasmoniany uczestniczą również w reakcjach roślin na stresy biotyczne i abiotyczne.

Odpowiedź abiotyczna wymaga natychmiastowej mobilizacji sygnałów obronnych

rośliny. Może to być realizowane poprzez wyzwolenie impulsu uwalniającego

30

fitohormon lub powodującego jego syntezę de novo. Ponadto uważa się, że kwas

jasmonowy i jego ester metylowy biorą udział w uruchamianiu mechanizmów

indukowanej odporności systemicznej (Andrys 2014 i literatura tam cytowana). W

zranionych tkankach roślin dochodzi do gromadzenia kwasu jasmonowego, który jest

sygnałem aktywującym ekspresję genów, takich jak inhibitory proteinaz, taniny czy

enzymów w metabolizmie fitoaleksyn (Creelman i Mullet 1997). α-tokoferol

wpływając na sygnalizację wewnątrzkomórkową bezpośrednio, przez interakcję

elementów kaskady sygnałowej bądź pośrednio, poprzez zapobieganie peroksydacji

lipidów reguluje pozim JA w roślinie (Munne-Bosch i Alegre 2002).

JA i Me-JA mogą być dodawane na każdym etapie prowadzenia kultur in vitro

oraz stosowane w kulturach zawiesinowych, gdzie wpływają na zwiększoną produkcję

metabolitów wtórnych (Kim i wsp. 2004, Wiktorowska i wsp. 2010, Zhao i wsp. 2013).

Stymulują proces tworzenia bulw, mikrobulw i cebul. W badaniach dotyczących kultur

in vitro stosowano JA i Me-JA m.in. w namnażaniu roślin – pistacji właściwej (Pistacia

vera L.), ziemniaka (Solanum tuberosum L.), gloriozy wspaniałej (Glorisa

rothschildiana ‘O’Brien’) (Dolcet-Sanujan i Claveria 1995, Weryszko-Chmielewska i

Kozak 2002) oraz ich ukorzenianiu (Maciejewska i Kopcewicz 2002, Luo i wsp. 2009).

U gatunków Cymbidium zaobserwowano, iż mieszanina Me-JA i chitozanu stymuluje

wzrost pędów (w przeciwieństwie do JA) i formowanie korzeni (Shimasaki i wsp.

2010). W kulturach in vitro ryżu (Oryza sativa L.) kwas jasmonowy zmniejszył wzrost

pędów, wielkość i liczbę liści oraz korzeni (Cho i wsp. 2007). Kwas jasmonowy

stymulował tworzenie się pędów oraz cebul w kulturach in vitro czosnku, a także

tworzenie bulw u narcyza trójpręcikowego (Narcissus triandrus L.) (Ravnikar i wsp.

1993, Santos i Salema 2000).

Brasinosteroidy (BR) to związki o charakterze regulatorów wzrostu należące do

grupy steroidów. Do naturalnych BR należą 24-epibrasinolid (BR27) oraz 28-

homobrasinolid (BR17). Syntetyczne BR oraz ich analogi o aktywności biologicznej

zbliżonej do naturalnych, to m.in. TS303, 5f-HCTS, MH5 (Janeczko 2005 i literatura

tam cytowana). Brasinosteroidy występują u roślin w łodygach, korzeniach, pyłku

kwiatowym, nasionach, pąkach kwiatowych, zidentyfikowano je również w glonach

(Bajguz i Hayat 2009). Związki te są aktywne fizjologicznie w około 1000 razy

mniejszych stężeniach niż znane hormony roślinne. Brasinosteroidy stymulują wzrost i

rozwój roślin, podnoszą efektywność fotosyntezy, odgrywają istotną rolę m.in. w

31

zahamowaniu wzrostu korzeni, biosyntezie etylenu, aktywacji pompy protonowej,

różnicowaniu naczyń, a także działają ochronnie na roślinę w warunkach stresu

(zwiększają aktywność enzymów antyoksydacyjnych, sprzyjają produkcji ochronnych

białek szoku cieplnego) (Yu i wsp. 2004, Krishna 2003, Mazzorra i wsp. 2002).

Brasinosteroidy znalazły również zastosowanie w roślinnych kulturach in vitro.

Stwierdzono, iż sprzyjają wzrostowi kalusa, stymulują embriogenezę oraz

organogenezę. W kulturach kalusa rzodkiewnika pospolitego, (Arabidopsis thaliana L.)

brasionosteroidy regulowały podziały komórkowe tak, jak w przypadku cytokinin

poprzez aktywację genów dla cyklin typu D (CycD3) (Hu i wsp. 2000).

Zaobserwowano również poprawę syntezy metabolitów wtórnych np. paclitakselu

stosowanego w chemioterapii nowotworów, pod wpływem brasinolidu dodanego do

kultur zawiesinowych cisu (Taxus chinesis (Pilger) Rehder) (Zang i wsp. 2001). W

kulturach hipokotylowych kalafiora (Brassica oleracea L. var.botrytis L.) pod

wpływem brasinolidu stwierdzono stymulację organogenezy pędowej (Sasaki 2002).

Brassinosteroidy wraz z cytokininami indukowały formowanie kalusa oraz kaulogenezę

w kulturach in vitro sałaty (Lactuca sativa L.) (Nunez i wsp. 2004). BR pobudzają

również proces embriogenezy somatycznej w kulturach takich roślin jak: sosna (Pinus

sp. L.), świerk (Picea sp. A. Dietr.) czy ryż (Pullman i wsp. 2003).

Oprócz omówionych powyżej hormonów na procesy wzrostu i morfogenezy

roślin mogą wpływać różne regulatory wzrostu (nie zaliczane do hormonów), np.

poliaminy (Sińska 1986), tlenek azotu, a także nowo poznane, jak karrikiny czy

strigolaktony (Janas i wsp. 2010, Marzec i Muszyńska 2012, Starck 2014).

1.3 Działanie abiotycznych czynników środowiskowych na proces

morfogenezy

Rośliny w warunkach naturalnych narażone są na działanie wielu

niekorzystnych czynników środowiska takich jak: zbyt niska lub wysoka temperatura,

deficyt wybranych składników pożywki, czy stres spowodowany niedoborem wody.

Mogą one być przyczyną zaburzeń metabolicznych, zahamowania wzrostu,

zmniejszonego owocowania czy uszkodzeń tkanek, organów, a długotrwałe i

intensywne ich oddziaływanie, w skrajnych przypadkach, doprowadza do fazy

wyczerpania organizmu i jego śmierci (Kacperska 2012).

32

Wspólną odpowiedzią tkanek roślinnych na działanie niekorzystnych czynników

biotycznych i abiotycznych jest stres oksydacyjny i nitrozacyjny, wywołany

nadprodukcją reaktywnych form tlenu (ROS), reaktywnych form azotu (RNS) i

rodników, powstający na skutek zachwiania równowagi między wytwarzaniem

ROS/RNS a ich usuwaniem przez systemy antyoksydacyjne (Jaspers i Kangasjarvi

2010). Przejawem działania tych stresów jest m.in. peroksydacja lipidów, uszkodzenia

DNA i białek oraz innych ważnych składników w komórce. Dane literaturowe wskazują

także, że ROS/RNS w niewielkich stężeniach, działając jako cząsteczki sygnalne

wpływają stymulująco na przebieg wielu procesów, zapoczątkowują ciąg zdarzeń

prowadzących do zmiany metabolizmu, naprawy uszkodzeń czy efektywniejszej

regeneracji (Mitrović i Bogdanović 2008, Kreslavski 2012).

ROS/RNS uczestniczą w procesach związanych ze wzrostem, różnicowaniem i

rozwojem komórek roślinnych, również podczas morfogenezy w kulturach in vitro

(Tian i wsp. 2003).

Ryc. 3. Podwójna rola reaktywnych form tlenu (ROS) oraz reaktywnych form azotu (RNS)

w regulacji morfogenezy roślin w kulturach in vitro. Zmodyfikowane wg Adamczuk i wsp.

(2012a)

Stres oksydacyjny/nitrozacyjny generowany w wyniku zaburzenia równowagi

pomiędzy wytwarzaniem ROS/RNS a ich usuwaniem, ma również wpływ na kultury in

33

vitro. Widoczne objawy tych stresów to zmniejszenie zawartości wody w tkankach,

zahamowanie wzrostu kultur czy obniżenie zdolności regeneracyjnych, a nawet ich

obumieranie (Abbasi 2011, Benson 2000). Zaobserwowano także, że działanie

niektórych niekorzystnych czynników stresowych może zwiększać zdolności

regeneracyjne roślin (Puijalon i wsp. 2008). Krótkotrwałe działanie stresu wodnego

wpływało stymulująco na regenerację ryżu oraz pszenicy zwyczajnej (Triticum

aestivum L.) (Jain i wsp. 1996, Khanna i Daggard 2001). Stres cieplny, solny oraz

niedobór składników mineralnych miały pozytywny wpływ na powstawanie pąków

pędowych na hipokotylach siewek lnu hodowanych in vitro (Mundhara i Rashid 2001).

Wprowadzanie i namnażanie roślin (bądź ich części) in vitro może wpływać na

metabolizm oksydacyjny i narażać tkanki na szkodliwe działanie ROS. Jednocześnie,

procesy utleniania oraz ROS mogą pozytywnie wpływać na procesy morfogenetyczne

w kulturach in vitro (Haq i wsp. 2009). Wybrane warunki stresowe generujące

powstawanie ROS, zastosowano w badaniach nad sposobem poprawy regeneracji w

kulturach in vitro.

1.4 Reaktywne formy tlenu (ROS) w procesie organogenezy w warunkach

in vitro

W komórkach roślinnych ROS powstają bezustannie jako produkty uboczne

wielu szlaków metabolicznych zlokalizowanych w różnych przedziałach komórkowych.

Poziom ROS w roślinach w optymalnych warunkach ich wzrostu jest niski.

Organellami o wysokiej aktywności metabolizmu tlenowego są chloroplasty,

mitochondria i peroksysomy (Małecka i Tomaszewska 2005). ROS są grupą wolnych

rodników, reaktywnych molekuł i jonów pochodzących z O2. Tlen ze stanu

podstawowego może przechodzić do dużo bardziej reaktywnych form zarówno przez

transfer energii, jak i reakcje przenoszenia elektronu. Wśród ROS wyróżnia się

wzbudzone cząsteczki tlenu: tlen singletowy, nadtlenek wodoru, rodniki tlenowe (O2.-,

rodnik hydroksylowy), ponadto rodniki organiczne np.: alkoksylowe (RO.),

nadtlenkowe (ROO.), acyloksylowe (RCOO

.). Najbardziej znanymi ROS są: tlen

singletowy (1O2), anionorodnik ponadtlenkowy (

.O2

-), nadtlenek wodoru (H2O2) oraz

rodnik hydroksylowy (.OH). Zarówno

.O2

-, jak i H2O2 są uważane za umiarkowanie

reaktywne. H2O2, najstabilniejsza cząsteczka wśród ROS odznacza się dość długim

okresem półtrwania (1 ms). Swobodnie, dyfunduje przez błony komórkowe, co

umożliwia oddziaływanie na komórki oddalone od miejsca jego powstawania, a zatem

34

może funkcjonować jako cząsteczka sygnałowa. Najbardziej aktywny spośród ROS,

rodnik hydroksylowy odznacza się bardzo krótkim okresem półtrwania, nie

przemieszcza się przez błony komórkowe i zdolny jest do utleniania praktycznie

wszystkich ważnych biologicznie związków (Sharma i wsp. 2012, Nowicka i Kruk

2013). Produkcja i usuwanie wolnych rodników musi podlegać ścisłej kontroli, gdyż ich

gwałtowne i niespecyficzne reakcje prowadzą do uszkodzeń, włączając w to

peroksydację lipidów, inaktywację enzymów, innych funkcjonalnych białek, zamiany w

strukturze zasad organicznych i uszkodzeń DNA (Apel i Hirt 2004). Minimalizacja

skutków reakcji ROS z ważnymi molekułami komórkowymi jest możliwa dzięki

obecności niskocząsteczkowych przeciwutleniaczy, służących jako akceptory

elektronów i wyspecjalizowanych enzymów rozkładających ROS (Foyer i Shigeoka

2011). Do antyoksydantów nieenzymatycznych zalicza się antyoksydanty hydrofobowe,

chroniące wnętrze błon komórkowych i antyoksydanty hydrofilowe, chroniące

środowisko wodne komórki. Główne antyoksydanty hydrofobowe to: α-tokoferol

(witamina E), karotenoidy (β-karoten) i ksantofile. α-tokoferol odgrywa ważną rolę w

ochronie błon komórkowych przed uszkodzeniami wywołanymi przez ROS. Działa

jako „wygaszacz” tlenu singletowego oraz wymiatacz ROS powstających podczas

peroksydacji lipidów (Bartosz 2013). Karotenoidy w chloroplastach chronią aparat

fotosyntetyczny, odpowiadają za detoksykację ROS i tlenu singletowego powstającego

w wyniku wzbudzenia kompleksu fotosyntetycznego prze światło (Apel i Hirt 2004). W

skład grupy antyoksydantów hydrofilowych zalicza się kwas askorbinowy (witamina

C), glutation, kofeinę, kwas nikotynowy. Askorbinian i glutation – główne elementy

cyklu Halliwella-Asady, reagują bezpośrednio z anionorodnikiem ponadtlenkowym,

tlenem singletowym i nadtlenkiem wodoru (Foyer i Noctor 2005). Askorbinian

uczestniczy w reakcji Mehlera, polegającej na przeniesieniu elektronu z kompleksu PSI

bezpośrednio na cząsteczkę tlenu z wytworzeniem anionorodnika ponadtlenkowego,

który ulega przekształceniu w H2O2 w reakcji katalizowanej w chloroplastach przez

miedziowo-cynkową dysmutazę ponadtlenkową (Asada 2000, Kozłowska-Szerenos i

Ciereszko 2013).

Funkcje antyoksydacyjne mogą pełnić także związki fenolowe, nieazotowe

metabolity wtórne, które w zależności od budowy mogą wykazywać aktywność w fazie

hydrofilowej lub hydrofobowej. Związki fenolowe dzieli się na proste fenole i ich

pochodne: taniny, flawonoidy i izoflawonoidy. Większość tych związków wywodzi się

35

z aminokwasów: tyrozyny i fenyloalaniny, a syntetyzowane są na drodze szlaku kwasu

szikimowego i/lub kwasu malonowego (Amalesh i wsp. 2011). Cząsteczki należące do

powyższych grup spełniają wiele funkcji w rozwoju roślin np., taniny chronią przed

roślinożercami, flawonole, flawony i antocyjany nadają barwy kwiatom i owocom,

adsorbują promieniowanie nadfioletowe, chroniąc przed uszkodzeniami

fotooksydacyjnymi, izoflawonoidy są silnymi fitoaleksynami, powstającymi na skutek

kontaktu z patogenem (Dixon i Paiva 1995, Ryan i wsp. 2002, Hernandez i wsp. 2008,

Jasiński i wsp. 2009, Barbehenn i Constabel 2011).

Dzięki obecności grup hydroksylowych flawonoidy posiadają zdolności

przeciwutleniające prowadzące do usuwania stresu oksydacyjnego oraz jego skutków i

uważane są za jedne z kluczowych związków obronnych odpowiedzialnych za

usuwanie ROS (Bartwal i wsp. 2013). Zaangażowane są m.in. w chelatację jonów

metali przejściowych, głównie miedzi i żelaza, które katalizują reakcję Fentona i

Habera-Weissa, gdzie produktem jest rodnik hydroksylowy, przerywanie kaskady

reakcji peroksydacji lipidów, oddziałują na wzrost aktywności enzymów

antyoksydacyjnych (m.in. dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy) bądź pełnią funkcję

substratów dla enzymów, w przypadku wyczerpania zasobów innych mechanizmów

(Kowalewska i Litwinienko 2010, Agati i wsp. 2012, Czaplińska i wsp. 2012).

Stężenie związków fenolowych zależy od etapu rozwoju rośliny, a synteza tych

metabolitów zachodzi nawet po jej zranieniu (Dubravina i wsp. 2005). Jednak w

początkowych etapach rozwoju kultur tkankowych zaobserwowano niższą zawartość

fenoli niż w roślinach macierzystych, znaczący wzrost ich produkcji nastąpił podczas

organogenezy pędowej), jak i korzeniowej (Wu i wsp. 2007, Soler-Cantero i wsp.

2012). Związki fenolowe chronią auksyny przed dekarboksylacją, co skutkuje

prawidłowym rozwojem korzeni, za których wzrost hormony te są odpowiedzialne (De

Klerk i wsp. 2011).

Do antyoksydantów enzymatycznych zaliczamy enzymy zaangażowane

bezpośrednio w usuwanie ROS (dysmutazy ponadtlenkowe, katalazy, peroksydazy), jak

również enzymy biorące udział w reakcjach utleniania i redukcji askorbinianu lub

redukcji glutationu: peroksydaza askorbinianowa (APX, EC 1.11.1.11), reduktaza

monodehydroaskorbinianu (MDHAR, EC 1.6.5.4), reduktaza dehydrosakorbinianu

(DHAR, EC 1.8.5.1), reduktaza gultationowa (GR, EC 1.6.4.2) (Batková i wsp. 2008).

Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD, EC 1.15.1.1) jest enzymem działającym w „pierwszej

linii obrony” przed wolnymi rodnikami, która katalizuje dwuetapową reakcję

36

dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego do H2O2. Wyróżnia się trzy rodzaje

dysmutaz ponadtlenkowych: i) cynkowo-miedziowe (CuZn SOD), obecne w

cytoplazmie, chloroplastach, peroksysomach; ii) manganowe (MnSOD), zlokalizowane

w mitochondriach i peroksysomach; iii) żelazowe (FeSOD), występujące głównie w

chloroplastach (Małecka i Tomaszewska 2005). H2O2 powstający w wyniku dysmutacji

anionorodnika ponadtlenkowego przy udziale: katalazy (CAT, EC 1.11.1.6), APX i GR

ulega następnie reakcji dysproporcjacji. Znane są trzy formy katalazy o różnej

lokalizacji w komórce: CAT-1, CAT-2 zlokalizowane w peroksysomach,

glioksysomach, cytozolu oraz CAT-3 obecna w mitochondriach, cytozolu (Bartosz

2013). Peroksydaza askorbinianowa jest enzymem biorącym udział w cyklu

sprzężonych reakcji – cyklu Halliwella-Asady, którego głównym celem jest usuwanie

H2O2 (Foyer i Noctor 2005). APX i jej izoformy występują w cytozolu, chloroplastach,

mitochondriach i peroksysomach (Blokhina i wsp. 2003). Reduktaza glutationowa i

DHAR, obecne w chloroplastach i cytoplazmie, to enzymy pośrednio uczestniczące w

dysmutacji H2O2 podczas cyklu Halliwella-Asady. Reduktaza dehydroaskorbinianowa

katalizuje reakcję regeneracji askorbinianu, podczas gdy GR regeneruje glutation

(Batková i wsp. 2008).

1.4.1 Rola ROS w morfogenezie w warunkach in vitro

ROS uczestniczą w procesach związanych ze wzrostem, różnicowaniem i

rozwojem komórek roślinnych, również podczas morfogenezy w kulturach in vitro

(Tian i wsp. 2003, Skrzypek 2012). Efekt działania warunków stresowych na procesy

morfogenetyczne roślin wiąże się z wytwarzaniem ROS, zwłaszcza H2O2 (Kreslavski i

wsp. 2012). Produkcja H2O2 związana jest nie tylko z działaniem stresu, ale związek ten

znany jest również jako cząsteczka sygnalna w procesach wzrostu i rozwoju roślin

(Ślesak i wsp. 2007).

Zaobserwowano iż, H2O2 wpływał na procesy rozwojowe kilku gatunków roślin

w warunkach in vitro (Papadakis i wsp. 2001, Mitović i wsp. 2012). W wyniku

działania H2O2 stwierdzono, iż niewielkie stężenia tej reaktywnej formy tlenu mogą być

zaangażowane w organogenezę pędową mieczyka (Gladiolus sp. L.) (Gupta i Datta

2003). H2O2 działał pozytywnie na namnażanie komórek kalusa i formowanie

primordiów pędowych w kulturach truskawki (Fragaria ×ananassa Duchesne) (Tian i

wsp. 2003). Wysokie stężenie H2O2 stwierdzono w kalusie przypołudnika

37

kryształowego (Masembryanthemum crystallinum L.), wykazującym wysoki potencjał

regeneracyjny (Libik i wsp. 2005). Podwójną rolę H2O2 zaobserwowano w kulturach

winorośli, gdzie obniżał on potencjał regeneracyjny, ale jednocześnie okazał się

niezbędny przy podziałach protoplastów (Papadakis i wsp. 2001).

Badania prowadzone w warunkach in vitro wskazują, że efektem działania ROS

może być zmiana potencjału antyoksydacyjnego tkanek i zaangażowanie systemu

antyoksydacyjnego w regulację morfogenezy roślin (Chen i Ziv 2001). W przypadku

pieprzu czarnego (Piper nigrum L.) potencjał ten ulegał znacznemu podwyższeniu

podczas regeneracji pędów, w porównaniu do tkanek niezróżnicowanych (Nisar i wsp.

2010). Zregenerowane tkanki biedrzeńca anyżu (Pimpinella anisum L.) również

wykazywały wysoki potencjał antyoksydacyjny. W materiale tym stwierdzano

równocześnie podwyższone stężenie fenoli, metabolitów pełniących ochronne funkcje

przed negatywnym działaniem ROS (Andarwulan i Shetty 1999, Mitrović i wsp. 2012).

Aktywność przeciwutleniaczy może ulegać zmianie na różnych etapach regeneracji. W

kulturach in vitro mieczyka, somatyczna embriogeneza była efektywniejsza, gdy

aktywność SOD była wysoka, natomiast CAT i peroksydazy (POD, EC 1.11.1.7) niska

(Gupta i Datta 2003). Wzrost aktywności CAT i POD obserwowano natomiast podczas

organogenezy pędowej w kulturach mieczyka. Wysoki poziom SOD i brak aktywności

CAT oraz POD w eksplantatch na początku prowadzenia kultur Tacitus bellus L. oraz

niska aktywność SOD, a podwyższona CAT i POD podczas organogenezy pędowej,

może świadczyć o tym, iż utrzymanie niskiego poziomu H2O2 jest niezbędne w procesie

kaulogenezy (Mitrović i wsp. 2012).

W pracy dotyczącej kultur pszenicy namnażanie kalusa związane było z

produkcją ROS, wywoływaną przez hormony roślinne dodane do pożywki. Autorzy

sugerują, iż ROS mogą pośredniczyć w drogach sygnalnych pomiędzy egzogennymi

hormonami a indukcją morfogenezy w kulturach in vitro (Sztechyńska-Hebda i wsp.

2007).

1.4.2 Sygnalna rola ROS w morfogenezie w warunkach in vitro

ROS mogą funkcjonować w komórce jako „podwójni agenci”. Inicjując silny

stres oksydacyjny, mogą prowadzić do uszkodzeń, a nawet śmierci organizmów, a

jednocześnie funkcjonują jako cząsteczki sygnalne w molekularnych, biochemicznych i

fizjologicznych odpowiedziach, które mogą przyczynić się do stworzenia

38

mechanizmów adaptacyjnych i poprawić tolerancję organizmu na czynniki stresowe

(Kreslavski i wsp. 2012). ROS (w tym H2O2) są wtórnymi przekaźnikami w kilku

odpowiedziach na działanie hormonów roślinnych: grawitropizmie korzenia,

kiełkowaniu nasion, biosyntezie ligniny, programowanej śmierci komórki, a także w

reakcjach nadwrażliwości i nabywania odporności na stresy abiotyczne i biotyczne

(Sharma i wsp. 2012). Informacje na temat elementów komórkowych szlaków

sygnałowych prowadzących do tolerancji na działanie czynników stresowych u roślin

można odnaleźć m.in. w pracach Ślesak i wsp. 2007, Kreslavski i wsp. 2012, Sharma i

wsp. 2012. Odbierany przez roślinny receptor sygnał związany z produkcją ROS, ulega

transdukcji poprzez wtórne przekaźniki sygnału, nagromadzeniu wapnia, białka G,

fosforylację białek (Batková i wsp. 2008). ROS mogą również modulować działanie

wielu elementów szlaków sygnalnych, jak fosfatazy, kinazy białkowe czy czynniki

transkrypcyjne (Xiong i wsp. 2002).

Percepcja i transdukcja sygnałów wywołanych przez ROS, a także mechanizmy

molekularne związane z ROS, które wpływają na procesy morfogenetyczne w kulturach

in vitro, nie są zbyt dobrze poznane (Verdus i wsp. 1997, Abbasi i wsp. 2011). Verdus i

współpracownicy (1997) sugerowali, że pozytywny efekt bodźców mechanicznych na

proces organogenezy w kulturach lnu może być związany z szybką aktywacją kinazy

MAPK, będącej elementem kaskady kinaz oraz kinazy zależnej od wapnia CDPK.

Obert i współpracownicy (2005) wykazali, że rozwój i różnicowanie komórek związane

jest ze zróżnicowaną ekspresją genów, dlatego metabolizm ROS może odgrywać

decydującą rolę w tych procesach.

1.5 Regulacja procesów wzrostowych i morfogenetycznych przez tlenek

azotu (NO)

Tlenek azotu (NO) jako niewielka, silnie reaktywna cząsteczka, jest

wielofunkcyjnym wtórnym przekaźnikiem w komórkach różnych organizmów

należącym do reaktywnych form azotu (RNS). Do RNS zalicza się także ditlenki azotu

(NO2) i tritlenki azotu (N2O3). W komórkach roślinnych NO odpowiada za regulację

podstawowych mechanizmów związanych z utrzymaniem homeostazy redoks. Reaguje

zarówno z akceptorami, jak i donorami elektronów, i może występować jako rodnik

(NO.), kation (NO

+) oraz anion (NO

-) (Wandehenne i wsp. 2001). Podwójny charakter

tej cząsteczki zależny jest od jej poziomu w komórce. W niskich stężeniach pozytywnie

39

wpływa na wzrost i rozwój, natomiast w wysokich przyczynia się do zaburzeń w

metabolizmie roślin. NO obok ROS i hormonów, odgrywa ważną rolę w regulacji

procesów morfogenetycznych w roślinach. NO może z łatwością migrować do

cytoplazmy, dyfundować przez warstwy lipidowe błon oraz reagować z donorami i

akceptorami elektronów, z jonami metali przejściowych (żelazo, cynk, miedź), a

pośrednio jako RNS z białkami i lipidami (Corpas i wsp. 2011, Gniazdowska i wsp.

2009, Grzegorzewska i wsp. 2009). Mechanizm działania NO związany jest między

innymi z potranslacyjną modyfikacją białek - nitracją i S-nitrozylacją. Nitracja jest

znacznikiem generowanego przez RNS stresu nitrozacyjnego i dotyczy aminokwasów

aromatycznych, a zwłaszcza tyrozyny. S-nitrozylacja natomiast dotyczy głównie

cysteiny. Modyfikacji tej podlegają przede wszystkim elementy szlaków transdukcji

sygnałów np. receptory, czynniki transkrypcyjne (Ciąćka i wsp. 2014 i literatura tam

cytowana). Dane literaturowe wskazują, że NO, jako cząsteczka sygnalna, poza

kinazami MAP, może uruchamiać inne elementy szlaku transdukcji sygnału, tj. cGMP,

cADPR, Ca2+

, doprowadzając do zmiany ekspresji genów i podwyższenia tolerancji na

działanie czynników stresowych (Gill i wsp. 2013, Mur i wsp. 2013).

Do egzogennych źródeł tlenku azotu należą związki stosowane w praktyce

laboratoryjnej m.in. S-nitrozoacetylopenicyloaminy (SNAP), nitroprusydek sodu (SNP),

S-nitrozoglutationu (GSNO) (Gniazdowska i Bogatek 2007). Światło wpływa na

uwalnianie z tych związków m.in. tlenku azotu. Donory różnią się między sobą

zarówno ilością emitowanego NO, ale także szybkością oraz czasem emisji tego gazu.

Wykazano, że największą emisją NO charakteryzuje się SNAP, następnie GSNO, a

najmniejszą SNP. W przypadku SNAP maksymalne wydzielanie NO przypadało na

pierwszą godzinę od naświetlania, dla GSNO – na piątą godzinę, w przypadku SNP na

drugą godzinę od naświetlania. Wykazano również, że czasowy brak światła

zahamował emisję NO z SNP, co dowodzi, że jest to najbardziej światłoczuły spośród

badanych donorów (Floryszak-Wieczorek i wsp. 2006).

SNP (donor NO) w medycynie wykorzystywany jest w nagłych przypadkach

wymagających obniżenia ciśnienia tętniczego krwi (Wang i wsp. 2002). Związek ten

znalazł również zastosowanie w badaniach dotyczących wpływu NO na procesy

wzrostu i rozwoju roślin. Pierwszym produktem rozkładu SNP, poza uwalnianym NO,

jest m.in. anion cyjankowy (CN-) (Meeussen i wsp. 1992, Wnag i wsp. 2002).

Organizmy roślinne posiadają zdolność do uwalniania cyjanowodoru (HCN), związku

chemicznego zbudowanego z wodoru, węgla i azotu, tworzącego z wodą kwas

40

cyjanowodorowy, którego sole zawierające anion CN- określa się mianem cyjanków.

Cyjanowodór odgrywa regulacyjną rolę w kiełkowaniu nasion (usuwa spoczynek i

stymuluje kiełkowanie m.in. zarodków jabłoni), asymilacji azotanów, metabolizmie

cukrów i lipidów oraz w różnych reakcjach roślin na czynniki środowiskowe

(Gniazdowska i wsp. 2010). Hamuje aktywność CAT, SOD, POD – enzymów systemu

antyoksydacyjnego, reduktazy azotanowej (NR, EC 1.7.1), reduktazy azotynowej (NiR,

EC 1.7.7.1) – enzymów uczestniczących w asymilacji azotu (Oracz i wsp. 2009). Pełni

ochronną rolę przed roślinożercami oraz patogenami. Działanie tego związku związane

jest przede wszystkim z hamowaniem aktywności oksydazy cytochromowej w

mitochondrialnym łańcuchu transportu elektonów, a także aktywności wielu enzymów

posiadających jony metali w centrum aktywnym. Posiada zdolność do swobodnego

przemieszczania się z miejsc syntezy do innych części komórki, dzięki temu z łatwością

dyfunduje przez błony. HCN, powstający razem z etylenem, uczestniczy w

aklimatyzacji roślin do abiotycznych i biotycznych warunków stresowych (Siegień i

Bogatek 2006). Źródłem cyjanowodoru w roślinach są głównie glikozydy cyjanogenne

(np., amigdalina, prunazyna, linamaryna, lotaustralina), a w przypadku nasion roślin z

rodziny mydleńcowatych i kasztanowcowatych – cyjanogenne lipidy (Zagrobelny i

wsp. 2004). Cyjanowodór powstawać może również z glioksalanu i hydroksyloaminy,

produktów pośrednich fotooddychania i szlaku redukcji azotanów.

W roślinie synteza NO zachodzi w mitochondriach, peroksysomach,

chloroplastach oraz w cytoplazmie i apoplaście. Szlaki biosyntezy tego gazu obejmują:

drogi redukcyjne – związane z redukcją NO2-, jak i zależne od argininy - oksydacyjne,

enzymatyczne oraz nieenzymatyczne (Frohlich i Durner 2011, Gupta i Igamberdiev

2015). Biosynteza NO na drodze nieenzymatycznej, charakterystyczna dla apoplastu,

zachodzi w kwaśnym pH, gdzie anion NO2- przy udziale reduktantów ulega

przekształceniu do NO. Enzymy odpowiadające za syntezę NO to m.in. reduktaza

azotanowa, katalizująca redukcję NO2- do NO w obecności NADPH, reduktazy azotyn-

tlenek azotu (Ni-NOR), oksydoreduktazy ksantynowej (XOR) (Stohr i wsp. 2001, Yu i

wsp. 2014). W fazie anabolicznej kiełkowania, a także w momencie przebicia okryw

nasiennych przez korzeń zarodkowy oraz w trakcie wzrostu siewki istotną drogą

biosyntezy NO wydaje się być zachodząca przy udziale enzymu o aktywności zbliżonej

do syntazy tlenku azotu (NOS-like). Enzym ten w obecności tlenu i przy udziale

NADPH katalizuje przekształcanie L-argininy do NO i L-cytruliny (Grupta i wsp. 2011,

Mur i wsp. 2013, Krasuska i wsp. 2016). Sugeruje się u organizmów roślinnych

41

występowanie innych, zależnych od argininy, oksydacyjnych dróg syntezy NO

związanych z udziałem poliamid i hydroksyloaminy (Gupta i wsp. 2011). Utrzymanie

równowagi stężenia NO w miejscu, działania zależy od syntezy oraz usuwania tej

cząsteczki. W regulację zawartości NO zaangażowane są m.in. anionorodnik

ponadtlenkowy, jony metali przejściowych oraz podstawowe zmiatacze NO, jak

niesymbiotyczne hemoglobiny (nsHb) i glutation (GSH) (Grzegorzewska i wsp. 2009,

Gniazdowska i wsp. 2009, Hebelstrup i wsp. 2013).

Tlenek azotu uczestniczy w regulacji procesów wzrostowych i rozwojowych

roślin np. wpływając stymulująco na kiełkowanie nasion m.in. szarłatu szorstkiego

(Amaranthus retroflexus L.) (Liu i wsp. 2011), sałaty siewnej (Beligni i Lamattina

2000) czy jabłoni domowej (Malus domestica Borkh.) (Gniazdowska i wsp. 2010),

przyrost świeżej masy kukurydzy (Zea mays L.), rozwój blaszki liściowej grochu

(Pisum sativum L.) czy regulację fotomorfogenezy u rzodkiewnika (Leshem i Haramaty

1996, Hebelstrup i wsp. 2013, Simontacchi i wsp. 2013). NO jako przeciwutleniacz,

regulując zawartość ROS utrzymuje homeostazę redoks, doprowadzając do

podwyższenia odporności roślin na stresy (Grzegorzewska i wsp. 2009). W badaniach

Fan i Liu (2012), rośliny poncyrii (Poncirus trifoliata L.) poddane działaniu

nitroprusydku sodu (SNP) i stresowi suszy, charakteryzowały się niższym stężeniem

ROS, przy podwyższonej aktywności enzymów antyoksydacyjnych, a także lepszą

odpornością na utratę wody. Sposób działania NO w roślinach w warunkach

stresowych, wiąże się ze współdziałaniem tej cząsteczki z hormonami (m.in. ABA,

etylenem, kwasem jasmonowym) i innymi cząsteczkami sygnalnymi (np. H2O2)

(Simontacchi i wsp. 2013, Qiao i wsp. 2014). W warunkach suszy NO, razem z ABA i

H2O2, poprzez kinazy MAP współdziała w zamykaniu aparatów szparkowych, a także

w reakcji na zranienie z JA, czy w regulacji starzenia z kwasem salicylowym (Neill i

wsp. 2003).

Regulacja morfogenezy poprzez NO, skorelowana jest również z hormonami

roślinnymi. Zaobserwowano, że cytokinina prowadzi do szybkiego wydzielania NO w

kulturach komórkowych, co może świadczyć o udziale tego gazu w szlaku transdukcji

sygnałów zależnym od cytokininy (Tun i wsp. 2001). NO wraz z cytokininami,

współdziałając w aktywacji ekspresji genów związanych z regulacją cyklu

komórkowego, doprowadził do proliferacji komórek w kulturach rzodkiewnika (Shen i

wsp. 2013). Wykazano, że NO, podobnie jak auksyny, stymulował wzrost i tworzenie

korzeni siewek ogórka (Cucumis sativus L.) oraz uczestniczył w modulacji wygięcia

42

geotropicznego korzeni siewek soi warzywnej (Glycine max (L.) Merr.) (Pagnussat i

wsp. 2003, Hu i wsp. 2005). Doniesienia związane z interakcją NO i auksyn w

kulturach in vitro dotyczyły głównie ukorzeniania zregenerowanych pędów (Han i wsp.

2009, Kalra i Babbar 2012).

W badaniach nad wpływem NO na organizmy roślinne technikę kultur in vitro

wykorzystuje się w niewielkim stopniu. Doświadczenia te dotyczą głównie efektu

morfogenetycznego obserwowanego w wyniku działania dodanych do pożywki

donorów NO (np. SNP, SNAP). Pozytywny efekt dodanych do pożywki donorów NO

(SNP, SNAP) na organogenezę pędów oraz korzeni, uzyskano w kulturach lnu

zwyczajnego (Kalra i Babbar 2010). W przypadku kultur pochrzynu chińskiego

(Dioscorea opposita Thunb.) wykazano, że zastosowanie SNP, poprzez obniżenie

stężenia H2O2, przyczyniło się do ograniczenia brązowienia eksplantatów pochodzących

z bulw, i równocześnie do zwiększenia proliferacji kalusa oraz regeneracji pędów (Xu i

wsp. 2009). Znane są także nieliczne przykłady pozytywnego wpływu egzogennego NO

na morfogenezę niektórych gatunków roślin w kulturach in vitro w warunkach

stresowych. SNP, będący donorem NO, korzystnie wpływał na regenerację pędów w

kulturach in vitro Cymbidium w warunkach deficytu magnezu (Guha i Rao 2012).

43

2 Założenia i cel pracy

Proces morfogenezy regulowany jest endogennie (na poziomie komórkowym)

oraz egzogennie poprzez czynniki środowiskowe. W kulturach in vitro formowanie

komórek, tkanek czy organów oraz tworzenie dojrzałych organizmów roślinnych,

uzależnione jest nie tylko od predyspozycji danej rośliny do namnażania w warunkach

in vitro, ale również od warunków prowadzenia kultury. Wprowadzenie do kultur

in vitro nowych gatunków roślin, wymaga szczegółowego doboru warunków kultury.

Do kluczowych elementów, które wymagają opracowania należą m.in.: wybór

odpowiedniego eksplantatu, metody dezynfekcji, dobór składu podłoża i warunków

wzrostu w celu efektywnego mnożenia materiału roślinnego. Pomimo szerokiej wiedzy

na temat mikrorozmnażania roślin w warunkach in vitro, istniejąca zmienność

międzyrodzajowa i międzygatunkowa wymusza dobór warunków panujących

w kulturach in vitro indywidualnie dla każdego gatunku i odmiany, a nawet typu

użytkowego, jak w przypadku lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.), co umożliwia

uzyskanie jednorodnego materiału badawczego. Len już w latach 70-tych XX wieku

wykorzystywany był jako roślina modelowa w badaniach kultur tkankowych (Millam

i wsp. 1992, 2005 i literatura tam cytowana), jednak nadal niewiele wiadomo o

mechanizmach kontrolujących organogenezę tego gatunku.

Warunki klimatyczne w Polsce w okresie wegetacyjnym są bardzo zmienne

i często niekorzystnie wpływające na wzrost, rozwój i plonowanie roślin uprawnych.

Len należy do grupy roślin, która charakteryzuje się szczególną wrażliwością na deficyt

wody. Wysoka temperatura oraz silne nasłonecznienie, w trakcie okresu wegetacyjnego,

nie wpływają korzystnie na wzrost i plonowanie lnu włóknistego. Dlatego też, jednym

z głównych celów hodowli twórczych lnu, jest poprawienie zdolności plonowania

tej rośliny w niesprzyjających warunkach środowiskowych, jak np. susza.

Zainicjowanie organogenezy oraz stymulacja tego procesu w kulturach in vitro,

mają kluczowe znaczenie w mikrorozmnażaniu roślin. Na zwiększenie ilości organów

ma wpływ nie tylko optymalizacja warunków wzrostu w kulturach in vitro, ale również

działanie niekorzystnych czynników środowiskowych, m.in. takich jak: zasolenie,

deficyt wody, wysoka temperatura. Syntetyzowane w takich przypadkach reaktywne

formy tlenu oraz reaktywne formy azotu, poza negatywnym oddziaływaniem, mogą

pozytywnie (funkcja sygnalna) wpływać na rośliny. Kultury in vitro stwarzają dogodne

44

warunki do badań udziału ROS i RNS w regulacji morfogenezy zarówno w warunkach

optymalnych, jak i stresowych.

Głównym celem badań prowadzonych w ramach realizacji rozprawy doktorskiej

było porównanie zdolności morfogenetycznych lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum

L.) typu oleistego (L. var brevimulticaulis Vav., odm. Szafir) i typu włóknistego

(L. var. elongatum Vav., odm. Selena), oraz określenie mechanizmów regulacji

organogenezy przez wybrane czynniki w kulturach in vitro obu badanych odmian.

W ramach postawionego problemu badawczego poszukiwano odpowiedzi

na następujące pytania:

1. Jakie są optymalne warunki wzrostu i organogenezy pędowej i korzeniowej lnu

zwyczajnego typu oleistego (odm. Szafir) i włóknistego (odm. Selena)

w kulturach in vitro. Czy istnieją różnice w warunkach wzrostu kultur badanych

odmian?

2. Jak przebiega proces organogenezy (analiza zmian anatomicznych na podstawie

preparatów mikroskopowych) obu badanych odmian lnu zwyczajnego?

3. Czy istnieją różnice w procesie fotosyntezy, oddychania i zawartości barwników

fotosyntetycznych w kulturach in vitro obu badanych odmian lnu zwyczajnego,

rosnących w optymalnych warunkach?

4. Czy kultury in vitro lnu zwyczajnego typu oleistego i włóknistego, rosnące

w optymalnych warunkach, różnią się składem chemicznym i zawartością

metabolitów wtórnych?

5. Czy kultury lnu zwyczajnego typu oleistego i włóknistego, w optymalnych

warunkach wzrostu i organogenezy, różnią się aktywnością/wykorzystaniem

elementów systemu antyoksydacyjnego?

6. Czy istnieją różnice we wzroście i organogenezie w kulturach badanych odmian

w reakcji na stres osmotyczny?

7. Czy stres osmotyczny indukuje w kulturach lnu zwyczajnego odm. Szafir i odm.

Selena stres oksydacyjny?

8. Czy nitroprusydek sodu (SNP) wpływa na wzrost i organogenezę pędową

i korzeniową lnu zwyczajnego w warunkach in vitro? Czy istnieją różnice

we wzroście i organogenezie w kulturach obu typów lnu w reakcji na SNP?

9. Czy egzogenne działanie SNP indukuje w kulturach badanych odmian lnu stres

oksydacyjny?

45

10. Czy egzogenne działanie SNP wpływa na zmiany aktywności systemu

antyoksydacyjnego w kulturach lnu zwyczajnego typu oleistego i włóknistego?

46

3 Materiał i metody

3.1 Materiał doświadczalny

3.1.1 Charakterystyka gatunku badawczego

Badania prowadzono na kulturach in vitro lnu zwyczajnego

(Linum usitatissimum L.) typu oleistego odm. Szafir oraz typu włóknistego odm. Selena

rosnących w warunkach optymalnych i poddanych działaniu czynników, mających

na celu poprawę procesu organogenezy.

Rodzaj Linum L. należący do rodziny Linaceae liczy ponad 200 gatunków,

spośród których jedynie len zwyczajny (Linum usitatissimum L.) ma zastosowanie

praktyczne. Len zwyczajny jest rośliną jednoroczną, kwitnącą od czerwca do lipca.

Roślinę cechują proste, rozgałęzione u góry łodygi o jasnoniebieskich lub białawych

kwiatach. Owocem lnu jest niepękająca, pięciokomorowa torebka nasienna, mieszcząca

około 10 nasion zwanych potocznie siemieniem lnianym. Oleiste formy lnu (Fot. 1)

są krótkopędowe i wielkonasienne, włókniste natomiast długopędowe, drobnonasienne

(Zając i wsp. 2012, Silska i wsp. 2014).

Fot. 1. Pokrój ogólny form lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) odmiany Selena

(typ włóknisty lnu - A) oraz Szafir (typ oleisty lnu - B), (Fot. A. Adamczuk).

47

Pochodzący z obszarów śródziemnomorskich len zwyczajny to jedna

z pierwszych roślin udomowionych przez człowieka. Znane są dwie formy lnu: len

włóknisty, z którego pozyskiwany jest surowiec w postaci włókien łykowych

do wyrobu materiału o szerokim zastosowaniu, oraz len oleisty, uprawiany przede

wszystkim dla nasion bogatych w olej. Odmiany włókniste lnu uprawiane są głównie

w klimacie wilgotnym i umiarkowanym w Europie (zwłaszcza we Francji, Hiszpanii)

oraz w Azji (Chiny) i Afryce (Egipt). Len oleisty uprawiany przede wszystkim

w Indiach, Argentynie, południowej Rosji, USA, a szczególnie w Kanadzie (największy

producent i eksporter nasion lnu na świecie), krajach o suchym i umiarkowanym

klimacie (Burbulis i wsp. 2007, Popis i wsp. 2015).

Uprawa lnu w Polsce miała duże znaczenie w okresie po II wojnie światowej

do lat dziewięćdziesiątych XX wieku (Heller 2012). Jeszcze w latach siedemdziesiątych

XX wieku uprawa tej rośliny zajmowała powierzchnię ok. 130 000 ha. Obecnie uprawa

lnu w Polsce nabiera tempa, zwłaszcza ze względu na nowe możliwości wykorzystania

tej rośliny. Z roku na rok następuje zwiększanie powierzchni plantacji lnu, która w roku

2009 wynosiła dla lnu włóknistego 19 000 ha, natomiast w roku 2013 dla lnu oleistego

14 000 ha (Zając i wsp. 2012, Popis i wsp. 2015). W Polsce uprawiane są 4 odmiany lnu

oleistego: Bukoz (najnowsza), Jantarol, Oliwin oraz Szafir. Walory użytkowe siemienia

lnianego powodują coraz większe zapotrzebowanie na nasiona lnu oleistego.

Odpowiedni dobór warunków siedliskowych, wprowadzanie nowych, lepiej

plonujących odmian, pozwoliło w ostatnim dwudziestoleciu na wzrost plonowania tego

typu lnu pomimo zmniejszenia areału upraw (Heller i Wielgusz 2011). Na terenie Polski

polecanych jest osiem odmian lnu włóknistego: Milenium, Fortuna, Minerwa, Ariadna,

Artemida, Selena, Luna, Atena, Temida (Heller 2007). Ten typ użytkowy lnu -

włóknisty najlepiej plonuje w regionach gdzie dominuje wilgotna i chłodna pogoda

czyli w rejonach nadmorskich i podgórskich (Dolny Śląsk).

Len zwyczajny to roślina o wysokim potencjale cyjanogennym. Związki

cyjanogenne poza rolą ochronną przed roślinożercami i atakiem patogenów, pełnią

również ważne funkcje w metabolizmie roślin, m. in. jako źródło azotu w syntezie

aminokwasów i białek, pełnią rolę regulacyjną HCN (Siegień 2007). Potencjał

cyjanogenny lnu zmienia się podczas kiełkowania nasion, rozwoju siewek i wzrostu

roślin (Niedźwiedź-Siegień 1998). Zawartość cyjanoglikozydów wzrasta u tych roślin

na wczesnym etapie rozwoju siewek oraz przed kwitnieniem. Len zawiera dwa

cyjanoglikozydy, należące do monoglikozydów – linamarynę i lotaustralinę. Nasiona

48

większości przebadanych odmian zawierają diglikozydy cyjanogenne – linustatynę

i neolinustatynę, natomiast w niewielkiej ilości monoglikozyd – linamarynę (Oomah

i wsp. 1992, Niedźwiedź-Siegień 1998).

Len zwyczajny stanowi źródło włókien i oleju, mających zastosowanie w wielu

gałęziach przemysłu m.in. w przemyśle włókienniczym, farmaceutycznym,

spożywczym, olejarskim, jako dodatek do pasz, a także w budownictwie, czy przemyśle

meblarskim (Adamczuk i wsp. 2015).

Badania prowadzono z wykorzystaniem 7-dniowych sterylnych siewek,

fragmentów hipokotyli oraz kultur in vitro wyprowadzonych z fragmentów (4-5 mm)

hipokotyli 7-dniowych sterylnych siewek lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.),

typu włóknistego (odm. Selena) i oleistego (odm. Szafir). Nasiona odmiany Selena

pochodziły z Instytutu Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich w Poznaniu, Zakład

Doświadczalny Sielc Stary (rok zbioru 2010) natomiast odmiany Szafir z Hodowli

Roślin Strzelce Sp. z o.o. (rok zbioru 2009, 2012).

3.2 Sterylizacja i kiełkowanie nasion lnu

3.2.1 Sterylizacja nasion

Sterylizację nasion lnu (4-5 g) przeprowadzano w komorze z laminarnym przepływem

powietrza (typ „ Biohazard” ESCO NC2-4LB) w następujących etapach:

a) Płukanie nasion w 50 ml 70% alkoholu etylowym przez 1 minutę w sterylnej

zlewce na mieszadle magnetycznym,

b) Płukanie nasion w sterylnej wodzie destylowanej przez 1 minutę,

c) Zasadnicza sterylizacja nasion:

- odmiana Szafir – płukanie nasion w 100 ml 0,1% (w/v) roztworu chlorku

rtęciowego (HgCl2) przez 15 minut,

- odmiana Selena - płukanie nasion w 100 ml 0,06% (w/v) roztworu HgCl2

przez 5 minut w sterylnych zlewkach na mieszadle magnetycznym,

d) Czterokrotne płukanie nasion sterylną wodą destylowaną przez: 1 min., 5 min.,

10 min. i 15 min.

3.2.2 Warunki kiełkowania nasion

Wysterylizowane nasiona lnu wykładano równomiernie (około 20-25

sztuk/szalkę) na sterylne podłoże agarowe (0,75% w/v) przy użyciu sterylnej pęsety.

49

Szalki owijano parafilmem i ustawiano do kiełkowania w pomieszczeniu fitotronowym,

gdzie panowały następujące warunki: długość dnia 16h, temperatura dzień/noc-

23oC/18

oC, wilgotność powietrza 60%, natężenie promieniowania

PAR – 50 µmol m-2

s-1

.

3.3 Skład podłoży hodowlanych oraz warunki wzrostu kultur in vitro

3.3.1 Skład i przygotowanie podłoży do wzrostu kultur in vitro

Pożywki do wzrostu kultur przygotowywano z wcześniej sporządzonych

roztworów wyjściowych przechowywanych w temperaturze 4oC (mikro-

i makroelementy) oraz -10oC (witaminy i składniki organiczne) lub gotowych podłoży

wg Murashige i Skoog (MS) oraz wg Gamborga (B5) zawierających makroelementy,

mikroelementy oraz witaminy opisane przez Murashige i Skoog (1962) i Gamborga

i wsp. (1968). Odpowiednie ilości sacharozy i kazeiny (pożywka MS) lub sacharozy

(pożywka B5) dodawano bezpośrednio do pożywki. Do podłoży dodawano hormony

roślinne (auksyny i cytokininy) w odpowiednich stężeniach sprzyjających

organogenezie pędowej lub korzeniowej. Pożywki zestalano agarem (0,75% w/v)

i doprowadzono ich pH do wartości 5,7-5,9 przy pomocy 0,1N HCl i 0,1N NaOH.

