Università degli Studi di Verona Dipartimento di Scienze ... · Analisi quantitativa delle...

Università degli Studi di VeronaDipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione

Analisi quantitativa delle immagini

Immagini & Computer S.n.c.Via Don Carlo Riva 420010 Bareggio (Mi)

26 Marzo 2010Aula Magna Gavazzi – Facoltà di Medicina

Verona

“L’analisi quantitativa delle immagini rappresenta l’arte di trasformare una sensazione visiva irrazionale nella sua forma schematica e discreta consentendone la descrizione, la classificazione e l’interpretazione matematica e logica univoca delle sue componenti spaziali e temporali.”



Quando e perché ?

Quando serve una rappresentazione oggettiva del risultato. Quando dobbiamo condividere i risultati con altri. Quando ci è richiesta una ripetibilità nei risultati ottenuti. Quando …

Perché risulta più professionale fornire numeri piuttosto che impressioni.

Perché ci consente di discutere e difendere i nostri dati. Perché possiamo rivedere e ripetere passo-passo il processo che ci ha

portato al risultato.Perché ….

Microscopia widefieldMicroscopia confocaleMicroscopia spettraleMicroscopia confocale 2 fotoniSistemi HCS

Un significativo contributo alla diffusione di questa disciplina è stato fornito dalla enorme disponibilità di strumenti digitali in grado di produrre informazioni in grande quantità.

Investigazione contemporanea in più dimensioni.

Elevata risoluzione spazialeEsplorazione temporale


Complessità

http://www.leica-microsystems.com/WebSite/pictures.nsf/(ALLIDs)/70CAD06537BAC1A8C12573FA005A0200/$FILE/SP5X_WLL1_prod_b_cl.jpg

Le informazioni di base generate dalla strumentazione possono essere utilizzate in modi diversi per scopi differenti.



Il computer non pensa come noi, calcola solo più velocemente.

Da qui la necessità di non delegare decisioni o di nutrire aspettative al di fuori delle reali possibilità offerte dalle soluzioni disponibili.

Risulta quindi basilare

1. Fissare gli obiettivi che ci proponiamo2. Studiare e definire i metodi ed i processi di acquisizione, trattamento ed analisi da

utilizzare (Protocollo di analisi). 3. Assicurare per quanto possibile l‟indipendenza dei risultati dalla piattaforma utilizzata.


Raccolta delle immagini

Correzione degli artefattiDecadimento (Photobleaching,ect)Correzione BackgroundDisomogeneità illuminazione

Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini.Rimozione del rumoreDeconvolulzione

Miglioramento aspettoContrasto/LuminositàFiltri spazialiRitocco coloreGrafica

ImageRegistrationMosaicatura

Documentare l’evento biologicoTrasferire le proprie sensazioni e le proprie conclusioni attraverso la rappresentazione visiva ottimizzata delle informazioni che descrivono l‟evento.

Pubblicazione

Questione Etica


Raccolta delle immagini

Correzione degli artefattiDecadimento (Photobleaching,ect)Correzione BackgroundDisomogeneità illuminazione

Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini.Rimozione del rumoreDeconvolulzione

Identificazione delle struttureSegmentazioneDistinzione da altre struttureCodifica dei confini e misuraClassificazione

ImageRegistrationMosaicatura

Quantificare l’evento biologicoRendere oggettive le proprie sensazioni e le proprie conclusioni attraverso la descrizione quantitativa (numerica) delle informazioni che compongono l‟evento.

Pubblicazione

Evoluzione e comportamento delle struttureTrackingCineticaRatio Imaging

Data MiningSimulazione eventoCreazione modelloAnalisi dei dati


La raccolta delle immagini richiede una serie di accorgimenti quali :

Rispetto dei principi di campionatura X, Y, Z Adeguata scelta della dinamica del segnale (rappresentazione dell‟evento) Qualità della ripresa (fuoco corretto, saturazione, ect) Definizione dei parametri operativi del dispositivo (potenza del laser,

esposizione della telecamera, livello di illuminazione del campione)Corretta (strutturata) memorizzazione delle immagini

Standardizzazione del processo


Come archiviare le immagini.

Importante considerare la finalità per la quale si vuole archiviare l’immagine.

