University of Groningen

Polyamide synthesis by hydrolasesSchwab, Leendert Willem

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.

Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of record

Publication date:2010

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):Schwab, L. W. (2010). Polyamide synthesis by hydrolases. s.n.

CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

Download date: 27-07-2021

 

Chapter 2 N435‐catalyzed ring‐opening polymerization of β‐propiolactam 

2.1 ABSTRACT  

The successful polymerization of β‐propiolactam to poly(β‐alanine) catalyzed by the immobilized lipase B of Candida antarctica yeast (N435) is reported in this chapter. From a collection of lactam rings (4, 7, 9 and 13 membered rings) the 4‐membered β‐propiolactam is a good substrate for the enzyme. The synthesis of the monomers and the subsequent polymerization is reported and the influence of the reaction conditions is discussed. The polymer is characterized by 1H‐NMR spectroscopy and MALDI‐ToF mass spectrometry. Cyclic reaction products were removed and pure linear poly(β‐alanine) is obtained.  

Reaction conditions are of great influence on the activity of the N435 in this reaction and the resulting polymer. The best results were obtained with N435 (dried for 24 hours  in  vacuo  at  46  °C)  in  toluene  of  55  °C  for  a  period  of  96  hours.  Control experiments showed that initiation by water or carrier material does not take place. Polymerization of  the hydrolyzed  lactam  ring,  the amino acid β‐alanine was not feasible by  the N435 catalyst. Showing  that  the β‐propiolactam  ring  is  the actual monomer for the reaction.  

It was expected that the ring‐opening polymerization of β‐propiolactam proceeds according to the established mechanism for enzymatic ε‐caprolactone polymerization. In this mechanism a hydroxy acid is the activated monomer, in our case this molecule is resembled by the amino acid β‐alanine. From the observation that β‐alanine cannot be polymerized it is concluded that the polymerization does not proceed according to the mechanism for enzymatic lactone polymerization. A new mechanism, developed by molecular modeling that explains the experimental results, is briefly discussed.    

‐ 18 ‐      

2.2 INTRODUCTION  

The enzymatic ring‐opening polymerization of lactones, lactides, cyclic carbonates and depsipeptides by various hydrolases has been studied extensively over the past decade as reviewed by different authors1,2,3 To the best of our knowledge nothing was published  on  the  enzymatic  ring‐opening  polymerization  of  lactams.  Enzymes catalyze reactions at ambient temperatures with a high selectivity and they can do so outside their natural environment in an organic solvent.4,5 When enzymes can be used in the synthesis of polyamides a reduction of the energy consumption and the use of less  toxic  compounds  in  the  production  process  of  polyamides will  benefit  the environment.  

Poly(β‐alanine) or nylon 3  is applied  in  in e.g. cosmetics6, water purification7 and construction.8 The conventional synthesis of this polymer is by anionic polymerization of  acrylamide  in  the  presence  of  a  strong  base.9 Unfortunately,  this method  of polymerization leads to branched polymers.10 Direct polymerization of β‐alanine or ring‐opening  polymerization  of  β‐propiolactam  by  conventional methods  is  not possible.  

This chapter introduces the enzymatic ring‐opening polymerization of β‐propiolactam as a new way to obtain linear poly‐β‐alanine.  

2.2.1 Cal‐B catalyzed ring‐opening polymerization of lactones 

Enzymatic ring‐opening polymerization was first reported in 1993 and involved the ring‐opening polymerization of ε‐caprolactone and δ‐valerolactone by lipases from Pseudomonas fluorescens, Candida cylindracea and porcine pancreatic lipase.3,11  

Unsubstituted lactones with a ring size from 4 to 16 have since been polymerized by using  Candida  antarctica  lipase  B  (Cal‐B)  among  other  lipases  from  different microorganisms see Figure 2‐1. But also the methyl, ethyl and propyl substituted lactones were polymerized by lipases from different origins. 

 

Figure 2‐1. Reaction scheme of the Cal‐B catalyzed ring‐opening polymerization of lactones. 

The reaction conditions for the ring‐opening polymerization of ε‐caprolactone have been  studied  towards  the  influence  of  water  content12,  organic  solvent13  and temperature.13,14  Decreasing the amount of water in the system produced the highest molecular weight polyester. Too much water present resulted in hydrolysis of the 

‐ 19 ‐      

desired polyester. However, not all the water should be removed since the enzymes need a small amount of water present as part of their structure referred to as bound or structural water.15  

Although the polymerization of lactones was the fastest at 90 °C, a higher degree of polymerization was found at 60 °C. This is attributed to the decreased amount of growing  chains  compared  to  the  polymerization  at  90  °C.13  The  reaction  speed however dropped significantly by lowering the temperature. 

Mechanism of enzyme catalyzed lactone polymerization 

The  generally  accepted  mechanism  for  the  ring‐opening  polymerization  of  ε‐caprolactone by Cal‐B proposed by different authors12,16 is depicted in Figure 2‐2.  

The first step is the formation of an acyl‐enzyme intermediate (see chapter 1) by a nucleophilic attack of serine105 on the ε‐caprolactone carbonyl group. Secondly a hydroxy acid is released from the serine moiety by hydrolysis of the acyl‐enzyme intermediate. In the third step a  new intermediate is attacked by the hydroxy acid and 

 

Figure 2‐2. General accepted mechanism for the enzymatic ε‐caprolactone polymerization 

‐ 20 ‐      

the growing chain is released from the serine.  

Polymers are formed when the serine forms an acyl‐enzyme complex with a growing chain and  is subsequently attacked by a hydroxy acid of one or more monomeric units. The acyl‐enzyme complex can be formed with a carbonyl at the chain end and with a carbonyl group of the main chain.  

It is a common feature of all polycondensations to form macrocycles17 and this was also found for enzymatic lactone polymerizations.18,19    

β‐Lactams are suitable substrates for Cal‐B 

The enzymatic hydrolysis of β‐lactams is a convenient method to obtain enantiomeric pure  β‐amino  acids20,21,22  and  shows  that  some  enzymes  are  capable  of  binding β−lactams in their active site and able to perform reactions on them.  

The number of  lipases  available  for  this  reaction however,  is  limited due  to  the irreversible binding of β‐Lactams and β‐lactones to the serine in the active site of some lipases and proteases.23,24 For this reason β‐lactams are used in antibiotics. They bind irreversibly to enzymes that are involved in cross‐linking reactions in bacterial cell wall synthesis, the peniciline binding proteins.25,26 Limiting the growth of bacteria is closely related to the inhibition of these enzymes.25,27  

One of the lipases that is not inhibited by these compounds is Candida antarctica lipase B. It is capable of  performing the enantioselective ring opening of β‐lactams without deactivation as was shown by Fülop and coworkers28 see Figure 2‐3. Starting from a racemic mixture only one of the enantiomers was hydrolyzed. Substituents on the β‐lactam can be cyclic and bicyclic with or without aromaticity.29,30,28,31 

NH

O

NH

OCOOH

NH2

+Cal-B, H2O

organic solvent 

Figure 2‐3. Hydrolysis of  substituted β‐lactams.28  

The reaction was performed in the organic solvents toluene and isopropylether or a mixture of these solvents with different alcohols. Reasonable conversions (30 % or higher) were found with long chain alcohols and secondary or tertiary alcohols as a co‐solvent,30 but hydrolysis was also performed in a solvent free system.28 In addition, the enzymatic formation of lactam rings (sizes 5‐7) by ring closure of β‐amino acid esters in organic solvents was reported by Arie Gutman and coworkers.32 The reaction was catalyzed by porcine pancreatic lipase and different proteases.  