Podłoża sterylizowano w autoklawie (ASL 80B) przez 30 minut w temperaturze 121oC

pod ciśnieniem 1 atm.

Przetestowano trzy warianty pożywki, których skład podano w tabeli 1:

a) wg Murashige i Skoog (MS)

b) wg Gamborga (B5)

c) MS (makroelementy) + B5 (mikroelementy i składniki organiczne) (MS+B5)

Do pożywek dodawano: cytokininę (benzyloaminopurynę - BA), auksyny (kwas

naftylo-1-octowy – NAA; kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy - 2,4-D) w proporcjach:

a) BA (1 mg l-¹) + 2,4-D (0,025 mg l

-¹) - w celu umożliwienia organogenezy

pędowej;

b) NAA (1mg l-¹) + BA (0,025 mg l

-¹) – w celu umożliwienia organogenezy

korzeniowej.

50

Tab. 1. Skład pożywek hodowlanych

Pożywki

Składniki

Murashige i Skoog –

stężenie w pożywce

(mg l-¹)

MS

Gamborga

– stężenie w pożywce

(mg l-¹)

B5

Murashige i Skoog +

Gamborga – stężenie w

pożywce (mg l-¹)

MS + B5

Makroelementy

NH4NO3 1650 - 1650

KNO3 1900 2500 1900

CaCl2x2H2O 440 113 440

MgSO4x7H2O 370 250 370

KH2PO4 170 - 170

(NH4)2SO4 - 134 -

NaH2PO4xH2O - 130,4 -

Mikroelementy

KJ 0,83 0,75 0,75

H3BO3 6,2 3,0 3,0

MnSO4x4H2O 22,3 - -

MnSO4xH2O - 10 10

ZnSO4x7H2O 8,6 2,0 2,0

Na2MoO4x2H2O 0,25 0,25 0,25

CuSO4x5H2O 0,025 0,025 0,025

CoCl2x6H2O 0,025 0,025 0,025

Na2xEDTA 37,3 37,3 37,3

FeSO4x7H2O 27,8 27,8 27,8

Składniki organiczne

M-inozytol 100 100 100

Kwas nikotynowy 0,5 1,0 1,0

Pirydoksyna 0,5 1,0 1,0

Tiamina 0,1 10 10

Glicyna 2,0 - -

Cukier

Sacharoza 30000 20000 20000

Białko

Kazeina 1000 - -

51

3.3.2 Badanie oddziaływania wybranych cytokinin i auksyn na proces

organogenezy

Warianty pożywek opisane w podrozdziale 3.3.1. wzbogacono o wybrane

cytokininy i auksyny. Do każdej dodawano hormony sprzyjające:

a) Organogenezie pędowej – dodawano kolejno wybrane cytokininy oraz auksynę

2,4-D w stężeniach:

BA (1mg l-¹) + 2,4-D (0,025 mg l

-¹)

Kinetynę (KIN) (1mg l-¹) + 2,4-D (0,025 mg l

-¹)

Tidiazuron (TDZ) (1mg l-¹) + 2,4-D (0,025 mg l

-¹)

b) Organogenezie korzeniowej – dodawano kolejno wybrane auksyny

oraz cytokininę BA w stężeniach:

2,4-D (1mg l-1

) + BA (0,025mg l-1

)

NAA (1mg l-1

) + BA (0,025 mg l-1

)

Kwas indolilo-3-masłowy (IBA) (1mg l-1

+ BA (0,025 mg l-1

)

3.3.3 Badanie wzajemnych stężeń cytokininy i auksyny na efektywność procesu

organogenezy

Wybrane na podstawie doświadczenia opisanego w podrozdziale 3.3.1. pożywki

odpowiednie do wzrostu i rozwoju kultur odm. Szafir oraz odm. Selena wzbogacono

o różne warianty stężeń wybranych hormonów (podrozdział 3.3.2.) w celu:

a) Obserwacji najefektywniejszej organogenezy pędowej – dodawano cytokininę

BA i auksynę 2,4-D w takiej ilości, aby stosunek stężeń każdego z tych

hormonów w pożywce odpowiadał wartościom przedstawionym w tabeli 2,

b) Obserwacji najefektywniejszej organogenezy korzeniowej – dodawano auksynę

NAA i cytokininę BA w takiej ilości, aby stosunek stężeń każdego z tych

hormonów w pożywce odpowiadał wartościom przedstawionym w tabeli 3.

52

Tab. 2. Wzajemne stężenia cytokininy BA i auksyny 2,4-D w poszczególnych

wariantach pożywki

Wariant pożywki BA [mg l-1

] 2,4-D [mg l-1

] 2,4-D : BA

1 1,0 0,0 0 : 1

2 1,0 0,025 1 : 40

3 1,0 0,05 1 : 20

4 1,0 0,1 1 : 10

5 1,0 0,2 1 : 5

6 1,0 0,5 1: 2

7 1,0 0,75 1 : 1,33

8 1,0 1,0 1 : 1

Tab. 3. Wzajemne stężenia auksyny NAA i cytokininy BA w poszczególnych

wariantach pożywki

Wariant pożywki NAA [mg l-1

] BA [mg l-1

] BA : NAA

1 1,0 0,0 0 : 1

2 1,0 0,025 1 : 40

3 1,0 0,05 1 : 20

4 1,0 0,1 1 : 10

5 1,0 0,2 1 : 5

6 1,0 0,5 1 : 2

7 1,0 0,75 1 : 1,33

8 1,0 1,0 1 : 1

3.3.4 Warunki wzrostu eksplantatów

Eksplantaty hipokotylowe (4-5 mm fragmenty), pochodzące ze sterylnych 7-

dniowych siewek lnu wykładano w komorze z laminarnym przepływem powietrza na

określone pożywki zestalone agarem (0,75% (w/v); 10 sztuk/szalka). Szalki z

eksplantatami zabezpieczano parafilmem i ustawiano do wzrostu na 28 dni w

pomieszczeniu fitotronowym, gdzie panowały warunki opisane w podrozdziale 3.2.2.

3.4 Badanie wpływu stresu osmotycznego na proces organogenezy

Pożywki z dodatkiem hormonów sprzyjających organogenezie pędowej

i korzeniowej lnu odm. Szafir i Selena (opis w p. 3.3.1.-3.3.3.) modyfikowano dodając

cukier w ilości (zmodyfikowana metoda wg Haq i wsp. 2009):

a) Pożywka MS:

MS + sacharoza 30000 mg l-1

pożywki – kontrola (K)

53

MS + sacharoza 2x 30000 mg l-1

pożywki – pierwszy wariant stresu (S I)

MS + sacharoza 3x 30000 mg l-1

pożywki– drugi wariant stresu (S II)

b) Pożywka MS:

MS + sorbitol 15000 mg l-1

+ maltoza 15000 mg l-1

pożywki – kontrola

(K)

MS+ sorbitol 2x 15000 mg l-1

+ maltoza 2x 15000 mg l-1

pożywki –

pierwszy wariant stresu (S I)

c) Pożywka B5:

B5 + sacharoza 20000 mg l-1

pożywki – kontrola (K)

B5 + sacharoza 2x 20000 mg l-1

pożywki – pierwszy wariant stresu (S I)

B5 + sacharoza 3x 20000 mg l-1

pożywki – drugi wariant stresu (S II)

Zastosowano różne warianty wzrostu kultur na pożywkach zawierających

zwiększoną zawartość cukrów. Warianty te podano w tabeli 4.

Tab. 4. Warunki wzrostu kultur in vitro lnu zwyczajnego na pożywkach ze zwiększoną

zawartością cukrów

Odmiana Organogeneza Warianty pożywki Warianty wzrostu kultury

Szafir

pędowa

SI

K (7 dni)+ S (7 dni) + K (14 dni)

K (5 dni) + S (5dni) + K (18 dni)

SII

K (7 dni)+ S (7 dni) + K (14 dni)

K (5 dni) + S (5dni) + K (18 dni)

korzeniowa SII

K (7 dni)+ S (7 dni) + K (14 dni)

K (5 dni) + S (5dni) + K (18 dni)

Selena

pędowa

SI K (7 dni)+ S (7 dni) + K (14 dni)

SII K (7 dni)+ S (7 dni) + K (14 dni)

korzeniowa

SI K (7 dni)+ S (7 dni) + K (14 dni)

SII K (7 dni)+ S (7 dni) + K (14 dni)

Po przeprowadzonych badaniach wstępnych do dalszych analiz wybrano

pogrubione w tabeli 5 warianty wzrostu kultur na pożywkach zawierających dwukrotne

(S I) i trzykrotne (S II) zwiększenie sacharozy w pożywce.

Warunki wzrostu eksplantatów opisano w podrozdziale 3.3.4.

54

3.5 Badanie wpływu nitroprusydku sodu (SNP) na proces organogenezy

3.5.1 Badanie wpływu SNP dodanego bezpośrednio do pożywki na organogenezę

Pożywkę z dodatkiem hormonów sprzyjających organogenezie pędowej lnu

odm. Szafir (opis w p. 3.3.1. - 3.3.3) sterylizowano, a następnie przy pomocy filtrów

strzykawkowych (Ahlstrom, średnica: 33 mm, wielkość porów: 0,2 µm) dodawano SNP

w stężeniach podanych w tabeli 5 (metoda wg Karla i Babbar 2010).

Tab. 5. Stężenia SNP dodanego bezpośrednio do pożywki

Len zwyczajny

(L. usitatissimum) Warianty kultur

Stężenie SNP

[mg l-1

]

odm. Szafir kultury pędowe

2µM

4µM

6µM

25µM

50µM

Warunki wzrostu eksplantatów na określonych wariantach pożywki opisano w

podrozdziale 3.3.4.

3.5.2 Badanie wpływu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP na

organogenezę

Eksplantaty hipokotylowe badanych odmian lnu wykładano na pożywkę z

dodatkiem hormonów sprzyjających organogenezie pędowej lub korzeniowej. Rodzaj

pożywki i hormonów, a także ich stężenia odpowiednie dla danej odmiany lnu wybrano

na podstawie wcześniejszych doświadczeń, opisanych w p. 3. 3.1. - 3.3.3.

55

Ryc. 4. Schemat przedstawiający eksplantaty hipokotylowe lnu zwyczajnego

(Linum usitatissimum L.) odmiany Szafir i Selena poddane działaniu par

wydzielających się z wodnego roztworu SNP.

Otwarte szalki z eksplantatami umieszczano w szklanej przeźroczystej komorze,

do której wstawiano również szalkę z odpowiednią pojemnością (Tab. 6) roztworu SNP

(Ryc. 4). Komorę zamykano wieczkiem i szczelnie okręcano parafilmem. Komorę

ustawiano w pomieszczeniu fitotronowym i poddawano naświetleniu (czas ekspozycji

podano w tabeli 6) światłem białym o natężeniu napromienienia 150µmol m-2

s-1

(metoda zmodyfikowana wg Floryszak-Wieczorek i wsp. 2006, Gniazdowska i wsp.

2007). W tych warunkach eksplantaty traktowane były oparami gazów wydzielających

się pod wpływem silnego promieniowania z wodnego roztworu SNP. Kultury kontrolne

poddawano naświetleniu światłem o jednakowym natężeniu i czasie ekspozycji jak

eksplantaty poddane działaniu SNP. Po upływie określonego czasu ekspozycji szalki z

eksplantatami wyjmowano w komorze z laminarnym przepływem powietrza, gdzie

przekładano eksplantaty na sterylną pożywkę (10 sztuk/szalka), a następnie

przenoszono do wzrostu w warunkach opisanych w p. 3.2.2.

56

Tab. 6. Czas i warunki ekspozycji kultur in vitro lnu zwyczajnego na opary gazów

wydzielających się z wodnego roztworu SNP

Len zwyczajny

(L. usitatissimum)

Warianty kultur

Czas ekspozycji

[h]

Stężenie SNP

odm. Szafir

pędowe

korzeniowe

bez hormonów

3

5 ml 5mM

10 ml

20 ml

30 ml

40 ml 5mM; 10mM

24 40 ml

250µM;

500µM; 5mM;

10mM

odm. Selena

pędowe

korzeniowe

bez hormonów

3

5 ml

5mM

10 ml

20 ml

30 ml

3.6 Badanie wpływu c-PTIO (ang. 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-


kulturach in vitro poddanych działaniu par wydzielających się z

wodnego roztworu SNP

Eksplantaty hipokotylowe badanych odmian lnu wykładano na sterylną bibułę

nasączoną pożywką (odpowiednią dla danej odmiany lnu wybraną na podstawie

wcześniejszych doświadczeń, opisanych w p. 3.3.1. - 3.3.3.) z dodatkiem hormonów

sprzyjających organogenezie pędowej lub korzeniowej oraz 15 ml 0,3 mM c-PTIO

(„wymiatacz” tlenku azotu).

57

Ryc. 5. Schemat przedstawiający eksplantaty hipokotylowe lnu zwyczajnego

(Linum usitatissimum L.) odmiany Szafir i Selena poddane działaniu par

wydzielających się z wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO.

Otwarte szalki z eksplantatami umieszczano w szklanej przeźroczystej komorze,

do której wstawiano szalkę z wybraną na podstawie wcześniejszego doświadczenia

opisanego w p. 3.5.2 pojemnością roztworu 5mM SNP (Ryc. 5). Komorę zamykano

wieczkiem i szczelnie okręcano parafilmem. Komorę ustawiano w pomieszczeniu

fitotronowym i poddawano naświetleniu przez 3h światłem białym o natężeniu

napromienienia 150 µmol m-2

s-1

(metoda zmodyfikowana wg Floryszak-Wieczorek i

wsp. 2006, Gniazdowska i wsp. 2007). W tych warunkach eksplantaty traktowane były

oparami gazów wydzielających się pod wpływem silnego promieniowania z wodnego

roztworu SNP. Po upływie określonego czasu ekspozycji szalki z eksplantatami

wyjmowano w komorze z laminarnym przepływem powietrza, gdzie przekładano

eksplantaty na sterylną pożywkę (10 sztuk/szalka), a następnie przenoszono do wzrostu

w warunkach opisanych w p. 3.2.2.

3.7 Analiza wzrostu materiału doświadczalnego

Obserwacje kultur prowadzono cotygodniowo przez 28 dni dokonując oceny

procesu organogenezy (% reagujących eksplantatów oraz liczby organów

przypadających na eksplantat) licząc reagujące eksplantaty i formujące się organy:

58

% reagujących ekspl. =

x 100%

liczba organów/ekspl. =

gdzie:

ekspl. - eksplantat

Wykonano również pomiary świeżej masy (g) (waga RADWAG E42S)

oraz suchej masy (g). Pojedyncze eksplantaty po zważeniu świeżej masy były suszone

przez 24 h w 105oC (suszarka Memmert UN110) i ponownie ważone w celu oznaczenia

suchej masy. Średnie wartości świeżej i suchej masy stanowiły podstawę do obliczenia

zawartości wody w kulturach:

gH2O g-1

św.m.=

gH2O g-1

s.m. =

gdzie:

św.m. – średnia świeża masa eksplantatów

s.m. – średnia sucha masa eksplantatów

3.8 Analiza mikroskopowa początkowych etapów organogenezy pędowej

i korzeniowej w hipokotylach lnu zwyczajnego

Do zbadania przebiegu najwcześniejszych zmian anatomicznych podczas

organogenezy pędowej i korzeniowej lnu odm. Szafir (typ oleisty) i odm. Selena (typ

włóknisty), przez 7 kolejnych dni wzrostu kultur pędowych i korzeniowych (warunki

wzrostu kultur p. 3.3.1. - 3.3.3.) pobierano po kilka eksplantatów, których źródłem były

7-dniowe sterylne siewki badanych odmian. Materiał roślinny utrwalano przez 24

godziny, początkowo pod zmniejszonym ciśnieniem, w FAA (formalino–aceto-alkohol,

zawierający 37% formaldehyd, 100% kwas octowy lodowaty i 70% alkohol etylowy w

stosunku objętościowym 5:5:90, wg Gerlacha 1972). Po utrwaleniu materiał płukano

trzykrotnie w 70% alkoholu etylowym i w nim przechowywano materiał do czasu

wykonywania skrawków.

Wykonywano preparaty mikroskopowe z przekrojów poprzecznych hipokotyli

według następujących procedur:

1) Preparaty półtrwałe: materiał utrwalony w FAA i przechowywany w 70%

alkoholu etylowym przepłukiwano w H2O destylowanej, następnie zatopiono

59

w 3% agarze i cięto na skrawki o grubości 30 µm z wykorzystaniem mikrotomu

wibracyjnego (Leica VT 1200S). Skrawki barwiono przez kilka minut 0,02%

błękitem metylenowym, przepłukiwano wodą i zamykano w 50% glicerynie.

2) Preparaty trwałe przygotowywano techniką parafinową. Utrwalony materiał

odwodniono dodatkowo w szeregu alkoholowym o rosnących stężeniach

w dwóch zmianach czystego ksylenu, następnie w cieplarce w dwóch zmianach

parafiny o temperaturze topnienia 56-58oC. Po odwodnieniu materiał zatapiano

w parafinie z 5% domieszką wosku pszczelego. Bloczki parafinowe cięto na

mikrotomie rotacyjnym Leica RM 2245 na skrawki o grubości 15 µm. Preparaty

barwiono 1% safraniną w 50% alkoholu etylowym oraz zielenią trwałą w 92%

alkoholu etylowym, następnie odwadniano w izopropanolu i zamykano

w Euparolu (metoda wg Garlacha 1972).

Mikrofotografie z preparatów anatomicznych wykonano w mikroskopie

Olympus BX53 przy użyciu programu cellSens Standard. Dodatkowo wykonano

fotografie pojedynczych eksplantatów (obraz morfologiczny) pochodzących z 10-12-

dniowej kultury pędowej i korzeniowej w mikroskopie stereoskopowym Leica M205

FA z użyciem programu LAS MultiFocus, który umożliwia automatyczną akwizycję

obrazów w osi Z.

3.9 Oznaczanie zawartości barwników fotosyntetycznych

Zawartość barwników fotosyntetycznych (chlorofilu a i b oraz sumy

karotenoidów) oznaczano metodą wg Wellburn (1994). Do badań wykorzystano 7-

dniowe sterylne siewki, fragmenty hipokotyli, kultury pędowe po 5, 14 i 28 dniu

wzrostu (opis warunków wzrostu p. 3.3.1. - 3.3.4.) badanych odmian. 300 mg materiału

roślinnego ucierano z 5 ml 95% alkoholu etylowego i odrobiną piasku morskiego.

Próby wirowano (wirówka MPW 351R) przy 10 000 g przez 10 minut. Absorbancję

ekstraktów odczytywano w spektrofotometrze (CE 2501, Cecil) przy długościach fal:

470 nm, 664,2 nm i 648,6 nm wobec próby ślepej (95% alkohol etylowy). Wszystkie

czynności wykonywano przy słabym oświetleniu, aby zapobiec fotooksydacji

chlorofilu.

Stężenie chlorofilu a i b oraz karotenoidów obliczono wg następujących wzorów:

Chlorofil a (Chla) = 13,36 A 664,2 – 5,19 A 648,6

Chlorofil b (Chlb) = 27,43 A 648,6 – 8,12 A 664,2

Chl a+b = 5,24 A 664,2 + 22,24 A 648,6

60

Karotenoidy = (1000 A470 – 2,13 Chla – 97,64 Chlb) / 209

gdzie

A470, A648,6, A664,2 – absorbancja przy długości fali 470 nm, 648,6 nm, 664,2 nm

Stężenie chlorofilu a i b oraz sumy karotenoidów wyrażano w [µg g-1

św. m.].

3.10 Oznaczanie natężenia fotosyntezy netto i oddychania ciemniowego

Natężenie fotosyntezy netto i oddychania ciemniowego oznaczono

w 7-dniowych sterylnych siewkach, kulturach pędowych po 5, 14 i 28 dniu wzrostu

(opis warunków wzrostu p. 3.3.1. - 3.3.4.) badanych odmian. Do pomiarów natężenia

fotosyntezy i oddychania ciemniowego stosowano analizator CO2

w podczerwieni (LI 6262, Li-COR). Pomiary wykonywano w gazowym układzie

otwartym, umieszczając badany materiał roślinny w kamerze fotosyntetycznej

o pojemności około 200 ml (Busch i wsp. 2013). Szybkość przepływu powietrza

w układzie otwartym wynosiła 0,5 l/min. Pomiarów dokonywano przy natężeniu

napromienienia wynoszącym 150 µmol m-2

s-1

. Temperatura wewnątrz kamery nie

przekraczała 25oC. W układzie wykorzystywano atmosferyczne stężenie CO2 (ok. 400

ppm). Otrzymane wyniki natężenia fotosyntezy netto (PN) oraz oddychania

ciemniowego (DR) wyrażano w [µmol CO2 g-1

św.m. min-1

].

3.11 Izolacja i identyfikacja związków chemicznych przy użyciu

chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS)

3.11.1 Izolacja lotnych związków organicznych (LZO) w kulturach pędowych lnu

zwyczajnego z wykorzystaniem mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej

(SPME)

Do oznaczeń wykorzystano 7-dniowe sterylne siewki i kultury pędowe

po 5-tym, 14-tym i 28-mym dniu wzrostu (opis warunków wzrostu p. 3.3.1. - 3.3.4.)

badanych odmian. Ekstrakcję lotnych związków organicznych (LZO) prowadzono

poprzez umieszczenie włókna ekstrakcyjnego w fazie nadpowierzchniowej (wariant

ang. Headspace-Solid Phase Microextraction, HS-SPME) nad materiałem roślinnym.

Izolację związków prowadzono przy użyciu włókna z fazą stacjonarną CAR/PDMS

Carboxen/Polidimetylosiloksan (CAR/PDMS) o grubości 75 µm. W celu dokonania

izolacji LZO próbkę materiału roślinnego o masie 2g umieszczano w szklanej fiolce

o pojemności 15 ml. Próbkę inkubowano w łaźni wodnej w 40oC przez 10 minut.

Następnie do fazy nadpowierzchniowej nad próbką wprowadzano włókno do SPME.

61

Proces izolacji lotnych związków prowadzono w czasie 30 minut. Przez cały czas

kontaktu włókna z fazą gazową, roztwór utrzymywano w temperaturze 40oC. Po

zakończeniu ekstrakcji włókno przenoszono do dozownika aparatu GC-MS. Włókno

wysuwano w głąb dozownika na głębokość 2 cm. Etap termodesorpcji trwał 30 minut.

Do oznaczeń wykorzystano chromatograf gazowy HP 6890 N (Agilent Technologies)

z elektroniczną kontrolą ciśnienia (EPC) 59864B, wyposażony w detektor MS 5973,

a także kolumnę kapilarną HP-5MS (30m 0,25mm 0,25 m) oraz dozownik typu

split/splitless. Warunki pracy układu chromatograficznego przedstawiono w tabeli 7.

Tab. 7. Warunki pracy układu chromatograficznego (GC/MS)

Parametr Wartość

Temperatura początkowa pieca 38 oC

Izoterma początkowa 2 min

Szybkość wzrostu temperatury 5

oC/min do 100

oC

10 oC/min do 270

oC

Temperatura dozownika 250 oC

Gaz nośny Hel

Objętościowe natężenie przepływu gazu nośnego 1 mL/min

Tryb pracy dozownika splitless

Odcinanie rozpuszczalnika brak

Warunki pracy

detektora

Tryb pracy detektora SCAN

Temperatura źródła jonów 230 oC

Temperatura kwadrupola 150 oC

Temperatura linii transferowej 280 oC

Zakres mas m/z 15 - 300

Czas analizy 80 min

3.11.2 Izolacja związków organicznych w ekstraktach metanolowych kultur

pędowych lnu zwyczajnego

Analizę związków organicznych w ekstraktach metanolowych kultur pędowych

lnu zwyczajnego wykonano wg zmodyfikowanej metody opisanej przez Zhou i wsp.

(2012). Oznaczenia wykonano w 7-dniowych sterylnych siewkach i kulturach

pędowych po 5-tym, 14-tym i 28-mym dniu wzrostu (opis warunków wzrostu p. 3.3.1. -

3.3.4.) badanych odmian. Materiał roślinny suszono w suszarce przez 24 godziny

w temperaturze 50oC. 500 mg wysuszonego materiału homogenizowano w moździerzu,

a następnie dodawano 3 ml mieszaniny metanolu z wodą w stosunku 4:1 (v/v) oraz

60 µl ksylitolu (0,1 mg ml-1

) jako wzorca wewnętrznego. Próby mieszano i inkubowano

62

w łaźni z ultradźwiękami (Elmasonic S80H) w przez 40 minut. Następnie próby

przesączano przez bibułę filtracyjną. Otrzymany supernatant odparowywano do sucha

w przy użyciu wyparki próżniowej (350, Unipan) w temperaturze 40oC. Tak

przygotowany materiał roślinny poddano procesowi derywatyzacji. W tym celu

wysuszony materiał rozpuszczono w 80 µl bezwodnej pirydyny oraz 200 µl N,O -

Bis(trimetylosililo)trifluoroacetamidu (BSTFA) i ogrzewano w temperaturze 70oC przez

30 min. Analizę otrzymanych ekstraktów prowadzono w układzie GC-MS.

3.11.3 Identyfikacja otrzymanych związków

Podczas analizy chromatograficznej uzyskano dwa rodzaje niezależnych

od siebie informacji identyfikacyjnych: dane retencyjne oraz widma mas. Widma mas

zarejestrowane dla poszczególnych związków organicznych porównywano z widmami

mas zgromadzonymi w bazie danych NIST MS. W drugim etapie identyfikacji

obliczono indeksy retencji (IRx) związków z wykorzystaniem wzoru na arytmetyczny

indeks retencji Van den Doola i Kratza (1963), stosowanego w przypadku analiz

prowadzonych z programowanym wzrostem temperatury:

)()1(

)()(100100IR x

ztzt

ztxtz

RR

RR

gdzie:

tR(x) – czas retencji badanego związku, tR(z) i tR(z+1) – czas retencji n-alkanów

zawierających odpowiednio z i z+1 atomów węgla w cząsteczce, pomiędzy którymi

znajduje się związek x.

Wyznaczone wartości IR poszczególnych związków porównywano

z wartościami literaturowymi IR dostępnymi w komputerowych bazach danych (m.in.

baza danych Zakładu Chemii Środowiska UwB). Związek uznano za poprawnie

zidentyfikowany, jeśli otrzymane widmo mas wykazywało zgodność z widmem w bazie

danych, a różnica między wyliczonym a literaturowym indeksem retencji była

nie większa niż 10 jednostek. W przypadkach, gdy nie był dostępny literaturowy

indeks retencji, a widmo mas było jednoznaczne, identyfikację prowadzono tylko

w oparciu o widmo mas.

3.12 Oznaczanie zawartości białka w ekstrakcie enzymatycznym

Zawartość białka oznaczano metodą wg Bradforda (1976) w ekstrakcie

enzymatycznym przygotowanym w sposób opisany w podrozdziale 3.13.1. i 3.15.2.

63

Z każdej próby pobierano 0,1 ml ekstraktu i dodawano 1 ml odczynnika Bradforda.

Próby mieszano i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie

mierzono absorbancję przy użyciu spektrofotometru (BECKMAN, DU730) przy

długości fali 595 nm, wobec próby ślepej (0,1 ml buforu ekstrakcyjnego i 1 ml

odczynnika Bradforda).

Stężenie białek oznaczano na podstawie krzywej wzorcowej sporządzonej

dla roztworów albuminy (25-250 g ml-1

) i wyrażono w [mg g-1

św.m.].

3.13 Oznaczanie zawartości metabolitów wtórnych

3.13.1 Oznaczanie zawartości antocyjanów i związków fenolowych

Zawartość wybranych związków fenolowych: fenylopropanoidy, flawonoidy

oraz antocyjany oznaczano metodą wg Kubo i wsp. (1999). 500 mg tkanki

homogenizowano z 2 ml 100mM buforu fosforanowego o pH 7,8 zawierającego 1mM

askorbinian. Homogenat przenoszono do probówek wirówkowych i wirowano

w temperaturze 4oC przy 22 000 g przez 30 minut. Następnie oznaczano absorbancję

w nierozcieńczonym ekstrakcie za pomocą spektrofotometru (BECKMAN) przy fali

o długości 600 nm (antocyjany). Po dziesięciokrotnym rozcieńczeniu mierzono

absorbancję przy długości fali 320 nm (związki fenolowe: fenylopropanoidy

+ flawonoidy).

Oznaczenia wykonano w 7-dniowych sterylnych siewkach, kulturach pędowych

i korzeniowych po 5, 14 i 28 dniu wzrostu (opis warunków wzrostu p. 3.3.1. - 3.3.4.)

badanych odmian.

Wyniki przedstawiono jako ilość jednostek absorbancji (U) na 1 mg białka.

1 U – ilość białka w ekstrakcie, wykazująca absorbancję (A)= 1, przy długości fali λ=

320 nm/ 600 nm w szklanej kuwecie o przekroju 1 cm.

3.13.2 Oznaczanie zawartości związków polifenolowych i tanin

Zawartość całkowita polifenoli i tanin oznaczono spektrofotometrycznie

wg metody opisanej przez Makkar i wsp. (1995) oraz Żebrowskiego (2009) przy użyciu

odczynnika Folin-Ciocalteau. Materiał roślinny suszono w suszarce przez 24 godziny

w temperaturze 50oC. 150-200 mg wysuszonego materiału homogenizowano

w moździerzu, następnie dodawano 3 ml 70% acetonu. Próby przenoszono

do probówek wirówkowych i inkubowano w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze

64

pokojowej. Następnie próby wirowano w temperaturze 4oC przez 15 minut przy 20 000

g. Zebrany supernatat przetrzymywano w łaźni lodowej i wykorzystano do oznaczenia

zawartości polifenoli i tanin.

W celu oznaczenia całkowitej zawartości polifenoli (Ctot) do 0,1 ml

odwirowanego ekstraktu dodawano 2 ml 2% węglanu sodu (Na2CO3). Po upływie

2 minut dodawano 0,1 ml odczynnika Folin-Ciocalteu, rozcieńczonego uprzednio

H2O destylowaną w stosunku 1:1. Próby pozostawiono w ciemności, w temperaturze

pokojowej na 30 minut. Próba zerowa zamiast ekstraktu zawierała 0,1 ml 70% acetonu.

Następnie mierzono absorbancję przy długości fali 750 nm. Zawartość polifenoli

odczytano wg krzywej wzorcowej sporządzonej dla roztworu kwasu taninowego w

zakresie stężeń 0 – 16 µg/ml. Zawartość polifenoli przedstawiono w [mg g-1

s. m.].

W celu określenia zawartości tanin wykonano oznaczenie stężenia fenoli

niezwiązanych z poliwinylopolipirolidonem (PVPP). Do probówki dodano 0,1 g PVPP,

1 ml H2O destylowanej oraz 1 ml ekstraktu. Próby mieszano i inkubowano 15 minut

w temperaturze 4oC. Następnie wirowano w temperaturze 4

oC przez 15 minut przy

20 000 g. W zebranym ekstrakcie oznaczono zawartość niezwiązanych z PVPP

polifenoli (CPVPP) według procedury opisanej dla oznaczenia całkowitej zawartości

polifenoli (Ctot). Absorbancję zmierzono przydługości fali 725 nm.

Oznaczenia wykonano dla wariantów doświadczalnych wymienionych w p. 3.13.1.

Zawartość tanin (CT) obliczono ze wzoru:

Ct= Ctot - CPVPP

Ct – stężenie tanin

Ctot – całkowite stężenie polifenoli

CPVPP – taniny nie związane z PVPP

Zawartość tanin wyrażono w [mg g-1

s. m.].

3.14 Oznaczenia parametrów stresu oksydacyjnego

3.14.1 Oznaczanie zawartości H2O2

Pomiar zawartości H2O2 w kulturach dokonano w wariantach badawczych

wybranych na podstawie wcześniejszych doświadczeń (p. 3.4. i 3.5.2.) metodą

wg Velikova i wsp. (2000).

1 g materiału roślinnego rozcierano w zimnym moździerzu (0-4oC) z piaskiem

morskim oraz 1,5 ml 0,1% kwasu trichlorooctowego (TCA). Następnie ekstrakty

65

wirowano przy 15 000 g przez 15 minut w 4oC w wirówce MPW 351R. Do 0,25 ml

supernatantu dodawano 0,25 ml buforu K-fosforanowego (10 mM, pH=7,0) oraz 0,5 ml

1M jodku potasu (KJ). Próba zerowa zawierała 0,5 ml 10 mM buforu K-fosforanowego

o pH=7,0 oraz 0,5 ml 1M KJ. Absorbancję roztworu odczytano przy długości fali 390

nm na spektrofotometrze (BECKMAN). Zawartość H2O2 w próbie odczytywano

z krzywej sporządzonej z użyciem roztworów wzorcowych H2O2 w zakresie

5– 200 nmol ml-1

.

Zawartość H2O2 wyrażono w [nmol g-1

św. m.].

3.14.2 Oznaczanie zawartości produktów peroksydacji lipidów reagujących

z kwasem tiobarbiturowym (TBARS)

Zawartość produktów reakcji z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) oznaczano

w wariantach badawczych wybranych na podstawie wcześniejszych doświadczeń

(p. 3.4. i 3.5.2.) wykorzystując zmodyfikowaną metodę wg Singh i Verma (1995).

Do rozdrobnionego materiału roślinnego dodawano: 1 ml 0,5% kwasu tiobarbiturowego

(TBA) w 20% TCA, 1 ml H2O oraz 30µl 2% butylohydroksytoluenu (BHT). Próby

inkubowano w łaźni wodnej (MILL 147) w temperaturze 95oC przez 30 minut, po czym

umieszczano w łaźni lodowej na 10 minut. Następnie próby odwirowywano w wirówce

(MPW 351R) przy 10 000 g przez 10 minut. Absorbancję oznaczano za pomocą

spektrofotometru (BECKMAN) przy długości fal: 532 i 600 nm. Zawartość TBARS

wyrażano jako stężenie aldehydu malonowego (MDA), które obliczano używając

współczynnika ekstynkcji dla kompleksu MDA-TBA (155 mM-1

x cm-1

) według wzoru:

TBARS = (A532 – A600) x V / x L x d x św.m.

A532, A600 – współczynnik ekstynkcji dla długości fal odpowiednio 532 i 600 nm

L – molowy współczynnik ekstynkcji dla TBARS [155 mM-1

x cm-1

]

V- objętość próby [L]

d – grubość warstwy naczynia [1 cm]

św.m. – równowartość materiału roślinnego w 1 ml próby [g]

Zawartość TBARS wyrażono w [nmol g-1

św.m.]

66

3.15 Oznaczanie zdolności przeciwwolnorodnikowej oraz aktywności

enzymów antyoksydacyjnych

3.15.1 Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego do oznaczania zdolności


1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowego (DPPH.)

Ekstrakt enzymatyczny wykorzystany do oznaczenia zdolności


1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowego (DPPH.) przygotowano z wariantów badawczych

wybranych na podstawie doświadczenia opisanego w p. 3.5.2. wg metody opisanej

przez Amarowicz i wsp. (2004).

Materiał roślinny rozcierano w moździerzu z 95% (w/v) alkoholem etylowym

w stosunku 15:100 (m/v). Próby inkubowano w łaźni z ultradźwiękami (Elmasonic

S80H) w temp. 50oC przez 30 minut. Następnie zawiesinę przesączano przez bibułę

filtracyjną, a pozostałość ekstrahowano jeszcze dwa razy. Połączone supernatanty

odparowywano do sucha przy użyciu wyparki próżniowej (350, Unipan)

w temperaturze 40oC. W celu dalszej analizy, próby przechowywane były w

temperaturze 4oC.

3.15.1.1 Oznaczanie zdolności przeciwwolnorodnikowej na zasadzie redukcji


Redukcję rodnika DPPH. pod wpływem ekstraktu enzymatycznego

(przygotowany wg podrozdziału 3.15.1) oznaczano poprzez pomiar intensywności jego

widma metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR)

wg zmodyfikowanej metody Olchowik-Grabarek i wsp. (2016).

Do 100 µl 500µM metanolowego roztworu DPPH.

dodawano

10 lub 20 µl ekstraktu roślinnego. Po upływie 3 minut rejestrowano pierwszą pochodną

widma DPPH.. Pomiary wykonano na spektrometrze EPR (Adani CMS 8400) przy

parametrach: moc tłumienia: 7dB; pole magnetyczne: 336 mT; zakres przemiatania:

10 mT; czas przemiatania: 50 s; amplituda modulacji: 0,02 mT; wzmocnienie: 6.10

-2;

częstotliwość: 9,41 GHz.

Próbę kontrolną stanowił metanolowy roztwór DPPH. bez dodatku ekstraktu.

Wyniki przedstawiono jako procent redukcji wolnego stabilnego rodnika DPPH..

67

3.15.2 Przygotowanie ekstraktu enzymatycznego do oznaczania aktywności

dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i katalazy (CAT)

Materiał roślinny (warianty badawcze wybrane na podstawie doświadczenia

opisanego w p. 3.5.2.) w ilości 1g homogenizowano w 5 ml 0,2M buforu ekstrakcyjnego

(bufor fosforanowy 0,1 M pH 7,8; 2 mM DTT; 0,1 mM EDTA; 1,25 mM PEG), 0,1 g

PVP i z piaskiem morskim. Następnie odwirowywano w 4˚C przy 11 500g przez

30 minut. Supernatant oczyszczano na wcześniej przygotowanych kolumnach żelowych

(PD 10 Sephadex G-25M, Amorsham Pharmacie Biotech). Otrzymany eluat

przetrzymywano w łaźni lodowej.

3.15.2.1 Oznaczanie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD)

Aktywność SOD (EC 1.15.1.1) oznaczano zmodyfikowaną metodą wg

Giannapolitis i Reis (1977). Mieszanina reakcyjna o objętości 3 ml zawierała: 0,1 M

bufor fosforanowy pH 7,8; 1,3 µM ryboflawinę; 13 mM metioninę; 63 µM błękitu

nitrotetrazoliowego (NBT) oraz ekstrakt enzymatyczny (uzyskany w sposób opisany w

p. 3.15.1.) lub H2O (próby kontrolne). Próby inkubowano przez 15 minut przy

napromieniowaniu 500 µmol m-1

s-1

w temperaturze 25˚C.

W celu oznaczenia aktywności poszczególnych izoform SOD ekstrakt

enzymatyczny inkubowano przez 30 min. w temperaturze 25o

C z 5 mM KCN

i/lub 5 mM H2O2 według metody opisanej przez Corpas i wsp. (1998).

Za jednostkę aktywności SOD przyjmowano ilość enzymu wymaganą

do 50% hamowania redukcji NBT, oznaczonej przy długości fali 560 nm.

3.15.2.2 Oznaczanie aktywności katalazy (CAT)

Aktywność CAT (EC 1.11.1.6) określano jako szybkość zużywania nadtlenku

wodoru (H2O2) w mieszaninie reakcyjnej przy długości fali 240 nm w czasie

100 sekund oznaczano metodą wg Aebi (1984). Mieszanina reakcyjna zawierała: 0,05

M bufor fosforanowy pH= 7,0; 37,5 mM H2O2 oraz ekstrakt enzymatyczny (uzyskany

w sposób opisany w p. 3.15.1.). Aktywność enzymu obliczano wg wzoru:

Aktywność CAT = [(∆DO/∆t) × Vm] / [E × P × Ve]

gdzie:

∆DO/∆t- przyrost gęstości optycznej w czasie (min-1

cm-1

)

68

Vm- objętość mieszaniny reakcyjnej (ml)

E- molekularny współczynnik absorbancji dla H2O2 przy długości fali 240 nm

(40,0 mM-1

cm-1

)

P- zawartość białka (µg ml-1

)

Ve- objętość ekstraktu (ml)

Aktywność CAT wyrażono w [mmol H2O2 min-1

mg-1

białka].

3.16 Analiza statystyczna wyników

Doświadczenia wykonano w minimum 5 powtórzeniach, w co najmniej 3

seriach doświadczalnych. Otrzymane wyniki przedstawiono w postaci średnich i ich

odchyleń standardowych (SD), obliczone z poszczególnych grup danych przy użyciu

pakietu Excel (Office 2007, Microsoft). Wyniki poddano analizie statystycznej,

wykorzystując analizę wariancji ANOVA dla układów czynnikowych. Wnioskowanie

statystyczne przeprowadzono na poziomie istotności p ≤ 0,05. Analizę statystyczną

wykonano przy użyciu programu SPSS Statistics 24.

69

4 Wyniki

4.1 Wzrost kultur oraz organogeneza pędowa w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) w zależności od rodzaju pożywki

Wszystkie spośród przetestowanych pożywek okazały się odpowiednie do powstawania

pędów na eksplantatach hipokotylowych lnu odm. Szafir (typ oleisty) – 100%

reagujących eksplnatatów (Fot. 2). Pędy formowały się już w pierwszym tygodniu

wzrostu kultur (Ryc. 6 A).

W przypadku kultur odm. Selena (typ włóknisty) pędy pojawiły się w drugim tygodniu

wzrostu na pożywce B5 i MS+B5. Efektywniejszą o około 40% organogenezę pędową

obserwowano w 2 i 3 tygodniu wzrostu na podłożu B5, w porównaniu do MS+B5 (Fot.

2, Ryc. 6 B). Najsłabsza kaulogeneza była na pożywce MS (około 15%) - pędy pojawiły

się dopiero w 4 tygodniu wzrostu (Ryc. 6 B).

Fot. 2. Kultury pędowe lnu zwyczajnego odm. Szafir i odm. Selena po 4 tygodniach wzrostu na

pożywkach: MS, B5 oraz MS+B5 z dodatkiem BA (1 mg l-1

) oraz 2,4-D

(0,025 mg l-1

).

70

A)

B)

Ryc. 6. Efektywność organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

(A) i odm. Selena (B) rosnących na pożywkach MS, B5, MS+B5 z dodatkiem BA (1 mg l-1

)

oraz 2,4-D (0,025 mg l-1

). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Najwyższą liczbą pędów odznaczały się kultury odm. Szafir, rosnące na pożywce MS

(Ryc. 7 A). W 1 i 2 tygodniu wzrostu liczba pędów w kulturach rosnących na podłożu

MS+B5 była niższa w porównaniu z pożywką MS, wynosiła średnio 3 i 5

pędów/eksplantat. W 3 i 4 tygodniu najniższą (średnio 13 pędów/eksplantat) liczbą

pędów odznaczały się kultury rosnące na podłożu B5, w porównaniu do MS (Ryc. 7 A).

Liczba pędów inicjowanych na pojedynczym eksplantacie w kulturach odm. Selena

była podobna na wszystkich testowanych pożywkach. W 4 tygodniu wynosiła średnio 3

pędy/ eksplantat (Ryc. 7 B).

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w

Czas wzrostu [tydzień]

Szafir MS B5 MS+B5

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena MS B5 MS+B5

* * *

71

A)

B)

Ryc. 7. Liczba pędów formujących się na eksplantatch hipokotylowych lnu zwyczajnego odm.

Szafir (A) oraz Selena (B) rosnących na pożywkach MS, B5, MS+B5 z dodatkiem BA (1 mg l-1

)

oraz 2,4-D (0,025 mg l-1


Najniższą świeżą i suchą masą, charakteryzowały się eksplantaty pochodzące

z kultur lnu oleistego, rosnące na pożywce B5 (Tab. 8). W przypadku lnu włóknistego

najniższą świeżą i sucha masa odznaczały się eksplantaty z kultur rosnących na podłożu

MS. Zawartość wody przypadająca na miligram świeżej i suchej masy w kulturach obu

badanych odmian była porównywalna we wszystkich wariantach doświadczenia

(Tab. 8).

0

4

8

12

16

20

24

1 2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t]


Szafir MS B5 MS+B5

*

*

* *

0

4

8

12

16

2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t.]


Selena MS B5 MS+B5

72

Tab. 8. Świeża i sucha masa eksplantatów z pędami oraz zawartość wody

w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir oraz Selena rosnących na pożywce MS, B5

oraz MS+B5 z dodatkiem BA (1 mg l-1

) oraz 2,4-D (0,025 mg l-1

). Wyniki średnie ± SD.

*Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05

Odmiana Pożywka Świeża masa Sucha masa Zawartość H2O Zawartość H2O

[mg ekspl.-1

] [mg ekspl.-1

] [mg H2O mg-1

św.m.] [mg H2O mg-1

s.m.]

Sza

fir

MS 1035,05±187,02 61,23±10,12 0,94±0,013 16,11±3,22

B5 423,16±63,33* 31,34±3,34* 0,92± 0,015 12,59±2,51

MS + B5 746,54±61,52 43,51±5,09 0,94±0,007 16,51±2,26

Sel

ena

MS 100,34±30,73* 10,09±2,66* 0,89±0,032 9,35±3,99

B5 289,12±42,23 22,31±1,32 0,92±0,011 12,03±1,87

MS + B5 246,42±55,63 17,84±3,23 0,93±0,025 13,94±5,09

4.2 Wzrost kultur oraz organogeneza korzeniowa w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego w zależności od rodzaju pożywki

Organogeneza korzeniowa w kulturach lnu odm. Szafir w 2 tygodniu wzrostu

była najwyższa na pożywce B5 i wynosiła ok. 80%. W 3 i 4 tygodniu wzrostu kultur

najefektywniejszą (około 100%) ryzogenezę zaobserwowano na pożywce MS oraz B5

(Ryc. 8 A).

Fot. 3. Kultury korzeniowe lnu zwyczajnego odm. Szafir i odm. Selena po 4 tygodniach

wzrostu na pożywkach: MS, B5 oraz MS+B5 z dodatkiem NAA (1 mg l-1

) oraz BA

(0,025 mg l-1

).

73

Najefektywniejszą organogenezę korzeniową w kulturach odm. Selena zaobserwowano

na podłożu B5 po 4 tygodniach wzrostu wynosiła około 60% (Ryc. 8 B). W tym

przypadku korzenie pojawiły się już w drugim tygodniu wzrostu. Na pożywce MS

korzenie pojawiły się w 3 tygodniu wzrostu. Procent reagujących eksplantatów był o

około 90% niższy w 3 tygodniu, natomiast w 4 tygodniu wzrostu o 30% niż na podłożu

B5. W przypadku pożywki MS + B5 oraz MS nie zaobserwowano formowania korzeni

na eksplantatach (Ryc. 8 B). Kultury takie brązowiały (Fot. 3).

A)

B)

Ryc. 8. Efektywność organogenezy korzeniowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm.

Szafir (A) i odm. Selena (B) rosnących na pożywkach MS, B5, MS+B5 z dodatkiem NAA

(1 mg l-1

) oraz BA (0,025 mg l-1

). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05.

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir MS B5 MS+B5

* *

*

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena MS B5 MS+B5

* *

74

Liczba formujących się korzeni na eksplantacie w kulturach odm. Szafir oraz odm.

Selena była najwyższa na pożywce B5 (Ryc. 9). W przypadku kultur odm. Szafir,

rosnących na pożywce B5 zaobserwowano, iż korzenie były bardzo liczne, lecz krótkie,

a eksplantaty ulegały szybszemu starzeniu (Fot. 3), natomiast na eksplantatach

rosnących na pożywce MS i MS + B5 korzenie były liczne i długie (Fot. 3).

A)

B)

Ryc. 9. Liczba korzeni formujących się na eksplantatch hipokotylowych lnu zwyczajnego odm.

Szafir (A) oraz Selena (B) rosnących na pożywkach MS, B5, MS+B5 z dodatkiem NAA

(1 mg l-1

) oraz BA (0,025 mg l-1

). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05.

Świeża oraz sucha masa, a także zawartość wody przypadająca na miligram

świeżej i suchej masy kultur korzeniowych odm. Szafir, rosnących na wszystkich

testowanych pożywkach, była podobna (Tab. 9). Świeża i sucha masa kultur odm.

Selena rosnących na pożywce MS oraz MS+B5 była istotnie niższa niż kultur

rozwijających się na podłożu B5. Zawartość wody, przypadająca na miligram suchej

0

4

8

12

16

20

24

2 3 4 Lic

zba

ko

rzen

i /

ek

spl.

[sz

t]


Szafir MS B5 MS+B5

* *

* *

* *

0

4

8

12

16

20

24

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i/ek

spl.

[sz

t.]


Selena MS B5 MS+B5

* *

75

masy w eksplantatach pochodzących z kultur odm. Selena rosnących na pożywce MS,

była najniższa (Tab. 9).

Tab. 9. Świeża i sucha masa eksplantatów z korzeniami oraz zawartość wody

w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir oraz Selena rosnących na pożywce MS, B5

oraz MS+B5 z dodatkiem NAA (1 mg l-1

) oraz BA (0,025 mg l-1



Odmiana Pożywka Świeża masa Sucha masa Zawartość H2O Zawartość H2O

[mg ekspl.-1

] [mg ekspl.-1

] [mg H2O mg-1


s.m.]

Sza

fir MS 863,36±201,13 59,23±14,25 0,93±0,027 14,41± 3,76

B5 833,12±257,36 49,19±18,02 0,94±0,022 17,76± 4,48

MS + B5 732,06±200,89 41,56±8,32 0,94±0,008 16,64±2,17

Sel

ena

MS 141,48±20,65* 15,36±1,66* 0,89±0,018 8,52±1,58*

B5 544,36±123,34 33,24±6,30 0,94±0,024 15,99±4,71

MS + B5 103,34±23,98* 9,38±2,51* 0,91±0,031 10,50±2,99

4.3 Wpływ wybranych auksyn i cytokinin na proces organogenezy

4.3.1 Oddziaływanie wybranych cytokinin na organogenezę pędową lnu

zwyczajnego (Linum usitatissimum L.)

Organogenezę pędową w kulturach in vitro lnu odm. Szafir (typ oleisty)

obserwowano już w pierwszym tygodniu wzrostu na wszystkich badanych podłożach,

natomiast w czwartym tygodniu w większości wariantów wynosiła 100% (Ryc. 10). W

obecności kinetyny (KIN) w pożywce MS, procent reagujących eksplantatów w 3 i 4

tygodniu wzrostu kultur był niższy niż w przypadku BA i TDZ (Ryc. 10 A). Na podłożu

B5 w obecności tidiazuronu (TDZ) efektywność kaulogenezy była niższa w 1 i 2

tygodniu wzrostu, w porównaniu do BA oraz TDZ (Ryc. 10 B). Organogeneza pędowa

w kulturach rosnących na pożywce MS+B5 była podobna niezależnie od zastosowanej

cytokininy (Ryc. 10 C). Najwyższą liczbą pędów (około 17 sztuk na eksplantat)

odznaczały się kultury lnu oleistego, rosnące w obecności BA na wszystkich

testowanych pożywkach w stosunku do KIN i TDZ (Ryc. 11).

