Università degli studi di padova
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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA
Dipartimento di Medicina
Dipartimento Medicina Animale, Produzioni e Salute
Corso di Laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico Presidente Prof. Ambrogio Fassina
TESI DI LAUREA
METODI INNOVATIVI DI VALUTAZIONE QUALITATIVA DEL SEME DI ARIETE DI RAZZE
VENETE A NUMEROSITA’ RIDOTTA
Relatore: Prof. Mario Pietrobelli Correlatore: Calogero Stelletta
Laureando:
Zucchini Paolo
ANNO ACCADEMICO 2011-2012
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INDICE
1. SCOPO DELLA RICERCA pag 3
2. INTRODUZIONE pag 4
2.1 Struttura dello spermatozoo pag 4
2.2 Cinetica dello spermatozoo pag 11
2.3 La crioconservazione del seme pag 14
2.4 Modificazione degli spermatozoi dopo congelamento pag 16
3. MATERIALI E METODI pag 21
3.1 Raccolta e congelamento del seme pag 21
3.2 Analisi Seminali pag 26
3.3 Analisi al Citofluorimetro pag 27
3.4 Reagenti pag 32
3.5 Preparazione dei campioni e lettura al citofluorimetro pag 34
4. RISULTATI e DISCUSSIONE pag 34
4.1 Conclusioni pag
5. BIBLIOGRAFIA pag
3
1.SCOPO DELLA RICERCA
Il presente studio è stato condotto per rilevare l’apoptosi degli spermatozoi di ariete dopo
congelamento con diverse tipologie di crioprotettori e tipologie di prelievo. Per lo studio si
è utilizzato lo strumento, il citofluorimetro, con due tipi di colorazione: annessina V e
ioduro di propidio. La annessina V è utilizzata per rilevare l’apoptosi, mentre lo ioduro di
propidio è utilizzato per rilevare la necrosi. Lo scopo dello studio è quello di verificare
quante cellule sono in una fase apoptotica e quante sono in fase di necrosi, valutando
l’effetto della crioconservazione e scongelamento degli spermatozoi di ariete sulla
frammentazione del DNA e sull’integrità di membrana per poter migliorare l’uso dei
crioprotettori.
La maggior parte delle cellule eucariote ha la capacità di auto-distruggersi mediante
l’attivazione di un suicidio, che prende il nome di morte cellulare programmata
(Programmed Cell Death, PCD) o apoptosi. Questo termine deriva da una parola greca,
“ptosi” significa caduta e “apo” significa “distacco”, quindi caduta per distacco che i Greci
utilizzarono per le foglie autunnali o per i fiori che sfioriscono. In medicina questo termine
è utilizzato per definire la morte cellulare programmata. Kerry nel 1972 pubblicò il primo
lavoro su questo fenomeno proprio per distinguerlo dalla necrosi, in cui le cellule si
gonfiano e si lisano rilasciando il materiale citoplasmatico nell’ambiente circostante, tra cui
enzimi lisosomiali che provocano infiammazione.
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Diversamente dalla necrosi, l’apoptosi è un processo strettamente controllato che richiede
l’attiva partecipazione della cellula destinata a morire e non si ha versamento del contenuto
citosolico all’esterno.
Coinvolta in diversi fenomeni quali l’embriogenesi, la risposta immunitaria, la PCD svolge
un ruolo di regolazione in quanto permette l’eliminazione delle cellule prodotte in numero
eccessivo, che sono sfuggite ai meccanismi di controllo del processo di sviluppo cellulare o
che hanno subito un danno genetico.
In condizioni patologiche si può avere una deregolazione dell’apoptosi e si possono
distinguere due casi: patologie associate a un aumento della sopravvivenza cellulare
(diminuzione dell’apoptosi) come avviene nei tumori, oppure patologie caratterizzate da un
eccesso di morte cellulare programmata, come per malattie virali o neurodegenerative
(AIDS; malattia di Alzheimer, morbo di Parkinson ecc.). In commercio è disponibile
un’ampia scelta di prodotti per lo studio dell’apoptosi sia in cellule in coltura e in situ.
Questi prodotti permettono di rilevare tutte le fasi di tale complesso processo; da eventi
precoci, come il cambiamento del potenziale di membrana mitocondriale, fino a eventi
tardivi come la frammentazione del DNA cromosomale.( 8 - Biotecnologie 2000 - Febbraio
2006)
2. INTRODUZIONE 2.1 Struttura dello spermatozoo.
Lo spermatozoo, o nemaspermio (dal Greco: nema=filamento; sperma=seme), è il gamete
maschile e la capacità di muoversi autonomamente, essendo una cellula dotata di una coda
mobile, è una delle sue caratteristiche peculiari. L’importanza di questa funzione ai fini
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della fertilizzazione è testimoniata dalla sua elevata conservazione nel corso
dell’evoluzione fino all’uomo (Yanagimachi 1994). La motilità dello spermatozoo si
realizza grazie alla peculiare struttura con cui è organizzato il flagello (Fig. 1).
Fig. 1 Schema di spermatozoo umano
Lo spermatozoo umano maturo, come quello di tutti i mammiferi, tra cui l’ovino, appare
costituito da tre domini: testa, collo, coda.
La testa è costituita a sua volta, dal nucleo e dall’acrosoma. Il nucleo, compatto e
condensato, contiene DNA con assetto cromosomico aploide ed è rivestito per due terzi dal
complesso acrosomiale. Tale struttura, a forma di cappuccio, è costituita da una membrana
acrosomiale interna a contatto con la membrana nucleare e da una membrana acrosomiale
esterna posta al di sotto della membrana plasmatica. L’acrosoma deriva dal corpo del Golgi
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dello spermatide e risulta indispensabile per la penetrazione ovocitaria grazie al suo
contenuto di enzimi litici.
La membrana plasmatica, che avvolge acrosoma e nucleo, mostra al microscopio
elettronico il consueto aspetto trilaminare; sulla superficie esterna è stratificato uno spesso
rivestimento glicoproteico (‘sperm coating substances’).
Il collo, rappresentato da un breve tratto, lungo solo 1 µ, si estende dalla parte posteriore
della membrana nucleare fino al punto di unione del segmento intermedio della coda con la
testa e contiene i residui citoplasmatici dello spermatide (precursore aploide dello
spermatozoo).
Tra gli elementi importanti contenuti nel collo c'è un centriolo in posizione trasversale
rispetto all'asse di simmetria dello spermatozoo, chiamato centriolo distale (l'altro centriolo,
il centriolo prossimale, è scomparso dopo aver dato origine al flagello), e una placca basale
di materiale denso dove si ancorano 9 colonne segmentate fibrose a costituzione proteica
che si continuano per tutta la coda.
La coda si divide in un “segmento intermedio” lungo 5-6 µ, in un “segmento principale”
lungo 45 µ ed in un “segmento finale” lungo 5µ. Nell’ovino le dimensioni sono: segmento
principale 40-45µ, segmento finale 8,2µ, intermedio 14µ.
E’ costituita dal complesso filamentoso assiale o assonema composta da una coppia di
microtubuli situata in posizione centrale e nove coppie disposte alla periferia
(organizzazione 9+2) (Fig. 2).
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Fig. 2 Schematizzazione della organizzazione 9+2 dell’assonema
Tale complesso di filamenti percorre tutta la lunghezza della coda.
A livello del tratto intermedio tale sistema è avvolto da nove fibre dense esterne, che si
presentano sottili nella zona a contatto con i microtubuli ed aumentano di spessore man
mano che si approssimano alla superficie esterna; tali fibre, a loro volta, sono circondate,
solo a livello del tratto intermedio, da un manicotto di mitocondri, definito guaina
mitocondriale, essenziale per la respirazione dello spermatozoo e per la produzione di
energia. Il segmento intermedio è separato dal segmento principale da una struttura detta
annulus, un anello di materiale denso che aderisce alla membrana del flagello.
A livello del segmento principale l’assonema e la fibre esterne sono circondate da una
guaina fibrosa composta da due colonne di fibre dense che si continuano con una struttura
circolare che avvolge le altre sette colonne rimanenti; tale struttura non è continua lungo il
decorso del flagello ma si interrompe a intervalli regolari. La sua interruzione definitiva
segna l'inizio del tratto terminale che è costituito dall’assonema rivestito unicamente della
membrana plasmatica.
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Lo spermatozoo umano maturo, lungo circa 60 µm (lungo circa 62,7-67,2µm nell’ovino), è
una cellula priva di reticolo endoplasmatico, di apparato di Golgi, di lisosomi, di
perossisomi, di inclusioni e di molte altre strutture cellulari.
La perdita di questi organuli riduce sia la massa che le dimensioni cellulari; riduzione
necessaria per realizzare con minore consumo energetico il trasporto del materiale genetico.