‐ 21 ‐      

2.2.2 Lactams chosen are the analogues of polymerized lactones  

For the enzymatic ring opening polymerization the 4, 7, 9 and 13 membered lactam rings were chosen as monomers. For each lactam monomer the lactone equivalent is listed  in  Table  2‐1.  All  the  mentioned  lactones  were  already  polymerized  by others2,33,34 using Candida antarctica lipase B as the catalyst.  

The Mn mentioned for the lactone polymers is reached by using N435 or free Cal‐B except for the octanolide that was polymerized by porcine pancreatic lipase (PPL). Other lipases that polymerize lactones are Candida cylindracea lipase (β‐propiolactone), porcine  pancreatic  lipase  (β‐butyrolactone)  and  Pseudomonas  cepacia  lipase (octanolide). Candida antarctica lipase B is not always the best catalyst but it is the most versatile  of  the  lipases  mentioned  and  accepts  most  of  the  lactones.  The polymerizations of  the  lactones were performed  in  the bulk or  in a hydrophobic solvent like toluene, isooctane or supercritical CO2.  

Table 2‐1. Lactone monomers for Cal‐B, the Mn reached and their lactam equivalents.2,33,34  

Ringsize  Lactam  Lactone   Mn (g mol‐1) polylactones 

4  β‐propiolactam  β‐propiolactone  510 

  β‐methyl‐β‐propiolactam1  α‐methyl‐β‐propiolactone  ~10 000 

7  ε‐caprolactam  ε‐caprolactone  44800 

9  η‐caprylolactam  octanolide2  5200 

13  ω‐laurolactam  dodecanolide(Cal‐B)  6100 

1 referred to as  4‐methyl‐azetidin‐2‐one in the following section, the α‐methyl‐lactam was not available.  

2 Polymerized by porcine pancreatic lipase (PPL) 

From  the  mentioned  lactams  only  the  ω‐laurolactam  and  ε‐caprolactam  are commercially  available.  The  β‐propiolactam,  4‐methylazetidin‐2‐one  and  the capryllactam were synthesized in our laboratory. Toluene and i‐PrO2 are selected as possible solvents for the enzymatic polymerization of the mentioned lactams. 

Synthesis of β‐propiolactam 

The  lactam  equivalent  of  β‐propiolactone was  produced  by  2,2‐cycloaddition  of chlorosulfonylisocyanate to vinylacetate followed by two reduction steps (see Figure 2‐4).35,36,37,38 

‐ 22 ‐      

 

Figure 2‐4. Reaction scheme of the synthesis of  β‐propiolactam by a cycloaddition reaction. 

Synthesis of 4‐methyl‐azetidin‐2‐one 

Two  reactions  were  used  to  synthesize  the  4‐methyl‐azetidin‐2‐one  since  the corresponding olefin was not available to use the cycloaddition method used for the synthesis of β‐propiolactam. Two ring closure reactions starting with  

This monomer was synthesized by ring closure of D,L‐3‐amino butyric acid using triphenylphosphine  /  tetrachloromethane  (method  I, Figure 2‐5)  39   or 2‐chloro‐1‐methylpyridinium iodide (method II, Figure 2‐6) 40 as a transfer agent. 

 

Figure 2‐5. Reaction scheme of the synthesis of 4‐methyl‐β‐propiolactam by method I. 

The  4‐methyl‐azetidin‐2‐one  was  obtained  but  the  triphenylphosphine  oxide produced in the reaction can hardly be removed from the reaction mixture. In method II 2‐chloro‐1‐methylpyridinium iodide is used as the agent (Figure 2‐6).40  

 

Figure 2‐6. Raction scheme of the synthesis of 4‐methyl‐β‐propiolactam by method II. 

In this reaction a N‐methylpyridone is formed that can be removed from the product mixture by column chromatography to yield the desired product. For both methods it must be noted that a polymerization might start under basic reaction conditions as observed by Escalante and coworkers.41 

‐ 23 ‐      

 Synthesis of capryllactam 

Capryllactam was synthesized according to the method of DSM42 and involves the Beckman rearrangement43 of cyclooctanoneoxime (Figure 2‐7.). The reaction starts with  the  oximation  of  cyclooctanone  to  cyclooctanoneoxime  by  a  reaction with hydroxylammonium sulphate under acidic (pH 4.5) conditions. The rearrangement was performed with sulfur trioxide. Capryllactam is extracted with toluene from the reaction mixture and obtained in 41 % yield.  

 

Figure 2‐7. Reaction scheme for the synthesis of capryllactam via a Beckman rearrangement of the oxime. 

‐ 24 ‐      

2.3 EXPERIMENTAL  

2.3.1 Materials and methods 

Materials 

Novozyme 435 (N435) kindly donated by Novozymes company was dried in vacuo for at least 24 hours over P2O5 (ACROS) before use. For the control reactions N435 was deactivated by heating it to 150 °C for 2 h. Toluene (Lab‐Scan) was purified prior to use by distillation from sodium. ε‐Caprolactone (Union Carbide) and vinyl acetate (ACROS) were dried with CaH2 (Merck) and distilled. β‐Alanine (Fluka) and β‐alanine ethylester (Sigma‐Aldrich) were dried for 48 hours at room temperature over P2O5 in vacuo.  ε‐Caprolactam,  ω‐laurolactam  were  obtained  from  Sigma‐Aldrich. β−Propiolactam was  bought  from Maybridge  or  synthesized  in  our  laboratory. Capryllactam and 4‐methyl‐azetidin‐2‐one were synthesized in our laboratory. All lactam monomers were dried over P2O5 before use. Na2SO3∙7H2O was prepared from anhydrous Na2SO3 (Sigma‐Aldrich). The water used is demineralized water from an in house tap.  

Other chemicals were used as  received  from  their suppliers: Trifluoroacetic acid, sulfuric acid (95‐97%), Na2SO4, NaOH, ammonia, triphenylphosphine, NaCl, ethanol, and ortho‐dichlorobenzene were obtained from Merck. Chlorosulfonyl  isocyanate (98%),  Acetonitril,  NaHSO3,  ethyl  acetate,  DL‐aminobutyric  acid,  triethylamine, ethylacetate and 1,4‐dioxane were obtained from ACROS. Hydroxylamine sulfate, cyclooctanone,  ammonium  sulfate,  NaHCO3,  α‐cyano‐4‐hydroxycinnamic  acid, diisopropylether and  2‐chloro‐1‐methylpyridinium iodide were obtained from Sigma‐Aldrich. Methanol and acetone were obtained from Lab‐Scan and tetrachloromethane was obtained from Riedel de Haen. 