76

A)

B)

C)


rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z dodatkiem wybranej cytokininy: BA,

KIN, TDZ (1 mg l-1

) + 2,4-D (0,025 mg l-1

). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne

statystycznie, przy p≤0,05.

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 % r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir BA KIN TDZ MS

* *

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 % r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir BA KIN TDZ B5

*

*

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 % r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir BA KIN TDZ MS+B5

77

A)

B)

C)


Szafir rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z dodatkiem wybranej cytokininy:

BA, KIN, TDZ (1 mg l-1

) + 2,4-D (0,025 mg l-1



0

4

8

12

16

20

24

1 2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ ek

spl.

[sz

t]


Szafir BA KIN TDZ MS

* *

*

* *

*

0

4

8

12

16

1 2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t]


Szafir BA KIN TDZ B5

* * * *

* * *

*

0

4

8

12

16

20

1 2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t]


Szafir BA KIN TDZ MS+B5

* * * *

*

78

Najwyższą świeżą masą odznaczały się eksplantaty z pędami pochodzące z

kultur lnu oleistego rosnących w na pożywkach MS i MS+B5 z dodatkiem BA, a

najniższą na podłożach z KIN. Sucha masa eksplantatów rozwijających się na podłożu

MS+B5 z KIN była niższa niż w pozostałych wariantach (Tab. 10). Zawartość wody,

przypadająca na miligram świeżej masy eksplantatów, była podobna niezależnie od

zastosowanej pożywki oraz zawartej cytokininy. Zawartość wody przypadająca na

miligram suchej masy eksplantatów była najniższa na podłożu MS w obecności KIN

oraz na podłożu B5 z dodatkiem TDZ (Tab. 10).

Tab. 10. Świeża i sucha masa eksplantatów z pędami oraz zawartość wody w kulturach in vitro

lnu zwyczajnego odm. Szafir rosnących na pożywce MS, B5 oraz MS+B5 z dodatkiem

wybranej cytokininy: BA, KIN, TDZ (1 mg l-1

) + 2,4-D (0,025 mg l-1



Rodzaj hormonu Świeża masa Sucha masa H2O H2O

[mg x ekspl.-1

] [mg x ekspl.-1

] [mg x mg-1

św.m.] [mg x mg-1

s.m.]

MS

BA 754,15±168, 23 46,45±10,12 0,94±0,02 16,33±4,21

KIN 134,23± 21,02* 18,13±8,11 0,80±0,13 7,90±0,91*

TDZ 580,41±136,16 41,56±9,12 0,92±0,02 12,21±3,34

B5

BA 172,20± 27,42 17,17±9,13 0,87±0,09 14,63±4,41

KIN 191,32±35,54 20,23±6,71 0,87±0,07 10,74±1,85

TDZ 149,19±35,41 17,32±6,14 0,88±0,02 7,61±1,32*

MS + B5

BA 644,00±77,11 37,72±3,32 0,94±0,01 16,69±2,99

KIN 146,05±68,24* 12,12±5,77* 0,91±0,04 11,33±5,02

TDZ 580,21±45,18 35,52±6,62 0,94±0,01 16,18±3,65

Kultury pędowe odm. Selena (typ włóknisty lnu) rosnące na podłożu B5 i

MS+B5 w obecności BA oraz KIN, odznaczały się najefektywniejszą organogenezą

(Ryc. 12). W kulturach rosnących na pożywce z dodatkiem TDZ kaulogeneza nie

wystąpiła. Liczba pędów formujących się na eksplantacie była podobna we wszystkich

wariantach doświadczenia, gdzie obserwowano proces organogenezy pędowej

(Ryc. 13).

79

A)

B)

C)

Ryc. 12. Efektywność organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm.

Selena rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z dodatkiem wybranej

cytokininy: BA, KIN, TDZ (1 mg l-1

) + 2,4-D (0,025 mg l-1

). Wyniki średnie ± SD. *Różnice

istotne statystycznie, przy p≤0,05.

0

20

40

60

80

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena BA KIN TDZ MS

0

20

40

60

80

2 3 4 % r

ea

gu

jący

hc

eksp

lan

tató

w


Selena BA KIN TDZ B5

*

0

20

40

60

80

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena BA KIN TDZ MS+B5

80

A)

B)

C)


Selena rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z dodatkiem wybranej

cytokininy: BA, KIN, TDZ (1 mg l-1

) + 2,4-D (0,025 mg l-1



0

2

4

6

8

2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t]


Selena BA KIN TDZ MS

0

2

4

6

8

2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t]


Selena BA KIN TDZ B5

*

0

2

4

6

8

2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t]


Selena BA KIN TDZ MS+B5

*

81

Najwyższą świeżą masą na pożywce MS odznaczały się eksplantaty rosnące

w obecności TDZ. Świeża masa eksplantatów rozwijających się na podłożu B5 była

podobna niezależnie od zawartej w niej cytokininy (Tab. 11). W przypadku pożywki

MS+B5 najniższą świeżą i suchą masą charakteryzowały się eksplantaty rosnące

w obecności KIN. Zawartość wody, przypadająca na miligram suchej masy

eksplantatów z pędami na pożywce MS+B5 z dodatkiem TDZ, była istotnie najwyższa

w porównaniu do pozostałych wariantów hormonalnych (Tab. 11).

Tab. 11. Świeża i sucha masa eksplantatów z pędami oraz zawartość wody w kulturach in vitro

lnu zwyczajnego odm. Selena rosnących na pożywce MS, B5 oraz MS+B5 w zależności od

wybranej cytokininy BA, KIN, TDZ (1 mg l-1

) + 2,4-D (0,025 mg l-1


*Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Rodzaj hormonu Świeża masa Sucha masa H2O H2O

[mg x ekspl.-1

] [mg x ekspl.-1

] [mg x mg-1

św.m.] [mg x mg-1

s.m.]

MS

BA 100,21±29,82* 10,02±2,11 0,89±0,03 9,34±3,99

KIN 124,13±12,02* 16,23±2,11 0,84±0,12 8,90±2,91

TDZ 280,41±26,16 21,46±9,12 0,92±0,02 12,51±3,12

B5

BA 693,32±231,51 39,17±8,13 0,92±0,03 17,39±7,41

KIN 318,23±115,45 28,23±9,71 0,86±0,11 14,17±4,65

TDZ 747,19±91,41 34,32±3,14 0,94±0,01 21,02±3,59

MS + B5

BA 519,00±129,11 51,72±11,32 0,84±0,16 9,69±1,08*

KIN 257,05±33,24* 22,12±2,77* 0,90±0,01 10,56±1,71*

TDZ 733,21±133,18 41,52±13,62 0,92±0,06 22,56±5,46

4.3.2 Oddziaływanie wybranych auksyn na organogenezę korzeniową lnu

zwyczajnego (Linum usitatissimum L.)

Spośród przetestowanych auksyn najwyższą efektywnością formowania korzeni w

kulturach odm. Szafir charakteryzowała się auksyna NAA (82-97% reagujących

eksplantatów) niezależnie od zastosowanego rodzaju pożywki (Ryc. 14). Na wszystkich

podłożach z dodatkiem 2,4-D organogeneza korzeni była najniższa i wynosiła około

10%. Najwyższą liczbę korzeni na eksplantacie odnotowano na pożywce B5

z dodatkiem auksyny NAA i wynosiła około 16 korzeni/eksplantat w 4 tygodniu

wzrostu (Ryc. 15 B). Najniższą liczbę korzeni inicjowanym na pojedynczym

eksplantatcie zaobserwowano na pożywkach z dodatkiem auksyny 2,4-D (Ryc. 15).

82

A)

B)

C)


Szafir rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z dodatkiem wybranej cytokininy:

2,4-D, NAA, IBA (1 mg l-1

) + BA (0,025 mg l-1



0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 % r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir 2,4-D NAA IBA MS

* * * *

* *

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir 2,4-D NAA IBA B5

*

*

*

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 % r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir 2,4-D NAA IBA MS+B5

*

*

*

83

A)

B)

C)

Ryc. 15. Liczba korzeni formujących się na eksplantatch hipokotylowych lnu zwyczajnego

odm. Szafir rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z dodatkiem wybranej

cytokininy: 2,4-D, NAA, IBA (1 mg l-1

) + BA (0,025 mg l-1



0

4

8

12

16

20

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i/ek

spl.

[sz

t]


Szafir 2,4-D NAA IBA MS

* * * * * *

0

4

8

12

16

20

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i/ek

spl.

[sz

t]


Szafir 2,4-D NAA IBA B5

* *

*

*

0

4

8

12

16

20

2 3 4 Lic

zba

ko

rzen

i /

ek

spl.

[sz

t]


Szafir 2,4-D NAA IBA MS+B5

* * * *

84

Świeża masa oraz zawartość wody przypadająca na miligram świeżej i suchej

masy eksplantatów z korzeniami pochodzących z kultur odm. Szafir była podoba we

wszystkich wariantach doświadczenia (Tab. 12). Sucha masa eksplantatów rosnących

na pożywce MS oraz MS+B5 z dodatkiem 2,4-D była istotnie niższa w porównaniu do

eksplantatów rozwijających w obecności NAA (Tab. 12).


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir rosnących na pożywce MS, B5 oraz MS+B5

w zależności od wybranej auksyny 2,4-D, NAA, IBA (1 mgl-1

) + BA (0,025 mgl-1

). Wyniki

średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05

Hormony Świeża masa Sucha masa H2O H2O

[mg x ekspl.-1

] [mg x ekspl.-1

] [mg x mg-1

św.m.] [mg x mg-1

s.m.]

MS

2,4-D 126,36±30,23 13,56±2,21* 0,89±0,03 8,71±2,99

NAA 263,31±115,51 25,23±5,56 0,88±0,08 10,50±3,08

IBA 94,20±50,23 12,89±6,62 0,85±0,07 8,13±3,57

B5

2,4-D 115,54±57,45 13,32±5,88 0,87±0,07 10,23±0,77

NAA 179,47±42,42 17,47±3,62 0,90±0,02 9,88±2,93

IBA 110,68±41,11 12,55±5,12 0,86±0,12 12,35±1,39

MS + B5

2,4-D 172,23±37,74 15,57±3,17* 0,91±0,02 10,51±3,08

NAA 264,49± 89,23 25,45±1,71 0,89±0,04 9,73±2,95

IBA 189,12±64,42 16,64±5,35 0,90±0,05 11,23±3,70

Organogenezę korzeniową w kulturach lnu włóknistego zaobserwowano jedynie

na pożywce MS oraz B5 (Ryc. 16). Efektywniejszą ryzogenezą (około 60% reagujących

eksplantatów) oraz wcześniejszym pojawieniem się organów (w 2 tygodniu wzrostu),

charakteryzowały się kultury rosnące na pożywce B5 z dodatkiem NAA (Ryc. 16 B).

Najwyższą liczbą korzeni (około 18 korzeni/eksplantat) odznaczały się kultury, rosnące

na podłożu B5 w obecności auksyny NAA (Ryc. 17).

85

A)

B)


Selena rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B) z dodatkiem wybranej cytokininy: 2,4-D,

NAA, IBA (1 mg l-1

) + BA (0,025 mg l-1

). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie,

przy p≤0,05.

0

20

40

60

80

100

3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena 2,4-D NAA IBA MS

0

20

40

60

80

100

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena 2,4-D NAA IBA B5

*

*

86

A)

B)


odm. Selena rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B) z dodatkiem wybranej cytokininy: 2,4-D,

NAA, IBA (1 mg l-1

) + BA (0,025 mg l-1

). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie,

przy p≤0,05.

Najwyższą świeżą masą na pożywce MS odznaczały się eksplantaty rosnące w

obecności NAA oraz 2,4-D. Świeża masa eksplantatów, rozwijających się na podłożu

B5 z dodatkiem IBA, była najniższa (Tab. 13). W przypadku pożywki MS najniższą

świeżą masą charakteryzowały się eksplantaty, rosnące w obecności 2,4-D. Zawartość

wody przypadająca na miligram świeżej i suchej masy eksplantatów z korzeniami była

podobna we wszystkich wariantach doświadczenia (Tab. 13).

0

4

8

12

16

3 4

Lic

zba

ko

rzen

i/ e

ksp

l. [

szt]


Selena 2,4-D NAA IBA MS

0

4

8

12

16

20

24

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i/ek

spl.

[sz

t]


Selena 2,4-D NAA IBA B5

* *

87


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena rosnących na pożywce MS, B5 oraz MS+B5

w zależności od wybranej auksyny 2,4-D, NAA, IBA (1 mgl-1

) + BA (0,025 mgl-1

). Wyniki

średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Hormony Świeża masa Sucha masa H2O H2O

[mg x ekspl.-1

] [mg x ekspl.-1

] [mg x mg-1

św.m.] [mg x mg-1

s.m.]

MS

2,4-D 103,46±23,32 9,45±2,11* 0,91±0,03 10,50±2,99

NAA 141,19±20,09 15,53±1,36 0,89±0,02 8,52±1,58

IBA 69,89±20,23* 11,79±2,32 0,88±0,03 8,77±2,97

B5

2,4-D 398,88±40,45 32,17±5,77 0,91±0,03 11,89±4,02

NAA 473,27±13,42 30,45±7,32 0,93±0,03 15,5±6,52

IBA 163,51±15,42* 19,14±5,35 0,87±0,02 7,55±1,25

Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń związanych z testowaniem

pożywek (p. 4.1-4.2) oraz wybranych hormonów (p. 4.3.1-4.3.2) na efektywność

organogenezy pędowej i korzeniowej w celu wyboru optymalnego składu podłoża oraz

najodpowiedniejszej cytokininy i auksyny do dalszych analiz, wybrano pożywkę MS

dla odm. Szafir (typ oleisty) i pożywkę B5 dla odm. Selena (typ włóknisty) oraz

cytokininę BA oraz auksynę NAA.

4.4 Wpływ wzajemnych stężeń cytokininy i auksyny na efektywność

procesu organogenezy


organogenezy pędowej

Organogenezę pędową w kulturach lnu odm. Szafir zaobserwowano już w

pierwszym tygodniu wzrostu. Najwyższa efektywność kaulogenezy była w zakresie

stężeń auksyny 2,4-D (0 - 0,2 mg l-1

) i wynosiła 100% w 4 tygodniu wzrostu (Ryc. 18

A, Fot. 4.) W stężeniu 2,4-D (0,5 mg l-1

) była istotnie niższa i wynosiła ok. 80%. W

wyższych stężeniach auksyny (0,75 oraz 1 mg l-1

) w pożywce procent reagujących

eksplantatów był niższy i wynosił odpowiednio ok. 50% - 25% (Ryc. 18 A).

Organogenezę pędową w kulturach odm. Selena zaobserwowano od 2 tygodnia

wzrostu. Najwyższym procentem reagujących eksplantatów (około 90%) w 3 tygodniu

wzrostu, odznaczały się kultury rosnące przy stężeniu auksyny 2,4-D (0,025 mg l-1

)

(Ryc. 18 B, Fot. 5). Przy stężeniu 2,4-D (0,05 mg l-1

) kaulogeneza wynosiła ponad 60%.

88

Przy stężeniach auksyny (0,75; 0,5; 1 mg l-1

) w pożywce organogeneza pędów nie

wystąpiła (Ryc. 18).

Liczba pędów przypadająca na eksplantat w kulturach odm. Szafir była

najwyższa, przy stężeniu auksyny 2,4-D w pożywce od 0 do 0,2 mg l

-1 (Ryc. 19 A).

Najwyższą liczbę pędów przypadającą na eksplantat w kulturach odm. Selena

obserwowano przy stężeniach 2,4-D od 0,05 mg l-1

do 0 mg l -1

w 3 tygodniu wzrostu.

W 4 tygodniu liczba pędów na pojedynczym eksplantacie była podobna we wszystkich

wariantach doświadczenia, gdzie stwierdzono ryzogenezę (Rys.19 B).

Fot. 4. Eksplantaty hipokotylowe lnu odm. Szafir oraz odm. Selena ze zregenerowanymi

pędami w zależności od zmieniających się stężeń auksyny 2,4-D (0-1 mg l-1

) przy stałym

stężeniu cytokininy BA (1mg l-1

) w pożywce (2,4-D:BA).

89

A)

B)


(A) i odm. Selena (B) w zależności od zmieniających się stężeń auksyny 2,4-D (0-1 mg l-1

) przy

stałym stężeniu cytokininy BA (1 mg l-1

) – (2,4-D : BA). Wyniki średnie ± SD. *Różnice


0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir 0:1 1:40 1:20 1:10 1:5 1:2 1:1.33 1:1

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena 0:1 1:40 1:20 1:10 1:5 1:2 1:1.33 1:1

90

A)

B)

Ryc. 19. Liczba pędów formujących się na eksplantatach hipokotylowych lnu zwyczajnego

odm. Szafir (A) i odm. Selena (B) w zależności od zmieniających się stężeń auksyny 2,4-D (0-1

mg l-1

) przy stałym stężeniu cytokininy BA (1mg l-1

) – (2,4-D:BA). Wyniki średnie ± SD.



organogenezy korzeniowej

Organogenezę korzeniową w kulturach lnu oleistego oraz lnu włóknistego

zaobserwowano od drugiego tygodnia wzrostu (Ryc. 20). Najwyższą ryzogenezę w

kulturach odm. Szafir w 4 tygodniu wzrostu, sięgającą około 100%, obserwowano w

stężeniu cytokininy BA w zakresie stężeń (0 – 0,05 mg lˉ1). W zakresie stężeń od 0,5

mg l-1

do 1,0 mg l-1

BA w pożywce, nie stwierdzono pojawienia się korzeni na

eksplantatch (Ryc. 20 A, Fot. 6). W kulturach odm. Selena procent reagujących

eksplantatów był najwyższy (100%) przy braku cytokininy BA w pożywce (Ryc. 20 B).

0

4

8

12

16

20

24

1 2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ ek

spl.

[sz

t]


Szafir 0:1 1:40 1:20 1:10 1:5 1:2 1:1.33 1:1

0

4

8

12

16

2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t]


Selena 0:1 1:40 1:20 1:10 1:5 1:2 1:1.33 1:1

91

Istotnie niższą organogenezę korzeniową, w porównaniu do kultur rosnących na

podłożu bez dodatku cytokininy, zaobserwowano przy stężeniach BA od 0,025 mg l-1

do 0,1 mg l-1

. W zakresie stężeń od 0,2 mg l-1

do 1,0 mg l-1

cytokininy BA w podłożu

nie stwierdzono ryzogenezy w kulturach odm. Selena (Ryc. 20 B). Najwyższą liczbę

korzeni na eksplantatach pochodzących z siewek lnu odm. Szafir w 4 tygodniu wzrostu,

zaobserwowano na pożywkach z dodatkiem BA w zakresie (0- 0,025 mg l-1

) 4-10

korzeni na eksplantacie (Ryc. 21 A). Liczba korzeni przypadająca na eksplantat w

kulturach odm. Selena po 4 tygodniach wzrostu, była najwyższa (około 17 sztuk na

eksplantat) na pożywce z dodatkiem 0,025 mg l-1

cytokininy BA (Ryc. 21 B).

Fot. 5. Eksplantaty hipokotylowe lnu odm. Szafir oraz odm. Selena ze zregenerowanymi

korzeniami w zależności od zmieniających się stężeń cytokininy BA (0-1mg l-1

) przy stałym

stężeniu auksyny NAA (1 mg l-1

) – (BA:NAA).

92

A)

B)


Szafir (A) i odm. Selena (B) w zależności od zmieniających się stężeń cytokininy wzajemnych

proporcji hormonów BA (0-1 mg l-1

) przy stałym stężeniu auksyny NAA (1 mg l-1

) – (BA :

NAA). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

0

20

40

60

80

100

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir 0:1 1:40 1:20 1:10 1:5 1:2 1:1.33 1:1

* *

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena 0:1 1:40 1:20 1:10 1:5 1:2 1:1.33 1:1

93

A)

B)

Ryc. 21. Liczba korzeni formujących się na eksplantatach hipokotylowych lnu zwyczajnego

odm. Szafir (A) i odm. Selena (B) w zależności od zmieniających się stężeń cytokininy BA (0-

1 mg l-1


) – (BA : NAA). Wyniki średnie ± SD.


Kultury lnu oleistego rosnące na pożywce MS charakteryzowały się efektywną

organogenezą (wysokim % reagujących eksplantatów oraz liczbą organów przypadającą

na pojedynczy eksplantat). Powstające pędy nie wykazywały oznak starzenia, korzenie

były liczne i długie. Eksplantaty pochodzące z kultur odm. Szafir, rosnące na pożywce

MS z dodatkiem BA (1 mg l-1

) + 2,4-D (0,025 mg l-1

), odznaczały się również wysoką

świeżą i suchą masą. Efektywną kaulogenezę i ryzogenezę stwierdzono w kulturach lnu

włóknistego, rosnącego na podłożu B5 z dodatkiem BA (1 mg l-1

) + 2,4-D (0,025 mgl-1

)

– kultury pędowe oraz NAA (1 mg l-1

) + BA (0,025 mg l-1

) – kultury korzeniowe. Na

podstawie przeprowadzonych i opisanych w podrozdziale od 4.1 do 4.4.2 doświadczeń,

do kolejnych analiz wybrano podłoża: MS (dla odm. Szafir) i B5 (dla odm. Selena) z

dodatkiem BA (1 mg l-1

) + 2,4-D (0,025 mg l-1

) - nazywane w dalszej części pracy

0

4

8

12

16

20

24

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i /e

ksp

l. [

szt]


Szafir 0:1 1:40 1:20 1:10 1:5 1:2 1:1.33 1:1

0

4

8

12

16

20

24

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i /e

ksp

l. [

szt]


Selena 0:1 1:40 1:20 1:10 1:5 1:2 1:1.33 1:1

94

pożywką pędową oraz MS (dla odm. Szafir) i B5 (dla odm. Selena) z dodatkiem NAA

(1 mg l-1

) + BA (0,025 mg l-1

) – nazywane dalej pożywką korzeniową.

4.5 Organogeneza pędowa i korzeniowa lnu zwyczajnego (Linum

usitatissimum L.) w pierwszym tygodniu wzrostu kultur in vitro

(analiza anatomiczna)

Analiza przekrojów poprzecznych hipokotyli lnu odm. Szafir i Selena z 7

kolejnych dni po wyłożenia eksplanatów na pożywki pędowe i korzeniowe, pokazuje

zmiany anatomiczne zachodzące w początkowym okresie inicjowania organów.


zwyczajnego odm. Szafir

Przekrój poprzeczny przez eksplantat hipokotylowy pochodzący z 7-dniowej

siewki lnu odm Szafir (środkowy fragment hipokotyla o długości ok. 0,5 cm)

przedstawia Fot. 6.0. Hipokotyl okrywa 1-warstwowa epiderma z aparatami

szparkowymi i charakterystycznymi komórkami brodawkowatymi, biegnącymi

pasmami wzdłuż organu. Korę pierwotną wypełnia miękisz asymilacyjny z większą

ilością skrobi na obwodzie i bliżej walca osiowego. Posiada miękiszowy rdzeń i wiązki

łykodrzewne o różnych układach pasm przewodzących w liczbie od 2 do 6, zależnie od

miejsca przekroju hipokotyla. Na zewnątrz od łyka pierwotnego obecne są pojedyncze,

grubościenne komórki włókien.

Po upływie doby od wyłożenia eksplantatów na pożywkę pędową, zaobserwowano

powiększenie się jąderek w komórkach epidermy i miękiszu, wzrost ilości i wielkości

ziaren skrobi na obwodzie hipokotyla i przy walcu osiowym, oraz podziały nielicznych

komórek miękiszu i epidermy (Fot. 6.1). Po dwóch dniach wzrostu kultury lnu oleistego

w całym miękiszu zwiększyła się ilość skrobi, a wiele komórek tej tkanki oraz epidermy

podzieliło się. Podzielone komórki miękiszu utworzyły wyraźne pasma biegnące

promieniście od walca osiowego ku obwodowi organu (Fot. 6.2). Po trzecim dniu

wzrostu stwierdzono wiele komórek miękiszowych podzielonych na wąskie

spłaszczone komórki (Fot. 6.3). Grupy komórek pochodnych epidermy, tworzące

zaczątki centrów merystematycznych (zawiązków pąków przybyszowych), widoczne

były już po trzech, czterech (Fot. 6.4), i pięciu dniach wzrostu kultury pędowej (Fot.

6.5). Po pięciu dniach od wyłożenia eksplantatów na pożywkę, większe centra

merystematyczne zaczęły się uwypuklać na powierzchni eksplantatu (Fot. 6.5 a) Po

95

upływie szóstej doby, w zawiązkach pąków zaczęły się wydłużać zawiązki liści, a pod

nimi różnicować z miękiszu pasma wiązek przewodzących (Fot. 6.6). Po tygodniu

wzrostu kultury, widoczne były centra merystematyczne pędów w różnych fazach

rozwoju oraz wydłużone zawiązki liści osłaniające merystemy wierzchołkowe pędów

(Fot. 6.7).

Po 12 dniach wzrostu kultury pędowej odm. Szafir powierzchnię hipokotyla pokrywały

liczne zawiązki pędów przybyszowych w różnych stadiach rozwoju, a na jego końcach

wykształcił się kalus (Fot. 6.12).

Fot. 6. Organogeneza pędów na eksplantatach hipokotylowych lnu odm. Szafir rosnących na

pożywce pędowej.

(0) Eksplantat - hipokotyl 7-dniowej siewki lnu na przekroju poprzecznym.

(1-7) Przekroje poprzeczne przez hipokotyl po kolejnych dniach (1-7) kultury pędowej.

(12) Hipokotyl z zawiązkami pędów przybyszowych po 12 dniach wzrostu na pożywce pędowej

(obraz stereoskopowy).

Skala dla fotografii: 0, 4, 6, 7a =200 µm; 1, 2, 3, 5, 5a = 20 µm; 6a , 7=50 µm; 12 =1 mm.

3 4 5

6a

00 2

12

0 1 2

5a 6 6a

7 7a 12

96


zwyczajnego odm. Selena

Budowa anatomiczna hipokotyla lnu odm. Selena (Fot. 7.0) okazała się zbliżona

(z wyjątkiem braku zróżnicowanych pojedynczych włókien w sąsiedztwie łyka) do

budowy hipokotyla lnu odm. Szafir (Fot. 6.0). Po pierwszej i drugiej dobie wzrostu

kultur odm. Selena, zmiany zachodzące w eksplantacie były podobne jak u odm. Szafir

(Fot. 6.1; 6.2). Po trzech dniach wzrostu kultury pędowej, komórki na końcach

eksplantatu, podzielone wielokrotnie i w różnych płaszczyznach, utworzyły kalus (Fot.

7.3). Dalej od jego końców niewiele komórek epidermy uległo podziałowi, a w

miękiszu podzielone komórki tworzyły pasma biegnące nieregularnie ku obwodowi.

Podobny obraz był widoczny po 4 dniach wzrostu kultury (Fot. 7.4). Po 5 dniach

wzrostu eksplantatów lnu włóknistego, bliżej uciętego końca hipokotyla w sąsiedztwie

kalusa, obserwowano nieliczne, uwypuklone i silniej barwiące się safraniną grupy

komórek, które przypominały merystematyczne zawiązki pędów (Fot. 7.5), ale na

wierzchołku posiadały aparat szparkowy (Fot. 7.5 a). Podobne struktury, w różnym

stopniu rozwinięte, obserwowano również w eksplantatach pochodzących z kultur po 6-

tym dniu wzrostu (Fot. 7.6 i 7.6 a). Po sześciu dniach od wyłożenia eksplantatów na

pożywkę, na granicy z kalusem widoczne były uwypuklone wzgórki merystematyczne,

ciasno przylegające do siebie, o niejasnym przeznaczeniu. Po siedmiu dniach wzrostu

kultury obserwowano nieliczne, ale typowe, merystemy pąków przybyszowych z 3-4

zawiązkami liści (Fot.7.7 i 7.7 a), wyrastające z bocznej powierzchni eksplantatu, a pod

nimi pasma różnicujących się wiązek przewodzących, połączone z systemem

przewodzącym walca osiowego.

Morfologię 7-dniowego eksplantatu lnu przedstawia Fot. 7.7 b.

97

Fot. 7. Organogeneza pędów na eksplantatach hipokotylowych lnu odm. Selena rosnących na

pożywce pędowej.


(1-7a) Przekroje poprzeczne przez hipokotyl po kolejnych dniach (1-7) kultury pędowej.

(7b) Hipokotyl z zawiązkami pędów przybyszowych po 7 dniach wzrostu na pożywce pędowej

(obraz stereoskopowy).

Skala dla fotografii: 0, 5, 6, 7 =200 µm; 1, 3 = 20 µm; 4, 5a, 6a , 6b, 7a=50 µm; 7b =1 mm.


zwyczajnego odm. Szafir

Przebieg organogenezy korzeniowej w kulturach in vitro lnu odm. Szafir w

ciągu pierwszego tygodnia wzrostu na pożywce korzeniowej przedstawia Fot. 8.

Budowa anatomiczna eksplantatu bezpośrednio po pobraniu z hipokotyla 7-dniowej

siewki lnu oleistego (Fot. 8.0) została dokładnie opisana w podrozdziale 4.5.1.

0 1 3

7 7a 7b

6 6a

6b

4 5

5a

0 1 3

3

5a

6b

98

Po upływie pierwszej doby od wyłożenia eksplantatów na pożywkę, w tkance

miękiszowej wzrosła ilość skrobi i zanikły antocyjany w hipodermie (obserwacje

wykonano na świeżych skrawkach). Po dwóch dniach wzrostu kultur (Fot. 8.2) liczne

komórki miękiszowe eksplantatu po jego dolnej stronie (zwróconej do pożywki)

podzieliły się, a stykające się ściany podziałowe utworzyły promieniste pasma biegnące

ku epidermie. Po trzecim dniu wzrostu zaobserwowano podziały w kambium w walcu

osiowym (Fot. 8.3). Miękisz kory pierwotnej eksplantatu był od pierwszego dnia

kultury biegunowo zróżnicowany: komórki po stronie dolnej (stykającej się z

podłożem) zawierały więcej skrobi i podlegały podziałom, komórki po stronie górnej

(nie dotykającej podłoża) nie dzieliły się. Od czwartego dnia wzrostu kultury

korzeniowej odm. Szafir w eksplantacie formowały się zawiązki korzeni

przybyszowych okryte endodermą (Fot. 8.4, 8.5, 8.6, 8.7); często wyrastały one parami

i były skierowane w przeciwne strony (Fot. 8.7 i 8.7 a). Po tygodniu od wyłożenia

eksplantatów na pożywkę komórki epidermy i miękiszu, od strony nie stykającej się z

podłożem, pozostawały prawie niepodzielone, a po stronie przylegającej do pożywki,

wskutek licznych podziałów utworzyły się kompleksy komórkowe, a wśród nich

naczynia siatkowate. Korzenie przybyszowe pozostawały nadal wewnątrz eksplantatu, a

tkanka miękiszowa wokół nich była znacznie rozluźniona (Fot. 8.7). Po tygodniu

wzrostu eksplantatu na pożywce korzeniowej obserwowano miejscami zwarte, silniej

barwiące się, koncentryczne układy komórek z pasmem naczyń wewnątrz,

przypominające centra merystematyczne. Przypuszczalnie mogły to być zawiązki

korzeni formujących się z kalusa (Fot. 8.7 b i 8.7 c).

Fot. 8.11 przedstawia eksplantat z korzeniami na powierzchni i z dużą ilością kalusa na

końcach po jedenastu dniach wzrostu kultury lnu odm. Szafir na pożywce korzeniowej.

99

Fot. 8. Organogeneza korzeni na eksplantatach hipokotylowych lnu odm. Szafir rosnących na

pożywce korzeniowej.


(1-7c) Przekroje poprzeczne przez hipokotyl po kolejnych dniach (1-7) kultury korzeniowej.

(11) Hipokotyl z zawiązkami korzeni przybyszowych po 11 dniach wzrostu na pożywce

korzeniowej (obraz stereoskopowy).

Skala dla fotografii: 0, 7 =200 µm; 2-6, 7a-7c = 50 µm; 11 =1 mm.

Zawiązki korzeni powstające w kalusie, z naczyniami wewnątrz (strzałki).


zwyczajnego odm. Selena

Budowa anatomiczna eksplantatów pochodzących z hipokotyli 7- dniowych siewek lnu

włóknistego, została opisana w podrozdziale 4.5.2. Zmiany jakie zaszły w eksplantatch

od ich wyłożenia na pożywkę (Fot. 9.0) przez pierwszy tydzień wzrostu kultury

korzeniowej przedstawia Fot. 9.

100

Po pierwszej dobie wzrostu kultur na pożywce korzeniowej wzrosła w

komórkach eksplantatu ilość skrobi, głównie na obwodzie i wokół walca osiowego (Fot.

9.1). Po dwóch dniach wzrostu kultury obserwowano podzielone komórki miękiszu

przy walcu osiowym (Fot. 9.2), a także niektóre komórki epidermy i miękiszu kory

pierwotnej. Stykające się ściany podziałowe utworzyły ciągi rozchodzące się

promieniście w miękiszu. Po trzeciej dobie od wyłożenia eksplantatów na pożywkę,

przy walcu osiowym widoczne były miejscowo namnożone komórki, ale ich układ nie

przypominał typowego zawiązka korzenia (Fot. 9.3). Dolna (przylegająca do podłoża) i

górna (nie stykająca się z podłożem) część eksplantatu wyraźnie się różniły: komórki

miękiszu od strony podłoża były podzielone wielokrotnie, a te po stronie górnej dzieliły

się w niewielkim stopniu. Po czwartej dobie wzrostu zmiany zachodzące w

eksplantatach były kontynuacją poprzednich (postępowały podziały komórek). Od

piątego dnia wzrostu kultur obserwowano nieliczne, ale typowe, zawiązki korzeni

przybyszowych okryte endodermą (Fot. 9.5). Prawie cały eksplantat (z wyjątkiem jego

górnej części) był wypełniony kulistymi kompleksami komórkowymi, utworzonymi z

komórek, które się wielokrotnie podzieliły w obrębie ściany komórki macierzystej. Po

szóstym i siódmym dniu wzrostu kultur odm. Selena, obserwowano nieliczne zawiązki

korzeni przybyszowych wyrastające nad ksylemem (Fot. 9.7), które występując parami,

były skierowane w dwóch przeciwnych kierunkach i ustawione naprzeciwko siebie

(Fot. 9.7 a). Miękisz w górnej (nie stykającej się z podłożem) części eksplantatu był

rozluźniony, a jego komórki prawie niepodzielone, natomiast w części stykającej się z

pożywką cały miękisz był przekształcony w kompleksy komórek (Fot. 9.7 a). Wewnątrz

niektórych kompleksów widoczne były pasma zróżnicowanego ksylemu (Fot. 9.7 b), ale

znaczenie tych struktur jest niejasne.

Fot. 9.11 przedstawia 11-dniowy eksplantat z kultury korzeniowej lnu odm.

Selena, z silnie rozwiniętym kalusem i kilkoma niewielkim korzeniami na powierzchni.

101

Fot. 9. Organogeneza korzeni na eksplantatach hipokotylowych lnu odm. Selena rosnących na

pożywce korzeniowej.


(1-7b) Przekroje poprzeczne przez hipokotyl po kolejnych dniach (1-7) kultury korzeniowej.

(11) Hipokotyl z zawiązkami korzeni przybyszowych po 11 dniach wzrostu na pożywce

korzeniowej (obraz stereoskopowy).

Skala dla fotografii: 0, 7a =200 µm; 1, 7, 7b = 50 µm; 2,3,5 =20 µm ; 11 =1 mm.

Zawiązek korzenia przybyszowego i kompleksy komórkowe z pasmem ksylemu

(strzałki).

4.6 Zawartość barwników fotosyntetycznych w kulturach pędowych in

vitro lnu zwyczajnego

Nie zaobserwowano istotnych różnic w zawartości chlorofilu a, b sumy tych

barwników oraz karotenoidów w 7-dniowych sterylnych siewkach obu badanych

odmian lnu (Ryc. 22 A-C, 23). Natomiast fragmenty hipokotyli pochodzące z siewek

odmiany Selena odznaczały się wyższą o około 30% zawartością barwników

fotosyntetycznych w porównaniu do odmiany Szafir (czas wzrostu 0). Wraz ze

wzrostem kultur pędowych odmiany Selena zawartość barwników obniżała się w

porównaniu do kultur odmiany Szafir (Ryc. 22 A-C, 23). Wszystkie warianty

doświadczalne odznaczały się wyższą zawartością chlorofilu a spośród badanych

barwników fotosyntetycznych (Ryc. 22 A).

102

A)

B)

C)

Ryc. 22. Zawartość chlorofilu a (A), chlorofilu b (B), sumy chlorofilu a+b (C) w 7-dniowych

siewkach (Siewki), hipokotylach (czas wzrostu 0) oraz w kulturach in vitro lnu zwyczajnego,

rosnących na pożywce pędowej. Wartości średnie ±SD. * Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05.

(Siewki – 7-dniowe sterylne siewki lnu stanowiące źródło eksplantatów, 5, 14, 28 – kultury in

vitro po 5, 14, 28 dniach wzrostu)

0

200

400

600

800

1000

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść c

hlo

rofi

lu a

[µ

g g

-1

św.m

.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

* * * *

0

200

400

600

800

1000

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść c

hlo

rofi

lu b

[µ

g g

-1

św.m

.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

* * *

0

200

400

600

800

1000

Siewki 0 5 14 28 Za

wa

rto

ść c

hlo

rofi

lu a

+b

[µ

g g

-1 ś

w.m

.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

* * * *

103

Ryc. 23. Zawartość karotenoidów w 7-dniowych siewkach (Siewki), hipokotylach (czas

wzrostu 0) oraz w kulturach in vitro lnu zwyczajnego, rosnących na pożywce pędowej.

Wartości średnie ±SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Szczegółowy opis wariantów doświadczalnych – w opisie Ryc. 22.

4.7 Intensywność fotosyntezy netto (PN) i oddychania ciemniowego (DR)

kultur pędowych in vitro lnu zwyczajnego

Najwyższą intensywnością fotosyntezy charakteryzowały się 7- dniowe siewki

lnu odm. Selena. Kultury odm. Szafir w 5-tym dniu wzrostu charakteryzowały się

wyższą o około 40% intensywnością fotosyntezy, w porównaniu do kultur odm. Selena

(Ryc. 24 A). W trakcie wzrostu kultur pędowych badanych odmian nastąpiło obniżenie

ich aktywności fotosyntetycznej (Ryc. 24 A).

We wszystkich badanych wariantach doświadczalnych nie odnotowano istotnej różnicy

w intensywności oddychania (Ryc. 24 B).

0

200

400

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść k

aro

ten

oid

ów

[µ

g g

-1 ś

w.m

.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

* * * *

104

A)

B)

Ryc. 24. Intensywność fotosyntezy netto (A) oraz oddychania ciemniowego (B) w przeliczeniu

na g św.m. 7-dniowych siewek, eksplantatów z kultur in vitro lnu zwyczajnego, rosnących na

pożywce pędowej. Wartości średnie ±SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


4.8 Analiza związków chemicznych przy użyciu chromatografii gazowej ze

spektrometrią mas (GC-MS)

4.8.1 Analiza LZO w kulturach pędowych lnu zwyczajnego z wykorzystaniem

mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (SPME)

Odmiana Selena charakteryzowała się bardziej zróżnicowanym składem

chemicznym emitowanych związków (24 zidentyfikowane związki) w porównaniu do

odmiany Szafir (15 zidentyfikowanych związków). Butan-2-on wykazywał największy

procentowy udział w ogólnej ilości związków emitowanych przez 7-dniowe siewki oraz

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Siewki 5 14 28 PN[µ

mo

l C

O2 m

in-1

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

*

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Siewki 5 14 28 DR

[µ

mo

l C

O2 m

in-1

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

105

kultury pędowe in vitro odm. Szafir (Tab. 14), n-heksan w przypadku odm. Selena

(Tab. 15). Zawartość tych związków malała znacznie wraz ze wzrostem kultur.

W trakcie wzrostu kultur odm. Szafir zawartość etanolu wzrosła 20-krotnie,

natomiast 2-cyjanopropen, 2-cyjanopropan - 10-krotnie. W kulturach 5-dniowych odm.

Szafir zanotowano ponad 15% udział acetonu, którego zawartość obniżała się w trakcie

wzrostu kultur (Tab. 14). Najwyższą zawartość eteru dietylowego (3,07%) oraz 2-

cyjanobutanu (5,92%) odnotowano w 14 dniu wzrostu kultur odm. Szafir. W trakcie

wzrostu kultur ilość siarczku dimetylu, estru etylowego kwasu 3-hydroksymigdałowego

oraz tetradekanu zwiększała się (Tab. 14).

Wraz ze wzrostem kultur pędowych odm. Selena, procentowy udział etanolu

zwiększył się do 60% wraz ze wzrostem kultur. W siewkach i kulturach 5-dniowych

zawartość acetonu była wyższa niż w kulturach 14 i 28 - dniowych (Tab. 15). Spośród

związków emitowanych przez 7-dniowe siewki najwyższą zawartość odnotowano dla

siarczku dimetylu (1,49%), natomiast w kulturach w 5-tym dniu wzrostu dla n-

heksanolu (1,60%). W kulturach 14-dniowych najwyższą zawartością odznaczały się:

eter dietylowy (7,60%), kwas szczawiowy (2,80%) oraz n-pentadekan (2,07%).

Najwyższą zawartość spośród związków emitowanych przez 28 - dniowe kultury odm.

Selena wykazywały butan-2-on (7,20%) oraz octan etylu (4,70%; Tab. 15).

106

Tab. 14. Związki emitowane przez 7-dniowe siewki oraz kultury pędowe in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

(Siewki – 7-dniowe sterylne siewki lnu stanowiące źródło eksplantatów, 5, 14, 28 – kultury in vitro po 5, 14, 28 dniach wzrostu)

Lp. Wynik identyfikacji Iexp Ilit Trzy największe

piki m/z

Zawartość [%]

Siewki 5 14 28

1. Etanol < 500 482 31, 45, 29 0,02 0,67 26,75 26,40

2. Aceton 500±1 500 43,58, 15 10,19 15,11 12,97 6,22

3. Eter dietylowy 506±1 504 31, 59, 45 0,58 2,25 3,07 1,57

4. Siarczek dimetylu 517±1 517 62, 47, 45 0,62 - 0,29 4,82

5. Octan metylu 525±1 523 43, 74, 42 - - - 1,78

6. Butan-2-on 599±1 598 43, 72, 29 87,50 70,90 20,27 21,66

7. 2-Cyjanopropen 603±1 611 41, 67, 66 - 3,74 9,87 12,14

8. 2-Cyjanopropan 622±1 626 42, 68, 54 0,17 1,92 10,89 9,85

9. 2-Metylobutanal 659±1 658 41, 57, 29 0,11 - - -

10. Pentan-3-on 699±1 688 57, 29, 86 0,13 - - -

11. 2-Cyjanobutan 723±1 726 55, 54, 27 0,13 0,29 5,92 3,92

12. 2-Metyl-1-butanol 737±1 740 56, 57, 41 0,13 - - -

13. Ester etylowy kwasu 3-

Hydroksymigdałowego 1162±1 - 267, 73, 268 0,07 0,85 1,82 2,43

14. Kwas 2-Metylobursztynowy 1330±1 1330 73, 147, 207 0,36 4,18 7,73 7,83

15. Tetradekan 1401±1 1400 57, 43, 71 - 0,08 0,41 1,36

107

Tab. 15. Związki emitowane przez 7-dniowe siewki oraz kultury pędowe in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena

(Siewki – 7-dniowe sterylne siewki lnu stanowiące źródło eksplantatów, 5, 14, 28 – kultury in vitro po 5, 14, 28 dniach wzrostu)

Lp. Wynik identyfikacji Iexp Ilit Trzy największe

piki m/z

Zawartość [%]

Siewki 5 14 28

1. Aldehyd octowy <500 427 44, 29, 15 - - - 1,79

2. Etanol < 500 482 31, 45, 29 - 0,95 3,94 60,08

3. Aceton 500±1 500 43,58, 15 12,37 7,92 10,64 4,53

4. Eter dietylowy 502±1 504 31, 59, 45 1,10 0,73 7,60 1,26

5. Siarczek dimetylu 517±1 517 62, 47, 45 1,49 - - -

6. Butan-2-on 591±1 598 43, 72, 29 - - - 7,20

7. n-Heksan 601±1 600 57, 43, 41 82,46 85,80 65,86 17,75

8. Octan etylu 612±1 613 43, 61, 45 - - 4,70

9. 2-Cyjanopropan 622±1 626 42, 68, 54 0,25 0,16 1,53 -

10. Pentan-2-on 690±1 689 41, 43, 86 - - 0,33 -

11. Pentan-3-on 697±1 688 57, 29, 86 0,64 0,91 1,78 -

12. 3-Hydroxy-butan-2-on, izomer1 709±1 712 45, 43, 88 - - - 0,46

13. 3-Hydroxy-butan-2-on, izomer 2 712±1 712 45, 43, 88 - - - 0,59

14. 2-Cyjanobutan 722±1 726 55, 54, 27 0,08 0,34 1,87 -

15. n-Heksanal 803±1 800 41, 44, 56 - 0,73 - -

16. n-Heksanol 870±1 870 31, 43, 56 - 1,60 - -

17. Ester etylowy kwasu 3-

Hydroksymigdałowego 1161±1 - 267, 73, 268 0,14 - - -

108

18. n-Tridekan 1301±1 1300 57, 43, 71 - - 0,31 -

19. Kwas szczawiowy 1329±1 1333 73, 147, 45 0,93 - 2,80 -

20. n-Tetradekan 1400±1 1400 57, 43, 71 0,15 0,18 0,67 0,24

21. n-Pentadekan 1500±1 1500 57, 43, 71 0,31 0,45 2,07 0,87

22. n-Heksadekan 1600±1 1600 57, 43, 71 - 0,05 0,22 0,11

23. 1-(2-furylo)-3-buten-1,2-diol 1607±1 - - - - 0,24 0,11

24. n-Heptadekan 1700±1 1700 57, 43, 71 0,07 0,18 0,14 0,31

109

4.8.2 Analiza związków organicznych w ekstraktach metanolowych kultur

pędowych lnu zwyczajnego

Największy procentowy udział spośród związków zidentyfikowanych w

ekstraktach pozyskanych z 7-dniowych siewek oraz kultur pędowych lnu odm. Szafir,

stanowiły węglowodany i glukozydy od 43% (kultury 5 i 14 -dniowe) do 78% (siewki

oraz kultury 28 - dniowe) (Ryc. 25 A-D). W ekstraktach pozyskanych z 5 i 14 -

dniowych kultur, zaobserwowano zwiększenie udziału związków należących do grupy

kwasów alifatycznych i glicerydów, aminokwasów oraz heterocyklicznych związków

zawierających azot (Ryc. 25 B i C). Procentowy udział alkoholi polihydroksylowych

wzrastał (od 0,2% - kultury 5 - dniowe do 3% - kultury 28 - dniowe) w ekstraktach

pochodzących z kultur pędowych (Ryc. 25 B-D).

A

B

110

Kwasy alifatyczne i glicerydy Węglowodany i glukozydy

Aminokwasy Alkohole polihydroksylowe

Heterocykliczne związki zawierające azot Diterpeny

Związki aromatyczne Pozostałe

Ryc. 25. Średni procentowy udział związków organicznych zidentyfikowanych w ekstraktach

metanolowych pozyskanych z 7-dniowych siewek (A), 5 (B), 14 (C) i 28 (D) - dniowych kultur

pędowych in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir.

Ekstrakty pozyskane z 7 dniowych siewek oraz z kultur pędowych lnu odm.

Selena, odznaczały się największą ilością węglowodanów i glukozydów (18% - 78%)

(Ryc. 26 A-D). Procentowy udział aminokwasów oraz związków aromatycznych obniża

się w ekstraktach z kultur, w porównaniu do 7-dniowych siewek. Ilość alkoholi

C

D

111

polihydroksylowych oraz kwasów alifatyczny i glicerydów była wyższa (2% i 22%

odpowiednio) w ekstraktach z kultur 5 - dniowych w porównaniu do pozostałych

wariantów doświadczenia (Ryc. 26 A-D).

A

B

112

Kwasy alifatyczne i glicerydy Węglowodany i glukozydy

Aminokwasy Alkohole polihydroksylowe

Heterocykliczne związki zawierające azot Diterpeny

Związki aromatyczne Pozostałe

Ryc. 26. Średni procentowy udział związków organicznych zidentyfikowanych w ekstraktach

metanolowych pozyskanych z 7 - dniowych siewek (A), 5 (B), 14 (C) i 28 (D) - dniowych

kultur pędowych in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena.

Szczegółowy wykaz związków organicznych zidentyfikowanych w ekstraktach

metanolowych, pochodzących z 7 - dniowych siewek oraz kultur pędowych lnu odm.

Szafir i odm. Selena, znajduje się w aneksie (Tab. I-II).

C

D

113

4.9 Zawartość metabolitów wtórnych w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

(Linum usitatissimum L.) odm. Szafir i odm. Selena

Zakładaniu i wzrostowi roślinnych kultur in vitro towarzyszy szereg czynników

stresowych, które mogą wpływać pozytywnie, bądź negatywnie na organogenezę.

Czynniki te, generując stres oksydacyjny, powodują podwyższenie aktywności sytemu

antyoksydacyjnego, który może być zaangażowany w regulację procesów

morfogenetycznych w warunkach in vitro. Dlatego też zbadano zawartość związków

fenolowych, antocyjanów, związków polifenolowych oraz tanin, metabolitów,

mających zdolność antyoksydacyjną w 7- dniowych siewkach lnu oleistego i

włóknistego oraz w kulturach pędowych i korzeniowych w różnym czasie ich wzrostu.

4.9.1 Zawartość związków fenolowych i antocyjanów w kulturach pędowych

in vitro lnu zwyczajnego

Zawartość fenylopropanoidów i flawonoidów była wyższa w siewkach (o około

30%) oraz fragmentach hipokotyli (o około 10%) odm. Szafir, w porównaniu do odm.

Selena (Ryc. 27A). Zawartość powyższych związków fenolowych, wraz z upływem

czasu wzrostu kultur obu badanych typów lnu, obniżała się. Zawartość antocyjanów w

fragmentach hipokotyli lnu włóknistego była istotnie wyższa (o 30%) w porównaniu do

lnu oleistego (Ryc. 27 B). Wraz z upływem czasu wzrostu kultur obu odmian, ilość tego

antyoksydantu obniżała się.

114

A)

B)

Ryc. 27. Zawartość fenylopropanoidów i flawonoidów (A) oraz antocyjanów (B) w 7-dniowych

siewkach, hipokotylach, kulturach pędowych in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir oraz Selena.

Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

(Siewki – 7-dniowe sterylne siewki lnu stanowiące źródło eksplantatów; 0 – fragmenty

hipokotyli 7-dniowych siewek; 5, 14, 28 – kultury in vitro po 5- tym, 14-tym, 28-mym dniu

wzrostu).

4.9.2 Zawartość związków fenolowych i antocyjanów w kulturach korzeniowych


Zawartość fenylopropanoidów i flawonoidów była wyższa w 7- dniowych

siewkach (o około 30%) i fragmentach hipokotyli (o około 10%) odm. Szafir, w

porównaniu do odm. Selena. W czasie wzrostu kultur korzeniowych obu odmian,

zawartość tych antyoksydantów obniżyła się, w porównaniu do siewek i fragmentów

hipokotyli średnio o 80% (Ryc. 28 A). W 5-tym (o 35%) i 28-mym dniu (o około 40%)

0

4

8

12

16

Siewki 0 5 14 28 Za

wa

rto

ść f

eny

lop

rop

an

oid

ów

i f

law

on

oid

ów

[U

mg

-1 b

iałk

a]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

*

0

0,4

0,8

1,2

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść a

nto

cyja

nó

w

[U

mg

-1 b

iałk

a]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

115

wzrostu kultur zawartość powyższych związków fenolowych była istotnie wyższa w

kulturach korzeniowych odm. Selena (typ włóknisty lnu), w porównaniu do odm. Szafir

(typ oleisty lnu). Zawartość antocyjanów w fragmentach hipokotyli odm. Selena była

wyższa w stosunku do odm. Szafir o 30%. W trakcie wzrostu kultur ilość antocyjanów

obniżyła się w porównaniu do siewek i pobranych z nich eksplantatów hipokotylowych

obu odmian o około 90% (Ryc. 28 B).

A)

B)

Ryc. 28. Zawartość fenylopropanoidów i flawonoidów (A) oraz antocyjanów (B) w 7-dniowych

siewkach, hipokotylach, kulturach korzeniowych in vitro lnu zwyczajnego odm Szafir oraz

odm. Selena. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


hipokotyli 7-dniowych siewek; 5, 14, 28 – kultury in vitro po 5-tym, 14-tym, 28-mym dniu

wzrostu).

0

4

8

12

16

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść f

eny

lop

rop

an

oid

ów

i f

law

on

oid

ów

[U

mg

-1 b

iałk

a]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

*

*

*

0

0,4

0,8

1,2

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść a

nto

cyja

nó

w

[U m

g -

1 b

iałk

a]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

*

116


zawartości związków fenolowych i antocyjanów w kulturach pędowych i

korzeniowych in vitro lnu zwyczajnego

Siewki oraz fragmenty hipokotyli odm. Selena charakteryzowały się wyższą (o

około 45%) zawartością białka w porównaniu do odm. Szafir (Ryc. 29 A, B). W

kulturach pędowych obu badanych odmian, zawartość białka występowała na

podobnym poziomie przez cały okres wzrostu (Ryc. 29 A). W kulturach korzeniowych

najwyższą zawartość białka odnotowano w kulturach odm. Szafir po 5-ciu dniach o

około 38% i po 14-tu dniach o około 30 % w stosunku do odm. Selena (Ryc. 29 B).

A)

B)

Ryc. 29. Zawartość białka w ekstraktach wykorzystanych do oznaczenia zawartości związków

fenolowych i antocyjanów w 7-dniowych siewkach (Siewki), hipokotylach (czas wzrostu 0)

oraz w kulturach pędowych (A) i korzeniowych (B) in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir oraz

odm. Selena. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

(Siewki – 7-dniowe sterylne siewki lnu stanowiące źródło eksplantatów; 0 - fragmenty


wzrostu)

0

4

8

12

16

20

24

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść b

iałk

a [

mg

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

*

0

4

8

12

16

20

24

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść b

iałk

a [

mg

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

* *

*

117

4.9.4 Zawartość związków polifenolowych i tanin w kulturach pędowych in vitro

lnu zwyczajnego

Całkowita zawartość fenoli w siewkach odm. Szafir była o około 15% wyższa w

porównaniu do odm. Selena (Ryc. 30 A). W kulturach pędowych, rosnących w

warunkach in vitro, zawartość polifenoli obniżyła się o około 40% w stosunku do

fragmentów hipokotyli, będących eksplantatmi. Zawartość związków polifenolowych

wzrastała w kulturach pędowych odm. Selena i była wyższa w kulturach 5 (o około

30%) i 14-dniowych (o około 15%) w stosunku do kultur odm. Szafir. Zawartość tanin

była wyższa w 7-dniowych siewkach lnu odm. Szafir o około 45%, w porównaniu do

siewek odm. Selena (Ryc. 30 B). W 5-dniowych kulturach pędowych odm. Selena

zaobserwowano wzrost ilości tanin w stosunku do kultur odm. Szafir o około 30%.

A)

B)

Ryc. 30. Zawartość związków polifenolowych (A) oraz tanin (B) w 7-dniowych siewkach

(Siewki), hipokotylach (czas wzrostu 0), kulturach pędowych in vitro lnu zwyczajnego odm.

Szafir oraz odm. Selena. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.



wzrostu).

0

4

8

12

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść z

wią

zkó

w

po

life

no

low

ych

[m

g g

-1 s

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

*

*

0

4

8

12

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść t

an

in [

mg

g-1

s.m

.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

* *

118

4.9.5 Zawartość związków polifenolowych i tanin w kulturach korzeniowych


Zawartość związków polifenolowych była wyższa w 7-dniowych siewkach lnu

odm. Szafir niż odm. Selena o około 15% (Ryc. 31 A). Wzrastała natomiast w kulturach

korzeniowych lnu włóknistego i była istotnie wyższa w 14-tym i 28-mym dniu o około

35%, w porównaniu do kultur lnu oleistego. Polifenole występowały w znacznie

większej ilości w hipokotylach obu badanych odmian lnu, niż w siewkach oraz

kulturach korzeniowych (Ryc. 31 A). Zaobserwowano istotną różnicę w zawartości

tanin w 7-dniowych siewkach badanych odmian. Ilość tanin w siewkach odm. Szafir

była wyższa o 45% w porównaniu do odm. Selena (Ryc. 31 B). Poziom tego

antyoksydantu był najwyższy w fragmentach hipokotyli obu odmian. Istotny wzrost

zawartości tanin odnotowano w kulturach w 14-tym i 28-mym dniu wzrostu. Był

wyższy w kulturach lnu włóknistego o 15% (kultura 14-dniowa) i o 40% (kultura 28-

dniowa), niż u lnu oleistego (Ryc. 31 B).

119

A)

B)

Ryc. 31. Zawartość związków polifenolowych (A) oraz tanin (B) w 7-dniowych siewkach

(Siewki), hipokotylach (czas wzrostu 0), kulturach korzeniowych in vitro lnu zwyczajnego odm.




wzrostu).

4.10 Aktywność enzymów antyoksydacyjnych w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) odm. Szafir i odm. Selena

Parametry stresu oksydacyjnego m.in. zawartość H2O2 (Ryc. 43, Ryc. 44), oznaczona w

czasie wzrostu kultur kontrolnych badanych odmian lnu, może świadczyć o

zachodzącym stresie oksydacyjnym. Zmiany w aktywności enzymów

antyoksydacyjnych, takich jak CAT czy SOD, na różnym etapie wzrostu kultur, może

mieć znaczenie w regulacji organogenezy lnu badanych odmian.

0

4

8

12

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść z

wią

zkó

w

po

life

no

low

ych

[m

g g

-1 s

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

* *

*

0

4

8

12

Siewki 0 5 14 28 Za

wa

rto

ść t

an

in [

mg

g-1

s.m

.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

* * *

120

4.10.1 Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w kulturach pędowych in

vitro lnu zwyczajnego

Najwyższą aktywność SOD stwierdzono w fragmentach hipokotyli (0 dni wzrostu).

Istotnie wyższą aktywność (o około 10%) odnotowano w przypadku hipokotyli odm.

Selena, w stosunku do odm. Szafir (Ryc. 32 A). W siewkach badanych odmian nie

stwierdzono istotnych różnic w aktywności SOD. Wraz ze wzrostem kultur odm. Szafir,

aktywność SOD spadała. W 14-tym i 28-mym dniu wzrostu kultur, aktywność SOD

była istotnie wyższa (o 40% - kultury 14 - dniowe oraz o 94% - kultury 28 - dniowe) w

kulturach lnu włóknistego, w porównaniu do lnu oleistego (Ryc. 32 A).

Najwyższą aktywność CAT zaobserwowano w 7-dniowych siewkach badanych

odmian lnu. W siewkach odm. Szafir, aktywność CAT była wyższa o około 30%, niż u

odm. Selena (Ryc. 32 B). W takcie wzrostu kultur obu odmian odnotowano spadek

aktywności CAT. W 5-tym (o 40%) i 14-tym dniu (o 45%) wzrostu wyższą

aktywnością CAT odznaczały się kultury odm. Szafir (typ oleisty lnu), w porównaniu

do kultur odm. Selena (typ włóknisty lnu). W 28-mym dniu wzrostu kultur odm. Selena

aktywność CAT była wyższa o około 40%, niż w kulturach odm. Szafir (Ryc. 32 B).

121

A)

B)

Ryc. 32. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (A) oraz katalazy (B) w 7-dniowych siewkach

(Siewki), hipokotylach (0 dni wzrostu), kulturach pędowych in vitro lnu zwyczajnego odm.




wzrostu).

4.10.2 Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w kulturach

korzeniowych in vitro lnu zwyczajnego

Najwyższą aktywność SOD stwierdzono w fragmentach hipokotyli odm. Szafir

(Ryc. 33 A). W trakcie wzrostu kultur odm. Szafir odnotowano spadek aktywności tego

enzymu. W kulturach odm. Selena aktywność SOD utrzymywała się na wyższym

poziomie, niż w kulturach odm. Szafir. W 5-tym dniu wzrostu była wyższa o 33%, w

14-tym dniu wzrostu o 45%, 28-mym dniu wzrostu o 90% (Ryc. 33 A).

0

4

8

12

16

20

24

Siewki 0 5 14 28

SO

D [

U m

g-1

bia

łka

]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

* *

0

4

8

12

16

20

24

Siewki 0 5 14 28 CA

T [

mm

ol

H2O

2 m

g-1

bia

łka

min

-1]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

*

* *

122

Aktywność CAT w siewkach odm. Szafir była wyższa o 30% niż u odm. Selena

(Ryc. 33 B). W trakcie wzrostu kultur badanych odmian odnotowano spadek

aktywności CAT. W 5-tym dniu wzrostu aktywność tego enzymu była wyższa w

kulturach odm. Selena o około 80%, w porównaniu do kultur odm. Szafir (Ryc. 33 B).

A)

B)

Ryc. 33. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (A) oraz katalazy (B) w 7-dniowych siewkach

(Siewki), hipokotylach (0 dni wzrostu), kulturach korzeniowych in vitro lnu zwyczajnego odm.

Szafir oraz odm. Selena. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

(Siewki – 7- dniowe sterylne siewki lnu stanowiące źródło eksplantatów; 0 – fragmenty


wzrostu).

0

4

8

12

16

20

24

Siewki 0 5 14 28

SO

D [

U m

g-1

bia

łka

]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

* *

*

*

0

4

8

12

16

20

24

Siewki 0 5 14 28 CA

T [

mm

ol

H2O

2 m

g-1

bia

łka

min

-1]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

* *

123


aktywności enzymów antyoksydacyjnych w kulturach pędowych

i korzeniowych in vitro lnu zwyczajnego

Siewki (o około 20%) oraz fragmenty hipokotyli (o około 10%) odm. Selena

charakteryzowały się wyższą zawartością białka w porównaniu do odm. Szafir (Ryc. 34

A, B). W kulturach pędowych odm. Szafir obserwowano podobną zawartość białka na

wszystkich badanych etapach wzrostu kultur (Ryc. 34 A). W kulturach odm. Selena w

28-mym dniu wzrostu, zawartość białka była niższa o około 20%, w stosunku do kultur

odm. Szafir (Ryc. 34 A). W kulturach korzeniowych najwyższą zawartość białka

odnotowano w kulturach lnu oleistego po 5-ciu dniach wzrostu (Ryc. 34 B). W trakcie

wzrostu kultur badanych odmian, zawartość białka obniżała się. W kulturach

korzeniowych odm. Selena była niższa, niż kulturach odm. Szafir. W 5-tym dniu

wzrostu o około 14%, w 14-stym dniu o około 26%, i w 28-mym dniu wzrostu o około

30% (Ryc. 34 B).

124

A)

B)

Ryc. 34. Zawartość białka w ekstrakcie enzymatycznym wykorzystanym do oznaczenia

aktywności SOD i CAT w 7-dniowych siewkach (Siewki), hipokotylach (0 dni wzrostu) oraz w

kulturach pędowych (A) i korzeniowych (B) in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir oraz odm.

Selena. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

(Siewki – 7-dniowe sterylne siewki lnu stanowiące źródło eksplantatów; 0 - fragmenty


wzrostu).

0

40

80

120

160

Siewki 0 5 14 28

Za

wa

rto

ść b

iałk

a [

µg

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

* *

0

40

80

120

160

Siewki 0 5 14 28 Za

wa

rto

ść b

iałk

a [

µg

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir Selena

*

*

* *

*

125

4.11 Wpływ stresu osmotycznego na proces organogenezy w kulturach in

vitro lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) odm. Szafir i odm.

Selena

4.11.1 Wpływ stresu osmotycznego na organogenezę pędową w kulturach in vitro

lnu zwyczajnego odm. Szafir, rosnących na podłożu z dodatkiem różnych

rodzajów cukru

Stres osmotyczny indukowano zwiększając zawartość cukrów: sacharozy oraz

sorbitolu+maltozy w pożywce pędowej, na którą wykładano eksplantaty hipokotylowe,

pochodzące z siewek lnu odm. Szafir (typ oleisty) według opisu w p. 3.4.

Zwiększenie zawartości cukru w pożywce nie wpłynęło na poprawę

organogenezy pędowej u odm. Szafir (Ryc. 35). W 28-mym dniu wzrostu kultur

rosnących w obecności zwiększonej ilości sacharozy, w podłożu zaobserwowano

istotne obniżenie procenta reagujących eksplantatów - około 15% w porównaniu do

kontroli (Ryc. 35 A).


rosnących w warunkach stresu osmotycznego na pożywce MS ze zwiększoną zawartością

sacharozy (A) lub sorbitolu+maltozy (B). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie,

przy p≤0,05.

SI - dwukrotne zwiększenie zawartości sacharozy oraz sorbitolu+maltozy w podłożu w

stosunku do kontroli (K).

Eksplantaty rosnące w warunkach stresu osmotycznego na pożywce z dodatkiem

sacharozy, w 28-mym dniu wzrostu kultur charakteryzowały się podwyższoną świeżą i

suchą masą oraz zawartością wody przypadającą na miligram suchej masy w

0

20

40

60

80

100

7 14 21 28

% r

eag

ują

cych

ek

spla

nta

tów

Czas wzrostu [dni]

Szafir K SI

*

A

0

20

40

60

80

100

7 14 21 28

% r

eag

ują

cych

ek

spla

nta

tów

Czas wzrostu [dni]

Szafir K SI B

126

porównaniu do kontroli (Tab. 16 A). Świeża masa eksplantatów, rosnących w

warunkach stresu osmotycznego na pożywce z dodatkiem sorbitolu+maltozy,

bezpośrednio po stresie była niższa niż w kontroli, a w 28-mym dniu wzrostu była

wyższa w stosunku do kultur kontrolnych (Tab. 16 B).

Tab.16. Świeża i sucha masa eksplantatów z pędami oraz zawartość wody

w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir rosnących w warunkach stresu osmotycznego

na pożywce MS z dodatkiem sacharozy (A) lub sorbitolu+maltozy (B) w 14-tym dniu

(bezpośrednio po działaniu stresu) oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD.




A)

B)


tiobarbiturowym (TBARS) w kulturach pędowych lnu odm. Szafir,

rosnących na podłożu z dodatkiem różnych rodzajów cukru

Zawartość TBARS w kulturach pędowych odm. Szafir (typ oleisty lnu),

rosnących w warunkach stresu osmotycznego (SI) na pożywce z dodatkiem sacharozy,

obniżyła się o około 10%, w stosunku do kontroli bezpośrednio po działaniu stresu

(Ryc. 36 A). W kulturach rosnących na podłożu z podwyższoną zawartością

Czas

wzrostu

[dni]

Warianty

doświad

czenia

Świeża masa Sucha masa Zawartość H2O Zawartość H2O

[mg ekspl.-1

] [mg ekspl.-1

] [mg H2O mg-1


s.m.]

14 K 99,17±11,5 7,63±0,32 0,92±0,006 11,96±0,95

S I 90,03±5,54 7,67±0,61 0,91± 0,002 10,76±0,34

28 K 142,98±4,17 11,52±0,75 0,92±0,004 11,45±0,74

S I 199,52±5,09* 14,20±0,29* 0,93±0,002 13,05±0,33*

Czas

wzrostu

[dni]

Warianty

doświad

czenia


[mg ekspl.-1

] [mg ekspl.-1

] [mg H2O mg-1


s.m.]

14 K 54,03±9,15 3,47±0,60 0,93±0,005 14,63±1,22

S I 37,43±3,55* 2,70±0,43 0,93± 0,006 12,97±1,13

28 K 72,06±3,34 5,26±0,69 0,93±0,009 12,85±1,51

S I 87,77±5,18* 6,68±0,93 0,93±0,003 12,99±0,70

127

sorbitolu+maltozy, nie zaobserwowano różnic w zawartości TBARS, w porównaniu do

kontroli (Ryc. 36 B).

Ryc. 36. Zawartość produktów peroksydacji lipidów (TBARS) w kulturach pędowych lnu

zwyczajnego odm. Szafir rosnących w warunkach stresu osmotycznego na pożywce MS z

dodatkiem sacharozy (A) lub sorbitolu+maltozy (B) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu

stresu) oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD.

* Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.



Na podstawie wcześniejszych doświadczeń (p. 4.11.1 - 4.11.2) i wyników,

przedstawionych na ryc. 35 B oraz 36 B, do kolejnych analiz wybrano warianty z

podwyższoną zawartością sacharozy w podłożu.


organogenezę pędową w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

oraz odm. Selena

Zastosowanie stresu osmotycznego nie wpłynęło na efektywność organogenezy

pędowej w kulturach in vitro obu badanych odmian lnu (Ryc. 37 A, B). Liczba pędów

na eksplantatch narażonych na działanie stresu, była zbliżona do kontroli przez cały

okres wzrostu kultur obu odmian (Ryc. 38 A, B). Porównując badane odmiany to

Selena (typ włóknisty lnu) odznaczała się niższą liczbą pędów formujących się na

eksplantatach, niż odm. Szafir (Ryc. 38).

0

4

8

12

16

20

14 28

TB

AR

S [

nm

ol

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir K SI

*

0

4

8

12

16

20

14 28

TB

AR

S [

nm

ol

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir K SI B A

128


(A) i odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne (SI) i

trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia sacharozy w podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-

tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu), 21-wszym dniu oraz w 28-mym dniu wzrostu

kultur. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne (SI) i

trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia sacharozy w podłożu w stosunku do kontroli (K) w 14-



Eksplantaty pochodzące z siewek odm. Szafir, rosnące w warunkach stresu

osmotycznego w 28-mym dniu wzrostu kultur, charakteryzowały się podwyższoną

świeżą masą (SI oraz SII) i suchą masą (SI), w porównaniu do kontroli (Tab. 17 A).

Zawartość wody przypadająca na miligram suchej masy eksplantatów odm. Szafir i

0

20

40

60

80

100

14 21 28

% r

eag

ują

cych

ek

spla

nta

tów

Czas wzrostu [dni]

Szafir K S I S II A

0

20

40

60

80

100

14 21 28

% r

eag

ują

cych

ek

spla

nta

tów

Czas wzrostu [dni]

Selena K S I S II B

0

4

8

12

16

20

24

14 21 28

Lic

zba p

ędów

/ek

spl

[szt

]

Czas wzrostu [dni]

Szafir K S I S II A

0

4

8

12

16

20

24

14 21 28

Lic

zba p

ędów

/ek

spl.

[sz

t]

Czas wzrostu [dni]

Selena K S I S II B

129

odm. Selena bezpośrednio po działaniu stresu (SII), a także w 28-mym dniu wzrostu

kultur lnu oleistego, była niższa, w stosunku do kontroli (Tab. 17 A, B).


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących w

warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne (SI) i trzykrotne (SII) zwiększenie sacharozy w

podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu) oraz w

28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05

A)

Czas

wzrostu

[dni]

Warianty

doświad

czenia


[mg ekspl.-1

] [mg ekspl.-1

] [mg H2O mg-1


s.m.]

14

K 119,49±23,39 9,47±2,35 0,93±0,003 11,63±1,58

S I 106,42±11,19 9,67±1,14 0,92± 0,002 9,89±0,44

S II 102,52±9,83 9,93±0,45 0,91±0,003 8,46±0,46*

28

K 224,62±13,89 17,36±1,19 0,95±0,005 17,68±0,79

S I 347,70±31,99* 22,22±0,87* 0,94±0,007 16,15±0,99

S II 289,48±12,92* 18,76±0,86 0,93±0,005 14,25±0,67*

B) Czas

wzrostu

[tydzień]

Warianty

doświadcz

enia


[mg ekspl.-1

] [mg ekspl.-1

] [mg H2O mg-1


s.m.]

14

K 95,68±13,45 9,07±1,65 0,90±0,005 9,17±0,51

S I 129,32±28,24 13,18±3,29 0,90± 0,005 8,87±0,44

S II 111,64±23,99 15,30±4,01 0,86±0,009* 6,13±0,49*

28

K 509,44±190,09 32,19±8,95 0,91±0,026 11,30±2,97

S I 502,72±191,05 34,20±8,59 0,94±0,014 15,74±2,76

S II 436,99±160,37 31,12±7,99 0,94±0,009 14,41±1,21


organogenezę korzeniową w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

oraz odm. Selena

Organogeneza korzeniowa w kulturach odm. Szafir była efektywniejsza w

kulturach narażonych na działanie stresu (SII) o około 30%, w porównaniu do kontroli

po 21-dniach wzrostu kultur (Ryc. 39 A). W kulturach odm. Selena bezpośrednio po

działaniu stresu osmotycznego (SI), ryzogeneza była o 40% wyższa, w stosunku do

kultur kontrolnych (Ryc. 39 B). W 28-mym dniu wzrostu procent eksplantatów z

130

korzeniami obniżył się o około 30% w kulturach lnu włóknistego, rosnących na podłożu

z trzykrotnie zwiększoną zawartością sacharozy, w porównaniu do kontroli (Ryc. 39 B).

Liczba korzeni na eksplantatch narażonych na działanie stresu, była podobna do

kontroli przez cały okres wzrostu kultur obu odmian (Ryc. 40 A, B).


Szafir (A) i odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne (SI) i

trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia sacharozy w podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-




odm. Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne

(SI) i trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia sacharozy w podłożu w stosunku do kontroli (K)) w

14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu), 21-wszym dniu oraz w 28-mym dniu wzrostu


0

20

40

60

80

100

120

14 21 28

% r

eag

ują

cych

ek

spla

nta

tów

Czas wzrostu [dni]

Szafir K S II

*

A

0

20

40

60

80

100

120

14 21 28 %

rea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w

Czas wzrostu [dni]

Selena K S I S II

* *

B

0

4

8

12

16

20

24

14 21 28

Lic

zba k

orz

eni/

ek

spl.

[sz

t]

Czas wzrostu [dni]

Szafir K S II A

0

4

8

12

16

20

24

14 21 28

Lic

zba k

orz

eni/

ek

spl.

[sz

t]

Czas wzrostu [dni]

Selena K S I S II B

131

Zawartość wody przypadająca na miligram suchej masy eksplantatów odm.

Szafir poddanych stresowi osmotycznemu, była niższa bezpośrednio po działaniu

stresu, w porównaniu do eksplantatów kultur kontrolnych (Tab. 18 A).

Zawartość wody przypadająca na miligram suchej masy eksplantatów,

bezpośrednio po działaniu stresu, zwiększyła się w kulturach rosnących na podłożu z

dwukrotnie wyższą zawartością sacharozy (SI), w stosunku do kontroli. W kulturach

lnu odm. Selena (typ włóknisty), narażonych na działanie stresu osmotycznego (przy

trzykrotnym zwiększeniu stężenia sacharozy (SII) w pożywce), sucha masa była

wyższa, natomiast zawartość wody, przypadająca na miligram świeżej i suchej masy

eksplantatów, była niższa bezpośrednio po działaniu stresu, w porównaniu do kontroli

(Tab. 18 B).


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących w

warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne (SI) i trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia

sacharozy w podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu

stresu) oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne

statystycznie, przy p≤0,05

A)

Czas

wzrostu

[dni]

Warianty

doświad

czenia


[mg ekspl.-1

] [mg ekspl.-1

] [mg H2O mg-1


s.m.]

14 K 126,28±5,28 11,06±0,48 0,91±0,004 10,42±0,38

S II 132,50±18,69 13,70±4,06 0,90± 0,019 7,89±0,35*

28 K 489,92±81,58 29,95±5,36 0,94±0,004 15,39±0,55

S II 562,80±22,48 39,20±4,42 0,93±0,007 13,46±1,24

B) Czas

wzrostu

[tydzień]

Warianty

doświad

czenia


[mg ekspl.-1

] [mg ekspl.-1

] [mg H2O mg-1


s.m.]

14

K 431,48±85,80 25,45±3,82 0,94±0,006 15,88±1,70

S I 400,83±53,02 31,62±2,74 0,92± 0,004 11,64±0,68*

S II 370,28±56,10 35,02±4,09* 0,90±0,004* 9,55±0,46*

28

K 520,37±91,36 23,42±2,95 0,95±0,007 21,74±6,04

S I 521,29±93,83 19,44±5,09 0,97±0,007 27,16±7,87

S II 489,35±78,71 22,90±4,56 0,95±0,008 21,22±8,23

132


tiobarbiturowym (TBARS) w kulturach pędowych lnu zwyczajnego odm.

Szafir i odm. Selena, poddanych działaniu stresu osmotycznego

W kulturach pędowych odm. Szafir (typ oleisty lnu) oraz odm. Selena (typ

włóknisty lnu), poddanych działaniu stresu osmotycznego, nie zaobserwowano

wzmożonej peroksydacji lipidów (Ryc. 41 A, B).

Ryc. 41. Zawartość produktów peroksydacji lipidów (TBARS) w kulturach pędowych lnu

zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu

osmotycznego (dwukrotne (SI) i trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia sacharozy w podłożu w

stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu) oraz w 28-mym

dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


tiobarbiturowym (TBARS) w kulturach korzeniowych lnu zwyczajnego

odm. Szafir i odm. Selena, poddanych działaniu stresu osmotycznego

Wykazano zwiększenie zawartości (o około 28%) produktów peroksydacji

lipidów, reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) w kulturach korzeniowych

lnu oleistego, rosnących w warunkach stresu osmotycznego (SII) bezpośrednio po

działaniu stresu (14 dzień wzrostu), w porównaniu do kultur kontrolnych (Ryc. 42 A).

W kulturach korzeniowych odm. Selena poddanych działaniu stresu, nie

zaobserwowano wzmożonej peroksydacji lipidów (Ryc. 42 B).

0

4

8

12

16

20

24

14 28

TB

AR

S[n

mol

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir K SI SII A

0

4

8

12

16

20

24

14 28

TB

AR

S [

nm

ol

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Selena K S I S II B

133

Ryc. 42. Zawartość produktów peroksydacji lipidów (TBARS) w kulturach korzeniowych lnu


osmotycznego (dwukrotne (SI) i trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia sacharozy w podłożu w

stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu) oraz w 28-mym

dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

4.11.7 Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach pędowych lnu


osmotycznego

Obniżenie zawartości H2O2 o około 35% bezpośrednio po stresie,

zaobserwowano w kulturach lnu oleistego, rosnących na podłożu o dwukrotnie

zwiększonym stężeniu sacharozy (SI), w porównaniu do kontroli (Ryc. 43 A).

Zwiększenie zawartości H2O2 w kulturach pędowych lnu włóknistego, poddanych

działaniu stresu osmotycznego (SI oraz SII) o około 20% (SI) oraz 15% (SII), w

porównaniu do kultur kontrolnych, stwierdzono bezpośrednio po działaniu stresu (Ryc.

43 B).

0

4

8

12

16

20

24

14 28

TB

AR

S [

nm

ol

g-1

św

. m

.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir K SII

*

A

0

4

8

12

16

20

24

14 28

TB

AR

S [

nm

ol

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Selena K S I S II B

134

Ryc. 43. Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach pędowych lnu zwyczajnego odm.

Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne (SI)

i trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia sacharozy w podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-

tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu) oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki


4.11.8 Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach korzeniowych lnu


osmotycznego

Niewielkie podwyższenie zawartości H2O2 (o około 20%), w porównaniu do

kontroli, zaobserwowano w kulturach korzeniowych lnu typu oleistego bezpośrednio po

działaniu stresu osmotycznego (SII). Tendencja ta utrzymywała się również w 28-mym

dniu wzrostu kultur (Ryc. 44 A). Zawartość H2O2 w kulturach lnu typu włóknistego

obniżyła się o około 50% bezpośrednio po działaniu warunków stresowych (SI, SII), w

porównaniu do kontroli. W 28-mym dniu wzrostu, kultury narażone na działanie stresu

osmotycznego (SI, SII), charakteryzowały się zwiększeniem zawartości H2O2 o około

30%, w stosunku do kultur kontrolnych (Ryc. 44 B).

W kulturach pędowych (Ryc. 43) oraz korzeniowych (Ryc. 44) zawartość H2O2

była trzykrotnie wyższa u lnu odm. Selena (typ włóknisty), niż u odm Szafir (typ

oleisty).

0

200

400

600

800

1000

14 28

H2O

2 [

nm

ol

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir K SI SII

*

A

0

200

400

600

800

1000

14 28

H2O

2 [

um

ol

g -1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Selena K S I S II

* *

B

135

Ryc. 44. Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach korzeniowych lnu zwyczajnego odm.

Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne (SI)

i trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia sacharozy w podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-

tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu) oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki

średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

4.12 Wpływ SNP, bezpośrednio dodanego do pożywki, na przebieg

organogenezy w kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum

usitatissimum L.) odm. Szafir

Badano wpływ SNP, związku powszechnie stosowanego jako donor NO, na

efektywność organogenezy pędowej i korzeniowej wg metody opisanej w podrozdziale

3.5. Szczegółowe ustalenie wariantów doświadczalnych stosowanych na dalszym etapie

badań, przeprowadzono z wykorzystaniem lnu odm. Szafir (typ oleisty).

4.12.1 Wpływ SNP, bezpośrednio dodanego do pożywki ,na przebieg

organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

Dodatek SNP do podłoża nie miał wpływu na efektywność formowania się

pędów. Zarówno procent eksplantatów (Ryc. 45 A), na których obserwowano

pojawianie się pędów, jak i liczba tych organów (Ryc. 45 B) w kulturach rosnących w

obecności SNP, była zbliżona do kontroli.

0

200

400

600

800

1000

14 28

H2O

2[n

mol

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Szafir K SII

* *

A

0

200

400

600

800

1000

14 28

H2O

2 [

nm

ol

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

Selena K S I S II

* *

* *

B

136

A)

B)

Ryc. 45. Efektywność formowania pędów w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir w

zależności od ilości SNP dodanego do pożywki pędowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice


Świeża masa eksplantatów, pochodzących z kultur rosnących na pożywkach z

dodatkiem SNP, była niższa, niż kultur kontrolnych (Tab. 19). Istotnie mniejszą suchą

masą charakteryzowały się eksplantaty rosnące w obecności 50 µM roztworu SNP, w

porównaniu do kontroli. Zawartość wody w kulturach, przypadająca na gram świeżej i

suchej masy, była porównywalna we wszystkich wariantach doświadczenia (Tab. 19).

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir K 2µM 4µM 6µM 25µM 50µM

0

4

8

12

16

20

24

28

1 2 3 4

Lic

zba

ped

ów

/ek

spl

[szt

]


Szafir K 2µM 4µM 6µM 25µM 50µM

137


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir rosnących na pożywce pędowej z dodatkiem

SNP. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 846,70 ± 99,67 40,43 ± 5,67 0,94±0,005 15,36 ± 0,92

2 µM 602,00± 72,87* 39,47± 8,69 0,92 ± 0,009 15,68 ± 1,73

4 µM 606,95± 49,32* 36,17 ± 1,99 0,93 ± 0,003 15,71 ± 0,48

6 µM 554,63 ±77,52* 30,16 ± 4,37 0,93 ± 0,003 16,70 ± 0,61

25 µM 567,42 ± 62,32* 29,99± 3,65 0,94± 0,006 17,48± 2,11

50 µM 474,03± 41,84* 25,05± 3,11* 0,95± 0,009 18,71± 4,81

4.12.2 Wpływ SNP, bezpośrednio dodanego do pożywki, na przebieg

organogenezy korzeniowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm.

Szafir

W drugim tygodniu wzrostu kultur korzeniowych, rosnących na pożywce z

dodatkiem 6 µM SNP, zaobserwowano obniżenie efektywności organogenezy

korzeniowej o około 40% w porównaniu do kultur kontrolnych. W kolejnych

tygodniach wzrostu kultur, nie odnotowano różnic w ryzogenezie pomiędzy kulturami

rosnącymi na pożywce z SNP a kontrolą (Ryc. 46 A, B).

138

A)

B)

Ryc. 46. Efektywność formowania korzeni w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir w

zależności od ilości SNP dodanego do pożywki korzeniowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice


Świeża masa kultur korzeniowych, rosnących w obecności SNP była

porównywalna do kultur kontrolnych (Tab. 20). Sucha masa kultur rosnących na

pożywce z dodatkiem 2 µM roztworu SNP, była istotnie wyższa w stosunku do

kontroli. Zawartość wody, przypadająca na miligram świeżej i suchej masy we

wszystkich badanych kulturach, była porównywalna z kontrolą (Tab. 20).

0

20

40

60

80

100

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir K 2µM 4µM 6µM

*

0

5

10

15

20

25

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i/ek

spl

[szt

]


Szafir K 2µM 4µM 6µM

139


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir, rosnących na pożywce korzeniowej z

dodatkiem SNP. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 240,00 ± 34,58 21,40 ± 2,82 0,91 ± 0,004 10,38 ± 0,28

2 µM 301,20 ± 47,20 28,37± 3,27* 0,91 ± 0,00 10,70 ± 0,18

4 µM 305,72 ± 76,54 27,30 ± 4,26 0,89 ± 0,032 7,78 ± 1,94

6 µM 279,08 ± 29,60 24,48 ± 2,25 0,91 ± 0,015 11,59 ± 1,23

4.13 Wpływ par wydzielających się z wodnego roztworu SNP na przebieg

organogenezy w kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum

usitatissimum L.) odm. Szafir i odm. Selena


organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

24-godzinna ekspozycja kultur pędowych lnu odm. Szafir na pary wydzielające

się z wodnego roztworu SNP o wybranych stężeniach, spowodowała opóźnienie

procesu kaulogenezy (Ryc. 47 A, B). W kolejnych tygodniach wzrostu kultur

poddanych na 24-godzinnemu działaniu SNP o stężeniu 250 µM i 500 µM, tak jak w

kontroli zaobserwowano 100% organogenezę (Ryc. 47 A). Liczba pędów

indukowanych na eksplantatach była podobna we wszystkich testowanych wariantach

doświadczenia (Ryc. 47 B). Eksplantaty poddane ekspozycji na 5 mM i 10 mM roztwór

SNP, obumarły.

140

A)

B)

Ryc. 47. Efektywność formowania pędów w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

poddanych 24-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 40 ml wodnego

roztworu SNP, rosnących na pożywce pędowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne


Świeża i sucha masa eksplantatów poddanych 24-godzinnej ekspozycji na

działanie 250 µM oraz 500 µM roztworu SNP, rosnących przez 4 tygodnie na pożywce

pędowej, była porównywalna z kontrolą. W przypadku zawartości wody, przypadającej

na miligram świeżej i suchej masy, również nie zaobserwowano istotnych różnic

między kulturami poddanych działaniu 250 µM oraz 500 µM roztworu SNP a kontrolą

(Tab. 21). Eksplantaty poddane działaniu par wydzielających się z 5 mM i 10 mM

wodnego roztworu SNP, obumarły.

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir K 250µM 500µM 5mM 10mM

0

4

8

12

16

20

24

28

1 2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t.]


Szafir K 250 µM 500 µM 5mM 10mM

141


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir poddanych 24-godzinnej ekspozycji na

działanie par wydzielających się z wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce pędowej.

Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 646,70 ± 99,67 40,43 ± 5,67 0,94±0,011 15,30 ± 4,03

250 µM 698,32± 163,71 34,97± 10,69 0,95 ± 0,024 21,05 ± 9,78

500 µM 759,42± 58,79 40,01 ± 1,99 0,95 ± 0,007 18,20 ± 2,85

5 mM - - - -

10 mM - - - -

W kolejnych doświadczeniach zastosowano 3-godzinną ekspozycję na pary

wydzielające się z 5mM oraz 10 mM wodnego roztworu SNP.

Procent reagujących eksplantatów był niższy w kulturach poddanych działaniu

SNP. Kultury poddane ekspozycji na 5 mM roztwór SNP, charakteryzowały się o około

35% słabszą efektywnością organogenezy pędowej, natomiast kultury traktowane 10

mM roztworem SNP o około 50% słabszą efektywnością organogenezy w porównaniu

do kultur kontrolnych we wszystkich tygodniach wzrostu (Ryc. 48 A). W 2, 3 i 4

tygodniu wzrostu kultur, zaobserwowano mniejszą liczbę powstających pędów o około

47% w kulturach traktowanych parami wydzielającymi się z roztworu SNP, w stosunku

do kontroli (Ryc. 48 B).

142

A)

B)

Ryc. 48. Efektywność formowania pędów w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 40 ml wodnego

roztworu SNP, rosnących na pożywce pędowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne


Eksplantaty poddane 3-godzinnej ekspozycji na pary wydzielające się z 5 mM i

10 mM roztworu SNP, po 4 tygodniach wzrostu na pożywce pędowej,

charakteryzowały się podobną świeżą i suchą masą, w stosunku do kontroli (Tab. 22).

Zawartość wody, przypadająca na gram świeżej i suchej masy w porównaniu do

eksplantatów pochodzących z kultur kontrolnych, była podobna w kulturach poddanych

działaniu SNP (Tab. 22).

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir K 5mM 10mM

*

* *

* *

* * *

0

4

8

12

16

20

24

1 2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t]


Szafir K 5mM 10mM

* * * * * *

143



działanie par wydzielających się z 40 ml wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce

pędowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 610,61 ± 64,82 41,72 ± 4,77 0,93±0,023 16,81 ± 3,96

5 mM 682,30± 76,32 48,12± 3,60 0,92 ± 0,018 14,85 ± 3,66

10 mM 722,50± 54,25 60,30 ± 3,43* 0,93 ± 0,008 16,00 ± 1,67

Na podstawie opisanych wyżej doświadczeń (Ryc. 47; Ryc. 48) do dalszych

analiz wybrano 3-godzinną ekspozycję na pary wydzielające się z 5 mM wodnego

roztworu SNP. Zastosowano różną ilość: 5 ml, 10 ml, 20 ml oraz 30 ml roztworu SNP,

których działanie na efektywność organogenezy testowano w kulturach dwóch odmian

lnu, Szafir oraz Selena.


organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

Opary wydzielające się z wodnego roztworu SNP nie wpłynęły na poprawę

organogenezy pędowej obu badanych odmian lnu przez 4 tygodnie wzrostu kultur (Ryc.

49,A, B; Fot. 10). W kulturach odm. Szafir (typ oleisty lnu), poddanych działaniu

roztworu SNP w ilości 30 ml, w pierwszym tygodniu wzrostu procent eksplantatów z

formującymi się pędami był niższy o około 25% w porównaniu do kultur kontrolnych

(Ryc. 49 A). W pozostałych tygodniach wzrostu efektywność kaulogenezy była

podobna do kontroli (Ryc. 49 A, B). Ekspozycja na roztwór SNP nie wpłynęła na liczbę

powstających pędów na eksplantatach we wszystkich testowanych wariantach

doświadczalnych (Ryc. 50 A, B).

144

Fot. 10. Eksplantaty hipokotylowe lnu zwyczajnego odm. Szafir oraz odm. Selena z

uformowanymi pędami, poddane 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z

5mM wodnego roztworu SNP w ilości: 5 ml,10 ml, 20 ml i 30 ml, po 4 tygodniach wzrostu na

pożywce pędowej.

A)

B)


(A) oraz Selena (B) poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z

5mM wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce pędowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice


0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir K 5ml SNP 10ml SNP 20ml SNP 30ml SNP

*

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena K 5ml SNP 10ml SNP 20ml SNP 30ml SNP

145

A)

B)


Szafir (A) oraz Selena (B) poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających

się z 5mM wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce pędowej. Wyniki średnie ± SD.


Eksplantaty badanych odmian lnu, niezależnie od ilości SNP jakim były

traktowane, po 4 tygodniach wzrostu na pożywce pędowej odznaczały się podobną do

kontroli świeżą i suchą masą oraz zawartością wody przypadającą na miligram świeżej i

suchej masy (Tab. 23 A i B).

0

4

8

12

16

20

24

28

32

1 2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t.]



0

4

8

12

16

2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t.]



146


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz Selena (B) poddanych 3-godzinnej

ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP, rosnących na

pożywce pędowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05

A)

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 532,66 ± 149,81 34,14 ± 9,84 0,91±0,021 14,92 ± 3,38

5 ml 600,47± 101,51 32,54± 4,89 0,90 ± 0,008 12,70 ± 0,94

10 ml 631,10± 150,21 41,47 ± 6,79 0,91 ± 0,015 16,04 ± 1,65

20 ml 534,38±152,42 31,99±9,85 0,91±0,023 15,28±2,64

30 ml 598,43±187,21 34,90±11,88 0,88±0,041 15,98±3,23

B)

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 106,65 ± 40,20 14,40 ± 4,01 0,85±0,083 7,77 ± 1,56

5 ml 114,32± 12,71 14,97± 1,69 0,87 ± 0,016 7,04 ± 1,08

10 ml 100,42± 10,79 12,01 ± 1,99 0,87 ± 0,018 7,17 ± 1,27

20 ml 139,25±52,12 17,20±6,02 0,86±0,068 7,81 ± 1,70

30 ml 100,25±12,42 13,41±2,54 0,86±0,019 6,42 ± 1,05


organogenezy korzeniowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego, rosnących

na pożywkach bez dodatku hormonów

Efektywność organogenezy korzeniowej była niższa o około 50% w kulturach

odm. Szafir, poddanych działaniu par wydzielających się z 30 ml roztworu SNP, w

porównaniu do kontroli już w pierwszym tygodniu wzrostu (Ryc. 51 A). Efekt ten

zaobserwowano także w 4 tygodniu wzrostu kultur (Fot. 11). Ryzogeneza była o 30%

niższa w kulturach narażonych na działanie roztworu SNP w ilości 30 ml, w stosunku

do kultur kontrolnych (Ryc. 51 A). W kulturach odm. Szafir, jedynie na początku

wzrostu kultur, liczba uformowanych korzeni przypadająca na eksplantat była wyższa

147

(o około 30%) w kulturach poddanych działaniu 5 ml wodnego roztworu SNP, w

porównaniu do kontroli (Ryc. 52 A). W pozostałych tygodniach wzrostu liczba korzeni

była podobna, jak w kulturach kontrolnych (Ryc. 52 A).

Efektywność ryzogenezy w kulturach odm. Selena wzrosła w kulturach

poddanych działaniu par wydzielających się z 5 ml roztworu SNP (Ryc. 51 B; Fot. 11).

W trzecim tygodniu wzrostu kultur była o około 30% wyższa, a w 4 tygodniu wzrostu o

około 15% wyższa, w porównaniu do kultur kontrolnych (Ryc. 51 B). Ekspozycja

eksplantatów odm. Selena na pary wydzielające się z 5 ml wodnego roztworu SNP,

spowodowało zwiększenie liczby korzeni w kulturach w 4 tygodniu wzrostu o około

15%, w porównaniu do kontroli (Ryc. 52 B).


uformowanymi korzeniami, poddane 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających

się z 5 mM wodnego roztworu SNP w ilości: 5 ml,10 ml, 20 ml i 30 ml, po 4 tygodniach

wzrostu na pożywce korzeniowej.

148

A)

B)


Szafir (A) oraz Selena (B) poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających

się z 5 mM wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce korzeniowej. Wyniki średnie ± SD.


0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 % r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Szafir K 5ml 10ml 20ml 30ml

*

*

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w



*

*

149

A)

B)


odm. Szafir (A) oraz Selena (B) poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par

wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce korzeniowej.

Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Eksplantaty odm. Szafir, niezależnie od ilości roztworu SNP jakim były

traktowane, po 4 tygodniach wzrostu na pożywce korzeniowej charakteryzowały się

podobną świeżą oraz sucha masą, a także zawartością wody, w porównaniu do kultur

kontrolnych (Tab. 24 A).

Świeża masa oraz zawartość wody przypadająca na miligram suchej masy eksplantatów

odm. Selena poddanych działaniu roztworu SNP w ilości 20 ml, była najniższa, w

porównaniu do eksplantatów kultur kontrolnych (Tab. 24 B). Sucha masa, a także

zawartość wody przypadająca na miligram świeżej masy eksplantatów z korzeniami we

wszystkich badanych wariantach, była zbliżona do kontroli (Tab. 24 B).

0

4

8

12

16

20

24

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i/ek

spl.

[sz

t]


Szafir K 5ml 10ml 20ml 30ml

*

0

4

8

12

16

20

24

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i/ek

spl.

[sz

t.]



*

150



ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5 mM wodnego roztworu SNP, rosnących na

pożywce korzeniowej. Wyniki średnie ± SD.

A)

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 409,50 ± 128,39 33,31 ± 8,63 0,92±0,017 12,39 ± 2,63

5 ml 243,66± 131,76 26,97± 5,21 0,89 ± 0,033 10,80 ± 2,28

10 ml 352,63± 50,33 33,71 ± 3,92 0,87 ± 0,067 10,85 ± 1,23

20 ml 289,59±61,31 28,18±6,08 0,88±0,024 11,12±1,89

30 ml 312,56±75,71 29,83±7,40 0,87±0,058 11,74±1,91

B)

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 341,28 ± 34,56 22,59 ± 3,83 0,93±0,029 14,85 ± 2,40

5 ml 301,06± 30,30 19,90 ± 4,40 0,91 ± 0,042 14,54 ± 1,49

10 ml 319,96± 36,31 21,93 ± 2,50 0,92 ± 0,033 14,09 ± 1,86

20 ml 214,23±29,95* 19,55± 2,50 0,92±0,012 10,02 ± 1,45*

30 ml 340,84± 51,61 22,96± 4,00 0,92±0,040 15,25 ± 3,76


procesu organogenezy w kulturach in vitro lnu zwyczajnego, rosnących na

pożywkach bez dodatku hormonów

W kolejnym wariancie doświadczalnym postanowiono sprawdzić jak opary

wydzielające się z wodnego roztworu SNP wpływają na kultury rosnące na podłożu bez

dodatku hormonów.

W kulturach rosnących na podłożu bez dodatku hormonów zaobserwowano

powstawanie zarówno pędów jak i korzeni. W przypadku lnu oleistego na eksplantatach

pojawiały się tylko pędy, zarówno w kontroli jak i wariantach poddanych działaniu

151

SNP. W kulturach odm. Szafir rosnących, na podłożu bez dodatku hormonów,

poddanych fumigacji SNP, nie zaobserwowano różnic w organogenezie pędów, w

porównaniu do kontroli (Ryc. 53 A; Fot. 12).

W kulturach odm. Selena rosnących na podłożu bez dodatku hormonów,

odnotowano powstawanie pędów, jak i korzeni, na eksplantatch (Ryc. 53 B, C; Fot. 13).

Istotne różnice w organogenezie pędowej w porównaniu do kultur kontrolnych

obserwowano w kulturach poddanych działaniu 10 ml SNP w 3 i 4 tygodniu wzrostu

(Ryc. 53 B). Wyższą organogenezą korzeniową charakteryzowały się kultury poddane

działaniu 5 oraz 10 ml roztworu SNP. W drugim tygodniu wzrostu organogeneza była

wyższa o około 40% w kulturach narażonych na działanie SNP w ilości 5 ml, w

porównaniu z kontrolą. W trzecim i czwartym tygodniu ryzogeneza była efektywniejsza

od kontroli o 40% (kultury poddane działaniu 5 ml roztworu SNP) i o około 35% w

kulturach poddanych ekspozycji na 10 ml roztworu SNP (Ryc. 53 C).

Efektywniejsze formowanie się korzeni zaobserwowano w kulturach odm.

Selena poddanych działaniu roztworu SNP w ilości 5 ml, w porównaniu do kultur

kontrolnych. W drugim i trzecim tygodniu wzrostu liczba korzeni w kulturach lnu

włóknistego narażonych na działanie SNP była około dwukrotnie wyższa, niż liczba

korzeni powstających w kulturach kontrolnych (Ryc. 54 C).

Liczba powstających pędów w kulturach odm. Szafir, jak i odm. Selena,

poddanych działaniu SNP, nie różniła się istotnie w stosunku do liczby tych organów

otrzymanych w kulturach kontrolnych prze cały okres wzrostu kultury (Ryc. 54 A, B).

152

Fot. 12. Kultury in vitro oraz eksplantaty hipokotylowe lnu zwyczajnego odm. Szafir, poddane 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z

5mM wodnego roztworu SNP w ilości: 5 ml,10 ml, 20 ml i 30 ml, po 4 tygodniach wzrostu na pożywce MS bez dodatku hormonów.

153

Fot. 13. Kultury in vitro oraz eksplantaty hipokotylowe lnu zwyczajnego odm. Selena, poddane 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z

5 mM wodnego roztworu SNP w ilości: 5 ml,10 ml, 20 ml i 30 ml, po 4 tygodniach wzrostu na pożywce B5 bez dodatku hormonów.

K 5ml 10ml 20ml 30ml

154

A)

B)

C)


(A) i Selena (B) oraz organogenezy korzeniowej w kulturach odm. Selena (C) poddanych

3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP,

rosnących na podłożu bez dodatku hormonów. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne


0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w



0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w



* *

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w



*

* *

* *

155

A)

B)

C)


Szafir (A) i Selena (B) oraz liczba korzeni formujących się na eksplantatch hipokotylowych

odm. Selena (C) poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5 mM

wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce bez dodatku hormonów. Wyniki średnie ± SD.