La durata della spermatogenesi è, nell’uomo, di circa 74 giorni (di circa 60 giorni
nell’ovino). Immediatamente dopo l’eliminazione della maggior parte del citoplasma, gli
spermatozoi si liberano nel lume del tubulo seminifero spinti dalla pressione del liquido
seminale. A questo punto lasciati i tubuli seminiferi che a livello dell’ilo assumono un
andamento rettilineo e perciò definiti tubuli retti, gli spermatozoi attraversano la rete testis,
una sorta d’inizio delle vie spermatiche, i canali efferenti, l’epididimo, il canale deferente o
dotto di Wolff e l’uretra al termine della quale abbandonano il corpo. Durante tale tragitto,
precisamente a livello dell’epididimo, gli spermatozoi subiscono un’ulteriore fase di
maturazione (Glover et al., 1974; Cooper et Orgebin-Crist, 1975).
In sede epididimaria: acquisiscono motilità che normalmente deve essere di tipo rettilineo
rapido, con una velocità media di circa 40 µm al secondo. Precisamente a livello della testa
epididimaria il flagello incomincia a compiere dei movimenti di maggiore ampiezza (15-16
µm) rispetto a quelli osservati a livello testicolare (6-7 µm) e gli spermatozoi incominciano
a mostrare movimenti propulsivi, tracciando delle traiettorie circolari o del tutto irregolari.
Durante il transito nell’epididimo la frequenza e l’ampiezza (18-19 µm) del movimento del
flagello aumentano sensibilmente, per cui la motilità nemaspermica diventa progressiva. È
importante ricordare che vari fattori contribuiscono allo sviluppo di tale caratteristica dei
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gameti, quali: l’aumento dell’osmolarità e la diminuzione del pH, l’aumento
intraspermatico di ioni calcio e di cAMP, la stabilizzazione, di numerose strutture dello
spermatozoo, quali il flagello, la guaina mitocondriale del segmento intermedio, le
membrane mitocondriali esterne, le fibre dense accessorie dell’assonema cambiano
metabolismo acquisendo, infatti, la capacità di sfruttare come fonte di energia fruttosio,
sorbitolo e glicerilfosfato che viene prodotto a partire dalla glicerofosfocolina da un enzima
presente nelle vie genitali maschili. Il fruttosio può essere utilizzato sia in condizioni
aerobiche che anaerobiche, il sorbitolo, invece, soltanto in condizioni aerobiche.
Al termine di tali cambiamenti gli spermatozoi stazionano a livello della coda
dell’epididimo come in un serbatoio di riserva e solo al momento dell’eiaculazione, si
uniscono al plasma seminale, che è il prodotto dell’azione secretoria combinata delle
ghiandole accessorie del tratto genitale maschile (vescichette seminali, prostata, ghiandole
bulbouretrali o ghiandole di Cowper) che apportano nutrienti necessari alla motilità e
producono secreti ad effetto tampone che contrastano l’acidità presente nell’uretra e nella
vagina. Le varie secrezioni non vengono emesse all’esterno in maniera casuale e
disordinata, ma seguendo una ben precisa successione: il primo secreto espulso è il
prostatico al quale segue quello epididimario (ricco di spermatozoi) e infine quello
vescicolare (Eliasson et Lindholmer, 1976; Tauber et al., 1975).
E’ stato dimostrato che numerose sostanze possono esercitare effetti tossici sulla
formazione e maturazione dei gameti maschili. Fra i danni provocati alla spermatogenesi
ricordiamo quelli derivanti da terapie farmacologiche basate sull’impiego di antibiotici,
antinfiammatori, ansiolitici, antidepressivi, antiulcera, antineoplastici ecc.; dal contatto e
dal conseguente assorbimento di tossici ambientali quali pesticidi, coloranti, composti
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chimici organici ed inorganici, inquinanti atmosferici . I difetti strutturali diffusi della coda
dello spermatozoo di origine congenita sono responsabili di un’alterata o assente motilità
spermatica. Singoli difetti della coda che interessano l’intera popolazione spermatica sono
associati ad immobilità totale dello spermatozoo (Zamboni 1987 ,Zamboni 1991 Ryder et
al. 1990) per assenza di motilità progressiva, mentre difetti misti a carico di differenti
segmenti della coda generalmente determinano severa astenozoospermia (Ryder et al. 1990
Chemes 2000) e possono essere associati a difetti misti della testa. La reale prevalenza di
tali anomalie nella popolazione degli uomini affetti da ridotta o assente motilità spermatica
è ancora poco nota. Il sospetto di una simile patologia impone innanzitutto, la necessità di
dover ricorrere ad un tipo di indagine particolare quale l’analisi ultrastrutturale dello
spermatozoo con microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Tuttavia, gli elevati costi
di questa indagine e l’esiguo numero di centri di riferimento con esperienza provata
impongono una selezione dei casi da esaminare.
Parametri seminali normali nella specie ovina Gli arieti raggiungono la maturità della
spermatogenesi da un anno di età e le ganadotropine e gli ormoni steroidei sono coinvolti
nel processo di iniziazione e mantenimento del processo della spermatognesi. La
concentrazione sierica del testosterone sale lentamente dopo la nascita fino a 20 settimane
di età, successivamente vi è un rapido aumento, a partire da 20-35 settimane di età.
L’’endpoint” per lo sviluppo puberale viene fatto coincidere con la produzione di un
eiaculato che abbia almeno 50 milioni di spermatozoi e con più del 10% di motilità
progressiva.
L’ormone follicolo-stimolante (FSH) e l’ormone leutinizzante (LH) sono le principali
proteine responsabili nella regolazione della spermatogenesi nel maschio. Entrambi gli
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ormoni vengono prodotti e immagazzinati nelle cellule gonadotrope nell’adenoipofisi e
sono secrete in risposta al fattore di rilascio delle gonadotropine (GnRH) dall’ipotalamo. La
presenza di recettori FSH nel testicolo è limitata alle cellule del Sertoli, mentre recettori
LH si trovano principalmente nelle cellule di Leydig, anche se sono presenti nelle cellule
della spermatogenesi. L’FSH stimola la proliferazione delle cellule del Sertoli e di
conseguenza ha un effetto sul numero di cellule germinali.
L’LH stimola la secrezione di testosterone da parte delle cellule di Leydig e modula il
flusso di sangue nei testicoli. Il testosterone e i suoi metaboliti sono indicati come ormoni
sessuali e nel maschio, il testosterone assume il ruolo principale nello sviluppo morfologico
e funzionale dei testicoli.
2.2 Cinetica dello spermatozoo
Come in tutti i mammiferi, anche nell'uomo il movimento dello spermatozoo è di tipo
flagellare e consiste in una serie di onde che si originano alla base del flagello e si
propagano lungo quest'ultimo, per cui la testa viene spinta in avanti passivamente con
oscillazioni ritmiche di ampiezza regolare (Katz and Overstreet, 1979; Amelar, 1980). La
progressione dello spermatozoo nello spazio è in realtà dovuta alla sommazione di due tipi
di movimento, uno oscillatorio ed uno rotatorio intorno all’asse longitudinale della cellula,
che originano nel collo e percorrono la coda in tutta la sua lunghezza. La motilità
rappresenta senza dubbio una proprietà fondamentale dello spermatozoo che insieme alle
contrazioni del tratto genitale femminile consentono il passaggio degli spermatozoi
attraverso la cervice e l’utero (Hunter 1980). Inoltre, anche, il passaggio attraverso la
giunzione utero-tubarica e lungo la tuba richiede la motilità degli spermatozoi, mentre
l’accentuato movimento a frusta è indispensabile per la penetrazione nel cumulo e nella
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zona pellucida. Nell’analisi seminale la motilità viene valutata al microscopio ottico.
Devono essere valutati almeno venti campi microscopici per preparato e, comunque, non
meno di 100 elementi nemaspermici. Nei campioni a bassa concentrazione risulta
indispensabile ripetere la valutazione su vari preparati. È peraltro necessario valutare non
soltanto la percentuale di forme mobili, ma anche il tipo di motilità, che normalmente deve
essere di tipo rettilineo rapido, cioé con una velocità media di circa 40 µ al secondo.
Quando la velocità media è significativamente al di sotto di tali valori, ma il movimento è
sempre di tipo rettilineo, la motilità viene definita rettilinea lenta. La motilità non rettilinea,
viene definita come discinetica; nei casi in cui non vi è uno spostamento reale dello
spermatozoo nello spazio, si parla di motilità agitatoria in loco o in situ.
Una caratteristica importante è la persistenza della motilità totale nel tempo: in condizioni
normali, se la situazione chimico-fisica del plasma seminale lo consente, essa si mantiene al
di sopra del 30-35% alla 24° ora. Il campione seminale deve essere naturalmente
conservato a temperatura costante, preferibilmente a 35°C, dal momento che le temperature
superiori aumentano la velocità riducendone la durata nel tempo per un maggiore consumo
energetico, mentre risultati opposti si ottengono a temperature più basse di 25°C.
La motilità deve essere distinta dalla vitalità nemaspermica. Infatti, gli spermatozoi per
essere vitali non debbono essere necessariamente mobili. Un classico esempio di tale
situazione è rappresentato dalla mancanza congenita dei bracci di dineina nell'assonema
nemaspermico. In tale condizione gli spermatozoi possono essere vitali, ma sono totalmente
immobili (acinesi).