1. DocumentazioneSoddisfatta la qualità visiva, le dimensioni del file rappresentano il principale obiettivo.I formati compressi con perdita di informazioni (Jpeg, Jpeg2000, ect) sono ampiamente giustificati.

2. Analisi successivaNecessità di preservare le informazioni originali contenute nell’immagine.In questo caso sono da preferire i formati lineari non compressi o con compressioni di tipo “lostless” (Tiff, Bmp, ect).


I danni introdotti dai sistemi di compressione ad alta efficienza (Jpeg, Jpeg2000, ect) non sono immediatamente percettibili. Essi si manifestano sotto forma di “pixellatura” artificiale dell’immagine.


I singoli pixel subiscono una modifica in termini di contenuto cromatico e/o di intensità/densità. Tale variazione può introdurre un errore di valutazione importante (5% - 10%) direttamente rapportato al coefficiente di compressione utilizzato.

TIFF JPEG

Differenza assoluta


Esempio comparativo tra la stessa immagine archiviata in formato TIFF ed in formato JPEG (qualità 75%). Sia l‟intensità che la distribuzione del contenuto dei pixel risulta variata.

Range dinamico del segnale

Il Range dinamico digitale, espresso in numero di livelli di grigio, necessario a descrivere appropriatamente il segnale generato dal dispositivo di acquisizione è funzione del rapporto tra la sua capacità di immagazzinamento dei fotoni (FWC) ed il suo rumore intrinseco (ReadNoise, ect).

La condizione ideale, ma che è anche la condizione limite, è rappresentata dal rapporto: 1 livello di grigio = 1 fotone/elettrone.

Esempio : Consideriamo una FWC pari a 40.000 e con un Noise di 12 e risulta :

GrayLevels = 40.000 / 12 = 3.333Un range dinamico pari a 12 bit (4.096 GrayLevels) risulta idoneo a garantire il corretto Range Dinamico Digitale.



Campionamento e densitàLa densità di campionamento rappresenta il numero di unità digitali base (pixel o voxel) catturate per unità di volume.La densità di campionamento è direttamente derivata dai parametri del sistema otticoe non può essere modificata dopo l‟acquisizione del volume.

Il valore di campionamento critico, al di sotto del quale il processo di acquisizione puòprodurre artefatti (frange di diffrazione), è calcolato utilizzando il criterio di Nyquist

Calcolo Z secondo Nyquist

Δz = λem / (2 N (1- cos α))

Λem = emission wavelenghtN = medium indexα = ½ angolo apertura obiettivo

In praticaΛem = 520nmN = 1.515NA = 1.3α = αrcsen(NA/N)

Δz = 520 /(2*1.515*(1-cos α))Δz = 353 nmCalcolo XY secondo Nyquist

Δxy = λem / (4 N sen α)

Dyes Ex (nm) Em (nm) X Y Z Z/2

Dapi 358 463 89 89 314 157

Fitc 495 517 99 99 351 175

Alexa488 493 520 100 100 353 176

Rodamina 551 573 110 110 389 194

Tritc 550 573 110 110 389 194

Cy3 549 562 108 108 381 191

Esempi di passi di campionamento in Z utilizzando il criterio di Nyquist



Le molteplici risoluzioni di un sistema

A. Risoluzione Ottica : limite di discriminazione tra due oggetti adiacenti. Determinato dalla apertura numerica dell’obiettivo e dalla lunghezza d’onda di emissione della luce.

B. Risoluzione spaziale : limite di discriminazione del sensore CCD. Determinato dalle dimensioni della singola cella del sensore e dall’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato.

C. Risoluzione Immagine : caratteristica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che formano l’immagine.

La risoluzione Ottica.

La risoluzione ottica del microscopio è funzione della :• lunghezza d’onda della luce utilizzata;• apertura numerica (N.A.) dell’obiettivo.

La risoluzione ottica del microscopio NON dipende da:• ingrandimento dell’obiettivo

Secondo la formula generale ->R = 0,61 l / N.A. dove N.A.= n sen a (Formula descritta per la prima volta da Ernest Abbe e Carl Zeiss)

Si consideri che:

• Maggiore e’ l’angolo (N.A.) con cui l’obiettivo è in grado diraccogliere la luce maggiore è il potere di risoluzione

•Maggiore è N.A. minore è la distanza di lavoro

Per obiettivi in aria aè sempre minore di 90°


Risoluzione ottica laterale

Regole generali

RO = 1,22 * (emwl) / (N.A.ob * N.Acond)

Fluorescenza : N.A.ob = N.Acond

Campo chiaro: emwl = 500nm


Risoluzione spaziale

La risoluzione spaziale rappresenta il limite dimensionale minimo di un oggetto, presente sul piano ottico, discriminabile dal sistema di acquisizione.