0

4

8

12

16

20

1 2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ ek

spl.

[sz

t.]



0

4

8

12

16

20

1 2 3 4

Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t.]



0

4

8

12

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i/ek

spl.

[sz

t]



* *

156

Świeża i sucha masa eksplantatów odm. Szafir, poddanych działaniu SNP w

ilości 10, 20 oraz 30 ml i rosnących na podłożu bez dodatku hormonów, była istotnie

niższa, w porównaniu do kontroli (Tab. 25 A). W przypadku zawartości wody,

przypadającej na miligram świeżej i suchej masy, nie zaobserwowano różnic między

badanymi wariantami a kontrolą (Tab. 25 A).

Eksplantaty odm. Selena, poddane działaniu roztworu SNP w ilości 5 i 10 ml,

charakteryzowały się wyższą świeżą masą, w stosunku do kontroli (Tab. 25 B). Sucha

masa eksplantatów narażonych na działanie 10 ml SNP, była najwyższa. Zawartość

wody przypadająca na miligram suchej masy w kulturach, których eksplantaty poddane

były działaniu SNP w ilości 20 i 30 ml, była istotnie wyższa niż w kulturach

kontrolnych (Tab. 25 B).

Tab. 25. Świeża i sucha masa eksplantatów z pędami i korzeniami oraz zawartość wody


ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5 mM wodnego roztworu SNP, rosnących na

pożywce bez dodatku hormonów. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05

A)

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 30,15 ± 6,89 4,46 ± 0,54 0,86±0,055 7,79 ± 1,28

5 ml 22,15± 4,82 2,88± 0,96 0,86 ± 0,086 6,98 ± 0,64

10 ml 14,89 ± 3,36* 1,87 ± 0,26* 0,85 ± 0,051 6,50 ± 0,76

20 ml 17,59 ± 3,84* 2,11± 0,53* 0,85±0,045 5,84± 0,96

30 ml 25,50 ± 5,52 3,26± 0,21* 0,87±0,082 9,59± 1,97

B)

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 39,69 ± 4,14 7,36 ± 0,95 0,81±0,070 4,64 ± 0,58

5 ml 53,36± 2,25* 8,54± 0,64 0,85 ± 0,018 5,75 ± 0,84

10 ml 61,99± 5,42* 9,36 ± 0,29* 0,86 ± 0,017 6,04 ± 0,76

20 ml 33,38± 3,69 5,51± 0,86 0,84±0,081 6,09± 0,40*

30 ml 50,15±8,86 7,02± 0,65 0,85±0,047 6,13± 0,45*

157

Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń, dotyczących wpływu par

wydzielających się z 5 mM wodnego roztworu SNP na efektywność organogenezy, do

dalszych doświadczeń wybrano: kultury odm. Selena rosnące na pożywce korzeniowej

poddane działaniu 5 ml roztworu SNP oraz kultury odm. Selena rosnące na podłożu bez

dodatku hormonów, poddane ekspozycji na 5 i 10 ml roztworu SNP, ponieważ dodatni

efekt SNP był w tych wariantach widoczny (Ryc. 51-54).

4.14 Wpływ c-PTIO (ang. 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-


kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.),

poddanych działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP

4.14.1 Intensywność procesu organogenezy korzeniowej w kulturach

korzeniowych in vitro lnu zwyczajnego, poddanych działaniu par

wydzielających się z wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO

W doświadczeniu zastosowano „wymiatacz” tlenku azotu c-PTIO w celu

potwierdzenia udziału egzogennego NO w stymulacji organogenezy w kulturach

in vitro lnu odm. Selena po ekspozycji na pary, wydzielające się z wodnego 5 mM

roztworu SNP.

W kulturach korzeniowych, poddanych działaniu SNP w obecności c-PTIO nie

zaobserwowano istotnych różnic w efektywności organogenezy, w porównaniu do

kultur, które inkubowane były tylko z roztworem c-PTIO (Ryc. 55). W 3 i 4 tygodniu

wzrostu kultur, najlepszą (o około 15% wyższą) organogenezą korzeniową odznaczały

się kultury poddane działaniu SNP, w stosunku do kultur poddanych fumigacji SNP w

obecności c-PTIO oraz kultur poddanych działaniu jedynie c-PTIO (Ryc. 55). Liczba

korzeni była wyższa, w kulturach poddanych działaniu roztworu SNP, w 2 tygodniu

wzrostu (o około 40%) oraz w 4 tygodniu wzrostu (o około 20%) kultur w porównaniu

z kulturami inkubowanymi z SNP+c-PTIO oraz z roztowrem c-PTIO (Ryc. 56).

Długość korzeni była większa w kulturach poddanych działaniu SNP w stosunku

do korzeni w kulturach inkubowanych jedynie z c-PTIO oraz kontroli (Ryc. 57).

158


Selena poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5 mM wodnego

roztworu SNP w obecności c-PTIO, rosnących na pożywce korzeniowej. Wyniki średnie ± SD.


(K- kultury nie poddane działaniu SNP i c-PTIO; 5 ml SNP – kultury poddane działaniu par

wydzielających się z roztworu SNP; c-PTIO- poddane działaniu c-PTIO; 5 ml SNP+c-PTIO –

kultury poddane działaniu par wydzielających się z roztworu SNP w obecności c-PTIO)


odm. Selena poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5 mM

wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO, rosnących na pożywce korzeniowej. Wyniki



0

20

40

60

80

100

120

2 3 4

% r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena K 5 ml SNP c-PTIO 5 ml SNP+c-PTIO

* *

0

4

8

12

16

2 3 4

Lic

zba

ko

rzen

i/ek

spl.

[sz

t.]


Selena K 5 ml SNP c-PTIO 5 ml SNP+c-PTIO

*

*

159

Ryc. 57. Długość korzeni w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena poddanych

działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO, rosnących na

pożywce korzeniowej po 4 tygodniach wzrostu. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne



Najniższą świeżą masą charakteryzowały się eksplantaty poddane ekspozycji na

SNP w ilości 5 ml i rosnące na pożywce korzeniowej, w porównaniu z kulturami

inkubowanymi z SNP+c-PTIO oraz samego roztworu c-PTIO (Tab. 26). Sucha masa

eksplantatów inkubowanych przez 3 godziny w obecności c-PTIO oraz 5 ml roztworu

SNP, była istotnie niższa, niż eksplantatów pochodzących z kultur kontrolnych.

Zawartość wody była podobna we wszystkich badanych wariantach (Tab. 26).

Tab. 26. Świeża i sucha masa oraz zawartość wody w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm.

Selena po 4-ch tygodniach wzrostu na pożywce korzeniowej, poddanych działaniu par

wydzielających się z 5 mM wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO. Wyniki średnie ± SD.


Szczegółowy opis wariantów doświadczalnych – w opisie Ryc. 55

Wariant

doświadczenia

Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 470,75± 66,70 44,36± 9,20 0,91± 0,04 11,15± 3,63

5 ml SNP 255,47± 35,43* 24,33±4,64* 0,91± 0,02 10,92± 3,39

c-PTIO 428,10± 37,86 27,90±2,66* 0,93± 0,01 14,44± 1,71

5 ml SNP+c-PTIO 410,75± 51,41 31,29± 4,58 0,93± 0,02 13,99± 4,37

0

1

2

3

4

K 5 ml SNP c-PTIO 5 ml SNP+c-PTIO

Dłu

go

ść k

orz

eni

[cm

]

Selena

*

160

4.14.2 Intensywność procesu organogenezy w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

odm. Selena, rosnących na pożywce bez dodatku hormonów, poddanych

działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP w obecności c-

PTIO

Nie zaobserwowano istotnych różnic pomiędzy kulturami inkubowanymi z

SNP+c-PTIO oraz c-PTIO a kontrolą (Ryc. 58).

W kulturach poddanych działaniu 5 ml SNP, SNP +c-PTIO oraz inkubowanych

przez 3 godziny w obecności c-PTIO nie odnotowano różnic w efektywności

organogenezy pędowej, w porównaniu do kontroli (Ryc. 58 A). W przypadku kultur

poddanych fumigacji 10 ml SNP, kaulogenza była wyższa o około 20 % niż w kulturach

poddanych działaniu 10 ml SNP+c-PTIO w 3 tygodniu wzrostu oraz wyższa o około

10%, w porównaniu do kultur inkubowanych z 10 ml SNP+c-PTIO i samym c-PTIO w

4 tygodniu wzrostu (Ryc. 58 A).

Efektywność organogenezy korzeniowej była wyższa w kulturach poddanych

działaniu 5 ml i 10 ml SNP niż w kulturach poddanych działaniu SNP+c-PTIO oraz c-

PTIO (Ryc. 58 B). W 3 tygodniu wzrostu % eksplantatów z korzeniami, w kulturach

poddanych działaniu 5 ml SNP, był wyższy o około 40%, a w kulturach poddanych

działaniu 10 ml SNP, wyższy o około 30% od kultur inkubowanych z SNP+c-PTIO

oraz c-PTIO. W 4 tygodniu wzrostu, kultury poddane fumigacji 5 ml i 10 ml SNP,

charakteryzowały się wyższą (o około 30%) organogenezą korzeniową niż w kultury,

na które działano SNP+c-PTIO oraz c-PTIO (Ryc. 58 B).

Liczba pędów jak i korzeni powstających na pojedynczym eksplantacie w

kulturach poddanych działaniu SNP, jak i SNP+c-PTIO oraz roztworu c-PTIO, była

podobna (Ryc. 59 A i B).

Powstające na eksplantatach poddanych działaniu roztworu SNP w ilości 5 oraz

10 ml korzenie były istotnie (o około 90%) dłuższe, niż w pozostałych wariantach

doświadczenia (Ryc. 60).

161

A)

B)

Ryc. 58. Efektywność organogenezy pędowej (A) i korzeniowej (B) w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Selena poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających

się z 5mM wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO, rosnących na pożywce bez dodatku

hormonów. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

(K- kultury nie poddane działaniu SNP i c-PTIO; 5 ml SNP, 10 ml SNP – kultury poddane

działaniu par wydzielających się z roztworu SNP; c-PTIO- poddane działaniu c-PTIO; 5 ml

SNP+c-PTIO, 10 ml SNP+c-PTIO – kultury poddane działaniu par wydzielających się z

roztworu SNP w obecności c-PTIO)

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 % r

ea

gu

jący

ch e

ksp

lan

tató

w


Selena K 5 ml SNP 10 ml SNP c-PTIO 5 ml SNP+c-PTIO 10 ml SNP+c-PTIO

* *

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 % r

ea

gu

jacy

ch e

ksp

lan

tató

w



* *

* *

162

A)

B)

Ryc. 59. Liczba pędów (A) i korzeni (B) formujących się na eksplantatch hipokotylowych lnu

zwyczajnego odm. Selena poddanych 3- godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających

się z 5mM wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO, rosnących na pożywce bez dodatku

hormonów. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


Ryc. 60. Długość korzeni w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena poddanych

działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO, rosnących na

podłożu bez dodatku hormonów po 4 tygodniach wzrostu. Wyniki średnie ± SD. *Różnice



0

4

8

12

16

20

1 2 3 4 Lic

zba

pęd

ów

/ek

spl.

[sz

t]

Czas wzrostu [tydzien]


0

4

8

2 3 4 Lic

zba

ko

rzen

i/ek

spl

[szt

.]



* * *

0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

K 5 ml SNP 10 ml SNP c-PTIO 5 ml SNP+ c-

PTIO

10 ml

SNP+c-PTIO

Dłu

go

ść k

orz

eni

[cm

]

Selena *

*

163

Świeża masa eksplantatów poddanych działaniu SNP w ilości 5 i 10 ml oraz 5

ml SNP+c-PTIO, a także inkubowanych w obecności c-PTIO, była wyższa, niż w

kulturach kontrolnych (Tab. 27). Wyższą suchą masą, w porównaniu do kontroli,

charakteryzowały się eksplantaty narażone na działanie SNP w ilości 5 i 10 ml oraz 5

ml SNP z dodatkiem c-PTIO. Zawartość wody, przypadająca na miligram świeżej i

suchej masy, była podobna pomiędzy wariantami. Jedynie w przypadku kultur, których

eksplantaty poddane zostały ekspozycji na 5 ml SNP w obecności c-PTIO, zawartość

wody, przypadająca na miligram suchej masy, była niższa, niż w kontroli (Tab. 27).

Tab. 27. Świeża i sucha masa oraz zawartość wody w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm.

Selena po 4 tygodniach wzrostu na pożywce bez dodatku hormonów, poddanych działaniu par

wydzielających się z 5 mM wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO. Wyniki średnie ± SD.


Szczegółowy opis wariantów doświadczalnych – w opisie Ryc. 58

Wariant

doświadczenia Świeża masa

[mg ekspl.-1

]

Sucha masa

[mg ekspl.-1

]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

św.m.]

Zawartość H2O

[mg H2O mg-1

s.m.]

K 27,54 ± 8,03 5,36 ± 1,76 0,78± 0,06 6,47 ± 1,23

5 ml SNP 75,82± 5,93* 10,72±1,89* 0,86± 0,05 6,17 ± 1,36

10 ml SNP 57,08± 8,76* 8,77 ± 1,06* 0,85± 0,04 6,37 ± 1,38

c-PTIO 43,80± 6,05* 7,77± 1,33 0,82± 0,05 4,57± 0,88

5 ml SNP+c-PTIO 53,34± 10,23* 10,13±2,21* 0,80± 0,07 3,47± 0,78*

10 ml SNP+c-PTIO 41,17± 7,01 7,50± 1,35 0,84± 0,05 4,71± 1,38

164

4.15 Natężenie stresu oksydacyjnego w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

(Linum usitatissimum L.) odm. Selena, poddanych działaniu par


W celu określenia sposobu oddziaływania NO wydzielającego się z SNP na

stymulację organogenezy w kulturach lnu odm. Selena, parametry stresu

oksydacyjnego, zdolność przeciwwolnorodnikową oraz aktywność enzymów

antyoksydacyjnych zbadano najpóźniej po 15 dniach od inkubacji kultur z SNP.

4.15.1 Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

odm. Selena, poddanych działaniu par wydzielających się z wodnego

roztworu SNP

Ekspozycja kultur lnu włóknistego na działanie par wydzielających się z

wodnego roztworu SNP, spowodowała zwiększenie zawartości H2O2 w kulturach

rosnących na podłożu bez dodatku hormonów po 1 dobie oraz 5-ciu i 15-tu dniach od

ekspozycji (Ryc. 61 A). Zwiększenie zawartości H2O2 o 40% w stosunku do kontroli

nastąpiło po 1 dobie i po 5-ciu dniach od ekspozycji na działanie par wydzielających się

z 10 ml roztworu SNP, natomiast po 15-tu dniach od ekspozycji obniżenie zawartości

H2O2 o 35%. W kulturach poddanych działaniu par wydzielających się z 5 ml roztworu

SNP, zawartość H2O2 była wyższa po 5-ciu (o 40%) i 15-tu dniach (o 20%). W

kulturach kontrolnych, rosnących na podłożu bez dodatku hormonów, zawartość H2O2

obniżyła się po 5-ciu dniach wzrostu kultur (Ryc. 61 A).

W kulturach rosnących na pożywce korzeniowej zawartość H2O2 była niższa, w

porównaniu do kontroli o 36% bezpośrednio po ekspozycji na roztwór SNP, o 48% po 1

dobie od ekspozycji, a także o 13% niższa w kulturach po 15-tu dniach od działania

SNP (Ryc. 61 B). W kulturach korzeniowych po 5-ciu dniach od ekspozycji na SNP,

zawartość H2O2 była wyższa o 40%, w porównaniu do kultur kontrolnych (Ryc. 61 B).

W kontrolnych kulturach korzeniowych zawartość H2O2 obniżyła się wraz ze wzrostem

kultur. Po 15-tu dniach wzrostu była o 66% niższa, w porównaniu do kultur po 1 dobie

od działania SNP (Ryc. 61 B).

165

A)

B)

Ryc. 61. Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm.

Selena rosnących na podłożu bez dodatku hormonów (A) i rosnących na pożywce korzeniowej

(B). Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

(K – eksplantaty hipokotylowe nie traktowane parami wydzielającymi się z SNP; 0 –

eksplantaty hipokotylowe bezpośrednio po 3-godzinnej ekspozycji na pary wydzielające się z

wodnego roztworu SNP; 1 – eksplantaty po 1-szej dobie od ekspozycji na pary wydzielające się

z wodnego roztworu SNP; 5, 15 – kultury in vitro w 5-tym, 15-tym dniu od ekspozycji na pary

wydzielające się z wodnego roztworu SNP)

0

200

400

600

800

0 1 5 15

H2O

2 [n

mo

l g

-1 ś

w.m

.]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP 10 ml SNP

* * * *

*

0

200

400

600

800

0 1 5 15

H2O

2 [n

mo

l g

-1 ś

w.m

.]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP

* * *

*

166

4.15.2 Zawartość produktów peroksydacji lipidów, reagujących z kwasem

tiobarbiturowym (TBARS) w kulturach in vitro lnu odm. Selena,

poddanych działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP

Wykazano zwiększenie zawartości (o 57%) produktów peroksydacji lipidów

reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), w kulturach rosnących na pożywce

bez dodatku hormonów po 5-ciu dniach od ekspozycji na pary wydzielające się z 10 ml

SNP, w porównaniu do kultur kontrolnych. W kulturach poddanych ekspozycji na pary

wydzielające się z 5 ml roztworu SNP, nie zaobserwowano wzmożonej peroksydacji

lipidów (Ryc. 62 A).

Najwyższą zawartość peroksydacji lipidów zaobserwowano w kulturach

kontrolnych, o około 55% wyższą w stosunku do kultur bezpośrednio po ekspozycji na

roztwór SNP i o 55% (kultury poddane działaniu 5 ml roztworu SNP) oraz o 30%

(kultury poddane działaniu 10 ml roztworu SNP) wyższą, w porównaniu do kultur po

1– szej dobie od ekspozycji na SNP (Ryc. 62 A).

Zawartość TBARS w kulturach kontrolnych, rosnących na pożywce z dodatkiem

hormonów warunkujących powstawanie korzeni, była wyższa o 72% w porównaniu do

kultur poddanych działaniu SNP bezpośrednio (0 dni wzrostu) po wyłożeniu

eksplantatów na podłoże (Ryc. 62 B). Zawartość produktów peroksydacji lipidów w

kulturach kontrolnych obniżyła się wraz z czasem wzrostu kultur. Zawartość produktów

TBARS była najwyższa (około 70%) w kulturach poddanych działaniu par SNP, po 1

dobie od ekspozycji, a następnie obniżyła się (Ryc. 62 B).

167

A)

B)

Ryc. 62. Zawartość produktów peroksydacji lipidów (TBARS) w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Selena rosnących na podłożu bez dodatku hormonów (A) i rosnących na

pożywce korzeniowej (B). Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


0

20

40

60

80

100

120

0 1 5 15

TB

AR

S [

nm

ol

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]


* *

*

* *

0

20

40

60

80

100

120

0 1 5 15

TB

AR

S [

nm

ol

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP

* *

168

4.16 Zdolność przeciwwolnorodnikowa oraz aktywność enzymów

antyoksydacyjnych w kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum

usitatissimum L.) odm. Selena, poddanych działaniu par


4.16.1 Zdolność przeciwwolnorodnikowa określona na zasadzie redukcji


w kulturach in vitro lnu odm. Selena, poddanych działaniu par


Zbadano oddziaływanie ekstraktów, pozyskanych z kultur poddanych działaniu

par wydzielających się z roztworu SNP z rodnikiem DPPH. metodą EPR. Na rycinie 63

i 65 przedstawiono widmo EPR, typowe dla rodnika DPPH. (kontrola) oraz DPPH

., po

reakcji z ekstraktem uzyskanym z kultur. Dodanie badanych ekstraktów do roztworu

rodnika DPPH., spowodowało zmniejszenie amplitudy sygnału, co świadczy o

właściwościach przeciwwolnorodnikowych badanych kultur. W celu określenia

aktywności ekstraktów użytych w doświadczeniu w reakcji z DPPH., za 100 % przyjęto

intensywność środkowej linii sygnału widma (h).

Redukcja rodnika DPPH. pod wpływem ekstraktu z kultur, rosnących na

pożywce bez dodatku hormonów, po 15-tym dniu od ekspozycji eksplantatów na pary

wydzielające się z 10 ml SNP, obniżyła się o około 50% względem kultur kontrolnych

(Ryc. 64). W pozostałych wariantach doświadczalnych (po 0, 1, 5-ciu dniach wzrostu)

nie zaobserwowano istotnych różnic w ilości rodnika DPPH, pod wpływem ekstraktów

z kultur poddanych ekspozycji zarówno na 5 ml jak i 10 ml SNP, w porównaniu z

kontrolą (Ryc. 64).

169

Ryc. 63. Przykładowe widmo EPR DPPH.

– widmo rodnika DPPH. (linia czarna) oraz K –

DPPH. po reakcji z ekstraktem z 15-dniowych kultur odm. Selena rosnących na podłożu bez

dodatku hormonów (linia zielona), 5 ml SNP – DPPH. po reakcji z ekstraktem z 15-dniowych

kultur rosnących na podłożu bez dodatku hormonów, poddanych działaniu par wydzielających

się z 5 ml SNP (linia żółta) i 10 ml SNP – DPPH. po reakcji z ekstraktem z 15-dniowych kultur

rosnących na podłożu bez dodatku hormonów, poddanych działaniu par wydzielających się z 10

ml SNP (linia niebieska)

Ryc. 64. Redukcja stabilnego wolnego rodnika DPPH. w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

odm. Selena, poddanych działaniu 5 mM roztworu SNP, rosnących na podłożu bez dodatku

hormonów. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


9000

11000

13000

15000

17000

19000

21000

23000

330 332 334 336 338 340 342

Inte

nsy

wn

ość

sy

gn

ału

DP

PH

Pole magnetyczne [mT]

DPPH K 5 ml SNP 10 ml SNP

h

0

20

40

60

80

100

0 1 5 15 Red

uk

cja

ro

dn

ika

DP

PH

[%

]

Czas wzrostu [dni]


*

170

Ekstrakt z kultur korzeniowych, otrzymany bezpośrednio (0 dni wzrostu) po

ekspozycji na pary roztworu SNP, zmniejszył ilość rodnika DPPH. o około 25%,

względem kultur kontrolnych (Ryc. 66). W kulturach po 1 - szej dobie od zakończenia

ekspozycji na SNP, redukcja rodnika zmniejszyła się o około 35% w porównaniu do

kontroli (Ryc. 66).

Ryc. 65. Przykładowe widmo EPR DPPH. – widmo rodnika DPPH (linia czarna) oraz K –

DPPH, po reakcji z ekstraktem z kultur korzeniowych odm. Selena (linia czerwona) i 5 ml SNP

– DPPH, po reakcji z ekstraktem z kultur korzeniowych, bezpośrednio (0 dni wzrostu) po

działaniu par wydzielających się z 5 ml SNP (linia żółta)

Ryc. 66. Redukcja stabilnego wolnego rodnika DPPH w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

odm. Selena, poddanych ekspozycji na pary wydzielające się z 5mM roztworu SNP, rosnących

na pożywce korzeniowej. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


5000

10000

15000

20000

25000

30000

330 332 334 336 338 340 342

Inte

nsy

wn

ość

sy

gn

ału

DP

PH

Pole magnetyczne [mT]

DPPH K 5 ml SNP

0

20

40

60

80

100

0 1 5 15

Red

uk

cja

ro

dn

ika

DP

PH

[%

]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP

*

*

h

171

4.16.2 Oznaczanie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w kulturach in

vitro lnu odm. Selena, poddanych działaniu par wydzielających się z

wodnego roztworu SNP

Aktywność SOD w kulturach po 5-tym dniu wzrostu, poddanych działaniu par

wydzielających się z 5 i 10 ml roztworu SNP, była o około 20%, wyższa w porównaniu

z kulturami kontrolnymi (Ryc. 67 A).W pozostałych wariantach doświadczalnych, nie

zanotowano istotnych różnic w aktywności SOD, kultur narażonych na działanie SNP,

w stosunku do kontroli (Ryc. 67 A).

Najwyższą aktywność w kulturach lnu włóknistego rosnących na podłożu bez

dodatku hormonów, (zwłaszcza w 5 dniu wzrostu kultur) wykazywała CuZn SOD,

zarówno w kulturach poddanych działaniu par wydzielających się z 5 ml oraz 10 ml

SNP, jak i w kontroli (Ryc. 67 B). Bezpośrednio (0 dni wzrostu) po działaniu par

roztworu SNP na kultury, nie zaobserwowano istotnych różnic w aktywności tej

izoformy w stosunku do kontroli. Po 1 dobie od inkubacji kultur z roztworem SNP,

aktywność CuZn SOD wzrosła o około 30%, w porównaniu z kulturami kontrolnymi.

Wraz ze wzrostem kultur aktywność tej izoformy w kulturach poddanych działaniu

SNP, obniżyła się o około 24% (kultura poddana ekspozycji 10 ml roztworu SNP) w 5-

tym dniu wzrostu i o około 50% - kultury poddane działaniu 5 ml roztworu SNP oraz o

około 60 % - kultury eksponowane na 10 ml roztworu SNP w 15-tym dniu wzrostu, w

stosunku do kontroli (Ryc. 67 B).

Wzmożoną aktywność MnSOD zaobserwowano w kulturach poddanych

fumigacji 10 ml roztworu SNP, zarówno bezpośrednio (0 dni wzrostu) po ekspozycji na

SNP, jak i w 15-tym dniu wzrostu kultur (Ryc. 67 C). W kulturach po 1 dobie od

działania roztworu SNP, aktywność MnSOD spadła o około 45%, w porównaniu z

kontrolą (Ryc. 67 C).

Najniższą aktywność wykazywała FeSOD (Ryc. 67 D). W kulturach

inkubowanych z 5 ml roztworu SNP po 5-tym dniu wzrostu, zaobserwowano

podwyższenie aktywności FeSOD o około 70%, natomiast w 15-tym dniu wzrostu

obniżenie aktywności o około 60%, w porównaniu z kulturami kontrolnymi (Ryc. 67

D).

172

A)

B)

C)

0

4

8

12

16

20

24

0 1 5 15

SO

D [

U m

g-1

bia

łka

]

Czas wzrostu [dni]


* *

0

4

8

12

16

20

24

0 1 5 15

Cu

Zn

SO

D [

U m

g-1

bia

łka

]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP 10ml SNP

* *

*

* *

0

4

8

12

16

20

24

0 1 5 15

Mn

SO

D [

U m

g-1

bia

łka

]

Czas wzrostu [dni]


*

*

*

173

D)

Ryc. 67. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i jej izoform w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Selena, poddanych ekspozycji na pary wydzielające się z 5 mM roztworu

SNP, rosnących na podłożu bez dodatku hormonów. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne



Aktywność SOD w kulturach korzeniowych obniżyła wraz ze wzrostem kultur,

zarówno eksponowanych na SNP, jak i kontrolnych (Ryc. 68 A). W kulturach

bezpośrednio (0 dni wzrostu) po działaniu SNP odnotowano obniżenie aktywności

enzymu o 25%, w porównaniu z kontrolą. W 5-tym dniu od ekspozycji na SNP

aktywność SOD w kulturach obniżyła się o około 20%, w stosunku do kontroli (Ryc. 68

A).

Wzmożoną aktywność CuZn SOD (o około 35% wyższa od kontroli),

zaobserwowano w kulturach korzeniowych 5 dni po ekspozycji na działanie par

roztworu SNP (Ryc. 68 B). Po 15-tym dniu wzrostu w kulturach wykazano obniżenie

aktywności tej izoformy o około 80% w stosunku do kontroli (Ryc. 68 B).

W trakcie wzrostu kultur korzeniowych zaobserwowano spadek aktywności

MnSOD. Jedynie w kulturach po 5-tym dniu wzrostu od ekspozycji na pary roztworu

SNP, zanotowano wzmożoną aktywności MnSOD o około 75%, w porównaniu z

kontrolą (Ryc. 68 C).

Kultury korzeniowe odznaczały się najniższą aktywnością Fe SOD. W kulturach

po 15-tym dniu wzrostu od ekspozycji na roztwór SNP, zaobserwowano wyższą

aktywność FeSOD o około 65%, w stosunku do kontroli (Ryc. 68 D).

0

4

8

12

16

20

24

0 1 5 15

FeS

OD

[U

mg

-1 b

iałk

a]

Czas wzrostu [dni]


* *

174

A)

B)

C)

0

4

8

12

16

20

24

0 1 5 15

SO

D [

U m

g-1

bia

łka

]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP

*

*

0

4

8

12

16

20

24

0 1 5 15

Cu

Zn

SO

D [

U m

g-1

bia

łka

]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP

*

*

0

4

8

12

16

20

24

0 1 5 15

Mn

SO

D [

U m

g-1

bia

łka

]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP

*

175

D)

Ryc. 68. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i jej izoform w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Selena poddanych ekspozycji na pary wydzielające się z 5mM roztworu

SNP, rosnących na pożywce korzeniowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie,

przy p≤0,05.


4.16.3 Oznaczanie aktywności katalazy (CAT) w kulturach in vitro lnu odm.

Selena, poddanych działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu

SNP

W kulturach poddanych działaniu 10 ml roztworu SNP, po 15-tym dniu wzrostu

aktywność CAT, była wyższa o 45% w stosunku do kontroli (Ryc. 69 A). Aktywność

CAT, w kulturach poddanych działaniu roztworu SNP, bezpośrednio (0 dni wzrostu) i

po 1 dobie od ekspozycji była zbliżona do kontroli. Po 5-tym dniu od działania SNP, w

kulturach rosnących na podłożu bez dodatku hormonów, aktywność CAT obniżyła się o

około 46%, w porównaniu do kontroli (Ryc. 69 A).

W kulturach korzeniowych bezpośrednio (o około 15%) i po 5-tym dniu (o

około 50%) po ekspozycji na roztwór SNP, odnotowano obniżenie aktywności CAT, w

porównaniu do kultur kontrolnych (Ryc. 69 B). Po 15-tym dniu wzrostu aktywność

CAT, była wyższa w kulturach poddanych fumigacji SNP, o około 40%, niż w kontroli

(Ryc. 69 B).

0

4

8

12

16

20

24

0 1 5 15

FeS

OD

[U

mg

-1 b

iałk

a]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP

*

176

A)

B)

Ryc. 69. Aktywność katalazy (CAT) w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena,

poddanych ekspozycji na pary wydzielające się z 5 mM roztworu SNP, rosnących na podłożu

bez dodatku hormonów (A) i na pożywce korzeniowej (B). Wyniki średnie ± SD. Wyniki



4.16.4 Zawartość białka w ekstraktach wykorzystanych do określenia aktywności

enzymów antyoksydacyjnych w kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum


z wodnego roztworu SNP

Zawartość białka w kulturach rosnących na pożywce bez dodatku hormonów,

poddanych działaniu par wydzielających się z 10 ml roztworu SNP, po 5-tym dniu

wzrostu obniżyła się o 18%, a po 15-tym dniu wzrostu o 26%, w porównaniu z kontrolą

(Ryc. 70 A).

0

4

8

12

16

20

24

0 1 5 15

CA

T [

mm

ol

H2O

2 m

in-1

mg

-1

bia

łka

]

Czas wzrostu [dni]


* * *

0

4

8

12

16

20

24

0 1 5 15

CA

T [

mm

ol

H2O

2 m

in-1

mg

-1

bia

łka

]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP

*

* *

177

W kulturach korzeniowych poddanych ekspozycji na pary roztworu SNP,

zawartość białka bezpośrednio (0 dni wzrostu) (o 15%), po 1-szej dobie (o 23%) oraz

po 15-tym dniu (o 10%) od działania SNP, obniżyła się, w stosunku do kultur

kontrolnych (Ryc. 70 B).

A)

B)

Ryc. 70. Zawartość białka w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena poddanych

działaniu par wydzielających się z 5 mM roztworu SNP, rosnących na podłożu bez dodatku

hormonów (A) i na pożywce korzeniowej (B). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne



0

30

60

90

120

150

0 1 5 15 Za

wa

rto

ść b

iałk

a [

µg

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]


* *

0

30

60

90

120

150

0 1 5 15 Za

wa

rto

ść b

iałk

a [

µg

g-1

św

.m.]

Czas wzrostu [dni]

K 5 ml SNP

* *

*

178

5 Dyskusja

5.1 Optymalne warunki wzrostu oraz przebieg wybranych procesów w

kulturach in vitro lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) odm.

Szafir (typ oleisty) i odm. Selena (typ włóknisty)

Początkowy etap przeprowadzonych badań dotyczył ustalenia optymalnych

warunków wzrostu i organogenezy badanych odmian lnu w kulturach

in vitro. Przebadano kilka pożywek: MS, B5 oraz MS+B5, a także różne rodzaje

i stężenia hormonów w celu wyboru odpowiednich dla kaulogenezy i ryzogenezy.

Efektywność organogenezy pędowej jak i korzeniowej w kulturach odm. Szafir,

zachodziła na wysokim poziomie na wszystkich przetestowanych podłożach. Jednak

pomimo 100% organogenezy pędowej w kulturach rosnących na pożywkach B5 oraz

MS+B5, widoczne były oznaki starzenia (4 tydzień wzrostu) w postaci żółknięcia

pędów. Kultury te odznaczały się również niższą świeżą oraz suchą masą (Tab. 8-9). W

kulturach korzeniowych odm. Szafir rosnących na podłożu MS, formujące się korzenie

były dłuższe niż na eksplantatach rosnących na pozostałych pożywkach. W przypadku

odm. Selena organogenezę pędową obserwowano na pożywce B5, gdzie była ona

najwyższa oraz na MS+B5. W kulturach korzeniowych tej odmiany najefektywniejsze

namnażanie korzeni zachodziło na podłożu B5. W przeciwieństwie do organogenezy

pędowej lnu włóknistego, ryzogeneza zachodziła w kulturach rosnących również na

pożywce MS, chociaż zdecydowanie słabiej. Na postawie przeprowadzonych badań

zaobserwowano nawet o 60% słabszą efektywność w formowaniu pędów i o 15-20% w

formowaniu korzeni w kulturach lnu włóknistego niż oleistego.

W przypadku kultur pędowych szybkość pojawiania się organów na

eksplantatach była różna u obu odmian. Pędy w kulturach lnu oleistego pojawiały się

już w pierwszym tygodniu wzrostu kultury. Natomiast u lnu włóknistego kaulogeneza

zachodziła wolniej, a organy widoczne były w 2 tygodniu wzrostu (Ryc. 8). Zauważono

również, że w kulturach pędowych odm. Selena, powstający kalus ulegał brązowieniu.

Biorąc pod uwagę powyższe obserwacje, do dalszych analiz dla odm. Szafir wybrano

podłoże MS, uznawane za najbardziej uniwersalne i najczęściej stosowane w kulturach

in vitro (George i wsp. 2008, Greenway i wsp. 2012), a dla odm. Selena - B5, pożywkę

nie zawierającą jonów amonowych. Pożywka MS okazała się odpowiednia również do

wzrostu kultur perowskii bylicowatej (Perovskia abrotanoides Karel.), a także w

kulturach gatunku z rodzaju pochrzyn (Dioscorea remotiflora (Kunth)) oraz lnu

179

zwyczajnego odm. Super (Bernabė-Antonio i wsp. 2012, Zaker i wsp. 2013, Takáč i

wsp. 2016). W przypadku kultur rośliny z rodzaju kufea (Cuphea aequipetala Cav.)

najlepszą do wzrostu i ryzogenezy była pożywka B5 (Martínez-Bonfil i wsp. 2014).

Spośród przetestowanych cytokinin, stymulujących organogenezę pędową u

obu odmian lnu, do dalszych doświadczeń wybrano BA. Liczba pędów formujących się

na eksplantatach hipokotylowych u odm. Szafir, rosnących na podłożu z dodatkiem BA,

była nawet 4-krotnie wyższa, niż na pożywkach z dodatkiem TDZ czy KIN. Najwyższą

efektywność BA w formowaniu pędów z eksplantatów hipokotylowych lnu odm. Szafir

obserwowano także we wcześniejszych badaniach własnych (Baran 2007). W

przypadku odm. Selena powstawanie pędów obserwowano jedynie w obecności dwóch

cytokinin BA oraz KIN. Dodanie do pożywki TDZ powodowało jedynie namnażanie

kalusa i zwiększenie świeżej masy kultur. Związek ten prowadzi do akumulacji wody i

w konsekwencji blokowania zdolności regeneracyjnych w warunkach in vitro (Paques

1991). Efektywność organogenezy, jak i liczba powstających pędów, była zbliżona

niezależnie od zastosowanej cytokininy. Stwierdzono jednak, że świeża masa i sucha

masa eksplantatów z pędami rosnących w obecności BA, była wyższa niż w obecności

KIN. Cytokinina BA również okazała się najbardziej efektywna w indukcji

organogenezy pędowej z eksplantatów liścieniowych śliwy (Prunus L.) czy Drymeria

cordata, tropikalnej rośliny z rodziny goździkowatych (Nas i wsp. 2010, Ghimire

2010). Odmiennych danych dostarczają natomiast badania Bretagne i

współpracowników (1994), którzy wykazali, iż formowanie pędów na eksplantatch

hipokotylowych lnu odmian Ariane, Antarĕs i Viking było wyższe w obecności TDZ.

Natomiast najefektywniejszą w organogenezie korzeni w kulturach obu odmian lnu

okazała się auksyna NAA (Ryc. 14-17.). Dodatek tego hormonu do podłoża sprzyjał

formowaniu korzeni, także w kulturach perowskii bylicowatej oraz bazylii świętej

(Ocimum sanctum L.) (Shilpa i wsp. 2010, Zaker i wsp. 2013). Z kolei w kulturach

Cuphea aequipetala i pochrzynu to IBA była efektywniejsza w stymulacji ryzogenezy

niż NAA (Bernabė-Antonio i wsp. 2012, Martínez-Bonfil i wsp. 2014).

Dostępnych jest szereg danych dotyczących efektywności wzajemnych proporcji

auksyn i cytokinin na wzrost kalusa i indukcję organogenezy w kulturach in vitro (Sha

Valli Khan i wsp. 1999, Martin-Uridoz i wsp. 2004). W przypadku roślin z rodzaju

Solanum brak auksyny w pożywce powodował obniżoną regenerację pędów (Hendrix i

wsp. 1987). Organogeneza pędów u żywopłonu (Aeschynomene spp.) była najwyższa,

gdy pożywka, na której namnażano kalus, zawierała niskie stężenie NAA (Rey i

180

Mroginski 1996). Przetestowano więc różne proporcje auksyny i cytokininy w

pożywce, w celu wyboru optymalnych zakresów stężeń tych hormonów na kierunek

organogenezy badanych odmian lnu. Badania potwierdziły ogólną zasadę, że im wyższe

stężenie cytokininy w stosunku do auksyny w pożywce, tym efektywniejsza

kaulogeneza, natomiast przy wyższej zawartości auksyny w porównaniu do cytokininy

następuje formowanie korzeni. Ustalono, że w obecności samej cytokininy w pożywce

(0:1, Ryc. 18-19), oraz gdy stężenie cytokininy BA jest co najmniej 40-krotnie wyższe

niż auksyny 2,4-D (1:40, Ryc. 18-19), kaulogeneza u obu odmian lnu zachodzi

najefektywniej. W przypadku kultur korzeniowych obserwowano zależności odwrotne.

To wzbogacenie podłoża samą auksyną NAA (0:1, Ryc. 20-21), lub auksyną i

cytokininą w stosunku 1:40 (BA:NAA, Ryc. 20-21), sprzyjało najlepszej organogenezie

korzeni w kulturach odm. Szafir, jak i Selena. Zmniejszenie proporcji stężeń

hormonów w pożywce powodowało obniżenie efektywności organogenezy, zwłaszcza

w kulturach lnu włóknistego. Podobne wyniki, dotyczące wpływu wzajemnych

proporcji stężeń hormonów na wydajność organogenezy, uzyskano w kulturach

pędowych szparaga (Asparagus sp. L.) oraz goryczki (Gentiana sp. L.) (Benmoussa i

wsp. 1996, Unda i wsp. 2007). Natomiast w przypadku kultur dzwonka karpackiego

(Campanula carpatica Jacq.), powstawanie pędów na drodze organogenezy pośredniej

stwierdzono przy równym stężeniu auksyny i cytokininy w pożywce (Frello i wsp.

2002).

Na podstawie powyższych danych można zauważyć znaczące różnice pomiędzy

warunkami sprzyjającymi optymalnej organogenezie lnu włóknistego i oleistego.

Dotyczą one nie tylko jakości użytego podłoża (składu pożywki, która okazała się

optymalną), ale także rodzaju i stężenia dodanych auksyn i cytokinin. Wymagania co do

składu pożywek w kulturach in vitro ściśle uzależnione są od badanego gatunku, typu, a

nawet odmiany.

Różnice w szybkości oraz intensywności organogenezy pędowej i korzeniowej

badanych typów lnu potwierdzono również na podstawie zmian anatomicznych

zachodzących w początkowej fazie wzrostu kultur. Należy zaznaczyć również, że tempo

rozwoju oraz pojawienia się organów na eksplantatach w obrębie tej samej szalki, w

której prowadzono kulturę, było bardzo niejednorodne. Na przekrojach poprzecznych

eksplantatów pochodzących z kultur pędowych odm. Szafir, już po 3 dobie wzrostu

można było zauważyć zgrupowania dzielących się komórek tworzące centra

merystematyczne (zawiązki pąków przybyszowych), które po 5 dobie zaczynają

181

uwypuklać się na powierzchni eksplantatu (Fot. 6.5 -6.5a). Tak wczesne pojawienie się

zawiązków pędów nie formujących się z tkanki kalusowej, sugeruje ich powstawanie na

drodze bezpośredniej organogenezy. W przypadku odm. Selena komórki miękiszu jak i

epidermy, dzielą się wolniej i z mniejszą intensywnością niż u odm. Szafir. Zawiązki

pędów przybyszowych zaczynają uwypuklać się na powierzchni eksplantatu później niż

u lnu oleistego, bo po 7 dobie wzrostu (Fot. 7.7). Jednakże, tak jak w przypadku odm.

Szafir, podobny sposób formowania pędów sugeruje ich powstawanie na drodze

organogenezy bezpośredniej. W ciągu pierwszego tygodnia wzrostu kultury

korzeniowej lnu oleistego na przekrojach poprzecznych eksplantatów zaobserwowano

tworzenie się korzeni przybyszowych z kambium walca osiowego, co świadczy o

powstawaniu tych organów na drodze organogenezy bezpośredniej (Fot. 8).

Pochodzenie korzeni w kulturach lnu oleistego może być jednak dwojakie.

Przypuszczalnie na dalszym etapie wzrostu korzenie powstają również z formującego

się kalusa. W przypadku kultur korzeniowych lnu włóknistego, po tygodniu wzrostu

powstają bardzo nieliczne zawiązki korzeni przybyszowych wyrastające z walca

osiowego niewidoczne jeszcze na powierzchni eksplantatu (Fot. 9). Późniejsze

pojawianie się organów na powierzchni eksplantatów tej odmiany sugeruje, że korzenie

mogą formować się także z powstającej tkanki kalusowej.

Zbadano zawartość barwników fotosyntetycznych, oraz wymianę gazową zarówno

w kulturach lnu na różnych etapach wzrostu, jak i w 7-dniowych sterylnych siewkach,

będących źródłem eksplantatów. Najwyższą zawartość barwników fotosyntetycznych

stwierdzono w siewkach. Poziom barwników fotosyntetycznych u obu odmian lnu był

podobny, najwyższy chlorofilu a, natomiast najniższy karotenoidów. Odnotowano

znaczący spadek poziomu barwników podczas wzrostu kultur. Stwierdzono różnice w

ich zawartości pomiędzy odmianami (Ryc. 22-23). Kultury odm. Szafir odznaczały się

wyższym poziomem barwników fotosyntetycznych w trakcie wzrostu, niż kultury odm.

Selena. Nie wydaje się, aby różnice te wynikały z odmiennego rodzaju i stężenia użytej

w pożywce cytokininy, jak w przypadku liliowca ogrodowego (Hemerocallis xhybrida

Hort.) oraz goździka ogrodowego (Dianthus caryophyllus L.) (Genkov i wsp. 1997;

Gabryszewska i wsp. 2009), ponieważ w doświadczeniach własnych wykorzystano tą

samą dla obu odmian cytokininę (BA) i jej jednakowe stężenie. Przypuszczać można, iż

obserwowane różnice uzależnione są od typu lnu (być może od nieco odmiennego

metabolizmu obu typów). Możliwe również, że zmiany zawartości barwników

fotosyntetycznych wynikają z różnic w składzie jakościowym pożywek, odmiennych

182

dla każdej z odmian. Różnice w poziomie chlorofili wykazano u siewek kukurydzy,

rosnących na podłożu wzbogaconym o wyższe stężenie molibdenu w porównaniu z

siewkami rosnącymi w warunkach kontrolnych (Pazurkiewicz-Kocot i wsp. 2009).

Przez wiele lat sądzono, że proces fotosyntezy w kulturach in vitro nie zachodzi lub

zachodzi z bardzo słabą wydajnością. Obecnie jest wiele dowodów na to, że fotosynteza

zachodzi w kulturach in vitro oraz ma bardzo duże znaczenie w procesach aklimatyzacji

i adaptacji do naturalnych warunków roślin powstałych dzięki tej technice (Borkowska

2003). Aktywność fotosyntetyczna w kulturach in vitro zależy od takich samych

czynników środowiskowych, jak w warunkach naturalnych: światła, CO2, wody,

temperatury, ale także (w sposób pośredni lub bezpośredni) od składu pożywki –

zwłaszcza od obecności cukrów, liczby pędów czy długości pojedynczego pasażu

(Serret i wsp. 2001, Borkowska 2003).

Oznaczenia natężenia fotosyntezy netto i oddychania ciemniowego z

zastosowaniem analizatora CO2 w podczerwieni (LI-COR 6262) przeprowadzono w

kulturach pędowych obu odmian lnu w 5-tym, 14-tym i 28-mym dniu wzrostu oraz w

7-dniowych sterylnych siewkach, stanowiących źródło eksplantatów. Natężenie

fotosyntezy obniżało się w czasie wzrostu kultur, aktywność procesu pod koniec ich

wzrostu była 4-krotnie niższa niż u siewek. Natężenie oddychania ciemniowego nie

zmieniało się znacząco w trakcie wzrostu kultur (Ryc. 24). Obniżenie zarówno

natężenia fotosyntezy, jak i zawartości barwników fotosyntetycznych u badanych

odmian, wynika prawdopodobnie ze starzenia się kultur.

Wstępne analizy LZO (lotne związki organiczne) oraz związków organicznych w

ekstraktach metanolowych wskazują na różnice w składzie chemicznym kultur lnu

oleistego i włóknistego. Dotyczą one nie tylko zmieniającego się w trakcie wzrostu

kultur pędowych badanych odmian procentowego udziału, ale również ilości

zidentyfikowanych związków. Ponadto, kultury odm. Selena charakteryzowała się

bardziej zróżnicowanym składem emitowanych związków, niż odm. Szafir (Tab. 14-15;

Ryc. 25-26). Również w obrębie jednej odmiany widoczne są wyraźne różnice w

składzie zidentyfikowanych związków organicznych. W przypadku lnu oleistego

obserwowano zmiany w ilości aminokwasów oraz kwasów alifatycznych i glicerydów

w trakcie wzrostu kultur, natomiast u lnu włóknistego również zmiany zawartości

związków aromatycznych. Wysoka zawartość związków z grupy „węglowodany i

glukozydy”, może częściowo wynikać z dużej ilości sacharozy dostarczonej z pożywką,

na której rosły kultury (Ryc. 25-26; Tab. I-II). Sugeruje to prawdopodobne różnice w

183

metabolizmie badanych odmian. Jednak określenie roli poszczególnych

zidentyfikowanych związków i powiązanie ich metabolizmu, m.in. z efektywnością

oraz szybkością formowania organów na eksplantatach, wymaga dalszych i bardziej

rozległych badań.

Kultury tkanek roślinnych są systemami, które podczas zakładania jak i wzrostu

narażone są na wiele czynników stresowych, takich jak: mechaniczne uszkodzenie

podczas wycinania eksplantatów, niedobór powietrza na skutek rozwarstwienia i szoku

osmotycznego wywołanych wnikaniem pożywki w przestrzenie międzykomórkowe,

zwiększonym stężeniem związków mineralnych lub hormonów. W zależności od

odpowiednio zaprojektowanej pożywki, jak i całego eksperymentu możliwe jest

wywołanie pozytywnego lub negatywnego efektu morfogenetycznego w warunkach in

vitro (Gaspar i wsp. 2002). Czynniki środowiskowe wywołujące stres oksydacyjny

kształtują strukturę oraz funkcjonowanie roślin. W przypadku kultur tkankowych są to

głównie zranienie, skład pożywek oraz warunki panujące wokół eksplantatów (Cassells

i Curry 2001). Czynniki stresowe, towarzyszące rozwojowi materiału roślinnego w

warunkach in vitro, mogą prowadzić do negatywnych skutków: redukcji wody w

tkankach, obniżenia zdolności regeneracji czy przyspieszenia procesu starzenia (Benson

2000). System antyoksydacyjny, którego aktywność wzrasta w warunkach stresowych,

odgrywa ważną rolę w regulacji morfogenezy w warunkach in vitro (Chen i Ziv 2001).

Zaobserwowano, że wzajemne zmiany aktywności enzymów, takich jak SOD, CAT czy

POD wpływały na organogenezę pędów lub na embriogenezę somatyczną u mieczyka

(Gladiolus L.) (Dutta Gupta i Datta 2004). Autorzy sugerowali, że endogenny poziom

H2O2 (najbardziej stabilnego związku wśród ROS) oraz zmiany aktywności POD, CAT,

SOD mogą stanowić ważne źródło oceny kompetencji roślin do regeneracji

(Szechyńska-Hebda i wsp. 2012). Dlatego też w badaniach własnych kultury

wybranych odmian lnu, rosnące we wcześniej dobranych optymalnych warunkach do

wzrostu oraz organogenezy, poddano analizie zawartości metabolitów wtórnych oraz

aktywności enzymów antyoksydacyjnych , takich jak SOD oraz CAT.

