1

UNIVERSITE PARIS XII- VAL DE MARNE

FACULTE DE MEDECINE

ANNEE : 2003 N°…………….

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS XII

Discipline : Parasitologie

Présentée et soutenue publiquement

par

DJAMAN Allico Joseph

Le 24 juillet 2003

Titre :

Évaluation de la chimiorésistance de Plasmodium falciparum à différents

antipaludiques (chloroquine, sulfadoxine-pyriméthamine, quinine) et profil

génétique des isolats correspondants

___________

Directeur de thèse : André MAZABRAUD ____________

JURY

Monsieur Martin DANIS Président

Monsieur Philippe DELORON Rapporteur

Monsieur Pascal RINGWALD Rapporteur

Monsieur Léonardo BASCO Examinateur

Madame Michèle DENIAU Examinateur

Monsieur André MAZABRAUD Examinateur

2

AVANT PROPOS

Un sage de l'antiquité a dit :

« Faire des livres est un travail sans fin et beaucoup d'étude fatigue le corps ».

Mais, il a ajouté :

« Tout labeur donne du profit et c'est un arbre de vie et douceur pour l'âme que le désir satisfait »

L'étude sur l'agent majoritairement causal du paludisme en Afrique subsaharienne m'a toujours

passionné. À présent, elle m'apporte certes une satisfaction personnelle mais elle me permet de

mieux comprendre le vivant, depuis le mammifère jusqu'au microbe.

A mon avis le comportement des êtres vivants face au danger peut se résumer ainsi :

« Face à ce qui peut menacer son existence et entraîner son extinction, le vivant réagit, soit en

évitant instinctivement le danger, soit, en lui faisant front tout en sachant qu'il est capable de tenir

tête par divers mécanismes ».

Plasmodium falciparum résiste aux médicaments en empruntant la deuxième voie, il est donc

instinctivement sage et son extinction n'est pas certainement pour demain.

« De ce fait, sans être alarmiste, il sera difficile à l'homme d'enrayer le paludisme et le Plasmodium

de la carte du monde par voie médicamenteuse ».

3

REMERCIEMENTS

Au terme de ce travail, qu'il me soit permis d'exprimer mes remerciements à tous ceux qui ont œuvré pour qu'il

puisse connaître un heureux dénouement.

Ainsi, je remercie sincèrement le Docteur André Mazabraud, affectueusement appelé "chef" pour l'honneur qu'il

m'a fait de m'accueillir dans son laboratoire et d'avoir assuré la direction scientifique de ce travail.

Je remercie particulièrement le Docteur Léonardo Basco, qui a été le maître d'œuvre dans la conception pratique de

ce travail. Il a gagné ma sympathie par sa rigueur scientifique concernant les trois aspects de la surveillance de la

chimiorésistance des plasmodies.

Cette thèse a lieu parce que le Professeur René Houin a accepté mon inscription dans la filière : hôte-parasite de

l'école doctorale SVS de Paris XII, puis a été mon correspondant durant toutes ces années. Merci Professeur pour votre

sollicitude à mon égard.

Je voudrais exprimer mes remerciements à Monsieur le Professeur M. Danis qui n'a pas hésité à être le président de

jury pour juger ce travail.

Toute ma reconnaissance à Messieurs les Docteurs Pascal Ringwald et Philippe Deloron pour avoir accepté de

corriger et de juger ce travail malgré les charges qui sont les leurs.

Je tiens à remercier Madame le Professeur Michèle Deniau qui n'a pas hésité un seul instant à faire partie du jury de

thèse pour juger ce travail.

Je remercie celui qui m'a donné le goût à la parasitologie, le Professeur Koné Moussa pour ses conseils pour mener

à terme cette étude et pour la confiance toujours renouvelée dans l'encadrement des étudiants en thèse d'exercice et de

DEA de Biologie humaine et Tropicale (BHT).

Merci à mon Ami le Docteur Gnagbomon Jacob, 1er médecin chef du FSUCOM "Toit rouge" qui malheureusement

a perdu la vie accidentellement alors que j'étais en France dans la première phase d'exécution de la partie moléculaire de

la présente étude.

Je remercie et suis reconnaissant à ceux qui m'ont aidé à persévérer dans ce travail et qui m'ont prodigué leur

expérience et encouragement (Dr P. Eldin de Pécoulas, Dr Rachida Tahar, Dr Myriam De Chalendar, Dr David

Dupasquier, Dr Jerôme Valin, Dr Nicolas Pollet). Je souhaite bon courage à Ludvine Sinzelle et à Raphaël Thuret pour

la suite de leurs travaux et merci à Mme Chantal Ballagny qui s'est beaucoup investie pour moi au plan administratif.

Je remercie toute l'équipe TGA pour leur sympathie durant tout le temps que je suis resté en leur compagnie.

Merci à toute l'équipe d'Abidjan (les techniciens de labo, le Médecin de l'équipe et tout le personnel du FSUCOM

de "Toit rouge" de Yopougon), ainsi que l'ensemble des collaborateurs du laboratoire de Microbiologie de l'Institut

National de Santé Publique (INSP) d'Abidjan pour avoir donné de leur temps et énergie afin de parvenir à la fin des

travaux.

Je remercie la direction de l'INSP pour m'avoir fait confiance et permis que cette étude continue malgré les débuts

difficiles à cause du coup d'état de 1999.

La partie moléculaire de la présente étude a été entièrement financée par le MAE du gouvernement français par

l'intermédiaire de la coopération française à Abidjan sous forme d'une bourse en alternance qui m'a été octroyée ; merci

pour le soutien financier.

Merci également au projet Pal+ de Dr Léonardo pour les quatre mois de bourses qui m'ont permis de finaliser et de

soutenir ma thèse.

4

PLAN

LISTE DES ABREVIATIONS ------------------------------------------------------------------------------------------------------7

LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES ------------------------------------------------------------------------------------------8

RESUME -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------10

I- INTRODUCTION -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------14

I-1 Définition et historique du paludisme -------------------------------------------------------------------------------------------15

I-1.1 Définition ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------15

I-1.2 Historique ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------15

I-2 Maladie, symptômes --------------------------------------------------------------------------------------------------------------17

I-2.1 Épidémiologie du paludisme --------------------------------------------------------------------------------------------------17

I-2.2 Symptomatologie ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------17

I-3 Diagnostic biologique -----------------------------------------------------------------------------------------------------------19

I-4 Antipaludiques -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------20

I-4.1 Lysosomotropes ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------21

I-4.2 antimétabolites- ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------22

I-4.3 Antibiotiques -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------23

I-4.4 Mode d’action des antipaludiques -------------------------------------------------------------------------------------------24

I-4.4.1 Métabolisme du Plasmodium ----------------------------------------------------------------------------------------------23

I-4.4.2 Mode d'action des lysosomotropes ----------------------------------------------------------------------------------------25

I-4.4.3 Mode d'action des antimétabolites ----------------------------------------------------------------------------------------26

I-4.5 Schéma de l’utilisation des antipaludiques ---------------------------------------------------------------------------------27

I-5 Chimiorésistance -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------28

I-5.1 Définition -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------28

I-5.2 Mécanismes de résistance de P. falciparum aux antipaludiques --------------------------------------------------------28

I-5.2.1 Mécanismes de résistance aux lysosomotropes -------------------------------------------------------------------------28

I-5.2.2 Mécanismes de résistance aux antimétabolites -------------------------------------------------------------------------29

I-5.3 Conditions d’apparition de la résistance -----------------------------------------------------------------------------------29

I-5.4 Facteurs favorisant la résistance ---------------------------------------------------------------------------------------------30

I-5.5 Etude de la chimiorésistance -------------------------------------------------------------------------------------------------31

I-5.5.1 Test de l'efficacité thérapeutique ------------------------------------------------------------------------------------------31

5

I-5.5.2 Test in vitro ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 32

I-5.5.2.1 Généralités -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------32

I-5.5.2.2 Culture in vitro de P. falciparum ----------------------------------------------------------------------------------------33

I-5.5.3 Test moléculaire -------------------------------------------------------------------------------------------------------------34

I-5.5.3.1 Génome de P. falciparum ------------------------------------------------------------------------------------------------34

I-5.5.3.2 Étude des gènes impliqués dans la résistance -------------------------------------------------------------------------35

I-5.5.4 Dosage de médicament -----------------------------------------------------------------------------------------------------37

I-6 Justification de l'étude -----------------------------------------------------------------------------------------------------------37

I-7 Objectifs ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------39

II- ZONE D’ETUDE, MATERIEL ET METHODES -----------------------------------------------------------------------41

II-1 Zone d étude ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------42

II-2 Matériel ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------43

II-2.1 Sélection des sujets -----------------------------------------------------------------------------------------------------------43

II-2.2 Prélèvement d'isolats de P. falciparum-------------------------------------------------------------------------------------44

II-2.3 Milieux de culture et réactifs pour le test in vitro ------------------------------------------------------------------------44

II-2.4 Gènes à amplifier, oligonucléotides et endonucléases utilisés ----------------------------------------------------------45

II-2.4.1 Gènes de P. falciparum à amplifier --------------------------------------------------------------------------------------45

II-2.4.2 Oligonucléotides utilisés --------------------------------------------------------------------------------------------------46

II-2.4.3 Endonucléases utilisés -----------------------------------------------------------------------------------------------------48

II-3 Méthodes -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------48

II-3.1 Chimiosensibilité in vivo de P. falciparum --------------------------------------------------------------------------------48

II-3.2 Chimiosensibilité in vitro de P. falciparum -------------------------------------------------------------------------------50

II-3.2.1 Préparation du milieu de culture ------------------------------------------------------------------------------------------51

II-3.2.2 Dilution de drogues et chargement des plaques -------------------------------------------------------------------------51

II-3.2.3 Préparation de l'échantillon de globules rouges parasités -------------------------------------------------------------52

II-3.2.4 Mise en culture de l'inoculum ---------------------------------------------------------------------------------------------53

II-3.2.5 Collecte cellulaire et comptage -------------------------------------------------------------------------------------------53

II-3.2.6 Interprétation du test --------------------------------------------------------------------------------------------------------54

II-3.3 Techniques moléculaires -----------------------------------------------------------------------------------------------------55

II-3.3.1 Extraction de l’ADN plasmodial à partir du sang total parasité ------------------------------------------------------55

6

II-3.3.2 Extraction de l’ADN plasmodial à partir du sang déposé sur confettis -----------------------------------------------56

II-3.3.3 Préparation et purification des oligonucléotides -------------------------------------------------------------------------56

II-3.3.4 Protocole d'amplification ----------------------------------------------------------------------------------------------------57

II-3.3.5 Digestion du produit de PCR ou PCR-RFLP -----------------------------------------------------------------------------60

II-3.3.6 Protocole de purification des produits de PCR et séquençage ---------------------------------------------------------60

II-3.4 Méthodes d'analyse des résultats --------------------------------------------------------------------------------------------63

III- RESULTATS -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------64

III-1 Chimiosensibilité in vivo de P. falciparum aux antipaludiques ----------------------------------------------------------65

III-1.1 Efficacité thérapeutique de la chloroquine -------------------------------------------------------------------------------65

III-1.2 Efficacité thérapeutique de la sulfadoxine-pyriméthamine ------------------------------------------------------------67

III-2 Chimiosensibilité in vitro à la chloroquine, sulfadoxine-pyriméthamine et quinine---------------------------------70

III-3 Tests couplés efficacité thérapeutique / sensibilité in vitro -------------------------------------------------------------72

III-3.1 Efficacité thérapeutique / sensibilité in vitro de P. falciparum à la chloroquine -----------------------------------72

III-3.2 Efficacité thérapeutique / sensibilité in vitro de P. falciparum à la pyriméthamine -------------------------------72

III-4 Profil génétique des isolats de P. falciparum ------------------------------------------------------------------------------75

III-4.1 Digestion enzymatique ou RFLP ------------------------------------------------------------------------------------------75

III-4.2 Acides aminés de la DHFR, DHPS, PFMDR-1 des isolats de P. falciparum --------------------------------------76

III-4.3 Prévalence de la mutation et sensibilité des isolats aux antipaludiques ---------------------------------------------79

III-4.3.1 Mutation K76T et sensibilité de P. falciparum à la chloroquine ---------------------------------------------------79

III-4.3.2 Mutation du gène pfmdr-1 et sensibilité de P. falciparum à la quinine et à la chloroquine ---------------------84

III-4.3.3 Mutations des gènes dhfr, dhps et sensibilité de P. falciparum à la sulfadoxine-pyriméthamine--------------88

IV- COMMENTAIRES, DISCUSSION ET CONCLUSION ------------------------------------------------------------97

IV-1 Surveillance épidémiologique de la résistance ---------------------------------------------------------------------------98

IV-2 Aspects moléculaires de la résistance plasmodiale ---------------------------------------------------------------------105

IV-3 Conclusion ---------------------------------------- ---------------------------------------------------------------------------111

V-REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ---------------------------------------------------------------------------------114

VI- ANNEXES --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------137

7

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ACD : acide citrique-dextrose

BET : bromure d'éthidium

BSA : albumine sérique de boeuf

CI50 : concentration inhibitrice à 50 %

DHFR-TS : dihydrofolate réductase thymidilate synthétase

DHPS : dihydroptéroate synthétase

DNTP : désoxyribonucléotide triphosphate

DTT : dithiothreitol

EDTA : éthylène diamine trétraacétate

ECT : échec clinique tardif

EPT : échec parasitologique tardif

ETP : échec thérapeutique précoce

ETT : échec thérapeutique tardif

HEPES : acide N-(2-hydroxyéthyl) pipérazine-N'-(2-éthanesulfonique)

PABA : Acide para-amino-benzoïque

pb : paire de bases

PCR : polymerase chain reaction

PFCRT : Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter

PFMDR : Plasmodium falciparum multidrug resistance

RPMI 1640 : Roswell Park Memorial Institute 1640

TBE : Tris ou Tris base, Acide borique, EDTA, pH 8,3

8

LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES

Tableaux Tableau I : Séquences des amorces utilisées pour amplifier les différents fragments

d'ADN des gènes de résistance ------------------------------------------------------------------------------------------- 47

Tableau II : Gamme de concentrations finales de médicaments lors du test in vitro ----------------------------- 52

Tableau III : Conditions d'amplification des fragments d'ADN des gènes de résistance ------------------------- 59

Tableau IV : Principaux polymorphismes des codons impliqués dans la résistance de P. falciparum

des gènes dhfr, dhps, pfcrt et pfmdr-1 avec les acides aminés résultant de ces changements ------------------- 62

Tableau V: Méthode de réalisation des tests --------------------------------------------------------------------------- 63

Tableau VI : Résultats de l’efficacité thérapeutique de la chloroquine--------------------------------------------- 66

Tableau VII : Résultats de l’efficacité thérapeutique de la sulfadoxine-pyriméthamine -------------------------68

Tableau VIII : Résultats du test couplé efficacité thérapeutique / in vitro à la chloroquine -------------------- 73

Tableau IX : Résultats du test couplé efficacité thérapeutique à la SP / in vitro à la pyriméthamine --------- 74

Tableau X : Répartition du nombre d'isolats par rapport au type de mutation de chaque gène ---------------- 78

Tableau XI : Réponses in vivo et in vitro à la chloroquine et mutation du gène pfcrt -------------------------- 80

Tableau XII : Répartition des isolats pfcrt mutants dans la population des sujets traités à la chloroquine et

dans la population des isolats à sensibilité in vitro connue---------------------------------------------------------- 81

Tableau XIII : Sensibilité in vivo et in vitro à la chloroquine et profil génétique (pfcrt) des isolats ---------- 82

Tableau XIV : Réponses in vivo et in vitro à la chloroquine et mutation du gène pfmdr-1--------------------- 85

Tableau XV : Répartition des isolats pfmdr-1 mutants dans la population des sujets traités

à la chloroquine et dans la population des isolats à sensibilité in vitro connue ---------------------------------- 86

Tableau XVI : Influence de la nature des gènes pfmdr-1 et pfcrt dans la population

des sujets traités à la chloroquine --------------------------------------------------------------------------------------- 87

9

Tableau XVII : Réponses in vivo à la sulfadoxine-pyriméthamine et in vitro à la pyriméthamine (PYR)

et mutation des gènes dhfr et dhps --------------------------------------------------------------------------------------89

Tableau XVIII : Répartition des isolats dhfr mutants dans la population des sujets traités à la SP et

dans la population des isolats à sensibilité in vitro connue ---------------------------------------------------------90

Tableau XIX : Répartition des isolats dhps mutants dans la population des sujets traités à la sulfadoxine-

pyriméthamine et dans la poppulation des isolats à sensibilité in vitro connue ---------------------------------- 92 Tableau XX : Chimiosensibilité et profil génétique (dhfr-ts et dhps) des isolats de P. falciparum ----------- 93

Tableau XXI : Résultats de la surveillance de la chimiorésistance de P. falciparum

dans quelques pays africains -------------------------------------------------------------------------------------------- 110

Tableaux en annexes

Tableau i : Sujets ayant un ETP ou une RCPA lors du test de l'efficacité thérapeutique de la chloroquine

et de la sulfadoxine-pyriméthamine ------------------------------------------------------------------------------------ 166

Tableau ii : CI50 des isolats de P. falciparum résistants à la chloroquine (CQ) et à la pyriméthamine ------- 167

Tableau iii : Nature des isolats après PCR-RFLP du gène dhfr de P. falciparum -------------------------------- 168

Tableau iv : Acides aminés de la PFCRT, DHFR et DHPS des isolats de P. falciparum ------------------------ 169

Tableau v : Acides aminés de la PFMDR-1 des isolats de P. falciparum ------------------------------------------ 172

Figures Figure 1: Répartition des réponses cliniques et parasitologiques aux antipaludiques ---------------------------- 69

Figure 2 : Sensibilité in vitro de P. falciparum à la chloroquine, à la pyriméthamine et à la quinine --------- 71

Figure 3 : Répartition des isolats selon les génotypes ----------------------------------------------------------------- 78

Figure 4 : fréquence de mutation des codons des gènes dhfr, dhps, pfcrt et pfmdr-1 ----------------------------- 96

10

RESUME

Le paludisme, infection parasitaire mortelle dans sa forme grave, est très répandu en zone

intertropicale où il sévit de façon endémique. Le traitement de cette pathologie est rendu difficile

ces dernières années à cause de l'émergence des souches résistantes de P. falciparum, agent

majoritairement causal du paludisme en Afrique subsaharienne, aux antipaludiques usuels (amino-

4-quinoléines, antifoliques et antifoliniques) accessibles à la plupart des familles à revenu modeste.

Depuis la constatation en 1986 des premiers cas de résistance du parasite en Côte d'Ivoire,

relativement peu d'études ont été consacrées à l'évaluation de la chimio-résistance de P. falciparum

dans ce pays. Il nous a donc paru nécessaire de mettre en place un système de surveillance de la

résistance de P. falciparum aux antipaludiques au moyen des tests d'efficacité thérapeutique, in

vitro et moléculaires, basés sur l'évaluation des marqueurs génétiques de la résistance aux

antipaludiques.

Le test d'efficacité thérapeutique a concerné la chloroquine (CQ) et la sulfadoxine-

pyriméthamine (SP) selon le protocole de l'OMS de 14 jours de suivi, deux années consécutives

pour chaque médicament. La classification des réponses au traitement s'est faite selon le nouveau

protocole de l'OMS 2002, en termes d'échec thérapeutique précoce (ETP), tardif (ETT) et de

réponse clinique et parasitologique adéquate (RCPA). Dans l'étude in vitro, les isolats de P.

falciparum prélevés des sujets atteints de paludisme ont été mis en culture en présence de

concentrations variables d'antipaludiques (chloroquine, pyriméthamine, quinine). Pour chaque isolat

mis en culture, nous avons déterminé sa sensibilité à chaque molécule en fonction de la

concentration inhibitrice 50 % (CI50). Le seuil de résistance varie selon qu'il s'agit de la chloroquine,

100 nM ; de la pyriméthamine (PYR), 100 nM ; de la quinine (QU), 800 nM. À l'exception de la

chloroquine, les seuils de résistance n'ont pas encore été validés et restent arbitraires. Les

techniques de biologie moléculaire offrant de nouvelles possibilités de recherche en parasitologie,

l'approche plus fondamentale basée sur l'évaluation des supports génétiques de la résistance a été

11

réalisée après extraction de l'ADN plasmodial et l’amplification par PCR des gènes pfcrt, dhfr, dhps

et pfmdr1. La digestion enzymatique ou RFLP à l'aide d'endonucléases spécifiques Apo I pour le

codon 76 du gène pfcrt, et Alu I, Bsr I et Scr FI pour le codon 108 du gène dhfr ont permis d'évaluer

rapidement sur un grand nombre d'isolats la proportion de parasites sauvages et mutants. Le

séquençage des fragments d'ADN des gènes dhfr, dhps, pfmdr-1 de chaque isolat de P. falciparum a

été réalisé après purification de l'amplifiat et a permis de rechercher d'éventuelles nouvelles

mutations en plus des mutations habituelles impliquées dans la résistance de P. falciparum aux

antipaludiques.

Les résultats du test de l'efficacité thérapeutique de la chloroquine ont révélé 44,6 % d'échecs

thérapeutiques dont 21,7 % d'échecs thérapeutiques précoces et 22,9 % d'échecs thérapeutiques

tardifs contre 55,4 % de réponses cliniques et parasitologiques adéquates. Les nombreux cas

d'échecs thérapeutiques tardifs sont répartis en échecs parasitologiques tardifs (19,3 %) et en échecs

cliniques tardifs (3,6 %). En ce qui concerne la sulfadoxine-pyriméthamine, 23,6 % d'échecs

thérapeutiques contre 76,4 % de réponses cliniques et parasitologiques adéquates ont été observés.

La différence entre les pourcentages d'échecs thérapeutiques à la chloroquine et à l’association

sulfadoxine-pyriméthamine est significative : pour χ2 = 5,6 ; ddl = 1 ; p = 0,02. Par ailleurs, aucun

cas d'échec thérapeutique tardif à la sulfadoxine-pyriméthamine (incluant les échecs

parasitologiques tardifs) n'a été observé dans cette étude. L'étude de la chimio-sensibilité in vitro a

révélé quant à elle, 63,8 % d'isolats chloroquino-sensibles (CQ-S) et 36,2 % d'isolats chloroquino-

résistants (CQ-R). La classification arbitraire des réponses in vitro à la pyriméthamine en sensible :

en dessous de 100 nM ; résistance modérée : entre 100 et 2000 nM ; forte résistance : plus de

2000 nM, a donné 8 % d'isolats sensibles, 53 % d'isolats modérément résistants et 39 % d'isolats

hautement résistants. Il n'existe aucune différence significative entre le groupe des isolats

chloroquino-résistants et des isolats hautement résistants à la pyriméthamine, (χ2 = 0,09 ; ddl = 1 ; p

= 0,76). Aucun isolat quinino-résistant n'a été mis en évidence dans cette étude. L'analyse du

12

polymorphisme des fragments d'ADN des isolats de P. falciparum a révélé 100 % d'isolats K76T

chez les enfants ayant un échec thérapeutique à la chloroquine et 71 % d'isolats K76T au sein des

isolats chloroquino-résistants. Cependant, 12 % des enfants ayant une réponse clinique et

parasitologique adéquate à la chloroquine portaient également des isolats K76T. Les mutations

affectant les gènes dhfr et dhps ont concerné respectivement 26,4 % et 93,4 % des isolats étudiés. Si

les isolats dhfr mutants étaient portés par 86 % des enfants ayant un échec thérapeutique à la

sulfadoxine-pyriméthamine, les mutants dhps étaient présents chez 100 % de ces enfants. 85 % de

ces isolats dhfr mutants étaient, soit hautement résistants, soit avaient une résistance modérée à la

pyriméthamine. La mutation au niveau du gène pfmdr-1 n'a concerné que 79 % des fragments

d'ADN des isolats étudiés. Aucune corrélation n'a été formellement établie entre les mutations

affectant le gène pfmdr-1 et la résistance des isolats à la quinine dans cette étude. Les coefficients

de kappa déterminés pour rechercher la concordance entre les différents tests (in vivo, in vitro,

profil génétique des gènes) montrent d'une part un très bon accord entre les tests in vivo à la

chloroquine et le profil génétique de pfcrt (kappa = 0,9), un accord modéré entre le test in vivo à la

sulfadoxine-pyriméthamine et le test moléculaire du gène dhfr-ts (kappa = 0,59), d'autre part, une

très mauvaise concordance lorsqu'il s'agit du gène pfmdr-1 et l'efficacité thérapeutique de la

chloroquine (kappa < 0), puis entre le test in vitro à la pyriméthamine et le profil génétique de dhps

(kappa = 0,28).

Ces résultats concernant la chimiorésistance de P. falciparum reposent le problème de

l'utilisation de la chloroquine et de la sulfadoxine-pyriméthamine comme médicament de première

et de deuxième intention en Côte d'Ivoire en général, et à Abidjan en particulier. En effet, le nombre

d'échecs thérapeutiques précoces et d'échecs cliniques tardifs (25,3 %) observés avec la chloroquine

dans cette zone est le même que celui obtenu en 2000 (26,9 %) dans le centre de la Côte d'Ivoire.

Bien qu'il n'ait pas été observé d'échec parasitologique tardif avec la sulfadoxine-pyriméthamine, ce

qui permet une bonne récupération du statut hématologique normal des enfants, le nombre d'échecs

13

thérapeutiques (23,6 %) à ce médicament n'est pas loin de 25 % (taux d'échec permettant de décider

d'un changement de médicament). De ce fait, son utilisation comme potentiel suppléant de la

chloroquine dans cette zone n'augure pas de lendemain meilleur.

En définitive, ces résultats qui prennent en compte les différents aspects de la surveillance de

la résistance serviront de base de données au programme national de lutte contre le paludisme

(PNLP) en Côte d'Ivoire pour une meilleure utilisation et une rationalisation des antipaludiques

usuels dans le district d'Abidjan. Ils vont conduire également à faire un suivi de la chimio-résistance

dans les autres régions du pays. Eu égard aux difficultés en termes de coût et de personnels qualifiés

pour la réalisation des tests in vitro et moléculaire tout aussi utiles pour surveiller les variations de

la sensibilité de P. falciparum aux antipaludiques et offrir un système d'alerte précoce, il

conviendrait pour le PNLP en collaboration avec les Institutions de recherche locales et sous

régionales qui en ont les compétences de conjuguer leurs efforts vers une centralisation de la

recherche sur la nature des isolats en circulation.

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Mots clés : Abidjan (Côte d'Ivoire), Dihydrofolate réductase (dhfr), Dihydroptéroate synthétase

(dhps), pfcrt, pfmdr-1, Epidémiologie, Plasmodium falciparum, Résistance aux antipaludiques

14

INTRODUCTION

15

I-1 Définition et historique du paludisme

I-1.1 Définition

Infection parasitaire mortelle dans sa forme grave, le paludisme ou malaria tiré de l’italien

«mal-aria» qui veut dire mauvais air est une parasitose due à un protozoaire. Il est transmis à

l’homme par la piqûre d’un moustique du genre Anopheles et se caractérise par l’apparition d’un

accès fébrile provoqué par l’hémolyse due à la présence et au développement du parasite dans les

hématies. L'agent pathogène de cette érythrocytopathie est un eucaryote unicellulaire appartenant à

l'embranchement des Apicomplexa, à la classe des Aconoidasida, à l'ordre des Haemosporida, à la

famille des Plasmodiidae et au genre Plasmodium (Levine, 1988).

Les plasmodies parasitent divers hôtes dont les reptiles, les oiseaux, les mammifères

(rongeurs, primates) et sont transmis par des Culicidés telles que Anopheles pour les Plasmodiums de

mammifères et Aedes pour les Plasmodiums d'oiseaux dans les conditions naturelles. En Afrique sub-

saharienne, les principaux vecteurs du paludisme sont Anopheles funestus, An. arabiensis et An.

gambiae (Carnevale et al., 1984 ; Mouchet et al., 1993).

I-1.2 Historique

L’origine géographique de cette maladie est controversée et se perd dans la nuit des temps. Si

pour certains auteurs, l’Afrique tropicale serait le berceau de cette affection (Knell, 1991), déjà, au

deuxième siècle avant Jésus-Christ, les grecs et les romains montraient qu’il existait une relation

entre les fièvres intermittentes et la proximité de terrains marécageux. De cette façon, Hippocrate et

Galien seront les premiers à décrire les symptômes de la fièvre tierce bénigne et de la fièvre quarte

(Ambroise-Thomas et al., 1984 ; Brasseur et al., 1987).

L’agent pathogène de cette maladie est un hématozoaire polymorphe (OMS, 1987) qui ne fut

découvert que vers la fin du XIXe siècle (1880) par un médecin français du nom d'Alphonse Laveran.

Il a été nommé Oscillaria malariae puis Heamanoeba malariae. Successivement, furent mis en

évidence après le sous-genre P. falciparum (Welch, 1897) qui n'a qu'une seule génération de

16

schizontes exoérythrocytaires et dont les gamétocytes sont falciformes, le sous-genre Plasmodium

qui comprend P. vivax (Grassi et Feletti, 1890), P. malariae (Laveran, 1881) et P.ovale (Stephens,

1922). L’hypothèse d’une transmission par la femelle d'un moustique du genre Anopheles a été

d'abord émise puis, en 1887 Ronald Ross déclare que l’anophèle était le vecteur du paludisme. Enfin,

les travaux de Grassi vont confirmer cette déclaration en 1898. Cette même année, Batista et Bignami

décrivirent le cycle de reproduction du Plasmodium et en 1900, Schandinu en nomme les différents

stades.

Les ravages dus au paludisme pendant la Première Guerre mondiale vont susciter la recherche

et la mise à disposition de nouvelles molécules antipaludiques telles que les dérivés des amino-8-

quinoléines, des amino-9-acridines et des amino-4-quinoléines dont la plus représentative est la

chloroquine (Bruce-Chwatt et al., 1984 ; Bryskier et Labro, 1988). Cette molécule sera largement

utilisée aussi bien en prophylaxie qu’en traitement curatif. En 1950 l’OMS lance un programme

d’éradication du paludisme à l’échelle mondiale : «le monde uni contre le paludisme». Ce cri

d'alarme va permettre le développement de nombreux antipaludiques de synthèse dont les plus

connus sont l'amodiaquine, la pyriméthamine, le cycloguanil et le proguanil. En 1971 l’activité

antiplasmodiale d’un extrait d’Artemisia annua L. dont le principe actif est l’artémisinine sera mis en

évidence (Bryskier et Labro, 1988). Malheureusement, malgré le nombre relativement considérable

d’antipaludiques disponibles depuis l’identification et l’isolement des deux alcaloïdes fondamentaux

des écorces de quinquina (quinine et cinchonine) en 1820 par Pelletier et Caventou, l’OMS met fin au

programme mondial d’éradication du paludisme à cause de son insuccès car l'enthousiasme

thérapeutique est menacé par l’apparition dès le début des années 60 des premiers cas de résistance à

la chloroquine. Suite à l'échec de ce programme, ainsi qu'à de nombreux cas de paludisme parmi les

troupes américaines envoyées au Vietnam, un vaste programme de criblage a été entrepris par l'armée

américaine et va permettre de découvrir la méfloquine et l'halofantrine qui seront plus tard

développées par les firmes pharmaceutiques.

17

I-2 Maladie et symptômes

I-2.1 Épidémiologie du paludisme (Golvan, 1983).

La simultanéité des événements suivants concourt à l'apparition du paludisme :

i- La présence d’hommes porteurs de gamétocytes de Plasmodium dans le sang. En général, les

enfants sont porteurs de gamétocytes plus fréquemment que les adultes. L’enfant est donc

épidémiologiquement considéré comme meilleur «réservoir» de parasites que l’adulte.

ii- L’existence d’une population d’anophèles vecteurs qui, lors de leur repas sanguin sur l’homme

impaludé, puisent ces gamétocytes et assurent la multiplication sexuée du parasite.

iii- La présence d’hommes réceptifs au Plasmodium, en particulier les enfants autochtones et les

immigrants en date récente. Les vecteurs infectant inoculeront à l’homme sain en le piquant, les

sporozoïtes, formes infestantes des plasmodies.

iv- Au rang des conditions écologiques nécessaires à la vie de l’anophèle et à celle du Plasmodium

qu’il héberge, il faut citer l’exigence thermique. En outre, comme pour toute maladie transmissible,

il faut qu’il soit atteint un seuil d’épidémisation, c’est-à-dire une densité critique de réservoir de

parasites d’anophèles et de sujets réceptifs pour que le paludisme puisse paraître et se manifester

ensuite comme cas sporadiques ou cas d’épidémies vraies.

I-2.2 Symptomatologie (Danis, 1991 ; Gilles, 1991)

Les manifestations cliniques du paludisme sont exclusivement liées à la schizogonie endo-

érythrocytaire. Les principaux signes que sont la fièvre, l’anémie et le subictère sont dus à

l’éclatement des hématies et des rosaces avec libération du pigment malarique. L'expression et la

gravité de la maladie dépendent du parasite (espèce plasmodiale et densité parasitaire) et de l’état de

l’individu (prémunition). Ainsi, ces manifestations vont de l'accès palustre non compliqué à l'accès

palustre grave. Selon les cas, il est possible de distinguer le paludisme de primo-invasion, l'accès

palustre intermittent, l'accès pernicieux ou neuropaludisme, le paludisme viscéral évolutif et la fièvre

bilieuse hémoglobinurique.

18

Le paludisme de primo-invasion est caractérisé par une fièvre allant de 39 à 40°C qui

s’accompagne de myalgies et de céphalées frontales. Cette fièvre diminue d’intensité (frisson et

sueur) après quelque temps. Il est également possible d'observer une hépatomégalie, un subictère et

un herpès labial. Bien traitée, la guérison est sans séquelle. Quand la prise en charge est mal conduite,

le paludisme de primo-invasion peut évoluer vers l’accès palustre intermittent, le neuropaludisme ou

le paludisme viscéral évolutif.

L'accès palustre intermittent est annoncé par des prodromes tels que les céphalées, les

nausées, l’asthénie et l’herpès labial. Il est caractérisé par les stades de frissons, de chaleur et de

sueur. En cas de mauvaise prise en charge, l’accès palustre intermittent peut évoluer vers l’accès

pernicieux ou vers le paludisme viscéral évolutif.

L'accès pernicieux ou neuropaludisme est dû à P. falciparum et se caractérise par un coma

stade II ou plus avec des convulsions généralisées et répétées, un syndrome de détresse respiratoire

aiguë, un œdème pulmonaire, un collapsus circulatoire, une hémoglobinurie, une coagulation

intravasculaire disséminée. Au plan biologique, l'accès pernicieux est caractérisée par une anémie

grave (sévère), une hypoglycémie, une acidose sanguine, une hyperlactatémie ; la multiplication et la

cytoadhérence des hématozoaires sont intenses dans les capillaires cérébraux (WHO, 2000). Le

paludisme grave ou compliqué peut conduire à la mort. Son évolution dépend de la rapidité et de la

qualité de la prise en charge thérapeutique. Il est fatal en 2-3 jours, voire quelques heures, si le

traitement est mal ou non conduit.

Le paludisme viscéral évolutif survient chez un sujet vivant en zone endémique et

insuffisamment ou non prémuni, mais se soumettant à une chimioprophylaxie incorrecte et se faisant

piquer par des anophèles femelles. L’évolution de la manifestation clinique dépend du traitement.

Bien traité, la guérison est sans séquelle ; dans le cas contraire, ce type de paludisme évolue vers

l’accès pernicieux.

19

La fièvre bilieuse hémoglobinurique est une réaction immuno-allergique grave qui survient

classiquement chez un sujet qui se soumet irrégulièrement à un traitement ou probablement une

prophylaxie aux sels de quinine (Djibo et al., 2000 ; Khandelwal et al., 2001). Plus récemment, la

fièvre bilieuse hémoglobinurique a été rapportée après l'administration de l'halofantrine (Vachon et

al., 1992 ; Orlando et al., 1996 ; Bruneel et al., 2002). Dans les zones de chloroquinorésistance, cette

fièvre est de plus en plus rencontrée (Djibo et al., 2000 ; Bruneel et al., 2002).

