UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Jelena S. Kričak

Uticaj auksina na indukciju aksilarnih pupoljaka

Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro

MASTER RAD

Niš, 2019.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Uticaj auksina na indukciju aksilarnih pupoljaka

Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Jelena S. Kričak Dr Dragana D. Stojičić

Br. indeksa: 249 redovni profesor

Niš, 2019.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

The influence of auxin on axillary buds induction of

Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro

MASTER THESIS

Candidate: Menthor:

Jelena S. Kričak Dr Dragana D. Stojičić

No. of index 249 Professor

Niš, 2019.

ZAHVALNICA

Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Dragani Stojičić na ukazanoj

pomoći i razumevanju prilikom izrade master rada.

Takođe, najlepše se zahvaljujem i dr Svetlani Tošić na savetima i pomoći pri

realizaciji eksperimentalnog dela ovog master rada.

Veliko hvala mojim roditeljima, sestri i suprugu na podršci.

Sažetak

Micromeria croatica je višegodišnja žbunasta biljka i predstavlja balkansku endemičnu vrstu, čiji se

areal vezuje za planinski venac Dinarida. Staništa ove vrste se mogu naći od 150 do preko 2000 m

nadmorske visine. M. croatica je rasprostranjena u Hrvatskoj, Bosni i Hercegovini, Crnoj Gori i

Albaniji. Na teritoriji Srbije zabeležena su staništa u zapadnim delovima zemlje. Pošto se radi o

ugroženoj i endemičnoj vrsti, pogodna je za umnožavanje i reintrodukciju u prirodna staništa

tehnikama in vitro kultura biljnih ćelija, tkiva i organa. Najveći prosečan broj pupoljaka po

eksplantatu dobijen je kada su eksplantati gajeni na podlozi MS sa 1mg/L IBA. Najveća prosečna

dužina pupoljaka bila je na MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja. Najveća prosečna visina

eksplantata bila je na MS podlozi sa 0.3 mg/L IBA. Najveća prosečna sveža i najveća prosečna suva

masa bile su na podlozi MS sa 1mg/L IBA.

Ključne reči: Micromeria croatica, mikropropagacija, aksilarni pupoljci, NAA, IBA.

Abstract

Micromeria croatica is a perennial shrub, and is a Balkan endemic species whose area is primarily

associated with the mountain range of Dinarides. Habitats of this species can be found in the range

of 150 to over 2000 m above sea level. M. croatica is widespread in Croatia, Bosnia and

Herzegovina, Montenegro and Albania. In the territory of Serbia, habitats have been recorded in the

western parts of the country. Since it is an endangered and endemic species, reproduction and

reintroduction into natural habitats of in vitro culture techniques of plant cells, tissues and organs is

suitable. The highest average number of buds per explant was on MS medium with 1mg/L IBA. The

highest average length of buds was on MS medium without growth regulator. The highest average

height of explants was on MS medium with 0.3 mg/L IBA. The highest average bindings and the

highest average dry weight were based on MS with 1mg/L IBA.

Keywords: Micromeria croatica, micropropagation, axillary buds, NAA, IBA.

SKRAĆENICE

2,4 D – 2,4-Dihlorofenoksisirćetna kiselina

2iP- izopentenil adenin

ABA- abscisinska kiselina

BA-6-benzil aminopurin

IAA- indol-3-sirćetna kiselina

IBA- indol-3-buterna kiselina

kin- kinetin

6-furfuril-aminopurin

MS- hranljiva podloga (Murashige i Skoog, 1962)

NAA- α-naftilsirćetna kiselina

TDZ- tidiazuron

Sadržaj

1.Uvod .................................................................................................................................................................2

1.1.Mikropropagacija ......................................................................................................................................4

1.2.Faktori koji utiču na rast biljnih kultura in vitro .......................................................................................5

1.2.1.Biljni regulatori rastenja .....................................................................................................................5

2.Cilj rada ............................................................................................................................................................7

3.Materijal i metode ............................................................................................................................................8

3.1.Biljni materijal ...........................................................................................................................................8

3.2.MS hranljiva podloga ................................................................................................................................8

3.3.Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka M. croatica ............................................................9

3.4.Sterilizacija ................................................................................................................................................9

3.5.Statistička analiza ....................................................................................................................................10

4.Rezultati .........................................................................................................................................................11

5.Diskusija .........................................................................................................................................................23

6.Zaključak ........................................................................................................................................................24

7.Literatura ........................................................................................................................................................25

2

1.Uvod

Familija Lamiaceae (usnatice) predstavlja veoma važnu i brojnu grupu biljaka, koju čini više

od 240 rodova. Ovoj familiji pripadaju jednogodišnje i višegodišnje, zeljaste ili žbunaste biljke

(Krivokućin, 1998). Većina predstavnika su aromatične biljke, koje se upotrebljavaju kao lekovite,

začinske i ukrasne biljke. Zbog visokog sadržaja etarskog ulja koje ispoljava antimikrobnu,

antiviralnu i antikancerogenu aktivnost, predstavnici ove familije imaju široku primenu u

tradicionalnoj medicini (Bozin et al., 2006).