Il pixel size è parametro intrinseco del dispositivo CCD che ne definisce le dimensioni delle singole celle.

Risoluzione spaziale

La risoluzione spaziale è funzione del pixel size del sensore CCD e del’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato.

4.6 um


Risoluzione spazialeA causa delle caratteristiche costruttive del sensore CCD, due oggetti devono distare almeno di un pixel tra loro per poter essere discriminati.

La risoluzione spaziale rappresenta la distanza minima, espressa in unità metriche, che deve intercorrere tra due oggetti proiettati sul piano di fuoco, e ben contrastati tra loro, per poter essere discriminati ed identificati come tali dal sistema di acquisizione.


Risoluzione spaziale La risoluzione spaziale è funzione del pixel size del sensore CCD e del’ingrandimento dell’obiettivo utilizzato.

il calcolo della risoluzione spaziale si esegue come segue :

Rs= (Pixel size / Ingrandimento obiettivo)

A conferma di quanto espresso in precedenza il calcolo della risoluzione spaziale si modifica come segue introducendo il coefficiente di correzione:

Rs = ((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3)

Esempio : Pixel size = 6.4 umIngrandimento = 20xRisoluzione spaziale Rs = ((6.4 / 20) * 2.3) = 0.736 um


Da considerare

Se l’adattatore passo “C” impiegato possiede una lente di riduzione (< 1.0x) il calcolo della risoluzione spaziale si modifica come segue : Rs = ((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3) / PassoCEsempio : Pixel size = 6.4 um, Ingrandimento = 20x, Passo “C” = 0.63x

Risoluzione spaziale Rs = ((6.4 / 20) * 2.3) / 0.63 = 1.168 um

Analogamente in presenza di un CCD colore con filtro Bayer (più comune) la risoluzione spaziale si riduce come segue:Rs = (((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3) / PassoC) *2

Risoluzione spaziale Rs = (((6.4 / 20)*2.3)/0.63)*2 = 2.336 um

Analisi quantitativa delle immaginiRisoluzione spaziale

Utilizzando la funzione di Binning della telecamerala risoluzione spaziale si riduce come segue:Rs = (((Pixel size / Ingrandimento) * 2.3) / PassoC) * Binning

Risoluzione spaziale Rs = (((6.4 / 20)*2.3)/0.63)*2 = 2.336 um


Risoluzione Immagine Caratteristica dell’immagine digitale. Corrisponde al numero di pixel orizzontali / verticali che formano l’immagine.

Da non confondere con i DPI.

544 x 631 pixel

680 x 789 pixel


L‟estrazione delle informazioni richiede una serie di azioni atte alla:

Correzione degli artefatti Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini. Identificazione delle struttureAnalisi della evoluzione e del comportamento delle strutture nel tempoInterpretazione dei dati (Data Mining)

Informazioni cromatiche

Livello unico

Informazioni intensità

Livelli differenti


Decadimento del segnaleLa procedura corregge le differenze di intensità di segnale causate dal degrado della sonda fluorescente nel corso del tempo (timelapse o volume 3D).

Correzione Background Elimina i difetti dovuti alla disomogeneità del campo illuminato (disallineamento lampada, ect)

Disomogeneità illuminazioneLa procedura corregge le differenze di intensità di segnale causate dallanon perfetta stabilità della sorgente di illuminazione (Flickering)

Correzione degli artefatti


Quencing : generato da processi che producono il passaggio degli elettroni dallo stato di eccitazione a quello di riposo senza emissione di luce. Questi processi competono con i classici processi fluorescenti riducendone il LIFETIME e la QY (emissione quantica) del fluoroforo utilizzato. Il processo di Quencing è reversibile.