I-3 Diagnostic biologique

En zone d’endémie palustre, le traitement du paludisme est le plus souvent donné à la suite

d’un diagnostic clinique où le symptôme majeur demeure la fièvre. Ce type de diagnostic est

pleinement justifié dans la mesure où la plupart des centres de santé sont dépourvus de laboratoire et

la majorité de la population est porteuse asymptomatique (WHO, 2000). Néanmoins, si le traitement

présomptif de la fièvre apporte une satisfaction surtout chez les enfants de moins de cinq ans,

confirmer le diagnostic clinique par un examen biologique permet de réduire l'utilisation des

antipaludiques dans le traitement injustifié pour des fièvres non palustres (Yavo et al., 2002). En

effet, la mise en œuvre des programmes de lutte contre le paludisme intègre la recherche d'un

diagnostic précoce et d'un traitement efficace. La clinique de cette affection n'étant pas toujours

évocatrice d'un paludisme, une confirmation biologique est souvent nécessaire. Ainsi, le diagnostic

du paludisme comprend les techniques de diagnostic indirect et direct.

Les techniques de diagnostic indirect consistent à rechercher la présence d’anticorps dans le

sérum du malade. Elles sont indicatives d'une infection antérieure et sont par conséquent sans valeur

diagnostique réelle dans les zones d'endémie palustre. Parmi ces techniques, il existe

l’immunofluorescence indirecte, l’hémagglutination passive, le test Elisa (Mackey, 1982 ; Ambroise-

Thomas et al., 1993 ; Mason et al., 2002).

Quant au diagnostic direct, il permet la mise en évidence du parasite. Ce sont la goutte

épaisse, le frottis sanguin mince (OMS, 1994), le quantitative buffy coat test (QBC) (Yavo et al.,

20

2002), le test parasight, le test optimal. Bien que la plus sensible des techniques de diagnostic, la PCR

demande une longue procédure, des équipements et des réactifs spécialisés et coûteux. La cible est

constituée du matériel génétique du parasite (WHO, 2000).

De toutes ses techniques, l'association goutte épaisse / frottis sanguin demeure la bonne

alternative (Thellier et al., 2002) pour le diagnostic biologique du paludisme dans les pays en

développement et est surtout recommandée pour le suivi des sujets inclus dans le protocole OMS de

l'efficacité thérapeutique des antipaludiques.

I-4 Antipaludiques

Depuis les découvertes empiriques, il y a plusieurs siècles, de l’activité de Artemisia annua L.

(Warburton, 1984) en Chine et de l’écorce de quinquina sur les «fièvres de marais» en Amérique du

Sud, jusqu’à nos jours, plusieurs centaines de milliers de médicaments antipaludiques ont été étudiés.

À l’heure actuelle, moins d’une dizaine de ces produits sont disponibles, témoignant de la difficulté

d’une recherche qui s'avère peu productive et du génie évolutif des plasmodies qui résistent de plus

en plus aux médicaments.

Dans cette situation, il convient de bien connaître les quelques produits encore utilisables afin

de tirer le meilleur profit de leur qualité. Il est possible de classer les antipaludiques en fonction de

leur nature chimique (amino-4-quinoléines, amino-8-quinoléines, amino-alcools, sesquiterpènes

lactones…), de leur point d’impact sur l’un des stades du cycle évolutif du parasite (schizonticides,

gamétocytocides, sporontocides) et en fonction de leur origine (naturelle, synthèse). De façon

générale, les antipaludiques jusque-là mis à disposition par les firmes pharmaceutiques sont tous des

schizonticides sanguins, actifs sur les formes asexuées du parasite. Néanmoins, certains exercent une

action inhibitrice sur les gamétocytes immatures de P. falciparum (Bryskier et Labro, 1988). Les

schizonticides intra-érythrocytaires peuvent être divisés en trois classes selon leur lieu d'action : les

lysosomotropes, les antimétabolites et les antibiotiques.

21

I-4.1 Lysosomotropes

L’efficacité sélective de ces antipaludiques est le fait de leur concentration très élevée atteinte

dans les hématies parasitées par rapport aux hématies non parasitées. Ils agissent sur le processus ou

les produits de digestion de l'hémoglobine (Warhurst et al., 2002). Ce sont essentiellement les amino-

4-quinoléines, les bases de mannich, les amino-alcools, et les dérivés de l'artémisinine.

Les amino-4-quinoléines représentent une famille de médicaments dont le plus utilisé est la

chloroquine, antipaludique majeur qui a révolutionné le traitement du paludisme en Afrique. Ainsi,

par son efficacité, sa tolérance exceptionnelle et sa moindre toxicité par rapport aux autres molécules

de la même famille, la chloroquine a pratiquement éclipsé pendant longtemps les autres molécules

antipaludiques découvertes dans les années 1950. Malheureusement, elle est confrontée à une

résistance confirmée des hématozoaires du paludisme du fait de sa moindre accumulation à

l’intérieur des érythrocytes parasités par les plasmodies résistants.

Les bases de mannich comprennent l'amodiaquine, l'amopyroquine et la pyronaridine.

L’amodiaquine est indiquée dans les cas de chloroquino-résistance. Elle est rapidement et presque

totalement absorbée et est entièrement métabolisée dans le foie pour donner un métabolite actif, le

monodeséthylamodiaquine. Néanmoins, tout comme la chloroquine, elle entraîne des troubles

digestifs (nausées, vomissements), oculaires, visuels, cutanés (prurit, urticaire). De plus

l’amodiaquine provoque une agranulocytose et une hépato-toxicité. Elle est donc contre-indiquée en

prophylaxie. Quant à la pyronaridine, elle a été synthétisée en Chine en 1970 (Chang et al., 1992 ;

Zoguéreh et Delmont, 2000) et dérive à la fois de la quinacrine (mépacrine) et de l'amino-4-

quinoléine (amodiaquine). Les CI50 sur les souches sensibles et chloroquinorésistantes sont

comparables à celle de la méfloquine (Basco et al., 1999). Néanmoins sa biodisponibilité est faible

(35 %) (Debaert, 2000).

Les amino-alcools regroupent des composés à structures chimiques diverses. Ils ont en

commun un radical carbinol ou méthanol. La connaissance de la structure chimique de la quinine a

22

servi de modèle au développement et à la synthèse des aryl-amino-alcools (Basco et al., 1994 ;

Ridley et Hudson, 1998). Ces derniers comprennent essentiellement les quinoléines méthanols

(méfloquine), les phénanthrènes méthanols (halofantrine) et le luméfantrine.

L’artémisinine est un endopéroxyde naturel issu de la pharmacopée chinoise. La présence du

groupe peroxy est essentielle pour l’activité antipaludique de l’artémisinine et ses dérivés actifs dont

la dihydro-artémisinine qui est une forme lactone ou hémiacétal des sesquiterpènes. Elle possède une

activité antipaludique élevée en se concentrant dans les érythrocytes parasités. En dehors de ce

dérivé, il en existe d'autres tels que l’artéméther qui est un dérivé méthyl éther qui s’obtient par

réduction du carbonyle lactone, l’artélinate (acide artélinique), l’artééther (dérivé éthyléther) et

l’artésunate (acide artésunique). Cette dernière molécule résulte de la réduction du lactone, ce qui

permet la formation d’éther et d’ester (Basco et al., 1994). Les schizonticides à action rapide sont le

plus souvent utilisés dans le traitement des phases aiguës du paludisme, soit seuls, soit en association

avec d’autres schizonticides.

I-4.2 Antimétabolites (Lau et al., 2001)

Ils regroupent les antifoliques, les antifoliniques et les analogues de l'ubiquinone. Les

antifoliques et les antifoliniques ne s’accumulent pas directement dans le plasma après absorption,

mais se lient aux tissus, aux protéines et aux lipides de l’organisme. Cette caractéristique leur confère

un effet prolongé.

Les antifoliques sont les sulfamides et les sulfones. Les sulfamides sont des dérivés du

sulfanilamide ou de l’amide-4-aminobenzène acide sulfonique. Les deux composés actuellement

utilisés comme antipaludiques sont la sulfadoxine et le sulfalène. Ces molécules peuvent entraîner

une agranulocytose et une réaction cutanée pouvant aller d’un urticaire à une manifestation plus

grave réalisant le syndrome de Stevens-Johnson. De ce fait, elles sont contre-indiquées chez le sujet

hypersensible, les prématurés et le nouveau-né pendant le premier mois et chez la femme enceinte

pendant les trois premiers mois.

23

Les antifoliniques sont représentés par les biguanides et leurs dérivés. Les plus utilisés en

thérapeutique antipalustre sont le proguanil et la pyriméthamine. Leur bonne activité antipaludique

est liée à la présence du noyau chlorophényl et au groupe isopropyle pour le proguanil et à la

présence du substituant 5-p-chlorphényl et du groupe éthyle en position 6 pour la pyriméthamine. Le

proguanil et ses dérivés sont d’absorption rapide mais d’élimination lente.

Quant aux analogues de l'ubiquinone, ils sont représentés par l'hydroxynaphtoquinone dont

l'atovaquone. C'est un produit nouvellement reconnu comme possédant des propriétés antipaludiques

(Baggish et Hill, 2002) en plus de son indication dans le traitement de la pneumocystose et de la

toxoplasmose cérébrale. Il est actif sur tous les stades du cycle du parasite et sur les souches de P.

falciparum résistantes ou non à la chloroquine. L’atovaquone est utilisée en association avec le

proguanil (Malarone®) afin de réduire les taux de rechutes relativement élevés (30 %). Les effets

secondaires qui ont été rapportés sont essentiellement des troubles digestifs (nausées, vomissements),

des douleurs abdominales et des céphalées (Laronze et laronze, 2000).

I-4.3 Antibiotiques (Zoguéreh et Delmont, 2000)

Les antibiotiques les plus utilisés en thérapeutique du paludisme sont les cyclines et les

macrolides. Ces antibiotiques sont actifs sur les formes sanguines asexuées et sur les formes exo-

érythrocytaires primaires de P. falciparum. Ils sont utilisés dans les régions où la sensibilité de P.

falciparum à la quinine est diminuée (Asie du Sud-Est) (Bourgeade et Delmont, 1998). Ces

antipaludiques sont représentés essentiellement par la tétracycline (macrolides) et la doxycycline

(cyclines). La tétracycline est toujours utilisée en thérapeutique en association avec la quinine à cause

de son action lente. Quant à la doxycycline, elle est utilisée en chimioprophylaxie chez le sujet

intolérant ou en cas de contre-indication à la méfloquine et projetant un voyage de courte durée dans

une zone de méfloquino-résistance (Baudon, 1999). Elle est active aussi bien sur les souches

multirésistantes que sur les souches chloroquinosensibles. Toutefois, les cyclines sont contre-

indiquées chez la femme enceinte et le jeune enfant de moins de 11 Kg ou de moins de 8 ans.

24

I-4.4 Mode d’action des antipaludiques

I-4.4.1 Métabolisme du Plasmodium

Digestion de l'hémoglobine

Une fois à l'intérieur de l'hématie le Plasmodium digère l'hémoglobine afin d'obtenir les acides

aminés nécessaires à sa synthèse protéique et à la formation d'ADN. Ce processus fait intervenir deux

protéases aspartates (également appelées plasmepsines I et II) et probablement une cystéine protéase.

La première protéase aspartate intervient au niveau du stade trophozoïte et la deuxième au stade

sporozoïte et au stade jeune schizonte. Quant à la cystéine protéase, les travaux de

Kamchonwongpaisan et al. ont montré qu'elle participe à la dégradation de la globine à un niveau

plus précoce (Kamchonwongpaisan et al., 1997). La digestion de l'hémoglobine entraîne la formation

de la ferriprotoporphyrine IX (FPP IX) ou hématine. Cette dernière est toxique pour le parasite, mais

dans les conditions normales, le Fe 2+ de son noyau héménique est rapidement oxidé en Fe 3+. La

FPP IX va ensuite s'associer à une protéine liant l'hème sous forme d'hémozoïne ou pigment

malarique non toxique. L'hémozoïne est un polymère constitué de monomères d'hème assemblés par

un oxygène lié à Fe 3+ (Ridley, 1998).

Métabolisme des folates

Les bases puriques et pyrimidines sont nécessaires à la synthèse de l'ADN. Plasmodium étant

incapable de synthétiser les bases puriques, il utilise celles de l'hôte. Par contre, au niveau des bases

pyrimidiques, il les synthétise de novo parce qu'il est incapable d'utiliser l'acide folique de l'hôte. Ceci

aboutit à la synthèse de dihydroptéroate grâce à l'action de la dihydroptéroate synthétase (DHPS) sur

l'acide p-aminobenzoïque, puis à la synthèse de dihydrofolate par action de la dihydrofolate réductase

(DHFR), véritable cofacteur dans la synthèse des pyrimidines.

Chaîne de transport des électrons

L'existence d'une mitochondrie dans les stades asexués et sexués du parasite a été mise en

évidence par Krungkrai et al (Krungkrai et al., 1999). Celle-ci serait le centre d'un système de

25

transport d'électron dont les fonctions non encore bien élucidées sont étroitement liées à la

biosynthèse de novo des pyrimidines en récupérant les électrons de la dihydroorotate

déshydrogénase. Ceci génère un potentiel de membrane qui intervient dans de nombreuses activités

métaboliques tels que le catabolisme des acides aminés, des lipides et de l'hème ou encore

l'homéostasie du calcium intracellulaire (Srivastava et al., 1997).

I-4.4.2 Mode d’action des lysosomotropes

Les amino-4-quinoléines

De l’espace extra-cellulaire à l’espace intra-cellulaire des hématies, il existe un gradient de

pH qui s’accentue lorsque l’hématie est parasitée, du fait de la vacuole digestive acide. Ces

antipaludiques sont des bases faibles (Krogstad et Schlesinger, 1986 ; Krogstad et al., 1986) qui se

concentrent sélectivement dans la vacuole parasitaire où elles deviennent protonées (Yayon et al.,

1984). Leur passage dans la vacuole digestive est soit un phénomène passif qui suit le gradient de pH,

régulé par une ATPase vacuolaire, soit un phénomène actif. Dans ce dernier cas, ce passage nécessite

la présence d'une perméase ou d'un autre transporteur (Warhurst, 1986 ; Sanchez et al., 1997). Une

fois à l’intérieur des hématies, les amino-4-quinoléines inhibent les activités enzymatiques (protéases,

phospholipases, phosphatases) et la dégradation de l’hémoglobine, source principale des acides

aminés du parasite intra-érythrocytaire. Leur action concerne principalement les stades asexués

(trophozoïtes et schizontes immatures) du parasite (Le Bras et al., 1993). Ainsi, les amino-4-

quinoléines s'intercalent entre les dimères d'hématine ou FPPIX, produit de dégradation de

l'hémoglobine à l'intérieur de la vacuole digestive du parasite (Moreau et al., 1982 ; Warhurst et al.,

2002). En effet, elles ont une forte affinité pour la FPPIX avec laquelle elles se lient pour former un

complexe inhibiteur d’activités enzymatiques, plus spécifiquement celles des protéases (Van der Jagt

et al., 1987 ; Dorn et al., 1998 ; Ridley, 1998). En entraînant une fuite ionique (potassium), ce

complexe est toxique pour les membranes plasmodiales et érythrocytaires.

26

Les bases de Mannich

Le mécanisme d'action de l'amodiaquine n'est pas encore connu.

Les amino-alcools

Ces antipludiques se lient dans le plasma à des lipoprotéines de haute densité. Les principes

actifs de ces médicaments interagiraient avec une protéine membranaire du globule rouge (la

stomatine) et seraient transférés dans le parasite par une voie de recapture des phospholipides

exogènes (Debaert, 2000). Si le mode d'action des amino-4-quinoléines est connu, les bases

moléculaires qui sous-tendent l'effet de la quinine et des autres amino-alcools ne sont pas encore

totalement élucidées.

Mode d’action des sesquiterpènes lactones (Basco et al., 1994)

Issue de la pharmacopée chinoise, la valeur thérapeutique de l’artémisinine a été redécouverte

au début des années 1970 par les chercheurs chinois qui ont isolé et purifié le principe actif. C’est

l'un des rares endoperoxydes naturels qui est caractérisé par la présence d’un groupement peroxyde

(épidioxyde). La différence avec les autres antipaludiques, surtout les amino-alcools et les amino-4-

quinoléines, est l’absence d’un hétérocycle comprenant un azote. L’action antipaludique et la stabilité

de la molécule sont le fait des ponts carbone-oxygène situés à des distances alternantes. Les

sesquiterpènes produisent rapidement des modifications dans le noyau du parasite. La

dihydroartémisinine, le principal composé actif de l’artémisinine, inhibe la synthèse protéique

plasmodiale et bloque la réplication des acides nucléiques. Son mode d’action implique les radicaux

libres qu’elle produit grâce à l’effet oxydant du groupement époxy en présence du fer.

I-4.4.3 Mode d’action des antimétabolites

Les antifoliques et les antifoliniques agissent, respectivement, comme des inhibiteurs de la

dihydroptéroate synthétase (DHPS) et de la dihydrofolate réductase thymidylate-synthétase (DHFR-

TS), enzyme bifonctionnelle (Bzik et al., 1987 ; Warhurst et al., 2002 ; Yuvaniyama et al., 2003) qui

catalyse les réactions séquentielles de la biosynthèse du désoxythymidine monophosphate (dTMP)

27

nécessaire à la synthèse de l’ADN du Plasmodium. Ces deux sous-familles de composés agissent

séquentiellement sur la même voie métabolique du parasite. Ainsi, les antifoliques inhibent par

compétition avec l'acide p-amino-benzoïque (PABA), l'action de la dihydroptéroate synthétase

(DHPS), absente des cellules des mammifères et dont le rôle est de catalyser la synthèse de

dihydroptéroate à partir du PABA. Quant aux antifoliniques, ils ont pour cible la dihydrofolate

réductase (DHFR). Ils se fixent sur le site actif de l'enzyme et empêchent la synthèse des bases

pyrimidiques, ce qui aboutit nécessairement à un arrêt de la croissance du parasite. On pensait fort

récemment, que les antifoliniques utilisés (pyriméthamine, cycloguanil) avaient une plus forte affinité

pour le site actif de la DHFR plasmodiale que pour celui de la DHFR humaine. En réalité, l'effet

différentiel de l'antifolinique vis-à-vis de ces deux cibles vient du fait que la cellule humaine

augmente sa synthèse de DHFR lorsque la quantité de molécules actives vient à baisser. Le parasite

ne possède pas ce mécanisme de rétrocontrôle (Zhang et Rathod, 2002). L'emploi simultané de

composés de ces deux sous-familles d'antipaludiques entraîne une potentialisation de leurs effets.

Ainsi, la dose nécessaire de chaque composé est diminuée et les parasites sont détruits plus

rapidement.

I-4.5 Schéma de l’utilisation des antipaludiques

Suivant les recommandations de l'OMS, le programme national de lutte contre le paludisme

(PNLP) dans la majorité des pays de l'Afrique tropicale recommande l’utilisation de trois

médicaments pour le traitement de l’accès palustre non compliqué à P. falciparum. Il s’agit de la

chloroquine ou de l’amodiaquine, de la sulfadoxine-pyriméthamine et de la quinine. La disponibilité

de ces antipaludiques dans les pharmacies de la santé publique (PSP) et leur coût les rendent

accessibles aux familles à revenu modeste. Leur prescription est hiérarchisée en trois niveaux de

traitement qui sont le traitement de première, deuxième et troisième intention. En dehors de ces

quatre antipaludiques, d’autres antipaludiques comme les aryl-amino-alcools et les dérivés de

l’artémisinine sont disponibles dans les officines. Malgré l’efficacité relative de la sulfadoxine-

28

pyriméthamine (Henry et al., 2002) et totale de la quinine en cas de chloroquino-résistance, la plupart

des autres antipaludiques sont utilisés et régulièrement prescrits par les cliniciens.

I-5 Chimiorésistance

I-5.1 Définition

Depuis l’apparition de la résistance de P. falciparum aux antipaludiques de synthèse, les

formes endo-érythrocytaires asexuées deviennent de plus en plus capables de survivre aux doses

thérapeutiques de plusieurs antipaludiques actuellement disponibles. La survie de ces parasites ou

leur aptitude à se reproduire malgré l’administration et l’absorption du médicament employé à des

doses égales ou supérieures aux doses ordinairement recommandées mais comprises dans les limites

de tolérance du sujet a été définie en 1973 par l’OMS comme étant la chimio-résistance (OMS,

1973). Les progrès réalisés en matière de recherche pharmacologique et biochimique (Homewood et

Neame, 1980) ont permis d’appréhender d’autres approches beaucoup plus techniques de la chimio-

résistance, lesquelles permettent de clarifier, décrire et mieux comprendre la résistance de

Plasmodium aux différents médicaments (Basco et Ringwald, 2000).

I-5.2 Mécanisme de résistances de P. falciparum aux antipaludiques

I-5.2.1 Mécanisme de résistances aux lysosomotropes

L’essentiel des études réalisées porte sur la chloroquine. En effet, toutes les souches de P.

falciparum chloroquino-résistantes étudiées ont montré un déficit de concentration du médicament

dans la vacuole digestive, plus probablement en rapport avec une sortie (efflux) rapide de la

chloroquine hors de la vacuole, qu’avec une diminution de la pénétration du produit (Krogstad et al,

1987). Ce phénomène d'efflux de médicament serait lié à des mutations ponctuelles au niveau du

gène pfcrt (P. falciparum chloroquine resistance transporter) situé sur le chromosome 7 dont le

produit d'expression est une protéine transmembranaire localisée dans la membrane digestive de la

vacuole du parasite (Mayor et al., 2001; Wellems et Plowe, 2001). Ces mutations sont à la base de

l'acidification du pH vacuolaire qui pourrait avoir pour effet d'altérer le flux de chloroquine ou de

29

réduire la fixation du médicament à l'hématine (Fidock et al., 2000). Les études réalisées par Fidock

et al. sur les clones des référence ont été confirmées par les résultats obtenus chez les isolats d'origine

africaines par Djimde et al (Djimde et al., 2001). En dehors de la sortie de la chloroquine, le gène

pfcrt est normalement impliqué dans la régulation du gradient de pH.

I-5.2.2 Mécanisme de résistances aux antimétabolites (antifoliques et antifoliniques)

Le rôle essentiel des antifoliques est de permettre une potentialisation des antifoliniques. La

résistance à ces composés est due à une modification de l'enzyme DHPS (pour revue, le Bras et al.,

1996). Ainsi, la résistance aux sulfamides est le fait de mutations ponctuelles qui surviennent dans le

gène de la DHPS et correspond à des mutations des codons 436, 437, 581. Cette résistance augmente

avec des mutations additionnelles au niveau des codons 540 et 613 (Brooks et al., 1994 ; Triglia et

al., 1997 ; Wang et al., 1997 ; Masimirembwa et al., 1999 ; Mberu et al., 2002).

La résistance aux antifoliniques correspond à la mutation survenant sur le gène de la DHFR

qui remplace la sérine 108 par une asparagine (Peterson et al., 1991 ; Thaithong et al., 1992 ; Basco

et al., 1995 ; Eldin et al., 1996 ; Reynolds et Roos, 1998). Deux ou trois mutations additionnelles qui

affectent en plus du codon 108, les codons 51, 59 et rarement les codons 16 en association avec Thr-

108, et le codon 164 élèvent le niveau de la résistance (Basco et al., 1995 ; Biswas, 2001).

I-5.3 Conditions d’apparition de la résistance

Il est remarquable que ce ne sont qu’un petit nombre de mutations, toujours les mêmes, qui,

affectant le plus souvent le site actif de l’enzyme, sont responsables de la résistance.

Au laboratoire, par mutagenèse et pression médicamenteuse en culture in vitro, on peut

sélectionner différentes mutations entraînant la résistance du parasite au médicament. Ainsi, dans le

cas des antifoliniques, il existait différentes mutations du gène dhfr dans les souches de P.

falciparum. Une étude faite à partir des isolats (de la nature) a bien précisé que la mutation du codon

108 (ser108asn) apparaît toujours en premier lieu (Peterson, 1988), entraînant un premier degré de

résistance à la pyriméthamine, suivie éventuellement par les mutations des codons 51, 59 et 164, qui

30

augmentent fortement la résistance (Basco et al., 1995 ; Eldin de Pécoulas et al., 1995). Ceci est dû

au fait que l’enzyme DHFR-TS ne peut accepter que certaines modifications structurales tout en

gardant son activité enzymatique.

I-5.4 Facteurs favorisant la résistance

Quatre facteurs sont en cause dans l’émergence des résistances de P. falciparum dans une

zone.

La pression médicamenteuse et la sélection des mutants résistants

Dans une zone d’endémie palustre, les premiers parasites mutants qui apparaissent sont

généralement très peu nombreux par rapport aux parasites sauvages. Selon la loi des équilibres

biologiques, leur nombre reste longtemps peu élevé tant qu’il n’y a pas d’intervention de facteurs

extrinsèques. Dans cette zone, l’utilisation d’un médicament aura pour conséquence l’élimination des

individus (plasmodies) sauvages, ce qui va faire rompre l’équilibre en faveur des mutants résistants.

Ainsi, plus ce médicament sera utilisé, plus on sélectionnera des mutants résistants. C'est la pression

médicamenteuse qui permet l’émergence des mutants pré-existants et non l’adaptation progressive

des parasites à des doses croissantes de produits.

Le degré d’immunité de la population

L’immunité (humorale ou cellulaire) agit de manière similaire aussi bien sur les isolats

sensibles que résistants à un médicament (Bruce-Chwatt et al., 1984 ; Leri et al., 1997 ; Smith et al.,

2002). Dans une zone où la transmission du paludisme est continue, le degré d’immunité de la

population est élevé et les mutants résistants qui échappent à l’action du médicament sont attaqués

par les facteurs de l’immunité. Si le niveau d’immunité n’est pas suffisant (sujets expatriés, jeunes

enfants non encore immunisés, adulte en état de déficit immunitaire), les mutants résistants se

multiplieront et engendreront des manifestations cliniques (Artavanis-Tsakonas et al., 2003).

31

Les voyages (Merritt et al., 1998 ; Filler et al., 2003)

Un voyageur non immun va emporter des mutants résistants d’une zone de chimiorésistance

dans une zone où ces mutants résistants n’existaient pas. Les sujets non immuns et non prémunis de

cette zone d’accueil vont permettre le développement et la dissémination de la résistance.

Le rôle des vecteurs anophéliens (Filler et al., 2003)

Selon les espèces d’anophèles vectrices, la multiplication des mutants résistants pourra être

favorisée ou non. Ainsi, en Asie du Sud-Est, la dissémination de souches de P. falciparum

chloroquino-résistantes serait due à Anopheles balabacensi, très bon vecteur anthropophile et

exophile.

I-5.5 Etude de la chimiorésistance

Quatre approches méthodologiques sont utilisées pour analyser le phénomène de la

chimiorésistance du paludisme. Le test de l'efficacité thérapeutique, qui, bien que non standardisé

pour tous les antipaludiques, représente la méthode de base pour déceler la résistance. Le test in vitro,

qui contourne certaines difficultés du test de l'efficacité, nécessite un minimum de formation des

réalisateurs et un équipement onéreux pour les laboratoires du sud. La biologie moléculaire

représente une autre approche technique importante, car elle permet d’analyser les gènes impliqués

dans la résistance (OMS, 2002). Enfin, le dosage du médicament dans le sang permet de juger si un

échec thérapeutique ou prophylactique a bien lieu en présence d’un taux plasmatique adéquat

d'antipaludique (Basco et Ringwald, 2001).

I-5.5.1 Test de l'efficacité thérapeutique

Le test de l'efficacité thérapeutique actuellement utilisé, est celui de l’OMS de 1994 (OMS,

1994) modifié en 1996 (OMS, 1996) et en 2001 (OMS, 2002). C’est un test simplifié, standard de 14

jours de suivi dont l'interprétation également simplifiée tient compte des réponses cliniques et

parasitologiques. Le test consiste à administrer à un sujet porteur de P. falciparum, présentant un

paludisme non compliqué, la dose ordinairement recommandée d’un antipaludique. Les contrôles

32

cliniques et parasitologiques sont effectués les jours 2, 3, 7 et 14. L’efficacité du médicament est

exprimée en termes de réponse clinique et parasitologique adéquate (RCPA), en échec thérapeutique

précoce (ETP) et en échec thérapeutique tardif (ETT).

Le test de l'efficacité thérapeutique est facile à mettre en route avec un minimum

d’équipements et de formation des personnels sanitaires. Il permet le recueil des données cliniques et

épidémiologiques sur le terrain. Mis à part ces avantages, le test comporte des inconvénients.

Lorsqu’il s’agit de le réaliser en ambulatoire, les sujets ne se présentent plus à l’équipe de recherche

pour les contrôles dès qu’ils se sentent mieux et ce, malgré les engagements pris dès le départ. Aussi,

des facteurs humains individuels peuvent-ils être responsables de fausses résistances, ce peut être des

troubles d’absorption du médicament dus à un défaut d’absorption intestinale, une élimination rapide

du produit par vomissement ou par diarrhée. D’autres facteurs tels qu'un faible taux de bio-

transformation du médicament, la dégradation avant même sa prise, une réinfection comme c’est

souvent le cas en Afrique tropicale, sont responsables de fausses résistances. Par ailleurs, la

prémunition et la prise non rapportée d’autres médicaments antipaludiques et de remèdes à base de

plantes avant ou après le traitement peuvent fausser l’interprétation des réponses cliniques adéquates

qui dans ces conditions ne signifient pas obligatoirement une sensibilité des parasites au médicament.

I-5.5.2 Test in vitro

I-5.5.2.1 Généralités

Depuis la mise au point du premier test in vitro par Rieckmann (Rieckmann et Lopez-

Antunauo, 1971) pour évaluer la sensibilité de P. falciparum à la chloroquine et à d'autres

antipaludiques, jusqu'à maintenant, de nombreux autres tests qui ne sont en réalité que des variantes

de la méthode de culture in vitro de Trager et Jensen (Trager et Jensen, 1976) ont vu le jour. Ainsi, en

1978, une épreuve in vitro a été adoptée à partir du microtest de Rieckmann (Rieckmann et al., 1978),

et deviendra plus tard le microtest standard de l'OMS après son évaluation par des chercheurs

extérieurs et par ceux de l'OMS. Ce test est fondé sur la lecture microscopique. Les autres méthodes

33

d'évaluation de la chimiosensibilité in vitro utilisées sont le test isotopique de Desjardins et le semi-

microtest de Le Bras (Le Bras et al., 1980 ; Deloron et al., 1982). Le test de Desjardins est une

méthode semi-automatisée qui mesure l'effet de l'antipaludique par l'incorporation d'hypoxanthine

radiomarquée par le parasite (Desjardins et al., 1979).

I-5.5.2.2 Culture in vitro de P. falciparum

Il s’agit de cultiver un isolat de P. falciparum en présence de concentrations variables

d’antipaludique et de déterminer la concentration inhibant 50 % de la croissance de cet isolat. Ce test

permet par conséquent de mesurer la capacité de doses croissantes d’un antipaludique d’inhiber la

transformation des jeunes trophozoïtes en schizontes. L’activité de l’antipaludique est appréciée en

fin de test, soit par lecture microscopique, soit par l’incorporation de l’hypoxanthine tritiée (un

précurseur d'acide nucléique) (Desjardin et al., 1979). La concentration 50 % inhibitrice (CI50) est

déterminée soit par régression linéaire soit par régression non linéaire. Ces tests mesurent l’activité

intrinsèque des drogues, le phénotype (résistant ou sensible) déterminé par ce test semble objectif et

reproductible. En dehors des schizonticides sanguins déjà connus et pour lesquels des seuils de

sensibilité ont été validés, le modèle in vitro permet également le criblage systématique de nouveaux

antipaludiques (Bryskier et Labro, 1988 ; Bickii et al., 2000). Le test in vitro mis au point, le plus

fiable et reproductible, est le micro-test isotopique dont une variante est le semi-microtest de Le Bras

et Deloron (Le Bras et al., 1984). Les difficultés du test in vitro résident dans le fait que les CI50 des

antipaludiques jusque-là proposées pour définir le seuil de résistance se fondent sur la base soit des

isolats importés soit des clones qui ont été longtemps en contact avec des milieux artificiels et qui par

conséquent ne reflètent pas forcément le niveau de sensibilité des isolats fraîchement récoltés du

terrain. Néanmoins, l’étude in vitro apporte des données complémentaires sur la chimiorésistance

quand elle est effectuée en parallèle avec le test de l'efficacité thérapeutique (Basco et Ringwald,

2001).

34

I-5.5.3 Test moléculaire

I-5.5.3.1 Génome de Plasmodium falciparum

C’est récemment qu’il a été possible d’analyser le génome de Plasmodium. Cette situation est

le fait de la complexité de son cycle qui rend les croisements difficiles et de la petite taille de ses

chromosomes qui ne se condensent pas pendant la mitose et qui, par conséquent sont invisibles au

microscope optique. En dépit de ces difficultés, la séparation des chromosomes de cette espèce

plasmodiale par leur taille a été possible par électrophorèse en champ pulsé (Schwartz et al., 1984 ;

Kemp et al., 1985 ; Van der ploeg et al., 1985 ; Wellems et al., 1987). Par ailleurs, le génome de

Plasmodium est haploïde pendant la majeure partie de son cycle à l’exception d’une courte période

de diploïdie qui se déroule chez le moustique (formation de zygote). Aussi, P. falciparum possède-t-il

14 chromosomes dont la taille génomique totale est de 22,8 mégabases (mb) (Goman et al., 1982 ;

Pollack et al., 1982 ; Walliker et al., 1987 ; Gardner et al., 2002), chaque chromosome allant de 650

kb à 3,3 mb. Le polymorphisme de taille des chromosomes résulterait des fréquentes délétions et

recombinaisons observées chez cette espèce (Patarapotikul et al., 1988). En plus de l’ADN

génomique, P. falciparum contient un ADN circulaire extra-nucléaire fonctionnel de 35 kb. L’étude

de sa structure a montré une analogie avec le génome chloroplastique des plantes (Preiser et al.,

1995). En dehors de cet ADN, il existe un autre génome extra-nucléaire, cette fois mitochondrial de

6kb (Feagin, 1982 ; Sharma et al., 2001). L’analyse de sa séquence a permis d’identifier trois gènes

codant pour une protéine (cytochrome oxydase I, cytochrome II et cytochrome b) ainsi que des gènes

codant pour l’ARN ribosomique. Actuellement, la carte de restriction des chromosomes de P.

falciparum est disponible (Corcoran et al., 1988 ; Foote et al., 1989 ; Walker-Jonah et al.,1992).

Le génome de P. falciparum complétement séquencé actuellement compte 5300 gènes qui

codent pour diverses enzymes et protéines de transport (Gardner et al., 2002). Ce génome est

caractérisé par sa richesse en bases puriques, adénine et thymine (A+T) qui se partagent environ

90 % des régions inter-géniques, télomériques et sub-télomériques et 70 % à 80 % des autres régions

35

(McCutchan et al., 1984 ; Pollack et al., 1989). Par ailleurs, le séquençage des chromosomes 2 et 3 a

également montré respectivement 82,2 % et 80 % de bases A+T (Gardner et al., 1998 ; Bowman et

al., 1999).