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Per ottenere l’energia necessaria alla motilità e al mantenimento di gradienti ionici di
membrana (Harrison 1977), lo spermatozoo metabolizza molecole semplici, principalmente
zuccheri e loro derivati (fruttosio, glucosio, mannosio e piruvato), attraverso la via aerobica
e anaerobica.
L’attività cinetica degli spermatozoi è l’espressione di un complesso processo molecolare
comprendente:
1) ossidazione di substrati energetici (Ruiz-Pesini et al. 1998; Ruiz-Pesini et al.2000);
2) metabolismo ciclico di nucleotidi e fosforilazione di proteine coinvolte nella traduzione
del segnale attraverso la membrana plasmatica (Aoki et al. 1999, Luconi et al. 2001; Uma
Devi et al. 2000);
3) la conversione di energia chimica in energia meccanica a livello del complesso
assonemale (Gagnon 1995).
Una motilità ridotta o assente ,(astenozoospermia), è una causa frequente di infertilità
maschile (Bourgeron 2000, Irvine 2000, Mundy et al. 1995) e rappresenta un segno clinico
piuttosto che una vera e propria diagnosi. Ci sono molti fattori morfologici, biochimici e
molecolari responsabili della normale motilità degli spermatozoi, quindi le possibili cause
di astenozoospermia possono essere diverse e nella gran parte dei casi non solo difficili da
stabilire ma rimangono anche inspiegabili (Courtade et al. 1998). L’astenozoospermia,
infatti, può essere causata da alterazioni strutturali, da alterazioni delle vie metaboliche che
forniscono energia, da alterazioni ormonali e da difetti genetici. Infatti ci possono essere
alterazioni funzionali e /o morfologiche mitocondriali che forniscono energia (Bourgeron
2000, Mundy et al. 1995, Rawe et al. 2001) o difetti strutturali del flagello (Chermes et al.
1998). Peraltro, ad oggi non sono ancora noti i meccanismi alla base dell’astenozoospermia
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ed in particolare la comprensione dei processi molecolari ci permetterebbe di affrontare il
problema da un punto di vista clinico con trattamenti terapeutici mirati , per es. stimolando
importanti vie di trasmissione energetiche o mediante terapia genica, piuttosto che superare
il problema con la Fecondazione Assistita.
2.3 La crioconservazione del seme
I primi successi nell’ottenere spermatozoi vivi dopo averli congelati e scongelati risalgono
alla metà del secolo scorso, ad opera di Smith e Polge (1950) su seme bovino. Nel 1951
nacque il primo vitello derivante da un’inseminazione artificiale con seme congelato
(Stewart, 1951).
La crioconservazione degli spermatozoi è una potente tecnica che offre innumerevoli
possibilità, rendendo inutile il trasferimento degli animali e rendendo possibile l’impiego
del seme quando necessario, ottenendo inoltre da un solo eiaculato, più dosi inseminanti.
Per ottenere la più rapida diffusione di individui con un buon corredo genetico,
l’inseminazione artificiale (IA) con seme congelato è stata usata commercialmente nei
bovini da latte per decenni. E’ una tecnica estremamente utile anche per la conservazione
del prezioso patrimonio genetico di maschi di alta fertilità o per preservare il genoma di
razze in via di estinzione.
Ad oggi, nella specie bovina, si ottengono buoni risultati di fertilità con IA con seme
congelato rispetto all’ accoppiamento naturale.
In altre specie di ruminanti come pecore, capre, bufali ed anche nei camelidi, la
crioconservazione per IA è commercialmente limitata.
La crioconservazione degli spermatozoi è una tecnica che da più di 50 anni rappresenta un
importante metodica per la valutazione e salvaguardia della fertilità maschile. La tappa più
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importante della crioconservazione del liquido seminale fu la scoperta di Polge (Polge C,
Smith AU 1949) dell’efficacia del glicerolo come agente crioprotettivo per il seme bovino.
Poco tempo dopo Sherman dimostrò con successo la crioconservazione degli spermatozoi
umani in ghiaccio secco (a-78°C), seguita da un normale scongelamento. Sempre Sherman
descrisse l’uso di vapori di azoto liquido per il congelamento e ottenne la prima gravidanza
attraverso l’inseminazione intra-uterina con spermatozoi congelati. (Bunge RG, Sherman JK.
1953). Da allora ci sono stati molti sviluppi nelle metodiche che hanno portato al
perfezionamento della tecnica di crioconservazione.
La crioconservazione è un metodo che comporta un elevato livello di adattamento delle
cellule biologiche, per una serie di cause, come diluizione, incubazione, il raffreddamento,
il congelamento o lo scongelamento, che causano alterazioni strutturali, biochimiche e
funzionali degli spermatozoi (Watson et al., 1992 ; Holt 2000). La capacità di una cellula,
infatti, di sopravvivere al congelamento dipende dalla sua forma e dimensione, dalla
quantità d’acqua in essa contenuta e dalle proprietà permeabili della membrana. Il
congelamento è un evento stressante per tutti i tipi di cellule, ma gli spermatozoi, grazie al
piccolo volume cellulare e alla compatta organizzazione cellulare della testa
(eterocromatizzazione del nucleo e scarso citoplasma), subiscono pochissime variazioni di
struttura durante tale processo. Nonostante questo, al momento dello scongelamento, essi
presentano alcune alterazioni e una riduzione della motilità (30%-50%). Inoltre ogni
campione seminale non avrà più le stesse capacità fecondanti e potranno verificarsi
variazioni di qualità anche tra campioni diversi appartenenti allo stesso paziente. Le
variazioni della qualità post-congelamento non dipendono dalla tecnica di congelamento
utilizzata, ma dalle caratteristiche biochimiche del campione stesso. Infatti, migliori sono le
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caratteristiche basali del liquido seminale, migliori saranno i risultati in termini di recupero
di spermatozoi mobili, pur utilizzando metodiche di congelamento e scongelamento
differenti che creano il minor danno cellulare possibile.
L'obiettivo di un protocollo di crioconservazione è quello di preservare spermatozoi
biologicamente funzionali che poi dovranno sopravvivere nell'ambiente uterino seguendo
quello che succede in una inseminazione naturale, quindi essere trasportati passivamente
all’ ovidotto, e mantenuti lì finché non arrivino in contatto con l'ovocita, anche grazie a
movimenti propri, per poi penetrare nell’ovocita e essere in grado di produrre un embrione
vitale.
2.4 Modificazioni degli spermatozoi dopo congelamento
A dispetto di uno sviluppo estensivo di protocolli di crioconservazione, la fertilità che si
ottiene con seme congelato-scongelato non è sempre paragonabile a quella ottenuta con
seme fresco. La riduzione della fertilità dopo crioconservazione è dovuta sia a una
diminuzione di vitalità degli spermatozoi, sia a una disfunzione subletale della popolazione
superstite (Watson, 2000), per effetto di maggiori anomalie morfologiche e genomiche
indotte dal gelo-disgelo, e dal tasso di riduzione della motilità degli spermatozoi (Pèrèz. Pe
etal,2002;.Martinetal,2004).
L’eiaculato è costituito da una popolazione eterogenea di cellule, in grado di raggiungere il
loro pieno potenziale di fertilità a ritmi diversi all'interno del tratto femminile e quindi
aumentare le probabilità che uno spermatozoo fertile fecondi un ovocita. Generalmente,
circa 40-50% della popolazione spermatica non sopravvive dopo congelamento-
scongelamento (Watson, 2000). Nei montoni, lo sperma congelato-scongelato può avere
una percentuale elevata (40-60%) di cellule mobili, anche se solo il 20-30% rimane
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biologicamente funzionale (Medeiro et al., 2002). Il problema biologico della
crioconservazione di materiale cellulare è rappresentato dal possibile danno che le basse
temperature provocano sulle cellule nemaspermatiche. Per ovviare a tali danni si ricorre a
metodologie che proteggano il materiale biologico dallo shock termico( uso di sostanze
crioprotettive e idonei tempi e procedure di congelamento e scongelamento).
In campo seminologico, la possibilità di congelare la cellula namaspermatica è basata
sull’impiego di vari terreni di crioconservazione. Questi hanno in comune di preservare lo
spermatozoo dalla disidratrazione e dall’aumento della concentrazione e dall’aumento di
concentrazione di sali (glicerolo, glicina, saccarosio, ecc.) e di ottimizzare l’osmolarità nei
fluidi extracellulari.( zuccheri, sali, ecc). La cinetica di entrata e di uscita del crioprotettore
dipende dalla temperatura. L’interazione del crioprotettore con il calo di temperatura
dipende dalla permeabilità all’acqua della membrana così come dalla superficie e dal
volume della cellula considerata.