Methods 

1H‐NMR spectra were recorded using a 300 MHz and 400 MHz Varian VXR apparatus using deuterated chloroform or deuterium oxide as the solvent. 

MALDI‐ToF‐MS measurements were performed on a Biosystems Voyager‐DE PRO spectrometer in reflector mode with α‐cyano‐4‐hydroxycinnamic acid as the matrix and acetonitril/H2O (50/50) with 0,5 % TFA as the solvent. Calibration was performed with a mixture consisting of matrix dimer, bradykinin, angiotensin I and ACTH 18‐39. The spots were created by mixing the matrix solution (10 mg mL‐1) with the sample solution  (3 mg mL‐1)in a 1:1 ratio by volume. Sometimes a 10‐fold dilution of  the sample is needeed to obtain a decent mass spectrum. 

‐ 25 ‐      

UV/VIS  measurements  were  carried  out  on  a  PYE  UNICAM  SP8‐200  UV/VIS spectrophotometer.  

A  TA  instruments  DSC  Q1000 was  used  to  determine  the melting  point  of  β‐propiolactam.  

Short‐path distillation was carried out with a Büchi GKR‐50 Kugelrohr apparatus.  

Elemental analysis was done using an EuroVector EA3000. 

2.3.2 Synthesis of the monomers 

Synthesis of β‐propiolactam 

Vinyl acetate (100 mL; 1.08 mol) was cooled using a acetone/liquid N2 mixture and to this  chlorosulfonyl  isocyanate  (17.4 mL,  0.2 mol) was  added while  keeping  the temperature between 20 and 25 °C. After addition of the isocyanate the mixture was stirred for 20 minutes and subsequently cooled rapidly to ‐20 °C.  

The obtained red‐brownish chlorosulfonyl‐β‐lactam (I) solution was added dropwise to a mixture of  water (20 mL), ice (90 g), sodium bicarbonate (47 g; 0.56 mol) and sodium sulphite heptahydrate (33 g; 0.13 mol) and stirred vigorously. The color of the reaction mixture changes to yellow. The reaction mixture was stirred for 15 minutes until no more gas evolved. After filtration, the vinyl acetate phase was separated and dried over Na2SO4 and NaHCO3 and was filtrated again. The residual vinylacetate was removed by rotary evaporation at 40 °C. The water phase was extracted 5 times with cold (‐15 °C) dichloromethane. The dichloromethane solution was added to the residue  of  the  organic  phase.  The  solvent was  removed  by  rotary  evaporation, yielding the dark yellow oily 4‐acetoxy‐2‐azetidinone (II) yield (40 % determined by weight). 

The crude 4‐acetoxy‐2‐azetidinone was dissolved in 20 mL of water. This solution was added to KBH4 (1.5 moles excess compared to II) in water (20 mL) whilst keeping the temperature of the reaction mixture at 30 °C. When no more gas evolved the mixture was neutralized with a sulfuric acid solution (1 M). After filtration the water was evaporated and the residue mixed with chloroform. Filtration and evaporation of the solvent yields β‐propiolactam. The  resulting crystals were purified by short path distillation, yielding a white crystalline product (20 %) m.p. 75 °C  (lit 73‐76 °C).  

1H‐NMR (CDCl3): δ= 5.72 (s, 1H; NH) 3.31(t,J=4.2 Hz 2H; CH2) ; 3.03(t, J=4.05 Hz, 2H; CH2)  

Elemental analysis(C3H5NO9) : calcd. C 50.69, H 7.00, N 19.71, O 22.51; Found C 50.57, H 7.13, N 19.54, O 22.76  

‐ 26 ‐      

Synthesis of capryllactam 

The  reactions  are  carried  out  in  500 mL  3‐neck  roundbottom  flasks  for  efficient cooling. A solution of hydroxylammonium sulphate (30 g; 0.183 mole) in water (25 % m/v)  was  heated  to  75  °C  and  while  stirring  vigorously  small  amounts  of cyclooctanone (15.4 g; 0.121 mole) were added while maintaining a pH of 4.5 using a sodium hydroxide solution (25 % w/w). The mixture was stirred at 75 °C for 1 hour. The organic layer (cyclooctanone oxime) was separated and nitrogen was bubbled overnight  through  the  reaction mixture  at  55  °C  to  reduce  the water  content. A solution (0.6 %) of sulfur trioxide was created by dissolving oleum (21.6 mL, 0.16 mole) in cold (0 °C) sulfuric acid (65 mL). The solution was kept between 0 and 5 °C while adding the cyclooctanone oxime (14.24 g, 0.1 mole) in 3 hours time yielding a bright orange solution. 

Sulfuric acid (30 mL) was cooled to 0 °C and a 65 % oleum solution (10 mL, 0.067 mole) was added dropwise to this to obtain a solution of 0.6 % free sulfur trioxide in sulfuric acid. To this the orange cyclooctanone oxime solution (65 mL, 0.1 mole in 0.6 % oleum) was added. The  reaction was  started by  the addition of 10 mL of  this solution and subsequent heating to 110 °C. The temperature was regulated by the dropwise  addition  of  the  remaining  cycloctanone  oxime  solution. After  this  the reaction mixture was stirred  for an additional 30 minutes yielding a dark brown solution. 

The brown capryllactam solution  is added dropwise  to a solution of ammonium sulphate (200 mL, 3.18 M) while maintaining a pH of 4.5 by adding ammonia with a second dropping funnel. During this reaction toluene is added (1:9 m/V) to solubilize the capryllactam. After separation the toluene is removed by rotary evaporation and the residue (7.3 g, 41 %) is stirred with a 4 mg equivalent  sodium hydroxide solution as a 50 % (w/w) solution for 30 minutes. The water is removed and a white solid is obtained by distillation under reduced pressure. 

1H‐NMR (CDCl3): δ= 5.81 (s, 1H; NH) 3.73 (m, 2H; CH2‐NH) 2.42 (m, 2H; CH2‐C=O) 1.82 (m, 4H; CH2) 1.58 (m, 6H; CH2) 

Method I. Synthesis of 4‐methyl‐β‐propiolactam39 

To  a  suspension  of  DL‐3‐aminobutyric  acid  (212  mg;  2.0  mmol)  and triphenylphosphine  (624  mg,  2.4  mmol)  in  acetonitril  (20  mL)  were  added tetrachloromethane (0.4 mL) and triethylamine (0.34 mL). The mixture is heated to 80 °C  and  stirred  for  24  hours  under  a  nitrogen  atmosphere. When  the  reaction  is finished the solvent is removed under reduced pressure and the residue is mixed with dichloromethane (40 mL). This solution is washed with brine (2x 10 mL). The organic layer  is  collected, dried with  sodiumsulphate  and  the  solvent  is  removed under reduced pressure. The residue has a large content of triphenylphosphineoxide that can be removed partially by dissolving everything in methanol and subsequently add 

‐ 27 ‐      

water untill  the phosphine  compounds precipitate. After  filtration  the  solvent  is removed. During rotary evaporation more phosphine compounds precipitate and they are removed by filtration. The product mixture is yellowish oil. From this oil two drops of pure 4‐methylazetidin‐2‐one could be obtained using short path distillation.  