Pendant la fécondation qui a lieu chez l’hôte définitif (l'anophèle femelle), la recombinaison

homologue entre les régions sub-télomériques entraîne des délétions et insertions (Walliker et al.,

1987). Au niveau de ces régions, les séquences sont soit répétitives et non codantes, soit codantes

mais pour des protéines non essentielles (Fenton et al., 1985 ; Fenton et Walliker, 1990). Le degré de

polymorphisme est augmenté et est dû à des délétions et insertions dans ces régions sub-télomériques

et à la recombinaison (la possibilité que des gamètes de souches différentes échangent une partie de

leur génome engendrant une nouvelle génération). Ce polymorphisme entraîne donc une grande

variabilité génotypique et phénotypique des parasites au niveau des gènes réarrangés tels que les

gènes codant pour les protéines antigéniques (circumsporozoïtes surface protein, CSP ; Merozoïte

Surface Protein, MSP-1 et MSP-2) et les gènes codant pour les protéines cibles des antipaludiques

qui sont souvent sujets à mutation après une pression médicamenteuse.

I-5.5.3.2 Etude des gènes impliqués dans la résistance de P. falciparum

La PCR (polymerase chain reaction) comme nouvel outil au service de la parasitologie

(Bogard et Lamoril, 1988) et plus précisément pour l’étude de la nature (sauvage ou mutant) des

isolats de Plasmodium apporte un éclairage nouveau à la notion de chimio-résistance plasmodiale.

Ainsi, elle permet d’amplifier, à l’aide d’amorces spécifiques et en présence d’une polymérase, un

fragment d’ADN plasmodial d’un gène impliqué dans le mécanisme d’action d’un antipaludique,

puis d’en étudier soit par digestion enzymatique soit par séquençage ses caractéristiques. Encore faut-

il que ce gène impliqué dans la résistance de ce médicament soit identifié. Les gènes de résistance

aux antifoliques (sulfadoxine) et aux antifoliniques (la pyriméthamine et cycloguanil, métabolite actif

du proguanil) sont bien établis, clonés et séquencés chez P. falciparum. Ce sont respectivement les

gènes codant pour la DHPS et la DHFR. La DHFR est le produit d'expression d'un gène situé sur le

36

chromosome 4 du génome plasmodial (Wu et al., 1996). Dans ce cas, comme il a été montré que le

codon 108 est la clé de la résistance aux antifoliniques, car il est toujours muté en premier lieu, un

test PCR-RFLP simple a été mis au point dans le laboratoire du Dr Mazabraud, qui permet de

connaître à coup sûr avec une bonne sensibilité la nature de ce codon (Eldin de Pécoulas et al., 1996).

Quant à la DHPS, c'est une enzyme dont le gène est situé sur le chromosome 8 et contient deux

introns (Triglia et Cowman, 1994).

Le gène pfcrt responsable de la résistance à la chloroquine, est situé sur le chromosome 7 de

P. falciparum et son expression donne une protéine localisée dans la vacuole digestive et qui joue un

rôle de transport trans-membranaire (Fidock et al., 2000 ; Zhang et al., 2002). La chloroquino-

résistance jusque-là mise en évidence chez différents isolats de diverses régions a fait apparaître une

relation entre les mutations qui surviennent dans ce gène et la baisse de sensibilité aux amino-4-

quinoléines (Wellems et Plowe, 2001).

Si, à l’heure actuelle, les mutations qui interviennent dans les gènes pfcrt, dhfr, dhps sont

fortement impliquées dans la résistance de P. falciparum à la chloroquine pour pfcrt, à la

pyriméthamine et au cycloguanil pour dhfr et à la sulfadoxine pour dhps, il n'a pas été établi de

véritable relation entre la mutation du gène pfmdr-1 et la résistance de P. falciparum à un

antipaludique (Mockenhaupt et al., 2001). Les premières hypothèses d'explication de l'efflux de la

chloroquine de la vacuole parasitaire étaient liées à l'intervention d'une phospho-glycoprotéine

(Pgh1) qui joue le rôle d'une pompe ATP-dépendante et est codée par des gènes appelés multidrogues

résistances (mdr). Chez Plasmodium, ces gènes sont au nombre de deux (pfmdr-1 et 2) et sont

localisés respectivement sur le chromosome 5 (Foote et al., 1989) et sur le chromosome 14.

L'amplification de pfmdr-2 n'a pas montré de lien avec la résistance à la chloroquine (Cowman et

Karcz, 1991). Par contre, le gène pfmdr-1 qui code pour la Pgh1 a une homologie d'environ 60 %

avec les gènes mdr de l'homme (Le Bras et al., 1993). Au départ, on a pensé que la chloroquino-

résistance était liée aux mutations ponctuelles qui survenaient à plusieurs endroits (codons) de ce

37

gène (pfmdr-1), mais ces mutations se sont révélées mal corrélées à la sensibilité des différents isolats

de P. falciparum étudiés. Par contre, l’étude de la relation entre les mutations sur le gène pfmdr-1 et

la résistance de P. falciparum aux amino-alcools pourrait se révéler plus prometteuse (Lopes et al.,

2002).

I-5.5.4 Dosage de médicaments dans le sang

Cette technique est couplée au test de l'efficacité thérapeutique pour l’analyse des cas d’échec

thérapeutique afin d’établir que l’antipaludique administré procure une concentration adéquate de

médicament dans le sang (May et Meyer, 2003). Même si, à l’heure actuelle, certains pensent que la

chromatographie liquide de haute performance (CLHP) est la méthode la plus fiable en terme de

sensibilité dans le dosage de médicament, l’extraction de l’antipaludique du sang total, cible

définitive du médicament, suivie de son dosage au spectrophotomètre est toujours pratiquée et par

conséquent peut être réalisée. Malheureusement, compte tenu des variations intra- et inter-

individuelles de la pharmacocinétique, il n’existe pas de valeur seuil qui reflète la bonne absorption

du médicament (Basco et Ringwald, 2001).

I- 6 Justification de l'étude

Le paludisme demeure l'une des maladies parasitaires les plus fréquentes dans le monde et

probablement la plus meurtrière de toutes les affections humaines. Le bilan n’est guère optimiste car

2,3 milliards de personnes sont exposées au méfait de cette pathologie, soit environ 41 % de la

population mondiale (OMS, 1998). Chaque année, 300 à 500 millions de personnes sont atteintes de

paludisme, souvent sous sa forme grave, avec 1,5 à 2,7 millions de décès (OMS, 1984).

Malheureusement, ce sont surtout les enfants de moins de 5 ans qui payent le plus lourd tribut à ce

triste record de mortalité pour la plupart en Afrique sub-saharienne (Anonyme, 2002). Par ailleurs, la

situation du paludisme dans le monde est exacerbée par la résistance confirmée des parasites à la

plupart des antipaludiques et par l’installation d’une multirésistance des vecteurs aux insecticides

(Touze et Charmot, 1993). Du fait de sa situation géographique (en position) sub-équatoriale, la Côte

38

d’Ivoire est une zone de paludisme à transmission permanente avec des pics saisonniers pendant

lesquels le paludisme constitue 30 à 40 % des états morbides et représente 10 % de toutes les causes

de mortalités (Mouchet et al., 1993 ; Yavo et al., 2002). Toutes les tranches d’âge sont concernées,

mais les populations les plus vulnérables sont les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes.

La politique nationale de lutte contre le paludisme dans ce pays recommande la chloroquine comme

médicament de première intention et la sulfadoxine-pyriméthamine en deuxième intention pour le

traitement de l’accès palustre non compliqué (Sibley et al., 2001). L’émergence du paludisme

chloroquino-résistant en 1986 dans les pays de l'Afrique de l'Ouest (Nicoulet et al., 1987 ;

Guiguemde, 1991 ; Penali et al., 1993 ; Henry et al., 2002), la surveillance et l’étude de la

chimiorésistance de P. falciparum demeurent une préoccupation (Blanchy et al., 1993 ; Le Bras et al.,

1993). Ainsi, l’extension des souches de P. falciparum résistantes aux antipaludiques usuels aggrave

le pronostic de la maladie et complique les schémas thérapeutiques jusque-là appliqués.

La stratégie mondiale actuelle de lutte contre le paludisme élaborée par l’OMS comporte quatre

volets : (i) le diagnostic précoce et le traitement rapide des cas, (ii) la planification et la mise en

œuvre de mesures de prévention sélectives et durables, y compris la lutte anti-vectorielle, (iii) la

détection rapide, l’éradication ou la prévention des épidémies et enfin (iv) le renforcement des

capacités locales dans le domaine de la recherche fondamentale et appliquée pour permettre et

encourager l’évaluation périodique de la situation du paludisme dans le pays, en particulier les

déterminants écologiques, sociaux et économiques de la maladie.

La plupart des études réalisées dans le pays sont de 7 jours et ne donnent qu’un aperçu de la

résistance plasmodiale (Nicoulet et al., 1987 ; Penali et al., 1990 ; Adjettey et al., 1997 ; Adou-Bryn

et al., 1999). Un suivi de 14 jours au moins est nécessaire afin de pouvoir prendre des mesures pour

mieux contrôler l’extension de la pharmaco-résistance. Le présent travail s'inscrit dans la dernière

recommandation de l'OMS en prenant comme base, la surveillance de la réponse de P. falciparum

aux antipaludiques couramment utilisés en Côte d'Ivoire.

39

I-7 Objectifs

L'objectif principal de cette surveillance est de recueillir des données sur la chimio-résistance

plasmodiale au niveau de chaque zone représentative de la population ivoirienne (comme celle de

Yopougon) afin de permettre par la suite une rationalisation et une meilleure utilisation des

antipaludiques autorisés par l'État ivoirien. Pour y arriver, les objectifs secondaires suivants qui sont

trois approches de l'étude de la chimiorésistance ont été définis :

- Évaluer l'efficacité thérapeutique de la chloroquine et de la sulfadoxine-pyriméthamine,

antipaludiques de première et deuxième intention pour le traitement de l'accès palustre non

compliqué. Cette partie du travail a été effectuée d'avril à début août de 1999 à 2000 avec

randomisation des traitements.

- Évaluer, de manière concomitante, la sensibilité in vitro à la chloroquine, à la pyriméthamine et à

la quinine des isolats de P. falciparum.

- Évaluer le profil génétique des isolats de P. falciparum correspondants,

- Analyser la relation entre les mutations qui surviennent dans les gènes dhfr-ts, dhps, pfcrt et

pfmdr-1, l'efficacité thérapeutique des antipaludiques et le test in vitro de la sensibilité de P.

falciparum.

* Exploitation des résultats par l'INSP

Les résultats de la présente étude serviront de base de données de la situation de la résistance

dans la commune de Yopougon pour l'Institut National de Santé Publique d'Abidjan qui a en charge

la recherche médicale en Côte d'Ivoire. Selon le chronogramme arrêté, mi-septembre 2003, les

principaux résultats seront discutés au cours d'une journée scientifique des chercheurs de l'Institut

puis un rapport sera envoyé au Ministère de la Santé Publique (MSP). Le MSP transmettra les

conclusions des travaux au Programme National de Lutte contre le Paludisme (PNLP) en Côte

d'Ivoire qui à son tour aura la responsabilité à court terme de prendre des décisons dans le sens :

40

1, au plan scientifique, en accord avec l'INSP, de poursuivre cette investigation dans les autres

régions du pays (centre, ouest, est),

2, d'informer, d'éduquer et de communiquer avec la population dans le but de freiner l'automédication

abusive dans la zone de la présente étude.

41

ZONE D’ETUDE, MATERIEL ET METHODES

42

II.1 Zone d'étude

Le district d'Abidjan, zone de brassage de la population ivoirienne, a servi de cadre à cette

étude qui est divisée en trois volets dans sa réalisation pratique. Le premier volet qui concerne le test

de l'efficacité thérapeutique s’est déroulé au dispensaire de la formation sanitaire urbaine à base

communautaire (FSUCOM) de Yopougon Toit Rouge (nord d'Abidjan, banlieue éloignée) et à la

PMI de l'Institut National de Santé Publique (INSP) d'Adjamé (banlieue proche d'Abidjan).

La commune de Yopougon est la plus grande commune d’Abidjan et de Côte d’Ivoire avec

plus de 700 000 habitants (hbts) dont 51 % d’hommes et 49 % de femmes. Les enfants de moins de 5

ans représentent une partie importante de la population vivant dans cette commune. L’activité

principale de la population est centralisée sur le secteur informel. Au plan sanitaire, la commune

dispose d’un centre hospitalier universitaire (CHU), de formations sanitaires dans chaque quartier et /

ou sous quartier. C’est l’une de ces formations sanitaires (celle de Toit Rouge) qui a servi de cadre à

l’évaluation de la chimiosensibilité in vivo de P. falciparum à la chloroquine et à la sulfadoxine-

pyriméthamine, puis aux prélèvements de sang contenant des hématozoaires de paludisme,

nécessaires à l’évaluation in vitro et au test moléculaire.

Les centres de santé sont fréquentés par les populations de nombreux quartiers précaires. Eu

égard à l'insalubrité sans cesse croissante dans ces quartiers tels que les gîtes propices au

développement de l'agent vecteur, le paludisme représente la première cause de consultation de la

population en général, et en particulier des enfants d'âge scolaire et ceux de moins de cinq ans.

D'avril à août, la fièvre due au paludisme est une cause majeure d'absentéisme scolaire. De ce fait

pendant cette période, les centres de santé augmentent la commande d'antipaludiques usuels car le

volume des consultations dans chaque centre dépasse largement 50 enfants par jour. La fièvre de

l'enfant est le plus souvent traitée par automédication à des doses incorrectes d'antipaludiques par les

parents deux à trois jours avant de le présenter au dispensaire. Par conséquent, tous les cas de

paludisme grave constatés ont souvent pour conséquence l'anémie avec un taux d'hémoglobine

43

inférieur à 6 g/dl. Les sujets sont de ce fait orientés et pris en charge par le CHU de Yopougon. La

période choisie pour notre étude (avril à début août) coincide avec la période de transmission intense

du paludisme et a permis d'avoir au moins un cas de paludisme non compliqué sur 10, confirmé par

goutte épaisse (OMS, 2002). Tous les enfants inclus dans cette étude habitaient les quartiers

environnants ce qui a également permis de dimunier les cas de perdus de vue. Le centre de santé de la

formation sanitaire de Yopougon dispose de salles de soins équipées et d'antipaludiques appropriés

(troisième intention) pour une prise en charge en cas de nécessité. Il est également doté d'un

laboratoire de type I pouvant permettre le diagnostic biologique du paludisme.

La commune d'Adjamé, moins étendue et moins peuplée que celle de Yopougon, abrite en

dehors des formations sanitaires, des Instituts de recherche tel que l'INSP qui dispose d'un PMI

(enfant), d'un dispensaire pour enfants de plus de 12 ans et adultes, de plusieurs laboratoires

d'analyses médicales et de recherche biologique et d'autres services de spécialité. Le suivi des enfants

étant difficile à cause de l'éloignement des parents, très peu d'enfants de cette commune ont été suivis

jusqu'à J14. Toutefois, les prélèvements de sang parasité ont surtout été utilisés pour le test in vitro.

II-2 Matériel

II-2.1 Sélection des sujets

Les enfants de 0 à 59 mois atteints de paludisme non compliqué venus en consultation au

dispensaire de la formation sanitaire de Toit Rouge pour hyperthermie ont été pris en charge par

l’équipe de recherche. La sélection des sujets s’est effectuée suivant les critères d’inclusion définis

par le protocole de l'OMS (OMS, 1996).

*Age compris entre 6 et 59 mois (< 5ans),

* infection mono-spécifique à P. falciparum avec une densité parasitaire comprise entre 2000 et 100

000 parasites asexués par micro-litre de sang,

* température axillaire supérieure ou égale à 37,5°C et inférieure à 39,5°C,

* possibilité d’honorer les rendez-vous pour le suivi,

44

* absence de malnutrition sévère, d’états fébriles dus à d’autres affections,

* absence de réaction d'hypersensibilité à la sulfadoxine.

En dehors de ces critères ci-dessus énumérés, tous les enfants présentant des signes de

paludisme grave ont été exclus de l’étude.

II-2.2 Prélèvement d’isolats de P. falciparum

Dans ce travail, chaque sujet porteur de P. falciparum a subi un prélèvement d’environ 5 à 10

ml de sang veineux sur anticoagulant (éthylène diamine tétraacétate ou acide citrique dextrose),

lorsque la densité parasitaire est supérieure à 4000 globules rouges parasités par microlite de sang

(Grp / µl). Le prélèvement est ensuite acheminé au Laboratoire de Microbiologie de l'INSP pour la

mise en culture de l’isolat de P. falciparum en présence de concentrations variables d’antipaludiques.

Mais, avant la culture de l'isolat, 1ml ou quelques gouttes de sang parasité sont mis respectivement

dans un cryo-tube puis congelé ou déposé sur des matrices du papier filtre Isocode Stix (Myers et

al.,1997), séché puis conservé en l’absence d'humidité jusqu'à la réalisation du test moléculaire. Les

isolats de P. falciparum utilisés dans ce travail correspondent à une ou plusieurs populations de

parasites génétiquement distinctes. Ces parasites ont été prélevés sur des sujets malades. La chimio-

sensibilité in vitro déterminée pour chaque isolat est la résultante de la sensibilité de toutes les

populations plasmodiales constituant l'isolat. Au plan moléculaire, ce mélange de populations peut

avoir des conséquences sur le profil génétique. Il se peut que la séquence de l’ADN amplifié d’un

isolat soit unique ou hétérogène, le profil génétique déterminé sera soit identique soit non identique

(population mixte).

II-2.3 Milieux de culture et réactifs pour le test in vitro

Pour la réalisation de la culture in vitro de P. falciparum, nous avons eu besoin de RPMI 1640

(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA), du bicarbonate de sodium (NaHCO3) (Merck,

Mannheim, Allemagne), de l’HEPES (Sigma Chemical Co ,USA.), de l’eau pour culture cellulaire

(GIBCO-BRL, USA), de pool de sérum humain. Ces produits étaient nécessaires pour la préparation

45

du milieu de culture. De l'hypoxanthine tritiée (Amersham International, Little Chalfont, Royaume-

Uni) a été également nécessaire. Le bicarbonate de sodium et l’HEPES [acide N-(2-hydroxyéthyl)

pipérazine-N'-(2-éthanesulfonique)] jouent le rôle de tampon afin de maintenir le pH du milieu entre

7,2 et 7,4 (Trager et Jensen, 1976). Nous avons par ailleurs, utilisé les principes actifs de trois

médicaments, la chloroquine (Aventis, Antony, France), la pyriméthamine (Sigma, Chemical Co), le

chlorhydrate de quinine (Sigma, Chemical Co). Le RPMI 1640 utilisé pour le test in vitro à la

pyriméthamine (Sigma, Chemical Co) est appauvri en PABA (acide para-amino-benzoïque) et en

acide folique alors que celui de la chloroquine et de la quinine est le RPMI normal.

II-2.4 Gènes de P. falciparum à amplifier, oligonucléotides et endonucléases utilisés

II-2.4.1 Gènes de P. falciparum

dhfr-ts

La PCR simple (extraction de l’ADN d’un culot globulaire) et la PCR enchâssée (ADN extrait

des « confettis » Isocode Stix) réalisées dans ce travail vont nous permettre d'amplifier un domaine

de 708 pb et 595 pb du gène dhfr respectivement. Ces domaines contiennent les codons (16, 51, 59,

108 et 164) dont les mutations entraînent une résistance de P. falciparum à la pyriméthamine et au

cycloguanil.

dhps

La première PCR va nous permettre d'amplifier un domaine de 708 pb puis la deuxième (PCR

enchâssée) un domaine de 680 pb contenant les codons 436, 437, 540, 581 et 613.

pfmdr-1

L'amplification (PCR et PCR enchâsée) de la première partie codante de ce gène permet d'avoir

des domaines successifs de 590 pb puis 394 pb contenant les codons 86 et 184 impliqués dans les

mutations. Quant à la deuxième partie codante, son amplification va permettre d'obtenir 968 pb puis

774 pb comportant les codons affectés par les mutations (codons 1034, 1042, 1238 et 1246).

46

pfcrt

L'amplification du gène pfcrt permet d'explorer un domaine de 537 pb puis de 145 pb contenant

les codons 74, 75 et 76. L'utilisation d'une enzyme de restriction (Apo I) va permettre d'analyser le

codon 76 dont la mutation est impliquée dans la résistance de Plasmodium falciparum.

II-2.4.2 Oligonucléotides utilisés

Au cours de cette étude, nous avons utilisé des oligonucléotides ou amorces spécifiques pour

chaque gène à amplifier (dhfr, dhps, pfcrt, pfmdr-1). Ainsi, deux amorces ont été utilisées pour

amplifier les domaines de la dihydrofolate réductase (dhfr) et de la dihydroptéroate synthétase (dhps)

des isolats de P. falciparum. Ces amorces ont été synthétisées sur la base de la séquence publiée par

Bzik et al en 1987 puis par Snewin et al en 1989 pour dhfr et par Brooks et al et Triglia et Cowman

en 1994 pour dhps. Une troisième amorce, dont les séquences ont été élaborées par Léonardo

BASCO, a été nécessaire dans chaque cas lorsqu'il s'est agit d'amplifier les gènes issus de l'ADN des

confettis. Pour dhfr, les amorces utilisées sont ST1L / ST2L dans la première PCR puis ST1L /

DHFR-595R pour la deuxième PCR. Quant à dhps, DHPS1 / DHPS-2R et PFDHPS-5 / DHPS-2R

ont été utilisées pour la première et deuxième PCR respectivement. Les amorces spécifiques à

l’amplification du gène pfcrt sont les couples d'amorces TCRP-1 / TCRP-2 et TCRD-1 / TCRD-2.

Quant au gène pfmdr-1, deu x couples d’amorces ont été utilisés pour amplifier chacune des des

deux parties codantes (notée A et B) du gène, ce sont, MDR-516 / MDR-1105R et MD-679 / MD-

1072, puis, MD-3398 / MDR-4365R et MD-3526 / MD-4299 R. Le tableau I présente les séquences

spécifiques à chaque amorce utilisée.

47

Tableau I : Séquences des amorces utilisées pour amplifier les différents fragments d'ADN des gènes

dhfr, dhps, pfmdr-1 et pfcrt

Amorces

Séquences

Gènes

Sens

ST1L 5’-ATG-ATG-GAA-CAA-GTC-TGC-GAC-GTT-TTG-GAT-3’ dhfr

DHPS-1 5’-GTA-TTT-TTG-TTG-AAC-CTA-AAC-GTG-3’ dhps

PFDHPS-5 5’-GTT-CAA-AGA-ATG-TTT-GAA-ATG-ATA-AAT-G-3’ dhps

TCRP-1 5’-CCG-TTA-ATA-ATA-AAT-ACA-CGC-AG-3’ pfcrt

TCRD-1 5’-TGT-GCT-CAT-GTG-TTT-AAA-CTT-3’ pfcrt

MDR-516 5’-AGA-GAA-AAA-AGA-TGG-TAA-CCT-CAG-3’ Pfmdr-1A

MDR-679 5’-TTT-GTA-TGT-GCT-GTA-TTA-TCA-GG-3’ Pfmdr-1A

MDR-3398 5’-GCG-GAG-TTT-TTG-CAT-TTA-GTT-CAG-ATG-ATG-3’ Pfmdr-1B

MDR-3526 5’-GAA-AAA-GCT-ATT-GAT-TAT-AAA-AAT-AAA-GG-3’ Pfmdr-1B

Anti- sens

ST2L 5’-TTC-ATT-TAA-CAT-TTT-ATT-ATT-CGT-TTT-CTT-3’ dhfr

DHFR-595R 5’-CTG-GAA-AAA-ATA-CAT-CAC-ATT-CAT-ATG-TAC-3’ dhfr

DHPS-2R 5’-CCA-CAA-TAT-TTT-TAT-TTT-CAT-TTT-G-3’ dhps

TCRP-2 5’-CGG-ATG-TTA-CAA-AAC-TAT-AGT-TAC-C-3’ pfcrt

TCRD-2 5’-CAA-AAC-TAT-AGT-TAC-CAA-TTT-TG-3’ pfcrt

MDR-1105R 5’-ACC-ACA-AAC-ATA-AAT-TAA-CGG-3’ Pfmdr-1A

MDR-1072R 5’-GTA-ATA-CAT-AAA-GTC-AAA-CGT-GC-3’ Pfmdr-1A

MDR-4365R 5'-AGC-AGC-AAA-CTT-ACT-AAC-ACG-TTT-AAC-ATC-3' Pfmdr-1B

MDR-4299R 5’-TTC-ATA-TAT-GGA-CAT-ATT-AAA-TAA-CAT-GGG-3’ Pfmdr-1B

48

II-2.4.3 Endonucléases utilisées

Toutes les endonucléases utilisées dans ce travail proviennent du fournisseur New England

Biolabs.

Endonucléases pour l’étude du codon 108 de dhfr

Alu I : C’est une endonucléase qui clive le fragment d'ADN au niveau du codon 108 lorsque celui-ci

est sauvage (séquence reconnue AGCT). Alu I a été utilisé pour mettre en évidence le codon Sérine

AGC.

Bsr I : Cette endonucléase de restriction provient de Bacillus stearothermophilus (souche NEB 447).

Elle a servi pour le test de digestion enzymatique du codon 108 pour la mise en évidence de la

mutation ponctuelle entraînant la spécification d'une asparagine par le nouveau codon 108, AAC

(séquence reconnue ACTGGN). En plus du tampon spécifique de l’enzyme Bsr I, l’addition de

sérum albumine bovine (BSA) a été nécessaire pour l'optimisation de l’activité de cette endonucléase.

Scr FI : extraite de Streptococcus cremoris souche F, cette endonucléase a servi à mettre en évidence

la mutation ponctuelle entraînant la spécification d'une thréonine par le nouveau codon 108 ACC

(séquence reconue CCNGG).

Endonucléase pour l’étude du codon 76 de pfcrt

Apo I : c’est une endonucléase recombinante purifiée à partir d’Escherichia coli et portant un

plasmide cloné par le gène Apo I de la souche d’Arthrobacter protophormiae NEB 760. Elle spécifie

la présence d'une Lysine dans le codon 76 du gène pfcrt (séquence reconnue : Pu AATTPy).

II-3 Méthodes

II.3.1 Chimiosensibilité in vivo de P. falciparum

Chaque enfant reçu en consultation le premier jour (J0) a bénéficié d’une pesée et d’une prise

de la température. Le sujet est ensuite conduit chez l'un des médecins du centre de santé pour une

consultation. Si le diagnostic de présomption est le paludisme, l’enfant est orienté vers l’équipe de

recherche qui pose un diagnostic de certitude (goutte épaisse et frottis sanguin) de la présence

49

d’hématozoaire de paludisme. Après un bref interrogatoire qui inclut l’explication du protocole

d’étude à l’accompagnateur du malade afin d’obtenir son consentement oral à cause des problèmes

d'analphabétisme, l’enfant est inclus dans l’étude pour un suivi jusqu’au jour 14 (J14), s’il remplit les

critères d’inclusion. Dans ce cas, il lui est administré soit la chloroquine, soit la sulfadoxine-

pyriméthamine (SP). Le traitement par la chloroquine consiste en une cure de trois jours, répartie en

doses de 10 mg/kg le premier et le deuxième jour puis 5 mg/kg le troisième jour. Lorsque

l’antipaludique est la SP, la posologie est de 1/2 comprimé pour 10 kg de poids corporel en prise

unique sans dépasser la dose de 3 comprimés. À J0, quand la température dépasse 38,5°C, il est

administré à l’enfant du paracétamol à raison de 1/4 comprimé pour un âge inférieur à 3 ans, et 1/2

comprimé pour un âge allant de 3 à 5 ans. Les malades inclus et traités subissent des contrôles

parasitologiques et cliniques à J3, J7 et J14. Les sujets qui présentent un échec thérapeutique sont pris

en charge pour un traitement avec un antipaludique de remplacement (la SP ou les sels de quinine).

L’indication du traitement de remplacement est fondée sur des critères cliniques et parasitologiques.

Son but est d’éviter l’aggravation de l’état clinique du sujet, donc de diminuer le risque. Aussi, les

observations cliniques sont-elles soutenues par des preuves parasitologiques. Au cours de l’étude, les

malades qui abandonnent le protocole bien qu’ils satisfassent à tous les critères d’inclusion sans que

n’apparaissent des critères d’exclusion au cours de la période de suivi sont perdus de vue.

L'efficacité du médicament administré au cours de l’étude est interprétée en fonction de la

réponse clinique et parasitologique, en échec thérapeutique ou en réponse clinique adéquate (OMS,

2002).

* Réponse clinique et parasitologique adéquate (RCPA)

Elle signifie l'absence de parasites asexués à J14, quelle que soit la température axillaire, sans

que le malade ait auparavant répondu aux critères d’échec thérapeutique précoce, d'échec clinique

tardif ou d'échec parasitologique tardif.

50

* Echec thérapeutique précoce (ETP) Il correspond soit à une apparition de signes de danger ou d’un

paludisme grave les jours 1, 2 ou 3 en présence de parasites asexués, soit une parasitémie à J2

supérieure à celle de J0, quelle que soit la température axillaire, soit une température axillaire

supérieure > 37,5°C à J3 avec une présence de parasites, soit enfin une parasitémie à J3 supérieure

d'au moins 25 % celle de J0.

* Echec Thérapeutique Tardif (ETT)

Il correspond à deux situations :

Un Echec clinique tardif (ECT), dans ce cas, il s'agit d'une apparition de signes de danger ou d’un

paludisme grave en présence d’une parasitémie n’importe quel jour entre le jour 4 et le jour 14, sans

que le malade ait auparavant répondu aux critères d’échec thérapeutique précoce, soit une

température axillaire supérieure ou égale à 37,5°C en présence d’une parasitémie n’importe quel jour

entre le jour 4 et le jour 14, sans que le malade ait auparavant répondu aux critères d’échec

thérapeutique précoce.

Un Echec parasitologique tardif (EPT) qui correspond à une présence de parasites à J14 avec une

température axillaire inférieure à 37,5°C sans que le malade ait auparavant répondu à un ETP ou à un

ECT.

II-3.2 Chimiosensibilité in vitro de P. falciparum

Dans ce travail, les isolats de P. falciparum sont maintenus en culture selon la méthode de

Trager et Jensen (Trager et Jensen, 1976 ; Trager, 1990) dans le milieu RPMI 1640 complété de 25

mM de tampon HEPES, 25 mM de bicarbonate de sodium (NaHCO3 ) (à 5 %) et de sérum humain à

10 %. L’incubation se fait en atmosphère appauvrie en oxygène et enrichie en gaz carbonique avec

une humidité de 95 % et une température de 37°C. Nous avons ajouté dans certains cas un

antibiotique (gentamycine) pour éviter les contaminations bactériennes.

51

II-3.2.1 Préparation du milieu de culture

Le milieu de culture est préparé à partir du RPMI 1640 normal pour la chloroquine et la

quinine et le RPMI contenant l'acide folique et le PABA pour la pyriméthamine. Il est tamponné avec

25 mM d’HEPES et 25 mM de NaHCO3 afin de maintenir le pH dans les limites de la croissance

plasmodiale. Le milieu est filtré sur une membrane stérilisante (unité Sartorius de diamètre 0,22 µm)

puis réparti en flacons stériles pour être congelé à -20°C. Au moment de son emploi, nous préparons

le milieu complet RPS (RPMI contenant le serum humain) en y ajoutant, après décongélation, 10 %

de sérum humain (Banque de sang, CNTS, Abidjan, Côte d'ivoire). Le sérum utilisé est un pool

(mélange) d’au moins trois sérums de donneurs différents, ce qui permet de remédier à la grande

variation des qualités nutritives du sérum humain d’un sujet à l’autre.

II-3.2.2 Dilution de drogues et chargement des plaques

Nous avons préparé des solutions-mères de sulfate de chloroquine (PM = 418 g/mole),

pyriméthamine base (PM = 249 g/mole) et de chlorhydrate de quinine (PM = 361 g/mole) à partir de

leur principe actif. La poudre pesée de chaque antipaludique est mise en solution dans des solvants

appropriés en fonction de la solubilité de chaque médicament, la chloroquine dans l’eau bi-distillée,

la quinine dans le méthanol et la pyriméthamine dans l'éthanol (Basco, 1996).

Les concentrations finales des antipaludiques sont obtenues par dilutions dichotomiques des

solutions-filles distribuées en triplet dans des plaques Multiwell® à 24 cupules. Les solutions

contenues dans ces cupules sont ensuite séchées sous une hotte à flux laminaire et conservées à l’abri

de la lumière et de l’humidité jusqu'à utilisation. Nous avons utilisé des plaques à large gamme de

médicament dont les concentrations variaient de 12,5 à 1600 nM pour la chloroquine et la quinine et

de 3,12 à 51200 nM pour la pyriméthamine (Tableau II).

52

Tableau II : Gamme de concentrations finales de médicaments lors du test in vitro

Chloroquine (CQ) en nM

Pyriméthamine (PYR) en nM

Quinine (QU) en nM

1600

51200

1600

800 12800 800

400 3200 400

200 800 200

100 200 100

50 50 50

25 12,5 25

12,5 3,12 12,5

Témoins sans CQ Témoins sans PYR Témoins sans QU

La dilution des solutions-filles a été réalisée respectivement au 1/2 pour la chloroquine et quinine et

au 1/4 pour la pyriméthamine.

II-3.2.3 Préparation de l’échantillon de globules rouges parasités et de la suspension globulaire

Le sang parasité, est centrifugé pendant 5 minutes à 1800 tours / min pour éliminer le plasma.

Après avoir enlevé la couche leuco-plaquettaire, le culot globulaire est transvasé dans un tube à

centrifuger auquel est ajouté du RPMI de lavage. Le mélange est alors centrifugé 3 fois

(Centrifugeuse Sigma 301) à +4°C pendant 5 min à 1800 tours/ min. Un frottis mince est réalisé pour

vérifier la densité parasitaire qui doit être comprise entre 0,1 et 0,2 %. Lorsque cette parasitémie est

supérieure à 0,2 %, elle est ramenée aux proportions ci-dessus indiquées par dilution avec des

globules rouges non parasités du groupe O+.

La préparation de la suspension globulaire (l’inoculum) a consisté à prélever et à mettre dans

un flacon stérile, du RPMI contenant du sérum humain, des globules rouges parasités auquels sont

ajoutés de l’hypoxanthine tritiée concentrée à 0,5 mCi .

53

II-3.2.4 Mise en culture de l'inoculum (Deloron et al., 1982 ; Le Bras et Deloron, 1983 ; Le Bras et

al., 1984)

L’inoculum est distribué à raison de 700 µl par cupule dans les plaques Multiwell® à 24 puits

contenant soit la chloroquine, soit la pyriméthamine, soit la quinine. Elles sont ensuite

homogénéisées par agitation sur vibreur automatique pendant quelques secondes et déposées dans

une jarre à bougie dans laquelle on crée, à l’aide d’une bougie allumée puis éteinte, une atmosphère

appauvrie en oxygène mais enrichie en gaz carbonique. L’humidité y est maintenue à l’aide d’une

cuve d’eau. L’ensemble est incubé dans un incubateur de type bactériologique à 37°C. Après 42

heures d’incubation, les plaques sont sorties et l'on recherche la présence de schizontes sur des

étalements (goutte épaisse ou frottis sanguin) réalisés à partir de quelques puits sans antipaludiques

(contrôle témoin), puis les plaques sont mises en congélation. Pour certains isolats, nous avons utilisé

la version non isotopique du semi microtest de Le Bras. Dans ce cas, le test est validé lorsque le

nombre de schizontes (parasites avec plus de 3 noyaux) représente au moins 20 % des parasites

asexués (OMS, 1984).