Crioprotettori. Il glicerolo è il crioprotettore più utilizzato per gli spermatozoi sia umani
che in zootecnia. Esso è un crioprotettore permeante che agisce sulla struttura della
membrana sulla permeabilità e stabilità del doppio strato lipidico, sull’associazione delle
proteine di superficie e sul metabolismo cellulare. Se usato da solo dà un risultato
sfavorevole per la sopravvivenza, per la membrana e per l’acrosoma, ma il suo utilizzo
permette anche il congelamento di spermatozoi di scarsa qualità. Studi di Sherman hanno
messo in evidenza che l’utilizzo di solo glicerolo provoca alcune alterazioni come: la
presenza di una membrana ondulata, la membrana acrosomale interna non si presenta più
parallela alla membrana esterna, il nucleo appare disomogeneo, si presentano alterazioni ai
mitocondri, le creste appaiono disorganizzate( Sherman JF. Keel B, Webster BW. 1990).
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Gli zuccheri: sono crioprotettori non permanenti. Sono molecole molto grandi con elevato
peso molecolare, che sfavoriscono la disidratazione cellulare durante il raffreddamento.
Hanno diverse funzioni: contribuiscono all’osmolarità, forniscono energia allo
spermatozoo, infatti il glucosio e il fruttosio sono zuccheri glicosilabili perciò ossidabili per
lo spermatozoo.
Proteine e Lipidi: Permettono di diminuire la concentrazione di glicerolo. Il tuorlo d’uovo
di gallina, che viene spesso incluso nel medium di crio-conservazione, non è di per sé un
crioprotettore, ma sembra conferire maggiore fluidità alle membrane citoplasmatiche degli
spermatozoi, grazie alla componente fosfolipidica delle proteine; ripara la membrana
scambiando acidi grassi con la membrana stessa; controlla la concentrazione di ioni Ca2+
intracellulare diminuendone l’accumulo dovuto al freddo(protegge le membrane sia dal
punto di vista funzionale che strutturale). E’ presente in quasi tutti i medium dal 3% al 25%
secondo la specie.
Antiossidanti: evitano la perossidazione lipidica creando dei legami con dei lipidi insaturi,
ma in realtà essi sono tossici ed interferiscono con la fluidità della membrana.
Detergenti non ionici: solubilizzano il tuorlo d’uovo.
Elettroliti e sali: favoriscono la disidratazione.
Agenti antimicrobici: a largo spettro, per evitare la proliferazione microbica. Lo scopo è di
eliminare la flora patogena che produrrebbe delle tossine utilizzando i differenti
componenti del diluente come substrato metabolico.
Altre sostanze: enzimi (amilasi) e stimolanti metabolici ( caffeina, callicreina,
prostaglandine).
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Qualunque sia la metodica di congelamento utilizzata (metodo rapido, o metodo veloce) è
indispensabile effettuare correttamente tutte le fasi pre e post crioconservazione per
ottenere il miglior risultato. Tali fasi prevedono uno studio seminologico accurato, la scelta
del terreno crioprotettivo più adeguato, il corretto condizionamento propedeutico al
congelamento e, infine, lo scongelamento.
Per condizionamento si intende le fasi di aggiunta del crioprotettore al liquido seminale. Il
volume di crioprotettore aggiunto è in genere pari al volume del liquido seminale da
crioconservare. E’ necessario che il terreno di crioconservazione interagisca con le cellule,
infatti, l’efficacia delle sostanze crioprotettrici è anche in funzione al tempo di interazione
tra il crioprotettore e le cellule. Per evitare shock osmotici, il terreno crioprotettivo viene
aggiunto goccia a goccia e miscelato delicatamente a temperatura ambiente, poi viene
posto e a 37°C per 10-15 minuti per permettere l’equilibrazione tra le cellule e il terreno. La
tecnica di scongelamento è altrettanto importante, perché deve consentire alle cellule di
recuperare le normali attività biologiche limitando il più possibile rapide differenze di
temperatura. Infatti, al fine di evitare bruschi sbalzi termici è necessario estrarre lentamente
le pailettes dall’azoto liquido e consentire il raggiungimento dell’equilibrio termico tra
materiale cellulare e ambiente esterno. Attualmente vengono impiegate varie tecniche di
scongelamento, tra cui ricordiamo: lo scongelamento a T ambiente per 10 minuti e il
successivo passaggio in termostato a 37°C per altri 10 minuti; lo scongelamento in
termostato in bagnomaria a 37°C per 10 minuti; lo scongelamento a T ambiente (22°C) per
15 minuti. Una volta scongelato il liquido seminale viene separato dal terreno di
crioconservazione mediante lavaggi con il terreno di coltura e centrifugazione. Dopo il
congelamento sia lento che veloce, cioè utilizzando diverse curve di discesa della
20
temperatura, negli spermatozoi di montone, è meglio conservata la motilità che l'integrità
morfologica. L'architettura mitocondriale è alterata, ma il filamento della coda e le fibrille
non mostrano alcun cambiamento rilevabile (Salamon and Maxwell, 2000).
Come precedentemente detto, durante il processo di crioconservazione, gli spermatozoi
subiscono enormi insulti chimici e fisici come temperatura ridotta, formazione di cristalli di
ghiaccio intercellulare (che sono letali per le cellule), disidratazione cellulare, lesioni
osmotiche durante l'aggiunta e la rimozione dei crioprotettori, mostrando tutti gli stessi
danni(GaoeCrister,2000;Gilmoreetal,2000;.Watson,2000).
Gli spermatozoi sottoposti a crioconservazione sono molto sensibili a una rapida riduzione
della temperatura da 25 a 5 ° C (Watson, 1981). Questo produce uno shock termico, una
transizione e alterazione di fase della membrana (Morris et al., 1987) e influenza la
asimmetria dei fosfolipidi con una rottura che risulta molto marcata. La perdita della
permeabilità selettiva e dell'integrità della membrana plasmatica porta a esposizione e
riorganizzazione dei siti di legame di actina (Holt e Nord, 1991), ridistribuzione degli ioni,
e cambiamenti nelle membrane acrosomiale e mitocondriale, riduzione del pH e del
metabolismo cellulare e la perdita della motilità (Quinn e White, 1966; Pickett e Komarek,
1967; Watson, 1995; Gadea, 2003).Questo potrebbe spiegare la riduzione della fertilità con
spermatozoi crioconservati nei piccoli ruminanti.
Gli effetti dannosi di raffreddamento e congelamento sulla membrana degli spermatozoi
variano da specie a specie ed sono influenzati da diversi elementi e cioè, dal rapporto
colesterolo / fosfolipidi, dal contenuto di lipidi nel doppio strato, dal grado di saturazione
degli idrocarburi e dal il rapporto di proteine / fosfolipidi (Medeiro et al. 2002 ). Lo
scongelamento inverte il processo di congelamento, costringendo la cellula a ripercorrere il
21
suo percorso a ritroso attraverso i vari ambienti incontrati (Quinn e White, 1966) e il flusso
di acqua conseguente può alterare la membrana. Dopo scongelamento il seme diventa più
sensibile alla perossidazione lipidica rispetto al seme fresco (Trinchero et al., 1990), per
effetto delle modifiche di membrana prodotte durante il processo di crioconservazione.
Molto recentemente, Martin et al. (2006) hanno osservato che la morte cellulare e
l’aumento della permeabilità della membrana dopo la crioconservazione potrebbe non
essere unicamente dovuta alla formazione di ghiaccio ma anche a causa di un ipotetico
processo di apoptosi nelle cellule spermatiche. E’ stato osservato che le caratteristiche di
eventi apoptotici sono comparse negli spermatozoi di toro durante il processo di
crioconservazione, come una diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale
(MMP), osservati immediatamente dopo la diluizione nel mezzo di crioconservazione,
attivazione delle caspasi, dopo cambiamenti nella permeabilità della membrana e dopo il
completo processo del congelamento/scongelamento si è arrivati all’evento apoptotico
come la morte. Molti studi hanno confermato come, velocità di raffreddamento e
congelamento, il tipo di agenti crioprotettivi e la loro concentrazione, la composizione
dell’extender’, i tassi di diluizione, la temperatura alla quale viene aggiunto il crioprotettore
al seme, il tempo di equilibrio, e la velocità di scongelamento sono considerati molto
importanti per il successo della crioconservazione (Mazur, 1994, Salamon e Maxwell,
1995; Aisen et al, 2000;. Paulenz et al, 2004;. Anel et al, 2005)..
3. MATERIALI E METODI
3.1 Raccolta e congelamento del seme
22
Sono stati utilizzati in questo studio adulti fertili di ariete di razze diverse: Alpagota,
Lamon, Brogna Vicentina o Foza. Inoltre si sono utilizzati 31 soggetti di arieti adulti di
razze Venete in via di estinzione, da cui sono stati prelevati i testicoli al momento della
macellazione.
Si sono dunque eseguite due metodologie di prelievo del seme: mediante
elettroeiaculatore,sui soggetti vivi, e dall’epididimo, post mortem.
Ogni eiaculato è stato diviso in due parti e trattato con due differenti extender commerciali
( Tryladil e Andromed) per un totale di 31 animali di cui 13 il seme prelevato
dall’ipididimo e 18 il seme prelevato con l’elettroeiaculatore.