Zawartość fenylopropanoidów i flawonoidów w siewkach oraz we fragmentach

hipokotyli lnu oleistego (Szafir), pobranych do wzrostu w warunkach in vitro, była

zdecydowanie wyższa, niż lnu włóknistego (Selena), (Ryc. 27-28) . W trakcie wzrostu

kultur obu typów lnu, ilość tych związków uległ obniżeniu. Obserwowany wyższy

poziom fenylopropanoidów i flawonoidów w hipokotylach odm. Szafir może wynikać z

ich większej wrażliwości na uszkodzenie mechaniczne, które indukują syntezę

184

związków fenolowych, co wykazano m.in. w kulturach cisu pospolitego (Taxus baccata

L.) (Dubravina i wsp. 2005). Stężenie tej grupy metabolitów wtórnych wzrastało wraz z

wiekiem kultur korzeniowych u odm. Selena. Podobnie, zmiany zawartości fenoli, w

zależności od czasu trwania hodowli, oraz od poziomu rozwoju tkanek w warunkach in

vitro, obserwowano w kulturach rośliny z rodziny hiacyntowatych (Merwilla plumbea

(Lindl.) Speta) (Aremu i wsp. 2013). Wykazano, że wzrost produkcji metabolitów

wtórnych w tkankach, następuje podczas ich różnicowania (Palacio i wsp. 2012)

Zawartość fenylopropanoidów oraz flawonoidów jest różna w zależności od

indukowanej w kulturach in vitro organogenezy, co potwierdzono w badaniach kultur

Ceropegia santapaui (Chavan i wsp. 2014) i lnu zwyczajnego (Drozdowska 2013). W

przypadku antocyjanów, odnotowano o 50% wyższą zawartość tych związków w

eksplantatach pobranych z hipokotyli siewek lnu włóknistego w porównaniu do lnu

oleistego. Zawartość tych metabolitów kształtowała się na podobnym poziomie,

zarówno w kulturach pędowych, jak i korzeniowych badanych odmian. Jedynie w

przypadku 5-dniowych kultur korzeniowych odm. Szafir zawartość antocyjanów była

wyższa niż u odm. Selena (Ryc. 28). Prawdopodobnie pełnią one funkcje niezwiązane z

morfogenezą, bądź ich poziom ulega podwyższeniu w wyniku działania czynników

stresowych innych niż te, które towarzyszą wzrostowi i rozwojowi roślinie w

warunkach in vitro. Badania przeprowadzone na kulturach remanii kleistej (Rehmannia

glutinosa Libosch.) wykazały, że istnieje silna korelacja pomiędzy zawartością

polifenoli i flawonoidów, a zdolnościami antyoksydacyjnymi tkanek (Piątczak i wsp.

2014). Inne badania natomiast sugerują, iż tkanki słabo zróżnicowane odznaczają się

niską zawartością tych związków, natomiast wysoką w rozwijających się organach,

głównie w pędach (Palacio i wsp. 2012, Drozdowska 2013). Jednocześnie

zaobserwowano, że nie wszystkie związki z tej grupy metabolitów, występujące przede

wszystkim w korzeniach, posiadają właściwości antyutleniające (Piątczak i wsp. 2014).

W badaniach własnych zawartość polifenoli była wyższa w kulturach odmiany Selena

rosnących zarówno na pożywce pędowej (w 5 oraz 14 dniu wzrostu kultur), jak i

korzeniowej (w 14-tym i 28-mym dniu wzrostu), w porównaniu do odm. Szafir.

Również poziom tanin był wyższy (w kulturach pędowych w 5-tym dniu wzrostu, a w

kulturach korzeniowych w 14-tym oraz 28-mym dniu wzrostu) u odmiany Selena (Ryc.

30-31). Wyższy poziom związków polifenolowych i tanin w kulturach lnu włóknistego,

w korelacji z ich słabszą regeneracją (w stosunku do kultur lnu oleistego), może

185

świadczyć o negatywnym wpływie tych metabolitów na potencjał morfogenetyczny

tego typu lnu.

Wysoka aktywność SOD prowadzi do powstawania H2O2 w wyniku reakcji

dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego. Wykazano, że H2O2 może pełnić funkcję

sygnalizacyjną (Qiusheng i wsp. 2005). Endogenny H2O2 indukuje organogenezę

poprzez wpływ na ekspresję genów i syntezę białek (Batková i wsp. 2008; Puijalon

2008; Meratan i wsp. 2009). Jednocześnie generowany zbyt wysoki poziom stresu

oksydacyjnego w trakcie hodowli in vitro, może doprowadzić do obniżenia zdolności

regeneracyjnych oraz przyspieszyć starzenie tkanek (Benson 2000). Badane w pracy

kultury lnu oleistego (odm. Szafir), charakteryzujące się wysoką efektywnością

formowania pędów i korzeni, odznaczały się spadkiem aktywności SOD w czasie

wzrostu w porównaniu do typu włóknistego (odm. Selena) odznaczającego się niższym

potencjałem regeneracyjnym (Ryc. 32-33). Być może wysoka aktywność SOD w

początkowym etapie wzrostu odm. Szafir prowadzi do zwiększenia ilości H2O2, który

indukuje proces różnicowania, prowadzący do powstania organów. Utrzymująca się na

wysokim poziomie aktywność SOD przez cały okres wzrostu kultur odm. Selena

prawdopodobnie związana jest z wysokim poziomem stresu oksydacyjnego w tkankach

tej odmiany, co oddziałuje hamująco na organogenezę (Ryc. 32-33) i obserwowane w

trakcie wzrostu starzenie eksplantatów.

W czasie wzrostu kultur pędowych i korzeniowych badanych odmian lnu

obniżyła się aktywność CAT – enzymu odpowiadającego za usuwanie nadmiaru H2O2.

Enzym ten może uczestniczyć również w regulacji wzrostu i różnicowania komórek

(Molassiotis i wsp. 2004). Jednakże w kulturach pędowych lnu odm. Szafir, zmiany

aktywności CAT nie wpłynęły na zmianę potencjału formowania pędów (Ryc. 32), co

może być związane z jednoczesnym obniżeniem aktywności SOD. Możliwe również, że

wpływ systemu antyoksydacyjnego na zdolności regeneracyjne eksplantatów lnu jest

bardziej znaczący na początku wzrostu kultur, niż w ostatnich dwóch tygodniach. Warto

zwrócić uwagę na różnicę w aktywności CAT i SOD między badanymi odmianami lnu

w 5-tym dniu wzrostu kultur korzeniowych – są one wyższe w kulturach odm. Selena

(Ryc. 32-33). Jednakże zdolności regeneracyjne obu odmian w kierunku ryzogenezy

wydają się być podobne (Ryc. 20-21). CAT może być odpowiedzialny za usuwanie

nadmiaru H2O2 nagromadzonego w początkowym etapie wzrostu, również w wyniku

aktywności SOD (Dutta Gupta i Datta 2004).W przypadku kultur odm. Selena można

sądzić, iż niska aktywność CAT (zwłaszcza w 14-tym i 28-mym dniu wzrostu) przy

186

jednocześnie wysokiej aktywności SOD wpływa negatywnie na kaulogenezę i

ryzogenezę oraz powoduje brązowienie eksplantatów. Dutta Gupta i Datta (2004)

wyjaśniają, że jest to wynikiem utrzymującego się wysokiego poziom H2O2, co może w

konsekwencji doprowadzić do śmierci komórek. W kulturach kopru ogrodowego

(Anethum graveolens L.), Tacitus bellus L. czy szafranu uprawnego (Crocus sativus L.)

zanotowano podwyższony poziom SOD w początkowych etapach wzrostu kultur, przy

jednoczesnym obniżeniu aktywności CAT na dalszych etapach organogenezy tych

gatunków (Vatankhah i wsp. 2010, Jana i Shekhawat 2012, Mitrowić i wsp. 2012).

5.2 Oddziaływanie stresu osmotycznego oraz SNP na modyfikację

organogenezy lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) typu oleistego

(odm. Szafir) i typu włóknistego (odm. Selena)

W pracy podjęto próbę określenia czynników poprawiających organogenezę w

kulturach in vitro lnu zwyczajnego. Sprawdzono wpływ stresu osmotycznego

wywołanego zwiększeniem zawartości różnych cukrów w pożywkach, odpowiednich

do wzrostu kultur lnu oleistego i włóknistego oraz wpływ SNP, powszechnie

używanego donora NO.

Niektóre warunki stresowe zwiększają zdolności regeneracyjne roślin w

warunkach in vitro (Puijalon i wsp. 2008). W celu poprawy organogenezy badano

wpływ ekspozycji kultur tkankowych na krótkotrwałe działanie wybranych stresów

takich jak deficyt wody, którego działanie poprawiało regenerację w kulturach in vitro

ryżu (Jain i wsp. 1996) oraz kilku odmian pszenicy (Khanna i Deggard 2001).

Mundhara i Rashid (2001) zaobserwowali pozytywny efekt działania wysokiej

temperatury, stresu solnego oraz niedoboru składników mineralnych na formowanie

pąków pędowych na hipokotylach siewek lnu w warunkach in vitro. Niedobór wapnia

oraz oddziaływanie niektórych bodźców fizycznych jak susza czy wiatr miały

pozytywny wpływ na pobudzanie merystemów epidermalnych hipokotyli lnu (Verdus i

wsp. 1997). Wyniki badań własnych wskazują, że zastosowana podwyższona zawartość

sacharozy w pożywce pędowej nie miała wpływu na stymulację kaulogenezy w

kulturach obu badanych odmian lnu (Ryc. 37-38). W przypadku kultur korzeniowych

trzykrotne podwyższenie zawartości sacharozy w podłożu, u odm. Szafir skutkowało

zwiększeniem organogenezy w 3-cim tygodniu wzrostu kultury. Kultury odm. Selena,

rosnące na podłożu z dwukrotnie zwiększoną zawartością sacharozy, bezpośrednio po

187

działaniu warunków stresowych (2 tydzień wzrostu) charakteryzowały się

podwyższonym procentem eksplantatów z korzeniami. Jednak różnica w efektywności

organogenezy korzeniowej pomiędzy kulturami kontrolnymi, a stresowanymi u

badanych odmian nie utrzymała się do ostatniego tygodnia wzrostu (Ryc. 39 -40).

Badania Millam i współpracowników (1992) pokazują, iż kultury lnu odm. Stormont

Silver, rosnące na podłożu z wysoką zawartością sacharozy, charakteryzowały się

efektywniejszą ryzogenezą oraz wyższą świeżą masą eksplantatów. W kulturach

zawiesinowych głowienki pospolitej (Prunella vulgaris L.) zawartość sacharozy w

pożywce w granicach 20-25g l-1

, wywołująca stres osmotyczny wpływała pozytywnie

na podwyższenie biomasy, podwyższenie poziomu związków fenolowych,

flawonoidów, białek oraz podwyższenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych. Z

kolei wyższe ilości sacharozy (40-50 g l-1

), wpływały negatywnie na aktywność

antyoksydacyjną w kulturach tego gatunku (Fazal i wsp. 2016). W przypadku kultur

korzeniowych dziurawca zwyczajnego (Hypericum perforatum L.) tak wysokie

zawartości sacharozy podwyższały aktywność systemu antyoksydacyjnego (Cui i wsp.

2010). Pozytywny efekt działania czynników stresowych na morfogenezę roślin,

związany jest ze zwiększoną produkcją ROS, zwłaszcza H2O2 i generowaniem stresu

oksydacyjnego (Kreslavski i wsp. 2012). Nadtlenek wodoru znany jest nie tylko jako

wskaźnik zachodzącego stresu, ale również jako cząsteczka sygnalna w procesie

wzrostu i rozwoju roślin (Śleak i wsp. 2007). Sakamoto i Murata (2002) stwierdzili, że

wysoka zawartość sacharozy wpływa na zwiększenie poziomu ROS, a zwłaszcza H2O2.

W badaniach własnych zaobserwowano podwyższenie zawartości H2O2 w kulturach

pędowych odm. Selena i korzeniowych odm. Szafir bezpośrednio po działaniu stresu.

Podwyższony poziom H2O2 stwierdzono również w końcowej fazie wzrostu kultur

korzeniowych badanych odmian (Ryc. 44). Sugerować można, że utrzymująca się tak

długo od zadziałania stresu wyższa zawartość H2O2, w porównaniu do kontroli, to efekt

innych procesów, np. związanych ze starzeniem się kultur.

Kolejne badania skoncentrowane były na określeniu oddziaływania roztworu

nitroprusydku sodu (SNP) dodanego do podłoża, oraz fumigacji kultur SNP na

organogenezę lnu zwyczajnego.

Najczęściej prowadzone doświadczenia w warunkach in vitro, dotyczące udziału

NO w regulacji wzrostu i rozwoju, dotyczyły obserwacji procesów morfogenetycznych

zachodzących pod wpływem dodanych do pożywki różnych donorów NO. Stymulujący

wpływ SNP na kaulogenezę stwierdzono w kulturach rośliny z rodziny bobowatych

188

Albizzia lebbeck L. (Kalra i Babbar 2012), zaś na kaulogenezę i ryzogenezę w kulturach

in vitro jabłoni hupeheńskiej (Malus hupehensis Rehd.) (Han i wsp. 2009).

Nitroprusydek sodu korzystnie wpływał na formowanie pędów w kulturach in vitro

wanilii płaskolistnej (Vanilla planifolia Andrews) (Tan i wsp. 2013). Pozytywny efekt,

dodanych bezpośrednio do pożywki donorów NO (m. in. SNP, SNAP), na

organogenezę pędów oraz korzeni, uzyskano również w kulturach lnu zwyczajnego

(Kalra i Babbar 2010). W przypadku kultur pochrzynu chińskiego (Dioscorea opposita

Thunb.) wykazano, że zastosowanie SNP przyczyniło się do ograniczenia brązowienia

eksplantatów, pochodzących z bulw i równocześnie do zwiększenia proliferacji kalusa

oraz regeneracji pędów (Xu i wsp. 2009). W badaniach własnych z kolei, gdy

dodawano SNP w różnych stężeniach bezpośrednio do pożywek odpowiednich do

wzrostu kultur pędowych i korzeniowych odm. Szafir (Ryc. 45 -46), podobnych

efektów nie obserwowano. Być może wynika to z odmiennej wrażliwości różnych

gatunków roślin na działanie NO wydzielającego się z SNP, jak również innych

cząsteczek (np. CN-, ROS) uwalnianych z SNP. Ponadto czas połowicznego rozpadu

tego donora wynosi 12 godzin (Gniazdowska i Bogatek 2007), więc uwalniane

cząsteczki (w tym NO) oddziaływały zbyt krótko i w zbyt małym stężeniu, aby wpłynąć

na organogenezę. Stwierdzono, że SNP charakteryzuje się maksymalnym wydzielaniem

NO w drugiej godzinie od naświetlania (Floryszak-Wieczorek i wsp. 2006), co przy

długotrwałym wzroście kultur lnu mogło nie wpłynąć na efekt morfogenetyczny.

Podjęto więc próbę zbadania oddziaływania par wydzielających się z wodnego

roztworu SNP na organogenezę lnu oleistego i włóknistego. Stwierdzono, iż opary

wodnego roztworu SNP wpływają stymulująco na ryzogenezę w kulturach in vitro odm.

Selena rosnących na podłożu z dodatkiem NAA (Ryc. 51-52). Zaobserwowano, że

najwyższy procent eksplantatów z korzeniami oraz liczba tych organów przypadająca

na eksplantat pojawiała się przy traktowaniu kultur niższymi dawkami SNP (5 ml),

natomiast organogeneza przy wyższych dawkach była porównywalna do kontroli (Ryc.

51-52; Fot. 11). Odmienne oddziaływanie SNP na ryzogenezę stwierdzono w

przypadku kultur lnu oleistego (odm. Szafir), gdzie SNP nie wpłynął na efektywność

organogenezy, a w wysokich dawkach (30 ml) obniżał namnażanie korzeni (Ryc. 51-52;

Fot. 11). W badaniach Pagnussat i współpracowników (2002) donory NO indukowały

organogenezę korzeni u ogórka, natomiast przy współdziałaniu SNP z zastosowaną z

auksyną (IAA), także wydłużanie tych organów nawet o 1,6 razy. Można więc

przypuszczać, że w warunkach eksperymentalnych na pobudzanie ryzogenezy lnu

189

włóknistego, w wyniku oddziaływania par wydzielających się z wodnego roztworu SNP

może mieć wpływ jego współdziałanie z auksyną. Warto podkreślić, że nie

zaobserwowano zmian w efektywności organogenezy pędowej w wyniku działania par

wydzielających się z roztworu SNP, zarówno w kulturach odm. Szafir jak i Selena

rosnących na pożywce z dodatkiem BA.

Przetestowano również działanie SNP na organogenezę w kulturach in vitro lnu,

rosnących na pożywce bez dodatku hormonów. Niższe dawki SNP (5 -10 ml) wpływały

stymulująco na organogenezę pędową i korzeniową w kulturach odm. Selena (Ryc. 53;

Fot. 13). Istotne jest, że w kulturach poddanych fumigacji SNP, korzenie były dłuższe i

lepiej rozwinięte, w porównaniu do kontroli, a zwłaszcza w kulturach poddanych

działaniu 5 ml oraz 10 ml SNP (Ryc. 60; Fot. 13). Zaobserwowano również dodatni

wpływ SNP na organogenezę pędową w kulturach tej odmiany, rosnących na podłożu

bez dodatku hormonów (Ryc. 53). W kulturach lnu odm. Szafir, rosnących na pożywce

bez hormonów, nie zaobserwowano wpływu SNP na efektywność organogenezy

pędowej i korzeniowej, gdyż potencjał regeneracyjny kultur kontrolnych i poddanych

ekspozycji na pary wydzielające się z SNP był podobny. Na postawie różnic w

efektywności organogenezy testowanych odmian lnu można sugerować o odmiennej ich

wrażliwości na pary wydzielające się z wodnego roztworu SNP. Obserwowany efekt

morfogenetyczny w kulturach odm. Selena może wskazywać, że NO, którego SNP jest

donorem, działając bezpośrednio lub współdziałając z auksynami, stymuluje proces

ryzogenezy. Nie wykluczony jest również efekt działania innych cząsteczek (np. CN-,

ROS) uwalnianych z SNP. Jednocześnie obniżenie efektywności organogenezy

korzeniowej w kulturach odm. Szafir rosnących na podłożu z dodatkiem NAA i

traktowanych SNP w dawce 30 ml może wskazywać na zbyt dużą ilość zastosowanego

roztworu, ale również na antagonistyczne działanie zastosowanego donora NO w

stosunku do auksyny. Podobnych wniosków dostarczyły również badania nad regulacją

wzrostu korzeni prowadzone na A. thaliana (Fernandez Marcos i wsp. 2011). Hamujący

wpływ donora na regenerację, obserwowano także u żyworódki pierzastej (Kalanchoë

pinnata (Lam.) Pres.) (Abat i Deswal 2013). Świadczyć to może o tym, iż efekt dawki

SNP i czas ekspozycji na związek jako czynników wpływających na organogenezę

zależy od odmiany/typu testowanej rośliny.

Przeprowadzono również doświadczenia z wykorzystaniem „wymiatacza” NO –

c-PTIO, mające na celu potwierdzenie udziału egzogennego NO w stymulacji

190

organogenezy w kulturach odm. Selena. Wyniki tych badań wskazują, że obserwowany

stymulujący wpływ SNP na organogenezę w kulturach lnu włóknistego jest efektem

działania NO, gdyż w kulturach poddanych działaniu c-PTIO oraz kontrolnych

potencjał morfogenetyczny był podobny (Ryc. 55 -60). Nie można jednak wykluczyć

również wpływu innych składników par wydzielanych z SNP, których w

doświadczeniach nie badano. Wyniki badań, dotyczące innych gatunków roślin, z

zastosowaniem „wymiataczy” NO (np. c-PTIO), dodawanych razem z donorami tlenku

azotu do pożywek, potwierdziły promujący wpływ tej cząsteczki na morfogenezę

(Song i wsp. 2006, Xu i wsp. 2009, Kalra i Babbar 2010). Uważa się, że SNP jest

skutecznym donorem NO w badaniach nad oddziaływaniem tej cząsteczki na roślinne

kultury in vitro (Rico-Lemus i Rodriguez-Garay 2014).

W przeprowadzonych badaniach wykazano odmienną reakcję kultur lnu

oleistego i włóknistego na działanie SNP. Do dalszych analiz, mających na celu

określenie prawdopodobnego sposobu działania NO, wybrano te warianty, w których

zaobserwowano poprawę organogenezy pod wpływem par wydzielających się z

roztworu SNP. Były to kultury lnu odm. Selena rosnące na podłożu bez dodatku

hormonów, w których obserwowano stymulację kaulogenezy i ryzogenezy oraz rosnące

na pożywce korzeniowej (z dodatkiem NAA), w których obserwowano tylko stymulację

ryzogenezy.

W kulturach lnu odm. Selena rosnących na pożywce korzeniowej (z dodatkiem

NAA), jak i bez dodatku hormonów oraz poddanych działaniu SNP, zawartość TBARS

obniżyła się bezpośrednio po ekspozycji (0 dzień hodowli) (Ryc. 62). Może to

świadczyć o ochronnej roli NO którego SNP jest donorem, przed uszkodzeniami

wynikającymi z peroksydacji lipidów (O’Donnell i wsp. 1997, Arasimowicz-Jelonek i

wsp. 2009). Zawartość H2O2 po ekspozycji obu typów kultur na SNP była jednak

odmienna. W rosnących na pożywce korzeniowej (z dodatkiem NAA) poziom H2O2 był

niższy od kontroli na początku wzrostu (0, 1 dzień) i ulegał podwyższeniu dopiero po 5-

tym dniu od ekspozycji na SNP. Natomiast w kulturach rosnących na podłożu bez

dodatku hormonów, zawartość H2O2 była wyższa 1-szego i 5-tego dnia (Ryc. 61).

Obserwowane w kulturach rozwijających się na pożywce bez dodatku hormonów i

poddanych działaniu SNP zmiany morfogenetyczne (stymulacja ryzogenezy i

kaulogenezy), mogły częściowo wynikać z generowanego w tkankach stresu

oksydacyjnego, o czym świadczy podwyższone stężenie H2O2 na początku wzrostu

kultur. NO, którego SNP jest donorem, jako przeciwutleniacz, poprzez regulację

191

stężenia ROS, uczestnicząc w utrzymywaniu homeostazy redoks, prowadzić może do

zwiększenia odporności roślin na czynniki stresowe (Arasimowicz i wsp. 2008). W

przypadku kultur pochrzynu, SNP, poprzez obniżenie stężenia H2O2, przyczyniło się do

ograniczenia brązowienia eksplantatów pochodzących z bulw i równocześnie do

zwiększenia proliferacji kalusa oraz kaulogenezy (Xu i wsp. 2009). Badania dotyczące

innych gatunków roślin, prowadzone w kulturach in vitro wskazują, że pozytywnym

efektem działania ROS może być zmiana potencjału antyoksydacyjnego tkanek. W

przypadku kultur pieprzu czarnego (Piper nigrum L.), potencjał ten ulegał znacznemu

podwyższeniu podczas powstawania pędów, w porównaniu do tkanek

niezróżnicowanych (Nisar i wsp. 2010). Zregenerowane tkanki biedrzeńca anyżu

(Pimpinella anisum L.) również wykazywały wysoki potencjał antyoksydacyjny. W

materiale tym stwierdzono równocześnie podwyższone stężenie fenoli, metabolitów

pełniących ochronne funkcje przed negatywnym działaniem ROS (Andarwulan i Shetty

1999, Mitrović i wsp. 2012). Zaobserwowano także, że wzajemne oddziaływanie H2O2 i

enzymów antyoksydacyjnych, wpływało korzystnie na formowanie pąków w kulturach

kalusowych truskawki (Tian i wsp. 2003). Sugerowano również sygnalną rolę H2O2 w

regulacji ekspresji genów kodujących enzymy systemu antyoksydacyjnego (Scandalios

2005, Skrzypek 2012). W badaniach własnych, jedynie w przypadku kultur odm.

Selena, rosnących na podłożu z dodatkiem NAA stwierdzono wzrost zdolności

przeciwwolnorodnikowej bezpośrednio po działaniu SNP (Ryc. 66). Wzrost potencjału

morfogenetycznego kultur pochrzynu był kojarzony z lepszymi zdolnościami

antyoksydacyjnymi eksplantatów traktowanych SNP, przejawem których była

podwyższona aktywność SOD i wyższe stężenie antyoksydantów nieenzymatycznych

(glutation, prolina) (Xu i wsp. 2009). Zaobserwowano, że kultury pomarańczy

trójlistkowej (Poncirus trifoliata L.) poddane działaniu SNP i stresowi suszy,

charakteryzowały się niższym stężeniem ROS, podwyższoną aktywnością enzymów

antyoksydacyjnych oraz były bardziej odporne na utratę wody (Fan i Liu 2012). W

badaniach własnych stwierdzono jednak obniżenie aktywności SOD w kulturach lnu

rosnących na pożywce korzeniowej bezpośrednio po działaniu SNP, natomiast w

kulturach rosnących na podłożu bez dodatku hormonów, aktywność tego enzymu

wzrosła, ale dopiero po 5-tym dniu od ekspozycji na SNP (Ryc. 67). Aktywność CAT

bezpośrednio po działaniu SNP (0 i 1 dzień) również nie uległa podwyższeniu w obu

badanych typach kultur (Ryc. 69). Niski poziom SOD może potwierdzać, że aktywność

enzymu nie jest związana z organogenezą korzeni, tak jak w przypadku kultur lnu odm.

192

Super oraz w kalusie przypołudnika (Mesembryanthemum sp. L.), zdolnego do

formowania korzeni (Libik-Konieczny i wsp. 2012, Takáč i wsp. 2016). Jednocześnie

wzrost aktywności MnSOD oraz CuZnSOD (odpowiednio 0 i 1 dzień po działaniu

SNP) w kulturach rosnących na podłożu bez dodatku hormonów oraz po 5-tym dniu w

kulturach korzeniowych (Ryc. 67-68), może sugerować udział tych izoform w

stymulacji organogenezy. W kulturach przypołudnika kryształowego

(Mesembryanthemum crystallinum L.) odnotowano podwyższenie aktywności izoformy

CAT-2 oraz MnSOD w czasie ryzogenezy (Konieczny i wsp. 2014). Sugeruje się

powiązanie aktywności NO, u roślin z aktywnością hormonów np. ABA, etylenu,

kwasu jasmonowego oraz innych cząsteczek sygnalnych (H2O2) (Simontacchi i wsp.

2013; Qiao i wsp. 2014). Dane literaturowe wskazują, że NO jako cząsteczka sygnalna,

może uruchamiać inne elementy szlaku transdukcji sygnału, tj. cGMP, cADPR, Ca2+

,

kinazy MAP, prowadząc w konsekwencji do zmiany ekspresji genów i podwyższenia

tolerancji na stres (Gill i wsp. 2013, Mur i wsp. 2013).

Regulacja morfogenezy w kulturach odm. Selena (typ włóknisty lnu) zachodzi

za pośrednictwem egzogennego NO, który indukuje ciąg zdarzeń, prowadzący do

stymulacji kaulogenezy i ryzogenezy. W kulturach rosnących na pożywce korzeniowej

(z dodatkiem NAA) i na pożywce bez dodatku hormonów (-NAA), reakcje inicjowane

przez NO mogą przebiegać w sposób nieco odmienny, prowadząc do tego samego

efektu, czyli stymulacji formowania organów. W kulturach rosnących na podłożu bez

hormonów, NO może wpływać na biosyntezę cytokinin, lub związków

cytokininopodobnych, czy też regulować ich aktywność. Możliwe następstwa reakcji,

które mogą mieć miejsce w czasie wzrostu tych kultur po fumigacji SNP przedstawiono

na Ryc. 71. Przypuszczać można, że w regulację organogenezy w kulturach odm. Szafir

(typ oleisty lnu) zaangażowany jest NO endogenny, którego odpowiedni poziom w

komórkach kultur tej odmiany skutkuje wysoką efektywnością formowania pędów i

korzeni.

193

Ryc. 71. Efekt działania NO na procesy morfogenetyczne w kulturach in vitro lnu odm. Selena

rosnących na pożywce korzeniowej (+NAA), oraz bez dodatku hormonów (-NAA).

(+) – podwyższona zawartość/aktywność; (-) – obniżona zawartość/aktywność; (=) – brak

różnic: (dotyczy początkowych etapów wzrostu kultur - 0, 1 dzień po fumigacji SNP)

Uzyskane wyniki wskazują na złożoność procesów stymulujących organogenezę

w kulturach in vitro lnu. Aby wyciągnąć jednoznaczne wnioski należałoby

kontynuować niniejsze badania. Wydaje się, że ciekawym uzupełnieniem uzyskanych w

pracy wyników byłyby oznaczenia endogennych stężeń hormonów (zwłaszcza auksyn i

cytokinin), zarówno w kulturach lnu rosnących w warunkach optymalnych, jak i

poddanych działaniu SNP lub innych donorów (np. SNAP) na różnym etapie ich

wzrostu. Ciekawym aspektem badań byłoby również zbadanie oddziaływania innych

cząsteczek wydzielających się z roztworu SNP – np. anionów cyjankowych (CN-), a

także ich współdziałania z NO (i hormonami) w regulacji morfogenezy lnu.

194

6 Podsumowanie i wnioski

1. Badane odmiany lnu zwyczajnego: Szafir (typ oleisty) i Selena (typ włóknisty)

mają różne wymagania pod względem składu pożywki. Optymalną pożywką do

wzrostu i organogenezy kultur lnu odm. Szafir jest podłoże MS, natomiast w

przypadku odm. Selena – B5.

2. Len oleisty oraz len włóknisty charakteryzują się podobnymi wymaganiami co

do rodzaju zastosowanych auksyn oraz cytokinin, a także ich wzajemnych stężeń

w podłożu.

3. Efektywniejszą organogenezę pędową oraz korzeniową w optymalnych

warunkach wzrostu obserwowano w kulturach lnu oleistego niż u włóknistego.

4. Szybkość pojawiania się organów na eksplantatach zależy od odmiany lnu - pędy

i korzenie formowały się wcześniej w kulturach odm. Szafir, niż u odm. Selena.

5. Kultury odm. Szafir charakteryzują się wyższą zawartością barwników

fotosyntetycznych oraz wyższym natężeniem fotosyntezy netto niż kultury odm.

Selena. Przejawem tych różnic może być obserwowana efektywniejsza

organogeneza pędowa w kulturach lnu oleistego.

6. Zawartość metabolitów wtórnych obniżała się w trakcie wzrostu kultur, przy

czym kultury lnu włóknistego, w odróżnieniu od oleistego, charakteryzują się

zwiększoną zawartością większości badanych metabolitów oraz wyższą

aktywnością enzymów antyoksydacyjnych SOD i CAT. Mogło to przyczynić

się do obniżenia potencjału regeneracyjnego włóknistego typu lnu.

7. Stres osmotyczny (wywołany zwiększoną ilością cukrów w podłożu), ani

nitroprusydek sodu (SNP) - dodany bezpośrednio do podłoża - nie wpływały

stymulująco na organogenezę w kulturach lnu.

8. Opary (m.in. NO) wydzielające się z wodnego roztworu SNP wpływały

stymulująco na organogenezę w kulturach lnu włóknistego, przy czym:

9. W kulturach rosnących w obecności auksyny NAA (pożywka korzeniowa)

obserwowano poprawę ryzogenezy;

10. W kulturach rosnących na pożywkach bez dodatku auksyny obserwowano

stymulację ryzogenezy, ale również organogenezy pędowej.

195

11. Zastosowanie „wymiatacza NO” c-PTIO, wskazuje, że efekt morfogenetyczny

obserwowany w kulturach odm. Selena pod wpływem par wydzielających się z

roztworu SNP wynika z działania NO.

12. Kultury odm. Selena wykazują aktywność przeciwwolnorodnikową o czym

świadczy redukcja rodnika DPPH.

13. W kulturach lnu odm. Selena, niezwłocznie po ekspozycji na SNP, zawartość

TBARS obniżyła się. Fumigacja SNP nie wpłynęła jednak znacząco na

podwyższenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych (SOD i CAT).

14. Zawartość H2O2 po ekspozycji kultur na SNP kształtowała się różnie w

początkowym etapie wzrostu (0, 1 dzień):

a) w kulturach rosnących na pożywce korzeniowej (z dodatkiem NAA)

obniżyła się;

b) w kulturach rosnących na podłożu bez dodatku hormonów podwyższyła się.

15. Regulacja organogenezy przez NO w kulturach lnu włóknistego może przebiegać

w dwojaki sposób:

a) NO, współdziałając z auksyną (NAA) dodaną do podłoża, inicjuje łańcuch

zdarzeń, prowadzący do poprawy ryzogenezy;

b) NO, prawdopodobnie w interakcji z H2O2, (którego poziom w kulturach

rosnących na podłożu bez hormonów podwyższa się w początkowych

etapach wzrostu po traktowaniu SNP) inicjuje łańcuch zdarzeń prowadzący

do wzmożonej syntezy auksyny i poprawy ryzogenezy, oraz syntezy

cytokininy lub jej analogów (wpływających na formowanie pędów).

16. W regulację organogenezy w kulturach lnu włóknistego, zapoczątkowaną przez

NO (i/lub inne gazy uwalniające się z SNP) może być zaangażowany również

system antyoksydacyjny, regulujący poziom ROS (szczególnie H2O2).

196

Streszczenie

Procesy morfogenetyczne w kulturach in vitro są regulowane zarówno przez

czynniki endogenne jak i egzogenne. Poszukiwanie elementów usprawniających

organogenezę w warunkach in vitro to aktualny problem badawczy dotyczący

efektywnego mikrorozmnażania roślin. W niniejszych badaniach wykorzystano kultury

in vitro lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) typu oleistego (odm. Szafir) i typu

włóknistego (odm. Selena) rosnące w warunkach umożliwiających optymalny wzrost i

rozwój eksplantatów. Kultury lnu poddano działaniu wybranych czynników (stresu

osmotycznego oraz oparów zawierających NO), które mogłyby wpłynąć na

efektywniejszą organogenezę. Celem niniejszej pracy było porównanie zdolności

morfogenetycznych obu typów lnu oraz określenie możliwych mechanizmów

regulujących procesy organogenezy w wyniku działania stresu osmotycznego lub po

traktowania kultur oparami z nitroprusydku sodu (SNP). Odmiany lnu, będące obiektem

badań, nie były jak dotychczas poddawane analizom w tym kierunku.

Wybrane odmiany lnu odznaczają się odmiennymi wymaganiami co do składu i

rodzaju pożywki wykorzystywanej do wzrostu kultur. Charakteryzują się natomiast

podobnymi wymaganiami co do rodzaju zastosowanych auksyn oraz cytokinin, a także

ich wzajemnych stężeń w podłożu. W dobranych optymalnych warunkach wzrostu

kultur, efektywniejszą organogenezą odznaczała się odm. Szafir, w porównaniu do

odm. Selena. Formowanie pędów i korzeni w kulturach lnu oleistego (Szafir)

obserwowano wcześniej i było ono efektywniejsze pod względem ilościowym, w

porównaniu z organogenezą u lnu włóknistego. W kulturach lnu oleistego obserwowano

także zwiększoną zawartość barwników fotosyntetycznych oraz wyższe natężenie

fotosyntezy. Jednocześnie, w kulturach odm. Szafir obserwowano zmniejszoną

zawartość większości badanych metabolitów wtórnych (polifenoli, tanin,

fenylopropanoidów i flawonoidów) w porównaniu do kultur odm. Selena,

wykazujących obniżony potencjał regeneracyjny. Ponadto odm. Selena

charakteryzowała się bardziej zróżnicowanym składem chemicznym związków

(analizowanych GC/MS) w porównaniu do odm. Szafir. Warto zwrócić uwagę że

aktywność badanych antyoksydantów enzymatycznych (SOD, CAT) w kulturach lnu

włóknistego (Selena), na początku wzrostu była również wyższa niż w kulturach lnu

oleistego.

197

Stres osmotyczny wywołany dodatkiem zwiększonej ilości cukrów do podłoża, nie

wpłynął na poprawę organogenezy w kulturach badanych odmian. Natomiast

zastosowanie par wydzielających się z wodnego roztworu SNP, zawierających NO,

przyczyniło się do poprawy ryzogenezy w kulturach lnu włóknistego, zarówno

rosnących na pożywce korzeniowej (wzbogaconej o NAA), jak i bez dodatku

hormonów. Warto podkreślić, że pary z SNP w kulturach tego typu lnu, rosnących na

pożywce bez hormonów również stymulowały kaulogenezę. Doświadczenia z użyciem

c-PTIO potwierdziły udział NO w regulacji organogenezy w kulturach lnu włóknistego.

Traktowanie kultur lnu włóknistego oparami z SNP spowodowało podwyższenie ich

zdolności przeciwwolnorodnikowej. Jednocześnie, niezwłocznie po fumigacji SNP,

obniżyła się zawartość TBARS w tych kulturach. Natomiast poziom H2O2 kształtował

się różnie: w kulturach rosnących na pożywce korzeniowej obniżył się, a uległ

podwyższeniu na podłożu bez dodatku hormonów. Wzmożona synteza H2O2 na

późniejszym etapie wzrostu kultur rosnących na podłożu bez dodatku hormonów

wskazuje na prawdopodobną rolę sygnalną tego związku. Fumigacja SNP nie wpływała

na podwyższenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych (SOD i CAT) w większości

przypadków, jednak w późniejszym etapie wzrostu kultur odm. Selena odnotowano

podwyższoną aktywność MnSOD (prawdopodobnie związaną z inną funkcją enzymu).

W kulturach odm. Selena poprawa efektywności organogenezy w wyniku działania NO

uwolnionego z roztworu SNP może być spowodowana współdziałaniem tego gazu z

hormonami dodanymi do podłoża, lub indukować syntezę innych hormonów (np.

cytokinin), lub cząstek sygnalnych (np. H2O2).

198

Summary

Morphogenetic processes in in vitro cultures are regulated by various

endogenous and exogenous factors. The search for new factors improving

organogenesis in vitro is a current problem for effective micropropagation of crop

plants. In this study, the flax plants (Linum usitatissimum L.), oil flax (cv. Szafir) and

fibrous (cv. Selena), are grown in an in vitro culture, under optimal growth conditions

enabling effective development of explants. Flax cultures were subjected to selected

treatments (osmotic stress or NO gas fumes) possibly affecting organogenesis. The aim

of this work was to compare the morphogenetic abilities of both cultivars of flax plants

and to study mechanisms regulating processes of organogenesis, as an affected by

osmotic stress or after sodium nitroprusside (SNP, donor of NO) treatments of culture.

The cultivars of flax, that were subject of the research, have not been analyzed so far in

this direction. Cultivars of flax have same different requirements for composition and

type of nutrient media used for in vitro growth. Both cultures required similar types of

auxins and cytokinins, as well as the same concentrations of hormones in the medium.

Under optimum conditions of growth, more effective organogenesis were distinguished

on cultures of flax cv. Szafir, compared to the Selena cultures. Formation of shoots and

roots in oil flax cultures (cv. Szafir) has been observed earlier and was more effective

(in quantitative terms) than fiber flax organogenesis. In the oil flax cultures also

chlorophylls and carotenoids content increased and a high net intensity of

photosynthesis was observed. At the same time, in the cultures of the cv. Szafir, a

decrease in secondary metabolites content (polyphenols, tannins, phenylpropanoids and

flavonoids) was observed, in comparison with the cv. Selena. In addition, Selena

cultures were characterized by a more diverse chemical composition of the LZO

compounds (analyzed by GC/MS), when compared to the oil flax. It should be noted

that the activity of the antioxidant enzymes (SOD, CAT) determined in fiber flax

cultures was also higher than in cultures of oil flax in an early stage of development.

Osmotic stress, induced by an addition of sugars to the medium, did not improve

organogenesis in studied cultivars. On the other hand, the vapours from the SNP

solution (containing NO) were contributed to the regeneration improvement, both in

NAA-enriched root cultures and in in vitro cultures of roots and shoots of Selena -

grown without hormones. Experiments with c-PTIO have confirmed NO's contribution

to regulation of organogenesis in flax fiber cultures. The DPR-based EPR spectroscopy

199

results indicated that the cultures of Selena treated with NO vapours (from SNP

solution) showed better antioxidant capacity than control. At the early stage of

regeneration these cultures were also characterized by reduced H2O2 and TBARS

content. Increased synthesis of H2O2 at the later stage of growth in hormone-free

cultures probably indicates the signaling role of hydrogen peroxide. SNP fumigation did

not affect antioxidant enzymes activity (SOD and CAT) in most cases, but in the later

stage of cv. Selena growth, the increased activity of MnSOD was observed (indicating

different function of this isoform). In fiber flax cultures (Selena) the organogenesis

efficiency improvement, as the result of NO action (released from SNP), probably

occurred due to interaction of the nitric oxide and phytohormones in the nutrient

medium, or via other hormones synthesis (e.g. cytokinins) and/or signaling molecules

(e.g. H2O2) stimulation.

200

Bibliografia

1. Abat J.K., Deswal R. 2013. Nitric oxide modulates the expression of proteins

and promotes epiphyllous bud differentiation in Kalanchoë pinnata. J. Plant

Growth Regul. 32: 92-101.

2. Abbasi B. H., Khan M., Guo B., Bokhari S. A., Mir Ajab Khan M. A. 2011.

Efficient regeneration and antioxidative enzyme activities in Brassica rapa var.

turnip. Plant Cell, Tiss. Organ Cult. 105: 337–344.

3. Adamczuk A., Siegień I., Ciereszko I. 2012a. Morphogenesis of plants in vitro

under stress conditions. W: G. Łaska (red.) Biological diversity - from cell to

ecosystem. Polish Botanical Society - Branch in Białystok: 25-39.

4. Adamczuk A., Siegień I., Ciereszko I. 2012b. Roślinne kultury in vitro -

charakterystyka i zastosowania. Edukacja Biologiczna i Środowiskowa 4: 38-46.

5. Adamczuk A., Siegień I., Ciereszko I. 2015. Len zwyczajny (Linum

usitatissimum L.) – znana, a niezwyczajna roślina. Edukacja Biologiczna i

Środowiskowa 3: 15-21.

6. Aebi H. 1984. Catalase in vitro. Methods in Enzymology 105: 121-126.

7. Agati G., Azzarello E., Pollastri S., Tattini M. 2012. Flavonoids as antioxidants

in plants: location and functional significance. Plant Sci. 196: 67–76.

8. Ahmad M. Jarillo J.A., Smirnova O., Cashmore A.R. 1998. The CRY1 blue light

photoreceptor of Arabidopsis interacts with phytochrome A in vitro. Molecular

Cell 1: 939–948.

9. Amalesh S., Gouranga D., Sanjoy K.D. 2011. Roles of flavonoids in plants. Int.

J. Pharm. Sci. Tech. 6: 12–35.

10. Amarowicz R., Pegg R. B., Rahimi-Moghadddam R., Barl B., Weil J. A. 2004.

Free-radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant

species from the Canadian prairies. Food Chem. 84: 551-562.

11. Andarwulan N., Shetty K. 1999. Phenolic content in differentiated tissue

cultures of untransformed and Agrobacterium-transformed roots of anise

(Pimpinella anisum L.). J. Agric. Food Chem. 47: 1776-1780.

12. Andrys D. 2014. The importane of jasmonic acid and its metyl ester in tissue

cultures. W: From biotechnology to environmental protection. Walińska K.

(red.). Faculty of Biological Sciences University of Zielona Góra: 129-139.

201

13. Apel K., Hirt H. 2004 Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress,

and signal transduction. Plant Biol. 55: 373-399.

14. Aphalo P.J. 2006. Light signals and the growth and development of plants – a

gentle introduction. Plant Photobiology Notes 1: 1–39.

15. Arasimowicz M., Floryszak-Wieczorek J., Milczarek G., Jelonek T. 2008. Nitric

oxide, induced by wounding, mediates redox regulation in pelargonium leaves.

Plant Biol. 11: 650-663.

16. Arasimowicz-Jelonek M., Floryszak-Wieczorek J., Kubiś J. 2009. Interaction

between polyamine and nitric oxide signaling in adaptive responses to drought

in cucumber. J. Plant Growth Regul. 28: 177-186.

17. Aremu A.O., Gruz J., Šubrtová M., Szűčová L., Doležal K, Bairu M.W., Finnie

J.F., van Staden J. 2013. Antioxidant and phenolic acid profiles of tissue

cultured and acclimatized Merwilla plumbea plantlets in relation to the applied

cytokinins. J. Plant Physiol. 170: 1303–1308.

18. Asada K. 2000 The waterwater cycle as alternative photon and electron sinks.

Philos. Trans. R. Soc. London B. 355: 1419-1431.

19. Attree S.M., Fowke L.C. 1993. Embryogeny of gymnosperms: advances in

synthetic seed technology of conifers. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 35: 1-35.

20. Baba‐Kasai A.K.I.K.O., Hara N., Takano M. 2014. Tissue‐specific and

light‐dependent regulation of phytochrome gene expression in rice. Plant, Cell

Environ. 37: 2654-2666.

21. Bach A., Pawłowska B. 2009. Procesy rozwojowe w kulturze in vitro i typy

kultury. W: Malepszy S. (red.). Biotechnologia roślin. Wydawnictwo Naukowe

PWN. Warszawa: 21-38.

22. Bajguz A., Hayat S. 2009. Effects of brassinosteroids on the plant responses to

environmental stresses. Plant Physiol. Biochem. 47: 1-8.

23. Baran A. 2007. Regeneracja pędów w kulturach in vitro lnu (Linum

usitatissimum L.). Praca magisterska. Uniwersytet w Białymstoku.

24. Barbehenn R.V., Constabel C.P. 2011. Tannins in plant-herbivore interactions.

Phytochemistry 72: 1551-1565.

25. Bartosz G. 2013. Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. .

Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.

202

26. Bartwal A., Mall R., Lohani P., Guru S.K., Arora S. 2013. Role of secondary

metabolites and brassinosteroids in plant defense against environmental stresses.

J. Plant Growth Regul. 32: 216-232.

27. Batková P., Pospišilová J., Synková H. 2008. Production of reactive oxygen

species and development of antioxidative systems during in vitro growth and ex

vitro transfer. Biol. Plantarum 52: 413-422.

28. Beligni M. V., Lamattina L. 2000. Nitric oxide stimulates seed germination and

de-etiolation, and inhibits hypocotyls elongation, three light-inductible responses

in plants. Planta 210: 215-221.

29. Belonogova M. A., Raldugina G. N. 2006. Shoot regeneration from cotyledon

explants of fibre flax (Linum usitatissimum L.) and their subsequent rooting.

Russ. J. Plant Physiol. 53: 501-506.

30. Benmoussa M., Mukhopadhyay S., Desjardins Y. 1996. Optimization of callus

culture and shoot multiplication of Asparagus densiflorus. Plant Cell, Tiss. Org.

Cult. 47: 91-94.

31. Benson E. E. 2000. In vitro plant cell recalcitrance: an introduction. In Vitro

Cell Dev. Plant. 36: 141–148.

32. Bernabė-Antonio A., Santacruz-Ruvalcaba F., Cruz-Sosa F. 2012. Effect of

plant growth regulators on plant regeneration of Dioscorea remotiflora (Kunth)

through nodal explants. Plant Growth Regul. 68: 293-301.

33. Bertram L., Lercari B. 2000. Phytochrome A and phytochrome B1 control

the acquisition of competence for shoot regeneration in tomato hypocotyl. Plant

Cell Rep. 19: 604-609.

34. Bishop G., Sakakibara M.S., Yamaguchi S. 2015. Biosynthesis of hormones. W:

Buchanan B. B., Gruissem W., Russell L.J. Biochemistry and molecular biology

of plants. Wiley Blackwell, UK: 769-833.

35. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. 2003. Antioxidants, oxidative

damage and oxygen deprivation stress: a review. Ann. Bot. 91: 179-194.

36. Bogunia H., Przywara L. 1999. Rola cukrowców w roślinnych kulturach in

vitro. Wiadomości Botaniczne 43: 25-36.

37. Borkowska B. 1997. Cytokininy. W: Jankiewicz L.S. Regulatory wzrostu i

rozwoju roślin. Właściwości i działanie. Tom I. Wydawnictwo Naukowe PWN.

Warszawa: 60-69.

203

38. Borkowska B. 2003. Fotosynteza jako marker fizjologiczny jakości kultur

pędowych i otrzymanych roślin. Biotechnologia 3: 30-38.

39. Bradford M. M. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram

quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.

Biochem. 72: 248-254.

40. Bretagne B., Chupeau M-Ch., Chupeau Y., Fuilloux G. 1994. Improved flax

regeneration from hypocotyls using thidiazuron as a cytokinin source. Plant Cell

Rep. 14: 120-124.

41. Burbulis N., Blinstrubienė A., Kuprienė R., Sliesaravičius A., Venskutonienė E.

2007. Optimization of linseed flax (Linum usitatissimum L.) in vitro cultures.

Agriculture 94: 120 -128.

42. Burza W. 1995. Sterowanie morfogenezą roślin w kulturach in vitro. Kosmos

44: 691-701.

43. Busch F.A., Sage T.L., Cousins A.B., Sage R.F. 2013. C3 plants enhance rates

of photosynthesis by reassimilating photorespired and respired CO2. Plant Cell

Environ. 36: 200-212.

44. Cantrill L. Overall R.L., Goodwin P.B. 2001. Changes in simple permeability

during adventitious shoot regeneration in tobacco thin cell layers. Planta 214:

206-214.

45. Casal J.J. 2000. Phytochromes, cryptochromes, phototropin: photoreceptor

interactions in plants. J. Photoch. Photobio. B. 71: 1–11.

46. Cashmore A.R., Jarillo J.A., Wu Y.–J., Liu D. 1999. Cryptochromes: blue light

receptors for plants and animals. Science 284: 760–765.

47. Cassells A.C., Curry R.F. 2001. Oxidative stress and physiological, epigenetic

and genetic variability in plant tissue culture: implications for micropropagators

and genetic engineers. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 64: 145-157.

48. Chavan J.J., Gaikwad N.B., Umdale S.D., Kshirsagar P.R., Bhat K.V., Yadav

S.R. 2014. Efficiency of direct and indirect shoot organogenesis, molecular

profiling, secondary metabolite production and antioxidant activity of

micropropagated Ceropegia santapaui. Plant Growth Reg. 72: 1-15.

49. Chen J., Ziv M. 2001. The effect of ancymidol on hyperhydricity, regeneration,

starch and antioxidant enzymatic activities in liquid-cultured Narcissus. Plant

Cell Rep. 20: 22–27.

https://scholar.google.com/citations?view_op=view_citation&hl=en&user=rw_B268AAAAJ&citation_for_view=rw_B268AAAAJ:u5HHmVD_uO8C



https://scholar.google.com/citations?view_op=view_citation&hl=pl&user=Z1ovb18AAAAJ&citation_for_view=Z1ovb18AAAAJ:roLk4NBRz8UC



204

50. Cho K., Agrawal G.K., Shibato J., Jung Y.H., Kim Y.K., Nahm B.H., Jwa N.S.,

Tamogami S., Han O., Kohda K., Iwahashi H., Rakwal R. 2007. Survey of

differentially expressed proteins and genes in jasmonic acid treated rice seedling

shoot and root at the proteomics and transcriptomics levels. J. Proteome Res. 6:

581-603.