Photobleaching : Perdita permanente della capacità di emettere elettroni da parte del fluoroforo a causa di un danno chimico indotto. Una delle cause principali del Photobleaching è l‟interazione del fluoroforo con luce ed ossigeno (distruzione molecole fluorescenti con creazione di radicali liberi che interagiscono con altre molecole presenti nelle cellule).Tale effetto può essere contenuto riducendo la quantità di luce utilizzata per l‟eccitazione ed aggiungendo al media di montaggio appositi preparati Antifading.Il processo di Photobleaching non è reversibile.

Fluoroforo : FITC Sorgente di eccitazione : HBO 100W Esposizione : 30secPerdita del 50% del segnale

Photobleaching

Perdita progressiva della capacità di un fluoroforo di emettere fotoni in risposta ad uno stimolo luminoso. La continua e prolungata esposizione ad una sorgente di eccitazione porta alla completa estinzione della molecola fluorescente.

T = 0 sec T = 15 sec T = 30 sec

Ogni fluoroforo possiede il proprio coefficiente di estinzione che ne determina la LIFETIME (numero di fotoni generati per unità di tempo).



Area di ripresa CCD

Area illuminata

Esposizione = 2 sec

Un problema pratico correlato al photobleaching.


Ripristino delle caratteristiche originali delle immagini

Image restoration = insieme di procedure e funzioni atte al recupero di un segnale (immagine) nella sua forma originale.

Deconvoluzione = operazione matematica utilizzata per recuperare un segnale degradato (immagine) da un processo fisico.

Convoluzione = processo fisico (ottico) di creazione del segnale (Immagine)

Image RestorationDeconvoluzione 3D (quantitativa)

Filtri spaziali lineari e non Filtri in domini di frequenza (FFT)

Alterazione dell‟immagine (?)


Perché una immagine si degrada ?

La convoluzione è il processo ottico di creazione dell‟immagine. Esso introduce artefatti di vario genere con la conseguente degradazione dell‟immagine.

1. Rumore 2. Aberrazioni (sferiche e cromatiche) 3. Errata localizzazione della luce (sfocatura)

La causa è dovuta alla profondità di campo dell‟obiettivo utilizzato (DoF). La DoF è funzione principalmente della apertura numerica della lente e della lunghezza d‟onda di emissione della luce utilizzata.La profondità di campo può essere espressa come :

dtot= λn/NA2 + (n/M×NA)e


A causa della profondità di campo dell‟obiettivo utilizzato, la luce proveniente dai piani di fuoco adiacenti a quello principale fornisce il proprio contributo nella formazione dell‟immagine. La deconvoluzione provvede a riassegnare tale contributo al corretto piano di appartenenza.

Prima conseguenza riscontrabile è la riduzione della risoluzione e del rapporto segnale / rumore all‟interno dell‟immagine.

DeconvolutaOriginale

Profilo intensità


Risoluzione

Originale Deconvoluta

Background Segnale S/N

Originale 801 1394 1.74

Deconvoluta 189 1318 6.97


Rapporto S/N

Sezioneda 25um di un bulbo celebrale olfattorio di topo che esprime GFP, ripresa a 60X in Olio. (25 sezioni)


Originale Deconvoluta


Identificazione delle strutture

Segmentazione

•Diretto (Intervallo di grigi o colore - assoluto)•Indiretto (Intervallo in % o Std - relativo)•Statistico (Distribuzione, ect)•Complesso (Probabilistico, stocastico)

Objectoriented

Tessitura

Selezione intervallo di intensità o colore che rappresenta il nostro obiettivo.

Tecniche basate sulla identificazione di particolari caratteristiche fisiche presenti all‟interno dell‟immagine.

Manipolazione

Le tecniche di segmentazione basate sull‟appartenenza del pixel ad un determinato intervallo spettrale (RGB) o di intensità luminosa (GrayLevel) risultano idonee per l‟analisi di singole immagini. Non risultano invece sufficientemente robuste per compensare ed adattarsi alle variazioni presenti tra differenti immagini.


Assottigliamento della struttura

L„approccio basato su tecniche che non fissano un intervallo di intensità rigidoconsente un migliore adattamento alle eventuali variazioni globali delle immagini.


Manipolare prima di segmentare ?