Rod Micromeria se prema Bräuchler et al. (2008) rasprostire od Makaronezijsko-

Mediteranske regije do južne Afrike, Indije i Kine. Opisan je od strane Bentham-a 1829.godine. Rod

Micromeria Benth. uključuje oko 130 vrsta rasprostranjenih u Mediteranskom regionu (Diklić,

1974). U flori Srbije i Crne Gore ovaj rod je predstavljen sa 10 vrsta, od kojih su 7 endemične (Šilić,

1979). Rod pripada familiji Lamiaceae. Sastavljen je od žbunova, polužbunova i biljaka sa

dvopolnim i entomofiloznim cvetovima, čija se semena rasejavaju uglavnom vetrom, a ponekad i

vodom ili mravima (Bräuchler et al., 2008). Sve vrste ovog roda su jednogodišnje ili višegodišnje

biljke, često aromatičnog mirisa (Bräuchler et al., 2005).

Slika 1. Rasprostranjenje roda Micromeria Benth. (Bräuchler et al., 2008)

3

Micromeria croatica predstavlja balkansku endemičnu vrstu, čiji se areal pre svega vezuje za

planinski venac Dinarida (Šilić, 1979). Nastanjuje pukotine krečnjačkih i krečnjačko-dolomitskih

stena sa humusom i kamenjare pretplaninskog i visokoplaninskog područja (Forenbacher, 1990).

Staništa ove vrste se mogu naći u rasponu od 150 do preko 2000 m nadmorske visine (Šilić, 1990).

Micromeria croatica (Pers.) Schott je višegodišnja žbunasta vrsta sa dugačkom stabljikom

(20-30 cm), listovi su bez stabljike sa cvetovima koji su ružičasto-ljubičasti ili beli i koji se

pojavljuju od juna do avgusta (Šilić, 1984).

M. croatica je rasprostranjena u Hrvatskoj, Bosni i Hercegovini, Crnoj Gori i Albaniji. Na

teritoriji Srbije zabeležena su staništa u zapadnim delovima zemlje (Tošić, 2015). U Srbiji ova vrsta

je zaštićena na nacionalnom nivou i nalazi se na ,,Listi strogo zaštićenih divljih vrsta biljaka,

životinja i gljiva'' (Sl.gl.R.Srbije, br.36/09). Pošto se radi o ugroženoj i endemičnoj vrsti, pogodna je

za umnožavanje i reintrodukciju u prirodna staništa tehnikama in vitro kultura biljnih ćelija, tkiva i

organa.

Slika 2. Micromeria croatica (Tošić, 2015)

4

1.1.Mikropropagacija

Mikropropagacija po Loberant & Altman (2010) predstavlja aseptičnu kulturu malih delova

(eksplantata) tkiva i organa u izolovanim posudama sa definisanom podlogom i pod kontrolisanim

spoljašnjim uslovima. Trenutno je komercijalno jedna od efikasnijih i praktično orijentisanih

biotehnologija, čiji je rezultat veliki broj klonskih biljaka mnogih biljnih vrsta, koje su u većini

slučajeva bez virusa i patogena.

Cljevi mikropropagacije:

1) Velika razmera klonalne propagacije u slučaju kada vegetativno razmnožavanje nije moguće

i kada je biljni materijal ograničen, ili kada je koeficijent tradicionalnog vegetativnog

razmnožavanja veoma nizak;

2) Početno brzo klonsko razmnožavanje novih varijeteta;

3) Spašavanje embriona gde je germinacija semena i embriona izvršena u in vitro uslovima, da

bi se spasilo inače nevijabilno potomstvo;

4) Dobijanje materijala bez patogena za razmnožavanje;

5) In vitro genske banke za poboljšanje useva;

6) Ukrštanje somatskom ćelijskom genetikom;

7) Početna generacija transgenih (genetski modifikovanih) biljaka.

Mikropropagacija biljaka je integrisani proces u kome su ćelije, tkiva ili organi izolovani sa

odabrane biljke, površinski sterilisani i gajeni u sterilnim uslovima da bi se dobile klonalne

propagule ili biljke. Ovaj proces prolazi kroz najmanje pet ključnih i operativnih faza, od kojih su tri

in vitro. Faza 0 podrazumeva izbor i pripremu biljnog materijala. Faza I predstavlja uvođenje

eksplantata u kulturu in vitro. Faza II je faza brze regeneracije brojnih propagula. Faza III

podrazumeva uspostavljanje kompletno ožiljenih biljaka ili drugih propagacionih jedinica u

uslovima in vitro. Faza IV predstavlja aklimatizaciju i uvođenje u ex vitro uslovima (Debergh et

al.,1990; Pierik, 1987; Loberant, 1994).

5

1.2.Faktori koji utiču na rast biljnih kultura in vitro

Osnovne komponente koje ulaze u sastav hranljive podloge su:

• Voda

• Agar

• Ugljeni hidrati

• Mineralne soli

• Vitamini, kofaktori i organska jedinjenja

• Biljni regulatori rastenja

Na rast in vitro kultura, pored sastavnih komponenti hranljive podloge, utiču i drugi faktori

kao sto su pH vrednost podloge, svetlost i temperatura. pH vrednost hranljive podloge je jedan od

važnih faktora. Kako bi biljna kultura bila gajena na pravi način, pH treba podesiti na vrednosti 5.0-

6.5, jer je to optimalna vrednost pH za rast kulture. Podešavanje pH vrednosti se vrši sa 0,1 N

NaOH, ili HCl. Svetlost je bitan faktor jer reguliše rastenje biljnih in vitro kultura svojim

intenzitetom, kvalitetom i fotoperiodom. Temperatura je, takođe, faktor koji utiče na rast kultura in

vitro. Obično se održava na vrednosti 20-25 ˚C sa tolerancijom odstupanja ± 2˚C.