L’extender Tryladil è composto da TRIS, glicerolo ( crioprotettore), fruttosio, antibiotici,
acido citrico e prevede l’aggiunta di tuorlo d’uovo, mentre l’Andromed è composto da
TRIS, glicerolo, fruttosio, antibiotici, acido citrico e fosfolipidi come protettori di
membrana al posto del tuorlo d’uovo.
Elettroeiaculazione
Si è utilizzato un elettroeiaculatore “Ruakura Ram Probe”.
Sviluppato per prelievi su arieti. Si tratta di uno strumento costituito da un tubo di vetro al
cui interno è alloggiato un circuito elettrico. Il primo tubo si collega ad un secondo in
metallo che ha funzione di sostegno e che alloggia 4 batterie da 3 Volt ciascuna, per un
totale di 12 Volt. Alla base del sostegno è posto un pulsante, facendo pressione su questo si
provoca il contatto delle batterie con il circuito elettrico, in questo modo la corrente può
passare. All’apice del tubo di vetro si trovano due elettrodi ad anello posti a distanza di un
centimetro.
23
Per eseguire il prelievo, l’ariete è stato contenuto, il retto è stato svuotato dalle feci e sono
stati inseriti nel retto 6 ml di lidocaina al 2% al fine di anestetizzare localmente la mucosa
rettale. Per esplorazione rettale è stata localizzata la prostata. L’elettroeiaculatore è stato
quindi inserito nel retto in modo che i 2 elettrodi si localizzassero dorsalmente alla parte
mediale della prostata. La stimolazione è stata eseguita applicando stimoli di 3 secondi
intervallati da un secondo di intervallo fino all’avvenuta eiaculazione, che di solito ha luogo
nell’arco di 10-12 stimolazioni. La tecnica è risultata essere ripetibile e pressochè
atraumatica per l’animale. L’eiaculato è stato raccolto per mezzo di una guaina conica in
lattice collegata all’estremità con un tubo graduato.
Il seme viene mantenuto a 37°C e sottoposto a valutazione visiva macroscopica: misura del
volume, colore, presenza di tracce di sangue o di odori anomali di urina; successivamente,
con l’osservazione microscopica vengono valutati i parametri spermatici che ne
determinano la congelabilità. I principali parametri valutabili sono: motilità di massa degli
spermatozoi (con punteggio variabile da 0 a 3).
I campioni ottenuti con una concentrazione maggiore di 3 miliardi di spermatozoi/ml e un
punteggio di massa maggiore di 2 sono stati considerati idonei per la preparazioni di dosi
da sottoporre al congelamento. I campioni, quindi, sono stati divisi in aliquote, una a cui è
stato aggiunto il diluente commerciale Triladyl e l’altro il diluente Andromed.
Il seme diluito aspirato in “cannuccie” (pailettes), tubi di plastica crio-resistenti, da 0,25 o
da 0,5 ml, ad una diluizione finale di 80 milioni di spermatozoi per pailettes. Dopo la
chiusura le pailettes vengono stabilizzate a 4°C per 2 ore e successivamente esposte a
vapori di azoto ( -75°C) per 5 minuti prima di essere definitivamente immerse in azoto
liquido.(-196°C). Alcune pailettes sono state scongelate a bagnomaria a 37°C per 60
24
secondi, al fine di valutare sia le caratteristiche spermatiche post scongelamento. Le dosi
del seme così conservate sono utilizzabili quando neccessario per inseminare le pecore, che
devono essere opportunamente preparate, ovvero con estro sincronizzato
farmacologicamente.
L’inseminazione artificiale negli ovini avviene principalmente per via laparoscopica, cioè
depositando il seme, direttamente a livello delle corna uterine vicino all’ovidotto dove
avverrà la fecondazione.
Prelievo dall’epididimo
I testicoli sono stati trasportati al laboratorio in soluzione salina ad una temperatura di 4° C
entro 4 a 6 ore post-mortem. Dall’arrivo in laboratorio gli epididimi sono stati separati dai
testicoli. I testicoli sono stati valutati e i montoni con testicoli anatomicamente anormali
non sono stati utilizzati in questo studio.
Il materiale seminale è stato raccolto dall’epididimo, il tratto iniziale del dotto escretore dei
testicoli, dove gli spermatozoi transitano dopo essersi formati a livello del parenchima
testicolare; in questa porzione anatomica quindi si possono trovare spermatozoi a diverso
stadio di maturazione. Dopo averlo separato dal testicolo, l’epididimo viene aperto
attentamente in condizioni di sterilità e il materiale seminale raccolto mediante il taglio
della coda dell’epididimo questo viene prima miscelato con una soluzione idonea al suo
mantenimento (comunemente definito mestruo) e successivamente sottoposto a valutazione
qualitativa.
Nell’analisi microscopica il materiale seminale è stato valutato in base a diversi parametri
(concentrazione di spermatozoi, motilità prima e dopo l’aggiunta di glicerolo, presenza di
25
malformazioni, ecc.) al fine di definirne la qualità complessiva e il numero di dosi utili
ottenibili da sottoporre a crioconservazione.
Per ciascun testicolo, la coda dell’epididimo è stata selezionata tagliando il vaso deferente
del corpo dell'epididimo (Figura-3). Alla dissezione, ogni coda è stata lavata con soluzione
fisiologica per togliere qualunque materiale residuo prima dell’estrazione degli spermatozoi
dell'epididimo. I campioni di ogni coda sono stati poi lavorati con gli extender (Tryladil e
Andromed). Gli spermatozoi dell'epididimo sono stati raccolti facendo 5-6 incisioni con
una lama chirurgica nella coda. La struttura, posta in una piastra Petri, è stata quindi irrigata
con il terreno di diluizione per per raccogliere la massima concentrazione di sperma. La
soluzione di spermatozoi è stata trasferita in una provetta da 15 ml e posta in un bagno
maria a 37° C per 15 minuti per analisi della qualità seminale.
I campioni prelevati dall’epididimo dei testicoli di un soggetto sono stati divisi in due
aliquote e destinati alla diluizione con due extenderd.(Tryladil e Andromed).
Figura 3. Raccolta dello sperma da epididimo.
26
La concentrazione è stata portata a 400 x 106 spermatozoi/ml con l'aggiunta degli
extender. La provetta contenente il campione di spermatozoi dell'epididimo è stata posta in
un bicchiere di vetro contenente acqua e il becher è stato posto in un frigorifero per il
raffreddamento a 4° C per 2 ore. Tutti i campioni sono stati caricati in pailettes da 0,25 ml
con una concentrazione di 100x106 spermatozoi / ml. Poi le pailettes sono state poste a 4°
C per ulteriori 2 ore di equilibratura. Trascorso il tempo di equilibrazione sono state
collocate in vapori di azoto (2-3 cm) per 5 minuti e poi immerse in azoto liquido e
conservate a -196°C.
3.2 Analisi Seminali
Parametri Rilevati “Computer-Aided Semen Analyzer” (CASA)
La motilità del seme dopo scongelamento è stata analizzata utilizzando l’apparecchio
Hamilton-Thorne Computer-Aided Semen Analyzer (CEROS 12.1 M analyzer Hamilton-
Thorne Research, USA), gentilmente messo a disposizione da Intermizoo Brussa Caorle
Venezia. Tale sistema funziona come un analizzatore del movimento degli spermatozoi e
della morfometria, e consiste in un microscopio a contrasto di fase, un piano portaoggetti
riscaldabile, un analizzatore digitale di immagini collegato ad un computer. Il seme è stato
trasportato all’Intermizoo in auto in un contenitore apposito mantenendolo a -196°C,
scongelato, in acqua calda a 37°C per 1’ e diluito con Tris Buffer in rapporto 1:2 e 10 µl di
seme sono stati posti su un vetrino tipo “ Cell-vu” preriscaldato a 37°C. Il vetrino è stato
collocato per un minuto sopra il piano preriscaldato in modo da far stabilizzare la goccia.
Per eseguire l’analisi si sono presi in considerazione 8 campi microscopici non consecutivi,
selezionati in modo casuale, che sono stati scansionati dall’analizzatore d’immagine. I
27
risultati di ogni campo microscopico sono stati analizzati dal computer in modo da ottenere
un valore medio di ogni parametro preso in considerazione. Tale tipo di analisi è stata
eseguita su due gocce per campione; i risultati ottenuti corrispondono alla media dei
risultati delle due gocce. Poi per ogni campione sono stati presi in considerazione i seguenti
parametri:
- Motilità totale (%)
- Motilità progressiva (%)
- VAP (Velocity Average Pathway), cioè la velocità media del tracciato degli
spermatozoi motili, espresso in µm/sec
- VSL (Velocity Straight Line), cioè la velocità media misurata in linea retta
dall’inizio alla fine del tracciato, espresso in µm/sec
- VCL (velocity Curvilinear), cioè la velocità media misurata punto per punto sul
tracciato seguito dallo spermatozoo, espresso in µm/sec
- ALH (Amplitude Lateral Head), cioè l’ampiezza dello spostamento laterale della
testa, espresso in µm
- BCF (Beat Cross Frequency), cioè la frequenza delle oscillazioni della testa degli
spermatozoi lungo il tracciato, espresso in Hertz
- STR ( Straightness), espresso in percentuale, è il rapporto VLS/VAP, ed esprime la
vicinanza alla linea retta della direzione degli spermatozoi considerati con il 100%
corrispondente ad un movimento perfettamente rettilineo
- LIN (Linearity), espresso in percentuale, è il rapporto VSL/VCL, ed esprime la
vicinanza alla linea retta del tracciato seguito dagli spermatozoi.