II-3.2.5 Collecte cellulaire et comptage

La congélation et la décongélation des plaques permettent de libérer les nucléoprotéines

plasmodiales radio-marquées par l’hypoxanthine tritiée. Les nucléoprotéines et les membranes

érythrocytaires et plasmodiales sont ensuite recueillies après lavage sur un papier filtre de fibre de

verre en bande rectangulaire à l’aide d’un collecteur cellulaire (Skatron Titertex Cell Harvester, Lier,

Norway). Une fois la collecte terminée, le papier filtre est retiré et mis à sécher. La première étape du

comptage a consisté en la récolte des pastilles (rondelle de papier filtre correspondant à chaque

cupule). Pour cela, des flacons contenant environ 2 ml de liquide scintillant (BCS-NA, Amersham

International ville, pays) et placés sur un porte-flacon puis recouvert de grille de sorte que chaque

orifice corresponde à un flacon, ont permis de recueillir les pastilles. Dans la deuxième étape, les

flacons contenant les pastilles et le scintillant sont placés dans le chargeur d’échantillons d’un

54

compteur bêta (modèle LS60001C, Beckman, USA) préalablement programmé et la quantité

d’hypoxanthine incorporée par les parasites est mesurée par le compteur en coup par minute (cpm).

Tous les résultats sont exprimés à la fin du comptage et les listings permettent l’exploitation des

résultats.

II-3.2.6 Interprétation du test

Les données brutes du compteur bêta étant exprimées en cpm, nous considérons comme

100 % de croissance parasitaire la valeur des cupules témoins sans médicament et celle des cupules

renfermant la concentration la plus élevée de médicament comme 0 % de croissance. Les valeurs

intermédiaires permettent de tracer le graphe logarithme de la dose sur le probit d’effet. Cette

méthode nous permet de linéariser la partie médiane de la courbe sigmoïdale entre 5-10 % et 90-95 %

de l’effet et de tracer la droite qui s’adapte le mieux aux points expérimentaux.

La concentration inhibitrice 50 % encore appelée CI50 est définie comme la concentration du

médicament qui inhibe 50 % d’incorporation de l’hypoxanthine tritiée par rapport aux cupules

témoins. La CI50 représente la concentration de médicament qui inhibe 50 % de la croissance

parasitaire. Le calcul de la CI50 est établi à partir du logiciel informatique Epi info 6.1 en nanomolaire

(nM). Un isolat est dit résistant à la chloroquine, pyriméthamine, quinine, lorsque les CI50

déterminées sont respectivement supérieures à 100 nM, 100 nM et 800 nM (Le Bras et al., 1984 ).

Dans le cas du test non isotopique, la lecture des lames s'effectue au microscope optique.

Nous déterminons le nombre de schizontes des puits témoins, soit X la moyenne de schizontes de ces

puits témoins et soit Y la moyenne des schizontes pour chaque concentration de drogue, le

pourcentage de maturation est déterminé par la relation Y / X x 100. La courbe dose-effet du taux de

maturation ou d'inhibition en fonction des concentrations de drogue est une courbe sigmoïdale qui

peut être linéarisée sur du papier log-probit. La concentration pour 50 % d'inhibition permet de

déterminer si l'isolat est résistant ou sensible. La lecture des lames (test non isotopique) a concerné

essentiellement les isolats prélevés sur des malades atteints de paludisme, venus en consultation de

55

médecine à la collectivité de l'Institut National de Santé Publique d'Adjamé (I.N.S.P.), deuxième site

d'étude.

II-3.3 Techniques moléculaires

II.3.3.1 Extraction de l’ADN plasmodial à partir du sang total parasité (Sambrook et al., 1989 ;

Bienvenu et al., 1999)

Le protocole standard d'extraction de l'ADN plasmodial a été simplifié par le Dr Léonardo

Basco. C'est cette forme simplifiée que nous avons utilisée dans le présent travail.

L’ADN plasmodial a été préparé à partir d’échantillon de sang prélevé sur des malades et

stocké à -35°C. Chaque échantillon de sang total décongelé est transféré dans un tube polypropylène

de 15 ml (Falcon®) et traité par du tampon NET (NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, Tris 50 mM pH 7,5)

à 4°C dans la glace. La décongélation du sang dans du NET permet la lyse des membranes

érythrocytaires et libère l’hémoglobine et les autres composants des hématies. Les parasites

sédimentent après centrifugation à 2000 tours / min pendant 10 min puis le culot récupéré est

resuspendu dans le tampon NET (400 µl) et traité par la N-laurosarcosine à 10 %, un détergent de

lyse cellulaire qui dissocie les tissus et libère l’ADN plasmodial. Le mélange obtenu est incubé 1

heure à 55°C en présence de protéinase K (100 µg/ml, Sigma, EC3.4.21.64). L’ADN contenu dans le

lysat est séparé des protéines en appliquant la technique d’extraction de référence, l’extraction au

phénol-chloroforme. Elle consiste en une série de trois extractions effectuées à 15000 tours / min

pendant 2 min. La première étape d'extraction est réalisée avec du phénol équilibré à pH 8. Le phénol

est un puissant agent dé-protéinisant dont l’addition à une phase aqueuse a pour effet de dénaturer les

protéines en solution dans le milieu. La deuxième étape d'extraction est réalisée avec un mélange

phénol-chloroforme isoamyl-alcool (v/v/v, 25:24:1) et la troisième étape avec le chloroforme-

isoamyl-alcool (v/v, 24:1) dont l’objectif est d’éliminer les traces de phénol (composé organique

capable d’inhiber la Taq ADN polymérase). L’ADN est ensuite précipité par l’addition d’une

solution d’acétate de sodium à 0,3 M final (pH 7) et 2,5 volumes d’éthanol absolu froid pendant 30

56

min à -80°C. Après une centrifugation à 15000 tours / min à +4°C pendant 30 min, l’ADN

plasmodial est séché pendant quelques minutes sous vide au Speedvac ; il est repris dans le tampon

TE (Tris 10mM, EDTA 1mM pH 8) et conservé à -20°C. Cependant, le phénol étant un produit

toxique et les manipulations correspondantes plus ou moins longues, d’autres techniques

d’extractions ont été utilisées.

II-3.3.2 Extraction de l’ADN plasmodial à partir du sang déposé sur confettis (Myers et al., 1997)

L’ADN est extrait par élution selon le protocole suivant : chaque matrice triangulaire est

détachée avec précaution et mise dans un tube stérile (1,5 ml) de micro-centrifugation auquel 500 µl

d’eau bi-distillée sont ajoutés. Il est mélangé au vortex pendant quelques secondes puis la matrice est

retirée et replacée dans un second tube stérile de 0,5 ml. Elle est immergée par 75 µl d’eau bi-distillée

et incubée à 99°C pendant 30 min. À la fin de cette incubation, le mélange est à nouveau mélangé au

vortex pendant 1min. La solution obtenue après une brève centrifugation à 13000 g pendant 30 sec

(Minicentrifugeuse, Minispin, Eppendorf, Hamburg, Germany) contient l’ADN plasmodial prêt pour

les réactions d’amplification.

II-3.3.3 Préparation et purification des oligonucléotides

Les oligonucléotides utilisés dans ce travail proviennent pour la plupart du Centre de

Génétique Moléculaire, CNRS (Gif-sur-Yvette). Ils sont synthétisés sur support solide comme la

résine de silice ou sur une membrane de cellulose par voie chimique (Millipore, 8909 ExpeditetM

Nucleic Acid synthesis system, Bedford, Massachusetts, USA). La préparation des oligonucléotides

synthétiques est effectuée en deux étapes : le clivage/la dé-protection et la purification (Sawadogo et

Van Dyke, 1991).

L’acétonitrile qui recouvre la résine de silice est retiré et de l’ammoniaque (NH4OH 33 %,

1ml) est ajoutée au tube contenant les oligonucléotides synthétiques. Ceci permet le clivage du

support solide et la dé-protection des bases nucléotides et des phosphates inter-nucléotidiques. Le

tube contenant l’oligonucléotide est incubé 6 heures à 55°C puis le mélange est refroidi à +4°C. Le

57

surnageant renfermant les oligonucléotides synthétiques décrochés est transféré dans un autre micro-

tube. Les chaînes sont bloquées en 5’ par «capping ». L’oligonucléotide est purifié par extraction au

n-butanol (Sawadogo et Van Dyke, 1991). 1ml de n-butanol est ajouté au surnageant et le mélange

obtenu est centrifugé à 13000 g pendant 5 min. Après avoir rejeté la phase supérieure contenant le

butanol, une deuxième extraction est effectuée de manière à réduire le volume de la phase aqueuse

contenant l’oligonucléotide à 300-500µl. Il est précipité par l'ajout de l’acétate de sodium (0,3 M) pH

6,5 et trois volumes d’éthanol absolu froid, puis centrifugé à 13000 g pendant 5mn. Le surnageant est

éliminé, le culot est séché sous vide (Speedvac) puis repris dans l’eau bi-distillée ou dans le tampon

TE. La concentration de l’ADN simple brin est calculée après mesure de l’absorbance à 260 nm au

spectrophotomètre. Les solutions-mères d’oligonucléotides sont diluées de façon à obtenir une

concentration à 10 pmol/µl.

P en µg/µl = DO x 33 x Dil M

P : Concentration d’ADN simple brin DO : Valeur de l’absorbance à 260 nm

33 : 33 µg d’ADN par ml, soit 1 unité de DO Dil. : Facteur de dilution

M : masse molaire de l'oligonucléotide en µg

II.3.3.4 Protocole d’amplification de l’ADN des isolats de P. falciparum

Après extraction, l’ADN génomique de P. falciparum (50 - 100 ng) est mis en présence de

couple d’amorces spécifiques (10 pmol) du gène à amplifier, de tampon (10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM

KCl), des quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (0,2 mM final),

d'une unité de Taq ADN polymérase, le tout dans un volume final de 50 µl. Ce mélange est ensuite

mis dans un thermocycleur de type PTC-100TM (MJ Research, Inc, Watertown, Massachussets,

USA). Cet appareil est programmé pour effectuer 30 cycles de 94°C x 2 mn de dénaturation, 50 -

56°C (pfcrt) x 1 min ou 30 s d’hybridation et 72°C x 1 min d’élongation. La PCR est arrêtée après 30

cycles, puis conservée à 4°C (Tableau III).

58

Lorsque l’ADN est extrait des confettis Isocode Stix, une semi-nested PCR (PCR semi-

enchâssée ou semi-nichée) est nécessaire pour amplifier les gènes dhfr et dhps de P. falciparum.

Cette deuxième PCR se déroule dans les mêmes conditions que la première. Elle est réalisée à partir

de l’amplifiat de la première PCR préalablement traitée au chloroforme-isoamyl-alcool (Ready Red,

Appligene Oncor). Les amorces utilisées sont ST1L / DHFR-595R (nouvelle amorce) pour le gène

dhfr et PFDHPS-5 / DHPS-2R (nouvelle amorce) pour le gène dhps (Tableau III). Toutefois, pour

amplifier les gènes pfcrt et pfmdr-1 de l’ADN issu du sang total et des confettis, une PCR nichée a

été réalisée. Dans ce cas, les deux nouvelles amorces utilisées sont TCRD-1 / TCRD-2 pour le gène

pfcrt, MDR-679 / MDR-1072R puis, MDR-3526 / MDR-4299R pour le gène pfmdr-1 (Tableau III).

Quel que soit le type de PCR que nous avons réalisée, le produit de PCR est mis en évidence

par électrophorèse en gel d’agarose (0,8 et 2 %) dans le tampon TBE (45 mM Tris, 45 mM acide

borique, 1mM EDTA) en utilisant un marqueur de poids moléculaire, l'ADN ladder® de 1kb (Smart

Ladder, Eurogentec). Le gel est ensuite plongé dans une solution de bromure d’éthidium (0,5 µg/ml)

afin de visualiser les bandes d’ADN par illumination ultraviolette (312 nm ou 360 nm). L'image du

gel sera sauvegardée sous forme de photos ou de fichier électronique.

59

Tableau III : Conditions d'amplification des fragments d'ADN des gènes de résistance

Nom du Prog.

Programmation du Thermocycleur

Gènes (1e PCR)

Gènes (2e PCR)

LKB 50L

1- 94°C x 5 min >>> dénaturation 2- 50°C x 5 min >>> hybridation 3- 72°C x 10 min >>> extension 4- 94°C x 1 min >>> dénaturation 5- 50°C x 2 min >>> hybridation 6- 72°C x 5 min >>> extension

7- 29 fois à partir de l'étape 4 8- 72°C x 15 min 9- 4°C indéfini 10- fin

pfmdr1-A pfmdr1-B

LKB 50C

1- 94°C x 2 min >>> dénaturation 2- 50°C x 1 min >>> hybridation 3- 72 °C x 1 min >>> extension

4- 94°C x 30 s >>>> dénaturation 5- 50°C x 30 s >>>> hybridation 6- 72°C x 1min >>>> extension 7- 29 fois à partir de l'étape 4 8- 72°C x 10 min 9- 4°C indéfini 10- fin

dhfr dhps

Pfmdr-1A Pfmdr-1B dhfr dhps pfcrt

TC-56C

1- 94°C x 2 min >>> dénaturation 2- 50°C x 30 s > >> hybridation 3- 72°C x 1 min >>> extension 4- 94°C x 30 s >>> dénaturation 5- 50°C x 30 s >>>> hybridation 6- 72°C x 1 min >>> extension 7- 30 fois à partir de l'étape 4 8- 72°C x 10 min 9- 4°C indéfini 10- fin

pfcrt

60

II-3.3.5 Digestion du produit de PCR ou PCR-RFLP (méthode d’Eldin de Pécoulas et al., 1996)

L’amplifiat obtenu après la PCR est digéré par une endonucléase de restriction (6 unités

d’enzyme) Alu I, Bsr I ou Scr FI, pour dhfr et Apo I pour pfcrt et incubé respectivement à 37°C,

65°C, 37°C et 50°C pendant 3 heures en présence d’un tampon fourni par le fabricant (NE Biolabs)

spécifique à chaque enzyme : NE buffer 2 (Tris-HCl 10mM, MgCl2 10mM, NaCl 50mM et DTT

1mM) pour Alu I, NE buffer 3 (Tris-HCl 50mM, MgCl2 10mM, NaCl 100mM, DTT 1mM) pour Bsr

I et Apo I, NE buffer 4 (Tris-acétate 20mM, acétate de magnésium 10mM, acétate de potassium

50mM, DTT 1mM) pour Scr F I.

Le fragment de dhfr amplifié de 708 pb après la première PCR ou de 595 pb après une semi-

nested PCR est digéré en deux fragments quelle que soit l’endonucléase (Alu I, Bsr I, Scr FI), pourvu

que le site de reconnaissance spécifique de cette dernière existe. Lorsqu'il s'agit de pfcrt, le fragment

de 145 pb issu de la nested PCR est également mis à digérer par Apo I. Ces fragments d’ADN sont

séparés dans un gel d’agarose à 1,8 % et visualisés sous UV après révélation au bromure d’éthidium

(BET). On inclut toujours dans la série à tester un isolat sécable comme témoin positif et un témoin

négatif.

En ce qui concerne le deuxième fragment de pfcrt, il est difficile de le visualiser étant donné

qu'il a moins de 50 pb. Ainsi, l'isolat sauvage sera défini par la présence d'une Lysine après la

digestion d'un fragment par Apo I. La non-digestion signifiera un changement de nucléotide par la

présence d'une mutation K76T.

II-3.3.6 Protocole de purification des produits de PCR et séquençage

Dans ce travail, les fragments d’ADN amplifiés (dhfr, dhps, pfmdr-1) de P. falciparum ont été

séquencés de manière automatique par la Société ESGS (groupe Cybergene, Evry, France).

Auparavant, les produits PCR ont été purifiés selon les recommandations du fabricant du kit de

purification utilisé (Roche Diagnostics, High Pure PCR product purification Kit, Mannheim,

Germany). Un volume de produit PCR est mis dans une micro-colonne munie d’un micro-tube de 2

61

ml auquel on ajoute 5 volumes du tampon 1 [3 M guaninidine-thiocyanante, 10 mM Tris-HCl, 5 %

éthanol (V / V), pH 6,6 (25°C)]. Après mélange et centrifugation à 13 000 g pendant 2 min, 5

volumes de tampon 2 [20 mM Nacl, 2 mM Tris-HCl, pH 7,5 (25°C), concentration finale après

addition d'éthanol] sont ajoutés à la colonne. Le mélange est de nouveau centrifugé à 13 000 g

pendant 2 min, puis le produit de PCR est relavé avec 2 volumes de tampon 2 et centrifugé dans les

mêmes conditions que précédemment pendant 3 min. La dernière étape a consisté à décrocher à

l’aide d’un volume de TE [10 mM Tris-HCl, pH 8,5 (25°C)] d’élution, suivi d’une centrifugation à

13000 g pendant 4 min, le fragment d’ADN purifié fixé sur la membrane de la colonne, puis à le

mettre dans un micro-tube propre et stérile de 1,5 ml connecté à cette colonne. Un dixième du

volume du produit de PCR purifié obtenu sert de contrôle. Après migration sur gel d’agarose (0,8 - 1

%) et visualisation des bandes, une photo du gel et l’amplifiat sont envoyés à la Société ESGS pour le

séquençage. Avant l'envoi, nous déterminons les amorces utiles pour le séquençage. Ainsi, pour le

séquençage de dhfr et dhps, nous avons utilisé les amorces FR-1 de 27 mer et DHPS-2R de 25 mer de

séquences respectives 5’-ATG-ATG-GAA-CAA-GTC-TGC-GAC-GTT-TTG--3’ (FR-1) et 5’-CCA-

CAA-TAT-TTT-TAT-TTT-CAT-TTT-G-3’ (DHPS-2R). Le séquençage a permis d'explorer les

codons 16, 51, 59, 108 et 164 de la DHFR et 436, 437, 540, 581 et 613 de la DHPS de P. falciparum,

et d'éventuelles nouvelles mutations sur ces gènes. Les isolats dhfr et dhps sauvages seront définis

par les combinaisons alléliques Ala-16 / Asn-51 / Cys-59 / Ser-108 / Ile-164 pour dhfr et Ser-436 /

Ala-437 / Lys-540 / Ala-581 / Ala-613 pour dhps (Tableau IV). Quant aux fragments d’ADN du gène

pfmdr-1, ils ont été séquencés en utilisant les amorces suivantes : 5’-TTT-GTA-TGT-GCT-GTA-

TTA-TCA-GG-3’ de 23 mer pour pfmdr-1A et 5’-GCT-ATT-GAT-TAT-AAA-AAT-AAA-GG-3’ de

23 mer pour pfmdr-1B. Ainsi, le gène pfmdr -1 sauvage est défini par les génotypes Asn-86 / Tyr-184

/ Ser-1034 / Asn-1042 / Asp-1246 (Tableau IV).

62

Tableau IV : Principaux polymorphismes des codons impliqués dans la résistance de P. falciparum

des gènes dhfr, dhps, pfcrt et pfmdr-1 avec les acides aminés résultant de ces changements

Codons

dhfr

16

codons AA

51

codons AA

59

codons AA

108

codons AA

164

codons AA

Sauvage

Mutant

GCA Ala

GTA Val

AAT Asn

ATT Ile

TGT Cys

CGT Arg

AGC Ser

AAC Asn

ACC Thr

ATA Ile

TTA Leu

Codons

dhps

436

codons AA

437

codons AA

540

codons AA

581

codons AA

613

codons AA

Sauvage

Mutant

TCT Ser

GCT Ala

TTT Phe

CTG Leu

TAT Tyr

GCT Ala GGT Gly

AAA Lys GAA Glu

GCG Ala GGG Gly

GCC Ala TCC Ser

ACC Thr

CCC Pro

Codons

pfcrt

74

codons AA

75

codons AA

76

codons AA

Sauvage

Mutant

ATG Met

ATT Ile

AAC Asn GAA Glu

AAA Lys ACA Thr

Codons

pfmdr-1

86

codons AA

184

codons AA

1034

codons AA

1042

codons AA

1246

codons AA

Sauvage

Mutant

AAT Asn

TAT Tyr

TAT Tyr

TTT Phe

AGT Ser

TGT Cys

AAT Asn

GAT Asp

GAT Asp

TAT Tyr

63

II-3.4 Méthodes d'analyse des résultats

Tous les résultats des électrophorégrammes ont été analysés à l'aide du logiciel Editview

(Perking Elmer). Le test Chi-deux (χ2) ou Chi-deux amélioré de la correction de Yates (χ2C) a été

utilisé pour comparer l'efficacité thérapeutique de la chloroquine à celle de la sulfadoxine-

pyriméthamine, la sensibilité in vitro de la chloroquine à celle de la pyriméthamine, et la nature des

isolats (sauvage et mutants). Le test de Kappa de Cohen a été utilisé pour la concordance entre les

tests in vivo et in vitro / moléculaire (Fermanian, 1984, Com-Nougue et Rodary, 1987 ; Mazoyer et

Mary, 1987). Le degré de l'accord entre deux tests peut être qualifié comme suit : très bon, le

coefficient kappa de Cohen sera > 0,81 ; bon, 0,61 - 0,80 ; modéré, 0,41 - 0,60 ; médiocre, 0,21 -

0,40 ; mauvais, 0 - 0,20 ; très mauvais, < 0.

La réalisation successive des tests in vitro et moléculaires de cette étude se présente de la

manière suivante (Tableau V)

Tableau V : Réalisation des tests

REFERENCES TESTS RÉALISÉS

SUJETS / ISOLATS EF. THÉRAP. TEST IN VITRO TESTS MOLÉCULAIRES

ET* (1999)

CQ

ND

dhfr (PCR-RFLP), dhfr SQ

AY0 (1999) SP CQ, PYR, QU dhps SQ

AY9 (2000)

CQ CQ, PYR, QU pfcrt (PCR-RFLP)

AY1 (2000) SP CQ, PYR, QU pfmdr-1 SQ

CQ : chloroquine ; SP : sulfadoxine-pyriméthamine ; PYR : pyriméthamine; QU : quinine

ND : non réalisé

ET* : Référence des sujets et isolats dans l'article Cahiers de santé

SQ : gène séquencé ; AY9, AY0, AY1 : référence de sujets et isolats inclus

64

RÉSULTATS

65

III-1 Chimiosensibilité in vivo de P. falciparum

III-1.1 Efficacité thérapeutique de la chloroquine

Les deux années d'étude sur la chloroquine à Yopougon (Abidjan) ont concerné 185 enfants

venus en consultation pour hyperthermie. Après consultation, les enfants nous ont été adressés pour

un diagnostic de certitude de la présence d’hématozoaires de paludisme dans le sang. 67,6 % (125)

d'entre eux étaient porteurs de P. falciparum, 116 (62,7 %) avaient une densité parasitaire supérieure

ou égale à 2000 parasites asexués par microlitre de sang (pa./µl). 28 sujets n'ont pas été inclus dans

l'étude pour cause de paludisme grave (anémie avec taux d’hémoglobine < 7g/dl). En définitive, 88

(76 %) d’entre eux satisfaisaient pleinement aux critères d’inclusion du test de l'efficacité

thérapeutique de l’OMS (OMS, 1996). Les résultats obtenus ont révélé : 3 sujets perdus de vue

(3,6 %), 2 sujets exclus (2,4 %) pour prise d'antipaludique (automédication) entre J7 et J14. À la fin

du suivi de 14 jours, 37 sujets sur 83 (44,6 %) ont présenté des échecs thérapeutiques (ET) à la

chloroquine. 18 sujets (21,7 %) avaient des échecs thérapeutiques précoces (ETP) et 19 autres sujets

(22,9 %) des échecs thérapeutiques tardifs (ETT) selon la classification de 2001. Ces échecs

thérapeutiques tardifs étaient répartis en échecs cliniques tardifs (3,6 %) et en échecs parasitologiques

tardifs (19,3 %). Par contre, chez 46 sujets (55,4 %), des réponses cliniques et parasitologiques

adéquates (RCPA) ont été observées. Il n' y a pas de différences significatives entre les taux

respectifs d'ET et de RCPA à la chloroquine (χ2 = 0,55 ; p = 0,46). La clairance de la fièvre a été de

100 % à J14 après administration de l'antipaludique de remplacement, la quinine. Le taux de

regression de la densité parasitaire moyenne a été de 98,9% à J14. 8 sujets (9,6 %) étaient porteurs de

gamétocytes de P. falciparum. Le Tableau VI présente les résultats globaux du test d'efficacité

thérapeutique de la chloroquine.

66

Tableau VI : Résultats de l'efficacité thérapeutique de la chloroquine

PARAMETRES NOMBRE DE SUJETS

nombre de sujets examinés

indice plasmodique

nombre de sujets fébriles à J0 avec GE* positive

nombre de sujets, DP * > 2000 parasites/µl (pa/µl)

nombre de sujets inclus à J0

moyenne arithmétique de densité parasitaire à J0

185

67,6%

125

116

88

21652 pa./µl

nombre de sujets vus à J3

nombre de sujets fébriles

nombres de sujets parasités

moyenne arithmétique de densité parasitaire à J3

88

18

27 + 3 sujets porteurs de gamétocytes

1150 pa./µl

nombre de sujets vus à J7

nombre de sujets fébriles

nombres de sujets parasités

moyenne arithmétique de densité parasitaire à J7

65 **

03

16 + 8 sujets porteurs de gamétocytes

105 pa./µl

nombre de sujets vus à J14

nombre de sujets fébriles

nombres de sujets parasités

moyenne arithmétique de densité parasitaire à J14

62

0

16 + 8 sujets porteurs de gamétocytes

235 pa./µl

médicament utilisé

nombre de sujets suivis jusqu’à J14

réponse clinique et parasitologique adéquate

échec thérapeutique précoce

échec clinique tardif

échec parasitologique tardif

sulfate de chloroquine

83

55,4 % (46 / 83)

21,7 % (18 / 83)

3,6 % (3 / 83)

19,3 % (16 / 83)

* GE : goutte épaisse ; DP : densité parasitaire

** 3 sujets perdus de vue (3,6 %) et 2 sujets exclus (2,4 %) pour prise d’antipaludique à J7

67

III-1.2 Efficacité thérapeutique de la sulfadoxine-pyriméthamine

Pendant deux ans, nous avons évalué de façon concomitante l’efficacité thérapeutique de la

sulfadoxine-pyriméthamine dans cette même localité à la même période que l’étude sur la

chloroquine chez les enfants de moins de 5 ans atteints de paludisme non compliqué. Sur 179 sujets

porteurs de formes asexuées de P. falciparum, 98 ont été inclus dans cette étude. Huit sujets perdus

de vue (8,1 %) et 1 sujet exclus pour malnutrition et anémie sévère (taux d’hémoglobine < 6g/dl) ont

été enregistrés. 89 enfants ont été suivis jusqu’à J14. La sulfadoxine-pyriméthamine à la dose unique

de 1/2 comprimé pour 10 kg de poids corporel a été administré aux sujets. Les résultats de l'efficacité

thérapeutique ont donné 76,4 % (68 / 89) de RCPA contre 23,6 % (21 / 89) d'échecs thérapeutiques.

Ces deux pourcentages sont significativement différents, χ2 = 24,8 ; p = 10-6. Aucun échec

thérapeutique tardif n’a été observé avec la sulfadoxine-pyriméthamine . La clairance de la fièvre et

de la parasitémie ont été de 100 % à partir de J3. 15 sujets (17 %) étaient porteurs de gamétocytes de

P. falciparum.

Les résultats globaux de la clairance de la fièvre, de la parasitémie et de la réponse clinique

sont contenus dans le Tableau VII.

Étant donné que nous avons évalué l'efficacité thérapeutique des deux antipaludiques à la

même période sur les sujets dont l'âge < 5 ans avec randomisation du traitement, nous pouvons

comparer le différents résultats. Les résultats obtenus sont respectivement 44,6 % (37 / 83) d'ET à la

chloroquine et 23,6 % (21 / 89) d'ET à la sulfadoxine-pyriméthamine, puis 55,4 % de RCPA à la

chloroquine et 76,4 % de RCPA à la sulfadoxine-pyriméthamine. Il y a plus d'ET à la chloroquine

qu'à la sulfadoxine-pyriméthamine dans cette localité (χ2 = 5 ; p = 0,02). Le nombre élevé d'ET à la

chloroquine est dû aux nombreux cas d'échecs parasitologiques tardifs à ce médicament (19,3 %).

Les échecs cliniques sont respectivement de 25,3 % à la chloroquine et 23,6 % à la sulfadoxine-

pyriméthamine. La différence n'est pas significative (χ2 = 0,05 ; p = 0,82).

68

Tableau VII : Résultats de l’efficacité thérapeutique de la sulfadoxine-pyriméthamine

EFFICACITE THERAPEUTIQUE NOMBRE DE SUJETS

Clairance de la fièvre

Sujets afébriles à J3

Sujets afébriles à J7

Sujets afébriles à J14

73 / 93 (78,5 %)*

68 / 68 (100 %)

68 / 68 (100 %)

Clairance de la parasitémie

Sujets non porteurs de parasites asexués à J3

Sujets non porteurs de parasites asexués à J7

Sujets non porteurs de parasites asexués à J14

Sujets non porteurs de gamétocytes à J14

68 / 89 (76,4 %)

68 / 68 (100 %)

68 / 68 (100 %)

74 / 89 (83,2 %)

Réponse clinique et parasitologique

Réponse clinique et parasitologique adéquate (RCPA)

Echec thérapeutique précoce (ETP)

Echec thérapeutique tardif (ETT)

68 / 89 (76,4 %)

21 / 89 (23,6 %)

0 / 89 (0 %)

* Après J3, 5 sujets (perdus de vue) ne se sont plus présentés aux contrôles à J7

69

Chloroquine Sulfadoxine-pyriméthamine

Figure 1 : Répartition des réponses cliniques et parasitologiques aux antipaludiques

55,4% RCPA

19,3% EPT

21,7%ETP

3,6% ECT

23,6%ETP

76,4% RCPA

70

III-2 Chimiosensibilité in vitro de P. falciparum à la chloroquine, pyriméthamine et quinine

Semi-microtest optique

Cette étude a été réalisée de novembre 1998 à février 1999 sur des prélèvements des sujets

venus en consultation pour hyperthermie en médecine de collectivité de l'Institut National de Santé

Publique (INSP). Sur 47 semi-microtests réalisés, 34 isolats ont donné une bonne maturation (plus de

20 % de schizontes dans les puits témoins sans antipaludique) et ont été interprétables, soit 72,3 % de

réussite. Les CI50 variaient de 25 à 400 nM avec une moyenne de 64 nM pour les isolats chloroquino-

sensibles et 205 nM pour les isolats chloroquino-résistants. 32,5 % des isolats étaient chloroquino-

résistants (CI50 > 100 nM) et 67,5 % sensibles (CI50 < 100 nM).

Semi-microtest isotopique

Étant donné le nombre élevé d’isolats chloroquino-résistants, nous avons continué cette

évaluation par la mise en place d'un système de surveillance de la chimio-résistance plasmodiale en

incluant d’autres molécules comme la pyriméthamine et la quinine. Les isolats utilisés provenaient

d’enfants de moins de cinq ans porteurs de plasmodies. Nous avons pu coupler dans certains cas le

test de l'efficacité thérapeutique de la sulfadoxine-pyriméthamine au test in vitro à la pyriméthamine

(PYR) et celui de l'efficacité thérapeutique de la chloroquine (CQ) à la chimio-sensibilité in vitro à ce

même médicament. Ainsi, 179 semi-microtests ont été réalisés avec 69 tests in vitro à la chloroquine

dont 15 tests couplés efficacité thérapeutique / test in vitro, 61 tests in vitro à la PYR dont 32 tests

couplés (efficacité de la SP / in vitro à la PYR) et 49 tests in vitro à la quinine, antipaludique pour

lequel aucun test couplé n'a été réalisé.

Sur l'ensemble des isolats étudiés, les CI50 à la chloroquine variaient de 20 à 450 nM (Tableaux

VIII), avec une moyenne arithmétique de 94 nM, tandis que la moyenne de la CI50 des isolats à la

PYR est égale à 2240 nM avec des valeurs extrêmes de 50 et 19000 nM (Tableaux IX). Quant à la

quinine, la moyenne est de 200 nM avec des valeurs extrêmes variant de 20 à 400 nM (Tableaux VIII

et IX). Au plan de la résistance, 25 isolats sur 69 étaient résistants à la chloroquine (CI50 > 100 nM)

71

soit 36, 2 % (Figure 2), contre 44 isolats sensibles (63,8 %) (CQ-S). Parmi les isolats sensibles,

certains avaient une sensibilité diminuée (90 nM < CI50 < 100 nM) et représentaient 10 %. Se basant

sur la classification arbitraire des réponses in vitro à la pyriméthamine : sensible, en dessous de 100

nM ; résistance modérée, entre 100 et 2000 nM ; hautement résistant, plus de 2000 nM, nous avons

obtenu 24 / 61 isolats (39,3 %) hautement résistants (PYR-R), 8,3 % (5 / 61) d'isolats

pyriméthamino-sensibles (PYR-S) et 52,4 % (32 / 61) d'isolats à résistance modérée (Figure 2).

Aucun isolat quinino-résistant n'a été observé, toutes les CI50 déterminées étaient inférieures à 800

nM. Lorsque nous considérons la résistance à la chloroquine et à la pyriméthamine de cette étude, la

différence entre les isolats chloroquino-résistants (36,2 %) et pyriméthamino-résistants (39 %) n'est

pas significative (χ2 = 0,09, p = 0,76).

100%

0%

64%

36%

8%

39%

53%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 2 3

Antipaludiques

QU CQ PYR

Figure 2 : Sensibilité in vitro de P. falciparum à la chloroquine (CQ), à la pyriméthamine (PYR)

et à la quinine (QU)

Isolats sensibles

Isolats résistants

Isolats à résisatnce modérée

72

III-3 Tests couplés efficacité thérapeutique / sensibilité in vitro de P. falciparum

III-3.1 Efficacité thérapeutique / sensibilité in vitro de P. falciparum à la chloroquine

Au niveau de ce test couplé, nous avons obtenu 40 % de résistance in vitro (6 / 15) contre 60 %

d’isolats sensibles (9 / 15). Les 6 isolats résistants correspondaient à 5 échecs thérapeutiques à la

chloroquine (ETP et ETT) et 1 RCPA, AY934 (CI50 = 120 nM) (Tableau VIII). Les moyennes

arithmétiques des CI50 de la chloroquine sont respectivement de 64,5 nM et 190 nM sur les isolats

sensibles et résistants. Les 3 isolats AY908, AY920, AY938 ont une sensibilité diminuée, c'est-à-dire

des CI50 proches de 100 nM (92, 90 et 98 nM) mais correspondaient à 3 RCPA à la chloroquine.

Dans cette série limitée en nombre de test comparatifs, un test kappa de Cohen nous permet de dire

qu'il existe une très bonne concordance entre le test in vivo et in vitro à la chloroquine (kappa = 0,86).

III-3.2 Efficacité thérapeutique de la sulfadoxine-pyriméthamine / sensibilité in vitro à la

pyriméthamine

Ce test couplé a permis d'obtenir des moyennes de CI50 de 303,1 nM sur les isolats PYR-S et

6490 nM sur les isolats PYR-R. Par ailleurs, 37,5 % (12 / 32) des isolats évalués étaient hautement

pyriméthamino-résistants (PYR-R), pour 50 % (16 / 32) d’isolats à résistance modérée (PYR-Rm) et

12,5 % (4 / 32) d'isolats sensibles (PYR-S). Les 12 isolats PYR-R correspondaient à 12 ETP à la

sulfadoxine-pyriméthamine (Tableau IX). Quant aux 20 isolats PYR-Rm et PYR-S, ils

correspondaient à 20 RCPA à la sulfadoxine-pyriméthamine. Lorsque nous définissons la résistance

in vitro à la pyriméthamine comme CI50 > 2000 nM, la concordance entre la réponse in vitro et la

réponse clinique et parasitologique est parfaite (kappa = 1,0).

Lorsque nous comparons les poucentages des isolats résistants à la chloroquine (40 %) et à la

PYR (37,5 %) au niveau des tests couplés, la différence n'est pas significative (χ2 = 0,016 p = 0,90).