1.2.1.Biljni regulatori rastenja

Biljni regulatori rastenja (hormoni) imaju ključnu ulogu u regulaciji rastenja biljnih in vitro

kultura. Pored toga što kontorlišu brzinu rastenja jednog organa ili tkiva, mogu da izazovu

diferenciranje organa, odnosno da usmeravaju i usklađuju rastenje kompleksnih struktura kao što su

izdanci ili embrioni. Podeljeni su u pet grupa: auksini, citokinini, giberelini, abscisinska kiselina i

etilen.

Auksini su prvi otkriveni fitohormoni. To su esencijalni fitohormoni i imaju brojne

fiziološke funkcije, od kojih je osnovna da stimulišu ćelijsku deobu, izduživanje koleoptila i

izdanaka. Takođe, uključeni su i u realizaciju fototropskih i geotropskih reakcija biljaka. Auksini

inhibiraju rast primarnog korena, ali istovremeno stimulišu formiranje adventivnih korenova, kao i

bočno grananje korenova. U kulturi in vitro auksini se najviše koriste kao faktori za indukovanje

adventivnih korenova. Glavni prirodni auksin je IAA (indol-3-sirćetna kiselina). U kulturi in vitro

(pored IAA) se često koriste sintetički auksini: NAA (1-naftilsirćetna kiselina), 2,4-D (2,4-

dihlorfenoksisirćetna kiselina) i IBA (indolbuterna kiselina).

6

Citokinini su hormoni koji regulišu ćelijske deobe, zajedno sa auksinima. Pored dejstva na

ćelijske deobe, citokinini imaju i druge funkcije. Oni sprečavaju starenje i zadržavaju hlorofil u

listovima. Za mikropropagaciju njihov najvažniji efekat je da poništavaju apikalnu dominaciju

stabla i tako potpomažu izduživanje aksilarnih pupoljaka u pazuhu listova. Prirodni citokinin koji se

nalazi u biljkama je zeatin (4-hidroksi-3-metil-trans-2-butenil aminopurin) sa svojim derivatima. Za

in vitro kulturu značajni su još i BAP (6-benzilaminopurin), 2iP (2-izopentiladeniin) i TDZ

(tidiazuron).

Giberelini predstavljaju hormone koji stimulišu izduživanje stabla biljaka patuljastog rasta.

Važni su i u regulaciji cvetanja i klijanja semena. U uslovima kulture in vitro, giberelinima se

stimuliše izduživanje izdanaka u procesu mikropropagacije.

Etilen i ABA - hormoni iz ove grupe označeni su kao inhibitori. Utiču na rastenje, ali tako

što zaustavljaju rastenje biljaka. Etilen izaziva starenje, dozrevanje plodova, kao i opadanje plodova

i listova. ABA (abscisinska kiselina) reguliše dormanciju pupoljaka i semena, poništava rastenje

izazvano auksinom, reguliše rastenje u lošim uslovima (stres), kao i odavanje vode kroz stome.

Pošto se radi o inhibitorima, ovi hormoni se retko dodaju kulturama, osim u slučaju posebnih

potreba (Vinterhalter & Vinterhalter, 1996), kao što je sazrevanje somatskih embriona tokom

somatske embriogeneze.

7

2.Cilj rada

• Ispitivanje uticaja različitih koncentracija fitohormona auksina (NAA, IBA) na indukciju,

multiplikaciju i elongaciju aksilarnih pupoljaka Micromeria croatica u kulturi in vitro;

• Ispitivanje uticaja auksina na produkciju biomase eksplantata M.croatica;

• Statistička obrada dobijenih rezultata, njihovo tumačenje i izvođenje zaključka.

8

3.Materijal i metode

3.1.Biljni materijal

U ovom radu korišćeni su vršni i bočni pupoljci biljne vrste M. croatica koja je ranije

uvedena u kulturu in vitro na MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja. Korišćeni eksplantati

bili su približno iste veličine, oko 5 mm i postavljani su na MS podlogu sa različitim

koncentracijama fitohormona auksina (NAA, IBA).

3.2.MS hranljiva podloga

Hranljiva podloga podrazumeva smesu agara, šećera, mineralnih soli, vitamina, inozitola,

aminokiselina, kofaktora i hormona (Vinterhalter & Vinterhalter, 1996). U ovom radu korišćena je

standardna MS podloga (Murashige & Skoog, 1962), čiji je sastav dat u Tabeli 1.

Tabela 1. Sastav MS podloge

Supstanca Težina

(mg/L) NH4NO3 1650

Makro soli

KNO3 1900

CaCl2 X 2H2O 440

MgSO4 X 7H2O 370

KH2PO4 170

MnSO4 X 4H2O 22.3

Mikro soli

ZnSO4 X 7H2O 8.6

H3BO3 6.2

KJ 0.83

Na2MoO4 X 2H2O 0.25

CuSO4 X 5H2O 0.025

CoCl2 X 6H2O 0.025

FeSO4 X 7H2O 27.8

Na2EDTA X

2H2O 37.3

Vitamin B1 0.4

Organska

jedinjenja

Vitamin B6 0.5

Nikotinskakiselina 0.5

Glicin 2

Mioinozitol 100

Saharoza 30000

Agar 7000

9

3.3.Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka M. croatica

Kako bi se ispitao uticaj regulatora rastenja na indukciju aksilarnih pupoljaka M. croatica u

standardnu MS podlogu dodate su različite koncentracije fitohormona NAA ili IBA. U Tabeli 2 su

prikazane korišćene koncentracije. Kontrolna grupa nije sadržala fitohormone.