L‟importanza della copia

A

BC

D

E

F

Inte

ns

ity

Position

A B C D E F

Inte

ns

ity

Position

Filtro Top Hat

Soglia fissa

Soglia fissa


Proprietà dei Pixel :• Intensità (luminosità)• Coordinate spaziali X,Y• Identità e di interazione con

pixel adiacenti

La totalità dei metodi di identificazione delle struttura contenute all‟interno dell‟immagine si basa sulla analisi delle caratteristiche dei singoli pixel e della loro interazione con gli altri elementi (pixel) adiacenti.

1 10 22 21 19 11 19 34

65 67 78 54 67 34 65 23

54 4 34 56 54 65 23 34

44 54 65 23 24 25 43 34

23 34 39 24 23 21 25 26

34 35 36 37 34 32 34 66

34 45 34 23 34 32 31 55


La trasformazione contestuale dei punti dell„immagine in strutture organizzateavviene attraverso una continua interazione tra i processi di raggruppamento deipixel e la classificazione degli oggetti secondo criteri cognitivi.

Tecniche di apprendimento Pianificazione del protocollo


Proprietà degli oggetti:• Intensità media (luminosità) deicanaliR,G,B• Coordinate spaziali XY • Identità degli oggetti immediatamente vicini• Forma• Dimensione• Tessitura• Compactness• Rotondità• Diametro• Perimetro• Deviazione standard dellaintensità• Caratteristiche degli oggetti confinanti• Caratteristiche dei SUPER/SUB-oggetti• Perimetro condiviso con altri oggetti• Altri ancora

Matrice di pixel

Matrice di oggetti


Struttura livello A

Struttura livello B

Struttura livello C

La connessione contestuale

degli oggetti implica che

ogniuno di loro “conosce”:

•Gli oggetti confinanti della

stessa classe

•Gli oggetti del livello

superiore

•Gli oggetti del livello inferiore

Livello Pixel


L„importanza della calibrazione.

Una misura espressa in unità metriche fornisce una indicazione immediata circa la scala dimensionale nella quale stiamo operando.La rappresentazione 3D del campione richiede il suo corretto dimensionamento.

Scala metrica

1


La calibrazione ottica.

L'assorbanza (inverso della trasmittanza) è in relazione lineare con la concentrazione di un campione (legge di Lambert-Beer) . L'assorbanza indica la quantità relativa o percentuale di luce assorbita dal campione.Misurando concentrazioni note (definite standard) in condizioni controllate è possibile calibrare il sistema di analisi.

Sorgente luminosa

Scala densitometricacalibrata

Telecamera CCD


Esempio di procedura per analisi densitometrica

Scala densitometricacalibrata

Eventuale calibrazione in concentrazioni (es. nc/mg)

Misure assolute


Le misure di fluorescenza e la calibrazione.

Impossibilità di associare il segnale fluorescente ad una scala assoluta.

Mancanza di standard di calibrazione affidabili

Decadimento del segnale (photobleaching, quencing, ect)

T = 0 sec T = 30 sec

FITC


Un approccio corretto con metodi sostenibili genera misure riproducibili.

100%Intensità relativa




0.667%Intensità relativa

Calibrazione del sistema di acquisizione

Linea cellulare nota inserita nel processo di analisi

Misure radiometriche (Ca2+)

Cellule non caricate e caricate a saturazione


1. Acquire optical images• Set up specimen and imaging system for optimal signal detection, low background, and low noise (Table I)2. Acquire digital images• Use software to monitor intensity values in the image to choose the best acquisition settings• Use full dynamic range of the camera for fixed specimens• For live-cell work, it is often necessary to sacrifice SNR to minimize specimen exposure to light and maintain cell

health and viability• Consider binning to increase SNRa• Avoid high camera gain when a large dynamic range is needed• Avoid saturating pixels in the image• Eliminate or minimize exposure of specimen to fluorescence excitation light prior to image acquisition• Focus carefully, preferably with phase or DIC3. Store images• Always save the raw images• Use either no compression or lossless compression4. Process images• Use flat-field correction to correct for uneven illumination• Be sure any other image processing used prior to quantitation preserves relative intensity values5. Analyze images• Subtract local background value from intensity measurements• Do not measure intensity values on compressed or pseudo-colored images• Validate image segmentation and analysis method• Calculate and report the error in your measurements


Alcuni lavori scientifici e testi interessanti

GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE !

Immagini & Computer SncVia Don Carlo Riva 4

Bareggio (Mi)

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