1H‐NMR (D2O): δ= 3.71 (m, 1H, CH); 2.99‐2.93 (d, 2H, CH2); 2.94‐2.93 (d, 1H, CH2); 2.45‐2.40 (d, 2H, CH2); 1.21‐1,19 (q, 3H, CH3) 

Method II. Synthesis of 4‐methyl‐β‐propiolactam40  

To  a  suspension  of  DL‐3‐aminobutyric  acid  (512  mg,  5  mmol)  and  2‐chloro‐1‐methylpyridinium  iodide  (1.405  g,  5.4 mmol)  in  acetonitril  (90 mL)  is  added  a triethylamine  (1.54 mL)  solution  in  acetonitril  (10 mL). The mixture  is heated  to refluxing  and  stirred  for  4  –  17  hours. After  this  the  acetonitril  is  removed  by distillation under reduced pressure. The residue is extracted with ethylacetate (3x 20 mL) filtrated and the solution is concetrated by rotary evaporation under reduced pressure. The product is obtained by column chromatography using a silica 60 column material and ethylacetate as the eluent. Yield 24 %. 

1H‐NMR (D2O): δ= 3.71 (m, 1H, CH); 2.99‐2.93 (d, 2H, CH2); 2.94‐2.93 (d, 1H, CH2); 2.45‐2.40 (d, 2H, CH2); 1.21‐1,19 (q, 3H, CH3) 

Polymerization of β‐propiolactam 

The glassware was flame‐dried before polymerization. A mixture of β‐propiolactam (100 mg, 1.41 mmol), N435 (100 mg) and dry toluene (5 mL), was stirred for 96 h at 90 °C under a N2‐blanket. After cooling to room temperature the toluene was removed by rotary evaporation. The crude product can be purified by stirring with ethanol for 15 minutes and filtrate. By extracting the residu with water the pure poly(β‐alanine) is obtained. (yield 30 %). 

1H‐NMR (D2O): δ = 3.3 (m, 2H; CH2) 3.12 (t, 2H; CH2) 2.52 (t, 2H; CH2) 2.29 (m, 2H; CH2)  

Control reactions 

The following experiments were performed to validate that N435 is the catalyst and β‐propiolactam the sole monomer in this reaction. 

1 Polymerization without catalyst present 2 N435 was deactivated by heating the beads to 150 °C for two hours. After this 

treatment  no  residual  activity  was  observed.  To  see  if  the  carrier  material influences  the  course  of  reaction  the  polymerization  of  β‐propiolactam was repeated with the deactivated N435. 

3 Polymerization with N435 and additional water 4 Polymerization with deactivated N435 and additional water 

‐ 28 ‐      

5 Polymerization of β‐alanine and β‐alanine ethylester was attempted 6 Polymerization of β‐propiolactam  in  the presence of β‐alanine  and β‐alanine 

ethylester 

2.3.3 Activity assays 

Hydrolytic assay 

N435 catalyzes the transesterification of p‐nitrophenyl acetate (pnpa) with methanol to yield p‐nitrophenol  (pnp). With UV spectrometry  the concentration of   pnp  is determined and a rate of esterification is calculated.  

A mixture of N435 (10 mg) and toluene (20 mL) stirred at 40 °C and a solution of p‐nitrophenyl  acetate  (5 mL,  7.25 mmol  L‐1)  in  toluene  was  added.  Immediately following methanol (6 μL) is added to the mixture. After 15 minutes four samples were taken from the mixture and filtered over a plug of cotton to remove the catalyst particles. Of each sample 0.5 mL of the filtrate was dissolved in 9.5 mL of toluene and the resulting solution was used for the UV‐absorption measurement. 

The absorbance (304 nm) by pnp is related to its concentration by equation 2‐1. With n = dilution factor (20), ε pnp (toluene, 304nm) = 9344.47 M‐1 cm‐1) and  ε pnpa (toluene, 304nm) = 2469.08 M‐1cm‐1 as determined from calibration curves.  

The activity (a) was calculated see Equation 2‐2 as nmol substrate converted by 1 mg N435 per minute during the first 15 minutes of the assay by using Equation 1‐2. With 

V, the reaction volume (25 mL) a factor x, (1*109) to convert the value to nmol M, the mass of the N435 (10 mg) and t, the time of reaction (15 min.). 

tMxVca

n ⋅⋅⋅

=435

  2‐2 

Synthetic assay  

The enzymatic polymerization of ε‐caprolactone was used as the synthetic activity assay. A mixture  of N435  (100 mg)  and  toluene  (5 mL) was  stirred  at  90  °C.  ε‐Caprolactone (1 mL, 9 mmol) was added and stirred for 5 h. After 5 h, 2 drops of the solution were withdrawn and the conversion of ε‐caprolactone was determined with 1H‐NMR‐spectroscopy.44 The signals of the CH2 next to the carbonyl group (4.09 ppm) in the polymer backbone and in the monomer (4.22 ppm) are compared. The ratio of the integral of the backbone CH2 over the total integral of the mentioned CH2 groups is used to determine the conversion of ε‐caprolactone. 

pnpapnp

opnpapnpa cAbsc

εεε−

⋅−⋅=

n  2‐1 

 

‐ 29 ‐      

2.4 RESULTS  AND  DISCUSSION  

2.4.1 Polymerization of β‐propiolactam 

The polymerization of lactams was attempted with lactam rings of different ring sizes. Capryllactam,  ε‐caprolactam  and valerolactam, were  tried  as  a monomer but no polymer  was  obtained.  The  4‐methyl‐azetidin‐2‐one  polymerized  by  thermal treatment  alone  without an enzyme.  

Only the β‐propiolactam was a substrate for the enzyme and yielded polymer while no polymer was obtained in a blank reaction. 

Toluene is the best reaction medium for the polymerization of β‐propiolactam.  

The first attempt to polymerize β‐propiolactam via enzyme catalyzed polymerization was performed in diisopropyl ether at an oilbath temperature of 60 °C for 24 hours, to resemble the system used by Fülöp et al.30 A series of experiments was carried out to determine the apropriate reaction conditions summed in Table 2‐2.  

Table 2‐2. Solvent optimization for the polymerization of β‐propiolactam. 

entry1  Solvent  t (h)  T (°C)2  yield   

1  i‐Pr2O  24  60  n.d.   

2    40  70  n.d.   

3    72  70  n.d.   

4    168  65  75 mg3   

5  toluene  96  90  30 %4   

6  1,4‐dioxane  96  80  < 5 %   

7  o‐dichlorobenzene  96  90  < 5 %   

1. 1H‐NMR spectra of  entries 1‐5 are shown in Figure 2‐8 

2. Temperatures are oilbath temperatures 

3. Total amount of product still containing β‐alanine 4. Purified polymer from ~70 mg crude product 

The products from the experiments 1‐5 in Table 2‐2 were examined with 1H‐NMR spectroscopy in deuterium oxide, depicted in Figure 2‐8. The first two experiments performed in i‐Pr2O yielded only little polymer and showed mainly monomer (δ=2.85 and 3.15 ppm).  