Tabela 2. Podloge sa različitim koncentracijama fitohormona

Eksplantati M. croatica gajeni su u staklenim teglama istih dimenzija. Tegle su bile

zatvorene metalnim zatvaračima sa otvorom na sredini kroz koji je provučena vata, radi

provetravanja i očuvanja aseptičnih uslova. Svaka pripremljena podloga je bila razlivena u po 3

tegle. Na svaku podlogu postavljeno je po 30 eksplantata, odnosno po 10 eksplantata u jednu teglu.

Kulture su gajene na temperaturi od 21 ± 2ºC i fotoperiodu od 16 sati svetlosti i 8 sati mraka.

Nakon 5 nedelja izmerena je sveža masa biljnog materijala. Potom je evidentiran broj pupoljaka i

merena je dužina pupoljaka na milimetarskom papiru. Eksplantati su zatim ostavljeni u karotnskim

posudama na sobnoj temperaturi da se suše. Nakon 7 dana sušenja izmerena je i suva masa biljnog

materijala. Merenja su vršena na analitičkoj vagi, a svi podaci su statistički obrađeni.

3.4.Sterilizacija

Sterilizacija hranljivih podloga vršena je u autoklavu na temperaturi od 120 ºC u trajanju od

30 minuta. Petri kutije, pincete, skalpeli i ostalo posuđe i pribor pakovani su u aluminijumsku foliju

i sterilisani suvom sterilizacijom 1 - 2 sata na temepraturi od 160 – 180 ºC. Radni prostor je

sterilisan UV lampama u trajanju od najmanje 2 sata, a radna površina je pre i u toku rada stalno

brisana 96%-tnim etil-alkoholom. Neposredno u blizini postavke eksperimenta goreo je plamenik

radi sterilisanja vazduha i pribora.

mg/L

IBA 0.1 0.2 0.3 1

NAA 0.1 0.2 0.3 1

10

3.5.Statistička analiza

Obrada podataka je urađena statističko-grafičkim paketom Statgraphics, procedura ANOVA

i test LSD na nivou značajnosti p˂0.05. Statistička analiza je urađena za svaki parameter i u

tabelama je predstavljena slovima. Statistički značajne razlike predstavljene su različitim slovima,

ista slova označavaju da tih razlika nije bilo.

11

4.Rezultati

Eksplantati M. croatica su gajeni 5 nedelja na hranljivim podlogama, a zatim je evidentiran

broj pupoljaka, merene su vrednosti dužine, visine i sveže mase eksplantata. Nakon sušenja 7 dana

na sobnoj temperaturi merena je suva masa eksplantata. Podaci su statistički obrađeni i prikazani su

u tabelama 3 i 4.

Tabela 3. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria croatica

Hranljiva podloga Eksplantati sa

pupoljcima (%)

Prosečan broj

pupoljaka

Prosečna dužina

pupoljka (mm)

1 MS 70,0 12,63 ± 0,32ab 8,77 ± 0,31e

2 MS + 0.1 NAA 90,0 11,90 ± 0,40a 6,32± 0,29c

3 MS + 0.2 NAA 60,0 11,81 ± 0,38a 6,49± 0,28c

4 MS + 0.3 NAA 76,7 15,50 ± 0,49c 4,84 ± 0,23a

5 MS + 1 NAA 46,7 19,70 ± 0,72d 8,33 ± 0,34d

6 MS + 0.1 IBA 66,7 11,07 ± 0,40a 5,08± 0,32b

7 MS + 0.2 IBA 60,0 12,00 ± 0,40ab 5,35± 0,30b

8 MS + 0.3 IBA 76,7 13,44 ± 0,43b 8,76 ± 0,34e

9 MS + 1 IBA 86,7 26,13 ± 0,44e 6,13± 0,18c Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p0.05

Tabela 4. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria croatica

Hranljiva podloga Visina

eksplantata (mm)

Prosečna sveža

masa

(g)

Prosečna suva masa

(g)

1 MS 21,94 ± 0,20c 0,17 ± 0,003b 0,014 ± 0,0004a

2 MS + 0.1 NAA 19,48 ± 0,31b 0,20 ± 0,009bc 0,021 ± 0,0009b

3 MS + 0.2 NAA 21,67 ± 0,29c 0,16 ± 0,006b 0,017 ± 0,0007ab

4 MS + 0.3 NAA 18,11 ± 0,25a 0,20 ± 0,009bc 0,023 ± 0,0011bc

5 MS + 1 NAA 24,13 ± 0,17e 0,28 ± 0,008c 0,024 ± 0,0006bc

6 MS + 0.1 IBA 21,00± 0,40c 0,16 ± 0,009b 0,016 ± 0,0007ab

7 MS + 0.2 IBA 22,00 ± 0,47c 0,14 ± 0,005a 0,014 ± 0,0005a

8 MS + 0.3 IBA 24,50 ± 0,25e 0,22 ± 0,005c 0,020 ± 0,0006b

9 MS + 1 IBA 23,70 ± 0,15d 0,30 ± 0,004d 0,028 ± 0,0003d Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p0.05

12

Biljni materijal dobijen je pasažiranjem eksplantata koji su uvedeni u kulturu in vitro

2015.god. (Tošić, S., doktorska disertacija). Nakon postavljanja na induktivne podloge, bez obzira

na različite koncentracije regulatora rastenja koje su korišćene, na eksplantatima su se razvijali

brojni aksilarni pupoljci.