73

Tableau VIII : Résultats du test couplé de l'efficacité thérapeutique et in vitro à la chloroquine et

détermination de la sensibilité des isolats de P. falciparum à la pyriméthamine et à la quinine.

N° ISOLATS

CI50 CQ en

nM

REPONSE

IN VIVO

CI50 PYR en

nM

CI50 QU en

nM

AY903 *

45

RCPA

90

250

AY902 135 ETP 400 220

AY904 155 ETP 9750 101

AY933 63 RCPA 500 150

AY905 55 RCPA 3500 200

AY908 92 RCPA 1800 90

AY910 35 RCPA 800 20

AY918 28 RCPA 950 105

AY920 90 RCPA 400 300

AY923 75 RCPA 550 220

AY938 98 RCPA 350 62

AY934 120 RCPA 1250 400

AY937 165 ECT 2750 200

AY9TR4 150 ECT 800 110

AY9TR2 450 ETP 7500 185

* Le numéro de l’isolat correspond à la référence du sujet suivi jusqu’à J14

ETP : échec thérapeutique précoce ; RCPA : réponse clinique et prasitologique adéquate

ECT : échec clinique tardif

CI50 : concentration inhibitrice à 50 %

CQ : chloroquine ; PYR : pyriméthamine ; QU : quinine

74

Tableau IX : Résultats du test couplé de l'efficacité thérapeutique à la sulfadoxine-pyriméthamine

et in vitro à la pyriméthamine et détermination de la sensibilité in vitro des isolats à la chloroquine

et à la quinine

N° ISOLAT

CI50 PYR

nM

REPONSE IN VIVO

CI50 CQ

nM

CI50 QU

nM

AY003

6400 ETP

147

200 AY010 120 RCPA 55 20 AY0148 2400 ETP 60 250 AY016 360 RCPA 45 250 AY0172 2005 ETP 115 300 AY022 110 RCPA 25 105 AY0240 3500 ETP 75 300 AY030 705 RCPA 35 45 AY032 250 RCPA 103 30 AY045 7500 ETP 72 80 AY048 150 RCPA 78 25 AY049 55 RCPA 43 50 AY053 90 RCPA 45 40 AY057 550 RCPA 20 20 AY058 77 RCPA 80 101 AY063 9000 ETP 220 75 AY065 285 RCPA 50 28 AY070 280 RCPA 35 25 AY084 4790 ETP 101 65 AY095 500 RCPA 85 42 AY120 11500 ETP 94 ND AY124 19000 ETP 130 ND AY125 4250 ETP 105 ND AY126 3500 ETP 75 ND AY128 4000 ETP 60 ND AY155 368 RCPA 43 ND AY159 600 RCPA 90 ND AY167 768 RCPA 60 ND AY169 50 RCPA 46 ND AY174 100 RCPA 52 ND AY175 104 RCPA 37 ND AY1TR5

540 RCPA 25 ND

* Le numéro de l’isolat correspond à la référence du sujet suivi jusqu’à J14

ETP : échec thérapeutique précoce ; RCPA : réponse clinique et parasitologique adéquate

CI50 : concentration inhibitrice à 50 %

CQ : chloroquine ; PYR : pyriméthamine ; QU : quinine

75

III-4 Profil génétique des isolats de P. falciparum d'origine ivoirienne

III-4.1 Digestion enzymatique ou RFLP

Résultats des digestions des fragments d'ADN du gène dhfr-ts

Avant de travailler sur un nombre plus important d’échantillons de P. falciparum, nous avons

montré dans un premier travail qu’il existait un nombre relativement élevé d’isolats provenant de

sujtes porteurs de P. falciparum mutants (22 %) potentiellement résistants aux antifoliniques à

Abidjan (Yopougon, zone de la présente étude). Cette étude a été réalisée en 1998 et a concerné le

profil génétique des isolats de P. falciparum en prenant comme base la mutation clé qui affecte le

codon 108 du gène dhfr. Compte tenu des difficultés à transporter les échantillons de sang total

parasité des zones d’endémie palustre vers les zones indemnes de paludisme pour les études

moléculaires, le sang parasité a été déposé sur du papier filtre Whatman 3MM et l’extraction de

l’ADN plasmodial a été réalisée à la résine (chelex 100, Biorad). La mutation de type Thréonine

(ACC) révélé dans cette étude de 1998 publiée en 2000 avait été faite par déduction (article en

Annexe-1). Elle n'a pas été confirmée par la digestion des fragments d'ADN par ScrF I.

Pour vérifier l'existence ou non de mutant de type Thréonine dans la zone d'étude un premier

lot de 54 isolats à sensibilité in vivo et / ou in vitro connue pour la plupart a été étudié. Le fragment

de 708 pb du gène dhfr de P. falciparum a été soumis à la digestion des endonucléases (Alu I, Bsr I et

ScrFI). Les résultats obtenus ont révélé que 21 isolats (39 %) étaient des mutants purs (Asn-108,

codon AAC), 27 isolats sauvages (50 %) (Ser-108, codon AGC) et 6 isolats (11 %) mixtes (Ser -108 /

Asn- 108, codon AGC / AAC). Aucun fragment d'ADN n’a été clivé par Scr FI, il n'y a pas eu de

mutant de type Thréonine. Tous les résultats relatifs à la PCR-RFLP des 54 isolats apparaissent dans

le Tableau iii en Annexe-2. Les fragments d'ADN clivés par Bsr I ont été par la suite séquencés pour

rechercher des mutations additionnelles sur le gène dhfr-ts.

76

Résultats des digestions des fragments d'ADN du gène pfcrt

Les fragments d'ADN de 145 pb contenant le codon 76 du gène pfcrt de 144 isolats de P.

falciparum ont été soumis à la digestion de Apo I, enzyme qui reconnaît et clive le codon 76 lorsqu'il

est sauvage (K76). L'analyse de ce codon après PCR-RFLP a révélé que l'allèle K76T mutant était

présent chez 65,3 % des isolats analysés (94 / 144) contre 34,7 % d'isolats sauvage K 76 (50 / 144)

(Figure 3 et Tableau X). Les résultats de la digestion de l'acide aminé 76 des fragments d'ADN des

144 isolats apparaissent dans le Tableau iv en Annexe-2.

III-4.2 Acides aminés de la DHFR, DHPS, PFMDR-1 des isolats de P. falciparum

Après l'analyse de l'électrophorégramme, les résultats de l'étude de la DHFR de 144 isolats de

P. falciparum ont donné 73 % d'isolats sauvages de type Ala-16 / Asn-51 / Cys-59 / Ser-108 / Ile-

164. En plus de l'allèle sauvage, 27 % d'isolats mutants de combinaisons alléliques suivantes ont été

obtenus : 5 % (7 / 144) d'isolats simples mutants Asn-51 / Cys-59 / Asn-108; 13 % (19 / 144) d'isolats

doubles mutants de type Ile 51 / Cys-59 / Asn-108 ; Asn-51 / Arg-59 / Asn-108 puis 9 % (13 / 144)

d'isolats triple mutants, Ile-51 / Arg-59 / Asn-108 (Tableau X). Aucune mutation affectant les codons

16 et 164 n'a été observée. Ils sont restés invariants (Tableau iv en Annexe-2).

Au niveau de la DHPS, très peu d'isolats sauvages ont été mis en évidence. Ils représentaient

6,6 % des 106 isolats dont le gène dhps a été séquencé et sont caractérisés par les acides aminés Ser-

436 / Ala-437 / Lys-540 / Ala-581 / Ala-613. Les codons 540 et 581 de tous les isolats étaient

sauvages. Ils sont restés invariants. Ainsi, l'allèle simple mutant est porté par 54,7 % des isolats (58 /

106) (Tableau X). La mutation a concerné soit le codon 436 (Ser-436-Ala ou Ser-436-Phe) soit le

codon 437 (Ala-437-Gly). Les isolats doubles mutants qui représentaient 34,9 % (37 / 106) avaient en

dehors des allèles invariants des codons 540 et 581, les allèles Ala-436 + Gly-437 ou Ala-436 + Ser-

613 ou Ala-436 + Pro-613 ou Leu-436 + Gly-437 ou Phe-436 + Ser-613 ou Tyr-436 / Ser-613. Quant

aux isolats triples mutants, ils étaient en proportion de 3,8 % (4 / 106) et avaient les allèles Ala-436 /

Gly-437 / Lys-540 / Ala-581 / Ser-613. En dehors de la mutation habituelle Ser-436-Ala, d'autres

77

types de mutations comme Ser-436-Leu (AY930), Ser-436-Phe (AY122, AY932..), Ser-436-Tyr

(AY005, AY126, AY905 …) ont été mis en évidence. Il en va de même du codon Ala-613-Pro

(AY03B) (Tableau v dans l'Annexe-2). L'analyse de toutes les séquences a montré que la mutation

ponctuelle du codon Ala-613 était toujours associée à la mutation du codon 436 et / ou 437. Dans

cette étude, la mutation Ala-613 n'apparaît jamais seule.

Le fragment de 394 pb de la première partie codante séquencée du gène pfmdr-1 comporte la

combinaison allélique Asn-86 / Tyr-184 pour les isolats sauvages. Sur un total de 144 isolats, les

résultats ont révélé : 33 isolats sauvages (23 %), 64 isolats simples mutants de type Asn-86 / Phe-184

ou Tyr-86 / Tyr-184 et 47 isolats double mutants (32,8 %) de type Tyr-86 / Phe-184. Aucune autre

mutation affectant la première partie codante de ce gène n'a été mise en évidence chez les isolats de

P. falciparum de Côte d'Ivoire.

L'analyse de l'électrophorégramme des fragments de 774 pb de la deuxième partie codante du

gène pfmdr-1 n'a révélé aucune mutation affectant les codons Ser-1034 et Asn-1042, de telle sorte

que les isolats sauvages représentaient 99,3 %. La mutation habituelle sur cette partie du gène n'a

concerné qu'un seul isolat (AY04B), qui représente 0,7 % (1 / 144). Elle est caractérisée par les

allèles Ser-1034 / Asn-1042 / Tyr-1246. Toutefois, de nouvelles mutations ont affecté les codons

Gly-1074 (AY02B) et Asn-1238 (AY03B). Ainsi, seulement 2,1 % (3 / 144) des mutations affectent

la deuxième partie du gène pfmdr-1, tous de simples mutants caractérisés par les allèles, soit, Ser-

1034 / Asn-1042 / Ser-1074 / Asn-1238 / Asp-1246 (AY02B), soit, Ser-1034 / Asn-1042 / Gly-1074 /

Tyr-1238 / Asp-1246 (AY03B), soit, Ser-1034 / Asn-1042 / Gly-1074 / Asn-1238 / Tyr-1246

(AY04B). Par ailleurs, les résultats ont montré que chez 9 isolats, le codon 1069-(ACT) a été

remplacé par le codon 1069-(ACG). Le changement de base (T en G) n'a pas modifié la nature de

l'acide aminé (Thréonine). En définitive, 32 isolats sauvages (22,2 %), 63 isolats simples mutants

(43,8 %) et 49 isolats doubles mutants (34 %) ont été observés après le séquençage du gène pfmdr1.

78

Toutes les séquences des acides aminés de fragment d'ADN de chaque isolat apparaissent dans

les Tableaux iv et v en Annexes-2.

Tableau X : Répartition du nombre d'isolats par rapport au type de mutation de chaque gène séquencé

Gènes de résistance Génotype

pfcrt

dhfr

dhps

pfmdr-1

Sauvage

50 (34,7 %)

105 (73 %)

7 (6,6 %)

32 (22,2 %)

Simple mutant 94 (65,3 %) 7 (5 %) 58 (54,7 %) 63 (43,8 %)

Double mutant - 19 (13 %) 37 (34,9 %) 49 (34 %)

Triple mutant - 13 (9 %) 4 (3,8 %) 0 (0 %)

Total 144 144 106 144

Figure 3 : Répartition des isolats selon les génotypes

pesP

ourc

enta

ge d

'isol

ats

35%

65%

73%

27%

7%

93%

22%

78%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 2 3 4 5Isolats

Sauvages

Mutants

pfcrt dhfr dhps pfmdr-1

Pour

cent

age

d'is

olat

s

79

III-4.3 Prévalence de la mutation et sensibilité des isolats aux antipaludiques

III-4.3.1 Mutation K76T et sensibilité de P. falciparum à la chloroquine

Mutation K76T et efficacité thérapeutique de la chloroquine

L'analyse du gène pfcrt de chaque isolat a montré que l'allèle K76T était présent chez 100 %

(24 / 24) des sujets ayant un ET à la chloroquine (Tableau XI). Cependant, la mutation Lys76Thr

était également présente chez 12 % (2 / 17) des sujets chez lesquels une RCPA a été obtenue.

Toutefois, l'allèle sauvage a été mis en évidence chez 88 % (15 / 17) de sujets à RCPA ; il y a plus de

sujets à RCPA portant des isolats sauvages que ceux portant des isolats mutants (χ2 = 9,9 ; p =

0,001). Un test kappa de Cohen permet de dire qu'il existe une très bonne concordance entre

l'efficacité thérapeutique de la chloroquine et les mutations affectant le gène pfcrt (kappa = 0,9).

Mutation K76T et sensibilité in vitro de P. falciparum à la chloroquine

L'analyse des fragments d'ADN de 50 isolats à sensibilité in vitro connue a révélé que parmi

les isolats chloroquino-résistants (CQ-R, CI50 > 100 nM), 29 % (6 / 21) avaient l'allèle Lys-76 et

donc sont de type sauvage (Tableau XI). La CI50 variait de 100 à 154 nM avec une moyenne

arithmétique de 116 nM. Cependant, 71 % (15 / 21) de ces isolats CQ-R portaient l'allèle Thr-76 avec

une CI50 moyenne de 181 nM dont les valeurs extrêmes sont comprises entre 130 à 450 nM. Le

pourcentage d'isolats CQ-R de génotype mutant (71 %) est sensiblement le même que celui d'isolats

CQ-R de génotype sauvage (29 %) (χ 2 = 3,86 p = 0,06). De la même façon, les isolats CQ-S n'étaient

pas tous de type sauvage. Parmi eux, 45 % (13 / 29) étaient des mutants Thr-76 et 55 % (16 / 29) de

type sauvage, Lys 76, (χ 2 = 0,31 ; p = 0,58) (Tableau XI). Les CI50 déterminées variaient

respectivement de 25 à 98 nM pour les isolats sauvages avec une moyenne de 63 nM, tandis que pour

les isolats mutants, cette CI50 moyenne était de 55,9 nM à avec des valeurs extrêmes de 25 à 94 nM.

La concordance entre le test in vitro et le profil du gène pfcrt est médiocre (kappa = 0,26).

80

Tableau XI : Réponses in vivo et in vitro à la chloroquine et mutation du gène pfcrt des isolats de P.

falciparum

REPONSES IN VIVO

N = 41 SUJETS

GENE DE

SAUVAGE (K-76)

LA PFCRT

MUTANT (T-76)

Réponses clin. parasitol.

Adéquates (RCPA)

17 (41 %)

88 % (15 / 17)

12 % (2 / 17)

Échec Thérapeutique (ET)

24 (59 %)

0 % (0 / 24)

100 % (24 / 24)

REPONSES IN VITRO

N = 50 ISOLATS

CQ-S (< 100 nM)

29 (58 %)

55 % (16 / 29)

45 % (13 / 29)

CQ-R (> 100 nM)

21 (42 %)

29 % (6 / 21)

71 % (15 / 21)

RCPA : Réponse clinique et parasitologique adéquate

CQ-S : chloroquino-sensible ; CQ-R : chloroquino-résistant

PFCRT : Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter

K-76 : codon Lysine 76 ; T-76 : codon Thréonine 76

81

Lorsque nous considérons la répartition de la mutation (T-76) dans la population des sujets

traités à la chloroquine, nous observons que les 26 isolats mutants proviennent majoritairement des

sujets à ET (92 %, 24 / 26) et 8 % (2 / 26) des sujets à RCPA (χ2 = 18,6 p < 0,05). Inversement, tous

les isolats pfcrt sauvages sont portés par les sujets à RCPA (Tableau XII).

Dans la population des isolats à sensibilité in vitro connue, nous obtenons 15 (54 %) isolats

mutants provenant des isolats CQ-R et 13 (46 %) d'isolats CQ-S (χ2 = 0,14 p = 0,7). Par contre, 73 %

(16 / 22) des isolats pfcrt sauvages proviennent des isolats CQ-S et 27 % (6 / 22) des isolats CQ-R

(χ2 = 4,5 p = 0,03).

Tableau XII : Répartition des isolats pfcrt mutants dans la population des sujets traités à la

chloroquine, et dans celle des isolats à sensibilité in vitro connue

GENE DE LA PFCRT N = 41

POPULATION À ET

POPULATION À RCPA

SAUVAGE, 15 (67 %)

0 / 15 (0 %)

15 / 15 (100 %)

MUTANT, 26 (63 %)

24 / 26 (92 %)

2 / 26 (8 %)

GENE DE LA PFCRT N = 50

CQR

CQS

SAUVAGE, 22 (44 %)

6 / 22 (27 %)

16/ 22 (73 %)

MUTANT, 28 (56 %)

15 / 28 (54 %)

13 / 28 (46 %)

RCPA : Réponse clinique et parasitologique adéquate

CQ-S : chloroquino-sensible ; CQ-R : chloroquino-résistant

PFCRT : P. falciparum chloroquine resistance transporter

Le Tableau XIII présente le profil génétique des isolats à sensibilité in vivo et / ou in vitro

connue par rapport à la chloroquine.

82

Tableau XIII : Sensibilité in vivo et in vitro à la chloroquine et profil génétique du gène pfcrt des

isolats correspondant de P. falciparum

N° ISOLAT

pfcrt-76

IN VITRO (CI50 en nM)

IN VIVO

AY003

T

R (147) ND

AY120 T S (094) ND AY124 T R (130) ND AY125 K R (105) ND AY126 T S (075) ND AY128 T S (060) ND AY155 K S (043) ND AY159 T S (090) ND AY167 T S (060) ND AY169 T S (046) ND AY174 T S (052) ND AY175 T S (037) ND AY1TR5 L S (025) ND AY901 T ND EPT AY902 T R (135) ETP AY903 K S (045) RCPA AY904 T R (155) ETP AY905 K S (055) RCPA AY906 K ND RCPA AY907 T ND EPT AY908 K S (092) RCPA AY909 T ND ETP AY910 K S (035) RCPA AY911 T ND ETP AY912 T ND EPT AY914 K ND RCPA AY916 T ND EPT AY917 K ND RCPA AY918 K S (028) RCPA AY919 T ND ETP AY920 K S (090) RCPA AY921 T ND EPT AY922 T ND ETP AY923 K S (075) RCPA AY924 K ND RCPA AY925 K ND RCPA AY926 T ND ETP AY927 T ND EPT AY929 T ND EPT AY930 T ND EPT AY 931 T ND ECT AY 932 T ND EPT AY933 K S (063) RCPA

83

AY 934 K R (120) RCPA AY 935 T ND ETP AY 936 T ND EPT AY 937 T R (165) ECT AY 938 K S (098) RCPA AY952 T ND EPT AY954 T ND RCPA AY9TR1 T ND EPT AY9TR2 T R (450) ETP AY9TR3 T ND RCPA AY9TR4 T R (150) ECT AY01B T S (045) ND AY03B T R (177) ND AY10B T R (180) ND AY11B K R (154) ND AY13B K R (105) ND AY20B K R (110) ND AYA40 K S (090) ND AYA41 K S (095) ND AYA42 K R (100) ND AYA43 T R (153) ND AYA44 T R (201) ND AYA45 T S (080) ND AYA46 T R (141) ND AYA47 K S (070) ND AYA48 K S (065) ND AYA49 T R (140) ND AYA50 T S (063) ND AYA51 T R (242) ND AYA53 T R (150) ND AYA54 T S (025) ND AYA56 K S (040) ND AYA57 T S (050) ND

ND : non déterminé

EPT : échec parasitologique tardif ; ECT : échec clinique tardif ; ETP : échec thérapeutique précoce

RCPA : échec clinique et parasitologique adéquate

84

III-4.3.2 Mutation du gène pfmdr-1 et sensibilité de P.falciparum à la quinine et à la chloroquine

Profil génétique du gène pfmdr-1 et sensibilité des isolats à la quinine

L'analyse de la chimio-sensibilité in vitro à la quinine a montré que toutes les CI50

déterminées sont inférieures à 800 nM (Tableaux VIII et IX), alors que l'analyse du gène pfmdr-1 a

montré 78 % (112 / 144) d'isolats mutants. La CI50 à la quinine la plus élevée est de 400 nM (isolat

AY934). Bien que cet isolat soit sensible à la quinine, il a les allèles double-mutants pfmdr-1, Tyr-86

/ Phe-184 / Ser-1034 / Asn-1042 / Asp-1246. De façon générale, les mutations n'ont pas influencé la

sensibilité des isolats de P. falciparum à la quinine.

Profil génétique du gène pfmdr-1 et sensibilité in vivo des isolats à la chloroquine

L'analyse des mutations affectant les codons Asn-86 et Tyr-184 du gène pfmdr-1 et la réponse

in vivo des sujets à la chloroquine montre que tous les sujets à ET ne portaient pas de parasites pfmdr-

1 mutants. 33 % (8 / 24) de sujets à ET portent des isolats sauvages, (Asn-86 / Tyr-184) et 67 % (16 /

24) des isolats pfmdr-1 mutants de combinaisons alléliques Tyr-86 / Tyr-184 (4,2 %), Asn-86 / Phe-

184 (29,2 %) et Tyr-86 / Phe-184 (29,2 %). De la même manière, 13 (76,5 %) des 17 sujets à RCPA

portent des isolats pfmdr-1 mutants. Les mutants proviennent aussi bien de la population à ET (55 %)

que de la population à RCPA (45 %). Il existe une très mauvaise concordance entre les mutations

affectant le gène pfmdr-1 et l'efficacité de la chloroquine (kappa < 0).

Profil génétique du gène pfmdr-1 et sensibilité in vitro des isolats à la chloroquine

En ce qui concerne la sensibilité in vitro à la chloroquine, les 39 isolats mutants pfmdr-1

proviennent aussi bien des isolats CQ-R, 16 (41 %) que de la population des isolats CQ-S, 23 (59 %)

(χ2= 1,2 p = 0,26). Il existe une très mauvaise concordance entre les mutations affectant le gène

pfmdr-1 et la sensibilité in vitro de P. falciparum à la chloroquine (kappa < 0) (Tableaux XIV et XV).

85

Tableau XIV : Réponses in vivo et in vitro à la chloroquine et mutation du gène pfmdr-1 des isolats

de P. falciparum

GENE DE LA PFMDR-1 REPONSES IN VIVO N = 41 SUJETS

SAUVAGE MUTANT

Réponses clin. parasitol.

Adéquates (RCPA)

17 (41 %)

23,5 % (4 / 17)

76,5 % (13 / 17)

Échec Thérapeutique (ET)

24 (59 %)

33 % (8 / 24)

67 % (16 / 24)

REPONSES IN VITRO N = 50 ISOLATS

CQ-S (< 100 nM)

29 (58 %)

21 % (6 / 29)

79 % (23 / 29)

CQ-R (> 100 nM)

21 (42 %)

24 % (5 / 21)

76 % (16 / 21)

RCPA : Réponse clinique et parasitologique adéquate

CQ-S : chloroquino-sensible ; CQ-R : chloroquino-résistant

PFMDR-1: Plasmodium falciparum multi-drug resistance gene -1

86

Tableau XV : Répartition des mutants pfmdr-1 dans la population des sujets traités à la

chloroquine et dans la population des isolats à sensibilité in vitro connue.

GENE DE LA PFMDR-1

N = 41

POPULATION À ET

POPULATION À RCPA

SAUVAGE

12 (30 %)

8 / 12 (67 %)

4 / 12 (33 %)

MUTANT

29 (71 %)

16 / 29 (52 %)

13 / 29 (45 %)

GENE DE LA PFMDR-1

N = 50

CQR

CQS

SAUVAGE

11 (22 %)

5 / 11 (45,5 %)

6/ 11 (54,5 %)

MUTANT

39 (78 %)

16 / 39 (41 %)

23 / 39 (59 %)

RCPA : Réponse clinique et parasitologique adéquate

CQ-S : chloroquino-sensible ; CQ-R : chloroquino-résistant

PFMDR-1 : Plasmodium falciparum multi-drug resistance gene-1

L'analyse de l'influence des mutations des deux gènes pfmdr-1 et pfcrt sur la réponse des

sujets au traitement par la chloroquine permet d'obtenir les résultats suivants : lorsque la mutation

affecte uniquement le gène pfcrt (pfmdr-1 sauvage), 33 % d'ET sont obtenus pour 0 % de RCPA. Par

contre, lorsqu'elle affecte le gène pfmdr-1 (pfcrt sauvage), nous n'obtenons aucun ET (0 %) pour 65

% (11 / 17) de RCPA. Lorsque les deux gènes sont mutés, 67 % d'ET sont obtenus et 11,5 % de

RCPA (χ2c = χ2 amélioré de la correction de Yates = 12,4 p = 0,001) (Tableau XVI).

87

Tableau XVI : Influence de la nature des gènes pfmdr-1 et pfcrt dans la population des sujets

traités à la chloroquine

NATURE DES GENES

POPULATION À RCPA

N = 17

POPULATION À ET

N = 24

pfmdr-1 Sauvage

pfcrt Sauvage

4 / 17 (23,5 %)

0 / 24 (0 %)

pfmdr-1 Sauvage

pfcrt Mutant

0 / 17 (0 %)

8 / 24 (33 %)

pfmdr-1 Mutant

pfcrt Sauvage

11 / 17 (65 %)

0 / 24 (0 %)

pfmdr-1 Mutant

pfcrt Mutant

2 / 17 (11,5 %)

16 / 24 (67 %)

RCPA : Réponse clinique et parasitologique adéquate

ET : Échec thérapeutique

Les résultats sur la sensibilité in vivo et in vitro de P. falciparum et les mutations affectant

les gènes pfmdr-1 et pfcrt seront soumis à publication sous le titre :

Association between pfcrt and pfmdr-1 gene mutations and chloroquine and quinine sensitivity of

Plasmodium falciparum isolates from Côte d'Ivoire

J. Djaman, A. Mazabraud, and L. Basco

88

III-4.3.3 Mutation des gènes dhfr-ts et dhps et sensibilité de P. falciparum à la SP

Profil génétique du gène dhfr-ts et dhps et efficacité thérapeutique de la sulfadoxine-pyriméthamine

Parmi les 21 sujets chez lesquels nous avons obtenu un ETP à l'association sulfadoxine-

pyriméthamine, 18 sujets (86 %), avaient des isolats mutants à la DHFR contre 3 sujets (14 %) chez

lesquels les isolats étaient mixtes (la différence entre ces deux pourcentages est significative χ2= 10,7

p < 0,05). Parmi les 68 sujets à RCPA, la majorité d'entre eux, soit 75 % (51 / 68), portaient des

isolats dhfr sauvages, le reste avait soit des isolats dhfr mutants, ils représentaient 22% (15 / 68) soit

des isolats mixtes, ils étaient 3 % (2 / 68) (Il y a plus de sujets RCPA portant des isolats dhfr

sauvages que d'isolats mutants, χ2 = 19, p < 0,05). Le degré de l'accord entre les deux tests (in vivo /

moléculaire) est modéré, (kappa = 0,59).

Au niveau de la DHPS, tous les sujets à ETP (100 %) portaient des isolats dhps mutants et 94

% (48 / 51) de sujets à RCPA portaient également des isolats dhps mutants pour 6 % (3 / 51) de sujets

à RCPA portants des isolats dhps sauvages (Il y a plus de sujets RCPA ayant des isolats dhps mutants

que d'isolats dhps sauvages, χ2= 39,7 p < 0,05) (Tableau XIV). Le degré de l'accord entre les deux

tests (in vivo / molécualaire) est mauvais, (kappa = 0,04).

Profil génétique des gènes dhfr-ts et dhps et sensibilité in vitro à la pyriméthamine

La chimio-sensibilité in vitro à la pyriméthamine, en tenant compte de la nature génétique de

ces isolats après analyse de la DHFR, a permis d'obtenir des groupes d'isolats repartis de la manière

suivante : parmi les 24 isolats PYR-R, 17 (71 %) sont de mutants purs présentant les combinaisons

alléliques Ala-16 / Asn-51 / Cys-59 / Asn-108 / Ile-164 ou Ala-16 / Ile-51 et / ou Arg-59 / Asn-108 /

Ile164. Les CI50 variaient de 2005 à 19 000 nM avec une moyenne arithmétique de 5850 nM. 8 % (2 /

24) des isolats PYR-R avaient un mélange d'allèles, ils étaient mixtes avec une moyenne de CI50 de

3600 nM et des valeurs extrêmes comprises entre 2400 à 4790 nM. Enfin, 5 isolats PYR-R (21 %)

sont des isolats dhfr sauvages. Il y a plus d'isolats PYR-R dhfr mutants que sauvages (χ2= 6 ; p =

0,02). Au niveau des isolats pyriméthamino-sensibles, tous (100 %) étaient dhfr sauvages (5 / 5). Par

89

contre, ceux qui étaient modérément résistants, 3 % (1 / 32) étaient mixtes, 3 % (1 / 32) dhfr mutant

et 94 % (30 / 32) dhfr sauvage (Tableau XVII). La concordance entre les deux tests (in vitro /

moléculaire) est bonne, (kappa = 0,75) si la résistance est définie pour CI50 > 2000 nM. Par contre,

elle est mauvaise (kappa = 0,089) pour CI50 < 100 nM.

Pour ce qui est de la DHPS, tous les 24 isolats (100 %) résistants à la PYR avaient le profil

génétique dhps mutant. Il y a une indépendance entre le test in vitro à la PYR et le profil génétque de

dhps (kappa = 0).

Tableau XVII : Réponses in vivo à la SP et in vitro à la PYR et nature des gènes dhfr et dhps des

isolats de P. falciparum

RÉP. IN VIVO GENE DE LA DHFR GENE DE LA DHPS N = 89 SUJETS SAUV. MIXTE MUT. SAUV. MUT.

RCPA, 68 (76 %)

75 %

51 / 68

3 %

2 / 68

22 %

15 / 68

6 %

3 / 51

94 %

48 / 51

ÉCHEC THÉRAP.

21 (24 %)

0 % 0 / 21

14 % 3 / 21

86 % 18 / 21

0 % 0 / 21

100 % 21 / 21

REP. IN VITRO N = 61 ISOLATS

PYR-S (<100 nM)

5 (8 %)

100 % 5 / 5

0 % 0 / 5

0 % 0 / 5

0 % 0 / 2

100 % 2 / 2

PYR-Rm *

32 (53 %)

94 %

30 / 32

3 %

1 / 32

3 %

1 / 32

14 %

2 / 14

86 %

12 / 14

PYR-R (> 2000 nM)

24 (39 %)

21 %

5 / 24

8 %

2 / 24

71 %

17 / 24

0 %

0 / 24

100 %

24 / 24

90

Considérons à présent la répartition des isolats dhfr mutants dans les différentes populations.

Parmi les 33 isolats dhfr mutants, 18 (54,5 %) provenaient de la population d'enfants à ETP et 15

(45,5 %) de la population d'enfants à RCPA (χ2 = 22 p < 5 %). Par contre, tous les isolats dhfr

sauvages (n = 51) sont portés par les sujets à RCPA (100 %) (Tableau XVIII).

Au niveau de la sensibilité in vitro à la PYR, les 18 (29,5 %) isolats dhfr mutants provenaient

majoritairement de la population d'isolats PYR-R, 17 (94 %) et 1 (6 %) de la population PYR-Rm.

Quant aux 40 isolats dhfr sauvages ils provenaient en majorité des isolats PYR-Rm (n = 30).

Seulement 10 (25 %) provenaient respectivement d'isolats PYR-R (n = 5, 12,5 %) et PYR-S (n = 5,

12,5 %) (Tableau XVIII).

Tableau XVIII : Répartition des isolats dhfr mutants dans la population des sujets traités à la SP, et

dans la population des isolats à sensibilité in vitro connue à la PYR

GENE DE LA DHFR

N = 89

POPULATION À ET

POPULATION À RCPA

SAUVAGE, 51 (57 %)

0 / 51 (0 %)

51 / 51(100 %)

SAUVAGE / MUTANT

5 (6 %)

3 / 5 (60 %)

2 / 5 (40 %)

MUTANT, 33 (37 %) 18 / 33 (54,5 %) 15 / 33 (45,5 %)

N = 61

PYR-R

PYR-Rm *

PYR-S

SAUVAGE, 40 (65,5 %)

5 / 40 (12,5 %)

30 / 40 (75 %)

5/40 (12,5 %)

SAUVAGE / MUTANT

3 (5 %)

2 / 3 (67 %)

1 / 3 (33 %)

0 / 3 (0 %)

MUTANT

18 (29,5 %)

17 / 18 (94 %)

1 / 18 (6 %)

0 / 18 (0 %)

91

Les 69 isolats dhps mutants provenaient principalement de la population d'enfants à RCPA

(48 / 69, 70 %) par rapport aux enfants à ETP à la SP (21 / 69, 30 %) (χ2 = 10,5 p = 0,001). Il en va

de même pour les isolats dhps sauvage (n = 3), ces isolats proviennent tous des sujets à RCPA

(100 %) (Tableau XIX). Par contre au niveau des 38 isolats dhps mutants du test de chimio-

sensibilité in vitro, 24 (63 %) de ces mutants provenaient des isolats PYR-R et 12 (32 %) des isolats

PYR-Rm (χ2= 3,7 p = 0,05, il n'y a pas de différence significative entre ces deux pourcentages)

(Tableau XIX).