The third experiment showed that elongation of the reaction to 72 hours in i‐Pr2O with the temperature raised to 70 °C leads to polymer formation. All the β‐propiolactam is 

‐ 30 ‐      

now converted to β‐alanine (δ=2.4 and 3.05 ppm) or polymer (δ=2.25 and 3.25 ppm). The fourth experiment shows that increasing the reaction time to 168 hours further increased the conversion of β‐propiolactam. In order to increase the temperature of the reaction the solvent was changed to toluene. This solvent was chosen because of the  high  activity  of  N435  in  this  solvent  at  90  °C  reported  in  the  enzymatic polymerization of ε‐caprolactone.13  

In the fifth experiment toluene was used at 90 °C, the reaction time could be reduced to 96 hours. From the 1H‐NMR spectrum (Figure 2‐8, nr 5) and the two assays it was concluded that further experiments should be done with toluene as the solvent and a reaction temperature of 90 °C.  

 

 

Figure 2‐8. The 1H‐NMR spectra of  the reaction product after 24, 40, 72, 168 hours of reaction in i‐Pr2O (1‐4 respectively) and after 96 hours of reaction in toluene (5). The reaction conditions of these reactions are summarized in Table 2‐2, entries 1‐5.  

2.4.2 Cal‐B remains active in toluene of  90 °C  

Enzymes in general can denaturate when they are exposed to higher temperatures especially in aqueous environments. In organic solvents the activity is usually better retained under these conditions. In the former paragraph toluene is selected as the best reaction medium  for the polymerization of β‐propiolactam but deactivation over time can not be excluded. Two activity assays were used to evaluate the activity of the N435 after incubation at 90 °C in toluene for a maximum of 96 hours. From the results in Table 2‐3 and Table 2‐4 it can be concluded that the activity of N435 is only slightly affected by the thermal treatment.  

‐ 31 ‐      

Hydrolytic assay 

N435  catalyzes a  transesterification of p‐nitrophenyl acetate with methanol  to p‐nitrophenol the rate of this transesterification can be used to determine the hydrolytic activity of the catalyst. The concentration of pnp was calculated from the absorption at 304 nm. The activity of the N435 is determined in the first 15 minutes because the conversion of pnpA is still linear with time in this region. The activity of the catalyst was determined after 0 and 96 hours of incubation at 90 °C and listed in Table 2‐3. The activities are the mean value of 4 measurements. 

Table 2‐3. Hydrolytic activity of N435 after incubation in toluene. Calculated per mg of N435. 

Incubation time (hours) 

Activity of N435 (nmol pnp min‐1 mg‐1) 

 

0  107.20 +/‐ 5.49   

96  115.24 +/‐ 15.38   

After 4 days in toluene of 90 °C the N435 has not lost any of its activity. It is concluded that N435 can be used for the enzymatic polymerization of β‐propiolactam in this reaction medium and temperature. 

Synthetic assay of poly‐ε‐caprolactone 

Lactones are easily polymerized by the N435 and the conversion of ε‐caprolactone over time  is used to evaluate the ability of the catalyst to perform a ring‐opening polymerization after incubation in toluene. In Table 2‐4 the incubation times and % conversion of the ε‐caprolactone are listed. The production of poly‐ε‐caprolactone is not affected by the treatment at 90 °C for 72 hours conversions remain 85 %.  

Table 2‐4. Synthetic activity of N435 after 0‐72 hours incubation in toluene of 90 °C. 

Incubation time  

(hours) 

N435 (g)  Conversion (%) 

 

0  0.0000  0   

0  0.0963  90   

24  0.0974  74   

48  0.0974  83   

72  0.0986  85   

‐ 32 ‐      

From the results obtained from the two synthetic assays we conclude that the enzyme retains its activity after prolonged incubation in toluene at 90 °C. The enzyme is not denatured and can be used for polymerization reactions under these conditions. 

2.4.3 Characterization of poly(β‐alanine) 

The  poly(β‐alanine)  was  characterized  by  both  MALDI‐ToF  MS  and  1H‐NMR spectroscopy. It is shown below that pure poly‐β‐alanine can be obtained when cyclic products, monomer and β‐alanine are removed from the crude polymer in a washing step with water and ethanol.  

Maldi‐ToF Mass spectra of poly(β‐alanine) 

In the MALDI‐ToF mass spectrum of the crude polymer (Figure 2‐9) cyclic structures appear as sodium adducts in the area of 300‐600 m/z as expected for polycondensation reactions.17 Also  in  the  lipase‐catalyzed  polymerization  of  β‐propiolactone  cyclic oligomers are formed as was reported by Namekawa et al.45  The insert explains the three typical peaks in this mixture [M‐Na]+ ion (m/z = 609), [M‐K]+ ion (m/z = 625) and the [M‐Na]+‐cyclic ions (m/z = 592).  

 

Figure 2‐9. The MALDI‐ToF mass spectrum of the crude poly(β‐alanine). The insert explains the peaks for the [M‐Na]+ ion (m/z = 609), [M‐K]+ ion (m/z = 625) and the [M‐Na]+ cyclic ions (m/z = 592).   

After purification of the poly(β‐alanine) by introducing a washing step with ethanol a white solid is obtained and the MALDI‐ToF mass spectrum (Figure 2‐10) shows a mass increment of 71 m/z corresponding to one monomeric unit. In the ionization process adducts with sodium and potassium are formed. The sodium adducts form the primary distribution while  the potassium  adducts  can be  found  as  a  second distribution of peaks between 300 and 700 m/z. The distribution has a maximum at 467 m/z (DP=6) and peaks up to 1319.7 m/z (DP=18) can be observed.   

‐ 33 ‐      

 

Figure 2‐10. The MALDI‐ToF mass spectrum of the purified poly(β‐alanine). At a Δm/z of 71 the [M‐Na]+ ions of the linear polymer are found. A small fraction of the [M‐K]+ ions remains and the cyclic structures are removed. 

1H‐NMR‐spectra of poly(β‐alanine) 

The crude polymeric product was analyzed by 1H‐NMR spectroscopy (Figure 2‐11). The main chain protons  (δ= 3.30, 2.29 ppm) and the protons next to the endgroups (amine δ= 3.12 ppm and carboxylic acid δ= 2.52 ppm) can be identified corresponding to literature.46,47 There is monomer (δ= 3.2, 2.85 ppm) left in the crude product and small traces of β‐alanine (δ: 3.02, 2.4 ppm) formed by hydrolysis of β‐propiolactam. Although polymerization is carried out sucessfully the conversion is not 100%. Low mass cyclic products and β‐alanine are removed by washing with ethanol. After this purification the degree of polymerization is determined from the 1H‐NMR spectrum (Figure 2‐12) of the pure poly(β‐alanine). 

 

Figure 2‐11. The 1H‐NMR spectrum of crude poly(β‐alanine) showing: polymer (δ= 3.30, 2.29 ppm) end‐groups (δ= 3.12, 2.52 ppm) monomer (δ= 3.2, 2.85 ppm) and β‐alanine (δ: 3.02, 2.4 ppm). 