Nakon 5 nedelja gajenja eksplantata na hranljivim podlogama, zatim merenja različitih

parametara i statističke obrade dobijenih podataka utvrđene su razlike u broju i dužini formiranih

aksilarnih pupoljaka i produkcije biomase. Različiti korišćeni auksini, NAA i IBA, i njihove

koncentracije nisu uticale na opšti izgled kultura.

Na hranljivoj podlozi MS bez regulatora rastenja na 70% eksplantata došlo je do formiranja

aksilarnih pupoljaka. Eksplantati na ovoj podlozi su bili vitalni, zdravi, zelene boje (Sl. 3). Prosečna

visina eksplantata koji su gajeni na ovoj podlozi iznosila je 21.94 mm (Tab. 3). Na ovim

eksplantatima prosečno je formirano 12.63 pupoljaka. Prosečna dužina pupoljaka bila je 8.77 mm,

statistički značajno viša u odnosu na broj formiranih aksilarnih pupoljaka na eksplantatima gajenim

na podlogama sa auksinima. Prosečna sveža masa eksplantata iznosila je 0.17 g, a prosečna suva

masa 0.014 g (Tab. 4).

Slika 3. Eksplantati M. croatica na MS podlozi bez regulatora rastenja

13

Na hranljivoj podlozi sa najnižom korišćenom koncentracijom NAA (0.1 mg/L) procenat

eksplantata sa aksilarnim pupoljcima bio je veći nego na podlozi bez regulatora rastenja (Tab. 3).

Eksplantati sa ove podloge (Sl. 3 i 4) se nisu morfološki razlikovali od eksplantata gajenih bez

regulatora rastenja, jedino je prosečna visina eksplantata na ovoj podlozi bila nešto manje vrednosti

19.48 mm Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 11.90, a prosečna dužina pupoljaka 6.32

mm. Prosečna sveža masa eksplantata bila je 0.20 g, a prosečna suva masa 0.021 g (Tab. 4).

Slika 4. Eksplantati M. croatica na MS podlozi sa 0.1 mg/L NAA

Slika 5. Pojedinačni eksplantat na MS podlozi sa 0.1 mg/L NAA

14

Na 60% eksplantata, gajenih 5 nedelja na hranljivoj podlozi sa 0.2 mg/L NAA, došlo je do

formiranja i razvića aksilarnih pupoljaka. Njihova prosečna visina bila je 21.67 mm (Tab. 3). Na

ovim eksplantatima (Sl. 6 i 7) prosečno je formirano 11.81 aksilarnih pupoljaka sa prosečnom

dužinom od 6.49 mm. Prosečna sveža masa eksplantata bila je 0.16 g, a prosečna suva masa 0.017 g

(Tab. 4).

Slika 6. Eksplantati M. croatica na MS podlozi sa 0.2 mg/L NAA

Slika 7. Pojedinačni eksplantat na MS podlozi sa 0.2 mg/L NAA

15

Na podlozi sa 0.3 mg/L NAA na 76.7% eksplantata došlo je do formiranja aksilarnih

pupoljaka. Prosečna visina eksplantata bila je 18.11 mm (Tab. 3). Na eksplantatima koji su gajeni na

ovoj podlozi (Sl. 8 i 9) prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 15.50, a prosečna dužina

pupoljaka bila je najmanja i iznosila je 4.84 mm. Prosečna sveža masa eksplantata bila je 0.20 g, a

prosečna suva masa 0.023 g (Tab. 4).

Slika 8. Eksplantati M. croatica na MS podlozi sa 0.3 mg/L NAA

Slika 9. Pojedinačni eksplantat na MS podlozi sa 0.3 mg/L NAA

16

Najmanji procenat eksplantata sa aksilarnim pupoljcima (46.7%) bio je na podlozi sa 1 mg/L

NAA. Ipak, ovi eksplantati su imali statistički značajno veću prosečnu visinu (24.13 mm) u odnosu

na kontrolne eksplantate (Tab. 3). Na ovoj podlozi prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je

19.70, a prosečna dužina pupoljaka 8.33 mm. Prosečna sveža masa eksplantata bila je 0.28 g, a

prosečna suva masa 0.024 g (Tab. 4).

Slika 10. Eksplantati M. croatica na MS podlozi sa 1 mg/L NAA

Slika 11. Pojedinačni eksplantat na MS podlozi sa 1 mg/L NAA

17

Na podlozi sa najnižom korišćenom koncentracijom IBA (0.1 mg/L) 66.7% eksplantata je

formiralo aksilarne pupoljke. Prosečna visina eksplantata bila je 21.00 mm (Tab. 3). Na

eksplantatima koji su gajeni na ovoj podlozi (Sl. 12 i 13) prosečno je formirano 11.07 pupoljaka sa

prosečnom dužinom od 5.08 mm. Prosečna sveža masa eksplantata bila je 0.16 g, a prosečna suva

masa 0.016 g (Tab. 4).

Slika 12. Eksplantati M. croatica na MS podlozi sa 0.1 mg/L IBA

Slika 13. Pojedinačni eksplantat na MS podlozi sa 0.1 mg/L IBA

18

Na hranljivoj podlozi sa 0.2 mg/L IBA 60% eksplantata formiralo je aksilarne pupoljke.