Les résultats sur les mutations affectant les gènes dhfr-ts et dhps en relation avec l'efficacité

thérapeutque de la sulfadoxine-pyriméthamine et in vitro à la pyriméthamine ont été soumis à

publication sous le titre :

Monitoring of in vitro and in vivo resistance to sulfadoxine-pyrimethamine and dhfr-ts and dhps

gene sequences of Plasmodium falciparum in Abidjan, Côte d'Ivoire

J. Djaman, L. Basco, F.Guédé-Guina, and A. Mazabraud

92

Tableau XIX : Répartition des isolats dhps mutants dans la population des sujets traités à la SP, et

dans la population des isolats à sensibilité in vitro à la pyriméthamine connue

GENE DE LA DHPS

N = 72

POPULATION À ET

POPULATION À RCPA

SAUVAGE

3 (4 %)

0 / 3 (0 %)

3 / 3 (100 %)

MUTANT

69 (96 %)

21 / 69 (30 %)

48 / 69 (70 %)

N = 40

PYR-R

PYR-Rm*

PYR-S

SAUVAGE

2 (5 %)

0 / 2 (0 %)

2 / 2 (100 %)

0 / 2 (0 %)

MUTANT

38 (95 %)

24 / 38 (63 %)

12 / 38 (32 %)

2 / 38 (5 %)

RCPA : Réponse clinique et parasitologique adéquate ; ET. : Echec thérapeutique

PYR : Pyriméthamine ; PYR-S : pyriméthamino-sensible ; PYR-Rm : résistance modérée à PYR ,

avec la CI50 comprise entre 100 et 2000 nM ; PYR-R : hautement résistant à PYR, CI50 > 2000 nM

DHPS : dihydroptéroate synthétase

93

Tableau XX : Chimiosensibilité et profil génétique (dhfr et dhps) des isolats de P. falciparum

correspondants

________________________________________________________________________

N° ISOLAT dhfr dhps REP. IN VITRO REP. IN VIVO

GENOTYPE

GENOTYPE

R / Se (CI50 nM)

RCPA / ETP

AY003

S/M

M

R (6400)

ETP

AY005 S M ND RCPA

AY006 M ND ND RCPA

AY007 S/M ND ND ETP

AY010 S ND Rm (120) RCPA

AY011 M ND ND RCPA

AY016 S ND Rm (360) RCPA

AY017 M ND ND RCPA

AY018 S ND ND RCPA

AY022 S ND Rm (110) RCPA

AY032 S ND Rm (250) RCPA

AY036 M ND ND RCPA

AY037 M ND ND ETP

AY040 S ND ND RCPA

AY045 M ND R (7500) ETP

AY048 S ND Rm (150) RCPA

AY053 S ND Se (90) RCPA

AY054 S ND ND RCPA

AY055 M ND ND RCPA

AY057 S ND Rm (550) RCPA

AY058 S ND Se (77) RCPA

AY063 M ND R (9000) ETP

AY084 S/M ND R (4790) ETP

AY095 S ND Rm (500) RCPA

AY0100 M ND ND RCPA

AY0103 S ND ND RCPA

AY0135 S ND ND RCPA

AY0148 S/M ND R (2400) ETP

AY0150 S ND ND RCPA

AY0172 M ND R (2005) ETP

94

AY0194 S ND ND RCPA

AY0216 M ND ND RCPA

AY0220 S ND ND RCPA

AY0240 M ND R (3500) ETP

AY0241 S ND ND RCPA

AY0243 M ND ND RCPA

AY015 S/M ND ND RCPA

AY021 M ND ND RCPA

AY025 M ND ND RCPA

AY030 S ND Rm (705) RCPA

AY046 M ND ND RCPA

AY047 M ND ND ETP

AY049 S ND Se (55) RCPA

AY056 M ND ND RCPA

AY059 S ND ND RCPA

AY060 S ND ND RCPA

AY062 S ND ND RCPA

AY065 S/M ND Rm (285) RCPA

AY070 S ND Rm (280) RCPA

AY071 M ND ND RCPA

AY076 M ND ND RCPA

AY080 S ND ND RCPA

AY083 S ND ND RCPA

IS2 M ND ND RCPA AY112 M M ND ETP AY116 S M ND RCPA AY117 S M ND RCPA AY118 S M ND RCPA AY120 M M R (11500) ETP AY121 S S ND RCPA AY122 S M ND RCPA AY123 S M ND RCPA AY124 M M R (19000) ETP AY125 M M R (4250) ETP AY126 M M R (3500) ETP AY127 S M ND RCPA AY128 M M R (4000) ETP AY155 S S Rm (368) RCPA AY158 S M ND RCPA AY159 S M Rm (600) RCPA AY160 S M ND RCPA AY161 S M ND RCPA AY162 S M ND RCPA

95

AY164 S S ND RCPA AY167 S M Se (50) RCPA AY168 M M ND ETP AY169 S M Rm (100) RCPA AY172 S M ND RCPA AY173 S M ND RCPA AY174 S M Rm (100) RCPA AY175 S M Rm (104) RCPA AY176 S M ND RCPA AY178 S M ND RCPA AY1TR5 S M Rm (540) RCPA AY136 S M ND RCPA AY182 M M ND ETP AY184 M M ND ETP AY1Tr6 M M ND ETP AY1Tr7 M M ND ETP AY903 S M Se (90) ND AY902 S M Rm (400) ND AY904 M M R (9750) ND AY905 M M R (3500) ND AY908 S ND Rm (1800) ND AY910 S M Rm (800) ND AY918 S ND Rm (950) ND AY920 S ND Rm (400) ND AY923 S S Rm (550) ND AY933 M M Rm (500) ND AY934 S M Rm (1250) ND AY937 S M R (2750) ND AY938 S M Rm (350) ND AY9TR4 S M Rm (800) ND AY9TR2 M M R (7500) ND AYA45 M ND R (3300) ND AYA46 M ND Rm (250) ND AYA47 S M Rm (1500) ND AYA49 M ND R (2600) ND AYA50 S ND R (2500) ND AYA51 S ND Rm (500) ND AY01B S M Rm (1000) ND AY03B S M R (2600) ND AY05B S M Rm (500) ND AY06B S M R (2500) ND AY12B S ND Rm (350) ND AY14B S M R (2020) ND AY21B M M R (2605) ND AY22B M M R (2500) ND S : sauvage ; M : mutant ; S/M : mixte ; Se : Sensible ; R : hautement résistant

Rm : résistance modérée ; ND : non déterminé ; RCPA : réponse clinique et parasitologique

adéquate ; ETP : échec thérapeutique adéquate

96

Figure 4 Fréquence de mutation des codons des gènes dhfr, dhps, pfcrt et pfmdr-1 des isolats de P.

falciparum

13 %

27 %

60 %

23 %

65 %

42 %

0,7 %

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 2 3 4 Codons

dhfr dhps pfcrt pfmdr-1

I-51 / R-59 / N-108 A-436 / G-437 / S-613 T-76 Y-86 / F-184/ Y-1246

Pour

cent

age

de m

utat

ions

97

COMMENTAIRES, DISCUSSION ET CONCLUSION

98

IV-1 Surveillance épidémiologique de la résistance in vivo et in vitro

Dans cette étude qui nous l'espérons, pourra être suivie d'études comparables dans les régions

Nord et Ouest du pays, il s’agissait pour nous de surveiller la sensibilité de P. falciparum aux

antipaludiques couramment utilisés par la population ivoirienne en général et celle de Yopougon en

particulier. Le test de l'efficacité thérapeutique a permis de mesurer l’efficacité des médicaments chez

les malades (enfants) atteints de paludisme non compliqué. Si l’utilisation de la SP a été aisée parce

qu’administrée en dose unique, l’administration de la chloroquine en trois jours (J0, J1, J2)

consécutifs, suivie des contrôles les jours 2 (lorsque cela a été nécessaire) 3, 7 et 14 a été difficile.

Par ailleurs, une fois l’apyrexie obtenue après deux jours de traitement, le parent accompagnant

l’enfant ne voit plus la nécessité de le conduire au dispensaire pour la suite de l’étude, malgré le

consentement de départ. Par conséquent, la difficulté du test de l'efficacité thérapeutique conduit chez

les sujets malades réside dans le suivi effectif des sujets jusqu’à J14. Il est donc beaucoup plus aisé

de prélever le sang parasité et de le mettre en culture pour mesurer directement la sensibilité de P.

falciparum aux médicaments. Cette alternative a l’avantage non seulement d’éviter le suivi souvent

difficile, mais aussi et surtout de mesurer l’efficacité du médicament sans que n’interviennent des

facteurs intrinsèques, tels que le système immunitaire de l’hôte et la pharmacocinétique de

l'antipaludique. Malheureusement, très peu d’isolats de P. falciparum ont été mis en culture

comparativement au nombre d’isolats pour lesquels le profil génétique a été étudié. En effet, la

méthode utilisée (le semi-microtest) nécessitait un volume important de sang parasité (700 µl

d'inoculum par cupule) prélevé sur des enfants de moins de 5 ans. S’il est aisé d’utiliser et de

travailler sur des plaques à 24 cupules, il est cependant difficile de mesurer la sensibilité d’un isolat à

plusieurs antipaludiques à la fois. Pour éviter cette difficulté souvent constatée, le microtest semble

plus approprié car il présente plus d'avantages. Il permet, soit le criblage de quatre antipaludiques à la

fois, soit, la mise en culture d'isolats issus de quatre malades différents. Aussi, 200 µl d'inoculum par

cupule suffisent-ils pour obtenir une bonne maturation des parasites (trophozoïtes en schizontes) (Le

99

Bras et Basco, 1991). Au cours de cette étude, nous avons utilisé aussi bien le test optique que le test

isotopique. Mais, le test optique a l'inconvénient d'être long (numération des schizontes sur goutte

épaisse) et fastidieux, surtout lorsqu'il s'agit de dénombrer les schizontes de plusieurs isolats mis en

culture. Quant au test isotopique, il est une bonne mesure de la croissance des plasmodies (Chulay et

al., 1986). La collecte des pastilles du papier filtre peut être différée et le dénombrement est facilité

par l'utilisation d'un compteur de radioactivité. Néanmoins, cette technique a également ses limites

dans la mesure où on utilise un produit radioactif dont l'utilisation est restrictive et demande une

surveillance pour son élimination afin d’éviter les contaminations. De plus, la technique isotopique

nécessite un matériel lourd (collecteur de plaque et compteur à scintillation) onéreux pour les

laboratoires du sud (Noedl et al., 2003). Pour cela, d'autres tests ont été développés dont le DELI test

(double-site enzyme-linked immunodetection) (Druilhe et al., 2001 ; Moreno et al., 2001). Il est issu

du test colorimétrique pLDH (parasite lactate deshydrogenase) et est très sensible (Basco, 1996). Il

permet de mesurer le taux de pLDH du Plasmodium grâce à des anticorps monoclonaux spécifiques

(mAbs). Ce test pourrait remplacer les tests isotopiques et optiques actuels pour la mesure de la

résistance de P. falciparum aux antipaludiques (Noedl et al., 2003). Toutefois, malgré les difficultés

spécifiques de chaque test utilisé dans ce travail, les résultats obtenus dans cette étude en termes

d'efficacité thérapeutique et de sensibilité in vitro (semi-microtest) autorisent quelques commentaires.

Efficacité thérapeutique des antipaludiques

Dans l'évaluation de l'efficacité thérapeutique des antipaludiques, nous avons utilisé dans la

méthodologie le protocole de 1996 (OMS, 1996). Dans l'interprétation des réponses des sujets au

traitement nous avons tenu compte du nouveau protocole standard de 2002 (OMS, 2002). Lorsque

nous considérons le protocole de 1996, le taux des échecs thérapeutiques à la chloroquine est de

25,3 %. Ce taux passe à 44,6 % dans le nouveau protocole standard après addition des échecs

parasitologiques tardifs (19,3 %) considérés jusqu'alors comme des RCA (réponse clinique

adéquate). Ainsi que nous l'avons constaté, des corrections ont été apportées dans le protocole

100

standard de 2002. Elles concernent : la limite d'âge (âge < 5 ans et > 5 ans) pour permettre une

stratification, la notion de fièvre qui est désormais évoquée quand la température axillaire est >

37,5°C ou quand la température rectale ou tympanique est > 38°C. La température > 39,5°C n'est

plus un critère d'exclusion et la parasitémie des sujets à inclure peut désormais dépasser 100 000 et

atteindre 200 000 dans les régions de transmission intense. Une autre particularité de ce nouveau

protocole est de débuter obligatoirement les contrôles parasitologiques à J2 et non J3. Désormais, la

classification des réponses au traitement doit être identique qu'il s'agisse d'une région de transmission

intense, faible ou modérée. Ainsi, selon les cas de réponses, on peut avoir des échecs thérapeutiques

précoces (ETP), des échecs thérapeutiques tardifs (ETT) qui regroupent les échecs cliniques tardifs

(ECT) et les échecs parasitologiques tardifs (EPT) et enfin les réponses cliniques et parasitologiques

adéquates (RCPA). Les 44,6 % d'ET à la chloroquine observés prouvent une fois de plus que la

résistance de P. falciparum à la chloroquine est une réalité dans la région d'Abidjan. Toutefois,

l'inefficacité de cette molécule n'est pas uniquement constatée dans la commune de Yopougon

(Abidjan). Elle l'est également dans d'autres régions du pays, dans la sous-région et même en Afrique

en général. Ainsi, une récente étude menée au centre de la Côte d’Ivoire (Yamoussoukro et Bouaké)

a révélé 26,9 % d’ET (protocole de 1996) à la chloroquine sans compter les échecs parasitologiques

tardifs signalés par les auteurs mais non quantifiés et considérés comme des RCA (Adou-Bryn et al.,

2002). Déjà, en 1995, dans la région sud, 30 % d'ET à la chloroquine avaient été notifiés dans la

commune d'Adzopé (ville située à environ 100 km d'Abidjan) (Adjetey et al., 1997). Au Burkina-

Faso, les résultats d'une étude menée dans certains villages de la ville de Koudougou sur la base du

protocole de 1996 ont révélé 10 % (12 / 120) d’ET et 27 % (32 / 120) d'échecs parasitologiques à la

chloroquine. En interprétant ces résultats sur la base du nouveau protocole OMS, le nombre d'ET à la

chloroquine dans la région de Koudougou s'élève à 37 % (44 / 120) (Müller et al., 2003). Au Mali,

une étude similaire sur l’efficacité thérapeutique de la chloroquine a révélé 17,6 % (8 / 33) et 24,3 %

(10 / 57) d’ET en 2001 respectivement à Mopti et à Bandiagara chez les enfants de moins de cinq ans

101

(Plow et al., 2001). Au Cameroun, une étude réalisée par Basco et Ringwald a révélé 46 % d'ET à la

chloroquine chez des sujets ayant plus de cinq ans (Basco et Ringwald, 2001). En Afrique de l’Est,

les études réalisées en Ouganda (Kampala) sur l’efficacité thérapeutique de la chloroquine ont révélé

76 % d’ET chez les enfants de moins de cinq ans (Kamya et al., 2001), tandis qu’au Mozambique, le

niveau d’ET à cet antipaludique était de 58 % (29 / 50) (Mayor et al., 2001). En Afrique du Nord et

plus précisément au Soudan, 22 % d’ET non compris les EPT à la chloroquine ont été observés par

Babiker et al. en 2001. Au vu de tous ces résultats, la situation de l'efficacité thérapeutique à la

chloroquine n'est guère réjouissante dans le continent africain. Que dire alors de son potentiel

suppléant, la SP ?

En ce qui concerne la SP, 23,6 % d'ET ont été observés à Yopougon. Bien que ce pourcentage

soit en dessous de celui de la chloroquine dans cette zone, la situation de cette association

médicamenteuse est également préoccupante. En effet, les résultats de son efficacité thérapeutique à

notre disposition dans d'autres parties du pays révèlent 13,3 et 25 % d'ET en 1999 et 2000

respectivement dans la région de Danané (Ouest de la Côte d'Ivoire) et dans la région d'Abidjan

(Kouakou, 1999 ; Koffi, 2002). En Afrique centrale telle qu'au Cameroun, 12,1 % d'ETP et 1,7 %

d'échecs parasitologiques ont été observé à Yaoundé par Ringwald et al. en 2000. En Afrique de

l’Est, 28 % d’ET (non compris les EPT) à la SP ont été observés à Kampala (Ouganda) chez les

enfants âgés de moins de cinq ans (Kamya et al., 2001). Bien qu'alarmants, les niveaux de résistance

à la chloroquine et à la SP à Abidjan et en Afrique Occidentale en général restent moins élevé qu’en

Afrique de l’Est. Néanmoins, si on s'en tient uniquement aux résultats obtenus au nord d'Abidjan, il

sera à priori difficile de substituer la chloroquine par la SP (Adou-Bryn et al., 2002 ; Henry et al.,

2002) dans cette zone. Ainsi, l’inefficacité des traitements administrés du fait de la résistance de P.

falciparum aux antipaludiques les plus utilisés, oblige de plus en plus de personnes à se tourner vers

d'autres alternatives thérapeutiques comme l'utilisation de remèdes à base de plantes obtenues sur les

marchés à des coûts comparables à la plaquette de chloroquine ou à la forme générique de la SP dans

102

les officines. Cependant, aucun ETT à la SP incluant les nombreux cas d'EPT constatés avec la

chloroquine n'a été observé. De plus, le taux de RCPA avec la SP (76,4 %) est plus élevé que celui

avec la chloroquine (55,4 %), antipaludique également confronté à des phénomènes de prurit au

même site d'étude. Si la présence et la persistance des parasites après le J14 retardent la bonne

récupération du statut hématologique normal des enfants (Henry et al., 2002), la SP permet d'obtenir

une clairance parasitaire. Néanmoins, si l'espoir doit renaître vis-à-vis du paludisme et surtout de la

résistance de P. falciparum à la chloroquine, il ne peut pas provenir de l'utilisation de l’association

antifolique / antifolinique au regard du nombre relativement faible de RCPA obtenues (moins de

80 %), mais élevé d’ET observés qui atteint presque 25 %. Dans les pays francophones d’Afrique

Occidentale, la SP n’est pas encore utilisée comme antipaludique de première intention. Toutefois,

les quelques résultats obtenus sur son efficacité n’augurent pas de lendemain meilleur si elle doit

occuper la tête de file dans la thérapie du paludisme.

Chimiosensibilité in vitro de P. falciparum

Au regard des résultats de la chimio-résistance in vitro, nous avons obtenu des taux semblables

d'isolats résistants aussi bien à la chloroquine (36,2 %), qu'à la pyriméthamine (39,3 %) dans cette

localité. En effet, d'une manière générale, les études in vitro réalisées sur les isolats ivoiriens révèlent

un taux de résistance à la chloroquine qui varie entre 30 et 40 % à Abidjan. Ainsi, ont été

successivement rapportés des taux de résistance de 37,4 %, 37,5 %, 32,5 % et 40 % respectivement

en 1999, 2000 et 2003 dans la région d'Abidjan et d’Adzopé (Le Bras et al., 1999 ; Loukou, 2000 ;

Abouanou, 2003). La situation de la résistance in vitro à la chloroquine en Afrique est différente d’un

pays à l'autre (Le Bras et al., 1999 ; Basco, 2002). En 2000, Tinto et al. ont révélé un niveau de

résistance de 24 % (31 / 128) à la chloroquine sur les isolats d'origine burkinabé (Bobo-dioulasso)

(Tinto et al., 2000). En Afrique centrale, telle qu'au Gabon, 50 % (30 / 60) et 95 % (57 / 60) de

résistance in vitro ont été notifiés respectivement dans les villes de Franceville et de Bakoumba

(Ndong et al., 20003). Au Cameroun, 43 % (40 / 93) de résistance in vitro à la chloroquine ont été

103

observés en 2001 par Basco et Ringwald. Pour ce qui est de la sensibilité in vitro des isolats ivoiriens

à la pyriméthamine, peu de données sont actuellement disponibles. Néanmoins, le niveau de

résistance observé à Abidjan est en dessous de celui observé en Afrique centrale telle qu'au

Cameroun et plus particulièrement à Yaoundé, 60,5 % (Ringwald et al., 2000). D’une manière

générale, la situation de la résistance in vitro des isolats de P. falciparum tout comme l’étude de

l’efficacité thérapeutique varient d’un pays à l’autre et d’un laboratoire à l’autre. Les résultats

obtenus dans cette étude sur la quinine corroborent ceux de Le Bras qui a constaté qu'aucune souche

quinino-résistante n'a été mise en évidence parmi les souches importées d'Afrique de 1992 à 1996 (Le

Bras et al., 1999). Toutefois, les taux d'isolats chloroquino-résistants et pyriméthamino-résistants

rapportés dans ce travail sont supérieurs aux taux respectifs d'échecs cliniques à ces deux

médicaments, ce qui suit logiquement la loi de l'équilibre biologique quant à l'expression de l'échec

clinique dans une zone d'endémie palustre. La résistance est d'abord détectée in vitro puis lorsqu'elle

atteint un certain seuil, elle s'exprime in vivo chez les sujets faiblement immuns tels que les

immigrants nouvellement installés et les sujets autochtones en particulier les enfants de moins de

cinq ans (Guiguemdé et al.,1991).

Tests couplés

La grande partie des RCPA obtenues chez les enfants a été confirmée en termes de sensibilité in

vitro des isolats de P. falciparum lors des tests couplés in vitro / efficacité thérapeutique des

antipaludiques, malgré quelques discordances. Par exemple, chez un enfant traité à la chloroquine,

une RCPA a été enregistrée alors que l'isolat qu'il portait était résistant in vitro à cet antipaludique.

Chez ce sujet, bien que faiblement immun, il a eu sûrement besoin des anticorps anti-plasmodiaux

pour éliminer le parasite. Cette situation se remarque en effet le plus souvent chez les jeunes africains

qui supportent quelque fois des parasitémies élevées. Dans l'immunité contre le paludisme, après la

phase d'hypersensibilité de l'organisme du jeune enfant à la suite du catabolisme des anticorps

maternels, la prémunition s'établit de manière progressive avec une ascension du taux d'anticorps à

104

partir de l'âge scolaire. Cette situation de prémunition diffère sûrement d'un enfant à l'autre. Compte

tenu de l'utilité publique de ces deux médicaments, la surveillance de la réponse du parasite aux

antipaludiques s'avère nécessaire. Bien que très peu efficace dans certaines régions, la chloroquine

demeure l'antipaludique le plus prescrit sous les tropiques en général malgré la résistance (Gilles,

1991). Il est également le médicament le plus abusivement utilisé par automédication en Côte

d'Ivoire (Henry et al., 1998). Elle permet d'obtenir une amélioration des symptômes et une

diminution de la mortalité et de la morbidité dans certaines zones d'endémie palustre. Aussi, compte

tenu de son coût qui est à la portée des bourses de nombreuses populations rurales, sa prescription et

son utilisation malgré la résistance sont un frein à l'utilisation de médicaments traditionnellement

améliorés à base de plantes dont on vante souvent les vertus thérapeutiques dans le traitement de

plusieurs pathologies et qui sont dangereux pour le fonctionnement de certains organes tels que les

reins (Lee et al., 1993 ; Ahn et al., 2002).

S'il est encore trop tôt de déclarer désuète l'utilisation des "molécules anciennes" comme la

chloroquine et la sulfadoxine-pyriméthamine dans la thérapie du paludisme dans certaines régions de

la Côte d'Ivoire, il n'est pas non plus utile de vanter leur efficacité. Car, par exemple, en ce qui

concerne l’association sulfadoxine-pyriméthamine, malgré la clairance parasitaire et l'apyrexie

rapidement obtenues chez la majorité des sujets de notre étude, les résistances à la pyriméthamine

apparaissent souvent trop rapidement à cause de la pharmacocinétique de cet antipaludique (demi-vie

longue) et sont souvent nombreuses (OMS, 1984). Ainsi, pour les antifoliniques, une seule mutation

(codon 108) sur le gène dhfr suffit au parasite pour devenir résistant, ce qui ne serait pas le cas avec

la chloroquine. En Côte d'Ivoire, cet antipaludique (SP) n'a jamais été utilisé en chimioprophylaxie de

masse sauf chez les femmes enceintes et pourtant le nombre d'isolats résistants mis en évidence dans

ce travail est supérieur à 30 %. Ainsi, l'avenir s'assombrit pour les populations frappées de plus en

plus par l'indigence et dont l'un des recours dans la thérapie du paludisme semblait être l'association

sulfadoxine-pyriméthamine dont la forme générique est à un coût abordable. Si l'espoir peut renaître

105

avec la recherche pour la mise au point de vaccin antipaludique et les essais cliniques en cours pour

de nouveaux produits (G25, pyronaridine, pipéraquine, artééther), il devient pratiquement impossible

pour les chercheurs de contenir l'expansion inexorable de la résistance de P. falciparum aux

antipaludiques. Néanmoins, l'utilisation de nouvelles molécules ayant une action suppressive sur les

formes résistantes du parasite peut faire penser d'ici quelques années à une stabilisation voire une

diminution de la résistance. Malheureusement, ces médicaments dits nouveaux, généralement

disponibles dans les pays africains, sont encore trop chers.

IV-2 Aspects moléculaires de la résistance plasmodiale

La deuxième partie de ce travail a été consacrée à l'analyse des séquences des gènes de

résistance chez des isolats de P. falciparum. En effet, s’il existe quelques difficultés dans la

réalisation et dans l’interprétation de la surveillance de P. falciparum aux antipaludiques, le test

moléculaire, une fois le gène de résistance connu, est un précieux outil permettant de mieux

appréhender l’ampleur du phénomène de résistance à partir de la nature de l’isolat (sauvage ou

mutante). Avant de réaliser l’amplification des gènes dhfr, dhps, pfcrt, et pfmdr-1, il s’agissait

d’obtenir, dans un premier temps, de l’ADN plasmodial pur et concentré, adapté aux tests à pratiquer

et dont la qualité devrait être compatible avec le travail à réaliser. La méthode utilisée pour libérer les

acides nucléiques était dépendante de la nature du spécimen, le sang parasité contenant le

Plasmodium. Dans notre cas, nous avons utilisé jusqu’à une date récente la technique d’extraction de

« référence » (phénol / chloroforme). L’extraction de l’ADN plasmodial en utilisant du phénol

(produit toxique) est une technique certes facile pour obtenir de l’ADN visible, mais difficile dans sa

première phase parce qu’elle nécessite l’utilisation de sang total. Ceci n’est pas aisé lorsqu’il s’agit

de faire un travail d’épidémiologie moléculaire qui nécessite le transport du matériel biologique (le

sang parasité) des zones d’endémie palustres (laboratoires du Sud) vers les zones où doit s’effectuer

l'étude. Pour remédier à cette situation, nous avons réussi, dans une première étude, à extraire l’ADN

plasmodial à l’aide de la résine (chelex 100, Biorad®), à partir du sang total déposé sur du papier

106

Whatman 3MM. Bien qu’il ait été possible d’amplifier le gène dhfr de certains isolats, d’analyser le

codon 108 et de donner la nature (sauvage ou mutante) de ces isolats de P. falciparum, il a été

impossible d’amplifier le gène dhfr de tous les isolats issus du papier Whatman (article 4 en Annexe-

1). À l’évidence, le rendement de l’extraction n’a pas atteint 100 %. Pour éviter l’utilisation du

phénol / chloroforme et améliorer le transport de P. falciparum, nous avons utilisé le papier filtre

Isocode Stix®. Le sang est déposé sur des matrices triangulaires, puis, l’ADN est extrait tout

simplement à l’eau distillée bouillante. La PCR qui s'en est suivie a permis d’amplifier l'ADN de tous

les isolats issus de ces confettis (Chaparro et al., 2001). Les résultats obtenus des PCR-RFLP et de

l’analyse des électrophorégrammes après séquençage que ce soit avec l’ADN plasmodial issu du sang

total extrait au phénol-chloroforme ou simplement à partir du sang déposé sur du papier Isocode

Stix® et extrait à l’eau distillée, méritent quelques commentaires.

La fréquence de mutations des codons des gènes impliqués dans la résistance de P. falciparum

est 65,3 % de mutation Thr-76 et 42,4 % de mutation Tyr-86 pour respectivement le gène pfcrt et

pfmdr-1. Ces résultats sont en accord avec ceux de Jelinek et al en 2002 qui rapportent

respectivement 59,8 % et 37,3 % de mutation de ces gènes des isolats d’origine ouest africaine. Mais,

en plus de la mutation Tyr-86 du gène pfmdr-1, nous avons également observé 68 % de mutation

Phe-184. D’autre part, nous n'avons pas observé chez les isolats d'origine ivoirienne de mutation des

codons 540 et 581 du gène dhps. Ces codons sont restés invariants à l'exception du codon 613 du

gène dhps pour lequel 22,6 % de mutation ont été observés (Ser-613), contrairement à ce que

rapporte Jelinek sur les isolats d'origine ouest africaine, 6 % de Glu-540, 0,7 % de Gly-581 et pas de

mutation du codon Ala-613 (Jelinek et al., 2002).

La PCR-RFLP réalisée par Apo I pour mettre en évidence la nature du codon 76 du gène pfcrt

impliqué dans la résistance de P. falciparum à la chloroquine a montré que plus de 60 % des

échantillons portaient l'allèle mutant Thr-76. Ceci fait penser qu'en principe, ces isolats de

Plasmodium falciparum étaient potentiellement résistants à la chloroquine. Cependant, nous n'avons

107

enregistré que moins de 30 % d'échecs cliniques et moins de 40 % de résistance in vitro à la

chloroquine. Aussi, si l'analyse du gène pfcrt a montré que l'allèle mutant Thr-76 était présent chez

100 % (24 / 24) des sujets chez lesquels nous avons obtenu un échec thérapeutique à la chloroquine,

12 % des sujets guéris (RCPA) avaient également des isolats portant l'allèle mutant (Thr-76). Par

conséquent, la mutation 76 ne signifie pas toujours un échec thérapeutique à la chloroquine chez les

enfants ivoiriens, bien que, les isolats pfcrt mutants proviennent majoritairement des sujets à ET.

Cette même observation a été faite par Basco sur les isolats camerounais et par Mayor sur les isolats

mozambicains (Mayor et al., 2001 ; Basco et al., 2002). Si tel doit être le cas, il devient à priori

difficile d'expliquer ces RCPA obtenues chez certains jeunes enfants de moins de cinq ans pourtant

porteurs de parasites mutants. Des facteurs intrinsèques à l'organisme, tels que le système

immunitaire, doivent sans doute jouer un rôle important dans l'obtention de la guérison et

l'élimination des parasites (Dorsey et al., 2001 ; Basco et al., 2002).

L'étude de la corrélation entre la chimiosensibilité in vitro et la mutation ponctuelle sur le

codon 76 a montré, par ailleurs, quelques discordances. Ainsi, des isolats chloroquino-résistants

avaient l'allèle sauvage Lys-76 de la même manière, quelques isolats chloroquino-sensibles étaient

porteurs de l'allèle mutant Thr-76. Étant donné que nous n'avons analysé que la mutation sur le codon

76, des mutations additionnelles sur le gène pfcrt ou sur d'autres gènes pourraient expliquer le

phénomène de discordance (Basco, 2002). En ce qui concerne pfmdr-1, bien que plus de 60 % de

mutations affectent ce gène, il n'existe pas de corrélation entre les mutations des codons 86, 184 et

1246 et la résistance de P. falciparum à la chloroquine. La distribution de la mutation du gène pfmdr-

1 dans la population des sujets traités à la chloroquine montre que les mutants provenaient aussi bien

des sujets à ET que des sujets à RCPA. Il n'y a pas non plus de concordance entre les mutations du

gène pfmdr-1 et la sensibilité des isolats à la quinine car aucun isolat quinino-résistant n'a été mis en

évidence dans cette étude. Cette dernière observation conforte l'utilisation de la quinine non

seulement en tant que médicament de troisième intention du Programme National de Lutte contre le

108

Paludisme (PNLP) mais aussi et surtout comme antipaludique de première intention pour le

traitement du paludisme grave et compliqué malgré l'existence de quelques effets secondaires

(cinchonisme). Depuis la mise en circulation des dérivés de l'artémisinine, de plus en plus de

personnes (celles qui ont les moyens) se tournent vers cette alternative thérapeutique en cas de non-

satisfaction après la prise d'antipaludiques confrontés à la résistance plasmodiale. Du fait de leur

rapidité d'action, leur innocuité relative constatée jusqu'ici, leur structure et leur mode d'action

laisseraient entrevoir des perspectives intéressantes si leur coût répondait à l'attente des personnes qui

en avaient le plus besoin (Gilles, 1991).

En ce qui concerne la DHFR et la DHPS des isolats de P. falciparum de Côte d'Ivoire, nous

remarquons que seulement 27,4 % des isolats séquencés portaient les allèles dhfr mutants tandis que

plus de 90 % de ces isolats étaient dhps mutants. Tous les sujets chez lesquels nous avons obtenu un

échec thérapeutique à la sulfadoxine-pyriméthamine portaient, soit des isolats mutants à la DHFR,

soit des isolats mixtes. Chez aucun sujet à ETP les isolats analysés étaient de type sauvage. Par

ailleurs, 100 % de ces sujets portaient les allèles dhps mutants. Par contre, chez les sujets à RCPA,

22 % d'entre eux avaient des isolats mutants. Pour ce qui est du test de chimio-sensibilité in vitro,

plus de 90 % des isolats PYR-S y compris ceux qui avaient une résistance modérée à la PYR,

portaient des allèles dhfr sauvages mais étaient dhps mutants. En dehors du codon 108, les mutations

affectaient aussi bien le codon 51 que le codon 59. Les isolats triples mutants représentaient 33 % de

l'ensemble des isolats mutants. Ainsi, tous les isolats dont la CI50 à la PYR était supérieure à 6000

nM avaient les codons 51 et / ou 59 et 108 mutés. Les codons 16 et 164, quant à eux, sont restés

invariants chez tous les isolats analysés. En Côte d'Ivoire, pour l’instant, la mutation de type

thréonine 108 n'a pas encore été identifiée dans les isolats. En termes de comparaison, le nombre

d'isolats mutants à la DHPS est plus élevé que ceux de la DHFR. Cependant, si la mutation du gène

dhps de P. falciparum n'est pas directement corrélée à la chimio-sensibilité in vivo de P. falciparum à

l’association antifolique / antifolinique, cette corrélation existe bien au vu des résultats obtenus avec

109

la DHFR. La mutation du gène dhfr est bien impliquée dans la survenue de la pyriméthamino-

résistance et les échecs thérapeutiques à la sulfadoxine-pyriméthamine. Cependant, la distribution de

la mutation de ce gène dans la population montre que les isolats mutants provenaient aussi bien des

sujets à ET que des sujets à RCPA à la SP. En définitive, comme dans le cas de la chloroquine, la

nature de l'isolat dhfr mutant influence peu la survie des parasites et la réponse clinique de certains

enfants de moins de cinq ans.

110

Tableau XXI : Résultats de la surveillance de la chimiorésistance de P. falciparum dans quelques

pays africains

* ECHEC THERAP. RESISTANCE IN VITRO TESTS MOLÉCULAIRES

PAYS

africains

CQ SP CQ SP dhfr dhps Pfcrt (Thr-76) Pfmdr-1

SOUDAN Babiker et al., 2001

11 / 50

(22 %)

ND

ND

3 / 37

(8 %)

Asn-108

(84 %)

Ile-51

(78 %)

Ala-436

11 / 22

(50 %)

1 / 22, Tyr-86

(5 %)

BURKINA -Müller et al., 2003

44 / 120

(37 %)

ND 24 % ND ND ND ND ND

COTE D'IV. -Djaman, 2003

37 / 83

(44 %)

21 / 89

(24 %)

25/69

(36 %)

24 / 61

(39 %)

39/144

(27 %)

99/106

(93 %)

94/144

(65 %)

112/144

(78 %)

MALI

-Plow et al.,2001

18 / 90

(21 %)

ND ND ND ND ND 60 / 60

(100 %)

48/56, Tyr-86

(86 %)

NIGERIA -Adagut , 2002

5 / 33

(15 %)

ND ND ND ND ND 7 / 33

(21 %)

Tyr-86

SENEGAL - Thomas et al., 2002

ND ND 31 % ND ND ND 79%

31% Tyr-86

2% Tyr-1246

GABON

-Mawili-M. et al,

2001

ND 35/117

(30 %)

ND 87/120

(72,5%)

73 / 141

(Asn-108)

1/141

(Thr-108)

31/38

(82 %)

Ala-436

Gly-437

ND ND

CAMEROUN -Basco et al.,2003

ND 16/75

(21%)

67/118

(58%)

16 / 16

(100 %)

Ala-436/

Gly-437

68/118

(58 %)

MALAWI

ND 22 / 43

(52 %)

ND ND ND ND ND ND

MOZAMBIQUE -Mayor et al., 2001

29 / 50

(58 %)

ND ND ND ND ND 51/56

(91 %)

ND

TANZANIE -Schellenberg et al., 2002

ND 37 / 117

(31 %)

ND ND ND ND 45 / 50

(90%)

ND

OUGANDA -Dorsey etal 2001

114 / 258

(44 %)

ND ND ND ND ND 106/114

(93 %)

112/114 Y-86

(98 %)

AF. DU SUD Jelinek et al., 2002

ND ND ND ND 33 %

Asn-108

Ile51 Arg-59

ND ND ND

* ECHEC THERAP. : échec thérapeutique

111

IV-3 Conclusion

Depuis plusieurs années, différentes études ont été menées dans divers endroits du pays sur la

chimiosensibilité in vivo de P. falciparum aux antipaludiques couramment employés en Côte

d’Ivoire, traduisant l’intérêt pour les chercheurs de produire des données pouvant servir à

l’amélioration de la prise en charge du paludisme. Malheureusement, depuis les premiers cas de

résistance notifiée dans le pays jusqu’à maintenant, rien n’a véritablement changé dans la politique

générale de la surveillance épidémiologique contre cette affection malgré les résultats obtenus qui

révèlent l'existence d'une inefficacité de la chloroquine dans certaines régions. Si la chloroquine,

antipaludique majeur est de plus en plus décriée par la population ivoirienne, ce n’est pas par son

manque d'efficacité antipaludique. C’est surtout parce qu’elle entraîne certains effets secondaires

dont le plus représentatif est le prurit. Étant donné que la Côte d’Ivoire se situe dans une zone

d’endémie palustre, le nombre élevé d’échecs thérapeutiques à tel ou tel antipaludique comme ceux

que nous avons étudiés ne peut pas apparaître de façon fortuite. En général, il faut d’abord que la

résistance in vitro dépasse un certain seuil avant qu’elle ne s’exprime in vivo chez le sujet malade.