‐ 34 ‐      

 

Figure 2‐12. The 1H‐NMR spectrum of the purified poly(β‐alanine). Polymer main chain (δ= 3.30, 2.29 ppm) and end‐groups (δ= 3.12, 2.52 ppm) are the remaining signals after purification. 

The average degree of polymerization determined from the 1H‐NMR‐spectrum is 7. This value is in good agreement with the maximum of the distribution found with MALDI‐ToF MS (DP=6). The conversion of β‐propiolactam is not complete as 30 wt% polymer is obtained after purification. Some of the monomer is hydrolyzed or left unharmed  as  was  proven  with  1H‐NMR  spectroscopy.  MALDI‐ToF  mass spectrometry showed that some of the monomer is converted into cyclic products that are also washed away during purification.  

Hydrolysis  is  caused by  the presence of water  in  the  catalyst. Although  activity measurements showed that the N435 is active after long periods of time at a high temperature, some of the catalyst might be deactivated by these reaction conditions.  

Optimization of the reaction time and temperature as well as changing the drying regime  for  the  catalyst  is  needed  to  improve  both  the  yield  and  the  degree  of polymerization of the poly(β‐alanine). 

2.4.4 Optimization of the reaction conditions 

The time and temperature of the reaction and the drying conditions used to dry N435 were optimized with respect to the yield and degree of polymerization of the poly(β‐alanine). 

Although the activity of N435 at 90 °C for 96 hours was shown in Paragraph 2.4.2 this is not necessarily the optimal combination of time and temperature. To prevent side reactions and thermal deactivation of the enzyme it is preferred to use a low reaction temperature.  

The N435 catalyst can be deactivated by denaturing when too much water is present. Also hydrolysis will predominantly take place. Drying of the catalyst  is therefore necessary. However not too much water should be removed since a small portion is needed for the structure of the enzyme and for catalysis.  

‐ 35 ‐      

Reaction time and temperature 

The N435 was dried for 48 hours at 46 °C for all the optimizations regarding time and temperature. The enzymatic polymerization of β‐propiolactam in toluene at 90 °C for 96  hours  gave  the  poly(β‐alanine)  in  30 %  yield with Dp  5. This  represents  the polymerization as described above. The temperature of the reaction medium was lowered to 55 °C. In the experiments the reaction time was either 96 hours or 144 hours. Table 2‐5 sums the reaction conditions, the yield of polymer and the average degree of polymerization for these reactions.  

The degree of polymerization did not change as a result of lowering the temperature or elongation of the reaction time to 144 hours. The yield of the polymerization did change from 30 % at 90 °C to 80 % at 55 °C. 

Therefore, for the polymerization a temperature of 55 °C and a reaction time of 96 hours gives the best results in terms of DP and yield of the reaction. 

Table 2‐5. Influence of the time and temperature on the yield and DP of poly(β‐alanine) 

T(°C)  t (h)  Yield (%) 

DP  (1H‐NMR) 

 

55  96  81  5   

55  144  83  5   

90  96  30  5   

Drying regime for  the catalyst 

Optimization towards the drying regime for the catalyst is done by evaluating the polymer (yield and DP) obtained after a reaction in toluene for 96 hours at 55 °C. Prior to the reaction the N435 was dried over P2O5 in vacuo using a temperature of 55 °C and 46 °C. After drying the catalyst for 2, 24 or 48 hours the polymerizations were started.  

In Table 2‐6 the results are summarized. Drying the enzyme for two hours already leads to a higher degree of polymerization, DP = 6.7 than drying for 48 hours as was presented in the former paragraph (DP = 5). After 24 hours of drying the polymers reached the highest degree of polymerization DP= 7. Changing to a slightly lower drying temperature (from 55 to 46 °C) did not influence the DP.  

After drying for two hours hydrolysis limits the DP to 6.7. After 24 hours a DP of 7 was reached and this is the best result. After 48 hours too much water is removed leading to a denaturation of the enzyme.   

After these two optimization steps it can be concluded that the polymerization is best performed at 55 °C for 96 hours using a catalyst that was dried over P2O5 in vacuo at  55 °C for 24 hours. Resulting in the highest yield of polymer with the longest chains.  

‐ 36 ‐      

Table 2‐6. Influence of drying N435 on the DP of the poly‐β‐alanine. 

time (h)  T (°C)  DP (by 1H‐NMR)   

2  55  6.7   

24  55  7.3, 8.0   

24  46  7.6   

48  46  5.0   

2.4.5 Control reactions and possible inhibition by intermediates 

The polymerization of β‐propiolactam by enzymatic catalysis was not reported before. Therefore it is of importance to show that the polymerization is only possible with the N435 catalyst present. This was indeed found because no  polymer is formed without the N435 after 96 hours in toluene at 90 °C. Only the monomer was retrieved from the reaction mixture.  

A reaction started with the deactivated catalyst (150 °C, 2h) shows no polymerization. The carrier material is therefore excluded as a possible catalytic agent. 

Also  it  is  known,  that  water  alcohols  and  other  nucleophiles  can  initiate  the polymerization of lactones.48 Different experiments were performed that proof that catalysis  by N435  is  really  the  only way  to  obtain  a  polymer  starting with  β‐propiolactam.     

When the N435 catalyst is used, water is inevitably present in the catalyst and could act as the initiator for the polymerization. Two experiments were designed to see if this is the case. The polymerization was repeated without N435 but with added water and the polymerization was repeated with deactivated N435 and added water. In both cases no polymer was formed. 

A second species that could act as the initiator of the polymerization is β‐alanine. β‐Alanine is formed when β‐propiolactam is hydrolyzed. Since water is always present there will always be some β‐alanine in the mixture. The polymerization was repeated without catalyst and added β‐alanine, no polymer resulted.  

Also  it  is possible  that  the  enzyme polymerizes β‐alanine  that  is  first  formed by hydrolysis of the β‐propiolactam. This was ruled out by feeding the catalyst with either β‐alanine or β‐alanine ethylester. These experiments did not yield any polymer. When  β‐alanine  was  added  to  the  polymerization  of  β‐propiolactam  the polymerization was  not  hindered  another  clue,  that  no  intermediate  is  formed between β‐alanine and the lipase. 

Although poorly soluble in toluene (10‐5 mol L‐1 determined with HPLC) the presence of β‐alanine ethylester reduces the hydrolytic activity of N435 by 37 % see Table 2‐7. 

‐ 37 ‐      

The  inhibitory  effect  is  also  found  in  the  synthetic  assay  (polymerization  of  ε‐caprolactone) and in the polymerization of β‐propiolactam. In both cases no polymeric product was retrieved after the polymerization with β‐alanine ethylester present.  

From these results it can be concluded that neither the water, β‐alanine or the carrier material starts the reaction. The N435 catalyzes the reaction. Because the β‐alanine is not  polymerized  by  the N435  it  can  be  stated  that  the  ring  structure  of  the  β‐propiolactam is essential for the formation of polymer. It was found that β‐alanine ethylester is an inhibitor for the polymerization of β‐propiolactam and ε‐caprolactone. 

Table 2‐7. The activity of Cal‐B decreases in the presence of β‐alanine ethylester. 