Visina eksplantata nakon 5 nedelja provedenih na ovoj podlozi iznosila je 22.00 mm (Tab. 3). Na

eksplantatima koji su gajeni na ovoj podlozi (Sl. 14 i 15) prosečan broj pupoljaka formiranih po

eksplantatu bio je 12.00, a prosečna dužina pupoljaka je iznosila 5.35 mm, Prosečna sveža i suva

masa eksplantata bila je najmanja u odnosu na mase eksplantata gajenih na ostalim podlogama i

iznosila je 0.14 g, odnosno 0.014 g (Tab. 4).

Slika 14. Eksplantati M. croatica na MS podlozi sa 0.2 mg/L IBA

Slika 15. Pojedinačni eksplantat na MS podlozi sa 0.2 mg/L IBA

19

Na hranljivoj podlozi sa 0.3 mg/L IBA na 76.7% eksplantata došlo je do formiranja

aksilarnih pupoljaka. Prosečna visina eksplantata bila je 24.50 mm (Tab. 3). Na eksplantatima koji

su gajeni na ovoj podlozi (Sl.16 i 17) prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 13.44, a

prosečna dužina pupoljaka bila je 8.76 mm. Prosečna sveža masa eksplantata iznosila je 0.22 g, a

prosečna suva masa 0.020 g (Tab. 4).

Slika 16. Eksplantati M. croatica na MS podlozi sa 0.3 mg/L IBA

Slika 17. Pojedinačni eksplantat na MS podlozi sa 0.3 mg/L IBA

20

Na podlozi sa najvećom korišćenom koncentracijom IBA (1 mg/L) 86.7% eksplantata je

formiralo aksilarne pupoljke. Prosečna visina eksplantata bila je 23.70 mm (Tab. 3). Na

eksplantatima koji su gajeni na podlozi sa 1 mg/L IBA (Sl. 18 i 19) prosečan broj pupoljaka po

eksplantatu je bio 26.13 statistički najznačajnije povećanje u odnosu na podlogu bez regulatora

rastenja. Prosečna dužina pupoljaka bila je 6.13 mm. Prosečna sveža i suva masa eksplantata bile su

najveće i iznosile su 0.30 g, odnosno 0.028 g (Tab. 4).

Slika 18. Eksplantati M. croatica na MS podlozi sa 1 mg/L IBA

Slika 19. Pojedinačni eksplantat na MS podlozi sa 1 mg/L IBA

21

Uporedni prikaz broja, dužine i visine aksilarnih pupoljaka u odnosu na podloge sa različitim

koncentracijama fitohormona prikazan je na histogramu 1. Najveći prosečan broj pupoljaka po

eksplantatu zabeležen je na podlozi MS sa 1 mg/L IBA. Najveću prosečnu dužinu imali su pupoljci

na eksplantatima gajenim na podlozi MS bez fitohormona i na podlozi sa 0.3 mg/L IBA.

Uticaj fitohormona ispitivan je i na produkciju biomase. Izvršeno je merenje prosečne visine

eksplantata, kao i sveže mase biljnog materijala, a nakon 7 dana sušenja na sobnoj temperaturi

izvršeno je merenje suve mase. Uporedni prikaz visine eksplantata, sveže i suve mase eksplantata u

odnosu na podloge sa različitim koncentracijama fitohormona prikazan je na histogramu 2. Najveća

prosečna visina eksplantata bila na podlogama MS sa 1 mg/L NAA i 0.3 mg/L IBA, dok je najveća

produkcija sveže i suve mase bila na podlozi sa 1 mg/L IBA.

Histogram 1. Uporedni prikaz uticaja različitih koncentracija fitohormona na broj i dužinu aksilarnih

pupoljaka M. croatica

0

5

10

15

20

25

30

MS 0.1 NAA 0.2 NAA 0.3 NAA 1 NAA 0.1 IBA 0.2 IBA 0.3 IBA 1 IBA

Prosečni broj

pupoljaka

Prosečna dužina

pupoljaka

22

.Histogram 2. Uporedni prikaz uticaja različitih koncentracija fitohormona na visinu, svežu i suvu

masu izdanaka M. croatica

0

5

10

15

20

25

30

MS 0.1 NAA 0.2 NAA 0.3 NAA 1 NAA 0.1 IBA 0.2 IBA 0.3 IBA 1 IBA

Prosečna sveža masa

Prosečna suva masa

Prosečna visina eksplantata

23

5.Diskusija

U ovom radu ispitivan je uticaj fitohormona auksina NAA i IBA (u različitim

koncentracijama) na indukciju aksilarnih pupoljaka na eksplantatima M. croatica, kao i na

produkciju njihove biomase. Rastenje i razviće eksplantata pod dejstvom različitih koncentracija

fitohormona auksina upoređivano je sa kontrolnom grupom, koja nije sadržala regulatore rastenja.

Na eksplantatima gajenim na MS hranljivoj podlozi koja nije sadržala regulatore rastenja

došlo je do formiranja pupoljaka. Prosečno po eksplantatu formirano je 12.63 aksilarnih pupoljaka

sa prosečnom dužinom od 8.77 mm. Slični rezultati dobijeni su gajenjem eksplantata M. pulegium

(Stojičić et al. 2016), M. croatica (Tošić, 2019) na MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja.