28
3.3 Analisi al Citofluorimetro
Descrizione dello strumento
Nato alla fine degli anni '70, il citofluorimetro a flusso, viene utilizzato nell’ individuazione
della presenza di determinanti antigenici, di membrana o citoplasmatici, effettuata con
metodi di immunofluorescenza, ma viene anche impiegato per misurare, a livello di singole
cellule, una serie di parametri come il volume, la ‘granulosità’ cellulare, il contenuto di
DNA, RNA, la concentrazione di ioni calcio, la permeabilità di membrana, le attività
enzimatiche, il pH intracellulare.
Per alcuni parametri, le informazioni sono ricavate dalla luce diffusa (scattering) della
cellula che attraversa il fascio laser di eccitazione, per altri si usa la proprietà posseduta
dalla sostanza in esame (es. derivati antraciclinici) di emettere fluorescenza in seguito
all’eccitazione, per altri ancora la rilevazione viene effettuata mediante sonde, come gli
anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromi (es. FITC, PE). La possibilità di associare,
mantenendole distinte, la misura di diffusione con quella di fluorescenza o la misura di un
fluorocromo associato ad altri (PI con FITC o PE) consente, mediante la strumentazione in
commercio, di ricavare fino a 5-6 parametri contemporaneamente, acquisendo in pochi m-
secondi, svariate informazioni per ogni singola cellula che attraversa il fascio di
eccitazione.
Una delle peculiarità della citofluorimetria a flusso risiede nella velocità di misura; essa,
infatti consente l’analisi di un numero di cellule dell’ordine di decine di migliaia sfruttando
un’automazione spinta della fase di misura e di acquisizione dei dati, ma non consente di
ricostruire la morfologia della cellula, come, del resto, si può fare con strumenti basati sulla
29
microscopia. Ciò implica che le misure effettuate mediante FACS (Fluorescence Activated
Cell Sorting) siano di tipo ‘demografico’ ovvero su popolazioni cellulari, che costituiscono
il pool delle cellule da analizzare, campionate significativamente. L’output analitico, in
altre parole, sarà la frequenza di distribuzione delle risposte dell’intensità di luce emesse
dalle cellule.
Nell’analisi citofluorimetrica la sospensione cellulare, marcata precedentemente, viene
aspirata attraverso un sistema campionatore; le cellule vengono trasportate, mediante un
flusso di soluzione fisiologica a regime laminare, e convogliate in una cuvetta in quarzo
(negli strumenti di 1° generazione all’interno di un nozzle) una alla volta, ben separate ed
allineate, ad intercettare un fascio di un laser di eccitazione (laser ad Argon, 488nm).
Quando le cellule marcate con Ioduro di Propidio attraversano il fascio laser, emettono un
segnale di luce diffusa ed un segnale di fluorescenza rossa che viene raccolta a 90° rispetto
al laser incidente che eccita il colorante. Il segnale di fluorescenza così selezionato viene
rilevato da un fotomoltiplicatore. Il citofluorimetro raccoglie gli impulsi elettrici
equivalenti agli impulsi di fluorescenza emessi da una cellula nell’attraversamento (un
tempo molto piccolo, 2 ms) del fascio laser in una scala arbitraria di intensità di
fluorescenza.. Il citofluorimetro acquisisce in ogni sessione di lavoro di ogni campione un
numero elevato di eventi (cellule marcate) dell’ordine delle migliaia; garantendo un’elevata
validità statistica del campionamento. Il risultato è una distribuzione statistica del numero
di cellule versus fluorescenza cellulare chiamata ‘istogramma di DNA’ .
Un citofluorimetro a flusso è costituito da:
• Una sorgente di luce di eccitazione: laser o lampada a vapori di mercurio.
30
Nella maggior parte degli strumenti viene impiegato un laser a ione Argon accordato sulla
lunghezza d’onda di 488nm (blu). Questa particolare lunghezza d’onda consente
un’efficace misura dei parametri fisici e può eccitare contemporaneamente fino a tre diversi
fluorocromi.
• Un sistema idrodinamico di trasporto delle cellule.
• Un sistema ottico costituito da lenti e filtri opportunamente disposti, che seleziona
le radiazioni emesse.
• Un sistema di misura della luce diffusa e di fluorescenza.
• Un sistema di memorizzazione e analisi dei dati.
• “Cell sorter”: sistema di separazione fisica delle popolazioni cellulari sulla base
delle caratteristiche misurate. Il flusso di liquido contenente le cellule, dopo aver
intersecato il fascio luminoso, viene frammentato in gocce mediante la vibrazione di
un trasduttore piezoelettrico; le gocce contenenti le cellule con le caratteristiche
selezionate vengono quindi caricate e, mediante il passaggio in un campo
elettrostatico, separate fisicamente dalle altre.
I citogrammi prodotti dall’elaborazione statistica possono essere di tre tipi:
• Istogramma monodimensionale; quando l’analisi è monoparametrica.
Il grafico è tracciato in due dimensioni, con la frequenza sull’asse verticale e la grandezza
della variabile su quello orizzontale.
Nella generazione del grafico a istogramma i segnali digitalizzati si accumulano, in base al
loro valore, nei rispettivi canali creando un diagramma di distribuzione di frequenza ad
istogrammi.
31
I canali sono molto ravvicinati tra loro e il calcolatore mostra solo gli apici degli
istogrammi; ne deriva un istogramma il cui aspetto grafico è caratterizzato da curve o
picchi, in ognuno dei quali si può analizzare il numero degli eventi, il canale di massima
frequenza e il coefficiente di variazione.
• Dot plot e contour plot; quando l’analisi è biparametrica bidimensionale.
Nel dot plot ogni particella è rappresentata da un punto in una visualizzazione
bidimensionale, che corrisponde alle coordinate dei valori misurati.
Nel contour plot le linee collegano punti che hanno un valore maggiore o uguale a
determinati punti fissi.
• Rappresentazione prospettica.
Si tratta di una distribuzione biparametrica della frequenza, in cui i valori delle due variabili
in esame sono tracciati come un reticolo di coordinate, con la frequenza degli oggetti che
risulta come la distanza al di sopra del piano del reticolo stesso.
La citofluorimetria a flusso sostituisce per certi versi la microscopia a fluorescenza, ma ci
sono vantaggi e svantaggi in entrambe le tecniche. L’analisi microscopica comporta la
valutazione dell’operatore nel determinare le cellule da includere nell’analisi ed è quindi
soggetta a variazioni individuali; il numero di cellule analizzato è ridotto e inoltre i tempi di
analisi sono piuttosto lunghi. Tutto ciò comporta un’accuratezza limitata.
Si possono tuttavia ottenere informazioni che il citofluorimetro non può fornire, quali la
localizzazione del fluorocromo nei vari compartimenti cellulari. Inoltre i costi di
manutenzione e di utilizzo sono decisamente ridotti rispetto a quelli del citofluorimetro.
32
D’altra parte il citofluorimetro seleziona elettronicamente le cellule da analizzare, conta
10000 cellule in pochi secondi a tutto vantaggio dell’accuratezza del risultato; inoltre non
dipendendo dall’operatore l’analisi è estremamente ripetibile e la lettura più obiettiva.
Lo strumento utilizzato FACS Canto II Flow Cytometer (Becton Dickinson) è stato messo
gentilmente a disposizione da………………………………
3.4 Reagenti Si sono scelti due fluorocromi, annessinaV coniugata con FITC (Boehringer Mannheim) e
ioduro di propidio (Sigma) per individuare apoptosi e necrosi cellulare.
Saggi con Annessina V e Ioduro di Propidio.
L’Annessina V è una proteina con elevata affinità per la fosfatidilserina (PS). Poiché
l’esposizione della PS sulla membrana esterna è stata associata all’inizio della fase di
esecuzione dell’apoptosi, ben prima che sia possibile vedere la frammentazione del DNA.
Il saggio con l’Annessina V è considerato un metodo di rivelazione più precoce di altri
metodi basati sul DNA.
La traslocazione di PS sulla superficie cellulare esterna, che si verifica con qualsiasi
stimolo iniziale di apoptosi, non avviene unicamente nell’apoptosi ma anche durante la
necrosi. La differenza tra queste due forme di morte cellulare consiste nel fatto che nelle
fasi iniziali di apoptosi la membrana cellulare rimane intatta mentre nel momento in cui si
verifica la necrosi la membrana cellulare perde la sua integrità.