Incubation time (hours) 

Activity of N435 +  β‐alanine ethylester  (nmol pnp min‐1 mg‐1) 

 

0  67.95 +/‐ 2.48   

96  45.18+/‐8.97   

2.4.6 Enzymatic lactam polymerization follows a different mechanism than ε‐caprolactone polymerization  

Lipase (N435) catalyzed amide bond formation is believed to proceed through the same intermediates as the formation of esters by N435. Prior to our experiments we expected that the  lactam polymerization proceeds according to the mechanism of lactone polymerization. When the mechanism of the β‐propiolactam polymerization is drawn according to the mechanism of lactone polymerization, Figure 2‐13 is obtained.  

In step 1 the first acyl‐enzyme intermediate that is formed will undergo hydrolysis to form β‐alanine (n=1). A newly formed intermediate can either be attacked by water or by  a β‐alanine molecule  resulting  in a growing  chain  (n+1). The  chains grow by performing step 2 repeatedly.  

 

Figure 2‐13. Hypothetical mechanism for the polymerization of β‐propiolactam drawn according to the mechanism for enzymatic ε‐caprolactone polymerization depicted in Figure 2‐2. 

‐ 38 ‐      

The mechanism  in Figure 2‐13 requires a β‐alanine molecule,  the analogue of the hydroxy acid  in Figure 2‐2,  to be  freed  and  attack  a newly  formed  acyl‐enzyme intermediate.  From  the  control  experiments  we  know  that  β‐alanine  is  not polymerized by the Cal‐B. Recent findings by Hollmann et al.49 show that organic acids with a pKa < 4.8 protonate the His224 and thereby prevent the deprotonation of Ser105 needed to form the acyl‐enzyme intermediate. Since β‐alanine has a pKa of 3.6.50 this could very well prevent the polymerization of this compound. In conclusion, β‐alanine is not an intermediate in the lactam polymerization and therefore the lactam polymerization has to follow a different mechanism than the polymerization of ε‐caprolactone.  

2.4.7 A new mechanism developed by molecular modeling explains the β‐propiolactam polymerization 

Based  on  the  experimental  results  outlined  above  Fels  and  Baum51,  in  close colaboration with us52, developed a mechanism  for  the enzymatic catalyzed ring‐opening polymerization of β‐propiolactam using molecular modeling. The authors explain the polymerization of β‐propiolactam in eight steps, keeping in mind that the lactam  ring  is  the  sole  monomer  of  the  reaction  and  that  β‐alanine  is  not  an intermediate nor a monomer in the reaction.  

Figure 2‐14 summarizes the sequence in four main steps. 1. Acyl‐enzyme formation, 2. activation of the monomer, 3. elongation and 4. release of the polymer. Two features of the proposed mechanism in enable the polymerization of β‐propiolactam without the  release and reattachment of β‐alanine or a growing chain. 

Activation of the lactam ring by a molecule of water  The nucleophilicity of the β‐propiolactam ring is not high enough for a direct attack on  the  acyl‐enzyme  intermediate. Activation  by  a water molecule  increases  the nucleophilicity  of  the  monomer  allowing  a  direct  attack  on  the  intermediate. Histidine224 accepts the proton and stabilizes the activated monomer by hydrogen bonding. In the lactone mechanism a hydroxy acid is released that attacks the next acyl‐enzyme intermediate. 

Insertion  of  the  activated  monomer  between  Ser105  and  the  growing  chain The accepted lactone polymerization suggests an attack of the released hydroxy acid or a growing chain on the acyl‐enzyme intermediate with the release of elongated chain. In this new mechanism the activated monomer is inserted and the growing chain stays bonded to the serine.  

A water molecule present near His224  in  the active site  (crystal structures 1TCA, 1TCB, 1TCC)53 of Cal‐B assists the transfer of protons between groups that are too far apart  for  direct  hydrogen  bonding  and  it  enhances  the  nucleophilicity  of  the monomer. This was suggested for other Cal‐B catalyzed reactions in molecular  

‐ 39 ‐      

Figure 2‐14. Mechanism of enzyme catalyzed β‐propiolactam polymerization developed by Baum et al.52 

modeling experiments by Lavandera et.al.54 The use of water during polymerization is catalytic. Freeing the polymer from the enzyme however, is performed at the cost of one water molecule. In the optimization steps described earlier it was shown that drying the enzyme is necessary but not too much water should be removed. This can now be understood not only as a disturbance of the enzyme structure but also as removing water molecules that are necessary in performing the polymerization. 

2.5 CONCLUSIONS  

The successful enzymatic polymerization of the four membered β‐propiolactam is reported. From a collection of lactam rings with 4, 6, 9 and 13 members only the 4‐membered ring is a good substrate for the N435 catalyst.  

The β‐propiolactam ring can be polymerized in different solvents but the optimal reaction conditions are a polymerization in toluene at a temperature of 55 °C for 96 hours. The N435 should be dried before use for 24 hours over P2O5 under reduced pressure. 

Although  a  reasonable  yield  of  polymer  (30 %  by weight) was  obtained  after  a reaction  at  90  °C  at  first,  the  yields  almost  tripled  (83  %)  when  the  reaction temperature was lowered to 55 °C. Also after longer reaction time (144 hours) the yields of polymer remained high. Changing the reaction time and temperature did 

‐ 40 ‐      

however  not  change  the  average  degree  of  polymerization  probably  due  to precipitation of the polymer. 

Drying the N435 catalyst and the reagents before use is essential to prevent hydrolysis of  the  β‐propiolactam.  The  drying  conditions  for  the N435 were  varied  in  both temperature (55 and 46 °C) and time (24, 48 h) over P2O5 in vacuo. This has a clear effect on the degree of polymerization as  it drops from 8 to 6 when the drying  is continued  from  24  to  48 hours. After  48 hours  of drying  the  structural water  is removed and the catalyst starts to loose its activity. 

The polymer that was obtained could only be formed when the β‐propiolactam was the monomer with N435 as the catalyst. The possible monomers β‐alanine and β‐alanine ethylester were not polymerized by  the N435. Also possible  initiation by water, β‐alanine and carrier material was excluded. 

Based on the experimental results that the possible intermediate β‐alanine was not polymerized by the N435, it was concluded that the polymerization of β‐propiolactam can not be explained by the mechanism accepted for the enzymatic ε‐caprolactone polymerization. In close colaboration with us Baum et al., developed a mechanism by molecular modeling showing that the β‐propiolactam can be the sole monomer in the polymerization when it is activated by a water molecule.  