51. Chung H.S., Koo A.J., Gao X., Jayanty S., Thines B., Jones A.D., Howe G.A.

2008. Regulation and function of Arabidopsis jasmonate zim-domain genes in

response to wounding and hebivory. Plant Physiol. 146: 952-964.

52. Ciąćka K., Krasuska U., Gniazdowska A. 2016. Modyfikacja endogennego

stężenia tlenku azotu w regulacji spoczynku nasion. W: Bajguz A., Ciereszko I.

(red.). Różnorodność biologiczna - od komórki do ekosystemu. Rośliny i grzyby

– badania środowiskowe i laboratoryjne. Polskie Towarzystwo Botaniczne

Białystok 2016. Agencja Wydawnicza EkoPress, Białystok: 21-32.

53. Ciereszko I. 2006. Kontrola metabolizmu sacharozy u roślin w odpowiedzi na

zmienne warunki środowiska. Kosmos 55: 229-241.

54. Ciereszko I. 2007. Odbiór i przekazywanie sygnału wywołanego zmianami

poziomu cukrów w komórkach roślin. Post. Biol. Kom. 34: 693-711.

55. Ciereszko I. 2016. Cukry jako regulatory wzrostu i rozwoju roślin. W:

Różnorodność biologiczna - od komórki do ekosystemu. Rośliny i grzyby –

badania środowiskowe i laboratoryjne. Bajguz A., Ciereszko I. (red.). Polskie

Towarzystwo Botaniczne Białystok 2016. Agencja Wydawnicza EkoPress,

Białystok :21-32 .

56. Corpas F. J., Leterrier M., Valderrama R., Airaki M., Chaki M., Palma J. M.,

Barroso J. B. 2011. Nitric oxide provokes nitrosative response in plants under

abiotic stress. Plant Sci. 181: 604-611.

57. Corpas F. J., Sandalio L. M., del Rio L. A., Trelese R. N. 1998. Copper–zinc

superoxide dismutase is a constituent enzyme of the matrix of peroxisomes in

the cotyledons of oilseed plants. New Phytol. 138: 307-314.

58. Creelman R.A., Mullet J.E. 1997. Biosynthesis and action of jasmonates in

plants. Annu. Rev. Plant Biol. 48: 355-381.

59. Cui X.H., Murthy H.M., Wu C.H., Paek K.Y. 2010. Sucrose induced osmotic

stress affects biomass, metabolite, and antioxidant levels in root suspension

cultures of Hypericum perforatum L. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 124: 573-581.

205

60. Czaplińska M., Czepas J., Gwozdziński K. 2012. Budowa, właściwości

przeciwutleniające i przeciwnowotworowe flawonoidów. Post. Bioch. 58: 235-

240.

61. Czerpak, R., Piotrowska, A. 2003. Cytokininy, ich struktura, metabolizm i

aktywność biologiczna. Kosmos 52: 203-215.

62. De Klerk G.J., Guan H., Huisman P., Marinova S. 2011. Effects of phenolic

compounds on adventitious root formation and oxidative decarboxylation of

applied indoleacetic acid in Malus ‘Jork 9’. Plant Growth Reg. 63: 175-185.

63. Demarsy E., Fankhauser C. 2009. Higher plants use LOV to perceive blue light.

Curr. Opin. Plant Biol. 12: 69–74.

64. Demmig-Adams B., Adams W.W. 1996. Xanthophyll cycle and light stress in

nature: uniform response to excess direct sunlight among higher plant species.

Planta 198: 460–470.

65. Dixon R.A., Paiva N.L. 1995. Stress-induced phenylpropanoid metabolism.

Plant Cell 7: 1085-1097.

66. Dolcet-Sanjuan R. i Claveria E. 1995. Improved shoot-tip micropropagation of

Pistacia vera L. and the beneficial effects of methyl jasmonate. J. Amer. Soc.

Hort. Sci. 120: 938-942.

67. Drozdowska K. 2013. Zmiany składu podłoża hodowlanego a wzrost lnu

włóknistego (Linum usitatissimum L.) w warunkach sterylnych. Praca

magisterska. Uniwersytet w Białymstoku.

68. Dubravina G.A., Zaytseva S.M., Zagoskina N.V. 2005. Changes in Formation

and Localization of Phenolic Compounds in the Tissues of European and

Canadian Yew during Dedifferentiation in vitro. Russ. J. Plant Physiol. 52: 672-

678.

69. Dutta Gupta S., Datta S. 2004. Anioxidant enzyme activities during in vitro

morphogenesis of gladiolus and the effect of application of antioxidants on plant

regeneration. Biol. Plantarum 47: 179-183.

70. Echeverrigaray S., Fracaro F., Andrade L.B., Biasio S., Atti-Serafini L. 2000. In

vitro shoot regeneration from leaf explants of Roman Chamomile. Plant Cell,

Tiss. Org. Cult. 60: 1-4.

71. Eckstein A., Zięba P., Gabryś H. 2012. Sugar and light effects on the condition

of the photosynthetic apparatus of Arabidopsis thaliana in vitro. J. Plant Growth

Regul. 31: 90–101.

206

72. Emons A.M.C., Samallo-Droppers A., Van der Torn C. 1993. The influence of

sucrose, manitol, L-proline, abscisic acid and gibberelic acid on the maturation

of somatic embryos of Zea mays L. from suspension cultures. J. Plant Physiol.

142: 597-604.

73. Fan Q., Liu J. 2012. Nitric oxide is involved in dehydration/drought tolerance in

Poncirus trifoliata seedlings through regulation of antioxidant systems and

stomatal response. Plant Cell Rep. 31: 145-154.

74. Fazal H., Abbasi B.H., Ahmad N., Ali M., Ali S. 2016. Sucrose induced

Osmotic stress and phtoperiod regimes enhanced the biomass and production of

antioxidant secondary metabolites in shake-flask suspension cultures of Prunella

vulgaris L. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 124: 573-581.

75. Fernandez-Marcos M., Sanz L., Lewis D.R., Munday G.K., Lorenzo O. 2011.

Nitric oxide causes root apical meristem detects and growth inhibition while

reducing PIN-FOR-MED1 (PIN1)-dependent acropetal auxin transport. PNAS

108: 18506-18511.

76. Figueroa C. M., Lunn J. E. 2016. A tale of two sugars: trehalose 6-phosphate

and sucrose. Plant Physiol. 172: 7-27.

77. Floryszak-Wieczorek J., Milczarek G., Arasimowicz M., Ciszewski A. 2006. Do

nitric oxide donors mimic endogenous NO-related response in plants? Planta

224: 1363-1372.

78. Foyer C.H., Noctor G. 2005. Oxidant and antioxidant signaling in plants: a

reevaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant

Cell Envir. 28:1058-1070.

79. Foyer C.H., Shigeoka S. 2011. Understanding oxidative stress and antioxidant

functions to enhance photosynthesis. Plant Physiol. 155: 93–100.

80. Franklin K.A., Quail P. 2010. Phytochrome functions in Arabidopsis

development. J. Exp. Bot. 61: 11–24.

81. Frankowski K., Kęsy J., Kopcewicz J. 2007. Regulacja biosyntezy etylenu u

roślin. Post. Bioch. 53: 66-73.

82. Frankowski K., Świeżawska B., Wilmowicz E., Kęsy J., Kopcewicz J. 2009.

Szlak sygnałowy kwasu jasmonowego - nowe informacje. Post. Bioch. 55: 337-

341.

207

83. Frello S., Stummann B.M., Serek M. 2002. Shoot regeneration of Campanula

carpatica Jacq. (Campanulaceae) via callus phase. Sci. Hort. 93: 86-90.

84. Frohlich A., Durner J. 2011. The hunt for plant nitric oxide synthase (NOS): is

one really needed?. Plant Sci. 181: 401-404.

85. Fuentes G., Talavera C., Desjardins Y., Santamaria J. 2005. High irradiance can

minimize the negative effect of exogenous sucrose on the photosynthetic

capacity of in vitro grown coconut plantlets. Biol. Plantarum 49: 7-15.

86. Gabryś H. 2012. Regulacja procesów wzrostu i rozwoju przez czynniki

środowiskowe. W: Kopcewicz J., Lewak S. (red.). Fizjologia roślin. PWN,

Warszawa: 176-198.

87. Gabryszewska E., Węgrzynowicz-Lesiak E., Kawa-Miszczak L., Góraj J.,

Saniewski M. 2009. Wpływ cytokinin i TDZ na namnażanie liliowca in vitro

oraz na zawartość węglowodanów i chlorofilu w pędach. Zeszyty Problemowe

Postępów Nauk Rolniczych 534: 31-42.

88. Gairi A., Rashid A. 2002. In vitro stimulation of shoot –buds on hypocotyls of

Linum seedlings, by flooding and ethereal treatment of cultures. Plant Sci. 163:

691-694.

89. Gamborg O. L., Miller R. A., Ojima K. 1968. Nutrient requirements of

suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158.

90. Garstka M. 2007. Strukturalne podstawy reakcji świetlnych fotosyntezy. Post.

Biol. Kom. 34: 445-476.

91. Gaspar T., Franck T., Bisbis B., Kevers C., Jouve L., Hausman J.F., Dommes J.

2002. Concepts in plant stress physiology. Application to plant tissue cultures.

Plant Growth Reg. 37: 263-285.

92. Gaspar T., Kevers C., Penel C., Creppin H., Reid M.D., Thorpe T.A. 1996. Plant

hormones and plant growth regulators in plant tissue culture. In Vitro Cell. Dev.

Biol.- Plant 32: 272-289.

93. Genga A., Allavena A. 1991. Factors affecting morphogenesis from immature

cotyledons of Phaseolus coccineus L. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 27: 189-196.

94. Genkov T., Tsoneva P., Ivanova I. 1997. Effect of cytokinins on photosynthetic

pigments and chlorophyllase activityin in vitro cultures of axillary buds of

Dianthus caryophyllus L. J. Plant Growth Reg. 16: 169-172.

208

95. George E.F., De Klerk G-J. 2008. The components of plant tissue culture media

I: macro- and micro-nutrients. W: George E.F., Hall M.A., De Klerk G-J. (red.).

Plant propagation by tissue culture 3rd edition. Springer: 65-115.

96. Gerlach D. 1972. Badanie materiału utrwalonego. Utrwalanie. W: Zarys

mikrotechniki botanicznej; red. Michalkiewicz K. Państwowe Wydawnictwo

Rolnicze i Leśne, Warszawa: 37-53.

97. Ghimire B.K., Seong E.S., Goh E.J., Kim N.Y., Kang W.H., Kim E.H., Yu C.Y.,

Chung I.M. 2010. High-frequency direct shoot regeneration from Drymaria

cordata Willd. leaves. Plant Cell, Tiss. Organ Cult. 100: 209-217.

98. Ghimire B.K., Seong E.S., Goh E.J., Kim N.Y., Kang W.H., Kim E.H., Yu C.Y.,

Chung I.M. 2010. High-frequency direct shoot regeneration from Drymaria

cordata Willd. leaves. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 100: 209-217.

99. Giannopolitis C.N., Ries S.K. 1977. Superoxide dismutases I. Occurrence in

higher plants. Plant Physiol. 59: 309-314.

100. Gieczewska K. 2015. " Napędzane światłem"- od fotosyntezy do fotoogniwa.

Kosmos 64: 387-399.

101. Gill S.S., Hasanuzzaman M., Nahar K., Macovei A., Tuteja N. 2013. Importance

of nitric oxide in cadmium stress tolerance in crop plants. Plant Physiol. Bioch.

63: 254-261.

102. Gniazdowska A., Bogatek R. 2007. Regulacyjna rola tlenku azotu w

kiełkowaniu nasion. Post. Biol. Kom. 34: 431-443.

103. Gniazdowska A., Dobrzyńska U., Babańczyk T., Bogatek R. 2007. Breaking the

apple dormancy by nitric oxide involves the stimulation of ethylene production.

Planta 225: 1051-1057.

104. Gniazdowska A., Krasuska U., Bogatek R. 2010. Dormancy removal in apple

embryos by nitric oxide or cyanide involves modifications in ethylene

biosynthetic pathway. Planta 232: 1397-1407.

105. Gniazdowska A., Krasuska U., Czajkowska K., Wierzbicki M., Bogatek R.

2009. Tlenek azotu i hemoglobiny roślinne. Post. Biol. Kom. 36: 233-250.

106. Górecka K., Krzyżanowska D., Glapś T., Górecki R. 1997. Porównanie wzrostu

i owocowania roślin pomidora otrzymanych w kulturach tkanek i tradycyjnie z

siewu. W: Dubert F., Skoczowski A. (red.). Zastosowanie kultur in vitro w

fizjologii roślin. ZFR PAN, Kraków: 87-92.

209

107. Greenway M.B., Phillips I.C., Lloyd M.N., Hubstenberger J.F., Phillips G.C.

2012. A nutrient medium for diverse applications and tissue growth of plant

species in vitro. In Vitro Cell. Dev. Biol..-Plant 48: 403-410.

108. Gruszczyńska A., Rakoczy-Trojanowska M. 2007. Charakterystyka genów

ulegających ekspresji podczas somatycznej embriogenezy u roślin.

Biotechnologia 76: 96-106.

109. Grzegorzewska W., Jaworski K., Szmidt-Jaworska A. 2009. Rola tlenku azotu w

odpowiedzi roślin na stres abiotyczny. Post. Biol. Kom. 4: 663-678.

110. Guha S., Rao I. U. 2012. Nitric oxide promoted rhizome induction in

Cymbidium shoot buds under magnesium deficiency. Biol. Plant. 56: 227-236.

111. Gupta K.J., Fernie A.R., Kaiser W.M., vanDongen J.T. 2011. On the origins of

nitric oxide. Trends Plant Sci. 16: 160-168.

112. Gupta K.J., Igamberdiev A.U. 2015. Compartmentalization of reactive oxygen

species and nitric oxide production in plant cell: an overview. W: Gupta K.J.,

Igamberdiev A.U. (red.). Reactive oxygen and nitrogen species signaling and

communication in plants. Springer International Publishing, Seria Signaling and

Communication in Plants, Szwajcaria: 1-14.

113. Gupta S. D., Datta S. 2003. Antioxidant enzyme activities during in vitro

morphogenesis of gladiolus and the effect of application of antioxidants on plant

regeneration. Biol. Plant. 47: 179–183.

114. Han X., Yang H., Duan K., Zhang X., Zhao H., You S., Jiang Q. 2009. Sodium

nitroprusside promotes multiplication and regeneration of Malus hupehensis in

vitro plantlets. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 97: 175-185.

115. Haq I., Chang-Xing Z., Mukhtar Z., Jaleel C. A., Azooz M. M. 2009. Effect of

physical desiccation on plant regeneration efficiency in rice (Oryza sativa L.)

variety super basmati. J. Plant Physiol. 166: 1568-1575.

116. Hasia Ch., Korban S.S. 1996. Organogenesis and somatic embryogenesis in

callus cultures of Rosa hybrida and Rosa chinensis minima. Plant Cell, Tiss.

Org. Cult. 44: 1-6.

117. Hebelstrup K. H., Shah J. K., Igamberdiev A. U. 2013. The role of nitric oxide

and hemoglobin in plant development and morphogenesis. Physiol. Plant. 148:

457-469.

210

118. Heller K. 2007. Technologie uprawy i przerobu lnu i konopi w warunkach

zrównoważonego i wielofunkcyjnego rozwoju rolnictwa polskiego. Fragmenta

Agronomica 3: 181-186.

119. Heller K. 2012. Metodyka integrowanej ochrony roślin dla uprawy lnu

włóknistego. Dostępne na www.minrol.gov.pl dostęp 05.04.2017

120. Heller K., Wielgusz K. 2011. Plonowanie odmiany lnu oleistego Bukoz w

gospodarstwach ekologicznych i konwencjonalnych. J. Res. Appl. Agric. Engng.

56: 138-142.

121. Hernández I., Alegre L., Van Breusegem F., Munné-Bosch S. 2008. How

relevant are flavonoids as antioxidants in plants?. Trends Plant Sci. 14: 125-132.

122. Ho S.L., Chao Y.C., Tong W.F., Yu S.M. 2001. Sugar coordinately and

differentially regulates growth- and stress-related gene expression via a complex

signal transduction network and multiple control mechanisms. Plant Physiol.

125: 877-890.

123. Hopkins W.G., Hüner N.P.A. 2004. Introduction to plant physiology. John

Wiley&Sons, USA.

124. Hu X.Y., Neill S.J., Tang Z.C., Cai W.M. 2005. Nitric oxide mediates

gravitropic bending in soybean roots. Plant Physiol. 137: 663-670.

125. Hu Y. X., Bao F., Li J. Y. 2000. Promotive effect of brassinosteroids on cell

division involves a distinct CycD3-induction pathway in Arabidopsis. Plant J.

24: 693–701.

126. Igamberdiev A.U., Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Popov V.N. 2014.

Phytochrome–mediated regulation of plant respiration and photorespiration.

Plant Cell Environ. 37: 290–299.

127. Jain R. K., Jain S., Wu R. 1996. Stimulatory effect of water stress on plant

regeneration in aromatic Indica rice varieties. Plant Cell Rep. 15: 449–454.

128. Jaiswal S., Sawhney S. 2006. Modulation of TDZ-induced morphogenetic

responses by anti-auxin TIBA in bud-bearing foliar explants of Kalanchoë

pinnata. Plant Cell, Tiss. Organ Cult. 86: 69-76.

129. Jana S., Shekhawat G.S. 2012. In vitro regeneration of Anethum graveolens,

anioxidative enzymes during organogenesis and RAPD analysis for clonal

fidelity. Biol. Plant. 56: 9-14.

211

130. Janas K.M, Dzięgielewski M., Szafrańska K., Posmyk M. 2010. Karrikiny -

nowe regulatory kiełkowania nasion i wzrostu roślin. Kosmos 59: 581-587.

131. Janeczko A. 2005. Brasinosteroidy w rolnictwie, ogrodnictwie i kulturach in

vitro. Kosmos 54: 2005.

132. Janowicz J., Wojciechowski A. 2009. Ocena zdolności regeneracyjnych dwóch

odmian lnu (Linum usitatissimum L.) w kulturach in vitro. Rośliny Oleiste 30:

35-49.

133. Jasiński M., Mazurkiewicz E., Rodziewicz P., Figlerowicz M. 2009.

Flawonoidy- budowa, właściwości i funkcja ze szczególnym uwzględnieniem

roślin motylkowych. Biotechnologia 2: 81-94.

134. Jaspers P., Kangasjarvi J. 2010. Reactive oxygen species in abiotic stress

signaling. Physiol. Plant. 138: 405-413.

135. Kacperska A. 2012. Reakcje roślin na stresowe czynniki środowiska. W:

Kopcewicz J., Lewak S. (red.). Fizjologia roślin. PWN. Warszawa: 634-708.

136. Kalra C., Babbar S. B. 2010. Nitric oxide promotes in vitro organogenesis in

Linum usitatissimum L. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 103: 353-359.

137. Kalra C., Babbar S. B. 2012. Stimulatory and period-specific effect of nitric

oxide on in vitro caulogenesis in Albizzia lebbeck (L.) Benth. Acta Physiol.

Plant. 34: 387-392.

138. Keller M.M., Jaillais Y., Pedmale U.V., Moreno J.E., Chory J., Ballaré C.L.

2011. Cryptochrome 1 and phytochrome B control shade–avoidance responses

in Arabidopsis via partially independent hormonal cascades. Plant Journal 67:

195–207.

139. Kępczyńska E. 2006. Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków in vitro.

Biotechnologia 4: 78-94.

140. Khan H., Siddique I., Anis M. 2006. Thidiazuron induced somatic

embryogenesis and plant regeneration in Capsicum annuum. Biol. Plant. 50:

789-792.

141. Khanna H. K., Daggard G. E. 2001. Enhanced of shoot regeneration in nine

Australian wheat cultivars by spermidine and water streatments. Australian J.

Plant Physiol. 28: 1243–1247.

212

142. Kim Y.S., Hahn E.J., Murphy H.N., Paek K.Y. 2004. Adventitious root growth

and ginsenoside accumulation in Panax ginseng cultures as affected by methyl

jasmonate. Biotechnol. Lett. 26: 1619-1622.

143. Koch K. E. 1996. Carbohydrate modulated gene expression in plants. Annu.

Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 509-540.

144. Kong S.-G., Okajima K. 2016. Diverse photoreceptors and light responses in

plants. J. Plant Res. 129: 111-114.

145. Konieczny R., Banaś A., Surówka E., Michalec Ż., Miszalski Z., Libik-

Konieczny M. 2014. Pattern of antioxidant enzyme activites and hydrogen

peroxide kontent during developmental stages of rhizogenesis from hypocotyls

explants of Mesembryanthemum crystallinum L.. Plant Cell Rep. 33: 165-177.

146. Kopcewicz J. 2012. Wzrost i rozwój roślin. W: Kopcewicz J., Lewak S. (red.).

Fizjologia roślin. PWN, Warszawa: 539-575.

147. Korach A., Juliani H.R., Kapteyn J., Simon J.E. 2002. In vitro regeneration of

Echinacea purpurea from leaf explants. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 69: 79-83.

148. Kowalewska E., Litwinienko G. 2010. Fenolowe antyoksydanty interwentywne-

aktywność i mechanizmy działania. Post. Bioch. 56: 274-283

149. Kozłowska-Szerenos B., Ciereszko I. 2013. Udział askorbinianu w odpowiedzi

roślin na niekorzystne czynniki środowiska. W: I. Ciereszko i A. Bajguz (red.).

Różnorodność biologiczna - od komórki do ekosystemu. Rośliny i grzyby w

zmieniających się warunkach środowiska, Białystok, Pol. Tow. Botaniczne: 69-

82.

150. Krasuska U., Ciacka K., Orzechowski S., Fettke J., Bogatek R., Gniazdowska A.

2016. Modification of the endogenous NO level influences apple embryos

dormancy by alterations of nitrated and biotinylated protein patterns. Planta 244:

877-891.

151. Kreslavski V. D., Los D. A., Allakhverdiev S. I., Kuznetov Vl. V. 2012.

Signailng role of reactive oxygen species in plants under stress. Russ. J. Plant

Physiol. 59: 141-154.

152. Krishna P. 2003. Brassinosteroid-mediated stress responses. J. Plant. Growth

Regul. 22: 289-297.

153. Kubo A., Aono M., Nakajima N., Saji H., tanaka K., Kondo N. 1999.

Differential responses in activity of antioxidant enzymes of different

environmental stresses in Arabidopsis thaliana. J. Plant Res. 112: 279-290.

213

154. Kulus D. 2013. Embriogeneza somatyczna in vitro. W: Kuczera M. (red.). Nowe

trendy w naukach przyrodniczych 4. CreativeTime, Kraków: 45-53.

155. Leshem Y. Y., Haramaty E. 1996. The characterization and contrasting effects

of the nitric oxide free radical in vegetative stress and senescence of Pisum

sativum Linn. foliage. J. Plant Physiol. 148: 258-263.

156. Libik –Konieczny M., Konieczny R., Surówka E., Ślesak I., Michalec Ż.,

Rozpądek P., Miszalski Z. 2012. Pathways of ROS homeostasis regulation in

Mesembryanthemum crystallinum L. calli exhibiting differences in rhizogenesis.

Plant Cell, Tiss Org. Cult. 110: 123-131.

157. Libik M., Konieczny R., Pater B., Ślesak I., Miszalski Z. 2005. Differences in

the activities of some antioxidant enzymes and in H2O2 content during

rhizogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of the ice plant. Plant

Cell Rep. 23: 834–841.

158. Lin C. 2000. Plant blue–light receptors. Trends Plant Sci. 5: 337–342.

159. Liu X., Deng Z., Cheng H., He X., Song S. 2011. Nitrite, sodium nitroprusside,

potassium ferricyanide and hydrogen peroxide release dormancy of Amaranthus

retroflexus seeds in a nitric oxide-dependent manner. Plant Growth Regul. 64:

155-161.

160. Ljung K., Nemhauser J.L., Perata P. 2015. New mechanistic links between sugar

and hormone signalling networks. Curr. Opin. Plant Biol. 25: 130-137.

161. Luesse D. R., DeBlasio S. L., Hangarter R. P. 2010. Integration of phot1, phot2,

and PhyB signalling in light–induced chloroplast movements. J. Exp. Bot. 61:

4387–4397.

162. Luo Z.B., Janz D., Jiang X., Göbel C., Wildhagen H., Tan Y., Rennenberg H.,

Feussner I., Polle A. 2009. Upgrading root physiology for stress tolerance by

ectomycorrhizas: Insights from metabolite and transcriptional profiling into

reprogramming for stress anticipation. Plant Physiol. 151: 1902-1917.

163. Maciejewska B., Kopcewicz J. 2002. Inhibitory effect of methyl jasmonate on

flowering and elongation growth in Pharbitis nil. J. Plant Growth Regul. 21:

216-223.

164. Magioli C., roch A.P.M., De Oliveira D.E., Mansur E. 1998. Efficient shoot

organogenesis of eggplant (Solanum melongena L.) induced by thidiazuron.

Plant Cell Rep. 17: 661-663.

214

165. Makkar H.P.S., Blummel M., Becker K. 1995. Formation of complexes between

polyvinylpyrrolidones or polyethylene glycols and tannins, and their implication

in gas production and true digestibility in in vitro techniques. British Journal of

Nutrition 73: 897-913.

166. Małecka A., Tomaszewska B. 2005. Reaktywne formy tlenu w komórkach

roślinnych i enzymatyczne systemy obronne. Post. Biol. Kom. 32: 311-325.

167. Martínez-Bonfil B.P., Cruz-Hernández A.C., López-Laredo A.R., Trejo-Tapia

G., Trejo-Espino J.L.2014. Effects of culture medium and auxins on growth of

adventitious root cultures of Cuphea aeguipetala Cav. and their ability to

produce antioxidant compounds. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 118: 401-408.

168. Martín-Urdíroz N., Garrido-Gala J., Martin J., Barandiaran X. 2004. Effect

of light on the organogenic ability of garlic using a one-step in vitro system.

Plant Cell Rep. 22: 721-724.

169. Marzec M., Kuczynska E.U. 2014. Importance symplasmic communications in

cell differentiation. Plant Signal Behav. 9: e27931.

170. Marzec M., Kurczyńska E. U. 2008. Rola komunikacji-izolacji symplastowej w

różnicowaniu komórek na wybranych przykładach. Post. Biol. Kom. 35: 369-

389.

171. Marzec M., Muszyńska A. 2012. Strigolaktony-nowi kandydaci na hormony

roślinne. Post. Biol. Kom. 39: 63 – 86.

172. Mazorra L.M. Nunez M., Hechavarria M., Coll F., Schanchez-Blanco M.J. 2002.

Influence of brassinosteroids on antioxidant enzymes activity in tomato under

different temperatures. Biol. Plantarum 45: 593-596.

173. Meeussen J.L., Keizer M.G., van Riemsdijk W.H. 1992. Dissolution behavior od

ion cyanide (Prussian blue) in contaminated soils. Environmental Science and

Toxicology 26: 1832-1838.

174. Meratan A.A., Ghaffari S.M., Niknam V. 2009. In vitro organogenesis and

antioxidant enzymes anctivity in Acanthophyllum sordidum. Biol. Plantarum 53:

5-10.

175. Mikuła A., Pożoga M., Tomiczak K., Rybczyński J. J. 2015. Somatic

embryogenesis in ferns: a new experimental system. Plant Cell Rep. 34: 783-

794.

215

176. Mikuła A., Skierski J., Rybczyński J. J. 2002. Somatic embryogenesis of

Gentiana genus III. Characterization of three-year-old embryogenic suspensions

of G. pannonica originated from various seedling explants. Acta Physiol. Plant.

24: 311-322.

177. Mikuła A., Wesołowska M., Kapusta J., Skrzypczak L., Rybczyński J. J. 1996.

Cytomorphological studies on somatic embryogenesis of Gentiana tibetica

(King) and G. cruciata (L.). Acta Soc. Bot. Pol. 65: 47-51.

178. Mikuła A., Wilbik W., Rybczyński J.J. 1997. Wpływ regulatorów wzrostu na

somatyczną embriogenezę Gentiana sp. w kulturach in vitro. W: Dubert F.,

Skoczowski A. (red.). Zastosowanie kultur in vitro w fizjologii roślin. ZFR

PAN, Kraków: 141-154.

179. Millam S., Davidson D., Powell W. 1992. The use of flax (Linum usitatissimum)

as a model system for studies on organogenesis in vitro: the effect of different

carbohydrates. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 28: 163-166.

180. Millam S., Obert B., Preťová A. 2005. Plant cell and biotechnology studies in

Linum usitatissimum – a review. Plant Cell, Tiss Org Cult. 82: 93-103.

181. Mitrović A., Bogdanović J. 2008. Activities of antioxidative enzymes during

Chenopodium rubrum L. ontogenesis in vitro. Arch. Biol. Sci. 60: 223-231.

182. Mitrović A., Janošević D., Budimir S., Bogdanović Pristov J. 2012. Changes in

antioxidative enzymes activities during Tacitus bellus direct shoot

organogenesis. Biol. Plantarum 56: 357-361.

183. Mohr H., Schofer P. 1995. Plant physiology. Springer-Verlag Berlin Heidelrberg

184. Molassiotis A.N., Dimassi K., Diamantidis G., Therios I. 2004. Changes in

peroxidases and catalase activity during in vitro rooting. Biol. Plant. 48: 1-5.

185. Morkunas I., Borek S., Formela M., Ratajczak L. 2012. Plant responses to sugar

starvation. W: Chang C.-F. (red.), Carbohydrates – comprehensive studies on

glycobiology and glycotechnology. InTech 409-438.

186. Mundhara R., Rashid A. 2001. Regeneration of shoot-buds on hypocotyl of

Linum seedlings: a stress related response. Plant Sci. 161: 19–25.

187. Mundhara R., Rashid A. 2006. TDZ-induced triple-response and shoot

formation on intact seedlings of Linum, putative role of ethylene in regeneration.

Plant Sci. 170: 185–190.

188. Munné-Bosch S., Alegre L. 2002. The function of tocopherols and tocotrienols

in plants. Crit. Rev. Plant Sci. 21: 31-57.

216

189. Mur L. A. J., Mandon J., Presijn S., Cristescu S. M., Moshkov I. E., Novikova

G. V., Hall M. A., Harren F. J. M., Hebelstrup K. H., Gupta K. J. 2013. Nitric

oxide in plants: an assessment of the current state of knowledge. AoB Plants,

doi. 10.1093/aobpla/pls052.

190. Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-

assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

191. Nas M.N., Bolek Y., Sevgin N. 2010. The effects of ex plant and cytokinin type

on regeneration of Prunus microcarpa. Sci. Hort. 126: 88-94

192. Neill S. J., Desikan R., Hancock J. T. 2003. Nitric oxide signaling in plants.

New Phytol. 159: 11-35.

193. Neto V.B.P., Otoni W.C. 2003. Carbon sources and their osmotic potential in

plant tissue culture: does it matter? Sci. Hort. 97: 193-202.

194. Niedźwiedź-Siegień I. 1998. Cyanogenic glucosides in Linum usitatissimum.

Phytochemistry 49: 59–63.

195. Nisar A., Hina F., Bilal H. A., Muhammad R., Tariq M., Nighat F. 2010.

Efficient regeneration and antioxidant potential in regenerated tissues of Piper

nigrum L. Plant Cell ,Tiss. Org. Cult. 102: 129-134.

196. Nowicka B., Kruk J. 2013. Reaktywne formy tlenu w roślinach – więcej niż

trucizna. Kosmos 62: 583-596.

197. Nunez M., Siqueira W. J., Hernandez M., Zullo M. A. T., Robaina C., Coli F.

2004. Effect of spirostane analogues of brassinosteroids on callus formation and

plant regeneration in lettuce (Lactuca sativa). Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 78: 97–

99.

198. O’Donell V.B., Chumley P.H., Hogg P.H., Blooodsworth A., Darley-Usmar

V.M., Freeman B.A. 1997. Nitric oxide inhibition of lipid peroxidation: kinetic

of reaction with lipid peroxyl radicals and comparsion with alpha-tocopherol.

Biochemistry 36: 15216-15223.

199. Obert B., Bensosn E. E., Millam S., Pret'ova A., Bremner D. H. 2005.

Moderation of morphogenetic and oxidative stress responses in flax in vitro

cultures by hydroxynonenal and desferrioxamine. J. Plant Physiol. 162: 537–

547.

217

200. Olchowik-Grabarek E., Mavlyanov S., Abdullajanova N., Gieniusz R.,

Zamaraeva M. 2016. Specificity of hydrolysable tannins from Rhus typhina L. to

oxidants in cell and cell-free models. Appl. Biochem. Biotechnol. DOI

10.1007/s12010-016-2226-1.

201. Oomah B. D., Mazza G., Kenaschuk E. O. 1992. Cyanogenic compounds in

flaxseed. J Agric Food Chem. 40: 1346 – 1348.

202. Oracz K., El-Maarouf Bouteau H., Kranner I., Bogatek R., Corbineau F., Bailly

C. 2009. The mechanisms involved in seed dormancy alleviation by hydrogen

cyanide unravel the role of reactive oxygen species as key factors of cellular

signaling during germination. Plant Physiol. 150: 494-505.

203. Orlikowska T. 1997. Regulatory roślinne w kulturach in vitro. W: Jankiewicz

L.S. (red.). Regulatory wzrostu i rozwoju roślin. Zastosowanie w ogrodnictwie,

rolnictwie, leśnictwie i w kulturach tkanek. Tom II. Wydawnictwo Naukowe

PWN. Warszawa: 219-233

204. Ostaszewska-Bugajska M., Podgórska A., Rychter A. M., Szal B. 2015.

Roślinny mitochondrialny łańcuch oddechowy. Kosmos 64: 401-414.

205. Pagnussat G. C., Lanteri M. L., Lamattina L. 2003. Nitric oxide and cyclic GMP

are messengers in the indole acetic acid-induced adventitious rooting process.

Plant Physiol. 132: 1241–1248.

206. Pagnussat G.C., Simontacchi M., Puntarulo S., Lamattina L. 2002. Nitric oxide

is required for root organogenesis. Plant Physiol. 129: 954-956.

207. Pak H., Guo Y., Chen M., Chen K., Li Y., Hua S., Shamsi I., Meng H., Shi C.,

Jiang L. 2009. The effect of exogenous methyl jamonate on the flowering time,

floral organ morphology, and transcript levels of a group of genes implicated in

the development of oilseed rape flowers (Brassica napus L.). Planta 231: 79-91.

208. Palacio L., Cantero J.J., Cusidó R.M., Goloniowski M.E. 2012. Phenolic

compound production in relations to differentiation in cell and tissue cultures of

Larrea divaricata (Cav.). Plant Sci. 193-194: 1-7.

209. Papadakis A. K., Siminis C. I., Roubelakis-Angelakis K. A. 2001. Reduced

activity of antioxidant machinery is correlated with suppression of totipotency in

plant protoplasts. Plant Physiol. 126: 434-444.

210. Paques M. 1991. Vitrification and micropropagation: causes, remedies and

prospects. Acta Hort. 289: 283-290.

218

211. Park Y.S., Barrett J.D., Bonga J.M. 1998. Application of somatic embryogenesis

in high-value clonal forestry:deployment, genetic control, and stability of

cryopreserved clones. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 34: 231-329.

212. Pazurkiewicz-Kocot K., Kita A., Krzykawska A. 2009. Oddziaływanie

molibdenu na zawartość barwników chlorofilowych w liściach siewek Zea mays

L. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych 534: 207-215.

213. Piątczak E., Grzegorczyk- Karolak I., Wysokińska H. 2014. Micropropagation

of Rehmannia glutinosa Libosch.: production of phenolics and flavonoids and

evaluation of antioxidant activity. Acta Physiol. Plant. 36: 1693-1702.

214. Pilarska, M., Skowron, E., Niewiadomska, E. 2015. Cytokininy a fotosynteza.

Postępy Biochemii 61: 61-68.

215. Polit J.T, Ciereszko I. 2009. In situ activities of hexokinase and fructokinase in

relation to phosphorylation status of root meristem cells of Vicia faba during

reactivation from sugar starvation. Physiol. Plant. 135: 342-350.

216. Popis E., Ratusz K., Przybysz M., Krygiel K., Sakowska A., Konarska M. 2015.

Światowa oraz polska produkcja lnu oleistego i oleju lnianego. Zeszyty

Problemowe Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie,

Problemy Rolnictwa Światowego 15: 106-116.

217. Puijalon S., Piola F., Bornette G. 2008. Abiotic stresses increase plant

regeneration ability. Evol. Ecol. 22: 493–506.

218. Pullman G. S, Zhang Y., Phan B. H. 2003. Brassinolide improves embryogenic

tissue initiation in conifers and rice. Plant Cell Rep. 22: 96–104.

219. Qiao W., Li C., Fan L. 2014. Cross-talk between nitric oxide and hydrogen

peroxide in plant responses to abiotic stresses. Environ. Exp. Bot. 100: 84-93.

220. Qiusheng Z., Bao J., Likun L., Xianhua X. 2005. Effects of antioxidants on the

plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea)

explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tiss Org. Cult. 81: 83-90.

221. Ramage C.M., Williams R.R. 2002. Mineral nutrition and plant morphogenesis.

In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant 38: 116-124.

222. Ravnikar M., Žel J., Plaper I., Špacapan A. 1993. Jasmonic acid stimulates shoot

and bulb formation of garlic in vitro. J. Plant Growth Regul. 12: 73-77.

223. Reuveni M., Evenor D. 2007. On the effect of light on shoot regeneration in

petunia. Plant Cel,l Tiss. Org. Cult. 89: 49-54.

219

224. Rey H.Y., Mroginski L.A. 1996. Regeneration of plants from callus tissue of

Aeschynomene spp. (Leguminosae). Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 45: 185-190.

225. Rico-Lemus M., Rodriguez-Garay B. 2014. SNP as an effective donor of nitric

oxide for in vitro plant cell and tissue culture. J. Plant Biochem. Physiol. 2:

e127.

226. Rival A., Beule T., Lavergne D., Nato A., Havaux M., Puard M. 1997.

Developmant of photosynthetic characteristics in oil palm during in vitro

micropropagation. J. Plant Physiol. 150: 520-527.

227. Ružić Dj.V., Vujović T.I. 2008. The effects of cytokinin types and their

concentration on in vitro multiplication of sweet cherry cv. Lapins (Prunus

avium L.). Horticultural Science (Prague) 35: 12-21

228. Ryan K.G., Swinny E.E., Markham K.R., Winefield C. 2002. Flavonoid gene

expression and UV photoprotection in transgenic and mutant Petunia leaves.

Phytochemistry 59: 23-32.

229. Rybczyński J. J., Borkowska B., Fiuk A., Gawrońska H., Śliwińska E., Mikuła

A. 2007. Effect of sucrose concentration on photosynthetic activity of in vitro

cultures Gentiana kurroo (Royle) germlings. Acta Physiol. Plant. 29: 445-453.

230. Sakamoto A., Murata N. 2002. The role of glycine betaine in the protection of

plants from stress: clues from transgenic plants. Plant Cell Environ. 25: 163-171.

231. Sanikhani M., Frello S., Serek., M. 2006. TDZ induces shoot regeneration in

various Kalanchoe blossfeldiana Poelln. cutivars in the absence of auxin. Plant

Cell, Tiss.Org. Cult. 85: 75-82.

232. Santos I., Salema R.2000. Promotion by jasmonic acid bulb formation in shoot

cultures of Narcissus triandrus. J. Plant Growth Regul. 30: 133-138.

233. Sasaki H. 2002. Brassinolide promotes adventitious shoot regeneration from

cauliflower hypocotyl segments. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 71: 111–116.

234. Scandalios J.G. 2005. Oxidative stress: molecular perception and transduction of

signals triggering antioxidant gene defenses. Braz. J. Med. Biol. Res. 38: 995-

1014.

235. Serret M.D., Trillas M.I., Araus J.L. 2001. The effect of in vitro culture

conditions on the pattern of photoinhibition during acclimation of gardenia

plantlets to ex vitro conditions. Photosynthetica 39: 67-73.

220

236. Sha Valli Khan P.S., Hausman J.F., Rao K.R. 1999. In vitro morphogenesis and

plantlet regeneration from seeds of Syzygium alternifolium. Biol. Plantarum 42:

177-184.

237. Sharma P., Jha A. B., Dubey R. S., Pessarakli M. 2012. Reactive oxygen

species, oxidative damage, and antioxidative defense mechanism in plants under

stressful conditions. J. Bot. 1–26.

238. Shen Q., Wang Y. T., Tian H., Guo F. Q. 2013. Nitric oxide-mediates cytokinin

functions in cell proliferation and meristem maintenance in Arabidopsis. Mol.

Plant. 6: 1214-1225.

239. Shilpa K., Selavakkumar C., Senthil A. K., Lakshmi B.S. 2010. In vitro root

culture of Ocimum sanctum L. and evaluation of its free radical scavenging

activity. Plant Cell, Tiss Org. Cult. 101: 105-109.

240. Shimasaki K., Wang T., Nishimura Y., Huyen N.T., Neera S., Hsiung T., Huang

C. 2010. Effect of chitosan and jasmonic acid related compounds on shoot

formation from rhizome cultures of an oriental Cymbidium species. Acta Hortic.

829: 399-402.

241. Siegień I. 2007. Cyjanogeneza u roślin i jej efektywność w ochronie roślin przed

atakiem roślinożerców i patogenów. Kosmos 56: 155 - 166.

242. Siegień I., Adamczuk A., Wróblewska K. 2013. Light affects in vitro

organogenesis of Linum usitatissimum L. and its cyjanogenic potential. Acta

Physiol. Plant. 35: 781-789.

243. Siegień I., Bogatek R. 2006. Cyanide action in plants – from toxic to regulatory.

Acta Physiol. Plant. 28: 483-497.

244. Silska G., Kozak J., Rajewicz M., Mańkowska G. 2014. Charakterystyka

morfologiczna genotypów lnu (Linum usitatissimum L.) pochodzących z Polski.

Polish J. Agron. 17: 38-47.

245. Simontacchi M., Garcia-Mata C., Bartoli C. G., Santa-Maria G. E., Lamattina L.

2013. Nitric oxide as a key component in hormone-regulated processes. Plant

Cell Rep. 32: 853-866.

246. Singh D., Verma K.1995. Response of the wild-type and high light-tolerant

mutant of Anacystis nidulans against photooxidative damage: differential

mechanism of high light tolerance. Photochem. Photobiol. 62: 314-319.

247. Sińska I. 1986. Poliaminy jako regulatory wzrostu i rozwoju roślin. Wiadomości

Botaniczne 30: 9-24.

221

248. Skoog F., Miller C.O. 1957. Chemical regulation of growth and organ formation

in plant tissue cultures in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 11: 118-131.

249. Skrzypek E. 2012. Rola związków fenolowych i enzymów antyoksydacyjnych w

regeneracji in vitro wybranych gatunków roślin bobowatych (Fabaceae L.). IFR

PAN, Kraków.

250. Ślesak I., Libik M., Karpinska B., Karpinski S., Miszalski Z. 2007. The role of

hydrogen peroxide in regulation of plant metabolism and cellular signaling in

response to environmental stresses. Acta Bioch. Pol. 54: 39-50.

251. Sokołowska K. 2005. Regulacja łączności symplastowej w procesach wzrostu i

rozwoju roślin. Post. Biol. Kom. 35: 603-616.

252. Soler-Cantero A., Jové M., Cacabelos D., Boada J., Naudí A., Romero M.P.,

Cassanyé A., Serrano J.C.E., Arola L., Valls J., Bellmunt M.J., Prat J., Pamplona

R., Portero-Otin M., Motilva J.S. 2012. Plant-Derived Phenolics Inhibit the

Accrual of Structurally Characterised Protein and Lipid Oxidative

Modifications. PLoS ONE 7(8): e43308

253. Song L., Ding W., Shen J., Zhang Z., Bi Y., Zhang L. 2008. Nitric oxide

modulates abscisic acid induced thermotolerance in the calluses from two

ecotypes of reed under heat stress. Plant Sci. 175: 826-832.

254. Staikidou I., Watson S., Harvey B.M.R., Selby C. 2005. Narcissus bulblet

formation in vitro: effect of carbohydrate type and osmolarity of the culture

medium. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 80: 313-320.

255. Starck Z. 2008. Funkcja tkanek przewodzących: zaopatrzenie w substancje

pokarmowe i udział w koordynacji procesów w roślinach. Kosmos 57: 67-83.

256. Starck Z. 2014. Fizjologia roślin: jak było wczoraj, jak jest dziś, a co przyniesie

jutro?. Kosmos 4: 569-589.

257. Stefaniak B. 2004. Roślinne kultury in vitro. W: Woźny A., Przybył K. (red).

Regulatory wzrostu i rozwoju roślin cz.2. Wydawnictwo Naukowe UAM,

Poznań: 13-91.

258. Stöhr C., Strube F., Marx G., Ullrich W.R., Rockel P. 2001. A plasma

membrane-bound enzyme of tobacco roots catalyses the formation of nitric

oxide from nitrite. Planta 212: 835-841.

259. Strzałka K. 2012. Fotosynteza i chemosynteza. W: Kopcewicz J., Lewak S.

(red.). Fizjologia roślin. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa: 274 -444.

222

260. Su Y.H., Liu Y.B., Zhang X.S. 2011. Auxin–cytokinin interaction regulates

meristem development. Mol. Plant 4: 616–625.

261. Sulkiewicz M., Ciereszko I. 2016. Fluorescencja chlorofilu a – historia odkrycia

i zastosowanie w badaniach roślin. Kosmos 65: 103–115.

262. Szabó I., Bergantino E., Giacometti G.M. 2005. Light and oxygenic

photosynthesis: energy dissipation as a protection, mechanism against photo-

oxidation. EMBO Reports 6: 629–634.

263. Szczygieł K. 2005. Somatyczna embriogeneza - alternatywny sposób uzyskania

wyselekcjonowanego materiału sadzeniowego gatunków drzew iglastych. Leśne

Prace Badawcze 3: 71-92.

264. Szechyńska-Hebda M., Skrzypek E., Dąbrowska G., Biesaga-Kościelniak J.,

Filek M., Wędzony M. 2007. The role of oxidative stress induced by growth

regulators in the regeneration process of wheat. Acta Physiol. Plant. 29: 327–

337.

265. Szechyńska-Hebda M., Skrzypek E., Dąbrowska G., Wędzony M., van

Lammeren A. 2012. The effect of endogenous hydrogen peroxide induced by

cold treatment in the improvement of tissue regeneration efficiency. Acta

Physiol. Plant. 34: 547-560.

266. Szopa J., Kostyń K. 2006. Kultury komórkowe i rośliny transgeniczne w

biotechnologii. Biotechnologia 4: 7-17.

267. Szweykowska A. 1968. Postępy badań nad cytokininami. Post. Bioch. 14: 193-

200.

268. Taiz L., Zeiger E. 2006. Plant Physiology. 4th. Sinauer Associate, Sunderland,

Mass., EUA.

269. Takáč T., Obert B., Rolčík J., Šamaj J. Improvement of adventitious root

formation in flax using hydrogen peroxide. New Biotechnology 33: 728-734.

270. Tan B.C., Chin C.F., Alderson P. Effects of sodium nitroprusside on shoot

multiplication and regeneration of Vanilla planifolia Andrews. In Vitro Cell.

Dev. Biol.-Plant 49: 626-630.

271. Tanaka H., Dhonukshe P., Brewer P. B., Friml L. 2006. Spatiotemporal

asymmetric auxin distribution: a means to coordinate plant development. Cell

Mol. Life Sci. 63: 2738-2754.

272. Tavares F., Abreu I., Salema R. 1998. Regeneration of the actinorhizal plant

Myrica gale L. from epicotyl explants. Plant Sci. 135: 203-210.

223

273. Tian M., Gu Q., Zhu M. 2003. The involvement of hydrogen peroxide and

antioxidant enzymes in the process of shoot organogenesis of strawberry callus.

Plant Sci. 165: 701-707.

274. Tilkat E., Onay A. 2009. Direct shoot organogenesis from in vitro-derived

mature leaf explants of pistachio. In Vitro. Cell. Dev. Biol. Plant 45: 92-98.

275. Tremblay L., Tremblay F.M. 1995. Maturation of black spruce somatic

embryos: sucrose hydrolysis and resulting osmotic pressure of the medium.

Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 42: 39-46.

276. Tretyn A. 2012. Mechanizmy wzrostu i rozwoju roślin. W: Kopcewicz J.,

Lewak S. (red.). Fizjologia roślin. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa:

474-502.

277. Tun N. N., Holk A., Scherer F. E. 2001. Rapid increase of NO in plant cell

cultures induced by cytokinin. FEBS Letters 509: 174-176.

278. Unda F., Kalynyak P., Riseman A. 2007. Organogenesis plant regeneration from

leaf explants of Exacum Styer Group. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 89: 105-111.

279. Van Den Dool H., Kratz P.D. 1963. A generalization of the retention index

system including linear temperature programmed gas—liquid partition

chromatography. J. Chromatogr. A 11: 463-471.

280. Van den Ende W. 2014. Sugars take a central position in plant growth,

development and, stress responses. A focus on apical dominance. Front. Plant

Sci. 5: 313.

281. Van Dingenen J., De Milde L., Vermeersch M., Maleux K., De Rycke R., De

Bruyne M., Storme V., Gonzalez N., Dhondt S., Inzé D. 2016. Chloroplasts are

central players in sugar-induced leaf growth. Plant Physiol. 171: 590-605.

282. Vatankhah E., Niknam V., Ebrahimzadeh H. 2010. Activity of enzyme during in

vitro organogenesis in Crocus sativus. Biol. Plantarum 54: 509-514.

283. Velikova V.,Yordanov I., Endreva A. 2000. Oxidative stress and some

antioxidant system in acid rain treated bean plants: protective role of exogenous

polyamines. Plant Sci. 151: 59-66.

284. Verdeil J.L., Hocher V., Huert C., Grosdemange F., Escoute J., Ferrieáre N.,

Nicole M. 2001. Ultrastructural changes in coconut calli associated with the

acquisition of embryogenic competence. Ann. Bot. 88: 9-18.

224

285. Verdus M. C., Thellier M., Ripoll C. 1997. Storage of environmental signals in

flax. Their morphogenetic effect as enabled by a transient depletion of calcium.

Plant J. 12: 1399-1410.

286. Wandehene D., Pugin A., Klessig D., Durner J. 2001. Nitric oxide: comparative

synthesis and signaling in animal and plant cells. Trends Plant Sci. 6: 177-183.

287. Wang L., Ruan Y.-L. 2013. Regulation of cell division and expansion by sugar

and auxin signaling. Front. Plant Sci. 4: 163.