Auksini IBA i NAA korišćeni su u cilju indukcije aksilarnih pupoljaka (Ramak et al., 2011;

Bakhtiar et al., 2016). Oba auksina koja su korišćena u niskim koncentracijama (0,1 i 0,2 mg/L) nisu

statistički značajno uticali na indukciju aksilarnih pupoljaka M. croatica. Njihov broj kao i dužina

bili su manji od onih kod kontrolnih eksplantata. Više korišćene koncentracije oba auksina (0,3 i 1

mg/L) uticale su stimulativno na indukciju aksilarnih pupoljaka ove vrste. Na podlozi sa 1 mg/L

IBA prosečan broj aksilarnih pupoljaka bio je najveći i iznosio je 26.13, dvostruko veći od broja

aksilarnih pupoljaka na kontrolnim eksplantatima. Dužina aksilarnih pupoljaka na eksplantatima

gajenim na svim korišćenim podlogana bila je manja od dužine pupoljaka sa kontrolnih eksplantata

osim u slučaju eksplantata gajenih na podlozi sa 0,3 mg/L IBA. Između dužina aksilarnih pupoljaka

sa kontrolnih eksplantata i eksplantata sa ove podloge nema statistički značajnih razlika. Slični

rezultati postignuti su u procesu mikropropagacije Micromeria croatica (Kereša et al., 2004).

U ovom istraživanju ispitivan je i uticaj različitih tretmana na masu M. croatica. Najveća

produkcija biomase je izmerena na podlozi MS sa 1 mg/L IBA. Najveća prosečna sveža masa

iznosila je 0.30 g, dok je najveća prosečna suva masa iznosila 0.028 g.

24

6.Zaključak

Micromeria croatica se uspešno gaji u kulturi in vitro. Eksplantati su uglavnom, u zavisnosti

od koncentracije korišćenog fitohormona, uspešno rasli na hranljivim podlogama. To je praćeno

evidentiranjem prosečnog broja pupoljaka po eksplantatu, merenjem prosečne dužine pupoljaka, kao

i visine eksplantata i prosečne sveže i suve mase.

Najveći prosečan broj pupoljaka po eksplantatu (26.13) zabeležen je na podlozi MS sa 1

mg/L IBA. Najveća vrednost prosečne dužine pupoljaka bila je na MS podlozi bez fitohormona

(8.77 mm), kao i na podlozi MS sa 0.3 mg/L IBA (8.76 mm).

Najveće vrednosti prosečne visine eksplantata bile su na MS podlozi sa 1 mg/L NAA (24.13)

i na MS podlozi sa 0.3 mg/L IBA (24.50).

Na MS podlozi sa 1 mg/L IBA izmerena je najveća prosečna sveža i suva masa. Najveća

prosečna sveža masa iznosila je 0.30 g, dok je najveća prosečna suva masa bila 0.028 g.

Rezultati dobijeni u ovom radu pokazuju da se metode kulture in vitro mogu uspešno

primenjivati na vrsti M. croatica. Ovom metodom se od male početne količine biljnog materijala

može dobiti veliki broj biljaka, koje se, ako se ukaže potreba, mogu reintrodukovati na prirodno

stanište ove vrste.

25

7.Literatura

1. Bakhtiar, Z., Hossein Mirjalili, M., Sonboli, A. (2016) In vitro callus induction and

micropropagation of Thymus persicus (Lamiaceae), an endangered medicinal plant, Crop

breeding and Applied Biotechnology 16: 48-54.

2. Bentham, G. (1829) Micromeria Bot Reg 15: t. 1282.

3. Bozin, B., Mimica-Dukić, N., Simin, N., Anackov, G. (2006) Characterization of the

Volatile Composition of Essential Oils of Some Lamiaceae Spices and the Antimicrobial

and Antioxidant Activities of the Entire Oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

54: 1822–1828.

4. Bräuchler, C. O Ryding and G Heubl (2008) The genus Micromeria (Lamiaceae), a

synoptical update. Willdenowia 38, 363-410.

5. Bräuchler, C., Meimberg, H., Abele, T., Heubl, G. Polyphyly of the genus Micromeria

(Lamiaceae): Evidence from cpDNA sequence data. Taxon. 2005;54:639–50.

6. Debergh, P., Zimmerman, R., editors. Micropropagation: technology and application.

Dordrecht: Kluwer Academic; 1990. p. 484.

7. Diklić, N. (1974) Micromeria Benth. In: Josifovic M. (ed.) Flore de la République

Socialiste de Serbie, Vol. 6. Académie Serbe des Sciences et des Arts, Belgrade, pp. 458–

462.

8. Forenbacher, S. (1990) Velebit i njegov biljni svijet. Školska knjiga, Zagreb, 587 – 589.

9. Kereša, S., Andrijanić, Z., Kremer, D., Habuš Jerčić, I., Barić, M., Batelja Lodeta, K.,

Bolarić, S., Bošnjak Mihovilović, A. (2004) Efficient micropropagation and rooting of

Micromeria croatica (Pers.) Schott (Lamiaceae), Faculty of Agrobiotechnical Sciences

Osijek, Agricultural Institute Osijek.

10. Krivokućin, I. (1998): Lekovite biljke familije Lamiaceae Lindley u flori Zapadne Bačke.

Specijalistički rad, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Novom Sadu.

11. Loberant, B. Industrial plant micropropagation. 1st International Conference on

Biotechnology; Jerusalem; 1994.

12. Loberant, B., Altman, A. (2010) Micropropagation of plants, John Wiley & Sons, Inc.

13. Murashige, T., Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue cultures. Phisol. Plant. 15: 473-497

14. Pierik, RLM. in vitro culture of higher plants. Dordrecht: Martinus Nijhoff; 1987. In vitro.

15. Ramak, P., Sharifi, M., Kazempour Osaloo, S., Ebrahimzadeh, H., Behmanesh, M. (2011)

Studies on seed germination and in vitro shoot multiplication of Satureja khuzistanica

Jamzad, an important medicinal plant, African Journal of Biotechnology Vol. 10(83), pp.