2.6 REFERENCES  

1.   Srivastava, R.K., Adv. Drug Delivery Rev., 2008, 60, 1077‐1093 2.   Kobayashi, S., Uyama, H., Kimura, S., Chem. Rev., 2001, 101, 3793‐3818 3.   Uyama, H., Kobayashi, S., Chem. Lett., 1993, 22, 1149‐1150 4.   Klibanov, A.M., ChemTech, 1986, 354 5.   Zaks, A., Klibanov, A.M., J. Biol. Chem., 1988, 263, 3194‐3201 6.   Grollier, J.‐F., Fourcadier, C.,  1985, 747443 7.   Huang, S.Y., Fisher, M.M.,  1981, 060534 8.   Foley, K.M., Bell, R.H., McCombs, F.P.,  1977, 620524 9.   Breslow, D.S., Hulse, G.E., Matlack, A.S., J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 3760‐3763 10.  Gurʹeva, L.L., Tkachuk, A.I., Dzhavadyan, E.A., Estrina, G.A., Surkov, N.F., 

Sulimenkov, I.V., Rozenberg, B.A., Polymer Science Series A, 2007, 49, 987‐999 11.  Knani, D., Gutman, A.L., Kohn, D.H., J. Polym. Sci. , Part A: Polym. Chem., 1993, 31, 1221‐

1232 12.  Dong, H., Cao, S.‐G., Li, Z.‐Q., Han, S.‐P., You, D.‐L., Shen, J.‐C., J. Polym. Sci. , Part A: 

Polym. Chem., 1998, 37, 1265‐1275 13.  Kumar, A., Gross, R., Biomacromolecules, 1999, 1, 133‐138 14.  Dong, H., Cao, S.‐G., Li, Z.‐Q., Han, S.‐P., You, D.‐L., Shen, J.‐C., Journal of polymer 

science:Part A: Polymer chemistry, 2008, 37, 1265‐1275 15.  Faber, K., Biotransformations in Organic Chemistry, 4th edition, Springer, 2000 16.  Mei, Y., Kumar, A., Gross, R., Macromolecules, 2004, 2003, 5530‐5536 17.   Jacobson, H., Stockmayer, W.H., J. Chem. Phys., 1950, 18, 1600‐1606 18.  Cordova, A., Iversen, T., Hult, K., Martinelle, M., Polymer, 1998, 39, 6519‐6524 

‐ 41 ‐      

19.  Thurecht, K.J., Heise, A., deGeus, M., Villarroya, S., Zhou, J.X., Wyatt, M.F., Howdle, S.M., Macromolecules, 2006, 39, 7967‐7972 

20.   Juaristi, E., Enantioselective Synthesis of β‐Amino Acids, 1st edition, Wiley‐VCH, 1997 21.   Juaristi, E., López‐Ruiz, H., Curr. Med. Chem., 1999, 6, 983‐1004 22.  Abdel‐Magid, A.F., Cohen, J.H., Maryanoff, C.A., Curr. Med. Chem., 1999, 6, 955‐970 23.  Knight, W.B., Green, B.G., Chabin, R.M., Gale, P., Maycock, A.L., Weston, H., Kuo, 

D.W., Westler, W.M., Dorn, C.P., Biochemistry, 1992, 31, 8160‐8170 24.  Wilmouth, R.C., Kassamally, S., Westwood, N.J., Sheppard, R.J., Claridge, T.D.W., 

Aplin, R.T., Biochemistry, 1999, 38, 7989‐7998 25.  Pauline, M., Carlos, C., Viviana, J., Otto, D., Andréa, D., FEMS Microbiol. Rev., 2006, 30, 

673‐691 26.  Walsh, C., Antibiotics: Actions, Origins,  Resistance, 1st edition, ASM press, 2003 27.  Buynak, J.D., ACS Chem. Biol., 2007, 2, 602‐605 28.  Forró, E., Fülöp, F., Tetrahedron: Asymmetry, 2008, 19, 1005‐1009 29.  Forró, E., Fülöp, F., Tetrahedron: Asymmetry, 2003, 15, 573‐575 30.  Park, S., Forró, E., Grewal, H., Fülöp, F., Kazlauskas, R.J., Adv. Synth. Catal., 2003, 345, 

986‐995 31.  Tasnádi, G., Forró, E., Fülöp, F., Tetrahedron: Asymmetry, 2007, 18, 2841‐2844 32.  Gutman, A.L., Meyer, E., Yue, X., Abell, C., Tetrahedron Lett., 1992, 33, 3943‐3946 33.  Albertsson, A.‐C., Srivastava, R.K., Advanced Drug Delivery Reviews, 2008, 60, 1077‐1093 34.  Xu, J., Gross, R.A., Kaplan, D.L., Swift, G., Macromolecules, 1996, 29, 4582‐4590 35.  Clauss, K., Grimm, D., Prossel, G., Liebigs Ann. Chem., 1974, 1974, 539‐560 36.  Pfaendler, H.R., Hoppe, H., Heterocycles, 1982, 23, 265‐272 37.  Mickel, S.J., Hsiao, S.‐N., Miller, M.J., Org. Synth., 1987, 135 38.  Moriconi, E.J., Meyer, W.C., J. Org. Chem., 2008, 36, 2841‐2849 39.  Kim, S., Lee, P.H., Lee, T.A., Synth. Commun., 1988, 18, 247‐252 40.  Huang, H., Iwasawa, N., Chem. Lett., 1984, 13, 1465‐1466 41.  Escalante, J., González‐Tototzin, M.A., Aviña, J., Muñoz‐Muñiz, O., Juaristi, E., 

Tetrahedron, 2000, 57, 1883‐1890 42.  Loontjens, T. and DSM Geleen, Capryllactam synthesis, description of process‐steps, 

personal communication, 1992 43.  March, J., Advanced organic chemistry, 3rd edition, 1985 44.  Chen, B., Miller, E.M., Miller, L., Maikner, J.J., Gross, R.A., Langmuir, 2007, 23, 1381‐1387 45.  Namekawa, S., Uyama, H., Kobayashi, S., Polym. J. (Tokyo), 1996, 28, 730‐731 46.   Jia, L., Ding, E., Anderson, W.R., Chem. Commun., 2001, 1436‐1437 47.  Applequist, J., Glickson, J.D., J. Am. Chem. Soc., 1971, 93, 3276‐3281 48.  Heijkants, R.G.J.C., Van Calck, R.V., Van Tienen, T.G., De Groot, J.H., Buma, P., 

Pennings, A.J., Veth, R.P.H., Schouten, A.J., Biomaterials, 2005, 26, 4219‐4228 49.  Hollmann, F., Grzebyk, P., Heinrichs, V., Doderer, K., Thum, O., J. Mol. Catal. B: Enzym., 

2009, 57, 257‐261 50.  Tarábek, P., Bonifacic, M., Beckert, D., J. Phys. Chem. A, 2006, 110, 7293‐7302 51.  Fels, G. and Baum, I. In Biocatalysis in Polymer Chemistry, 349‐368, Loos, K., Ed, Wiley‐

VCH, 2010 52.  Schwab, L.W., Baum, I., Fels, G., and Loos, K. In ACS Symp. Ser. Green Polymer 

Chemistry: Biocatalysis and Biomaterials, 265‐278, Cheng, H.N., Gross, R.A., Eds, 2010 53.  Uppenberg, J., Hansen, M.T., Patkar, S., Jones, T.A., Structure, 1994, 15, 293‐308 54.  Lavandera, I., Fernández, S., Magdalena, J., Ferrero, M., Kazlauskas, R.J., Gotor, V., 

ChemBioChem, 2005, 6, 1381‐1390