Cette observation prouve que si une surveillance de la chimiosensibilité in vitro était mise en place,

elle allait contribuer à suivre l’évolution de la résistance plasmodiale et permettre de prendre des

mesures pour mieux contrôler l’extension de la pharmacorésistance. Les résultats obtenus pour

chaque médicament montrent que le seuil critique de 25 % d’échec thérapeutique appelant à un

changement d’antipaludique de première intention selon l’OMS est atteint pour la chloroquine dans

la plus grande commune de Côte d'Ivoire et n'est pas loin de l'être pour la sulfadoxine-

pyriméthamine, au regard du nombre d'échecs thérapeutiques à cet antipaludique. Bien que des

médicaments nouveaux (Artésiane®, Arsumax®, Paluther®, Coartem®, Plasmotrim®, Artequin®)

ayant une action suppressive sur les isolats chloroquino-résistants ou pyriméthamino-résistants

existent dans le pays, ils ne sont abordables que pour une catégorie de personnes.

112

Pour l’heure, étant donné qu’aucun vaccin antipaludique n’est encore disponible (Acosta et

al., 1999), une meilleure connaissance de la répartition des plasmodies résistants dans le pays peut

permettre d’adapter les différents schémas thérapeutiques en fonction de chaque zone ou région. Pour

y arriver, les nouveaux outils d’étude de la chimiosensibilité de P. falciparum doivent être utilisés.

Toutefois, les résultats des tests d'efficacité thérapeutique restent la base des stratégies d'utilisation

des antipaludiques. Cependant, les outils comme les tests in vitro et la recherche des marqueurs

moléculaires aident à préciser et à compléter cette utilisation. Compte tenu du coût et des difficultés

techniques de sa réalisation, le test in vitro doit être utilisé pour (i), évaluer la résistance croisée entre

divers antipaludiques, (ii) évaluer la sensibilité initiale vis-à-vis de médicaments destinés à être

adoptés et (iii) surveiller dans l'espace et dans le temps la sensibilité du parasite aux antipaludiques.

En définitive, ce test peut être utilisé aux fins de la surveillance de la pharmacorésistance dans une

région (OMS, 2002).

Quant aux marqueurs moléculaires, ils peuvent permettre de prévoir l'efficacité thérapeutique

à grande échelle. Le recueil, la conservation et le transport des prélèvements en vue des analyses

moléculaires sont beaucoup plus faciles que pour les tests in vitro. Toutefois, les marqueurs

moléculaires n'ont été identifiés que pour un petit nombre de médicaments (sulfadoxine,

pyriméthamine, cycloguanil et chloroquine) et n'ont été validés pour l'instant que pour P. falciparum.

Toutefois, comme pour le test in vitro, l'étude moléculaire peut offrir un système d'alerte précoce ou

servir à cibler les études d'efficacité thérapeutique (OMS, 2002 ; Sangster et al., 2002). Les tests

moléculaires offrant de nouvelles perspectives d’étude de l’épidémiologie moléculaire de la

résistance plasmodiale, ils méritent d'être également intégrés tout comme le test in vitro aux systèmes

de surveillance de la chimiorésistance de P. falciparum en Côte d'Ivoire, en partenariat avec les

laboratoires du Nord ou ceux de la sous régions qui en ont les compétences. Bien que les gènes de la

résistance de Plasmodium à la sulfadoxine, à la pyriméthamine et plus récemment à la chloroquine

soient connus, on ne peut expliquer les phénomènes de discordances que nous avons observés dans le

113

rapprochement des résultats de l'efficacité thérapeutique (RCPA) et du test moléculaire (présence

d'isolats mutants) chez les enfants africains de moins de cinq ans que par l'action du système

immunitaire des sujets. À présent que le génome complet de P. falciparum et celui de l’Anopheles

gambiae, principal vecteur du paludisme humain en Afrique subsaharienne sont connus (Gardner et

al., 2002 ; Christophides et al., 2002), de bonnes perspectives s’annoncent pour le développement de

nouveaux antipaludiques et pour la recherche de vaccin contre les stades asexué et sexué du parasite.

Pour l’heure, nous devons intensifier la lutte contre le paludisme en Côte d’Ivoire et dans la sous-

région (pays limitrophes) par la mise en place effective d’un système de surveillance de la

chimiosensibilité aux médicaments pour lesquels des résistances ont été notifiées tels que les amino-

4-quinoléines, les antifoliques / antifoliniques et les médicaments pour lesquels il existe très peu de

données, halofantrine, quinine, artémisinine et ses dérivés.

114

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

115

ABOUANOU S.

Évaluation de la chimiosensibilité in vitro de Plasmodium falciparum à la chloroquine, pyriméthamine

et quinine à Abidjan. 250p : Th. D : parasitologie : Univ. Cocody, Abidjan : 2003 ; 250.

ACOSTA C.J., GALINDO C.M., SCHELLENBERG D., APONTE J.J., KAHIGWA E., URASSA H.,

SCHELLENBERG J., MASANJA H., HAYES R., KITUA A.Y., LWILLA F., MSHINDA H., MENENDEZ

C., TANNER M., ALONSO P.L.

Evaluation of the SPf66 vaccine for malaria control when delivered through the EPI scheme in

Tanzania. Trop Med Int Health, 1999, 4, 368-376.

ADAGUT I S., WARHURST D.C.

Plasmodium falciparum : linkage disequilibrium between loci in chromosome 7 and chloroquine

selective pressure in northern Nigeria. Parasitology, 2001, 123, 219-224.

ADJETEY A.C., NEKOURESSI G., MENAN E.I.H., ASSAVO N., DIARRA S., KOUA G.B., NEBAVI

N.G.F., OUHON J., PENALI L.K., KONE M.

Situation de la sensibilité de Plasmodium falciparum à quelques antipaludiques à Adzopé (Côte

d'Ivoire). Malaria, 1997, 6, 24-27.

ADOU-BRYN K.D., KRELO K., AKOUSSI C.F., BONI N.M., YAPO G.C., PENALI L.K., OUHON J.,

ASSOUMOU A., EHOUMAN A.

Efficacité thérapeutique de la chloroquine dans le traitement du paludisme simple dû à P. falciparum

des consultants hospitaliers dans le centre de la Côte d’Ivoire (1997-2000). Bull Soc Pathol Exot,

2002, 95, 4, 262-264.

ADOU-BRYN K.D., MEMAIN S.D., OUHON J., ASSOUMOU A., KONE M.

Étude de la sensibilité de Plasmodium falciparum à la chloroquine à Man (Ouest de la Côte d'Ivoire).

Méd Mal Infect, 1999, 29, 476-479.

AHN C.B., SONG C.H., KIM W.H., KIM Y.K.

Effects of Juglans sinensis Dode extract and antioxidant on mercury chloride-induced acute renal

failure in rabbits. J Ethnopharmacol, 2002, 82, 45-49.

AMBROISE-THOMAS P., PINEL C., PELLOUX H., PICOT S.

Le diagnostic du paludisme : actualités et perspectives. Cahiers Santé, 1993, 3, 280-284.

116

ANONYME (Ministère de l’intérieur de Côte d’Ivoire)

Mairie de Yopougon In : Recensement Général de la Population et de l'Habitat en 1998, 2002, service de

communication.

ARTAVANIS-TSAKONAS K., TONGREN J.E., RILEY E.M.

The war between the malaria parasite and the immune system : immunity, immunoregulation and

immunopathology. Clin Exp Immunol, 2003, 133, 145-152.

BABIKER H A., PRINGLE S J., ABDEL MUHSIN A., MACKINNON M., HUNT P., WALLIKER D.

High-level chloroquine resistance in Sudanese isolates of Plasmodium falciparum is associated with

mutations in the chloroquine resistance transporter gene pfcrt and the multidrug resistance gene

pfmdr -1. J Infect Dis., 2001, 183, 1535-1538.

BAGGISH A.L., HILL D.R.

Antiparasitic agent atovaquone. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46, 1163-1173.

BASCO L.K., RUGGERI C., LE BRAS J.

Molécules antipaludiques, mécanismes d'action, mécanismes de résistance, relations structure-activité

des schizonticides sanguins. Paris : Masson, 1994, 364p.

BASCO L.K., ELDIN DE PECOULAS P., WILSON C.M., LE BRAS J., MAZABRAUD A.

Point mutations in the dihydrofolate reductase-thymidylate synthase gene and pyrimethamine and

cycloguanil resistance in Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol, 1995, 69, 135-138.

BASCO L.K.

Plasmodium sp. Humains : Recherche d'antipaludiques nouveaux et étude des chimiorésistances au

niveau moléculaire. 491p : Th. Parasitologie : Univ. René Descartes de Paris : 1996 ; Série Pharmacie.

BASCO L.K., RINGWALD P., FRANETICH J.F., MAZIER D.

Assessment of pyronaridine activity in vivo and in vitro against the hepatic stages of malaria in

laboratory mice. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1999, 93, 651-652.

BASCO L.K., RINGWALD P.

Chimiorésistance du paludisme : problèmes de la définition et de l'approche technique. Cahiers Santé,

2000, 10, 47-50.

117

BASCO L.K., RINGWALD P.

Analysis of the key pfcrt point mutation and in vitro and in vivo response to chloroquine in Yaoundé,

Cameroon. J Infect Dis, 2001, 183, 1828-1831.

BASCO L.K.

Molecular epidemiology of malaria in Cameroon XII. In vitro drug assays and molecular surveillance of

chloroquine and proguanil resistance. Am J Trop Med Hyg, 2002, 64, 383-387.

BASCO L.K.

Molecular epidemiology of malaria in Cameroun XIII. Analysis of pfcrt mutations and in vitro

chloroquine resistance. Am J Trop Med Hyg, 2002, 64, 388-391.

BASCO L.K., NDOUNGA M., NGANE V.F., SOULA G.

Molecular epidemiology of malaria in Cameroon. XIV. Plasmodium falciparum chloroquine resistance

(PFCRT) gene sequences of isolates before and after chloroquine treatement. Am J Trop Med Hyg,

2002, 67, 392-395.

BAUDON D.

New prophylactic treatments against malaria : doxycycline and atovaquone-proguanil. Med Mal

Infect, 1999, 29, 413s-424s.

BICKII J., NJIFUTIE N., FOYERE J.A., BASCO L.K., RINGWALD P.

In vitro antimalarial activity of limonoids from Khaya grandifoliola CDC (Meliaceae). J

Ethnopharmacol, 2000, 69, 27-33.

BIENVENU T., MEUNIER C., BOUSQUET S., CHIRON S., RICHARD L., GAUTHERET-DEJEAN A.,

ROUSELLE J.F., FELDMANN D.

Different procedures for the isolation of DNA from blood samples. Ann Biol Clin (Paris), 1999, 57, 77-

84.

BISWAS S.

Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase Val-16 and Thr-108 mutation associated with in vivo

resistance to antifolate drug : a case study. Indian J malariol, 2001, 38, 76-83.

BOGARD M., LAMORIL J.

Biologie moléculaire en biologie clinique : Paris : Elsevier, scientifique et médicale, 1, 1988, 348p.

118

BOURGEADE A., DELMONT J.

On the proper use of available anti-malarial drugs in France. Bull Soc Path Exot, 1998, 91, 493-496.

BOWMAN S., LAWSON D., BASHAM D., BROWN D., CHILLINGWORTH T., CHURCHER C.M.,

CRAIG A., DAVIES R.M., DEVLIN K., FELTWELL T., GENTLES S., GWILLIAM R., HAMLIN N.,

HARRIS D., HOLROYD S., HORNSBY T., HORROCKS P., JAGELS K., JASSAL B., KYES S., MCLEAN,

J., MOULE S., MUNGALL K., MURPHY L., OLIVER K., QUAIL M.A., RAJANDREAM M.A., RUTTER

S., SKELTON J., SQUARES R., SQUARES S., SULSTON J.E., WHITEHEAD S., WOODWARD J.R.,

NEWBOLD C., BARRELL, B.G.

The complete nucleotide sequence of chromosome 3 of Plasmodium falciparum. Nature, 1999, 400,

532-538.

BLANCHY S., RAKOTONJANABELO A., RANAIVOSON G.

Surveillance épidémiologique du paludisme instable. Cahiers Santé, 1993, 3, 247-255.

BRASSEUR P., PATHE-DIALLO M., DRUILHE P.

Low sensitivity to chloroquine and quinine of Plasmodium falciparum isolates from Guinea in March.

Am J Trop Med Hyg, 1986, 37, 452-454.

BROOKS D.R., WANG P., READ M., WATKINS W.M., SIMS P F G., HYDE J.E.

Sequence variation of hydroxymethyldihydropterin pyrophosphokinase : dihydropteroate synthase gene

in lines of the human malaria parasites, Plasmodium falciparum, with differing resistance to sulfadoxine.

Eur J Biochem, 1994, 224, 397-405.

BRUCE-CHWATT L.J., BLACK R.H., CANFIELD D.F., CLYDE D.F., PETERS W., WERNSDORFER

W.H.

Chimiothérapie du paludisme : Génève : 2ème éd / OMS, série monographie, 1984, 274p.

BRUNEEL F., GACHOT B., WOLFF M., BEDOS J. P., REGNIER B., DANIS M., VACHON F.

Blackwater fever. Presse med, 2002, 31, 1329-1334.

BRYSKIER A., LABRO M-T.

Paludisme et médicaments : Paris : Arnette, 1988, 276p.

119

BZIK D.J., LI W B., HORII T., INSELBURG J.

Molecular cloning and sequence analysis of the Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase

thymidylate synthase gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84, 8360-8364.

CARNEVALE P., ROBERT V., MOLEZ J.F., BAUDON D.

Faciès épidémiologique des paludismes en Afrique sub-saharienne. Et Med, 1984, 3, 123-133.

CHANG C., LIN-HUA T., JANTANAVIVAT C.

Studies on a new antimalarial compound : pyronaridine. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1992, 86, 7-10.

CHAPARRO J., ROJAS M.O., WASSERMAN, M.

Plasmodium falciparum : underestimation of dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthase

polymorphism in field samples : a technical shortcoming of nested PCR assays with mutation-specific

primers. Exp Parasitol, 2001, 99, 115-122.

CHRISTOPHIDES G.K., ZDOBNOV E., BARILLAS MURY C., BIRNEY E., BLANDIN S., BLASS C.,

BREY P.T., COLLINS F.H., DANIELLI A., DIMOPOULOS G., HETRU C., HOA N., HOFFMANN J.A.,

KANZOK S.M., LETUNIC I., LEVASHINA E.A., LOUKERIS T.G., LYCETT G., MEISTER S., MICHEL

K., MULLER H.M., OSTA M.A., PASKEWITZ S.M., REICHHART J.M., RZHETSKY A., TROXLER L.,

VERNICK K.D., VLACHOU D., VOLZ J., VON MERING C., XU J.N., ZHENG L.B., BORK P.,

KAFATOS F.C.,

Immunity-related genes and gene families in Anopheles gambiae. Science, 2002, 298, 159-165.

CHULAY J.D., SCHNEIDER I., COSGRIFF T.M., HOFFMAN S.L., BALLOU W.R., QUAKYI I.A.,

CARTER R., TROSPER J.H., HOCKMEYER W.T.

Malaria transmitted to humans by mosquitoes infected from cultured Plasmodium falciparum. Am J

Trop Med Hyg, 1986, 35, 66-68.

COM-NOUGUE C., RODARY C.

Revue des procedures pour mettre en évidence l'équivalence de deux traitements. Rev Epidemiol Sante

Publique, 1987, 35, 416-430.

CORCORAN L.M., THOMPSON J.K., WALLIKER D., KEMP D.J.

Homologous recombination within subtelomeric repeat sequences generates chromosome size

polymophisms in P. falciparum. Cell, 1988, 53, 807-813.

120

COWMAN A.F., KARCZ S.R.

The pfmdr gene homogues of Plasmodium falciparum. Acta, 1991, 60, 121-129.

DANIS M.

Symptomatologie In : Paludisme, éd. par M. Danis et J. Mouchet Paris : Ellipses / Aupelf, Marketing,

1991. 87-99.

DEBAERT M.

Antipaludiques In : Traités de chimie thérapeutique, principaux antifongiques et antiparasitaires, ed TEC

& DOC / ed médicales Internationales, 2000. 13-137

DELORON P., LE BRAS J., ANDRIEU B., HARTMANN J.F.

Standardisation de l'épreuve de chimio-sensibilité in vitro de Plasmodium falciparum. Path Biol, 1982,

30, 585-588.

DESJARDINS R.E., CANFIELDS C J., HAYNES J.P., CHULAY J.D.

Quantitative assement of antimalarial activity in vitro by a semi-automated microdilution technique.

Antimicrob Agents Chemother, 1979, 16, 710-718.

DJIBO A., SOUNA-ADAMOU A., BRAH BOUZOU S.

Blackwater fever in adults with sickle cell anemia. Two fatal cases. Med Trop, 200, 60, 156-168.

DJIMDE A., DOUMBO O.K., CORTESE J.F., KAYENTAO K., DOUMBO S., DIOURTE Y., DICKO, A.,

SU, X.Z., NOMURA T., FIDOCK D.A., WELLEMS T.E., PLOWE C.V., COULIBALY D.

A molecular marker for chloroquine-resistant falciparum malaria. New England J Med, 2001, 344,

257-263.

DORN A., VIPPAGUNTA S.R., MATILE H., JAQUET C., VENNERSTROM J.L., RIDLEY R.G.

An assessment of drug-haematin binding as a mechanism for inhibition of haematin polymerisation by

quinoline antimalarials. Biochem Pharmacol, 1998, 55, 727-736.

DORSEY G., KAMYA M R., SINGH A., ROSENTHAL P.J.

Polymorphisms in the Plasmodium falciparum pfcrt and pfmdr-1 genes and clinical response to

chloroquine in Kampala, Uguanda. J Infect Dis, 2001, 183, 1417-1420.

121

DRUILHE P., MORENO A., BLANC C., BRASSEUR P.H., JACQUIER P.

A colometric in vitro drug sensitivity assay for Plasmodium falciparum based on highly sensitive

double-site lactate deshydrogenase antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay. Am J Trop

Med Hyg, 2001, 64, 233-241.

ELDIN DE PECOULAS P., BASCO L.K., ABDALLAH B., DJE M.K., LE BRAS J., MAZABRAUD A.

Plasmodium falciparum : détection of antifolate resistance by mutation-specific restriction enzyme

digestion. Exp Parasitol, 1995, 80, 483-487.

ELDIN DE PECOULAS P., BASCO L.K., LE BRAS J., MAZABRAUD A.

Association between antifolate resistance in vitro and dhfr point mutation in Plasmodium falciparum

isolates. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1996, 90, 181-182.

FEAGIN J E.

The 6-kb element of Plasmodium falciparum encodes mitochondrial cytochrome genes. Mol Biochem

Parasitol, 1992, 52, 145-148.

FENTON B., WALKER A., WALLIKER D.

Protein variation in clones of Plasmodium falciparum detected by two dimensional electrophoresis. Mol

Biochem Parasitol, 1985, 16, 173-183.

FENTON B., WALLIKER D.

Genetic analysis of polymorphic proteins of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genet

Res, 1990, 55, 81-86.

FERMANIAN J.

Mesure de l'accord entre deux juges. Cas qualitatif. Rev Epidemiol Sante Publique, 1984, 32, 140-147.

FIDOCK D.A., NOMURA T., TALLEY A.K., COOPER R.A., DZEKUNOV S.M., FERDIG M.T., URSOS

L.M.B., SIDHU A.B.S., NAUDE B., DEITSCH K.W., SU X.Z., WOOTTON J.C., ROEPE, P.D., WELLEMS

T.E.

Mutations in the P. falciparum digestive vacuole transmembrane protein PfCRT and evidence for their

role in chloroquine resistance. Mol Cell, 2000, 6, 861-871.

122

FILLER S., CAUSER L.M., NEWMAN R.D., BARBER A.M., ROBERTS J.M., MACARTHUR J. PARISE

M.E., STEKETEE R.W.

Malaria surveillance--United States. MMWR Surveill Summ, 2003, 52, 1-14.

FOOTE S J., KEMP D J.

Chromosomes of malaria parasites. Trends genet, 1989, 5, 337-342.

FOOTE S J., THOMPSON J.K., COWMAN A.F., KEMP D.J.

Amplification of the multidrug resistance gene in some chloroquine-resistant isolates of P. falciparum.

Cell, 1989, 57, 921-930.

GARDNER M.J., TETTELIN H., CARUCCI D.J., CUMMINGS L.M., ARAVIND L., KOONIN E.V.,

SHALLOM S., MASON T., YU K., FUJII C., PEDERSON J., SHEN K., JING J.P., ASTON C., LAI Z.W.,

SCHWARTZ D.C., PERTEA M., SALZBERG S., ZHOU L.X., SUTTON G.G., CLAYTON R., WHITE O.,

SMITH H.O., FRASER C.M., ADAMS M.D., VENTER J.C., HOFFMAN S.L.

Chromosome 2 sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Science, 1998, 282,

1126-1132.

GARDNER M.J., HALL N., FUNG E., WHITE O., BERRIMAN M., HYMAN R.W., CARLTON J.M., PAIN

A., NELSON K.E., BOWMAN S., PAULSEN I.T., JAMES K., EISEN J.A., RUTHERFORD K.,

SALZBERG S.L., CRAIG A., KYES S., CHAN M.S., NENE V., SHALLOM S.J., SUH B., PETERSON J.,

ANGIUOLI S., PERTEA M., ALLEN J., SELENGUT J., HAFT D., MATHER M.W., VAIDYA A.B.,

MARTIN D.M.A., FAIRLAMB A.H., FRAUNHOLZ M.J., ROOS D.S., RALPH S.A., MCFADDEN G.I.,

CUMMINGS L.M., SUBRAMANIAN G.M., MUNGALL C., VENTER J.C., CARUCCI D.J., HOFFMAN

S.L., NEWBOLD C., DAVIS R.W., FRASER C.M., BARRELL B.

Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature, 2002, 419, 498-511.

GILLES H.M.

La prise en charge du paludisme grave et compliqué, d'après : severe and complicated malaria, 2è

édition, Trans R Soc Trop Med Hyg, 1990, 84 (supplément 2). OMS, Genève, 1991, 47p.

GOLVAN J-Y.

Eléments de parasitologie médicale : Paris : 4ère Ed, Flammarion, 1983, 571p.

123

GUIGUEMDE T.R., GBARY A.R., OUEDRAOGO J.B., GAYIBOR A., LAMIZANA L., MAIGA A.S.,

BOUREIMA H.S., COMLANVI C.E., FAYE O., NIANG S.D.

Point actuel sur la chimio-résistance du paludisme des sujets autochtones dans les Etats de l'OCCGE

(Afrique de l'Ouest). Ann Soc Belge Med Trop, 1991, 71, 199-207.

GUIGUEMDE T.R., GBARY A.R., COULIBALY C.O., OUEDRAOGO J.B.

Comment réaliser et interpréter les résultats d’une épreuve de chimio-résistance de P. falciparum chez

les sujets malades en zone tropicale. Cahiers Santé, 1996, 6, 187-191.

GOMAN M., LANGSLEY G., HYDE J.E., YANKOVSKY N.K., ZOLG J.W., SCAIFE J.G.

The establishment of genomic DNA librairies for the human malaria parasites Plasmodium falciparum

and identification of individual clones by hybridisation. Mol biochem Parasitol, 1982, 5, 391-400.

HENRY M.C, KONE M., GUILLET P., MOUCHET J.

Chloroquine resistance and malaria control in Ivory Coast. Cahiers Santé, 1998, 8, 287-291.

HENRY M.C, NIANGUE J., KONE M.

Quel médicament pour traiter le paludisme simple quand la chloroquine devient inefficace dans l'Ouest

de la Côte d'Ivoire ? Med Trop, 2002, 62, 55-57.

HOMEWOOD C A., NEAME K D.

Biochemestry of malarial parasites in : Kreier J P., éd. Malaria, New York, Academic press, 1980, 1,

346-405.

JELINEK T., PEYERL-HOFFMAN G., MUHLBERGER N., WICHMANN O., WILHELM M.,

SCHMIDER N., GROBUSCH M.P., VON SONNENBURG F., GASCON J., LAFERL H., HATZ C.,

ALIFRANGIS M., BURCHARD G., McWHINNEY P., SCHULZE M., KOLLARITSCH H., DA CUNHA

S., BERAN J., KERN P., GJORUP I., CUADROS J.

Molecular surveillance of drug resistance through imported isolates of Plasmodium falciparum in

Europe. Malar J, 2002, 1, p 11.

KAMCHONWONGPAISAN S., SAMOFF E., MESHNICK S.R.

Identification of hemoglobin degradation products in Plasmodium falciparum. Mol Biohem Parasitol,

1997, 86, 179-186.

124

KAMYA M.R., DORSEY G., GASASIRA A., NDEEZI G., BABIRYE J.N., STAEDKE S.G.,

ROSENTHAL P.J.

The comparative efficacy of chloroquine and sulfadoxine-pyrimethamine for the treatment of

uncomplicated falciparum malaria in Kampala, Uganda. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2002, 95, 50-55.

KEMP D.J., CORCORAN V.R., COPPEL R.L., STAHL H.D., BIANCO A.E., BROWN G.V., ANDERS R.F.

Size variation in chromosomes from independent cultured isolates. Nature, 1985, 315, 347-350.

KHANDELWAL V., UDAWAT H., KUMHAR M.R., GOYAL R.K.

Blackwater fever is a rare manifestation of falciparum malaria characterized by sudden intravascular

hemolysis followed by fever and hemoglobinuria. We present a case of blackwater fever, having

occurred after administration of quinine, which was treated successfully with artemether. J Assoc

Physicians India, 2001, 49, 1191-1192.

KOFFI P.C.

Évaluation de l'efficacité thérapeutique de l'association sulfadoxine-pyriméthamine (fansidar®) dans le

traitement de l'accès palustre non compliqué chez les enfants de 6 à 59 mois dans la commune de

Yopougon. 230p Th. D : parasitologie : Univ. de Cocody, Abidjan : 2003 ; 260.

KOUAKOU K.B.W.

Évaluation de l'efficacité de la chloroquine et de la sulfadoxine-pyriméthamine dans dans le traitement

des accès palustres simples chez les enfants dans la département de Danané (Protocole de 28 jours).

128p Th. D : parasitologie, Univ. de Cocody, Abidjan : 1999 ; 1404.

KROGSTAD D.J., SCHLESINGER P.H.

A perspective on antimalarial action : effets of weak bases on Plasmodium falciparum. Biochem

Pharmacol 1986, 35, 547-552.

KROGSTAD D.J., GLUZMAN I.Y., KYLE D E., ODUOLA A.M., MARTIN S;K., MILHOUS W.K.,

SCHLESINGER P.H.

Efflux of chloroquine from Plasmodium falciparum : mechanism of chlorquine-resistance. Science,

1987, 238, 1283-1285.

125

KRUNGKRAI J., BURAT D., KUDAN S., KRUNGKRAI S., PRAPUNWATTANA P.

Mitochondrial oxygen consumption in asexual and sexual blood stages of the human malarial parasite,

Plasmodium falciparum. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 1999, 30, 636-642.

LARONZE J.Y., LARONZE J.

Émétine et ses dérivés In : Traités de chimie thérapeutique, principaux antifongiques et antiparasitaires,

ed TEC & DOC, ed médicales Internationales, 2000, 260-271.

LAU H., FERLAN J.T., BROPHY V.H., ROSOWSKY A., SIBLEY C.H.

Efficacies of lipophilic inhibitors of dihydrofolate reductase against parasitic protozoa. Antimicrob

Agents Chemother, 2001, 45, 187-195.

LE BRAS J., THULLIER D., COULAUD J.P., SAVEL J.

In vitro comparaison of patient and P. falciparum strain sensitivities to chloroquine. In : Van den

Bossche H., the host Invader Interapy., Ed. Elsevier, north holland, Bio-medical press BV, 1980, 638-

641.

LE BRAS J., DELORON P.

In vitro study of drug sensitivity of plasmodium falciparum : an evalution of a new semi-microtest. Am J

Trop Med Hyg. 1983, 32, 447-451.

LE BRAS J., ANDRIEU B., HATIN I., SAVEL J., COULAUD J.P.

Plasmodium falciparum : interprétation du semi-microtest de chimio-sensibilité in vitro par

incorporation de 3H-hypoxanthine. Path Biol, 1984, 32, 463-466.

LE BRAS J., HATIN I,. BOURREE P., COCO-CIANCI O., GARIN J.P., REY M., CHARMOT G., ROUE R.

Chloroquine-resistant falciparum malaria in Benin. Lancet, 1986, 2, 1043-1044.

LE BRAS J., BASCO K.L.

Chimiorésistance des Plasmodiums In : Paludisme, ed. par M. Danis et J. Mouchet Paris : Ellipses /

Aupelf, Marketing, 1991. 146-167.

LE BRAS J., BASCO K.L., CHARMOT G.

Les bases moléculaires de la chimiorésistance de Plasmodium falciparum et ses différents profils.

Cahiers Santé, 1993, 3, 293-301.

126

LE BRAS J., BASCO L K., ELDIN DE PECOULAS P.

Mécanismes et épidémiologie des résistances aux antipaludiques. Soc Biol, 1996, 190, 471-485.

LE BRAS J., LONGUET C., CHARMOT G.

Transmission humaine et résistance des plasmodies. In Paludisme, Rev Prat, 1998, 48, 258-263.

LEE H S., KIM S.T., CHO D.K.

Effects of rehmanniae radix water extract on renal function and renin secretion rate in unanesthezide

rabbits. Am J Chin Med, 1993, 21, 179-186.

LERI O., PERINELLI P., LOSI T., MASTROPASQUA M., PERI C., TUBILI S.

Malaria: recent immunological acquisitions and therapeutic prospects. Clin Ter, 1997, 148, 655-665.

LEVINE N.D.

Progress in taxonomy of the Apicomplexan protozoa. J Protozool, 1988, 35, 518-520.

LOPES D., NOGUEIRA F., GIL J.P., FERREIRA C., DO ROSARIO V.E., CRAVO P.

pfcrt and pfmdr1 mutations and chloroquine resistance in Plasmodium falciparum from Sao Tome and

Principe, West Africa. Ann Trop Med Parasitol, 2002, 96, 831-834.

LOUKOU D.D.A.

Etude comparative de la sensibilité in vivo / in vitro de Plasmodium falciparum à l'amodiaquine versus

chloroquine chez les enfants de moins de 15 ans dans la région d'Adzopé. 147p Th. D : parasitologie,

Univ de Cocody, Abidjan : 2000 ; 468.

MACKEY L.

Diagnosis of Plasmodium falciparum infection in man: detection of parasite antigens by Elisa. WHO

Bull, 1982, 60, 69-75.

MASIMIREMBWA C.M., PHUONG DUNG N., PHUC B.Q., DUC DAO L., SY, N.D., SKOLD O.,

SWEDBERG G.

Molecular epidemiology of Plasmodium falciparum antifolate resistance in Vietnam: genotyping for

resistance variants of dihydropteroate synthase and dihydrofolate reductase. Int J Antimicrob Agent,

1999, 12, 203-211.

127

MASON D.P., KAWAMOTO F., LIN K., LAOBOONCHAI A., WONGSRICHANALAI C.

A comparison of two rapid field immunochromatographic tests to expert microscopy in the diagnosis

of malaria. Acta Trop, 2002, 82, 51-59.

MAY J., MEYER C.G.

Association of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter variant T76 with age-related

plasma chloroquine levels. Am J Trop Med Hyg, 2003, 68, 143-146.

MAYOR A.G., GOMEZ OLIVE X., APONTE J.J., CASIMIRO S., MABUNDA S., DGEDGE M.,

BARRETO A., ALONSO P.L.

Prevalence of the K76T mutation in the putative Plasmodium falciparum chloroquine resistance

transporter (pfcrt) gene and its relation to chloroquine resistance in Mozambique. J Infect Dis, 2001,

183, 1413-1416.

MAWILI MBOUMBA D.P., EKALA M.T., LEKOULOU F., NTOUMI F.

Molecular analysis of DHFR and DHPS genes in P. falciparum clinical isolates from the Haut-Ogooué

region in Gabon. Acta Tropica, 2001, 78, 231-240.

MAZOYER B, MARY J Y.

Le kappa utilise comme mesure de reproductibilite : distribution sous l'hypothese nulle. Rev Epidemiol

Sante Publique, 1987, 35, 474-481.

MBERU E.K., NZILA A.M., NDUATI E., ROSS A., MONKS S.M., KOKWARO G.O., WATKINS W.M.,

SIBLEY C.H.

Plasmodium falciparum : in vitro activity of sulfadoxine and dapsone in field isolates from Kenya:

point mutations in dihydropteroate synthase may not be the only determinants in sulfa resistance. Exp

Parasitol, 2002, 101, 90-96.

McCUTCHAN T.F., DAME J B., MILLER L.H., BARNWELL J.

Evolutionary relatedness of Plasmodium species as determined by the structure of DNA. Science, 1984,

225, 808-811.

MERRITT A., EWALD D., VAN DEN HURK A.F., STEPHEN S., JR., LANGRELL J.

Malaria acquired in the Torres Strait. Commun Dis Intell, 1998, 22, 1-2.

128

MOCKENHAUPT F.P., EGGELTE T.A., TILL H., BIENZLE U.

Plasmodium falciparum pfcrt and pfmdr1 polymorphisms are associated with the pfdhfr N108

pyrimethamine-resistance mutation in isolates from Ghana. Trop Med Int Health, 2001, 6, 749-755.

MOREAU S., PERLY B., BIGNET J.

Interactions de la chloroquine avec la ferriprotoporphyrine IX. Etude par résonance magnétique

nucléaire. Biochimie, 1982, 64, 1015-1025.

MORENO A., BRASSEUR P., CUZIN-OUATTARA N., BLANC C., DRUILHE P.

Evaluation under field conditions of the colourimetric DELI-microtest for the assessment of

Plasmodium falciparum drug resistance. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2001, 95, 100-103.

MOUCHET J., CARNEVALE P., COOSEMANS M., FONTENILLE D., RAVAONJANAHARY C.,

RICHARD A., ROBERT V.

Typologie du paludisme en Afrique. Cahiers santé, 3, 220-238.

MULLER O., TRAORE C., KOUYATE B.

Clinical efficacy of chloroquine in young children with uncomplicated falciparum malaria - a

community-based study in rural Burkina Faso. Trop Med Int Health, 2003, 8, 202-203.

MYERS R.L., BURGHOFF R L., ENGLISH D.W., WENZEL A.Z., HARVEY M.A.

Evaluation of isocode and other novel collection matrices as nucleic acid storage and processing devices

for clinical samples. Poster reprint presented at the 49th AACC Annual Metting, july 20-24th, 1997,

Atlanta, GA. # 774.

NDONG M.M.J., ATTEKE C., AUBOUY A., BAKARY M., LEBIBI J., DELORON P.

In vitro activity of chloroquine, quinine, mefloquine and halofantrine against Gabonese isolates of

Plasmodium falciparum. Trop Med Int Health, 2001, 8, 25-29.

NICOULET I., SIMON F., LE BRAS J.

Apparition de la chloroquino-résistance de paludisme à Plasmodium falciparum en Côte d'Ivoire. Bull

Epidémiol Hebdo, 1987, 41, 163.