19407-19414.

16. Šilić, Č. (1979) Monographie der Gattungen Satureja L., Calamintha Miller, Micromeria

Benth., Acinos Miller und Clinopodium L. in der Flora Jugoslawiens, Zemaljski Muzej

BiH, Sarajevo, pp. 172– 262.

26

17. Šilić, Č. (1984). Endemične biljke (p. 114). Sarajevo: Svjetlost.

18. Šilić, Č. (1990) Endemic plants (In Croatian). IP Svjetlost, Sarajevo.

19. Stojičić D, Tošić S, Slavkovska V, Zlatković B, Budimir S, Janošević D, Uzelac B (2016)

Glandular trichomes and essential oil characteristics of in vitro propagated Micromeria

pulegium (Rochel) Benth. (Lamiaceae). Planta 244(2): 393-404.

20. Stojičić D, Tošić S, Slavkovska V, Zlatković B, Budimir S, Janošević D, Uzelac B (2016).

Glandular trichomes and essential oil characteristics of in vitro propagated

Micromeriapulegium (Rochel) Benth. (Lamiaceae). Planta 244(2): 393-404.

21. Tošić, S., Stojičić, D., Slavkovska, V., Mihajilov-Krstev, T., Zlatković, B., Budimir,

S., Uzelac, B.(2019) Phytochemical composition and biological activities of native and in

vitro-propagated Micromeria croatica (Pers.) Schott (Lamiaceae) (Article). PLANTA,

(2019), vol. 249 br. 5, str. 1365-1377.

22. Tošić, S. (2015) Fiziološki i biohemijski aspekti propagacije endemičnih vrsta Micromeria

pulegium (Rochel) Benth. i Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro, Doktorska

disertacija, - Biološki fakultet, Beograd.

23. Vinterhalter, D., Vinterhalter, B. (1996) Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka. Axial,

P. O., Beograd.

Biografija kandidata

Jelena Kričak, rođena je u Nišu 28.10.1993. godine. Osnovnu školu „Stefan Nemanja" završila je

u Nišu, nakon čega upisuje Gimnaziju „9.maj" u Nišu, koju završava 2012. godine. Iste godine

upisuje Prirodno-matematički fakultet Univerziteta u Nišu na Departmanu za biologiju i

ekologiju, gde završava Osnovne i Master Akademske studije Biologije.

Прилог 5/1

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Јелена Кричак

Ментор, МН: Драгана Стојичић

Наслов рада, НР:

Утицај ауксина на индукцију аксиларних пупољака Micromeria

croatica (Pers.) Schott in vitro

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2019.

Издавач, ИЗ: Ауторскирепринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: 26стр.; 19 слика; 4 табеле; 2 хистограма

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Биологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria croatica, микропропагација, аксиларни пупољци, НАА,

ИБА.

УДК 577.175.1:581.44+582.929.4

Чувасе, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ:

Micromeria croatica је вишегодишња жбунаста биљка и представља балканску

ендемичну врсту, чији се ареал пре свега везује за планински венац Динарида. Станишта ове врсте се могу наћи у распону од 150 до преко 2000 м надморске висине.

M. croatica је распрострањена у Хрватској, Босни и Херцеговини, Црној Гори и

Албанији. На територији Србије забележена су станишта у западним деловима земље. Пошто се ради о угроженој и ендемичној врсти, погодна је за умножавање и

реинтродукцију у природна станишта техникама in vitro култура биљних ћелија, ткива и

органа. Највећи просечан број пупољака по експлантату био је на подлози MS са 1mg/L IBA.Највећа просечна дужина пупољака била је на MS хранљивој подлози без

регулатора растења. Највећа просечна висина експлантата била је на MS подлози са 0.3

mg/L IBA. Највећа просечна свежа и највећа просечна сува маса биле су на подлози МС

са 1mg/L IBA.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

Члан, ментор: Др Драгана Стојичић

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Jelena Kričak

Mentor, MN: Dragana Stojičić

Title, TI: The influence of auxin on the axillary buds induction of Micromeria croatica

(Pers.) Schott in vitro

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2019

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

26 p. ; 19 pictures ; 4 tab. ; 2 chart.

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Biology

Subject/Key words, S/KW: Micromeria croatica, micropropagation, axillary buds, NAA, IBA.

UC 577.175.1:581.44+582.929.4

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: Micromeria croatica is a perennial shrub, and is a Balkan endemic species whose area is

primarily associated with the mountain range of Dinarides. Habitats of this species can be

found in the range of 150 to over 2000 m above sea level. M. croatica is widespread in Croatia, Bosnia and Herzegovina, Montenegro and Albania. In the territory of Serbia,

habitats have been recorded in the western parts of the country. Since it is an endangered

and endemic species, reproduction and reintroduction into natural habitats of in vitro culture techniques of plant cells, tissues and organs is suitable. The highest average number

of buds per explant was on MS medium with 1mg/L IBA. The highest average length of

buds was on MS medium without growth regulator. The highest average height of explants was on MS medium with 0.3 mg/L IBA. The highest average bindings and the highest

average dry weight were based on MS with 1mg/L IBA.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor: Dr Dragana Stojičić