288. Wang P.G., Xian M., Tang X., Wu X., Wen Z., Cai T., Janczuk J. A. 2002.

Nitric oxide donors: chemical activities and biological applications. Chemical

Reviews 102: 1091-1134.

289. Warening P.F., Philips I.D.J. 1985. Growth and differentiation in plants.

Pergamon Press, Oxford.

290. Wasąg P., Kowalczyk S. 2009. Wewnątrzkomórkowe i błonowe receptory

kwasu abscysynowego. Post. Biol. Kom. 36: 3-22.

291. Wellburn A. R. 1994. The spectra determination of chlorophylis a and b and

total carotenoids rusing various solvents with spectrophotometers of different

resolution. J. Plant Physiol. 144: 307-313.

292. Were B.A., Gudu S., Onkware A.O., Carlsson A.S., Welander M. 2006. In vitro

regeneration of sesame (Sesamum indicum L.) from seedling cotyledon and

hypocotyls explants. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 85: 235-239.

293. Werner T., Schmülling T. 2009. Cytokinin action in plant development. Curr.

Opin. Plant Biol. 12: 527-538.

294. Weryszko-Chmielewska E., Kozak D. 2002. Anatomical changes in Gloriosa

rothschildiana ‘O’Brien’ stems induced by JA-Me and ABA. Acta Hortic. 570:

433-436.

295. Wiktorowska E., Długosz M., Janiszowska W. 2010. Significant enhancement of

oleanolic acid accumulation by biotic elicitors in cell suspension cultures of

Calendula officinalis L. Enzyme Microb. Tech. 46: 14-20.

296. Wilmowicz E., Kućko A., Sidłowska M., Frankowski K., Maciejewska B.,

Glazińska P., Kopcewicz J. 2012. Rola jasmonianów w regulacji rozwoju

generatywnego. Kosmos 61: 603-612.

225

297. Wiśniewska J., Pietrzykowska M., Szyndel B., Tretyn A. 2009. Lokalizacja

gradientu auksyny oraz rozmieszczenie białek PIN w proliferującym i

różnicującym się transgenicznym kalusie Arabidopsis thaliana. Zeszyty

Problemowe Postępów Nauk Rolniczych 534: 297-305.

298. Wiśniewska J., Xu J., Seifertová D., Brewer P.B., Rûžčka K., Blilou I., Rouquie

D., Benková E., Scheres B., Friml J. 2006. Polar PIN localization directs auxin

flow in plants. Science 312: 883.

299. Wróbel-Marek J., Kulińska-Łukaszek K., Kurczyńska E. U. 2015. Komunikacja

symplastowa i jej rola w rozwoju roślin. Post. Biol. Kom. 42: 573–594.

300. Wu H.C., du Toit E.S., Reinhardt C.F., Rimando A.M., van der Kooy F., Meyer

J.J.M. 2007. The phenolic, 3,4-dihydroxybenzoic acid, is an endogenous

regulator of rooting in Protea cynaroides. Plant Growth Reg. 52: 207-215.

301. Xiong L., Schumaker K. S., Zhu J. K. 2002. Cell signaling during cold, drought,

and salt stress. Plant Cell 14: S165-S183.

302. Xu J., Yin H., Wang W., Mi Q., Liu X. 2009. Effects of sodium nitroprusside on

callus induction and shoot regeneration in micropropagated Dioscorea opposita.

Plant Growth Regul. 59: 279-285.

303. Yu J. Q., Huang L.F., Hu W., Zhou Y. H., Mao W. H., Ye S. F., Nogues S.

2004. A role of brassinosteroids in the regulation of photosynthesis in Cucumis

sativus. J Exp. Bot. 55: 1135-1143.

304. Yu M., Lamattina L., Spoel S.H., Loake G.J. 2014. Nitric oxide function in plant

biology: a redox cue in deconvolution. New Physiol. 202: 1142-1156.

305. Zagrobelny S., Bak S., Rasmussen V., Jorgrnsen B., Naumann C.M, Moller

B.L.2004. Cyanogenic glucosides and plant – insect interactions. Pytochem. 65:

293-306.

306. Zając T., Oleksy A., Klimek-Kopyra A., Kulig B. 2012. Biological determinants

of plant and crop productivity of flax (Linum usitatissimum L.). Acta Agrobot.

65: 3 - 14.

307. Zaker A., Abrishamchi P., Asill J., Mousavi S.H. Rezaee A. 2013. Induction of

callogenesis and rhizogenesis in Perovskia abrotanoides Karel., a little known

medicinal plant. J. Med. Plants Res. 7: 3385-3392.

226

308. Zang X., Mei X. G., Zhang C. H., Lu C. T., Ke T. 2001. Improved paclitaxel

accumulation in cell suspension cultures of Taxus chinensis by brassinolide.

Biotechnol. Lett. 23: 1047–1049.

309. Żebrowski J. 2009. Polyphenols. W: Narwall S. S., Bogatek R., Zadgańska

B.M., Sampietro D. A., Vattuone M. A. (red). Plant biochemistry. Studium Press

LLC: 239-261.

310. Zenkteler E., Borkowska B. 2002. The photosynthetic status of in vitro

strawberry shoots. Acta Hort. 567: 309-312.

311. Zhao Z.J., Song Y.G., Liu Y.L., Qiao M., Zhai X.L., Xiang F.N. 2013. The

effect of elicitors on oleanolic acid accumulation and expression of triterpenoid

synthesis genes in Gentiana straminea. Biol. Plantarum 57: 139-143.

312. Zhou J., Zhang L., Li X., Chang Y., Gu Q., Lu X., Xu G. 2012. Metabolic

profiling of transgenic rice progeny using gas chromatography-mass

spectrometry: the effects of gene insertion, tissue culture and breeding.

Metabolomics 8: 529-539.

227

Spis rycin

Ryc. 1. Drogi organogenezy i embriogenezy somatycznej w roślinnych kulturach in

vitro. Zmodyfikowane wg (Adamczuk i wsp. 2012).

Ryc. 2. Współdziałanie auksyn i cytokinin w indukcji organogenezy w kulturach

in vitro.

Ryc. 3. Podwójna rola reaktywnych form tlenu (ROS) oraz reaktywnych form azotu

(RNS)

w regulacji morfogenezy roślin w kulturach in vitro. Zmodyfikowane wg Adamczuk i

wsp. 2012).

Ryc. 4. Schemat przedstawiający eksplantaty hipokotylowe lnu zwyczajnego (Linum

usitatissimum L.) odmiany Szafir i Selena poddane działaniu par wydzielających

się z wodnego roztworu SNP.

Ryc. 5. Schemat przedstawiający eksplantaty hipokotylowe lnu zwyczajnego (Linum

usitatissimum L.) odmiany Szafir i Selena poddane działaniu par wydzielających

się z wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO.

Ryc. 6. Efektywność organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm.

Szafir (A) i odm. Selena (B) rosnących na pożywkach MS, B5, MS+B5 z dodatkiem

BA (1mg l-1

) oraz 2,4-D (0,025 mg l-1



Ryc. 7. Liczba pędów formujących się na eksplantatch hipokotylowych lnu

zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz Selena (B) rosnących na pożywkach MS, B5,

MS+B5 z dodatkiem BA (1mg l-1

) oraz 2,4-D (0,025 mg l-1



Ryc. 8. Efektywność organogenezy korzeniowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

odm. Szafir (A) i odm. Selena (B) rosnących na pożywkach MS, B5, MS+B5 z

dodatkiem NAA (1mg l-1

) oraz BA (0,025 mg l-1



228

Ryc. 9. Liczba korzeni formujących się na eksplantatch hipokotylowych lnu

zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz Selena (B) rosnących na pożywkach MS, B5,

MS+B5 z dodatkiem NAA (1mg l-1

) oraz BA (0,025 mg l-1



Ryc. 10. Efektywność organogenezy pędowej w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

odm. Szafir rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z dodatkiem

wybranej cytokininy: BA, KIN, TDZ (1 mgl-1

) + 2,4-D (0,025 mgl-1

). Wyniki średnie ±

SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


zwyczajnego odm. Szafir rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z

dodatkiem wybranej cytokininy: BA, KIN, TDZ (1 mgl-1

) + 2,4-D (0,025 mgl-1

).



odm. Selena rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z dodatkiem

wybranej cytokininy: BA, KIN, TDZ (1 mgl-1

) + 2,4-D (0,025 mgl-1




zwyczajnego odm. Selena rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z


) + 2,4-D (0,025 mgl-1

).



odm. Szafir rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z dodatkiem

wybranej cytokininy: 2,4-D, NAA, IBA (1 mgl-1

) + BA (0,025 mgl-1




zwyczajnego odm. Szafir rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B), MS+B5 (C) z

dodatkiem wybranej cytokininy: 2,4-D, NAA, IBA (1 mgl-1

) + BA (0,025 mgl-1

).


229


odm. Selena rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B) z dodatkiem wybranej

cytokininy: 2,4-D, NAA, IBA (1 mgl-1

) + BA (0,025 mgl-1




zwyczajnego odm. Selena rosnących na pożywkach MS (A), B5 (B) z dodatkiem

wybranej cytokininy: 2,4-D, NAA, IBA (1 mgl-1

) + BA (0,025 mgl-1




odm. Szafir (A) i odm. Selena (B) w zależności od zmieniających się stężeń auksyny

2,4-D (0-1 mg l-1


) – (2,4-D : BA). Wyniki


Ryc. 19. Liczba pędów formujących się na eksplantatach hipokotylowych lnu

zwyczajnego odm. Szafir (A) i odm. Selena (B) w zależności od zmieniających się

stężeń auksyny 2,4-D (0-1 mg l-1


) – (2,4-

D:BA). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


odm. Szafir (A) i odm. Selena (B) w zależności od zmieniających się stężeń cytokininy

wzajemnych proporcji hormonów BA (0-1 mg l-1

) przy stałym stężeniu auksyny NAA

(1mg l-1

) – (BA : NAA). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05.

Ryc. 21. Liczba korzeni formujących się na eksplantatach hipokotylowych lnu

zwyczajnego odm. Szafir (A) i odm. Selena (B) w zależności od zmieniających się

stężeń cytokininy BA (0-1 mg l-1

) przy stałym stężeniu auksyny NAA (1mg l-1

) – (BA

: NAA). Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Ryc. 22. Zawartość chlorofilu a (A), chlorofilu b (B), sumy chlorofilu a+b (C) w 7-

dniowych siewkach (Siewki), hipokotylach (czas wzrostu 0) oraz w kulturach in vitro

lnu zwyczajnego, rosnących na pożywce pędowej. Wartości średnie ±SD. * Różnice


230

Ryc. 23. Zawartość karotenoidów w 7-dniowych siewkach (Siewki), hipokotylach (czas

wzrostu 0) oraz w kulturach in vitro lnu zwyczajnego, rosnących na pożywce pędowej.

Wartości średnie ±SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Ryc. 24. Intensywność fotosyntezy netto (A) oraz oddychania ciemniowego (B)

w przeliczeniu na g św.m. 7-dniowych siewek, eksplantatów z kultur in vitro lnu

zwyczajnego, rosnących na pożywce pędowej. Wartości średnie ±SD. * Różnice istotne


Ryc. 25. Średni procentowy udział związków organicznych zidentyfikowanych w

ekstraktach metanolowych pozyskanych z 7-dniowych siewek (A), 5 (B), 14 (C) i 28

(D) -dniowych kultur pędowych in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir.

Ryc. 26. Średni procentowy udział związków organicznych zidentyfikowanych w

ekstraktach metanolowych pozyskanych z 7-dniowych siewek (A), 5 (B), 14 (C) i 28

(D) -dniowych kultur pędowych in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena.

Ryc. 27. Zawartość fenylopropanoidów i flawonoidów (A) oraz antocyjanów (B)

w 7-dniowych siewkach, hipokotylach, kulturach pędowych in vitro lnu zwyczajnego

odm. Szafir oraz Selena. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05.

Ryc. 28. Zawartość fenylopropanoidów i flawonoidów (A) oraz antocyjanów (B)

w 7-dniowych siewkach, hipokotylach, kulturach korzeniowych in vitro lnu

zwyczajnego odm Szafir oraz odm. Selena. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne


Ryc. 29. Zawartość białka w ekstraktach wykorzystanych do oznaczenia zawartości

związków fenolowych i antocyjanów w 7-dniowych siewkach (Siewki), hipokotylach

(czas wzrostu 0) oraz w kulturach pędowych (A) i korzeniowych (B) in vitro lnu

zwyczajnego odm. Szafir oraz odm. Selena. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne


Ryc. 30. Zawartość związków polifenolowych (A) oraz tanin (B) w 7-dniowych

siewkach (Siewki), hipokotylach (czas wzrostu 0), kulturach pędowych in vitro lnu



231

Ryc. 31. Zawartość związków polifenolowych (A) oraz tanin (B) w 7-dniowych

siewkach (Siewki), hipokotylach (czas wzrostu 0), kulturach korzeniowych in vitro lnu



Ryc. 32. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (A) oraz katalazy (B) w 7-dniowych

siewkach (Siewki), hipokotylach (0 dni wzrostu), kulturach pędowych in vitro lnu



Ryc. 33. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (A) oraz katalazy (B) w 7-dniowych

siewkach (Siewki), hipokotylach (0 dni wzrostu), kulturach korzeniowych in vitro lnu

zwyczajnego odm. Szafir oraz odm. Selena. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne


Ryc. 34. Zawartość białka w ekstrakcie enzymatycznym wykorzystanym do oznaczenia

aktywności SOD i CAT w 7-dniowych siewkach (Siewki), hipokotylach (0 dni wzrostu)

oraz w kulturach pędowych (A) i korzeniowych (B) in vitro lnu zwyczajnego odm.

Szafir oraz odm. Selena. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05.


odm. Szafir rosnących w warunkach stresu osmotycznego na pożywce MS ze

zwiększoną zawartością sacharozy (A) lub sorbitolu+maltozy (B). Wyniki średnie ±


Ryc. 36. Zawartość produktów peroksydacji lipidów (TBARS) w kulturach pędowych

lnu zwyczajnego odm. Szafir rosnących w warunkach stresu osmotycznego na pożywce

MS z dodatkiem sacharozy (A) lub sorbitolu+maltozy (B) w 14-tym dniu (bezpośrednio

po działaniu stresu) oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD.

* Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

232


odm. Szafir (A) i odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu osmotycznego

(dwukrotne (SI) i trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia sacharozy w podłożu w

stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu), 21-wszym

dniu oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne




osmotycznego (dwukrotne (SI) i trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia sacharozy w

podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu),

21-wszym dniu oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur . Wyniki średnie ± SD. *Różnice



odm. Szafir (A) i odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu osmotycznego


stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu), 21-wszym

dniu oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne





podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu),

21-wszym dniu oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. *Różnice


Ryc. 41. Zawartość produktów peroksydacji lipidów (TBARS) w kulturach pędowych

lnu zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu


podłożu

w stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu) oraz w

28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie,

przy p≤0,05.

233

Ryc. 42. Zawartość produktów peroksydacji lipidów (TBARS) w kulturach

korzeniowych lnu zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących w

warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne (SI) i trzykrotne (SII) zwiększenie stężenia

sacharozy w podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po

działaniu stresu) oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. * Różnice


Ryc. 43. Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach pędowych lnu zwyczajnego

odm. Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących w warunkach stresu osmotycznego


stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu) oraz w 28-

mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05.

Ryc. 44. Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach korzeniowych lnu



podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu)

oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne


Ryc. 45. Efektywność formowania pędów w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm.

Szafir w zależności od ilości SNP dodanego do pożywki pędowej. Wyniki średnie ±


Ryc. 46. Efektywność formowania korzeni w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm.

Szafir w zależności od ilości SNP dodanego do pożywki korzeniowej. Wyniki średnie ±



Szafir poddanych 24-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 40 ml

wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce pędowej. Wyniki średnie ± SD.


234


Szafir poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 40 ml

wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce pędowej. Wyniki średnie ± SD.




wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce pędowej.



zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz Selena (B) poddanych 3-godzinnej ekspozycji na

działanie par wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP, rosnących na

pożywce pędowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.



wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce

korzeniowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz Selena (B) poddanych 3-godzinnej ekspozycji na


pożywce korzeniowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05.


odm. Szafir (A) i Selena (B) oraz organogenezy korzeniowej w kulturach odm. Selena

(C) poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5mM

wodnego roztworu SNP, rosnących na podłożu bez dodatku hormonów. Wyniki średnie

± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

235


zwyczajnego odm. Szafir (A) i Selena (B) oraz liczba korzeni formujących się na

eksplantatch hipokotylowych odm. Selena (C) poddanych 3-godzinnej ekspozycji na


pożywce bez dodatku hormonów. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie,

przy p≤0,05.


odm. Selena poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z

5mM wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO, rosnących na pożywce

korzeniowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


zwyczajnego odm. Selena poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par

wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO, rosnących na

pożywce korzeniowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05.

Ryc. 57. Długość korzeni w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena

poddanych działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP w obecności c-

PTIO, rosnących na pożywce korzeniowej po 4 tygodniach wzrostu. Wyniki średnie ±


Ryc. 58. Efektywność organogenezy pędowej (A) i korzeniowej (B) w kulturach in

vitro lnu zwyczajnego odm. Selena poddanych 3-godzinnej ekspozycji na działanie par

wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO, rosnących na

pożywce bez dodatku hormonów. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie,

przy p≤0,05.

Ryc. 59. Liczba pędów (A) i korzeni (B) formujących się na eksplantatch

hipokotylowych lnu zwyczajnego odm. Selena poddanych 3-godzinnej ekspozycji na

działanie par wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP w obecności c-PTIO,

rosnących na pożywce bez dodatku hormonów. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne


236

Ryc. 60. Długość korzeni w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena

poddanych działaniu par wydzielających się z wodnego roztworu SNP w obecności c-

PTIO, rosnących na podłożu bez dodatku hormonów po 4 tygodniach wzrostu. Wyniki


Ryc. 61. Zawartość nadtlenku wodoru (H2O2) w kulturach in vitro lnu zwyczajnego

odm. Selena rosnących na podłożu bez dodatku hormonów (A) i rosnących na pożywce

korzeniowej (B). Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Ryc. 62. Zawartość produktów peroksydacji lipidów (TBARS) w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Selena rosnących na podłożu bez dodatku hormonów (A) i

rosnących na pożywce korzeniowej (B). Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne


Ryc. 63. Przykładowe widmo EPR DPPH. – widmo rodnika DPPH

. (linia czarna) oraz K

– DPPH. po reakcji z ekstraktem z 15-dniowych kultur odm. Selena rosnących na

podłożu bez dodatku hormonów (linia zielona), 5 ml SNP – DPPH. po reakcji z

ekstraktem z 15-dniowych kultur rosnących na podłożu bez dodatku hormonów,

poddanych działaniu par wydzielających się z 5 ml SNP (linia żółta) i 10 ml SNP –

DPPH. po reakcji z ekstraktem z 15-dniowych kultur rosnących na podłożu bez

dodatku hormonów, poddanych działaniu par wydzielających się z 10 ml SNP (linia

niebieska)

Ryc. 64. Redukcja stabilnego wolnego rodnika DPPH. w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Selena, poddanych działaniu 5mM roztworu SNP, rosnących na

podłożu bez dodatku hormonów. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie,

przy p≤0,05.

Ryc. 65. Przykładowe widmo EPR DPPH. – widmo rodnika DPPH (linia czarna) oraz K

– DPPH, po reakcji z ekstraktem z kultur korzeniowych odm. Selena (linia czerwona) i

5 ml SNP – DPPH, po reakcji z ekstraktem z kultur korzeniowych, bezpośrednio (0 dni

wzrostu) po działaniu par wydzielających się z 5 ml SNP (linia żółta)

Ryc. 66. Redukcja stabilnego wolnego rodnika DPPH w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Selena, poddanych ekspozycji na pary wydzielające się z 5mM

roztworu SNP, rosnących na pożywce korzeniowej. Wyniki średnie ± SD. * Różnice


237

Ryc. 67. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i jej izoform w kulturach in

vitro lnu zwyczajnego odm. Selena, poddanych ekspozycji na pary wydzielające się z

5mM roztworu SNP, rosnących na podłożu bez dodatku hormonów. Wyniki średnie ±

SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Ryc. 68. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i jej izoform w kulturach in

vitro lnu zwyczajnego odm. Selena poddanych ekspozycji na pary wydzielające się z

5mM roztworu SNP, rosnących na pożywce korzeniowej. Wyniki średnie ± SD. *

Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Ryc. 69. Aktywność katalazy (CAT) w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena,

poddanych ekspozycji na pary wydzielające się z 5 mM roztworu SNP, rosnących na

podłożu bez dodatku hormonów (A) i na pożywce korzeniowej (B). Wyniki średnie ±

SD. Wyniki średnie ± SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Ryc. 70. Zawartość białka w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena

poddanych działaniu par wydzielających się z 5mM roztworu SNP, rosnących na

podłożu bez dodatku hormonów (A) i na pożywce korzeniowej (B). Wyniki średnie ±

SD. * Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Ryc. 71. Efekt działania NO na procesy morfogenetyczne w kulturach in vitro lnu

odm. Selena rosnących na pożywce korzeniowej (+NAA), oraz bez dodatku hormonów

(-NAA).

238

Spis tabel

Tab. 1. Skład pożywek hodowlanych.

Tab. 2. Wzajemne stężenia cytokininy BA i auksyny 2,4-D w poszczególnych

wariantach pożywki.

Tab. 3. Wzajemne stężenia auksyny NAA i cytokininy BA w poszczególnych

wariantach pożywki.

Tab. 4. Warunki wzrostu kultur in vitro lnu zwyczajnego na pożywkach ze zwiększoną

zawartością cukrów.

Tab. 5. Stężenia SNP dodanego bezpośrednio do pożywki.

Tab. 6. Czas i warunki ekspozycji kultur in vitro lnu zwyczajnego na opary gazów

wydzielających się z wodnego roztworu SNP.

Tab. 7. Warunki pracy układu chromatograficznego (GC/MS).


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir oraz Selena rosnących na pożywce

MS, B5 oraz MS+B5 z dodatkiem BA (1mg l-1

) oraz 2,4-D (0,025 mg l-1

). Wyniki



w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir oraz Selena rosnących na pożywce

MS, B5 oraz MS+B5 z dodatkiem NAA (1mg l-1

) oraz BA (0,025 mg l-1

). Wyniki


Tab. 10. Świeża i sucha masa eksplantatów z pędami oraz zawartość wody w kulturach

in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir rosnących na pożywce MS, B5 oraz MS+B5 z


) + 2,4-D (0,025 mgl-1

).


Tab.11. Świeża i sucha masa eksplantatów z pędami oraz zawartość wody w kulturach

in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena rosnących na pożywce MS, B5 oraz MS+B5 w

zależności od wybranej cytokininy BA, KIN, TDZ (1 mgl-1

) + 2,4-D (0,025 mgl-1

).


239


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir rosnących na pożywce MS, B5 oraz

MS+B5 w zależności od wybranej auksyny 2,4-D, NAA, IBA (1 mgl-1

) + BA (0,025

mgl-1



w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Selena rosnących na pożywce MS, B5 oraz

MS+B5 w zależności od wybranej auksyny 2,4-D, NAA, IBA (1 mgl-1

) + BA (0,025

mgl-1


Tab. 14. Związki emitowane przez 7-dniowe siewki oraz kultury pędowe in vitro lnu

zwyczajnego odm. Szafir.

Tab. 15. Związki emitowane przez 7-dniowe siewki oraz kultury pędowe in vitro lnu

zwyczajnego odm. Selena.

Tab.16. Świeża i sucha masa eksplantatów z pędami oraz zawartość wody

w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir rosnących w warunkach stresu

osmotycznego na pożywce MS z dodatkiem sacharozy (A) lub sorbitolu+maltozy (B) w

14-tym dniu (bezpośrednio po działaniu stresu) oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur.



w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących

w warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne (SI) i trzykrotne (SII) zwiększenie

sacharozy w podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio po

działaniu stresu) oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD. *Różnice



w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz odm. Selena (B) rosnących

w warunkach stresu osmotycznego (dwukrotne (SI) i trzykrotne (SII) zwiększenie

stężenia sacharozy w podłożu w stosunku do kontroli (K)) w 14-tym dniu (bezpośrednio

po działaniu stresu) oraz w 28-mym dniu wzrostu kultur. Wyniki średnie ± SD.


240


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir rosnących na pożywce pędowej z

dodatkiem SNP. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir rosnących na pożywce korzeniowej z

dodatkiem SNP. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir poddanych 24-godzinnej ekspozycji

na działanie par wydzielających się z wodnego roztworu SNP, rosnących na pożywce

pędowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.



działanie par wydzielających się z 40 ml wodnego roztworu SNP, rosnących na

pożywce pędowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.


w kulturach in vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir (A) oraz Selena (B) poddanych 3-

godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5mM wodnego roztworu

SNP, rosnących na pożywce pędowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne





SNP, rosnących na pożywce korzeniowej. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne


Tab. 25. Świeża i sucha masa eksplantatów z pędami i korzeniami oraz zawartość wody



SNP, rosnących na pożywce bez dodatku hormonów. Wyniki średnie ± SD. *Różnice


241

Tab. 26. Świeża i sucha masa oraz zawartość wody w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Selena po 4-ch tygodniach wzrostu na pożywce korzeniowej,

poddanych działaniu par wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP w

obecności c-PTIO. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy p≤0,05.

Tab. 27. Świeża i sucha masa oraz zawartość wody w kulturach in vitro lnu

zwyczajnego odm. Selena po 4 tygodniach wzrostu na pożywce bez dodatku

hormonów, poddanych działaniu par wydzielających się z 5mM wodnego roztworu

SNP w obecności c-PTIO. Wyniki średnie ± SD. *Różnice istotne statystycznie, przy

p≤0,05.

242

Spis fotografii

Fot. 1. Pokrój ogólny form lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L.) odmiany Selena

(typ włóknisty lnu - A) oraz Szafir (typ oleisty lnu - B), (Fot. A. Adamczuk).

Fot. 2. Kultury pędowe lnu zwyczajnego odm. Szafir i odm. Selena po 4 tygodniach

wzrostu na pożywkach: MS, B5 oraz MS+B5 z dodatkiem z dodatkiem BA (1mg l-1

)

oraz 2,4-D (0,025 mg l-1

).

Fot. 3. Kultury korzeniowe lnu zwyczajnego odm. Szafir i odm. Selena po 4

tygodniach wzrostu na pożywkach: MS, B5 oraz MS+B5 z dodatkiem NAA (1mg l-1

)

oraz BA (0,025 mg l-1

).

Fot. 4. Eksplantaty hipokotylowe lnu odm. Szafir oraz odm. Selena ze

zregenerowanymi pędami w zależności od zmieniających się stężeń auksyny 2,4-D (0-1

mg l-1


) w pożywce (2,4-D:BA).

Fot. 5. Eksplantaty hipokotylowe lnu odm. Szafir oraz odm. Selena ze

zregenerowanymi korzeniami w zależności od zmieniających się stężeń cytokininy BA

(0-1mg l-1


) – (BA:NAA).

Fot. 6. Organogeneza pędów na eksplantatach hipokotylowych lnu odm. Szafir

rosnących na pożywce pędowej.

Fot. 7. Organogeneza pędów na eksplantatach hipokotylowych lnu odm. Selena

rosnących na pożywce pędowej.

Fot. 8. Organogeneza korzeni na eksplantatach hipokotylowych lnu odm. Szafir

rosnących na pożywce korzeniowej.

Fot. 9. Organogeneza korzeni na eksplantatach hipokotylowych lnu odm. Selena

rosnących na pożywce korzeniowej.


uformowanymi pędami, poddane 3-godzinnej ekspozycji na działanie par

wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP w ilości: 5 ml,10 ml, 20 ml i 30 ml,

po 4 tygodniach wzrostu na pożywce pędowej.

243


uformowanymi korzeniami, poddane 3-godzinnej ekspozycji na działanie par

wydzielających się z 5mM wodnego roztworu SNP w ilości: 5 ml,10 ml, 20 ml i 30 ml,

po 4 tygodniach wzrostu na pożywce korzeniowej.

Fot. 12. Kultury in vitro oraz eksplantaty hipokotylowe lnu zwyczajnego odm. Szafir,

poddane 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5mM wodnego

roztworu SNP w ilości: 5 ml,10 ml, 20 ml i 30 ml, po 4 tygodniach wzrostu na pożywce

MS bez dodatku hormonów.

Fot. 13. Kultury in vitro oraz eksplantaty hipokotylowe lnu zwyczajnego odm. Selena,

poddane 3-godzinnej ekspozycji na działanie par wydzielających się z 5mM wodnego

roztworu SNP w ilości: 5 ml,10 ml, 20 ml i 30 ml, po 4 tygodniach wzrostu na pożywce

B5 bez dodatku hormonów.

244

Aneks

Tab. I. Wykaz związków organicznych zidentyfikowanych w ekstraktach metanolowych,

pochodzących z 7-dniowych siewek (A), 5 (B), 14 (C) i 28 (D) -dniowych kultur pędowych in

vitro lnu zwyczajnego odm. Szafir

A)

Lp. IR exp IR lit Nazwa związku Zawartość

[%]

Kwasy alifatyczne i glicerydy

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

1068

1083

1152

1215

1322

1349

1509

1530

1573

1592

1652

1670

2049

2219

1070

1083

1153

1218

1321

1350

1510

1527

1574

1571

1652

1671

2052

2215

Kwas mlekowy, di-TMS

Kwas hydroksyoctowy, di-TMS

Kwas 3-hydroksypropanolowy, di-TMS

Kwas malonowy, di-TMS

Kwas bursztynowy, di-TMS

Kwas glicerynowy, tri-TMS

Kwas jabłkowy, tri-TMS

Kwas piroglutaminowy, di-TMS

Kwas erytromorfowy, tetra-TMS

Kwas rythronowy, tetra-TMS

Kwas D-arabinonowy, gamma-lactone, tri TMS

Kwas butanodiowy, tetra-TMS

Kwas palmitynowy, TMS

Kwas linolenowy, TMS

0,20

0,06

0,04

0,06

0,27

0,10

1,05

0,53

0,04

0,15

0,08

0,04

0,21

0,37

Aminokwasy

15

16

17

18

1089

1266

1303

1499

1090

-

1308

-

L-Walina, TMS

L-Seryna, O,O-di-TMS

L-Treonina, O,O-di-TMS

Aminokwas (84, 73, 75)

0,05

0,09

0,04

0,26

Związki aromatyczne

19 2151 2155 Kwas kawowy, TMS 0,43

Heterocykliczne związki zawierające azot

20 2467 2469 Urydyna, tri-TMS 0,08

Węglowodany i glukozydy

245

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

1832

1844

1852

1874

1878

1886

1930

1935

1939

1977

2028

2066

2094

2103

2142

2164

2178

2208

2594

2658

2713

2856

2888

2925

3003

3065

3110

3228

-

1843

1851

-

1879

1885

1930

-

1937

1978

2028

-

-

-

-

-

-

-

-

-

2714

2853

-

-

-

-

-

-

Monosacharyd (217, 73, 129)

β-Fruktofuranoza, penta-TMS

α-Fruktofuranoza, penta-TMS


α-Glukofuranoza, TMS


α-D-Glukopyranoza, penta-TMS


α-D-Galaktopyranoza, penta-TMS

Sedoheptuloza, hexa-TMS

α-D-Glucopyranoza, penta-TMS

Węglowodan (204, 73, 217)









Sacharoza, octa-TMS

Leukroza, TMS

Węglowodan (204, 361, 437)

Węglowodan (217, 361, 437)


Węglowodan (204, 205, 361)


Węglowodan (204, 217, 361)

0,12

2,79

3,48

0,07

0,39

0,48

3,51

0,35

0,06

0,36

4,44

0,20

1,46

1,74

11,97

0,95

0,12

6,03

1,52

3,89

32,84

0,16

0,10

0,09

0,29

0,19

0,34

0,44

Alkohole polihydroksylowe

49 1536 1536 Treitol, tetra-TMS 0,10

Pozostałe

50

51

52

1288

1292

1739

1289

1293

-

Kwas fosforowy, tri-TMS

Glicerol, tri-TMS

NN (73, 147, 246)

6,36

0,48

0,48

246

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

1826

1956

1996

2003

2026

2043

2128

2532

2691

2701

2721

3098

-

1955

-

2004

2024

-

2128

-

-

-

-

-

NN (73, 437, 217)

muko-Inozytol, hexa-TMS

NN (204, 73, 205)

chiro-Inozytol, penta-TMS

scyllo-Inozytol, hexa-TMS

NN (217, 73, 305)

mio-Inozytol, hexa-TMS

NN (73, 287, 217)

NN (289, 361, 73)

NN (289, 361, 217)

NN (73, 217, 361)

NN (324, 361, 217)

0,12

0,14

0,31

0,51

3,04

0,11

0,80

0,66

0,13

0,29

2,16

0,88

B)


[%]


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

1066

1068

1080

1083

1215

1322

1349

1503

1509

1531

1592

2049

2216

2607

1069

1070

1078

1083

1218

1321

1350

1500

1510

1527

1571

2052

2215

Kwas etanodiowy


Kwas glikolowy, di-TMS





Kwas 2-piperydynokarboksylowy






Gliceryna 1-monopalmitoilowa

0,16

0,33

0,11

0,07

0,09

0,21

0,18

1,26

0,11

3,01

0,09

0,15

0,17

0,04

Aminokwasy

16

17

18

1089

1111

1194

1090

1119

1203

L-Walina, TMS

Alanina, di-TMS

Glicyna

0,30

0,30

0,04

247

19

20

21

1266

1304

1522

-

1308

-



N-Acetylometionina, di-TMS ? (73, 116, 261)

0,53

0,33

0,39


22

23

24

25

1244

1910

2098

2152

1243

2155

Kwas benzoesowy, TMS

Benzaldehyd

Benzhydrazyd

Kwas kawowy, TMS

0,06

0,02

0,08

0,08


26

27

28

29

1036

1143

1950

2468

2469

Pirydyna, 3-trimetylosiloksyl

1- (trimetylosililo) -2-pirolidynon

Benzotiofen

Urydyna, tri-TMS

0,15

0,17

0,19

0,16

Diterpeny

30 2182 2183 Fitol, TMS

0,13


31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

1844

1852

1930

1936

2294

1978

2029

2067

2094

2145

2165

2203

2239

2373

2543

2594

1843

1852

1879

-

1977

1978

2030

-

-

-

-

2205

2239

2378

-

-





D-Glukoza


β-D-Glukopyranoza, penta-TMS





α-D-Galaktopyranoza

α-D-Mannopyranoza

2-O-glicerol-α-d-galaktopiranozyd

Węglowodan (204 ,73, 105 )


0,45

0,57

0,23

0,36

0,07

3,45

0,25

0,81

0,14

28,05

0,02

0,13

0,16

0,04

0,09

0,17

248

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

2612

2628

2715

2829

2849

2945

2995

3003

3066

3110

3228

-

2630

2714

2829

-

2945

-

-

-

-

-

Glukuronolakton

D-Turanoza

Sacharoza, octa-TMS

Glukopiranozyd, p-etylofenol


Lyksoza



Węglowodan (204, 205, 361)


Węglowodan (204, 217, 361)

0,25

0,25

0,08

28,60

0,13

0,10

0,09

0,25

0,28

0,28

0,18


59

60

61

62

1538

1732

1746

1920

1538

1728

1740

1925

Treitol, tetra-TMS

Ksylitol, penta-TMS

Arabinitol, penta-TMS

Heksitol, TMS, isomere 1

0,02

0,05

0,01

0,17

Pozostałe

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

1289

1292

1411

1961

1996

2003

2128

2533

2692

2721

3098

1289

1293

-

1955

-

2004

2128

-

-

-

-


Glicerol, tri-TMS

NN (73, 147, 245)


NN (204, 73, 205)



NN (73, 287, 217)

NN (289, 361 , 73)

NN (73, 217, 361)

NN (324, 361, 217)

3,01

0,58

0,12

0,15

0,24

0,11

2,65

0,02

0,10

0,05

0,39

C)


[%]


1 1068 1070 Kwas mlekowy, di-TMS 3,54

0,41

249

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

1083

1152

1214

1322

1349

1502

1509

1530

1573

1592

2050

2220

1083

1153

1218

1321

1350

1500

1510

1527

1574

1571

2052

2215


Kwas 3-hydroksypropanolowy, di-TMS




Kwas 2-piperydynokarboksylowy



Kws erytomorfowy, tetra-TMS




0,28

0,53

1,16

0,81

2,17

0,66

6,30

0,15

0,20

0,07

0,04

Aminokwasy

14

15

16

17

18

19

20

1089

1110

1159

1265

1303

1499

1521

1090

1119

1185

-

1308

-

-

L-Walina, TMS

Alanina, di-TMS

L-Leucyna




N-Acetylometionina, di-TMS ? (73, 116, 261)

1,72

1,60

0,34

2,37

2,58

0,69

1,27


21 1244 1243 Kwas benzoesowy, TMS

0,33


22 2593 2469 Urydyna, tri-TMS 1,09

Diterpeny

23 2208 2183 Fitol, TMS 0,18


24

25

26

27

28

29

1852

1878

1890

1894

1935

1950

1843

1852

1879

1889

1930

-




α-DL-Arabinofuranozyd



1,56

2,21

0,06

0,03

0,64

2,07

250

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

1978

1996

-

2094

2103

2128

2182

2371

2467

2606

2658

2701

3228

3257

1977

1978

-

-

-

-

-

2378

2460

-

2652

-

-

-

D-Glukoza







2-O-Glicerol-α-d-galaktopiranozyd

D-Fruktoza


Maltoza



Węglowodan (204, 217, 361)

0,17

9,95

0,25

2,01

1,72

0,16

21,04

0,30

0,02

0,10

0,31

0,13

0,08

1,10


44

45

46

47

48

49

50

1536

1568

1732

1745

1758

1844

1929

1536

1568

1728

1740

1755

1841

1925

Treitol, tetra-TMS

Pentitol

Ksylitol, penta-TMS


Arabitol, penta-TMS

Rybitol, penta-TMS

Heksitol, TMS, isomere 1

0,41

0,03

0,12

0,13

0,16

0,02

0,40

Pozostałe

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

1078

1194

1288

1292

1411

1459

1556

1906

1961

2003

2026

-

-

1289

1293

-

-

-

-

1955

2004

2024

NN (221,103,130,73)

NN (73, 170, 75, 141)


Glicerol, tri-TMS

NN (73, 147, 245)

NN (155, 273, 73)

NN (73, 147, 218)

NN (159, 247, 303, 116, 160)




0,23

0,17

9,08

4,90

0,35

0,02

0,14

0,04

0,32

0,28

0,61

251

62

63

64

2128

2142

3098

2128

-

-


NN (289, 361, 217)

NN (324, 361, 217)

0,78

1,66

0,04

D)


[%]


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

1068

1083

1322

1349

1459

1501

1509

1516

1531

1573

1592

1652

1952

2216

2651

1070

1083

1321

1350

1460

1503

1510

1518

1527

1574

1571

1652

1953

2215

2653





Kwas 2-izopropylo-3-ketobutanowy

Kwas butanodiowy


Kwas pentanowy


Kws erytomorfowy, tetra-TMS


Kwas D-arabinonowy, gamma-lakton, tri-TMS

Kwas idonowy


Kwas Ribonic

0,55

0,08

0,15

0,07

0,15

0,81

0,82

0,04

0,04

0,04

0,03

0,10

0,03

0,15

6,51

Aminokwasy

16 1522 - N-Acetylometionina, di-TMS ? (73, 116, 261)

0,05


17 2730 2732 Deoksyfruktozazyna 0,25


18

19

2468

2482

2469

-

Urydyna, tri-TMS

Deoksygedunina

0,07

0,08

Diterpeny

252

20 2182 2183 Fitol, TMS

0,04


21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

1761

1844

1852

1878

1893

1906

1930

1936

2294

1978

2029

2067

2075

2094

2102

2112

2141

2163

2177

2203

2208

2269

2287

2372

2450

2594

2612

2628

2658

2715

2829

2892

2905

1760

1843

1852

1880

1894

1908

1879

-

1977

1978

2030

-

2077

-

-

2112

-

-

-

2205

-

2269

2283

2371

-

-

-

2630

-

2714

2829

2890

2903

Glukofuranozyd




α-D-Mannopyranozyd

Arabinofuranoza



D-Glukoza




α-D-Galaktofuranozyd



Mannoza




α-D-Galaktopyranozyd

Weglowodan (204, 73, 217)

α-D-Fruktopyranoza

α-D-Fruktoza

Glicerol-α-d-galaktopyranozyd

Gulose


Glukuronolakton

D-Turanoza


Sacharoza, octa-TMS


Lyksopyranozyd

β-Cellobioza, octa-TMS

0,32

2,88

3,20

0,08

0,71

0,03

1,25

1,91

0,19

6,54

0,05

0,02

0,03

0,39

0,05

0,48

0,12

0,05

0,05

0,08

0,08

0,11

1,13

0,03

0,42

0,05

0,90

0,18

0,87

5,39

0,10

0,02

0,03

253

54 3228 -

Węglowodan (204, 217, 361)

0,03


55

56

57

1538

1539

1732

1538

1538

1735

Treitol, tetra-TMS

Erytritol,

Galaktitol

0,10

0,02

0,06

Pozostałe

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

1289

1292

1956

1919

1950

1996

2003

2025

2044

2127

2080

2506

2524

2531

2548

2691

2701

2722

3097

1289

1293

1955

-

-

-

2004

2024

-

2128

-

-

-

-

-

-

-

-

-


Glicerol, tri-TMS


NN (73, 147, 217)

NN (73, 204, 324)

NN (204, 73, 205)



NN (217, 73, 305)


NN (73, 147, 217, 278)

NN (73, 147, 211, 325)

NN (73, 97, 362)

NN (73, 287, 217)

NN (73, 98, 215, 242, 361)

NN (289, 361, 73)

NN (289, 361, 217)

NN (73, 217, 361)

NN (324, 361, 217)

0,54

0,44

0,28

0,04

0,05

0,12

0,23

1,52

0,07

1,51

0,05

0,03

0,56

0,07

0,23

2,56

37,31

0,52

0,28

254

Tab. II. Wykaz związków organicznych zidentyfikowanych w ekstraktach metanolowych,

pochodzących z 7-dniowych siewek (A), 5 (B), 14 (C) i 28 (D) -dniowych kultur pędowych in

vitro lnu zwyczajnego odm. Selena

A)


[%]


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1068

1083

1215

1322

1349

1509

1652

1670

2049

2219

1070

1083

1218

1321

1350

1510

1652

1671

2052

2215







Kwas D-arabinonowy, gamma-lactone, tri TMS

Kwas butanodiowy, tetra-TMS



0,19

0,08

1,67

0,69

0,44

1,67

0,04

0,07

0,01

1,05

Aminokwasy

11

12

13

14

1089

1111

1266

1303

1090

1119

-

1308

L-Walina, TMS

Alanina, di-TMS

L-Seryna. O,O-di-TMS


0,21

0,33

0,51

0,20


15 2151 2155 Kwas kawowy, TMS 1,82


16 2467 2469 Urydyna, tri-TMS 0,04


17

18

19

20

21

22

1874

1878

1886

1935

1939

1977

-

1879

1885

-

1937

1978





α-D-Galaktopiranoza, penta-TMS


0,04

0,15

8,52

0,01

0,05

0,67

255

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

2028

2066

2094

2103

2112

2142

2164

2178

2208

2467

2594

2658

2856

2888

2925

3003

3065

3110

2028

-

-

-

2112

-

-

-

-

2460

-

-

2853

-

-

-

-

-

α-D-Glucopiranoza, penta-TMS




Mannoza





D-Fruktoza



Leukroza, TMS

Węglowodan (204, 361, 437)

Węglowodan (217, 361, 437)


Węglowodan (204, 205, 361)


0,41

0,29

0,43

1,85

0,94

0,05

0,17

0,08

0,29

0,65

0,39

0,28

0,07

13,16

0,03

0,40

0,13

0,05


41 1536 1536 Treitol, tetra-TMS 0,03

Pozostałe

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

1288

1956

1996

2003

2026

2043

2128

2532

2691

2701

2721

3098

1289

1955

-

2004

2024

-

2128

-

-

-

-

-



NN (204, 73, 205)



NN (217, 73, 305)


NN (73, 287, 217)

NN (289, 361, 73)

NN (289, 361, 217)

NN (73, 217, 361)

NN (324, 361, 217)

15,45

0,24

2,31

10,23

4,04

0,07

9,49

0,05

0,12

14,86

3,16

0,88

256

B)


[%]


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1068

1083

1322

1349

1501

1509

1531

1652

1952

2216

1070

1083

1321

1350

1503

1510

1527

1652

1953

2215





Kwas butanodiowy



Kwas D-arabinonowy, gamma-lakton, tri-TMS

Kwas idonowy


4,67

1,18

0,32

0,07

1,81

2,99

0,16

0,50

0,03

4,98

Aminokwasy

11 1522 - N-Acetylometionina, di-TMS ? (73, 116, 261)

1,12


12 2730 2732 Deoksyfruktozazyna 1,90


13

2468

2469 Urydyna, tri-TMS

1,12

Diterpeny

14 2182 2183 Fitol, TMS

0,12


15

16

17

18

19

20

21

1844

1852

1878

1930

1936

2294

1978

1843

1852

1880

1879

-

1977

1978




α-D-Glukopiranoza, penta-TMS


D-Glukoza


2,13

2,30

0,08

1,75

1,91

0,89

11,69

257

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

42

43

44

44

45

46

47

48

49

50

2029

2067

2075

2094

2102

2112

2141

2163

2177

2203

2208

2269

2287

2450

2594

2628

-

2715

2829

2892

2030

-

2077

-

-

2112

-

-

-

2205

-

2269

2283

-

-

2630

-

2713

2829

2890

β-D-Glukopiranoza, penta-TMS


α-D-Galaktofuranozyd



Mannoza




α-D-Galaktopiranozyd

Weglowodan (204, 73, 217)

α-D-Fruktopiranoza

α-D-Fruktoza


Glukuronolakton

D-Turanoza


Sacharoza, octa-TMS


Lyksopyranozyd

0,03

0,12

0,02

0,59

0,05

0,58

0,13

0,05

0,05

0,18

0,08

0,11

1,13

5,59

0,05

0,18

0,87

24,29

0,11

0,02


51

52

53

1538

1539

1732

1538

1538

1735

Treitol, tetra-TMS

Erytritol

Galaktitol

1,10

0,21

1,06

Pozostałe

54

55

56

57

58

59

60

61

62

1289

1292

1956

1919

1950

1996

2003

2044

2080

1289

1293

1955

-

-

-

2004

-

-


Glicerol, tri-TMS


NN (73, 147, 217)

NN (73, 204, 324)

NN (204, 73, 205)


NN (217, 73, 305)

NN (73, 147, 217, 278)

5,30

2,55

0,28

0,04

0,05

0,12

0,23

0,57

0,05

258

63

64

65

66

67

2506

2524

2531

2701

2722

-

-

-

-

-

NN (73, 147, 211, 325)

NN (73, 97, 362)

NN (73, 287, 217)

NN (289, 361, 217)

NN (73, 217, 361)

0,23

1,56

0,17

0,23

1,03

C)


[%]


1

2

3

4

5

6

7

1068

1083

1215

1322

1349

2049

2216

1070

1083

1218

1321

1350

2052

2215








1,68

0,02

1,70

0,86

1,35

0,26

0,12

Aminokwasy

8

9

10

11

12

1089

1111

1159

1304

1499

1090

1119

1185

1308

-

L-Walina, TMS

Alanina, di-TMS

L-Leucyna



0,12

0,21

0,04

0,14

0,14


13

2467 2469 Urydyna, tri-TMS 0,31

Diterpeny

14 2182 2183 Fitol, TMS

0,02


15 1844 1843 β-Fruktofuranoza, penta-TMS 4,76

259

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

1852

1930

1978

2029

2067

2094

2145

2165

2203

2543

2594

2628

2715

2856

2995

3003

3066

3110

3228

1852

1879

1978

2030

-

-

-

-

2205

-

-

2630

2714

2853

-

-

-

-

-










Węglowodan (204 ,73, 105 )


D-Turanoza

Sacharoza, octa-TMS

Leukoza, TMS



Węglowodan (204, 205, 361)


Węglowodan (204, 217, 361)

1,37

0,47

6,28

2,76

1,64

0,60

0,28

0,24

0,53

0,08

0,17

0,39

47,16

0,46

11,04

0,52

0,30

0,33

0,18


35 1538

1538 Treitol, tetra-TMS 0,02

Pozostałe

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

1289

1292

1411

1961

1996

2003

2128

2533

2692

2721

3098

1289

1293

-

1955

-

2004

2128

-

-

-

-


Glicerol, tri-TMS

NN (73, 147, 245)


NN (204, 73, 205)



NN (73, 287, 217)

NN (289, 361 , 73)

NN (73, 217, 361)

NN (324, 361, 217)

3,22

1,08

0,14

0,35

4,06

1,13

1,46

0,20

1,26

0,41

0,14

260

D)


[%]


1

2

3

4

5

6

7

1068

1083

1322

1509

1530

2050

2220

1070

1083

1321

1510

1527

2052

2215








4,55

0,19

0,74

4,04

0,44

1,60

0,40

Aminokwasy

8 1194

1203

Glicyna

0,40


9 2593 2469 Urydyna, tri-TMS 0,56


10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

1852

1878

1935

1950

1978

2103

2128

2182

2371

2467

2606

2658

2701

2713

3228

1843

1852

1930

-

1977

-

-

-

-

2460

-

2652

-

2714

-





D-Glukoza





D-Fruktoza


Maltoza


Sacharoza, octa TMS


6,62

4,26

2,59

4,07

20,24

0,65

0,05

0,16

1,06

0,30

5,10

0,04

0,13

24,26

0,36


25 1568 1568 Pentitol 0,08

261

26

27

28

29

1732

1745

1758

1844

1728

1740

1755

1841

Ksylitol, penta-TMS


Arabitol, penta-TMS

Rybitol, penta-TMS

0,21

0,13

0,18

0,01

Pozostałe

30

31

32

33

34

35

36

1078

1194

1288

1292

1961

2026

2128

-

-

1289

1293

1955

2024

2128

NN (221,103,130,73)

NN (73, 170, 75, 141)


Glicerol, tri-TMS




2,23

2,34

2,95

1,34

0,55

0,04

0,52

Uniwersytet w Białymstoku Wydział Biologiczno-Chemiczny...4.5 Organogeneza pędowa i korzeniowa...

Documents

Transcript of Uniwersytet w Białymstoku Wydział Biologiczno-Chemiczny...4.5 Organogeneza pędowa i korzeniowa...