NOEDL H.,. WONGSRICHANALAI C., WERNSDORFER W.

Malaria drug-sensitivity testing : new assays, new perspectives. Trends Parasitol, 2003, 19, 175-181.

129

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE

Chimiothérapie du paludisme et résistance aux antipaludiques. Série de rapports techniques, n°529,

Genève, 1973, 128p.

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE

Mode d’emploi du nécessaire d’épreuve (Macro-test) pour l' évolution de la réponse de P. falciparum à

la chloroquine in vitro, 1984, 7p.

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE

Progrès en chimiothérapie du paludisme, rapport d'un groupe scientifique, série de rapports techniques,

n° 711, Genève, 1984, , 235p.

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE

Techniques de base pour le diagnostic microscopique du paludisme, partie I et II, génève, 1984.

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE

Biologie des plasmodies, rapport d'un groupe scientifique de l'OMS, série de rapport techniques n° 743,

Genève, 1987, 251p.

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE

Stratégies d'utilisation des antipaludiques : besoins de données, traitement du paludisme non compliqué

et prise en charge pendant la grossesse. WHO/MAL/94.1070, 1994, 72p.

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE

Evaluation de l'efficacité thérapeutique des antipaludiques pour le traitement du paludisme à

Plasmodium falciparum non compliqué dans les régions à transmission élevée. WHO/MAL96.1077,

1996, 33p.

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE

Paludisme, aide-Mémoire, Génève, 1998, 94, 7p.

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE

Surveillance de la résistance aux antipaludiques, rapport d'une consultation de l'OMS, Genève, Suisse,

WHO/CDS/CSR/EPH/2002.17, 2002, 35p.

ORLANDO G., ISABELLA L., ATZORI C., CARGNEL A.

Blackwater fever after halofantrine. Lancet, 1996, 347, 1408-1409.

130

PATARAPOTIKUL J., LANGSLEY G.

Chromosome size polymorphism in Plasmodium falciparum can involve deletions of the subtelomeric

pPFrep 20 sequence. Nucleic Acids Res, 1988, 16, 4331-4340.

PENALI L.K., HOUDIER M., ASSOUMOU A., COULIBALY A., KONE M.

In-vivo evaluation of Plasmodium falciparum sensitivity to chloroquine in Abidjan. Bull Soc Path

Exot 1990, 83, 187-92.

PENALI L.K., KONE M., KOMENAN A., COULIBALY L.

Decrease in chloroquine resistant Plasmodium falciparum in the Abidjan region (Ivory Coast). Med

Trop, 1993, 53, 191-194.

PETERSON D.S., WALLIKER D. WELLEMS T.E.

Evidence that a point mutation in the dihydrofolate reductase-thymidilate synthase confers resistance to

pyrimethamine in falciparum malaria. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85, 9114-9118.

PETERSON D.S., DI SANTI S M., POVOA M., CALVOSA V.S., DO ROSARIO V.E., WELLEMS T.E.

Prevalence of the dihydrofolate reductase Asn-108 mutation as the basis for pyrimethamine-resistant

falciparum malaria in the brazilian amazon. Am J Trop Med Hyg, 1991, 45, 492-497.

PLOW C.V., DOUMBO O.K., DJIMDE A., KAYENTAO K., DIOURTE Y., DOUMBO S.N., COULIBALY

D., THERA M., WELLEMS T.E., DIALLO D.A.

Chloroquine treatment of uncomplicated Plasmodium falciparum malaria in Mali : parasitologic

resistance versus therapeutic efficacy. Am J Trop Med Hyg, 2001, 64 5, 242-246.

POLLACK Y., KATZEN A.L., SPIRA D.T., GOLENSER J.

The genome of Plasmodium falciparum I: DNA base composition. Nucleic Acids Res, 1982, 10, 539-

546.

PREISER P., WILLIAMSON D.H., WILSON R.J.

tRNA genes transcribed from the plastid-like DNA of Plasmodium falciparum. Nucleic Acids Res,

1995, 23, 4329-4336.

131

REYNOLDS M.G., ROOS D.S.

A biochemical and genetic model for parasite resistance to antifolates - Toxoplasma gondii provides

insights into pyrimethamine and cycloguanil resistance in Plasmodium falciparum. J Biol Chem,

1998, 273, 3461-3469.

RIDLEY R.G.

Malaria : Dissecting chloroquine resistance. Curr Biol, 1998, 8, R346-R349.

RIDLEY R.G., HUDSON A.T.

Quinoline antimalarials. Exp Op Therapeut Pat, 1998, 8, 121-136.

RIECKMANN K.H., LOPEZ-ANTUNAUO F.J.

Mode d’emploi du nécessaire d’épreuve pour l’évaluation de la réponse de P. falciparum à la

chloroquine in vitro. Bull Org Mond Santé, 1971, 45, 157-167.

RIECKMANN K.H., CAMPBELL G.H., SAX, L.J., MREMA J.E.

Drug sensitivity of P. falciparum. An in-vitro microtechnique. Lancet, 1978, 1, 22-23.

RINGWALD P., EKOBO A.S., KEUNDJIAN A., MANGAMBA D.K., BASCO L.K.

Chimiorésistance de Plasmodium falciparum en milieu urbain à Yaoundé, Caméroun. Part 1 :

Surveillance in vitro et in vivo de la résistance de Plasmodium falciparum à la chlorquine entre 1994 et

1999 à Yaoundé, Caméroun. Trop Med Int Health, 2000, 5, 612-619.

RINGWALD P., KEUNDJAN A., EKOBO A.S., BASCO L.K.

Chimiorésistance de Plasmodium falciparum en milieu urbain à Yaoundé, Caméroun. Part 2 :

Evaluation de l'efficacité de l'amodiaquine et de l'association sulfadoxine-pyriméthamine pour le

traitement de l'accès palustre simple à Plasmodium falciparum à Yaoundé, Caméroun. Trop Med Int

Health, 2000, 5, 620-627.

SAMBROOK J., FRITSCH E M., MANIATIS T.

Agarose gel electrophoresis in molecular cloning : a laboratory manual 2nd edition, cold spring harbor

laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, p 63.

SAMBROOK J., FRITSCH E F., MANIATIS T.

A laboratory manual cold spring harbor laboratory, cold spring harbor, New York , 1989.

132

SANCHEZ C P., WUNSCH S., LANZER M.

Identification of a chloroquine importer in Plasmodium falciparum. J Biol Chem, 1997, 272, 2652-2658.

SANGSTER N., BATTERHAM P., CHAPMAN H.D., DURAISINGH M., LE JAMBRE L., SHIRLEY M.,

UPCROFT J., UPCROFT P.

Resistance to antiparasitic drugs : the role of molecular diagnosis. Int J Parasitol, 2002, 32, 637-653.

SANSONETTI P.J., LE BRAS J., VERDIER F., CHARMOT G., DUPONT B., LAPRESLE C.

Chloroquine-resistant Plasmodium falciparum in Cameroon. Lancet, 1985, 1, 1154-1155.

SAWADOGO M., VAN DYKE M W.

A rapid method for the purification of deprotected oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res, 1991, 19,

p 674.

SCHELLENBERG D., KAHIGWA E., DRAKELEY C., MALENDE A., WIGAYI J., MSOKAME C.,

APONTE J.J., TANNER M., MSHINDA H., MENENDEZ C., ALONSO P.L.

The safety and efficacy of sulfadoxine-pyrimethamine, amodiaquine and their combination in the

treatment of uncomplicated Plasmodium falciparum malaria. Am J Trop Med Hyg, 2002, 67, 17-23.

SCHWARTZ D.C., CANTOR C.R.

Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell, 1984,

37, 67-75.

SHARMA I., RAWAT D.S., PASHA S.T., BISWASS., SHARMA Y.D.

Complete nucleotide sequence of the 6 kb element and conserved cytochrome b gene sequences

among Indian isolates of Plasmodium falciparum. Int J Parasitol, 2001, 31, 1107-1113.

SIBLEY C.H., HYDE,J.E., SIMS P.F.G., PLOWE C.V., KUBLIN J.G., MBERU E.K., COWMAN A.F.,

WINSTANLEY P.A., WATKINS W.M., NZILA A.M.

Pyrimethamine-sulfadoxine resistance in Plasmodium falciparum : what next? Trends Parasitol, 2001,

17, 582-588.

SMITH L.M., SANDERS J.E., KAISER R. J., HUGHES P., DODD C., CONNELL C.R., HEINER C.,

KENT S.B., HOOD L.E.

Fluorescence detection in automated DNA sequencing analysis. Nature, 1986, 321, 647-649.

133

SMITH T.G., AYI K., SERGHIDES L., McALLISTER C.D., KAI K.C.

Innate immunity to malaria caused by Plasmodium falciparum. Clin Invest Med, 2002, 25, 262-272.

SRIVASTAVA I.K., ROTTENBERG H., VAIDYA A.B.

Atovaquone, a broad spectrum antiparasitic drug, collapses mitochondrial membrane potential in a

malarial parasite. J Biol Chem, 1997, 272, 3961-3966.

THAITHONG S., CHAN S.W., SONGSOMBOON S., WILAIRAT.P., SEESOD N., SUEBLINWONG T.,

GOMAN M., RIDLEY R., BEALE G.

Pyrimethamine resistant mutation in Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol, 1992, 52, 149-

157.

THELLIER M., DATRY A., ALFA CISSE O., SAN C., BILIGUI S., SILVIE O., DANIS M.

Diagnosis of malaria using thick bloodsmears : definition and evaluation of a faster protocol with

improved readability. Ann Trop Med Parasitol, 2002, 96, 115-124.

THOMAS S.M., NDIR O., DIENG T., MBOUP S., WYPIJ D., MAGUIRE J H., WIRTH D.F.

In vitro chloroquine susceptibility and PCR analysis of pfcrt and pfmdr-1 polymorphisms in

Plasmodium falciparum isolates from Senegal. Am J trop Med Hyg, 2002, 66, 474-480.

TINTO H., OUEDRAOGO J.B., COULIBALY S.O.,TRAORE B., GUIGUEMDE T.R.

Le microtest isotopique simplifié : une méthode pour l'étude de la chimio-résistance in vitro de

Plasmodium falciparum aux antipaludiques. Cahiers Santé, 2000, 10, 353-356.

TOUZE J E., CHARMOT G.

Le paludisme à Plasmodium falciparum : situation actuelle et perspectives. Cahiers Santé, 1993, 3, 217-

219.

TRAGER W., JENSEN J.B.

Human malaria parasite in continuous culture. Science, 1976, 193, 673-675.

TRAGER W.

On the establishment in culture of isolates of Plasmodium falciparum. Trans R Soc Trop Med Hyg,

1990, 84, p 466.

134

TRIGLIA T., MENTING J.G.T., WILSON C., COWMAN A.F.

Mutations in the dihydropteroate synthase are responsible for sulfone and sulfonamide resistance in

Plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94, 13944-13949.

TRIGLIA T., COWMAN A.F.

Primary structure and expression of the dihydropteroate synthetase gene of Plasmodium falciparum.

Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 91, 7149-7153.

VACHON F., FAJAC I., GACHOT B., COULAUDJ. P., CHARMOT G.

Halofantrine and acute intravascular haemolysis. Lancet, 1992, 340, 909-910.

VAN DER JAGT D.L., HUNRAKER L.A., CAMPOS N.M.

Comparison of protease from chloroquine sensitive and chloroquine resistant strains of Plasmodium

falciparum. Biochem Pharmacol, 1987, 36, 3285-3291.

VAN DER PLOEG L.H., SMITS M., PONNUDURAI T., VERMEULEN A., MEUWISSEN J.H.,

LANGSLEY G.

Chromosome-sized DNA molecules of Plasmodium falciparum. Science, 1985, 229, 658-661.

WALKER-JONAH A., DOLAN S.A., GWADZ R W., PANTON L.J., WELLEMS T.E.

An RFLP map Plasmodium falciparum genome, recombination rates and favored linkage groups in a

genetic cross. Mol Biochem Parasitol, 1992, 51, 313-320.

WALLIKER D., QUAKYI I A., WELLEMS T.E., MCCUTCHAN T.F., SZARFMAN A., LONDON W.T.,

CORCORAN L.M., BURKOT T. R., CARTER R.

Genetic analysis of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Science, 1987, 236, 1661-1666.

WANG P., READ M., SIMS P.F., HYDE J.E.

Sulfadoxine resistance in the human malaria parasite Plasmodium falciparum is determined by

mutations in dihydropteroate synthetase and an additional factor associated with folate utilization. Mol

Microbiol, 1997, 23, 979-986.

WARBURTON D.

Miscellaneous compounds in antimalarial drugs II. Current Antimalarials and New drugs

Developments, 68/II Ed. Peters W., Richards W H G Springer-Verlag, 1984, 68, 471-495.

135

WARHURST D.C.

Antimalarial schizonticides : why a permease is necessary ? Parasitol Today, 1986, 2, 331-333.

WARHURST D.C., CRAIG J.C., ADAGU I.S.

Lysosomes and drug resistance in malaria. Lancet, 2002, 360, 1527-1529.

WELLEMS T E., WALLIKER D., SMITH C L., DO ROSARIO V.E., MALOY W.L., HOWARD R.J.,

CARTER R., McCUTCHAN T.F.

A histidine-rich protein gene marks a linkage group favored strongly in a genetic cross of Plasmodium

falciparum. Cell, 1987, 49, 633-642.

WELLEMS T.E., PLOWE C.V.

Chloroquine-resistant malaria. J Infect Dis, 2001, 184, 770-776.

WORLD HEALTH ORGANIZATION

New perspectives malaria Diagnosis, report of a joint WHO / USAID informal consultation, 25-27

october 1999, WHO / CDS / RBM / 200.14 WHO / MAL / 2000. 1091, 57p.

WORLD HEALTH ORGANIZATION

Severe falciparum malaria. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2000, 94, s1-s90

WORLD HEALTH ORGANIZATION

What is malaria, infosheet, march, 2002, 11p.

WU Y., KIRKMAN L.A., WELLEMS T.E.

Transformation of Plasmodium falciparum malaria parasites by homologous integration of plasmids that

confer resistance to pyrimethamine. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93, 1130-1134.

YAVO W., ACKRA K.N., MENAN E.I., BARRO-KIKI P.C., KASSI R.R., ADJETEY T.A., BAMBA A.,

KONE M.

Comparative study of four malaria diagnostic techniques used in Ivory Coast. Bull Soc Pathol Exot,

2002, 95, 238-240.

YAVO W., MENAN, E. I. H., ADJETEY T.A.K., BARRO KIKI P.C., NIGUE L., KONAN, Y.J., NEBAVI

N.G.F., KONE M.

In vivo sensitivity of Plasmodium falciparum to 4 amino quinoleines and pyrimethamine-sulfadoxine

in Agou (Cote d'Ivoire). Path Biol, 2002, 50, 184-188.

136

YAYON A., CABANTCHIK Z. I., GINSBURG H.

Identification of the acidic compartment of P. falciparum-infected human erythrocytes as the target of

the antimalarial drug chloroquine. EMBO J , 1984, 3, 2695-2700.

YUVANIYAMA J., CHITNUMSUB P., KAMCHONWONGPAISAN S., VANICHTANANKUL J.,

SIRAWARAPORN W., TAYLOR P., WALKINSHAW M. D., YUTHAVONG Y.

Insights into antifolate resistance from malarial DHFR-TS structures. Nature, 2003, 10, 357-365.

ZHANG K., RATHOD P. K.

Divergent regulation of dihydrofolate reductase between malaria parasite and human host. Science,

2002, 296, 545-547.

ZHANG H., HOWARD E.M., ROEPE P.D.

Analysis of the antimalarial drug resistance protein Pfcrt expressed in yeast. J Biol Chem, 2002, 277,

49767-49775.

ZOGUÉREH D. D., DELMONT J.

Les médicaments antipaludiques et leurs modes d'emploi en milieu africain. Cahiers Santé, 2000, 10,

425-433.

137

ANNEXES

138

ANNEXES-1

QUELQUES ARTICLES D'ÉTUDE PONCTUELLE SUR LA CHIMIOSENSIBILITÉ A

ABIDJAN

1- Mise au point d'un test

2- Mise en place d'un système de surveillance de la chimio-résistance (Étude in vivo à la chloroquine)

3- Sensibilité in vitro à la chloroquine à Adjamé (Abidjan)

4- La prévalence de la résistance aux antifoliniques

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ANNEXES -2

Tableau i : Sujets ayant un ETP ou un ETT lors du test de l'efficacité thérapeutique à la chloroquine

(CQ) et à la sulfadoxine-pyriméthamine (SP)

N° SUJET

MCT §

REPONSE

N° SUJET

MCT

REPONSE

AY 003 1

SP

ETP *

AY 901

CQ

EPT **

AY 007 SP ETP AY 902 CQ ETP

AY 0148 SP ETP AY 904 CQ ETP

AY 0172 SP ETP AY 907 CQ EPT

AY 0240 SP ETP AY 952 CQ EPT

AY 037 SP ETP AY 909 CQ ��P

AY 045 SP ETP AY 911 CQ ETP

AY 047 SP ETP AY 912 CQ EPT

AY 063 SP ETP AY 916 CQ EPT

AY 084 SP ETP AY 919 CQ ETP

AY 112 SP ETP AY 921 CQ EPT

AY 120 SP ETP AY 922 CQ ETP

AY 124 SP ETP AY 926 CQ ETP

AY 125 SP ETP AY 927 CQ EPT

AY 126 SP ETP AY 929 CQ EPT

AY 128 SP ETP AY 930 CQ EPT

AY 168 SP ETP AY 931 CQ ECT

AY 182 SP ETP AY 932 CQ EPT

AY 184 SP ETP AY 935 CQ ETP

AY 1TR6 SP ETP AY 936 CQ EPT

AY 1TR7 SP ETP AY 937 CQ ECT ***

* ETP : échec thérapeutique précoce AY 9TR1 CQ EPT

** EPT : échec parasitologique tardif AY 9TR2 CQ ETP

*** ECT : échec clinique tardif AY 9TR4 CQ ECT § MCT : Médicament

1 La référence du sujet correspond au numéro de l'isolat

167

Tableau ii : CI50 des isolats de P. falciparum résistants à la chloroquine et à la pyriméthamine

N° ISOLATS

CI50 CQ en nM N° ISOLATS

CI50 PYR en nM

AY003

147

AY003

6400

AY0172 115 AY045 7500

AY032 103 AY063 9000

AY063 220 AY084 4790

AY084 101 AY0148 2400

AY124 130 AY0172 2005

AY125 105 AY0240 3500

AY3B 177 AY120 11500

AY10B 180 AY124 19000

AY11B 154 AY125 4250

AY13B 105 AY126 3500

AY20B 110 AY128 4000

AY902 135 AY904 9750

AY904 155 AY905 3500

AY934 120 AY937 2750

AY937 165 AY9TR2 7500

AY9TR2 450 AYA45 3300

AY9TR4 150 AYA49 2600

AYA42 100 AYA50 2500

AYA43 153 AY03B 2600

AYA44 201 AY06B 2500

AYA46 141 AY14B 2020

AYA49 140 AY21B 2605

AYA51 242 AY22B 2500

AYA53 150

CQ : chloroquine ; PYR : pyriméthamine

168

Tableau iii : Nature du codon 108 de la dhfr de P. falciparum après PCR-RFLP

N° ISOLATS

NATURE CODON 108

N° ISOLATS

NATURE CODON 108

N° ISOLATS

NATURE CODON 108

AY003

AGC/AAC

AY055

AAC

AY015

AGC/AAC AY005 AGC AY057 AGC AY021 AAC AY006 AAC AY058 AGC AY025 AAC AY007 AGG/AAC AY063 AAC AY030 AGC AY010 AGC AY084 AGC/AAC AY046 AAC AY011 ACC AY095 AGC AY047 AAC AY016 AGC AY0100 AAC AY049 AGC AY017 AAC AY103 AGC AY056 AAC AY018 AGC AY0135 AGC AY059 AGC AY022 AGC AY0148 AGC/AAC AY060 AGC AY032 AGC AY0150 AGC AY062 AGC AY036 AAC AY0172 AAC AY065 AGC/AAC AY037 AAC AY0194 AGC AY070 AGC AY040 AGC AY0216 AAC AY071 AAC AY045 AAC AY0220 AGC AY076 AAC AY048 AGC AY0240 AAC AY080 AGC AY053 AGC AY0241 AGC AY083 AGC AY054 AGC AY0243 AAC IS2 AAC

169

Tableau iv : Acides aminés de la PFCRT, DHFR et DHPS des isolats de P. falciparum

N° ID PFCRT DHFR DHPS 76 16 51 59 108 164 436 437 540 581 613

AY003

T

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A AY005 T A N C S I Y A K A S AY104 K A N C S I A G K A A AY110 T A N C S I S G K A A AY112 T A I C N I F A K A S AY116 K A N C S I A G K A S AY117 K A N C S I A A K A A AY118 T A N C S I S G K A A AY120 T A I R N I A A K A A AY121 T A N C S I S A K A A AY122 T A N C S I F A K A S AY123 T A N C S I A A K A A AY124 T A I R N I A A K A S AY125 K A I R N I S G K A S AY126 T A N R N I Y A K A S AY127 T A N C S I S G K A A AY128 T A I C N I A A K A A AY155 K A N C S I A G K A S AY158 T A N C S I A A K A S AY159 T A N C S I A A K A A AY160 T A N C S I A G K A A AY161 T A N C S I A A K A A AY162 T A N C S I S G K A A AY164 K A N C S I S A K A A AY167 T A N C S I A A K A A AY168 T A I R N I A A K A A AY169 T A N C S I S G K A A AY172 T A N C S I C A K A A AY173 T A N C S I S G K A A AY174 T A N C S I S G K A A AY175 T A N C S I S G K A A AY176 T A N C S I S G K A A AY178 T A N C S I A A K A A AY134 K A N C S I S G K A A AY136 T A N C S I A G K A A AY182 T A I R N I A G K A A AY184 T A I R N I A A K A A AY181 T A N C S I A G K A S AY198 T A N C S I ND ND ND ND ND

AY199 T A N R N I ND ND ND ND ND

AY109 T A N C S I A G K A A AY119 T A I C N I S G K A A AY137 T A N C S I S G K A A AY1Tr5 K A N C S I A G K A A AY1Tr6 T A N R N I A A K A A

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AY1Tr7 T A I R N I A G K A A AY165 K A N C N I ND ND ND ND ND

AY179 T A N C N I ND ND ND ND ND

AY180 T A N C S I ND ND ND ND ND

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AY186 T A I C N I ND ND ND ND ND

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AY183 K A I R N I ND ND ND ND ND

AY188 K A N C S I ND ND ND ND ND

AY187 K A N C S I ND ND ND ND ND

AY901 T A N R N I F A K A S AY902 T A N C S I S G K A A AY903 K A N C S I A A K A A AY904 T A I R N I A G K A S AY905 K A N C N I Y G K A A AY906 K A N R N I ND ND ND ND ND

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AY910 K A N C S I S G K A A AY911 T A N C S I ND ND ND ND ND

AY912 T A N C S I A G K A A AY914 K A N C S I ND ND ND ND ND

AY916 T A N C S I ND ND ND ND ND

AY917 K A N R N I A A K A S AY918 K A N C S I ND ND ND ND ND

AY919 T A N C S I ND ND ND ND ND

AY920 K A N C S I ND ND ND ND ND

AY921 T A N C S I S G K A A AY922 T A N C S I A A K A A AY923 K A N C S I S A K A A AY924 K A N C S I S G K A A AY925 K A N C S I A A K A S AY926 T A N C S I A A K A A AY927 T A N C S I S G K A A AY929 T A I R N I A G K A A AY930 T A N C S I L G K A A AY931 T A N C S I S G K A A AY932 T A N C S I F A K A S AY933 K A N R N I Y A K A S AY934 K A N C S I F G K A S AY935 T A N C S I S A K A A AY936 T A N C S I S G K A A AY937 T A N C S I A G K A A AY938 K A N C S I S G K A A AY952 T A N C S I ND ND ND ND ND

AY954 T A N C N I A A K A S AY9Tr1 T A N C S I A A K A A AY9Tr2 T A I R N I S G K A A

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AY9Tr3 T A N C S I ND ND ND ND ND

AY9Tr4 T A N C S I S G K A A AY913 K A N C S I A G K A S AY928 K A N C S I A A K A A AY939 T A N R N I A A K A A AY955 T A N C S I S G K A S AY970 K A N C S I ND ND ND ND ND

AY990 K A N C N I ND ND ND ND ND

AY991 K A N C S I ND ND ND ND ND

AYA40 K A N C S I ND ND ND ND ND

AYA41 K A N C S I A G K A A AYA42 K A N C S I A G K A A AYA43 T A N C S I ND ND ND ND ND

AYA44 T A N C S I S A K A A AYA45 T A N R N I ND ND ND ND ND

AYA46 T A N R N I ND ND ND ND ND

AYA47 K A N C S I S G K A A AYA48 K A I R N I ND ND ND ND ND

AYA49 T A N R N I ND ND ND ND ND

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AYA53 T A N C S I ND ND ND ND ND

AYA54 T A N C N I A A K A S AYA56 K A N C S I S G K A S AYA57 T A N C S I S A K A A AY01B T A N C S I S G K A A AY02B K A N C S I A A K A A AY03B T A N C S I A A K A P AY04B T A N C S I S G K A A AY05B K A N C S I A A K A A AY06B K A N C S I A G K A A AY07B K A N C S I A G K A A AY08B K A N C S I A G K A A AY09B K A N C S I Y A K A A AY10B T A N C S I S G K A A AY11B K A N C S I ND ND ND ND ND

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AY13B K A N C S I A G K A A AY14B T A N C S I A G K A A AY15B T A N C S I A A K A A AY16B T A N C S I ND ND ND ND ND

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172

Tableau v : Acides aminés de la PFMDR-1 des isolats de P. falciparum

N° ID PFMDR-1

86 184 1034 1042 1074 1238 1246

AY003 N Y S N G N D AY005 N F S N G N D AY104 N F S N G N D AY110 N F S N G N D AY112 Y Y S N G N D AY116 N F S N G N D AY117 N F S N G N D AY118 N Y S N G N D AY120 Y F S N G N D AY121 N F S N G N D AY122 N Y S N G N D AY123 N F S N G N D AY124 N F S N G N D AY125 N F S N G N D AY126 N F S N G N D AY127 N F S N G N D AY128 N Y S N G N D AY155 N F S N G N D AY158 N F S N G N D AY159 Y F S N G N D AY160 N F S N G N D AY161 Y F S N G N D AY162 N Y S N G N D AY164 N F S N G N D AY167 Y F S N G N D AY168 N F S N G N D AY169 N Y S N G N D AY172 N Y S N G N D AY173 Y Y S N G N D AY174 Y F S N G N D AY175 Y F S N G N D AY176 Y Y S N G N D AY178 N F S N G N D AY134 N Y S N G N D AY136 Y F S N G N D AY182 Y F S N G N D AY184 Y F S N G N D AY181 Y F S N G N D AY198 Y F S N G N D AY199 Y F S N G N D AY109 Y F S N G N D AY119 Y F S N G N D AY137 N F S N G N D AY1Tr5 N F S N G N D AY1Tr6 N Y S N G N D

173

AY1Tr7 N F S N G N D AY165 N F S N G N D AY179 N Y S N G N D AY180 N Y S N G N D AY185 Y Y S N G N D AY186 N F S N G N D AY190 N Y S N G N D AY129 N Y S N G N D AY183 N F S N G N D AY188 Y F S N G N D AY187 Y Y S N G N D AY901 N Y S N G N D AY902 N Y S N G N D AY903 N F S N G N D AY904 Y Y S N G N D AY905 N F S N G N D AY906 N F S N G N D AY907 N Y S N G N D AY908 N F S N G N D AY909 Y F S N G N D AY910 N Y S N G N D AY911 N Y S N G N D AY912 Y F S N G N D AY914 Y F S N G N D AY916 Y F S N G N D AY917 Y F S N G N D AY918 N Y S N G N D AY919 N F S N G N D AY920 N F S N G N D AY921 N Y S N G N D AY922 N F S N G N D AY923 Y F S N G N D AY924 N F S N G N D AY925 N F S N G N D AY926 Y F S N G N D AY927 Y F S N G N D AY929 N F S N G N D AY930 N Y S N G N D AY931 N Y S N G N D AY932 N F S N G N D AY933 Y F S N G N D AY934 Y F S N G N D AY935 N Y S N G N D AY936 N F S N G N D AY937 Y F S N G N D AY938 N Y S N G N D AY952 Y Y S N G N D AY954 Y Y S N G N D AY9Tr1 Y F S N G N D AY9Tr2 N F S N G N D

174

AY9Tr3 Y F S N G N D AY9Tr4 N F S N G N D AY913 N F S N G N D AY928 Y Y S N G N D AY939 N Y S N G N D AY955 Y F S N G N D AY970 N F S N G N D AY990 Y Y S N G N D AY991 Y F S N G N D AYA40 Y Y S N G N D AYA41 Y F S N G N D AYA42 Y Y S N G N D AYA43 Y F S N G N D AYA44 N Y S N G N D AYA45 Y F S N G N D AYA46 N F S N G N D AYA47 N F S N G N D AYA48 Y F S N G N D AYA49 Y F S N G N D AYA50 N F S N G N D AYA51 N Y S N G N D AYA53 Y F S N G N D AYA54 N F S N G N D AYA56 Y Y S N G N D AYA58 Y F S N G N D AYA57 Y F S N G N D AY01B N Y S N G N D AY02B N Y S N S N D AY03B N F S N G Y D AY04B Y Y S N G N Y AY05B N F S N G N D AY06B Y F S N G N D AY07B N F S N G N D AY08B Y F S N G N D AY09B N Y S N G N D AY10B N F S N G N D AY11B N F S N G N D AY12B Y F S N G N D AY13B N Y S N G N D AY14B Y F S N G N D AY15B Y F S N G N D AY16B N Y S N G N D AY17B Y F S N G N D AY18B Y F S N G N D AY19B N Y S N G N D AY20B Y F S N G N D AY21B Y F S N G N D AY22B N F S N G N D AY23B N F S N G N D AY24B N F S N G N D

175

RESUME Depuis la constatation en 1986 des premiers cas de résistance de P. falciparum en Côte d'Ivoire, relativement peu d'études ont été

consacrées à l'évaluation de la chimiorésistance dans ce pays. Il nous a paru nécessaire de mettre en place un système de surveillance de la résistance de P. falciparum aux antipaludiques au moyen des tests d'efficacité thérapeutique à la chloroquine (CQ) et à la sulfadoxine-pyriméthamine (SP) d'une part, et des tests in vitro à la chloroquine, la pyriméthamine et à la quinine d'autre part. Une approche plus fondamentale basée sur la PCR et la RFLP à l'aide d'endonucléases spécifiques et du séquençage de fragments d'ADN des gènes dhfr, dhps, pfmdr-1 de chaque isolat de P. falciparum a aussi été réalisée.

L'étude de l'efficacité thérapeutique de la chloroquine a révélé 21,7 % d'échecs thérapeutiques précoces (ETP), 3,6 % d'échecs cliniques tardifs et 19,3 % d'échecs parasitologiques tardifs contre 55,4 % de réponses cliniques et parasitologiques adéquates (RCPA). 36,2 % des isolats mis en culture étaient chloroquino-résistants (CQ-R). Quant à la sulfadoxine-pyriméthamine, 23,6 % d'échecs thérapeutiques (ET) et 76,4 % de réponses cliniques adéquates ont été observés. 39 % des isolats testés in vitro étaient hautement résistants à la pyriméthamine (PYR). Par contre, aucun isolat quinino-résistant n'a été mis en évidence dans cette étude. L'analyse du polymorphisme de taille des fragments d'ADN des isolats de P. falciparum a révélé 100 % d'isolats K76T chez les enfants ayant un ET à la chloroquine et 71,4 % d'isolats K76T au sein des isolats CQ-R. Cependant, 11,8 % des enfants ayant une RCPA portaient des isolats pfcrt mutants. Les mutations affectant les gènes dhfr et dhps ont concerné respectivement 26,4 % et 93,4 % des isolats étudiés. Si les isolats dhfr mutants étaient portés par 85,7 % des enfants ayant un ETP, les mutants dhps étaient présents chez 100 % de ces enfants. De plus, 85,4 % de ces isolats dhfr mutants étaient hautement résistants à la PYR. En définitive, ces résultats reposent le problème de l'utilisation de la CQ et de la SP comme médicament de première et de deuxième intention en Côte d'Ivoire en général et à Abidjan en particulier. Notre travail peut servir de base de données au programme national de lutte contre le paludisme dans le pays pour une meilleure utilisation et une rationalisation des antipaludiques usuels. EVALUATION OF RESISTANCE OF FALCIPARUM MALARIA TO VARIOUS ANTIMALARIAL DRUGS (CHLOROQUINE, SULFADOXINE-PYRIMETHAMINE, QUININE) AND GENETIC PROFILE OF THE CORRESPONDING ISOLATES IN THE AREA OF ABIDJAN (CÔTE D'IVOIRE)

SUMMARY Since the notification in 1986 of the first cases of P. falciparum drug resistance in Côte d'Ivoire, relatively few studies have been

devoted to the assessment of chemio-resistance in the country. It appeared necessary to us to set up a process of monitoring. the resistance of P. falciparum to antimalarial drugs by use of the tests of therapeutic efficacy to chloroquine (CQ) and sulfadoxine-pyrimethamine (SP) on the one hand, and the in vitro tests to chloroquine, pyrimethamine and quinine on the other hand. A more fundamental approach based on the PCR, the RFLP using specific endonucleases and the sequencing of DNA fragments of dhfr, dhps, pfmdr-1 genes of P. falciparum isolates has been achieved.

The studies of the therapeutic efficacy of chloroquine revealed 21.7% of early therapeutic failures (ETF), 3.6% of late clinical failures (LCF) and 19.3% of late parasitological failures (LPF) against 55.4% of adequate clinical and parasitological responses (ACPR). 36.2% of the isolates were chloroquino-resistant (CQ-R) when cultivated. concerning the sulfadoxine-pyrimethamine, 23.6% of therapeutic failures (TF) and 76.4% of adequate clinical and parasitological responses were observed. 39% of the isolates tested in vitro were highly resistant to pyrimethamine (PYR). On the other hand, no quinino-resistant isolate was highlighted in this study. The analysis of size polymorphism of P. falciparum DNA fragments revealed 100% K76T of isolates from children with therapeutic failures to chloroquine and 71.4% of K76T isolates within the CQ-R isolates. However, 11.8% of the children having ACPR carried pfcrt mutant isolates. The mutations affecting the dhfr and dhps genes were found respectively in 26.4% and 93.4% of the isolates. The dhfr mutant were carried by 85.7% of the children having ETF, whereas the dhps mutants were present in 100% of these children. Moreover, 85.4% of these dhfr mutant isolates were highly resistant to PYR. Ultimately, these results set the problem of the use of the chloroquine and the sulfadoxine-pyrimethamine as first and second line drug in Côte d'Ivoire in general and in Abidjan in particular. These results could be used as a data-base for the National Program of Fight against Malaria in the country for a better use and the rationalization of usual antimalarial drugs. DISCIPLINE : Parasitologie SPECIALITE DOCTORALE : Interaction Hôtes-Parasites

MOTS CLES : Abidjan (Côte d'Ivoire), dihydrofolate réductase (dhfr), dihydroptéroate synthétase (dhps), pfcrt,

pfmdr1, Epidémiologie, Plasmodium falciparum, Résistance aux antipaludiques

FACULTÉ DE MEDÉCINE : 8, RUE DU GLE SARRAIL- 94000 CRETEIL TRAVAIL RÉALISÉ AU

-LABORATOIRE TGA, IBAIC, BAT. 447, UMR 8080, 91405 ORSAY (FRANCE)-