Se si procede alla colorazione simultanea della PS di superficie con annessina V marcata
con molecole fluorescenti e di cellule necrotiche con ioduro di propidio, il saggio consente
di distinguere l’apoptosi dalla necrosi in citofluorimetria o microscopia in fluorescenza. Le
33
cellule necrotiche sono facilmente colorate sia con annessina V che con ioduro di propidio
(che invece è escluso dalle cellule normali e da quelle apoptotiche), mentre le cellule
apoptotiche sono colorate solo con annessina V.
La marcatura delle cellule con annessina è rapida (circa 10 minuti) e non è richiesta
fissazione. Il saggio è in genere molto sensibile, permettendo di rilevare anche solo una
cellula marcata.
Oltre ai Kit completi, è possibile acquistare la singola proteina non coniugata o coniugata
PE, APC, FITC, Alexa 568, Cy3, Cy5, EGFP o biotina. ( 8 - Biotecnologie 2000 - Febbraio
2006).
Lo ioduro di propidio(3,8- diammino-5dietilmetil amminopropil-6fenilfenantridin diioduro)
(PI) è un colorante sintetico caratterizzato da una bassa fluorescenza (rosso arancio), in
grado di legarsi selettivamente agli acidi nucleici. Il PI instaura essenzialmente due tipi di
legame con il DNA o RNA a doppia elica: un legame primario, quando il colorante si lega
a due coppie di basi adiacenti dell’acido nucleico, e un legame secondario, esterno alla
doppia elica.
Una volta intercalato nei siti “primari” tra le coppie di acidi nucleici, il PI incrementa di 20
volte rispetto al colorante libero la sua efficienza quantica di fluorescenza, mentre per il
colorante legato nei siti “secondari” questo non si verifica. Questo effetto è probabilmente
il risultato dell’immersione del colorante nel mezzo idrofobico del sito di intercalazione e
rende il PI un ottimo “marker” fluorescente degli acidi nucleici in doppia elica che
possiedono siti primari. Il PI legandosi stechiometricamente alla doppia elica del DNA (o
RNA a doppia elica) fornisce un’informazione sulla quantità di DNA contenuta nelle
34
cellule, in relazione all’intensità di fluorescenza (maggiore è il contenuto di DNA maggiore
sarà la fluorescenza).
3.5 Preparazione dei campioni e lettura al citofluorimetro
Seme di due arieti, a conc di 100 milioni spermatozoi/ 0,25ml in una pailette per un totale
di 8 campioni, anessina V coniugata con FITC (Boehringer Mannheim) e ioduro di
propidio a concentrazione di 1µg/ml della ditta Sigma. Come controllo seme fresco (non
congelato) di bovino ad una concentrazione di 100 milioni spermatozoi/ml.
I campioni per l’analisi con il citofluorimetro( FACS Canto II flow cytometer Becton
Dickinson) sono stati preparati nel modo seguente. Prelevati 2µl del campione
(corrispondenti a 200 mila spermatozoi) e aggiunti in 50µl di soluzione FACSMIX,
contenente 135mM di NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, è stato addizionato con
Annessina V coniugata con FITC ( Boehringer Mannheim) per marcare le fosfatidil-serine
esposte sulla superficie delle cellule apoptotiche e con Ioduro di Propidio (PI 1µg/ml) per
identificare le cellule morte con alterazioni di integrità di membrana plasmatica. Poi i
campioni sono stati messi ad incubare a 37°C per 20 minuti (colorazione). Al termine
dell’incubazione sono stati aggiunti 350µl di soluzione FACSMIX non contenente ioduro
di propidio e annessina per un volume finale per campione di 400µl. Tutto è stato poi
trasferito nei tubi di lettura, i campioni sono stati, poi, acquisiti e analizzati(488nm per
l’annessina coniugata con la FITC e ioduro di propidio) utilizzando FACS Diva software.
35
4.1 Risultati e discussione
La prima analisi effettuata ai nostri campioni è stata l’analisi cinetica dopo congelamento e
i risultati ottenuti sono riportati nella seguente tabella. I campioni sono stati così suddivisi:
18 animali prelievo del seme con elettroeiaculatore e 13 animali prelievo del seme
dal’ipididimo.
EE A EE T EPI A EPI T Motilità 46,50 ± 20,59a* 49,77 ± 27,92a* 63,77±27,14a 55,08 ± 23,48a Prog 16,50 ± 5,88a 17,82±9,07a 21,31±8,04a 18,00±6,36a VAP 88,93±11,87a 78,00±20,21a* 95,97±29,35a* 85,89±25,71a VSL 62,69±6,78a 56,81±10,37a* 65,75±16,47a 60,42±14,15a VCL 141,96±19,39a 124,84±38,15a* 160,79±53,56a* 141,94±40,04a ALH 15,09±2,16a 14,48±2,86a 16,23±2,68b 16,32±2,21b BCF 15,94±1,47a 15,92±1,03a 15,24±1,16a 15,74±1,31a STR 71,36±3,80a 74,36±6,84a 69,69±5,69a 71,46±5,62a LIN 47,00±5,00a 50,55±8,00a 45,10±5,62a 46,80±5,42a elong 40,43±5,29a* 42,14±4,52a 42,85±5,48a 44,61±5,04a*
Tabella 1( i valori indicati con la lettera b indicano una differenza statistica significativa
con P<0,05, mentre con il simbolo * indica………)
Nella tabella 1 sono indicati valori medi dei parametri rilevati dal CASA, su seme di ariete
prelevato mediante elettroeiaculazione (EE) o dall’epididimo (EPI), congelato con diluitore
Andromed (A) e Tryladil (T). I valori seguiti dalla lettera (b), nel parametro ALH(ampiezza
dello spostamento laterale della testa) sono significativamente differenti (P<0,05). Cioè
nota che c’è una differenza statistica (P<0,05) per quanto riguarda i diluitori nel metodo di
raccolta EPI. Mentre nei campioni raccolti con il metodo EE, evidenzia che c’è una
tendenza statistica(P>0,05) nel parametro “Motilità” dovuta, molto probabilmente, alla
presenza del liquido seminale che influisce negativamente sulla motilità.
36
I risultati dell’analisi citofluorimetrica del seme sono raffigurati nei ‘dot-plot’. Il
diagramma di dispersione a punti o ‘dot plot’ rappresenta la correlazione fra due parametri,
in cui ogni punto rappresenta un singolo evento dotato di un particolare valore per ciascuno
dei i due parametri. All’interno dei dot plot si possono definire quadranti e finestre di
diverse dimensioni. Ogni singolo valore relativo a ciascun parametro misurato, dopo essere
stato amplificato e convertito, rappresenta il “quanto” citometrico e prende il nome di
evento.
In Figura 4 è riportata l’analisi del seme fresco di bovino, utilizzato come controllo positivo
di vitalità, in quanto i campioni di seme di ariete erano crioconservati.
Figura 4 Campione di seme fresco di bovino
Sull’asse delle ordinate sono riportati i valori dell’intensità del segnale emesso dallo
ioduro di propidio (PI) e sull’asse delle ascisse l’intensità del segnale del fluorocromo
FITC(fluorescina isocianato) coniugata con annessina V. La colorazione con PI indica che
37
le cellule sono permeabili a soluti dall’esterno e quindi danneggiate solitamente in maniera
irreparabile e sono in genere da considerarsi morte, mentre la positività al segnale di FITC
indica che le cellule stanno andando incontro al processo apoptotico. Il grafico è stato
diviso in 4 parti identificando i quadranti Q1,Q2,Q3 e Q4. Nel Q1 è riportata la percentuale
di cellule positive allo ioduro di propidio, nel Q2 è invece rappresentata la percentuale di
cellule positive ad entrambi i parametri (FITC e PI), nel Q4 è rappresentata la percentuale
di cellule positive solo per la FITC ed infine nel Q3 sono plottati gli eventi negativi ad
entrambi le colorazioni. Dalla distribuzione degli eventi possiamo vedere che il 73,2% delle
cellule non hanno colorazione (appartengono al Q3) e quindi sono vitali; il 25,6% è
positivo al PI(quadranti Q1+Q2) indicano che le cellule sono morte.
Figura 5 Campione 1: n° 76371 EE-A Campione 2: n°76371 EE-T
Nella Figura 5 vengono rappresentati, come esempio due Dot Plot di due campioni di seme
di ariete congelati analizzati con il metodo FITC e ioduro di propidio e con i due diversi
diluenti (Andromed, e Tryladil). Si può vedere che già a prima vista nel Q3, dove sono
rappresentate le cellule vive, il campione 2 (contenente Tryladil) ha una percentuale di vivi
maggiore (Q1), che è del 34,2%, mentre nel campione 1 la percentuale (Q1) è del 16,9%.
38
Cosi come nei positivi all’Ioduro di propidio (Q1+Q2) si ha che nel campione 1 è del
83,1% mentre nel 2 è del 63,1%. La positività alla annessina FITC (Q4) è invece stata ne
campione 1 di 0,1% mentre nel campione 2 del 2,7%. Questo andamento di percentuale si è
più o meno mantenuto in tutti i campioni secondo le tabella riportata sotto dove, sono stati
anche inseriti i dati della cinetica (motilità e progressività) dei due animali analizzati con il
citofluorimetro.
A/IP-‐ A+ IP+ motilità prog
EEA 12,1a 0,15a 86,75a 65a 20,5a EET 25,2b 2,35a 72,45a* 85b 25a EPIA 3,45a* 4,85a 91,75a 68ab 25a EPIT 18,6a* 2,35a 79,05a* 63ab 20a
Tabella 6 Percentuale di spermatozoi positivi all’
39
4.1 Conclusioni
40
5. BIBLIOGRAFIA
Aisen EG, Alvarez HL, Venturino A, Gaede JJ. Effect of trehalose and EDTA on
cryoprotective action of ram semen diluents. Theriogenology 2000 ; 53: 1053-1061.
Amelar, M.D., Dubin, L., Schoenfeld, C,Y., “Sperm motility”. In: Fertil. Steril. 1980;
34, 197.
Anel L, Kaabi M, Abroug B, Alvarez M, Anel E, Boixo JC, de la Fuente LF, de Paz P.
Factors influencing the success of vaginal and laparoscopic artificial insemination in
churra ewes: a field assay.Theriogenology 2005; 63: 1235-1247. Anim Reprod Sci.
2000; 62: 113-141.
Aoki F., Sakai S., Kohmoto K., “Regulation of flagellar bending by cAMP and Ca2++
in hamster sperm”. In: Mol Perod Dev. 1999; 53: 77-83.
Bourgeron T., “Mitochondrial function and male infertility. In Results and Problems in
Cell Differentiation. The Genetic Basis of Male Infertility”. In: McElreavey M [Ed],
Springer-VerIag, Berlin-Heidelberg. 2000; 187-210.
Bunge RG, Sherman JK. Fertilizing capacity of frozen human spermatozoa. Nature
1953; 172:767-8.
Chemes H.E., Olmedo S.B., Carrere C., Oses R., Carizza C., Leisner M., “Blaquierj
Ultrastructural pathology of the sperm flagellum: association between flagellar
pathology and fertility prognosis to severely asthenozoospermic men”. In: Hum
Reprod. 1998; 13: 252 1-2526.
Chemes, H.E., “Phenotypes of sperm pathology genetic and acquired forms in infertile
men”. In: J Androl 2000; 21: 799–808.
41
Courtade M., Lagorce C., Bujan L., Caratero C., Mieusset R., “Clinical characteristics
and light trasmission electron microscopic sperm defects of infertile men with persistent
unexplained asthenozoospermia”. In: Fertil Steril. 1998; 70:297-304.
Eliasson R., Treichl L., “Supravital staining of human spermatozoa”. In: Fertil Steril.
1971; 22:134-37.
Eliasson, R. and Treichl, L., “Supravital staining of human spermatozoa”. In: Fertil
Steril. 1971; 22: 134–137.
Gadea J. Semen extenders used in the artificial insemination of swine. A review. Span.
J. Agric. Res. 2003;1:17–27.
Gagnon C., “Regulation of sperm motility et the axonemal level”. In: Reprod Fertil
Dev. 1995; 7:847-855.
Gao D, Crister JK. Mechanism of cryoinjury in living cells. ILAR J 2000; 41: 187–196.
Gilmore JA, Liu C, Woods EJ, Peter AT, Crister JK. Cryopreservation agents and
temperature effects on human sperm permeabilities: convergence of theoretical and
empirical approaches for optimal cryopreservation methods. Hum Reprod 2000; 15:
335–343.
Glover, T.J., Suzuki, F., Racey, P.A., “The role of the epididymal cells in sperm
survival”. In: The functional anatomy of the spermatozoon. Afzelius, B.A. Ed.,
pergamon Press, Oxford- New-York.. 1974; 359.
Holt WV, North RD. Cryopreservation, actin localization and thermotropic phase
transitions in ram spermatozoa. J. Reprod. Fert. 1991; 91: 451–461.
42
Holt WV. Fundamental aspects of sperm cryobiology: The importance of species and
individual differences. Theriogenology 2000; 53: 47-58.
Irvine D.S., “Male reproductive health: cause for concern?”. In: Andrologia. 2000; 32:
195-208.
Katz, D.F., Overstreet, J.W., “Biophysical Aspects of Human Sperm Movement”. In:
D.W. Fawcett J.M Bedford (eds) The Spermatozoon Urban and Schwarzenberg,
Baltimore. 1979; 413.
Keel B, Webster BW. CRC Press Boca Raton Ann Arbor Boston, 1990: 229-60.
Luconi M., Marra F., Gandini L., Filimberi E., Lenzi A., Forti G., Baldi E.,
“Phosphatidylinositol 3-kinase inhibition enhance human sperm motilità”. In: Hum
Reprod. 2001; 16: 1931-1937.
Martin G, Sabido O, Durand P, Levy R. Cryopreservation induces an apoptosis-like
mechanism in bull sperm. Biol Reprod 2004; 71: 28–37.
Medeiro CMO, Forell F, Oliveira ATD, J.L. Rodrigues Gao D, Mazur P, Critser JK.
Current status of sperm cryopreservation: why isn’t it better? Theriogenology 2002; 57:
327-344.
Paulenz H, Soderquist L, Adnoy T, Nordstoga A, Gulbrandsen B, Berg KA. Fertility
results after different thawing procedures for ram semen frozen in mini tubes and mini
straws. Theriogenology 2004; 61: 1719-1727.
43
Pérez-pé R, Grasa P, Fernández-Juan M, Peleato ML, Cebrian-Pérez JA, Muiño-Blanco
T. Seminal plasma proteins reduce protein tyrosine phosphorylation in the plasma
membrane of cold-shocked ram spermatozoa. Mol Reprod Develop. 2002; 61: 226-233.
Pickett BW, Komarek RJ. Effect of cold shock and freezing on loss of lipid from
spermatozoa. J Dairy Sci 1967; 50: 753–770.
Polge C, Smith AU, Parkes AS. Revival of spermatozoa after vitrification and
dehydration at low temperatures. Nature.
Quinn PJ, White IG. The effect of cold shock and deep freezing on the concentration of
major cations in spermatozoa. J Reprod Fertil 1966; 12: 263–70.
Ruiz-Pesini E., Diez C., Lapena A.C., Perez-MArtos A., Montyoa J., Alvarez E.,
Arenas J., Lopez-Perez M.J., “Correlation of sperm motility with mitochondrial
enzymatic activies”. In: Clin Chem. 1998; 44:1616-1620.
Ruiz-Pesini E., Lapena A.C., Diez- Sanchez C., Perez-Martos, A., Montoya, J.,
Alvarez E., Diaz, M., Urries, A., Montoro, L., Lopez-Perez M.J., Enriquez J.A.,
“Human mtDNA haplogroups associated with high or reduced spermatozoa motility”.
In: Am. J. Hum. Genet. 2000; 67: 682-696.
Ryder,TA., Mobberley, M.A., Hughes L., and Hendry, W.F A., “Survey of the
ultrastructural defects associated with absent or impaired human sperm motility”. In:
Fertil Steril. 1990; 53: 556–60.
Salamon S, Maxwell WMC. Frozen storage of ram semen. I. Processing, freezing,
thawing, and fertility after cervical insemination. Anim Reprod Sci 1995; 37: 185-249.
Salamon S, Maxwell WMC. Storage of ram semen. Anim Reprod Sci. 2000; 62: 77-111.
Sherman JF. Cryopreservation of human semen. In "Handbook of the Laboratory
Diagnosis and Treatment of Infertility”.1949; 164:666-76.
44
Trinchero GD, Affranchino MA, Schang LM, Beconi MT. Antioxidant effect of bovine
spermatozoa on lipid peroxidation. Corn Biol 1990; 8: 339-350.
Uma Devi K., Jha K., Patil S.B., Padma P., Shivaji S., “Inhibition of motility of
hamster spermatozoa by protein tyrosine kinase inhibitors”. In: Andrologia. 2000;
32:95-106.
Watson PF, Kunze E, Cramer P, Hammerstedt RH. A comparison of critical osmolality,
hydraulic conductivity and its activation energy in fowl and bull spermatozoa. J Androl
1992; 13: 131–138.
Watson PF. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa
and the assessment of their post-thawing function. Reprod Fertil Dev 1995; 7: 871–891
Watson PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim Reprod Sci
2000; 60–61: 481–492.
Watson PF. The effects of cold shock on sperm cell membranes. In: Morris, G.J.,
Clarke, A._Eds..,Effects of Low Temperatures on Biological Membranes. Academic
Press, London 1981; 189–218.
Yanagimachi, R., “Mammalian fertilization”. In: Physiology of reproduction Knobil E.
Neill J. (Eds.), Raven Press, New York. 1994; 189-317.
Zamboni L., “Physiology and pathophysiology of the human spermatozoon: the role of
electron microscopy”. In: J Electron Microsc Tech. 1991; Apr 17(4):412-36.
Zamboni L., “The ultrastructural pathology of the spermatozoon as a cause of infertility
the role of electron microscopy in the evaluation of semen quality”. In: Fertil Steril.
1987; 48: 711–734.
45